KR20040054472A

KR20040054472A - 사람 성장 호르몬(ｇｈ1) 유전자의 근접 프로모터에서일배체형 분할

Info

Publication number: KR20040054472A
Application number: KR1020030031746A
Authority: KR
Inventors: 데이비드네일 쿠퍼; 애니마리에 프록테르; 데이비드스튜어트 밀라르; 존 그레고리
Original assignee: 유니버시티 오브 웨일즈 칼리지 오브 메디슨
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2003-05-20
Publication date: 2004-06-25
Also published as: AU2003203781A1; WO2004057028A1; NZ525314A; US20040110173A1; EP1573060A1; JP2004290173A; HRP20050569A2; AU2003290247A1; CA2423904A1; NO20053489L

Abstract

본원 발명은 사람 성장 유전자(GH1)의 변이체, 특히 근접 프로모터 영역에서 이의 변이체에 관한다. 또한, 본원 발명은 상기 변이체의 상호작용 및 이런 상호작용이 성장 호르몬 발현에 영향을 주는 방법에 관한다.

Description

사람 성장 호르몬(ＧＨ1) 유전자의 근접 프로모터에서 일배체형 분할{HAPLOTYPE PARTITIONING IN THE PROXIMAL PROMOTER OF THE HUMAN GROWTH HORMONE(GH1) GENE}

본원 발명은 성장 호르몬 기능이상의 존재 또는 이에 대한 감수성을 진단하는 방법, 이런 방법에 사용하기 적합한 키트 및 여기에 기초한 연구 수단에 관한다.

사람 신장은 여러 유전적ㆍ환경 인자의 상호작용에 기인하는 매우 복합적인 특성이다. 가족성의 작은 신장이 성장 호르몬 유전자(GH1)의 유전된 돌연변이와 연관하는 것으로 이미 공지되어 있기 때문에, 이런 뇌하수체 발현된 유전자에서 다형성 변이가 성인 신장에도 영향을 줄 수 있다고 추론하는 것은 타당해 보인다.

사람GH1유전자는 태반에서 발현되는 성장 호르몬 유전자(GH2: MIM #139240), 2가지의 융모 신체유선자극호르몬 유전자(CSH1과CSH2), 가유전자(CSHP1)를 비롯한 5가지 관련된 유전자의 66 kb 클러스터에서 크로모좀 17q23에 위치한다.GH1유전자 프로모터의 근접 영역은 높은 수준의 서열 변이를 보이는데, 535개의 염기쌍 거리에서 16개의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이 보고되었다. 이들 SNP의 대부분은 동일한 위치에서 발생하고, 여기서GH1유전자는 파라로거스(paralogous)GH2,CSH1,CSH2,CSHP1과 상이한데, 이런 결과는 이들이 유전자 전환(gene conversion)통하여 발생할 수 있다는 것을 시사한다.

사람GH1유전자의 발현은GH1유전자 상류의 14.5 kb와 32 kb 사이에 위치하는 좌위 조절 영역(LCR)에 의해서도 영향을 받는다. LCR은 복수의 DNase I 과민성 부위를 보유하고 뇌하수체와 태반에서 GH 유전자 클러스터의 유전자 활성화에 필요하다. 2가지 DNase I 과민성 부위(I과 II)는 뇌하수체-특이적 전사 인자 Pit-1에 대한 결합 부위를 보유하고GH1유전자의 높은 수준-소마토트로프(somatotrope)-특이적 발현을 주도한다.

본 출원인은GH1유전자의 근접 프로모터 영역과 LCR 모두에서 다형성 변이의 기능적 중요성을 평가하는 조사를 실시하였다.

본원에서 밝힌 조사의 결과로서, 연구 개체군에서 변이가 16개의 공지된 SNP 위치중 15곳에서 발생하고 총 40개의 상이한 프로모터 일배체형에서 명백하게 나타나는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 일배체형에 대한 조사를 통하여 이들을 분할 수 있었고, SNP중 6개가GH1유전자 발현의 주요 결정소로 작용하고 다른 6개의 SNP는GH1유전자 발현에 대한 약간의 정보를 제공할 뿐이라는 결론을 얻을 수 있었다.

이에 더하여, 사람 신장의 유전적 복합성에 비추어 본 출원인은 이런 데이터로부터 SNP의 특정 조합 및 일배체형이 사람 신장에 매우 결정적인 효과를 나타낼 수 있다는 결론에 도달하였다. 따라서, 이런 정보의 인식은 성장 호르몬의 과소 발현(underexpression)으로 고생하고 적어도 사춘기까지 대체 요법을 필요로 하는 개체를 확인하는데 도움이 된다.

성장 호르몬 유전자(GH1)의 구조, 기능 또는 발현에 영향을 주는 병변이 있는 지를 확인하기 위하여 개체의 DNA를 분석하는 의학 유전학 분야에서, 전반적인 결실 또는 주요 돌연변이를 검출하는 것은 상대적으로 수월하다. 하지만, 상기 데이터에서 제시된 바와 같이, 개체는GH1프로모터 일배체형의 특징으로 인해 성장 호르몬을 과소-발현할 수 있다. 통상적인 유전자 분석을 이용하면, 주요 결실이나돌연변이를 보유하지 않는 개체는 성장 호르몬 발현에서 정상으로 간주된다. 하지만, 본원에서는 성장 호르몬 발현 및 결과적으로 신장에 영향을 주는 SNP의 조합을 명료하게 하였다. 이런 인식은 야생형과 돌연변이된 유전자의GH1발현에 민감하고 전반적인 유전자 결실과 관련된 증상이 분명하지 않은 개체를 비롯한 폭넓은 개체의 유전자 검사에서 정확한 GH 분석법을 산출하는데 이용할 수 있다.

도 1 은GH1프로모터에서 전사 개시 부위(화살표로 표시)에 상대적인 16개 SNP의 위치를 도시한다. 빗금으로 표시된 박스는 엑손 1을 나타낸다. 전사 인자, 핵 인자 1(NF1), Pit-1, 비타민 D 수용체(VDRE)에 대한 결합 부위, TATA 박스, 전시 개시 코돈(ATG)의 위치를 또한 도시한다.

도 2 는 야생형(일배체형 1)에 상대적인 40개GH1일배체형의 표준화 발현 수준을 도시한다. 현저하게 감소된 수준(일배체형 1과 비교하여)의 루시페라제 리포터 유전자 발현과 연관된 일배체형은 교차된 평행선으로 표시된 막대로 나타낸다. 현저하게 증가된 수준(일배체형 1과 비교하여)의 루시페라제 리포터 유전자 발현과 연관된 일배체형은 속이 차있는 막대로 나타낸다. 일배체형은 우세(prevalence)가 감소하는 순서로 정렬한다.

도 3 은 kSNP을 이용한 일배체형 분할과 연관된 표준화 발현 수준의 최소 상대적 잔류 편차 δ_R(Π_k,_min)을 도시한다(빗금으로 표시된 막대). 점으로 표시된 곡선은 최소-δ_R-분할 Π_k,_min을 보유하는 일배체형의 개수를 나타낸다.

도 4 는 6가지 선택된 SNP(번호 1, 6, 7, 9, 11, 14)를 이용한 순환 이진 일배체형 분할로 얻은GH1유전자 프로모터 발현의 회귀 나무를 도시한다. 노드에서 번호는 각각의 노드가 분리되는 SNP를 의미한다. 종단 노드는 정사각형으로 표시하고 좌에서 우로 번호를 지정한다.

도 5 는 154명의 백인 남성에서 8회이상 관찰되는 7가지 일배체형(원)을 연결하는 "축소된 정중 네트워크"를 도시한다. 각 원의 크기는 대조군 시료에서 개별 일배체형의 빈도에 비례한다. 일배체형 H12와 H23은 각각 5회와 2회만 관찰되지만, 연결 노도(connective node)로서 포함된다. 일배체형이 상이한 SNP는 각각의 가지를 따라 표시한다. 검은 점은 관찰되지 않은 일배체형, 또는 SNP 부위 4와 5에서 이중 돌연변이를 나타낸다.

도 6 은 전기이동도 변화(EMSA) 분석에 의해 확인된GH1프로모터 SNP 대립유전자간 단백질 결합 능력의 차이를 도시한다. 화살표는 대립유전자-특이적 상호작용 단백질을 표시한다. 쐐기모양은 Pit-1-유사 결합 단백질의 위치를 나타낸다. -ve(네거티브 대조군), +ve(파지티브 대조군), S(특이적 경쟁자), N(비-특이적 경쟁자), P(Pit-1 공통 서열), P^*(프롤락틴 유전자 Pit-1 결합 부위), TSS(전사 개시 부위).

따라서, 본원 발명은 개체에서 성장 호르몬 기능이상의 존재 또는 이에 대한 감수성을 진단하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:

a) 검사 개체로부터 성장 호르몬 유전자(GH1)의 근접 프로모터 영역을 인코딩하는 핵산 분자의 검사 시료를 수득하고;

b) 상기 핵산 분자는 복수의 SNP: 1, 6, 7, 9, 11, 14(표 1) 혹은 상응하는 이의 일배체형; 또는 이들과 연쇄불평형(linkage disequilibrium) 상태에 있는 다형성에 대하여 검사하고;

c) 복수의 상기 SNP 혹은 이들의 상응하는 일배체형, 또는 이들에 상응하는 다형성이 존재하면, 개체가 성장 호르몬 기능장애로 고생하거나 또는 이에 대한 감수성을 보이는 지를 확인한다.

본원 발명의 적절한 방법에서, 연쇄불평형 상태에 있는 다형성은 본원에서 밝힌 바와 같이, 상응하는 좌위 조절 영역의 1144 또는 1194에서 다형성이다.

본원 발명의 다른 측면에서, 개체에서 성장 호르몬 기능이상의 존재 또는 이에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:

b) 상기 핵산 분자는 표 1에서 번호 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 또는 29로 표시된 적어도 1개의 일배체형에 대하여 검사하고;

c) 상기 일배체형이 존재하면, 개체가 성장 호르몬 기능장애로 고생하거나 또는 이에 대한 감수성을 보이는 지를 확인한다.

이런 연구로부터, 이들 일배체형이 성장 호르몬 발현에서 감소를 주도하고, 따라서 성장 호르몬 기능이상을 초래한다는 결론이 도출되었다.

적절하게는, 본원 발명에 따른 진단 방법의 실행에는 통상적 방법을 활용하는데, 전형적으로 검사 개체의 핵산 분자를 검사하는 과정에는 증폭되는 핵산의 상보성 가닥과 혼성화되는 동일 프라이머 또는 프라이머 쌍의 증폭이 포함된다. 적합한 프라이머의 예는 하기에 제시한다:

GGG AGC CCC AGC AAT GC(GH1F); 또는

TGT AGG AAG TCT GGG GTG C(GH1R).

적절하게는, 프라이머는 통상적인 라벨, 예를 들면 방사성 라벨, 효소, 형광이나 화학발광 라벨, 또는 비오틴-아비딘 라벨을 이용하여 탐지할 수 있도록 표지한다.

가장 적절하게는, 프라이머는 엄격한 조건하에 핵산 분자와 혼성화한다. 이는 혼성화의 수준이 크로모좀 17q23에서 66 kb 클러스터내에 5가지 상동성 유전자를 구별할 수 있을 만큼 충분하다는 것을 의미한다. 일반적으로, 엄격한 혼성화를 뒷받침하는 세척 조건은 온도와 염 농도의 조합이 되는데, 변성 온도는 조사중인 핵산의 계산된 융점보다 5 내지 20℃ 정도 낮다.

본원 발명의 다른 측면에서, 본원 발명의 전술한 진단 방법을 실행하는데 적합한 키트를 제시하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:

a)GH1의 근접 프로모터 영역을 탐지 및/또는 증폭하기 위한 하기 프라이머중 적어도 하나:

GGG AGC CCC AGC AAT GC(GH1F); 또는

TGT AGG AAG TCT GGG GTG C(GH1R) 및 선택적으로

b) 환자 DNA의 원하는 영역을 증폭하는 PCR을 실행하는데 적합한 하나 또는 복수의 시약.

적절하게는, 본원 발명의 키트는 복수의 SNP: 1, 6, 7, 9, 11, 14에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본원 발명의 SNP와 일배체형은 성장 호르몬 기능이상의 치료를 위한 요법의 확인에 유용하다. 따라서, 전술한 SNP 및/또는 일배체형을 포함하는 한가지이상 성장 호르몬 유전자나 이의 일부의 적합한 세포 또는 세포주로의 삽입은 성장 호르몬 기능이상을 치료하는 약물을 확인하는데 유용한 도구를 제공한다.

본원 발명의 다른 측면에서GH1의 근접 프로모터 영역을 적어도 포함하는 벡터를 제시하는데, 여기서 상기 영역은 복수의 SNP: 1, 6, 7, 9, 11, 14를 포함한다.

본원 발명의 적절한 구체예에서, 상기 영역은 복수의 전술한 SNP, 가장 이상적으로는 6과 9; 10과 12; 또는 8과 11을 포함한다. 한가지 대립유전자에서 1개의 프로모터 일배체형내에서 뿐만 아니라 프로모터 일배체형 사이, 즉 다른 대립유전자에서 프로모터 일배체형 사이에도 상호작용(분할)이 존재한다. 게다가, 어느 정도의 부계 유래된 우성이 존재하는데, 부계 유래된 일배체형은 모계 유래된 일배체형보다 좀더 우세하다.

본원 발명의 다른 측면에서,GH1의 근접 프로모터 영역을 적어도 포함하는 벡터를 제시하는데, 여기서 상기 영역은 표 1에서 번호 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 혹은 29로 표시된 하나 또는 복수의 일배체형을 보유하는 것으로 특성화된다.

본원 발명의 다른 측면에서, 본원에서 밝힌 LCR 근접 프로모터 융합 구조체를 포함하는 벡터를 제시한다.

적절하게는, 이런 벡터는 원핵이나 진핵 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection)시키도록 개조되고, 프로모터 영역의 활성이 이를 활성화 또는 저해하는 약물에 반응하여 모니터될 수 있도록 담보하는 수단이 상기 벡터에 추가로 제공된다. 따라서, 상기 근접 프로모터 영역은 성장 호르몬 유전자(GH1)의 코딩 영역 또는 대안 유전자의 코딩 영역에 연결되는데, 여기서 성장 호르몬 유전자 또는 대안 유전자의 발현은 상응하는 프로모터의 활성을 모니터하는데 이용될 수 있다.

좀더 이상적으로는, 벡터에서 유전자는 발현 단백질 태그의 상류 또는 하류에서 발현되고, 예로써 이런 태그는 상기GH1코딩 영역 및 여기에 이웃한 태그의 발현이GH1의 근접 프로모터의 조절을 받는 녹색 형광 단백질이다.

본원 발명의 다른 측면에서, 성장 호르몬 유전자(GH1)의 복수 프로모터 및 가장 이상적으로는 성장 호르몬 유전자의 차별적인 복수 프로모터를 포함하는 벡터를 제시한다. 본원에서 "차별적"은 각 프로모터가 상이한 코딩 서열로 구성되고, 따라서 상이한 유형의 SNP 및 일배체형을 보유하는 것을 의미한다. 이런 배열에서 각 프로모터는 상이한 DNA 서열에 연결되고, 여기서 상기 프로모터 활성은 상이한 유전자의 발현에 의해 모니터될 수 있고, 대안으로 동일한 코딩 서열이 사용되지만 상이한 태그가 제공되고, 여기서 동일한 유전자의 발현은 상이한 태그에 의해 특이적으로 모니터될 수 있다.

이상적으로, 본원 발명의 이들 벡터는 숙주 세포를 형질전환하는데 사용되고, 상기 숙주 세포는 성장 호르몬 기능이상을 치료하는데 효과적인 약물의 스크리닝에 사용될 수 있다. 바람직한 세포에는 박테리아, 효모, 진균, 곤충 세포 또는 포유동물 세포가 포함되고, 가장 바람직하게는 영속화된 세포, 예를 들면 영속화된 사람 세포주이다. 대안으로, 쥐 세포를 사용할 수도 있다.

본원 발명의 다른 측면에서, 본원 발명의 벡터로 형질전환된 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 제시한다.

본원 발명의 다른 측면에서,GH1프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 분자를 발현하도록 조작된 재조합 세포주를 제시하는데, 상기 프로모터는 표 1에 도시된 복수의 SNP: 1, 6, 7, 9, 11 혹은 14 및/또는 하나 또는 복수의 일배체형:3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 혹은 29를 포함한다.

본원 발명의 다른 측면에서, 복수의 SNP: 1, 6, 7, 9, 11 혹은 14를 보유하는 GH1 프로모터로 인하여 및/또는 일배체형: 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 혹은 29중 한가지로 특성화되는 프로모터로 인하여, 성장 호르몬을 과소-발현하는 외래유전자도입된 사람-제외 동물을 제시한다.

본원 발명의 적절한 외래유전자도입된 사람-제외 동물에서, 상기 프로모터는 일배체형 23 또는 27로 특성화되고 각각 "낮은 발현 프로모터 일배체형" 및 "높은 발현 프로모터 일배체형"이라 한다. 이들 두 일배체형은 상기 동물의 성장 패턴에 대한 후보 약물의 효과를 비교 및 대조하는데 효과적으로 이용될 수 있다. 이에 덧붙여, 표 1에 기재된 일배체형 H1은 "정상 발현 프로모터 일배체형"으로 간편하게 이용할 수 있다.

본원 발명의 적절한 구체예에서, 상기 프로모터는 일배체형 AGGGGTTAT-ATGGAG로 특징지어지는 극대 발현 프로모터 일배체형, 또는 AG-TTGTGGGACCACT와 AG-TTTTGGGGCCACT로 특성화되는 극소 발현 프로모터 일배체형으로 인공적으로 가공된다.

본원 발명의 다른 측면에서, 성장 호르몬 기능이상을 치료하는데 이용할 수 있는 치료요법적 활성 약물의 스크리닝 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본원 발명의 세포 또는 세포주를 후보 약물에 노출시키고, 이후 후보 약물이 성장 호르몬 유전자의 프로모터 영역의 활성 및 세포주의 경우에 리포터 분자의 발현에 영향을 주는 지를 확인하는 단계로 구성된다.

본원 발명의 다른 측면에서, 성장 호르몬 기능이상을 치료하는데 이용할 수 있는 치료요법적 활성 약물의 스크리닝 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본원 발명의 외래유전자도입된 사람-제외 동물을 후보 약물에 노출시키고, 이후 상기 동물의 성장을 모니터하는 단계로 구성되고, 동물 성장의 측면에서 후보 약물이 긍정적인 효과를 보이면 이런 성장이 상기 후보 약물의 치료요법적 활성을 암시하는 것으로 결론짓는다.

전술한 긍정적인 효과에 대한 기준은 일반적으로 성장을 촉진하는 능력을 의미하지만, 높은 발현 프로모터가 사용되는 특정 환경에서 성장에 영향을 주는 능력에는 성장을 저해하는 능력이 포함될 수 있다.

본원 발명은 하기의 재료와 방법 섹션을 참고로 하여 예시한다.

사람 피험자

DNA 시료는 신장에 상관없이 154명의 영국군 백인 신병으로부터 취한 림프구로부터 구하였다. 신장 데이터는 이들 피험자중 124명으로부터 입수할 수 있었는데(평균, 1.76±0.07 m), 신장 분포는 정상이었다(Shapoiro-Wilk 통계치 W=0.984, p=0.16). 이들 연구는 지역 Multi-Regional Ethics Committee로부터 승인을 받았다.

중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭

3.2 kbGH1유전자-특이적 단편의 PCR 증폭은 올리고뉴클레오티드 프라이머 GH1F(5' GGGAGCCCCAGCAATGC 3';-615 내지 -599)와 GH1R(5' TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3'; 2598 내지 2616)[+1의 전사 개시 부위에 상대적인번호지정(numbering)(GenBank Accession No. JO3071)]을 이용하여 실시하였다.GH1LCR의 부위 I과 II를 보유하는 1.9 kb 단편은 LCR5A(5' CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3'; -315 내지 -334)와 LCR3.0(5' CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3'; 1589 내지 1698)[LCR 서열은 GenBank(Accession No. AC005803)로부터 구하였고, LCR 번호지정은 Jin et al. 1999를 따른다; GenBank(Accession No. AF010280)]. 양 반응에 대한 조건은 동일하다; 간단히 말하면, 200ng 림프구 DNA는 98℃ 2분; 95℃ 3분; 30회 사이클의 95℃ 30초, 64℃ 30초, 68℃ 1분으로 Expand^TM고성능 시스템(Roche)을 이용하여 증폭한다. 후반 20회 사이클에서, 68℃ 신장 단계는 사이클당 5초씩 증가시킨다. 이후, 68℃에서 7분동안 추가로 배양한다.

클로닝과 서열분석

처음에, PCR 산물은 클로닝없이 직접 서열분석한다.GH1유전자의 근접 프로모터 영역은 프라이머 GH1S1(5' GTGGTCAGTGTTGGAACTGC 3': -556 내지 -537)을 이용하여 3.2 kbGH1-특이적 PCR 단편으로부터 서열분석한다. 1.9 kbGH1LCR 단편은 프라이머 LCR5.0(5' CCTGTCACCTGAGGATGGG 3'; 993 내지 1011), LCR3.1(5' TGTGTTGCCTGGACCCTG 3'; 1093 내지 1110), LCR3.2(5' CAGGAGGCCTCACAAGCC 3'; 628 내지 645), LCR3.3(5' ATGCATCAGGGCAATCGC 3'; 211 내지 228)을 이용하여 서열분석한다. 서열분석은 BigDye v2.0(Applied Biosystems)과 ABI Prism 377이나 3100 DNA 서열분석장치로 실행한다. 프로모터 영역 또는 LCR 변이체에 대한 이형접합체의 경우에, 적합한 단편은 서열분석에 앞서 pGEM-T(Promega)에 클론한다.

루시페라제 리포터 유전자 발현 벡터의 작제

40개의 상이한GH1근접 프로모터 일배체형(표 1)의 개별 실례는 일배체형의 +59 위치에서 염기에 따라, 프라이머 GHPROM5(5'AGATCTGACCCAGGAGTCCTCAGC 3'; -520 내지 -501) 및 GHPROM3A(5'AAGCTTGCAGCTAGGTGAGCTGTC 3'; 44 내지 62) 또는 GHPROM3C(5'AAGCTTGCCGCTAGGTGAGCTGTC 3'; 44 내지 62)를 이용하여 582 bp 단편으로 증폭한다. 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 모든 프라이머는 5' 말단(위에 밑줄로 표시된 부분)에 부분적인 또는 완전한 비-주형된 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 보유한다;Bg/II(GHPROM5)와HindIII(GHPROM3A와 GHPROM3C). 이후, PCR 단편은 pGEM-T에 클론한다. 플라스미드 DNA는 먼저HindIII(New England Biolabs)로 절단하고 5' 오버행(overhang)은 녹두 뉴클레아제(New England Biolabs)로 제거한다. 이후, 프로모터 단편은Bg/II(New England Biolabs)로 절단하고 겔 정제한다. 제한된 프로모터 단편은 루시페라제 리포터 유전자 벡터 GL3 Basic에 클론한다. 플라스미드 DNA(pGL3GH 시리즈)는 분리하고(Qiagen midiprep 시스템) 프라이머 RV3(5' CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3'; 4760 내지 4779), GH1SEQ1(5' CCACTCAGGGTCCTGTG 3'; 27 내지 43), LUCSEQ1(5' CTGGATCTACTGGTCTGC 3; 683 내지 700), LUCSEQ2(5' GACGAACACTTCTTCATCG 3'; 1372 내지 1390)로 서열분석하여,GH1프로모터와 루시페라제 유전자 서열이 정확하도록 담보한다. 절두된GH1근접 프로모터 구조체(-288 내지 +62) 역시Ncol과Bg/II로 pGL3GH1(일배체형 1)을 제한하고, 이후 평활-말단화/재결찰로 SNP 부위 1-5를 제거한다.

인공의 근접 프로모터 일배체형 리포터 유전자 구조체는 특정부위-돌연변이유발(SDM)[Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)]로 예상 극대 일배체형(AGGGGTTAT-ATGGAG)과 극소 일배체형(AG-TTGTGGGACCACT와 AG-TTTTGGGGCCACT)을 만들었다.

LCR-근접 프로모터 융합 구조체를 만들기 위하여, 1.9 kb LCR 단편은Bg/II로 제한하고, 생성된 1.6 kb 단편은 pGL3에서 582 bp 프로모터 단편의 바로 상류에Bg/II 부위로 클론한다. 3가지 상이한 LCR 일배체형은 pGL3 Basic에서, 각각 "높은 발현 프로모터 일배체형"(H27), "낮은 발현 프로모터 일배체형"(H23), "정상 발현 프로모터 일배체형"(H1)을 보유하는 3가지GH1근접 프로모터 구조체중 한가지의 5'에 클론하여 총 9개의 상이한 LCR-GH1근접 프로모터 구조체(pGL3GHLCR)를 작제한다. 이후, 플라스미드 DNA는 분리하고(Qiagen midiprep), 서열은 적합한 프라이머로 검사한다.

루시페라제 리포터 유전자 분석

성장 호르몬을 발현하는 사람 뇌하수체 세포주의 부재하에, 쥐 GC 뇌하수체 세포(Bancroft 1973; Bodner and Karin 1989)는 시험관내 발현 검사를 위하여 선별하였다. 쥐 GC 세포는 15% 말 혈청과 2.5% 우태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시킨다. 사람 HeLa 세포는 5% 우태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시킨다. 양 세포주는 5% CO₂, 37℃에서 성장시킨다. GC 세포와 HeLa 세포의 리포좀-매개된 트랜스펙션은 96-웰 평판에서 Tfx^TM-20(Promega)을 이용하여 실행한다. 합류(confluent) 세포는 배양 플라스크로부터 이전하고 새로운 배지로 희석하며 96웰 평판에 도말하여 익일에 ~80% 수준으로 합류되도록 한다.

트랜스펙션 혼합물은 웰당 총 90㎕ 부피로 혈청-없음 배지, 250 ng pGL3GH이나 pGL3GHLCR 구조체, 2 ng pRL-CMV, 0.5 ㎕ Tfx^TM-20 시약(Promega)을 함유한다. 1시간후, 각 웰에 200 ㎕ 완전 배지를 첨가한다. 트랜스펙션이후, 세포는 5% CO₂, 37℃에서 24시간동안 배양하고, 후속으로 리포터 분석을 위하여 용해시킨다.

루시페라제 분석은 Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)으로 실행한다. 분석은 마이크로평판 발광분석기(Luminometer, Applied Biosystems)에서 실행하고, 이후 Renilla 활성에 대하여 표준화시킨다. 각 구조체는 평판당 6개의 사본으로 3가지 개별 평판에서 분석한다(즉, 총 18개의 독립된 측정). 근접 프로모터 분석을 위하여, 각 평판은 네거티브(프로모터없는 pGL3 Basic)와 파지티브(SV40 프로모터-보유 pGL3) 대조군을 포함한다. LCR 분석을 위하여, 근접 프로모터는 보유하지만 LCR이 결핍되는 구조체를 네거티브 대조군으로 이용한다.

전기이동도 변화 분석(EMSA)

EMSA는 16가지 모든 SNP 부위를 커버하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에서 실시한다(참조: 온라인 보충 자료). GC와 HeLa 세포로부터 핵 추출물은 Berg et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 준비한다. 올리고뉴클레오티드는 [γ-³³P]-dATP로 방사성표지하고 겔 전기영동후 자가방사법으로 검출한다. EMSA 반응물은 10 ㎕의 최종 부피로, 20 mM Hepes, pH 7.9, 4% 글리세롤, 1 mM MgCl₂, 0.5 mM DTT, 50 mMKCl, 1.2 ㎍ HeLa 세포나 GC 세포 핵 추출물, 0.4 ㎍ 폴리[dl-dC]ㆍ폴리[dl-dC], 0.4 pM 방사성표지된 올리고뉴클레오티드, 40 pM 표지되지 않은 경쟁 올리고뉴클레오티드(100-배 과량)를 함유한다. EMSA 반응물은 얼음에서 60분동안 배양하고 자가방사법에 앞서 4% PAGE 겔에서 100V로 45분동안 전기영동한다. 각 반응에서, 이중 가닥의 표지되지 않은 검사 올리고뉴클레오티드는 특이적 경쟁자로 이용되고,NF1유전자 프로모터(5' CCCCGGCCGTGGAAAGGATCCCAC 3')로부터 유래된 올리고뉴클레오티드는 비-특이적 경쟁자로 이용된다. 사람 프롤락틴(PRL) 유전자 Pit-1 결합 부위(5' TCATTATATTCATGAAGAT 3')와 Pit-1 공통 결합 부위(5' TGTCTTCCTGAATATGAATAAGAAATA-3')에 상응하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 SNP 8 부위에 결합하는 단백질에 대한 특이적 경쟁자로 이용된다.

프라이머 신장 분석

프라이머 신장 분석은 상이한 SNP 일배체형을 보유하는 구조체가 동일한 전사 개시 부위를 이용하는 지를 확인하기 위하여 실행한다. 프라이머 신장은 Triezenberg et al.(1992)의 방법을 따른다.

데이터 표준화

네거티브 대조군(프로모터없는 pGL3 Basic)에 대한 발현 측정값은 평판간에 현저한 변이를 보였다. 기저수준 발현과 평판 효과에 대하여 데이터를 보정하기 위하여, 임의의 평판에서 네거티브 대조군의 평균 활성은 동일한 평판에서 모든 다른 활성 값으로부터 감한다. 이후, 각 평판에서 야생형 근접 프로모터 일배체형 1(H1)에 대한 평균(평판-보정된) 활성을 계산하고, 동일한 평판에서 모든 다른 일배체형-관련된 활성을 이 값으로 나눈다. 이들 2가지 변환은 평균 네거티브 대조군 활성이 0으로 동등하고 H1의 평균 활성이 평판 수에 무관하게 통일되도록 담보한다. 따라서, 결과의 활성 값은 H1에 대한 상대적 변화(fold change)로 해석하고 기저수준과 평판 효과 모두에 대하여 보정될 수 있다. 변환이후에는 현저한 평판 효과가 관찰되지 않기 때문에, 평판과 관련된 데이터는 통합한다. LCR-프로모터 융합 구조체 발현 데이터 역시 일배체형 A를 참고 일배체형으로 하여 유사한 과정을 따른다.

통계학적 분석

근접 프로모터 일배체형의 표준화 발현 수준은 SAS 통계 분석 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary NC, USA)의 UNIVARIATE 과정에서 실행되는 바와 같이, Shapiro-Wilk 통계치(W)를 활용하여 가우스 분포(Gaussian distribution)에 대한 적합도(goodness-of-fit)를 검정하였다. 유의성 평가는 P_practcal= 0.05/400.001 설정으로 다중(즉, 40-배) 검정을 위하여 조정되었다. 이런 기준을 이용한 2가지 프로모터 일배체형의 발현 수준은 가우스 분포와 현저하게 상이한 것으로 밝혀졌다, 다시 말하면 H21(W=0.727, p=0.0002)과 H40(w=0.758, p=0.0004). 다른 38개의 일배체형에서 발현 수준은 일정한 정상 상태로 간주되고, 따라서 Tukey 스튜던트화 범위 검증(SAS 과정 GLM)을 이용한 쌍별 비교를 실시하였다. 상이한 일배체형 군간 발현 수준의 쌍별 비교는 윌콕슨 순위합 통계치(SAS 과정 NPAR1WAY)의 정규 근사 x를 이용하여 실시한다.

SNP간의 상관관계를 공식적으로 평가하고 추가적인 연구에 적합한 주요 다형성의 부분집합을 동정하기 위하여, 일배체형 분할직후에 근접 프로모터 SNP의 모든 가능 부분집합에서 잔류 편차를 계산한다.

포인트 데이터 세트: X₁...., X_m의 정해진 분할{1...m}=Π=π₁U...Uπ_k및 π(i)=j if I∈π_j에서, Π의 잔류 편차 δ는 다음과 같이 정의한다:

데이터 세트가 분할되지 않으면, δ=δ(Π₀)=421.7이고 임의의 다른 분할 Π의 상대적 잔류 편차는 δR(Π)=δ(Π)/δ(Π₀)으로 정의한다.

6가지 SNP(번호 1,6,7,9,11,14; 하기 참조)는 상대적으로 적은 일배체형 변이를 유발하는 동시에 발현 수준에서 잔류 편차의 상당 부분(~60%)을 차지하는 것으로 확인되었다. 이들 SNP의 통계학적 상호의존성은 통계 소프트웨어 R(Ihaka and Gentleman 1996)을 이용한 회귀 나무(regression tree)로 작성된 순환 이진 분할(recursive binary partitioning)로 추가 분석하였다. 트리 작성 과정동안, SNP는 반응 변수(즉, 표준화된 근접 프로모터 발현)에 대하여 일배체형의 가장 상동한 2가지의 부분집합을 선별하기 위한 각 노드(node)에서 예측 변수(predictor variable)로 이용된다. 새로운 스플릿(split)을 도입하는 역할을 하는 상기 노드와 SNP는 결과적인 중간단계 나무의 종단 노드에 의해 정의된 바와 같이 분할을 위한 δ_R이 최소화되도록 선택된다. 이런 과정은 모든 종단 노드가 개별 일배체형에상응할 때까지 지속한다('완전 성장 나무'). δ_R추정값의 신뢰도(reliability)는 10배 교차 확인(cross-validation)으로 각 단계에서 평가하고, 표준 오차(SE)를 계산한다.

신장 및 시험관내에서 근접 프로모터 발현 수준의 회귀 분석은 SAS 소프트웨어 패키지의 REG 과정을 활용하여, 신장이 확인된 124명의 개체에서 실시한다. μ_nor,h1과 μ_nor,h2는 임의의 개체가 보유한 2가지 일배체형의 평균 표준화 발현 수준을 의미한다. H1에 대하여 동형접합체가 아닌 개체(n=109)의 신장은 다음과 같이 모델하고:

측정 계수 r²를 계산한다.

축소된 정중 네트워크(Bandelt et al., 1995)는 154명의 연구 개체에서 8회 이상 관찰되는 7가지 프로모터 일배체형(H1-H7)에 대하여 작성한다.

연쇄 불평형 분석

프로모터 SNP간 및 개별 SNP와 LCR 일배체형간 연쇄 불평형(LD)은 Morton et al.(2001)에 의해 이중대립유전자 좌위에 대하여 고안된 파리미터 ρ를 이용하여, 총 154명의 연구 군에서 무작위로 선택된 100명의 개체에서 평가하였다. ρ=1은 완전한 LD를 보이는 2개의 좌위에 대등한 반면, ρ=0은 LD의 완전한 부재를 시사한다. 단지 8개의 SNP만 산입(inclusion)을 담보할 만큼 개체군 시료에서 충분히 다형성인 것으로 밝혀졌다(이형접합성≥5%). SNP5는 SNP4와의 완벽한 LD로 인해 배제되었다(유일하게 존재하는 2개의 쌍별 일배체형). LD 분석에 필요한 통합 LCR-근접 프로모터 일배체형 빈도의 최대 가능 추정치는 예상 최대(EM) 알고리즘의 인-하우스(in-house) 실행으로 얻었다.

결과

근접 프로모터 일배체형과 상대적 프로모터 강도

40개의 프로모터 일배체형은 시험관내 리포터 유전자 분석으로 조사하였는데, 쥐 뇌하수체 세포에서 루시페라제 유전자 발현을 유도하는 능력의 측면에서 상이한 것으로 밝혀졌다(표 3). 발현 수준은 야생형과 최대 발현 일배체형(번호 27) 발현 수준의 30% 수준으로 평균 수준을 보이는 최소 발현 일배체형(번호 17)에서 12-배 범위에서 변화되는 것으로 밝혀졌다(표 3). 12가지 일배체형(번호 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26, 29)은 H1과 비교하여 현저하게 감소된 수준의 루시페라제 리포터 유전자 발현과 연관하였다. 반대로, 총 10개의 일배체형(번호 14, 20, 27, 30, 34, 36, 37, 38, 39, 40)은 H1과 비교하여 현저하게 증가된 수준의 루시페라제 리포터 유전자 발현과 연관하였다(표 3). 프라이머 신장 분석에서 상이한 SNP 일배체형을 보유하는 구조체가 동일한 전사 개시 부위를 이용하는 것으로 밝혀졌다. 리포터 유전자 구조체의 발현은 GC 세포에서보다 HeLa 세포에서 1000-배 더 낮은 것으로 밝혀졌다.

40개의 상이한 GH1 프로모터 일배체형의 시험관내 발현 수준은 도 2에 도표로 나타낸다. 시험관내 발현은 높은 발현 일배체형에서보다 낮은 발현 일배체형에서 좀더 빈번하게 진행된다(Wilcoxon ρ<0.01). 이런 발견 결과는 선택(selection) 작용을 시사하기 때문에, 개별 SNP 수준에서 선택 효과를 조사하였다. 여기서 조사된 15개의 SNP에서, 평균 발현 수준(일배체형 빈도로 가중됨) 및 대조군에서 좀더 드문 대립유전자의 빈도는 양의 상관관계를 보였다(Sperman 등급 상관계수, r=0.32, 단측 ρ<0.10). 명백한 이상치(outlier)로 인해 SNP 7을 배제하면(이는 좀더 희소한 대립유전자와 연관된 특별히 높은 발현 수준을 보인다), r=0.53, 단측 ρ<0.05이다.

개별 SNP와 관련된 발현 수준은 강하게 상호의존하는 것으로 밝혀졌다. 시험관내 발현 수준에서 관찰된 변이에 불평형적으로 기여하는 핵심 다형성 부위의 부분집합을 이런 방식으로 동정하기 위하여 발현 데이터의 분할을 시도하였다. 16가지 모든 SNP로 구성되는 완전 일배체형에 의한 분할은 δ_R(Π₁₆)=0.245의 상대 잔류 편차를 결과하였다. 이는 일배체형에서 변이에 의해 해명되지 않는 발현 수준에서 24.5% 변이의 측면에서 해석될 수 있다. 1≤k ≤16에서, 최소-δ_R-분할 Π_{k, min}은 가장 적은 상대 잔류 편차 δ_R을 결과하는 kSNP를 이용한 일배체형 분할로 정의되었다. Π_{k, min}을 보유하는 일배체형의 개수와 함께, k와 δ_R(Π_{k, min})간 상관관계는 도 3에 도시한다. 정성적 차이는 k=6과 k=7 사이에 명확한데, 여기서 Π_{k, min}과 관련된 일배체형의 개수는 13에서 22로 증가하는 반면 δ_R(Π_{k, min})은 약간 감소하였다[δ_R(Π_{6, min})=0.397 vs δ_R(Π_{7, min})=0.371]. 따라서, Π_{6, min}을 정의하는 SNP1, 6, 7, 9, 11, 14는 추가 분석을 위한 핵심 다형성의 최적 선택이라는 결론이 도출되었다. 나머지 SNP 중에서, 6개(번호 3, 4, 8, 10, 12, 16)는 "약간의 정보만 제공하는" 것으로 분류되었다. 6개의 핵심 SNP와 조합된 이들 마커는 관찰된 40개의 일배체형중에서 39개를 정의하고 거의 모든 해석가능 편차(δ_R(Π_{12, min})=0.245)의 원인이 된다. 다른 4개의 SNP(번호 2, 5, 13, 15)는 표준화된 시험관내 발현 수준과 관련된 정보를 제공하지 않는데, 그 이유는 이들이 시료에서 단일다형성이거나(번호 2), 또는 다른 마커와 완전한(번호 5와 13) 혹은 거의 완전한(번호 15) 연쇄 불평형 상태에 있기 때문이다.

이후, 6개의 핵심 SNP의 상관 구조는 일련의 연속적으로 증가하는(즉, 중첩된) 회귀 나무를 이용하여 평가한다. 회귀 나무 분석(Therneau and Atkinson 1997)의 규칙에 따라, 완전히 자란 나무의 SE중 한가지 SE에서 교차 확인된 δ_R을 갖는 최소 중간단계 나무가 대표 분할로 선택되었다. '최적' 나무는 10개의 내부 노드와 11개의 종단 노드로 구성되었다(도 4, 표 4). 이런 나무의 상대 잔류 편차는 δ_R=0.398에 필적하고, 따라서 일배체형 분할로 해석가능한 편차의 (1-0.397)/(1-0.245)80%를 차지한다

가장 중요한 단일 스플릿(split)은 해석가능 편차의 15%를 차지하는 SNP 7에 의한다. 이 SNP의 C 대립유전자를 보유하는 4가지 일배체형은 H1에서보다 1.8배 더 높은 평균 표준화 발현 수준을 갖는 상동성 부분군(종단 노드 11)을 정의한다. SNP 7의 T 대립유전자를 보유하는 일배체형은 SNP 9에 의해 추가로 세분되는데, 이런 다형성의 대립유전자 T는 대립유전자 G(μ_nor=0.84; Wilcoxon z=7.09, ρ<0.001)보다 좀더 높은 발현(μ_nor=1.26)을 유도한다. 결과의 nnTTnn 일배체형은 SNP 6(G/T)에 의해 분리되고, nGTTnn은 야생형 일배체형 H1을 포함하는 종단 노드(종단 노드 8)를 형성한다. 흥미롭게도, SNP 11에 의해 세분된 nTTTnn 일배체형은 발현 수준에서 현저한 차이를 보였다. 일배체형 nTTTGn(종단 노드 9)은 낮은 발현자이고(μ_nor=0.64), 반면 nTTTAn(종단 노드 10)은 최대 평균 발현을 보였다(μ_nor=3.89; Wilcoxon z=5.11, ρ<0.001).

SNP 7과 9에 대한 일배체형 nnTGnn은 SNP 14와 1에 의해 세분되는데, 결과적인 3가지 일배체형은 종단 노드(종단 노도 1, 6, 7)를 형성하였다. 4번째 일배체형, GnTGnA는 SNP 11과 6에 의해 추가로 분리되는 중간 발현자(μ_nor=0.86)이다. 흥미롭게도, SNP 14와 1의 한가지 특정 조합만 SNP 7과 9 nnTGnn 배경에서 증가된 발현을 결과하였다(AnTGnG, 종단 노드 7, μ_nor=1.83). 또한, 일배체형 GnTGnA에서 고려하는 경우에 발현에 대한 유사한 비-부가적 효과가 SNP 6과 11에서 나타났다: 반면, SNP 11 대립유전자 A는 SNP 6 대립유전자 T와 결합하는 경우에 G보다 좀더 높은 발현과 연관하는데(GTTGAA, 종단 노드 5, μ_nor=1.18 vs GTTGGA, 종단 노드 2, μ_nor=0.74; Wilcoxon z=7.09, ρ<0.001), 이는 SNP 대립유전자 G와 결합되는 반대의 상황에도 유효하다(GGTGAA, 종단 노드 4, μ_nor=0.74 vs GGTGGA, 종단 노드 3,μ_nor=1.04; Wilcoxon z=5.28, ρ<0.001).

일배체형 다양성의 진화

본 연구에서 다형성으로 확인된 15가지GH1유전자 프로모터 SNP중에서, 14개 위치에서 양자택일적 대립유전자가 유전자 전환에 의해 잠재적으로 해석가능한데, 그 이유는 이들 대립유전자가 4가지 파라로거스 사람 유전자중 적어도 하나에서 유사한 위치의 대립유전자와 일치하기 때문이다(표 2). 10가지 다른 포유동물의 오쏘로거스 GH 유전자 프로모터 서열과의 비교에서, 사람GH1유전자에서 뉴클레오티드 위치 -75, -57, -31, -6, +3, +16, +25(SNP 8-15에 상응)에서 가장 빈번한 대립유전자가 포유동물 진화동안 엄격하게 보존되는 것으로 나타났다(Krawczak et al., 1999). 흥미롭게도, 사람GH1유전자의 -1 위치(SNP 12)에서 3가지 양자택일적 대립유전자중 가장 드물게 나타나는 대립유전자는 포유동물 오쏘로거스에서 엄격하게 보존된 대립유전자와 일치하였다.

'축소된 정중 네트워크'(도 5)에서, 야생형 일배체형 H1이 단일 돌연변이 현상에 의해 다른 빈번한 일배체형과 직접적으로 연결되지 않는 것으로 나타났다. 두 번째로 흔한 일배체형인 H2는 H23과 H12를 통하여 H1에 연결되고, 세 번째로 흔한 일배체형인 H3은 아직 관찰되지 않은 일배체형 또는 이중 돌연변이를 통하여 H1에 연결된다. 추가의 일배체형을 통합하기 위한 이런 네트워크의 확대는 일배체형당 적은 회수의 관찰(결과)로 인해 신뢰성이 없는 것으로 간주되었다. 게다가, 이런 네트워크의 확대는 다중의 단일 염기쌍 치환의 도입을 필연적으로 수반하였다.이들은 기존의 일배체형간 유전자 전환과 구별되지 않기 때문에, 네트워크에서 결과적인 거리가 진정한 진화적 상관관계를 반영하지 못할 가능성이 높다. 하지만, 이는 도 5에 도시된 가장 빈번한 7가지 일배체형을 연결하는 네트워크의 전형적인 사례라고 추정할 수는 있는데, 그 이유는 각 돌연변이가 1회만 일어나기 때문이다.

물리적 거리에 따른 연쇄 불평형(LD)의 전반적인 감소는 일부를 제외하고 대부분의 SNP에서 나타난다(표 5). 따라서, SNP 9는 모든 다른 근접 프로모터 SNP와 상대적으로 약한 LD를 보였던 SNP 16을 비롯하여 다른 SNP에 강한 LD를 보였다. 이런 발견 결과는 SNP의 기원이 상대적으로 최근이라는 것을 암시한다. 하지만, SNP 10은 SNP 12에 완전한 LD를 보이지만 SNP 11(ρ=0.381)에는 그렇지 않고, 반면 SNP 8은 SNP 10보다는 SNP 11에 좀더 강한 LD를 보였다(ρ=0.925 vs ρ=0.687). 이들 발견 결과는 근접 프로모터 SNP 사이에서 LD의 패턴이 거리에 따른 재조합적 감소에 의해서만 일어나는 것이 아니고 다른 기전, 예를 들면 재현성 돌연변이, 유전자 전환 또는 선택의 작용을 반영할 가능성이 높다는 것을 시사한다.

극대와 극소 일배체형의 예상과 기능 검사

일배체형-의존성 근접 프로모터 발현 데이터에서 얻은 '최적' 회귀 나무에 기초하여, 발현의 수준 측면에서 잠재적인 "극대"와 "극소" 일배체형의 예측을 시도하였다. 이를 위하여, 6가지 핵심 SNP의 대립유전자는 나무의 적절한 종단 노드의 평균 발현 수준을 고려하여 선택하였다. 나머지 SNP의 대립유전자는 개별 SNP의 발현을 각각 최대화 또는 최소화시키기 위하여 측정하였다. 예상 극대 일배체형의 경우에, SNP 6, 7, 9, 11의 대립유전자는 종단 노드 10에 위치하고, 반면 SNP1과 14의 대립유전자는 종단 노드 7에 위치하였다. 극소 일배체형은 종단 노드 1을 나타내기 위하여 선택되었다(SNP 1, 7, 9, 14의 경우). 하지만, SNP 6과 11에 대한 대립유전자의 최적 선택은 다소 애매한데, 그 이유는 종단 노드 2(암시 대립유전자 T, G)와 4(암시 대립유전자 G, A)에서 상대적으로 낮은 평균 발현 수준이 예측되었기 때문이다. 이런 이유로, 시험관내 검사를 위한 양 구조체를 작제하기로 결정하였다. 나머지 SNP에 대한 가설적 일배체형의 완결은 극대 일배체형 AGGGGTTAT-ATGGAG 및 극소 일배체형 AGTTGTGGGACCACT와 AG-TTTTGGGGCCACT를 결과하였다.

이후, 이들 3가지 인공 일배체형은 작제하고 쥐 뇌하수체 세포에서 발현시켰는데, 야생형(일배체형 1)과 비교하여 각각 145±4, 55±5, 20±8%의 발현 수준을 유도하였다.

이동도 변화(EMSA) 분석에 의해 드러난 SNP 대립유전자간 차이

EMSA는 쥐 뇌하수체 세포를 핵단백질 공급원으로 하여, 모든 대립유전자 변이체에 대한 모든 근접 프로모터 SNP 부위에서 실시하였다. 단백질 상호작용 밴드는 -168, -75, -57, -31, -6/-1/+3, +16/+25 부위에서 관찰되었다. 단백질 상호작용 밴드의 수에서 대립유전자간 차이는 -75(SNP 8), -57(SNP 9), -31(SNP 10), -6/-1/+3(SNP 11, 12, 13), +16/+25(SNP 14, 15) 부위에서 나타났다[도 6; 표 6]. 후자의 2가지 부위에서, 특정 SNP 대립유전자 조합에 대한 EMSA 분석은 상이한 단백질 결합이 각각 SNP 12와 15에서 대립유전자 변이의 원인이 된다는 것을 암시하였다(표 6). HeLa 세포 추출물을 이용하여 이런 분석을 반복하는 경우에, -57 위치만 G 대립유전자에 대해서 단백질 상호작용의 증거를 분명하게 보이고 T 대립유전자에 대해서는 그렇지 않았다. 2개의 상이한 Pit-1 결합 부위에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 이용한 경합 실험의 결과는 2개의 SNP 8 상호작용 단백질중 한가지가 Pit-1일 때의 결과와 일치하였다(도 6). 하지만, 대립유전자-특이적 단백질 상호작용은 아무런 영향을 받지 않았는데, 이는 관련된 다른 단백질이 Pit-1이 아니라는 것을 의미한다.

시험관내에서 프로모터 일배체형 발현과 생체내 신장(stature)간의 연관

124명의 백인 남성에서GH1근접 프로모터의 시험관내 일배체형-특이적 시험관내 발현과 성인 신장을 연관시키는 시도를 하였다. 각 일배체형은 표준화된 시험관내 발현 데이터(표 3)로부터 평균 발현값을 구하고, 각 개체에 대하여 2가지 일배체형의 평균 Ax=(μ_nor.h1+ μ_nor,h2)을 계산하였다. H1에 대한 상동접합성 개체는 분석에서 제외하였는데, 그 이유는 이들의 Ax 값(1.0)이 인과적 변이에 기여하지 않기 때문이다. 여기에서 적합한 유전형을 갖고 신장이 알려진 109명의 시료가 산출되었다(표 7). 평균(1.765 m) 위아래의 신장과 평균(0.9) 위아래의 Ax 값의 비교에서, 신장과GH1근접 프로모터 일배체형-관련된 시험관내 발현간 연관의 증거가 드러났다(X²=4.846, 1 d.f., ρ=0.028). 하지만, 2항식을 이용한 회귀 분석에서 2가지 μ_nor값은 상대적으로 불량한 신장 예측변수(predictor)라는 것이 입증되었다. 측정 계수가 r²=0.033(ρ>0.5)이었다는 점에서, 신장에서 대략 3.3%의 변이는 시험관내에서GH1유전자 근접 프로모터 일배체형 발현에 기인한다고 결론내릴 수 있다.

좌위 조절 영역(LCR) 다형성 및 근접 프로모터 강도

연구 군으로부터 무작위로 선택된 100명의 개체에 대한 심사에서 3가지의 새로운 다형성 변화가GH1LCR의 부위 I과 II(GH1유전자의 뇌하수체-특이적 발현에 필요; Jin et al., 1999)에서 발견되었다. 이들은 뉴클레오티드 위치 990(G/A; 0.90/0.10), 1144(A/C; 0.65/0.35), 1194(C/T; 0.650/0.35)[Jine et al. 1999에 따른 번호지정]에 위치하였다. 1144와 1194에서 다형성은 완전 연쇄 불평형 상태에 있었고, 3가지의 상이한 일배체형이 관찰되었다: 일배체형 A(990G, 1144A, 1194C; 0.55), 일배체형 B(990G, 1144C, 1194T; 0.35), 일배체형 C(990A, 1144A, 1194C; 0.10).

3가지의 LCR 일배체형이 하류GH1유전자의 발현에 차별적인 영향을 주는 지를 확인하기 위하여, 다수의 상이한 LCR-GH1근접 프로모터 구조체를 작제하였다. 3가지의 다른 1.6 kb LCR-보유 단편은 3가지 상이한 유형의 근접 프로모터 일배체형, 다시 말하면 "높은 발현 프로모터"(H27), "낮은 발현 프로모터"(H23), "정상 발현 프로모터"(H1)의 직전 상류에서 pGL3으로 클론시켜 총 9개의 상이한 LCR-GH1근접 프로모터 구조체를 작제하였다. 이후, 이들 구조체는 쥐 GC 세포와 HeLa 세포 모두에서 발현시키고, 결과적인 루시페라제 활성을 측정하였다. GC 세포에서, LCR의 존재는 근접 프로모터 단독과 비교하여 최대 2.8-배까지 발현을 강화시킨다(표 8). 하지만, 이런 유도 효과의 정도는 연결된 프로모터 일배체형에 좌우되었다. 양방 변이 분석(표 9)에서 근접 프로모터에 의해 발휘되는 영향에 의한 주요 효과와 프로모터^*LCR 상호작용이 유의한 것으로 밝혀졌다(ρ<0.0001). 표 8은 각 프로모터 일배체형에 대하여 개별적으로 실시된 95% 유의성 수준에서 Tukey 스튜던트화 범위 검증의 결과이다. 프로모터 일배체형 1과 함께, LCR 일배체형 A의 활성은 N(근접 프로모터를 보유하지만 LCR이 결핍된 구조체)의 활성과는 현저하게 상이하지만, LCR 일배체형 B와 C의 활성과는 별다른 차이가 없다; LCR 일배체형 B와 C는 서로 및 N과 현저하게 상이하다. 하지만, 프로모터 27에서 LCR 일배체형간 유의한 차이는 발견되지 않았다. HeLa 세포에서, 임의의 근접 프로모터 일배체형에서 LCR-매개된 발현 유도는 관찰되지 않았다.

LCR과 근접 프로모터 SNP간 물리적 거리가 너무 크면 공동 물리적 하플로타이핑(haplotyping)이 불가능하기 때문에, 이들간 연쇄 불평형(LD)은 근접 프로모터에 대한 SNP간 LD 분석에 참여한 100명의 개체로부터 얻은 유전자형 데이터를 활용한 최대 가능성 방법으로 평가하였다. 프로모터 SNP와 LCR 일배체형간 쌍별 LD는 SNP 16을 제외하고 모두 높게 나타났다(표 5). 따라서, SNP 16과 강한 연쇄 불평형인 것으로 확인된 유일한 SNP인 SNP 9의 발생에 앞서 SNP 16이 재현성 돌연변이되었다고 결론내릴 수 있다. LCR 일배체형간 실질적인 차이는 SNP 4, 8, 16과 이들의 LD의 측면에서 존재하는데, 이는 일배체형 A와는 반대로 LCR 일배체형 B의 상대적으로 젊은 연령을 시사한다.

결론

일배체형의 분할에서GH1유전자 발현 수준의 주요 결정소로 6개의 SNP(번호 1, 6, 7, 9, 11, 14)가 동정되었고, 다른 6개의 SNP(번호 3, 4, 8, 10, 12, 16)는 약간의 정보만을 제공하였다. 16개 전체 SNP의 기능적 중요성은 EMSA 분석으로 조사하였는데, 이는GH1근접 프로모터에서 6개 다형성 부위가 핵산 결합 단백질과 상호작용한다는 것을 시사하였다; 이들 부위중 5곳[-75(SNP 8), -57(SNP 9), -31(SNP 10), -1(SNP 12), +25(SNP 15)]에서, 양자택일적 대립유전자가 차별적인 단백질 결합을 보였다. 이들 5개 부위에서, SNP 9만 순환 분할에 의해GH1유전자 발현 수준의 주요 결정소로 동정되었다. 이런 명백한 모순은 40개 전체 일배체형에서 나타나는 전체 유전자 변이를 고려한 회귀 나무 분석의 측면에서 해명할 수 있다. 이에 더하여, 분할 과정에서 개별 SNP는 직접 측정가능한 기능적 특징이 아닌 발현 수준에 대한 알짜 효과에 기초하여 평가한다. 이는 대립유전자-특이적 단백질 결합을 제외한 인자가 회귀 나무에서 개별 SNP의 위치를 결정하는데 일정한 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다.

따라서,GH1유전자 프로모터 강도에서 일배체형-의존한 차이의 분자적 근거는 동족 결합 부위의 대안적 어레이에 다중 전사 인자의 차별적 결합의 알짜 효과에 기초할 수 있다. 이들 어레이는 관찰된 프로모터 일배체형을 조합적으로 구성하는 다양한 SNP의 상이한 대립유전자의 보유 측면에서 구별된다. 일부 전사 인자는cis-작용 DNA 서열 모티프에 의해 직접적으로 조절되고, 다른 전사 인자는 3차원 퍼즐(jigsaw puzzle)과 유사한 단백질-단백질 상호작용에 의해 간접적으로 조절된다: DNA 서열 모티프는 퍼즐 주형을 제공하고, 전사 인자는 퍼즐 조각이 된다.프로모터의 이런 분자적 관점은 임의의 일배체형에서 상이한 SNP 조합의 효과가 어떻게 전사 인자 결합, 트랜스크립토솜(transcriptosome) 조립, 유전자 발현에 대한 차별적 효과로 이어지는 지를 직시할 수 있도록 한다. 따라서, 유전자 발현에 대한GH1프로모터 SNP에서 관찰된 이런 비-부가적 효과는 한 SNP 부위에서 일정한 단백질의 대립유전자-특이적인 차별적 결합의 측면에서 이해할 수 있는데, 이런 차별적 결합은 대립유전자-특이적 단백질 결합을 하는 다른 SNP 부위에 대한 2번째 단백질의 결합에 영향을 주게 된다.

GH 유전자 클러스터의 LCR 상류는 인헤서 활성을 보유하고 발현의 조직 특이성을 공여하며 히스톤 아세틸화의 확대를 통하여 장범위 유전자 활성을 촉진하는 서열 요소를 보유한다(Shewchuk et al., 1999; Su et al., 2000; Shewchuk et al., 2001; Ho et al., 2002). LCR의 소마토트로프-특이적 결정소는GH1유전자의 ~14.5 kb 상류에서 1.6 kb 영역(I과 II 부위)에 존재한다(Shewchuk et al., 1999). 본원의 시스템에 상기 1.6 kb LCR 단편의 도입은 연결되는 최대 프로모터 일배체형의 종류에 의해 강화의 정도가 달라지긴 하지만,GH1근접 프로모터의 활성을 최대 2.8-배까지 강화시키는 역할을 하였다. 일정한 일배체형의 근접 프로모터의 활성 강화 역시 LCR 일배체형의 종류에 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 이를 종합하면, 이들 발견 결과는GH1유전자 발현에서 개체간 차이의 유전적 기초가 매우 복합적이라는 것을 암시한다.

표 1. 16곳에서 유전자 변이에 의해 정의된GH1근접 프로모터 일배체형

n: 154명의 영국 백인 남성에서 빈도; §: GC 세포에서 현저하게 감소된 수준(일배체형 1의 55% 수준)의 루시페라제 활성을 보이는 일배체형; $: 고립된 사례의 GH 결핍에서만 관찰됨.- 연구중인 염기의 부재를 의미한다.

표 2: 154명의 백인 남성의GH1유전자 프로모터에서 15가지 SNP의 대립유전자 빈도 및 GH 클러스터의 파라로거스 유전자의 유사한 위치에서 상응하는 뉴클레오티드

$:GH1전사 개시 부위에 상대적 위치; §: 사람 GH 클러스터에서 4가지 파라로거스 유전자의 야생형 서열에서 유사한 위치의 염기

표 3: 40가지의 상이한 SNP 일배체형의 시험관내GH1유전자 프로모터 발현 분석

n: 측정 개체수; μ_nor: 평균 표준화 발현 수준(즉, H1에 대한 상대적 변화(fold change); σ_nor: 발현 수준의 표준 편차; Tukey: Tukey 스튜던트화 범위검증의 결과, 중복된 문자 세트를 갖는 일배체형은 평균 발현 수준의 측면에서 통계학적 유의성이 없다;^*: 비-가우스 분포

표 4:GH1유전자 프로모터 발현 데이터의 일배체형 분할

n_hap: 종단 노드에 포함된 일배체형의 개체수; μ_nor: 평균 표준화 발현 수준; σ_nor: 발현 수준의 표준 편차; δ(종단 노드): 종단 노드내에서 잔류 편차; §: 대립유전자는 SNP 1, 6, 7, 9, 11, 14의 순서로 제시한다(n: 임의의 염기); &: 도 4에 도시된 바와 같은 번호지정.

표 5: 100명의 백인 남성에서GH1근접 프로모터 SNP와 LCR 일배체형간 연쇄 불평형, ρ

&: 200개중에서 1개의 크로모좀이 SNP12 대립유전자 C를 보유하는 것으로 밝혀졌다; 이 크로모좀은 SNP12와 관련된 모든 LD 분석에서 배제되었다; 각 LCR 일배체형에서 ρ는 다른 2가지 LCR 일배체형의 조합에 대비하여 계산함으로써, LCR을 이진 시스템으로 전환시켰다.

표 6: 쥐 뇌하수체 세포 핵 추출물을 이용하여GH1유전자 프로모터의 다양한 SNP 부위에서 대립유전자-특이적인 차별적 단백질 결합을 입증하는 EMSA 분석 결과

TSS: 전사 개시 부위; 5'UTR: 5'비번역 영역

표 7: 124명의 백인 남성에서 성인 신장과 GH1 근접 프로모터 일배체형-관련된 시험관내 발현 데이터간의 연관

	A_x<0.9	A_x>0.9
신장<1.765	34	22
신장>1.765	21	32

A_x: 개체에서 2가지 일배체형의 평균 표준화 시험관내 발현 수준,

다시 말하면 A_x=(μ_nor,h1+ μ_nor,h2)/2

표 8: 상이한 LCR-GH1근접 프로모터 구조체의 평균 GC 세포-유도된 표준화 루시페라제 활성±표준 편차

프로모터일배체형	LCR 일배체형
프로모터일배체형	N	A	B	C
H1	1.00±0.26^x	2.47±0.41^yz	2.30±0.46^y	2.77±0.55^z
H23	1.00±0.14^x	1.72±0.55^yz	2.14±0.52^z	1.35±0.48^xy
H27	1.00±0.26^x	1.11±0.36^x	1.00±0.41^x	1.25±0.27^x

x,y,z: 프로모터 일배체형내에서 Tukey 표준화 범위 검증; 중복된 문자 세트를 갖는 LCR 일배체형(A, B, C)은 평균 발현 수준의 측면에서 통계학적으로 차이가 없다. N: 근접 프로모터를 보유하지만 LCR이 결핍된 구조체. LCR 일배체형은 각 경우에 N에 대하여 표준화시켰다.

표 9: LCR-GH1근접 프로모터 구조체의 표준화 루시페라제 활성의 양방 ANOVA

출처	df	평균 제곱	F 값	ρ
프로모터 일배체형	2	51.46	390.97	<0.0001
LCR 일배체형	3	5.67	43.08	<0.0001
상호작용	6	3.09	23.48	<0.0001

df: 자유도(Degree of freedom)

온라인 보충 자료

대립유전자-특이적 단백질 결합을 보이는 SNP 부위의 EMSA 분석을 위한 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열. SNP 부위 11-15는 상이한 대립유전자 조합으로 조사하였다. TSS: 전사 개시 부위.

본원 발명은 성장 호르몬 기능이상의 존재 또는 이에 대한 감수성을 진단하는데 효과적이다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Wales College of Medicine COOPER, David N PROCTER, Anne M MILLAR, David S GREGORY, John <120> Haplotype Partitioning in the Proximal Promoter of the Human Growth Hormone (GH1) Gene <130> WCM.102A <140> GB 0308240.1 <141> 2003-04-10 <150> GB 0229725.7 <151> 2002-12-19 <150> GB 0306417.7 <151> 2003-03-20 <160> 40 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 1 ggggggtatg aagaat 16 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 2 gggggttagg gagaat 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 3 gggttgtagg aagaat 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 4 gggttgtagn aagaat 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 5 gggggttggg gagaat 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 6 gggttgtagn aagaag 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 7 gggggttagg gtgaat 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 8 gggttgtagg gagaat 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 9 gggggttatg gagaat 16 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 10 gggttgtagn gagaat 16 <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 11 gggggttggg gaggct 16 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 12 gggggttagg aagaat 16 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> note = n may be any nucleotide <400> 13 ggnggttggg gagaat 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 14 gggggtcagg gtgaat 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 15 gggttgtagg gtgaat 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 16 gggggttggg aagaat 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> note = n may be any nucleotide <400> 17 ggnggttagg gagaat 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 18 gggggttagn gagaat 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 19 aggggttagg gagaat 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 20 ggggggtagn aagaat 16 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 21 gggggttggg gagaag 16 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 22 gggttgtatg aagaat 16 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 23 ggggggtagg aagaat 16 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 24 gggttgtggn aagaat 16 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 25 gggttgtagg aagaag 16 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 26 gggggttggg gtgaat 16 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 27 gggggttatg aagaat 16 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 28 gggggttagn aagaat 16 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 29 aggggttagg aagaat 16 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> note = n may be any nucleotide <400> 30 ggnggttagg aagaat 16 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> note = n may be any nucleotide <400> 31 gggggttggn gagaat 16 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 32 gggttgtggg gagaag 16 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 33 gggggttagg gaggct 16 <210> 34 <211> 16 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> note = n may be any nucleotide <400> 34 ggnggtcagg gtgaat 16 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 35 ggggggtagg accaat 16 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 36 gggggttagg gtgaag 16 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 37 aggggttagg gaggat 16 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 38 gggggtcagg aagaat 16 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 39 gggttgtagg gagact 16 <210> 40 <211> 16 <212> DNA <213> human <400> 40 gggggtcagg gagaat 16

Claims

개체에서 성장 호르몬 기능이상의 존재 또는 이에 대한 감수성을 진단하는 방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

a) 검사 개체로부터 성장 호르몬 유전자(GH1)의 근접 프로모터 영역을 인코딩하는 핵산 분자의 검사 시료를 수득하고;

b) 상기 핵산 분자는 복수의 SNP: 1, 6, 7, 9, 11, 14(표 1) 혹은 상응하는 이의 일배체형(표 1); 또는 이와 연쇄불평형(linkage disequilibrium) 상태에 있는 다형성에 대하여 검사하고;

c) 복수의 상기 SNP 혹은 이들의 상응하는 일배체형, 또는 이들에 상응하는 다형성이 존재하면, 개체가 성장 호르몬 기능장애로 고생하거나 또는 이에 대한 감수성을 보이는 지를 확인한다.
제 1 항에 있어서, 다형성은 상기 유전자의 좌위 조절 영역의 114에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 다형성은 상기 유전자의 좌위 조절 영역의 1194에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 성장 호르몬 기능이상의 존재 또는 이에 대한 감수성을 진단하는방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

a) 검사 개체로부터 성장 호르몬 유전자(GH1)의 근접 프로모터 영역을 인코딩하는 핵산 분자의 검사 시료를 수득하고;

b) 상기 핵산 분자는 표 1에서 번호 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 혹은 29로 표시된 하나 또는 복수의 일배체형에 대하여 검사하고;

c) 상기 일배체형이 존재하면, 개체가 성장 호르몬 기능장애로 고생하거나 또는 이에 대한 감수성을 보이는 지를 확인한다.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계의 검사에는 상기 유전자의 PCR 증폭이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 다음에서 선택되는 프라이머가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법:

GGG AGC CCC AGC AAT GC(GH1F); 또는

TGT AGG AAG TCT GGG GTG C(GH1R).
제 6 항에 있어서, 프라이머는 증폭된 산물의 검출을 용이하게 하기 위하여 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 7 항중 어느 한 항에 따른 진단 방법을 실시하는데 적합한 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 키트:

a) 성장 호르몬 유전자(GH1)의 근접 프로모터 영역을 탐지 또는 증폭하기 위한 하기 프라이머중 적어도 하나:

GGG AGC CCC AGC AAT GC(GH1F); 또는

TGT AGG AAG TCT GGG GTG C(GH1R) 및 선택적으로

b) 환자 DNA의 원하는 영역을 증폭하는 PCR을 실행하는데 적합한 하나 또는 복수의 시약.
제 8 항에 있어서, SNP 1, 6, 7, 9, 11, 14를 보유하는 유전자의 선택된 영역에 상보적인 다른 프라이머가 추가로 또는 대안으로 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
GH1의 근접 프로모터 영역을 적어도 포함하는 벡터에 있어서, 상기 영역은 복수의 SNP 1, 6, 7, 9, 11, 14를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항에 있어서, 상기 영역은 적어도 SNP 6과 9를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항에 있어서, 상기 영역은 적어도 SNP 10과 12를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항에 있어서, 상기 영역은 적어도 SNP 8과 11을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항에 있어서, 상기 영역은 표 1에 도시된 다음의 일배체형: 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 또는 29중 적어도 한가지에 의해 특성화되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항 내지 14 항중 어느 한 항에 있어서, 본원에서 밝힌GH1좌위 조절 영역 근접 프로모터 융합 구조체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항 내지 15 항중 어느 한 항에 있어서, 근접 프로모터 영역은 선택된 유전자의 코딩 영역에 기능적으로 연결되고, 여기서 상기 근접 프로모터의 활성이 조절되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 16 항에 있어서, 근접 프로모터 영역은 성장 호르몬 유전자(GH1)의 코딩 영역에 연결되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 16 항 또는 17 항에 있어서, 상기 유전자에서 근접 프로모터 영역은 태그(tag)에 추가로 연결되고, 여기서 상기 유전자의 발현 및 이에 따른 상기 근접프로모터 영역의 활성이 모니터되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 18 항에 있어서, 태그는 단백질 태그인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항 내지 19 항중 어느 한 항에 있어서, 성장 호르몬 유전자(GH1)의 적어도 한가지의 다른 근접 프로모터 영역이 추가로 제공되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 20 항에 있어서, 다른 근접 프로모터 영역은 원 근접 프로모터 영역과 상이한 것을 특징으로 하는 벡터.
제 21 항에 있어서, 각 근접 프로모터 영역은 상이한 코딩 서열에 연결되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 21 항 또는 22 항에 있어서, 각 근접 프로모터 영역은 프로모터 각각의 활성을 모니터할 수 있는 상이한 태그에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10 항 내지 23 항중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환되는 숙주 세포.
성장 호르몬 유전자의 근접 프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 재조합 세포주에 있어서, 상기 근접 프로모터는 복수의 SNP 1, 6, 7, 9, 11 혹은 14, 또는 표 1에 도시된 하나 또는 복수의 일배체형 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 혹은 29를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포주.
복수의 SNP 1, 6, 7, 9, 11 혹은 14를 포함하는 GH1 프로모터로 인해, 또는 표 1에 도시된 1가지의 일배체형 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 혹은 29로 특성화되는 상기 프로모터로 인해 성장 호르몬을 과소 발현하는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 사람-제외 동물.
제 26 항에 있어서, 프로모터는 일배체형 23으로 특성화되는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 사람-제외 동물.
제 26 항에 있어서, 프로모터는 일배체형 27로 특성화되는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 사람-제외 동물.
제 26 항에 있어서, 프로모터는 일배체형 1로 특성화되는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 사람-제외 동물.
일배체형 AGGGGTTAT-ATGGAG로 특성화되는 성장 호르몬 유전자(GH1)의 인공 근접 프로모터 영역.
일배체형 AG-TTGTGGGACCACT로 특성화되는 성장 호르몬 유전자(GH1)의 인공 근접 프로모터 영역.
일배체형 AG-TTTTGGGGCCACT로 특성화되는 성장 호르몬 유전자(GH1)의 인공 근접 프로모터 영역.
성장 호르몬 기능이상을 치료하는데 사용할 수 있는 치료요법적 활성 약물의 스크리닝 방법에 있어서, 각각 제 24 항 또는 25항에 따른 세포 또는 세포주를 후보 약물에 노출시키고, 이후 후보 약물이 성장 호르몬 유전자의 프로모터 영역의 활성 및 세포주의 경우에 리포터 분자의 발현에 영향을 주는 지를 확인하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
성장 호르몬 기능이상을 치료하는데 사용할 수 있는 치료요법적 활성 약물의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 방법은 제 27 항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 외래유전자도입 사람-제외 동물을 후보 약물에 노출시키고, 이후 상기 동물의 성장을 모니터하는 단계로 구성되고, 동물 성장의 측면에서 후보 약물이 긍정적인 효과를 보이면 이런 성장이 상기 후보 약물의 치료요법적 활성을 암시하는 것으로 결론짓는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.