JP2004290173A - ヒト成長ホルモン（ｇｈ１）遺伝子の近位プロモーター中のハプロタイプ分割 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト成長ホルモン異常の存在及び成長ホルモン異状に対する感受性の診断方法の提供及び成長ホルモン異状に対する治療薬のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】以下について調べる；ａ）試験されるべき個体から，成長ホルモン遺伝子の近位プロモーター領域をコードする核酸分子のサンプルを得，ｂ）この核酸分子を６のＳＮＰ’Ｓのうちの複数，又はその対応するハプロタイプ又はそれとの連鎖不平衝における多型，Ｃ）そしてａ及ｂから個体が成長ホルモン異常を患っているか、又は成長ホルモン異常に対する感受性があるかについて決定する。
【選択図】なし

Description

【０００１】
本発明は、成長ホルモン異常の存在又は成長ホルモン異常に対する感受性の診断方法及びそこで用いられるのに好適なキット、そのための部品及びそれを基礎とするさらなる研究手段に関する。
【０００２】
ヒトの身長は、複数の遺伝的及び環境的要素の相互作用の結果として生じる高度に複雑な特性である。家族性の低身長については既に、遺伝した成長ホルモン（ＧＨ１）遺伝子の突然変異と結びついていることが知られているため、この下垂体で発現する遺伝子の多型的な変異が成人の身長にも影響すると仮定することは、理にかなっていると思われる。
【０００３】
ヒトＧＨ１遺伝子は、１７ｑ２３染色体上、胎盤で発現する成長ホルモン遺伝子（ＧＨ２、ＭＩＭ＃１３９２４０）、２の絨毛性体乳腺発育ホルモン遺伝子（ＣＳＨ１及びＣＳＨ２）及びシュードジーン（ＣＳＨＰ１）を含む５の関連した遺伝子の６６ｋＤのクラスター中に存在する。ＧＨ１遺伝子プロモーターの近位領域においては、５３５塩基対の範囲内で、１６の１塩基多型（ＳＮＰｓ）という高レベルの配列変異を示すことが報告されている。これらの１塩基多型の大多数は、ＧＨ１遺伝子が派生相同なＧＨ２、ＣＳＨ１、ＣＳＨ２及びＣＳＨＰ１遺伝子と相違する位置と同じ位置において起こることから、それらは、遺伝子変換により発生したのかも知れないと推測されている。
【０００４】
ヒトＧＨ１遺伝子の発現は、ＧＨ１遺伝子の１４．５ｋｂ及び３２ｋｂ上流の間に位置する遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）によっても影響される。上記ＬＣＲは複数のＤＮエースＩ高感受性部位を含み、下垂体及び胎盤の双方で、ＧＨ遺伝子クラスターの遺伝子の活性化に必要とされる。２のＤＮエースＩ高感受性部位（Ｉ及びＩＩ）は、下垂体特異的な転写因子Ｐｉｔ−１への結合部位を含み、高度に成長ホルモン産生細胞特異的なＧＨ１遺伝子の発現に関与している。
【０００５】
やや異例ではあるが、我々は、ＧＨ１遺伝子の近位プロモーター領域及びＬＣＲ双方の多型的変異の機能的重要性を評価する研究を行なった。
【０００６】
ここに記載された研究の結果、我々は、我々の調査の母集団中、１６の既知のＳＮＰ位置のうち１５において変異が起こり、全体で４０の異なるプロモーターハプロタイプが表れたことを示した。さらに、これらのハプロタイプについての研究により、我々はそれらを分割し、上記ＳＮＰ’ｓのうちの６がＧＨ１遺伝子発現の主要な決定因子であるが、一方、さらなる６のＳＮＰ’ｓは単にＧＨ１遺伝子発現についての情報をわずかに与えるにすぎない、と結論した。
【０００７】
さらに、ヒトの身長の遺伝的な複雑性を前提として、我々のデータは、一定のＳＮＰ’ｓの組み合わせ、それゆえハプロタイプは、ヒトの身長に非常に決定的な影響を及ぼすことができるという結論に我々を導いた。したがって、この情報についての知識は、成長ホルモンの低度の発現を患い、したがって少なくとも思春期までは置換療法を必要とする個体を同定するのに有用である。
【０００８】
成長ホルモン（ＧＨ１）遺伝子の構造、機能又は発現に影響する損傷の有無を決定するために、個体のＤＮＡが分析される遺伝医学の分野では、大きな欠失又は主要な突然変異を検出することは比較的簡単である。しかし、我々のデータが示す通り、個体は、ＧＨ１プロモーターハプロタイプの性質により、成長ホルモンの低度の発現をおこし得る。慣用の遺伝子アッセイにより、仮に上記主要な欠失又は突然変異がないような個体は、成長ホルモン発現に関して、正常であると考えられる。しかし、ここに記載された研究は、ＳＮＰ’ｓの組み合わせが、成長ホルモン発現に影響し、そして今度は身長に影響を及ぼすことを明らかにした。この知見は、野生型及び突然変異遺伝子のＧＨ１発現に感受性が高く、したがって大きな遺伝子欠損と結びついた症状を示さない者を含む広い範囲の個体の遺伝的試験に用いるのに大変正確である、ＧＨ分析をつくり出すのに用いることができる。
【０００９】
本発明の陳述
したがって、本発明は、個体における成長ホルモン異常の存在又は成長ホルモン異常に対する感受性を診断するための方法であって、以下の：
ａ）試験されるべき個体から、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の近位プロモーター領域をコードする核酸分子の試験サンプルを得ること；
ｂ）前記核酸分子を以下の６のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４（表１に示す）のうちの複数、又はその対応するハプロタイプ（同様に表１に示す）；又はそれとの連鎖不平衡における多型
について調べること；
ｃ）そして、複数の前記ＳＮＰ’ｓ、又はそれらの前記対応するハプロタイプ、或いはそれらの前記対応する多型から、個体が成長ホルモン異常を患っているか、又は成長ホルモン異常に対する感受性があるかについて決定すること、
を含む前記方法に関する。
【００１０】
本発明の好ましい方法においては、前記連鎖不平衡における多型は、ここで記載されている通り、対応する遺伝子座制御領域の１１４４位又は１１９４位における多型である。
【００１１】
本発明のさらなる側面又は実施例によれば、個体における成長ホルモン異常の存在又は成長ホルモン異常に対する感受性を診断する方法であって、以下の：
ａ）試験されるべき個体から、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の近位プロモーター領域をコードする核酸分子の試験サンプルを得ること；
ｂ）前記核酸分子を、以下の表１中のハプロタイプであって、番号３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９で示されたうちのいずれか１又はそれを越えるものについて調べること；
ｃ）そして、前記ハプロタイプが存在する場合、個体が成長ホルモン異常を患っているか、又は成長ホルモン異常に対する感受性があるかについて決定すること、
を含む前記方法が提供される。
【００１２】
我々の研究は、これらのハプロタイプが成長ホルモン発現の低下の原因となり、したがって成長ホルモン異常に導くという結論に我々を導いた。
【００１３】
好ましくは、本発明による診断方法の実施に、慣用方法が用いられ、したがって典型的には、試験される個体の前記核酸分子の検査は、増幅される核酸の相補的一本鎖にハイブリダイズするのと同じ使用プライマー又はプライマー対の増幅を含む。好適なプライマーの例を以下に示す：
ＧＧＧ ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＣ（ＧＨ１Ｆ）；及び／又は
ＴＧＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ Ｃ（ＧＨ１Ｒ）。
【００１４】
有益には、プライマーはそれらの検出を可能とするために、放射線ラベル、酵素、蛍光又はケミルミネッセントラベル或いはビオチン−アビジンラベルのような慣用的なラベルを用いて、ラベルされる。
【００１５】
最も好適には、プライマーは、核酸分子に厳重な条件下でハイブリダイズする。これは、上記ハイブリダイゼーションのレベルが、染色体１７ｑ２３上の６６ｋｂクラスター中の５の相同遺伝子を識別するのに十分であることを意味する。一般的には、厳重なハイブリダイゼーションを支える洗浄条件は、温度と塩濃度の組み合わせであり、したがって、研究の結果、ＤＮＡ変性温度は、計算された核酸の融点よりも約５〜２０℃低い。
【００１６】
本発明のさらなる側面によれば、本発明による前記の診断方法を実行するのに好適なキットであって、以下の：
ａ）ＧＨ１の近位プロモーター領域を検出し及び／又は増幅するためのプライマーであって以下の：
ＧＧＧ ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＣ（ＧＨ１Ｆ）；
ＴＧＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ Ｃ（ＧＨ１Ｒ）；
であらわされる前記プライマーの少なくとも１及び、場合により、
ｂ）患者のＤＮＡの目的の領域を増幅するためのＰＣＲを実行するのに好適な１又はそれ以上の試薬
を含む前記キットを提供する。
【００１７】
有益には、本発明によるキットは以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４のうちの複数に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００１８】
本発明によるＳＮＰ’ｓ及びハプロタイプは、成長ホルモン異常の治療のための治療法の同定に有用である。したがって、当然の帰結として前記のＳＮＰ’ｓ及び／又はハプロタイプを含む、１又はそれ以上の成長ホルモン遺伝子又はその断片を好適な細胞又は細胞株へ導入することは、成長ホルモン異常を治療する試剤の同定に有用なツールを生み出すであろう、ということになる。したがって、本発明のさらなる側面によれば、以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４のうちの複数を含むＧＨ１の近位プロモーター領域を少なくとも含むベクターを提供する。
【００１９】
本発明の好ましい実施例においては、前記領域は、複数の前記ＳＮＰ’ｓ及び最も理想的には、さらに６及び９；及び／又は１０及び１２；及び／又は８及び１１を含む。１の対立遺伝子上の１のプロモーターハプロタイプ中だけでなく、プロモーターハプロタイプ間、すなわち他の対立遺伝子上のプロモーターハプロタイプ間での相互作用（分割）もある。さらに、ある程度の両親由来の優性があり、父系由来のハプロタイプの方が母系由来のものよりもより優性、またはその逆もある。
【００２０】
本発明のさらなる側面によれば、以下の表１に示されたハプロタイプ：３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９のうちのいずれか１又はそれを越えるものを有することに特徴を有するＧＨ１の近位プロモーター領域を含むベクターが提供される。
【００２１】
本発明のなお、さらなる側面によれば、ここで記載されたようなＬＣＲ近位プロモーター融合構築物を含むベクターが提供される。
【００２２】
最も好ましくは、上記ベクターは、原核細胞又は真核細胞を形質転換又は形質移入するのに適合させられ、さらにプロモーター領域の活性を確認するための手段であって、プロモーター領域を活性化又は阻害する試剤に対する応答をモニターすることのできるものが提供される。したがって、前記近位プロモーター領域は、これにより、成長ホルモン遺伝子又は代替遺伝子の発現が対応するプロモーター活性をモニターするのに用いられることができるところの成長ホルモン（ＧＨ１）遺伝子のコード領域又は代替遺伝子のコード領域、に連結する。
【００２３】
なおさらに理想的には、上記ベクター内では、遺伝子は発現タンパクタグの上流又は下流で発現することができ、例えば、そのようなタグは、前記ＧＨ１をコードする領域及び隣接したタグの発現がＧＨ１の近位プロモーターの制御下にあるところの緑色蛍光タンパクである。
【００２４】
本発明の実施例のさらなる側面においては、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の複数のプロモーター、最も理想的には成長ホルモン遺伝子の異なる複数のプロモーターを含むベクターが提供される。異なるという語により、我々は各プロモーターが異なるコード配列を有し、したがって異なる型のＳＮＰ’ｓ及びしたがってハプロタイプを含むということを意味する。この取り決めによれば、最も有益には、各プロモーターは、上記プロモーター活性が異なる遺伝子の発現の結果としてモニターされることが可能であるところの異なるＤＮＡ配列のいずれかに連結し、あるいは代わりに同一のコード配列が使用されることができ、しかし、好適には、同一の遺伝子の発現が異なるタグを用いることによって差別的にモニターされることができるところの異なるタグが提供される。
【００２５】
本発明によるこれらのベクターは理想的には、宿主細胞を形質転換するのに用いられ、ここで宿主細胞は有益には、成長ホルモン異常の治療に有用であるかも知れない試剤のスクリーニングの目的に用いられることができる。好ましい細胞は細菌性酵母、カビ、こん虫細胞又は哺乳動物細胞を含み、最も好ましくは、例えばヒト細胞株である細胞株のような不死化された細胞である。あるいは、ラット細胞も用いられることができる。
【００２６】
本発明のなお、さらなる側面によれば、本発明によるベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞が提供される。
【００２７】
本発明のなおさらなる側面によれば、遺伝子組み換え細胞株であって、レポーター分子を発現するように設計されており、ここで上記レポーター分子の発現は、表１に示す以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１又は１４のうちの複数及び／又は以下のハプロタイプ：３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９のいずれか１又はそれを越えるものを含むＧＨ１の近位プロモーターに制御されている、前記細胞株が提供される。
【００２８】
本発明のなおさらなる側面によれば、非ヒトトランスジェニック動物であって、表１に示した以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４のうちの複数を含むＧＨ１プロモーターを有する結果として、及び／又は、前記プロモーターが表１に示した以下のハプロタイプ：３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９のうちの１に特徴を有する結果として、成長ホルモンの発現が低下した前記動物が提供される。
【００２９】
本発明による好ましい非ヒトトランスジェニック動物においては、前記プロモーターは、ハプロタイプ２３又は２７に特徴を有し、したがってそれぞれ“低発現プロモーターハプロタイプ”又は“高発現プロモーターハプロタイプ”と称される。これら２のハプロタイプは、前記動物における候補薬物の効果を比較し、対照するのに有益に用いられることができる。加えて、表１のハプロタイプＨ１は、“正常発現プロモーターハプロタイプ”として便利に用いられることができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施例においては、前記プロモーターは、超最大の発現をするように人工的に設計され、ハプロタイプＡＧＧＧＧＴＴＡＴ−ＡＴＧＧＡＧに特徴を有するか又は配列ＡＧ−ＴＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴ及びＡＧ−ＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴに特徴を有する準最小のプロモーターハプロタイプである。
【００３１】
本発明のさらなる側面によれば、その結果、成長ホルモン異常の治療に用いることのできる、治療的活性のある薬物のスクリーニングのための方法であって、本発明の細胞又は細胞株を候補薬物にさらすこと、そして、その後候補薬物が成長ホルモン遺伝子のプロモーター領域の活性に影響を及ぼしたかどうか、そしてそれにより、細胞株の場合には、レポーター分子の発現に影響を及ぼしたかどうかを決定することを含む前記方法が提供される。
【００３２】
本発明のなお、さらなる側面によれば、成長ホルモン異常の治療に用いることのできる、治療的活性のある薬物のスクリーニングのための方法であって、本発明による非ヒトトランスジェニック動物を候補薬物にさらすこと、そしてその後前記動物の成長をモニターすること、そして動物の成長によって、候補薬物が正の効果を示した場合には、前記成長は、前記候補薬物の治療的活性を示唆するものであると結論付けることを含む前記方法が提供される。
【００３３】
ここにおける正の効果への言及は最も典型的には成長を促進する能力を意味するが、高発現プロモーターが用いられる一定の環境においては、成長に影響を及ぼす能力は、成長を阻害する能力を含むことができる。
【００３４】
本発明は、以下の材料及び方法のセクションにおける言及によって例証されるであろう。
【００３５】
ヒト由来の材料
ＤＮＡサンプルは、身長に関わりなく選ばれたコーカサス出身の英国軍人男性１５４人から採取したリンパ球から得た。身長データはこれら個体のうちの１２４人について利用可能であり（平均、１．７６±０．０７ｍ）、身長分布は正常であることがわかっている（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ統計 Ｗ＝０．９８４、ｐ＝０．１６）。倫理的同意は、地域的なＭｕｌｔｉ−Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。
【００３６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法
３．２ｋｂのＧＨ１遺伝子特異的なフラグメントのＰＣＲ増幅法はオリゴヌクレオチドプライマーＧＨ１Ｆ（５′ＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣ ３′；−６１５位〜−５９９位）及びＧＨ１Ｒ（５′ＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣ ３′；２５９８位〜２６１６位）［番号は翻訳開始部位を＋１とした相対的なものである（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｊ０３０７１）］。ＧＨ１ ＬＣＲのＩ及びＩＩ部位を含む１．９ｋｂのフラグメントをＬＣＲ ５Ａ（５′ＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧ ３′；−３１５位〜−３３４位）及びＬＣＲ ３．０（５′ＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ ３′；１５８９位〜１６９８位）［ＬＣＲ配列はＧｅｎＢａｎｋ （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＣ００５８０３ ）から得た。一方ＬＣＲ番号はＪｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９； ＧｅｎＢａｎｋ （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＦ０１０２８０）に従った］を用いてＰＣＲ増幅した。両反応の条件は同一であった；すなわち、２００ｎｇのリンパ球ＤＮＡをＥｘｐａｎｄ（登録商標）高フィデリティーシステム（ロシュ）を用いて増幅し、最初の高温が９８℃２分、続いて９５℃３分、３０サイクルの９５℃３０秒、６４℃３０秒、６８℃１分で行なった。最後の２０サイクルでは、６８℃における伸長反応ステップを各サイクル５秒ずつ延長した。これをその後さらに６８℃で７分間インキュベーションした。
【００３７】
クローニング及びシークエンシング
最初に、ＰＣＲ産物をクローニングせずに直接シークエンシングした。ＧＨ１遺伝子の近位プロモーター領域を上記３．２ｋｂのＧＨ１特異的なＰＣＲフラグメントから、プライマーＧＨ１Ｓ１（５′ＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣ ３′：−５５６位〜−５３７位）を用いてシークエンシングした。上記１．９ｋｂのＧＨ１ ＬＣＲフラグメントをプライマーＬＣＲ ５．０（５′ＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧ ３′；９９３位〜１０１１位）、ＬＣＲ ３．１（５′ＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧ ３′；１０９３位〜１１１０位）、ＬＣＲ ３．２（５′ＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣ ３′；６２８位〜６４５位）及びＬＣＲ ３．３（５′ＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣ ３′；２１１位〜２２８位）を用いてシークエンシングした。シークエンシングはＢｉｇ Ｄｙｅ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７又は３１００ ＤＮＡシークエンサーを用いて実施した。プロモーター領域のヘテロ接合体又はＬＣＲ変異体の場合には、好適なフラグメントをシークエンシングの前にｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ）中へクローン化した。
【００３８】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するベクターの構築
４０の異なるＧＨ１近位プロモーターハプロタイプ（表１）の各例が５８２ｂｐフラグメントとしてプライマーＧＨＰＲＯＭ５（５′ＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＣ ３′；−５２０位〜−５０１位）及びハプロタイプの＋５９位の塩基によってＧＨＰＲＯＭ３Ａ（５′ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＣ ３′；４４位〜６２位）又はＧＨＰＲＯＭ３Ｃ（５′ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＴＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＣ ３′；４４位〜６２位）のいずれかを用いて、ＰＣＲ増幅された。クローニングの便宜のために、すべてのプライマーに、部分的又は完全な鋳型には存在しない制限エンドヌクレアーゼを認識する配列をその５′末端（上記の下線部分）に付加した；ＢｇｌＩＩ（ＧＨＰＲＯＭ５）及びＨｉｎｄＩＩＩ （ＧＨＰＲＯＭ３Ａ及びＧＨＰＲＯＭ３Ｃ）。ＰＣＲフラグメントをその後ｐＧＥＭ−Ｔ中にクローン化した。プラスミドＤＮＡを最初にＨｉｎｄＩＩＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）で消化し、５′オーバーハングをリョクトウヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）によって除去した。プロモーターフラグメントをＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）による消化で放出し、ゲル精製した。ルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３ ＢａｓｉｃはＮｃｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）消化により調製し５′オーバーハングをリョクトウヌクレアーゼにより除去した。上記ベクターをその後ＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）により消化し、ゲル精製した。制限されたプロモーターフラグメントをルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクターＧＬ３ Ｂａｓｉｃ中へクローン化した。ＧＨ１プロモーター及びルシフェラーゼ遺伝子の配列が正しいことを確認するためにプラスミドＤＮＡｓ（ｐＧＬ３ＧＨシリーズ）を単離し（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｄｉｐｒｅｐ ｓｙｓｔｅｍ）、プライマーＲＶ３（５′ＣＴＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＣ ３′；４７６０位〜４７７９位）、ＧＨ１ＳＥＱ１（５′ＣＣＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＧ ３′；２７位〜４３位）、ＬＵＣＳＥＱ１（５′ＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＣ ３′；６８３位〜７００位）、及びＬＵＣＳＥＱ２（５′ＧＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧ ３′；１３７２位〜１３９０位）を用いてシークエンシングした。切断されたＧＨ１近位プロモーター構築物（−２８８位〜＋６２位）もまた、ＮｃｏＩ及びＢｇｌＩＩを用いたｐＧＬ３ＧＨ１（ハプロタイプ１）の制限により作成され、続いてＳＮＰ部位１〜５を除去するために平滑末端／再連結を行なった。
【００３９】
予想された超最大ハプロタイプ（ＡＧＧＧＧＴＴＡＴ−ＡＴＧＧＡＧ）及び準最小ハプロタイプ（ＡＧ−ＴＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴ及びＡＧ−ＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴ）を生成するために合成近位プロモーターハプロタイプレポーター遺伝子構築物を部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）［Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）］により作成した。
【００４０】
ＬＣＲ−近位プロモーター領域融合構築物を作成するために、上記１．９ｋｂ ＬＣＲフラグメントをＢｇｌＩＩで制限し、結果として生じた１．６ｋｂフラグメントをｐＧＬ３中の５８２ｂｐプロモーターフラグメントの直接上流のＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。上記３の異なるＬＣＲハプロタイプをｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃ中の３のＧＨ１近位プロモーター構築物であって、それぞれ“高発現プロモーターハプロタイプ”（Ｈ２７）、“低発現プロモーターハプロタイプ”（Ｈ２３）及び“正常発現プロモーターハプロタイプ”（Ｈ１）の５′側にクローン化し、全部で９の異なるＬＣＲ−ＧＨ１近位プロモーター構築物（ｐＧＬ３ＧＨＬＣＲ）を得た。プラスミドＤＮＡをその後単離し（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｄｉｐｒｅｐ ）、そして適切なプライマーを用いてシークエンスをチェックした。
【００４１】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
成長ホルモンを発現するヒト下垂体細胞がない場合には、ラットＧＣ下垂体細胞（Ｂａｎｃｒｏｆｔ １９７３； Ｂｏｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｉｎ １９８９）をｉｎ ｖｉｔｒｏの発現試験のために選択した。ラットＧＣ細胞は、１５％ウマ血清及び２．５％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で成長させた。ヒトＨｅＬａ細胞は５％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で成長させた。両細胞株を３７℃、５％ ＣＯ_２ 中で成長させた。リポソームが仲介するＧＣ細胞及びＨｅＬａ細胞の形質移入は９６穴プレートフォーマット中でＴｆｘ（登録商標）−２０（Ｐｒｏｍｅｇａ ）を用いて実施した。コンフルエントな細胞を培養フラスコから除去し、翌日までに〜８０％コンフルエントになるように新鮮な培地で希釈し９６穴プレートに分注した。
【００４２】
形質移入のための混合物は、血清を含まない培地、２５０ｎｇのｐＧＬ３ＧＨ構築物又はｐＧＬ３ＧＨＬＣＲ構築物、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、及び０．５μｌのＴｆｘ（登録商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ）を含み各ウェルに全容量で９０μｌずつ入れた。１時間後、２００μｌの完全培地を各ウェルに加えた。続く形質移入において、上記細胞を２４時間、３７℃、５％ ＣＯ_２ 中でインキュベート、その後レポーターアッセイのために可溶化した。
【００４３】
ルシフェラーゼアッセイは、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。アッセイはマイクロプレートルミノメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行ない、Ｒｅｎｉｌｌａ活性を考慮して正規化した。各構築物は独立した３のプレート上でプレートあたり６回反復した（すなわち、全部で１８の独立した測定）。近位プロモーターアッセイのためには、各プレートにネガティブコントロール（プロモーターを含まないｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃ）及びポジティブコントロール（ＳＶ４０プロモーターを含むｐＧＬ３）を入れた。ＬＣＲ分析のためには、近位プロモーターを含むがＬＣＲを欠く構築物をネガティブコントロールとして用いた。
【００４４】
電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡを２本鎖のオリゴヌクレオチドであって、共同してすべての１６ＳＮＰ部位（オンラインの添付資料を参照のこと）をカバーするものについて実施した。ＧＣ及びＨｅＬａ細胞からの核抽出液を Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４）により記載された通りに調製した。オリゴヌクレオチドを［γ−^３３Ｐ］−ｄＡＴＰで放射能標識し、ゲル電気泳動の後、オートラジオグラフィにより検出した。ＥＭＳＡ反応物は、最終濃度で２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．９、４％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、０．５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．２μｇのＨｅｌａ細胞又はＧＣ細胞核抽出液、０．４μｇのポリ［ｄｌ−ｄＣ］・ポリ［ｄｌ−ｄＣ］、０．４ｐＭの放線能標識されたオリゴヌクレオチド、適宜４０ｐＭの非標識競合オリゴヌクレオチド（１００倍過剰）を最終容量１０μｌで含む。
【００４５】
ＥＭＳＡ反応物を６０分、氷上でインキュベートし、オートラジオグラフィーの前に４０％ ＰＡＧＥゲル上、１００Ｖ、４５分間インキュベートした。各反応においてはＮＦ１遺伝子プロモーター（５′ＣＣＣＣＧＧＣＣＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣ ３′）を非特異的競合物質として用いる一方、２本鎖の非標識テストオリゴヌクレオチドを特異的競合物質として用いた。ヒトプロラクチン（ＰＲＬ）遺伝子Ｐｉｔ−１結合部位（５′ＴＣＡＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴ ３′）及びＰｉｔ−１コンセンサス結合部位（５′ＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡ ３′）に対応する２本鎖オリゴヌクレオチドをＳＮＰ８部位へのタンパク結合の特異的競合物質として用いた。
【００４６】
プライマー伸長アッセイ
プライマー伸長アッセイは、異なるＳＮＰハプロタイプを有する構築物が同一の翻訳開始部位を利用することを確認するために実施した。プライマー伸長アッセイはＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２）の方法にしたがった。
【００４７】
データの正規化
ネガティブコントロール（プロモーターを含まないｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃ）の発現測定は、プレートによってかなりの相違を示した。ベースラインの発現及びプレートの効果を補正するために、所定のプレート上のネガティブコントロールの平均活性値を同じプレート上の他のすべての活性値から差し引いた。その後、各プレート上の野生型近位プロモーターハプロタイプ１（Ｈ１）の平均活性（プレートごとに補正した）を計算し、同一のプレート上の他のすべてのハプロタイプに関連した活性をこの値で割った。これらの２の形質転換により、Ｈ１の平均活性が、プレート番号に関わりなく、一定である一方、ネガティブコントロールの平均活性がゼロであることを確認した。したがって、活性値の結果は、ベースライン及びプレート効果の双方について補正され、Ｈ１との比較において回数のちがいによるものと解されるだろう。形質転換後は、顕著なプレート効果は検出されなかったため、データをプレートを越えて併合した。ハプロタイプＡを対照ハプロタイプとして用いて、同様の手順がＬＣＲ−プロモーター融合構築物発現データについても実行された。
【００４８】
統計分析
近位プロモーターハプロタイプの正規化された発現レベルについて、ＳＡＳ統計分析ソフトウエア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ ＮＣ， ＵＳＡ）のＵＮＩＶＡＲＩＡＴＥ手続中で実行されるＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ統計（Ｗ）を用いて、正規分布への適合度をテストした。有意性の評価は棄却域＝０．０５／４０≒０．００１に設定し複数回（すなわち４０回）テストすることにより補正した。この基準を用いて、２のプロモーターハプロタイプの発現レベルがガウス分布とは、有意に異なることを発見した、つまりＨ２１（Ｗ＝０．７２７、ｐ＝０．０００２）及びＨ４０（Ｗ＝０．７５８、ｐ＝０．０００４）である。他の３８ハプロタイプについては発現レベルは正規性と一致したため、Ｔｕｋｅｙのスチューデント化された範囲試験（ＳＡＳ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ＧＬＭ ）を用いて、対比較に供した。異なるハプロタイプグループ間の発現レベルの対比較をＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和統計（ＳＡＳ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ＮＰＡＲ１ＷＡＹ）の正規近似ｚを用いて実施した。
【００４９】
ＳＮＰｓ間の相関構造を公式に評価するため、そしてさらなる研究のために重要な多型の適切なサブセットを同定することを可能とするために、ハプロタイプの分割における残差乖離度を近位プロモーターＳＮＰｓのすべての可能なサブセットについて計算した。
【００５０】
データセットの所定の分割
【数１】

は、ｘ_１ …，ｘ_ｍ を指し、仮りにｉ∈πｊのときπ（ｉ）＝ｊとすると、Πの残差乖離度δは、
【数２】

と定義する。
データセットが全く分割されない場合には、δ＝δ（Π_０ ）＝４２１．７であって、他のどの分割Πの相対残差乖離度もδ_Ｒ （Π）＝δ（Π）／δ（Π_０ ）と定義した。
【００５１】
６のＳＮＰｓ（番号１、６、７、９、１１及び１４；以下を参照のこと）が、同時に生じる比較的小さなハプロタイプ変異にくらべて、かなり大きな（〜６０％）発現レベルの残差乖離度の原因となっていることがわかった。これらのＳＮＰｓの統計的な相互依存は、統計ソフトウエアＲ（Ｉｈａｋａ ａｎｄ Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ １９９６）を用いた帰納的２成分分割により構築された回帰ツリーによってさらに分析した。ツリー構築の過程において、従属変数（すなわち正規化された近位プロモーター発現）に関して２の最も均一なハプロタイプのサブグループを選択するために上記ＳＮＰｓは各分岐点において、個々に予測変数として用いた。結果物である中間ツリーの終端分岐点（‘リーフ’）で定義される分割のδ_Ｒ を最小化するように、新たな分裂を導入するのに貢献する分岐点及びＳＮＰを、選んだ。このプロセスをすべてのリーフが各ハプロタイプに対応するまで継続した。（‘成熟したツリー’）δ_Ｒ 予測値の信頼性を各ステップにおいて１０倍クロス−バリデーションによって評価し、標準誤差（ＳＥ）を計算した。
【００５２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける身長及び近位プロモーター発現の回帰分析を、調査された１２４人の身長のわかっている個体について、ＳＡＳソフトウエアパッケージのＲＥＧ手順を用いて実施した。μ_{ｎｏｒ，ｈ１}及びμ_{ｎｏｒ，ｈ２}は、所定の個体が有する２のハプロタイプの正規化された発現レベルの平均を表すとする。Ｈ１に対してホモ接合性でない個体（ｎ＝１０９）の身長を以下の：
【数３】

で表わされるようにモデル化し、決定係数、ｒ^２ を計算した。調査した１５４人の個体において少なくとも８回観察された７のプロモーターハプロタイプ（Ｈ１−Ｈ７）のために、ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｅｄｉａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ （Ｂａｎｄｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を構築した。
【００５３】
連鎖不平衡分析
プロモーターＳＮＰｓ間並びに個々のＳＮＰｓ間及び個々のＬＣＲハプロタイプ間の連鎖不平衡（ＬＤ）を、Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００１）によるｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｌｏｃｉのために考えられたパラメータρを用いて、調査された全１５４人の中から、ランダムに選ばれた１００人について評価した。ρ＝１が完全なＬＤを示す２の座に相当する一方、ρ＝０は完全なＬＤの欠除を示す。包含関係を保証するのに、母集団のサンプル（ヘテロ接合性＞５％）中で十分に多型であるのは８のＳＮＰｓのみであることがわかった。ＳＮＰ４との完全なＬＤによって、ＳＮＰ５を除外した（２の対ハプロタイプのみが存在する）。ＬＤ分析のために必要とされるようなＬＣＲ−近位プロモーターハプロタイプの組み合わせの頻度の最尤推定値を、学内で実施している期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを用いて得た。
【００５４】
結果
近位プロモーターハプロタイプ及び相対的プロモーター強度
４０のプロモーターハプロタイプについてｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるレポーター遺伝子アッセイにより研究し、それらがラット下垂体細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子発現を推進する能力に関して異なることを発見した（表３）。発現レベルは平均レベルで野生型の３０％を示す最小の発現をするハプロタイプ（ｎｏ．１７）と平均レベルで野生型の３８９％を示す最大の発現をするハプロタイプ（ｎｏ．２７）とでは１２倍以上の範囲で多様であることがわかった（表３）。１２のハプロタイプ（番号３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６及び２９）は、Ｈ１と比較して有意に低いレベルのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現と相関していた。逆に、全部で１０のハプロタイプ（番号１４、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９及び４０）は、Ｈ１に比較して有意に高いレベルのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現と相関していた（表３）。異なるＳＮＰハプロタイプを有する構築物を同一の翻訳開始部位を利用するプライマー伸長アッセイにより示した（データは示していない）。レポーター遺伝子構築物の発現は、ＧＣ細胞中よりもＨｅｌａ細胞中の方が１０００倍低かった（データは示していない）。
【００５５】
４０の異なるＧＨ１プロモーターハプロタイプのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現レベルを図２に図式で示す。高発現ハプロタイプがより低い頻度で発生する傾向にある（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｐ＜０．０１）一方、低発現ハプロタイプがより頻繁に発生する傾向にあるという有意な傾向が明らかである。この発見が選択作用を示唆するものであることから、選択効果を個体のＳＮＰｓのレベルで研究した。ここで研究された１５のＳＮＰｓについては、平均発現レベル（ハプロタイプの頻度により調整した）とコントロールにおける、よりまれな対立遺伝子の頻度は、正の相関関係のあることがわかった（Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数、ｒ＝０．３２、片側検定ｐ＜０．１０）。仮にＳＮＰ７を明らかな孤立値として除外するならば（よりまれな対立遺伝子と結びついた特別に高い発現レベルを示す）、片側検定でｒ＝０．５３、ｐ＜０．０５である。
【００５６】
個々のＳＮＰと相関する発現レベルは、強力に相互依存していることがわかった。したがって、観察されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現の多様性に不相応に寄与している、手がかりとなる多型部位のサブセットを同定する方法で発現データの分割をすることを試みた。１６のＳＮＰｓすべてを含む完全なハプロタイプによる分割は、相対残差乖離度δ_Ｒ （Π_１６）＝０．２４５を得た。ハプロタイプにおける多様性によって説明できない発現レベルの多様性が２４．５％あるということで解釈できる。１＜ｋ＜１６については、最小−δ_Ｒ −分割Π_{ｋ，ｍｉｎ} は、最小の相対残差乖離度を得たｋＳＮＰｓによるハプロタイプ分割と定義した。ｋとδ_Ｒ （Π _{ｋ，ｍｉｎ} ）の関係をΠ_{ｋ，ｍｉｎ} を含むハプロタイプの数とともに図３にあらわした。ｋ＝６とｋ＝７の間で量的な相異は明らかであり、δ_Ｒ （Π_{ｋ，ｍｉｎ} ）がごく小さな減少しかしなかった［δ_Ｒ （Π_{６，ｍｉｎ} ）＝０．３９７ ｖｓ δ_Ｒ （Π_{７，ｍｉｎ} ）＝０．３７１］のに対して、Π_{ｋ，ｍｉｎ} と相関するハプロタイプの数は１３から２２に増加した。したがって、Π_{６，ｍｉｎ} を定義づけるＳＮＰｓ１、６、７、９、１１及び１４はさらなる分析のための手がかりとなる多型の良好な選択物であると結論した。残りのＳＮＰｓのうちの６（番号３、４、８、１０、１２及び１６）は、“ごくわずかに情報を与える”と分類されうる。
これらのマーカーは、上記６の手がかりとなるＳＮＰｓと協同して、観察された４０のハプロタイプのうち３９について明らかにし、実質的にすべての説明できる乖離度（δ_Ｒ （Π_{１２，ｍｉｎ}）＝０．２４５）について説明づける。他の４のＳＮＰｓ（番号２、５、１３及び１５）は正規化されたｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現に関して“情報を与えるものではない”、なぜならそれらは我々のサンプル（ｎｏ．２）においては、単型性であるか或いは他のマーカーと完全に（番号５及び１３）又は完全に近い（ｎｏ．１５）連鎖不平衡にあるからである。
【００５７】
次に６の手がかりとなるＳＮＰｓの相関構造について一連の連続的に成長する（すなわちｎｅｓｔｅｄ）回帰ツリーを用いて評価した。回帰ツリー分析における慣習（Ｔｈｅｒｎｅａｕ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓｏｎ １９９７）に従って、完全に成長したツリーの中の標準誤差の中の１の中のクロスバリデートされたδ_Ｒ を伴う最小の中間ツリーを代表的な分割として選択した。この‘最適の’ツリーは、１０の内部分岐及び１１の終端分岐点を含むことがわかった（図４、表４）。上記ツリーの相対残差乖離度はδ_Ｒ ＝０．３９８に等しく、それによってハプロタイプの分割を通じて説明のつく、（１−０．３９７）／（１−０．２４５）≒８０％という乖離度を説明づけることができる。
【００５８】
１の最も重要な分割はＳＮＰ７によるものであり、これは、説明のつく分割の１５％を独立して担っている。このＳＮＰのＣ対立遺伝子を有する４のハプロタイプは、平均の正規化発現レベルでＨ１よりも１．８倍高い同質のサブグループ（リーフ１１）を定義する。ＳＮＰ７のＴ対立遺伝子を有するハプロタイプはさらにＳＮＰ９によって再分され、この多型の対立遺伝子Ｔ（μ_ｎｏｒ ＝１．２６）は対立遺伝子Ｇ（μ_ｎｏｒ ＝０．８４；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｚ＝７．０９、ｐ＜０．００１）よりも高い発現をおこす。結果としてできたｎｎＴＴｎｎハプロタイプは、ＳＮＰ６（Ｇ／Ｔ）により分割され終端分岐点（リーフ８）を形成するｎＧＴＴｎｎを生成し、これは野生型ハプロタイプＨ１を含む。興味深いことに、ＳＮＰ１１で再分された場合、ｎＴＴＴｎｎハプロタイプは、発現レベルにおける劇的な相違を明らかにした。ｎＴＴＴＧｎ（リーフ９）が低度の発現をおこす（μ_ｎｏｒ ＝０．６４）一方、ハプロタイプｎＴＴＴＡｎ（リーフ１０）は最大平均発現を示した（μ_ｎｏｒ ＝３．８９；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｚ＝５．１１、ｐ＜０．００１）。
【００５９】
ＳＮＰｓ７及び９のハプロタイプｎｎＴＧｎｎはＳＮＰｓ１４及び１で再分され、結果としてできたハプロタイプのうちの３は終端分岐点（リーフ１、６、及び７）を形成した。第４のハプロタイプ、ＧｎＴＧｎＡはさらにＳＮＰｓ１１及び６により分割される中程度の発現をおこした（μ_ｎｏｒ ＝０．８６）。興味深いことに、ＳＮＰｓ１４及び１の対立遺伝子のただ一つ特別な組み合わせだけがＳＮＰ７及び９のｎｎＴＧｎｎをバックグラウンドとして発現を増加させるという結果を生じた（ＡｎＴＧｎＧ、リーフ７、μ_ｎｏｒ ＝１．８３）。ＳＮＰ１１の対立遺伝子ＡはＳＮＰ６の対立遺伝子Ｔと組み合わされた場合、Ｇよりも高い発現と相関しており（ＧＴＴＧＡＡ、リーフ５、μ_ｎｏｒ ＝１．１８ ｖｓ ＧＴＴＧＧＡ、リーフ２、μ_ｎｏｒ ＝０．７４；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｚ＝７．０９、ｐ＜０．００１）、ＳＮＰ６の対立遺伝子Ｇと組み合わされた場合には逆が成り立つ（ＧＧＴＧＡＡ、リーフ４、μ_ｎｏｒ ＝０．７４ ｖｓ ＧＧＴＧＧＡ、リーフ３、μ_ｎｏｒ ＝１．０４；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｚ＝５．２８、ｐ＜０．００１）にもかかわらず、ハプロタイプＧｎＴＧｎＡについて考慮するとＳＮＰ６及び１１については発現に対する類似の非付加的効果もまた有意であった。
【００６０】
ハプロタイプの多様性の進化
本研究において多型であることがわかった１５のＧＨ１遺伝子プロモーターＳＮＰｓの中で１４の位置における選択的対立遺伝子は、遺伝子変換によって説明のつくものであり、なぜなら、それらは４の派生相同なヒト遺伝子のうちの少なくとも１と類似の位置にあるものと同一だからである（表２）。他の１０の哺乳動物の真正相同なＧＨ遺伝子プロモーターシークエンスとの比較により、ヒトＧＨ１遺伝子中のヌクレオチド位置−７５、−５７、−３１、−６、＋３、＋１６及び＋２５（ＳＮＰ８から１５までに対応している）にある最も頻度の高い対立遺伝子は哺乳動物の進化の間に厳格に保存されていたことが明らかとなった（Ｋｒａｗｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９ ）。おもしろいことに、ヒトＧＨ１遺伝子中の−１位置にある３の選択的対立遺伝子のうち最もまれなもの（ＳＮＰ１２）は、哺乳動物の真正相同な遺伝子中に厳格に保存されたものと同一であった。
【００６１】
‘Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ’（図５）は、野生型ハプロタイプＨ１は、１回の突然変異によって他の頻度の高いハプロタイプと直接連鎖されたものでないことを明らかにした。３番目に最もよく生じるハプロタイプ、Ｈ３が観察されていないハプロタイプ又は二重突然変異を介してＨ１に連鎖する一方、２番目に最もよく生じるハプロタイプ、Ｈ２、はＨ２３及びＨ１２を経由してＨ１に連鎖する。さらなるハプロタイプを取り込むためにこのネットワークを拡張することは、ハプロタイプごとの観察数が少ないことにより、信頼できないものと考えた。なおその上に、ネットワークの拡張は、多数の１塩対置換の導入を必然的に伴うものであろう。これらは、前に存在したハプロタイプ間での連続した遺伝子変換と区別できるものでないため、ネットワーク中での結果としての距離は、純粋な進化的関係を反映するものではないだろう。しかし、各突然変異は１回しか起こらないため、これは７の最も頻度の高いハプロタイプを連鎖する図５にあらわされたネットワークのケースであると考えて間違いないであろう。
【００６２】
いくつかの注目すべき例外を伴って、物理的距離の連鎖不平衡の一般的な減退が認められた（表５）。したがって、ＳＮＰ９は、すべての近位プロモーターＳＮＰｓと比較的弱いＬＤにあるＳＮＰ１６を含む他のＳＮＰｓと強いＬＤにあることがわかった。この発見は、ＳＮＰ９の起源が比較的遅いことを示唆する。しかし、ＳＮＰ８はＳＮＰ１１との方がＳＮＰ１０よりも、より強いＬＤにあったのに対して（ρ＝０．９２５ ｖｓ ０．６８７）、ＳＮＰ１０は、ＳＮＰ１２と完全なＬＤにあったがＳＮＰ１１とはそうでなかった（ρ＝０．３８１）。これらの例外的な発見は、近位プロモーターＳＮＰｓ間の現存するＬＤパターンが、遺伝子組み換えによる距離の崩壊のみにより発生したものではなく、むしろ、反復する突然変異、遺伝子変換又は遺伝子選択のような他のメカニズムの作用を反映するものであるらしいことを示唆する。
【００６３】
超最大及び準最小のハプロタイプの予測及び機能試験
ハプロタイプ依存性の近位プロモーター発現データについて得られた‘最適の’回帰ツリーに基づいて、それらの発現レベルの面からの潜在的な“超最大の”及び“準最小の”ハプロタイプを予測することを試みた。この目的のために、上記ツリーの適切なリーフの平均発現レベルを考慮して６の手がかりとなるＳＮＰｓの対立遺伝子を選択した（表４）。残りのＳＮＰｓの対立遺伝子は、個々のＳＮＰｓの発現をそれぞれ最大化又は最小化するように決定した。したがって、超最大のハプロタイプを予測するためにＳＮＰｓ１及び１４の対立遺伝子がリーフ７に含まれる一方、ＳＮＰｓ６、７、９及び１１の対立遺伝子はリーフ１０に含まれた。準最小のハプロタイプはリーフ１（ＳＮＰ１、７、９及び１４のための）を表すように選んだ。しかし、リーフ２（対立遺伝子Ｔ及びＧを示唆する）及び４（対立遺伝子Ｇ及びＡを示唆する）には、類似する低度の平均発現レベルが予想されたため、ＳＮＰｓ６及び１１に対する最適の対立遺伝子の選択はややあいまいなものとなった。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために両者について構築物を作成することとした。残りのＳＮＰｓのための仮定のハプロタイプは、超最大ハプロタイプＡＧＧＧＧＴＴＡＴ−ＡＴＧＧＡＧ及び準最小ハプロタイプＡＧ−ＴＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴ及びＡＧ−ＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴとして完成した。
【００６４】
これら３の合成ハプロタイプをその後構築し、ラット下垂体細胞中で発現させたところ、野生型（ハプロタイプ１）と比較してそれぞれ１４５±４、５５±５及び２０±８％の発現レベルを得た。
【００６５】
電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイにより明らかとなったＳＮＰ対立遺伝子間の相違
すべての対立遺伝子の変異体のためにすべての近位プロモーターＳＮＰ部位においてラット下垂体細胞を核タンパクの供給源として用いてＥＭＳＡを実行した。タンパクの相互作用のバンドは、−１６８、−７５、−５７、−３１、−６／−１／＋３及び＋１６／＋２５部位において顕著であった（表６）。対立遺伝子内でのタンパク相互作用のバンド数の相違は−７５（ＳＮＰ８）、−５７（ＳＮＰ９）、−３１（ＳＮＰ１０）、−６／−１／＋３（ＳＮＰｓ１１、１２、１３）及び＋１６／＋２５（ＳＮＰｓ１４、１５）位において顕著であった［図６；表６］。最後の２の部位の場合、特異的なＳＮＰ対立遺伝子の組み合わせについてのＥＭＳＡアッセイは、特異なタンパク結合が１２及び１５のＳＮＰ部位それぞれにおける対立遺伝子の多様性に寄与しうることを示唆した（表６）。ＨｅＬａ細胞抽出液を用いて分析をくり返したところ、５７位のみがタンパク相互作用の証拠を明らかに示し、それはＴ対立遺伝子ではなく、Ｇ対立遺伝子についてであった（データは示していない）。２の異なるＰｉｔ−１結合部位に対応するオリゴヌクレオチドを利用した競合実験の結果は、２のＳＮＰ８との相互作用タンパクの１がＰｉｔ−１であることと一致する（図６）。しかし、対立遺伝子特異的なタンパク相互作用が影響を受けずにいることは、含まれる他のタンパクはＰｉｔ−１でなかったことを意味している。
【００６６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプロモーターハプロタイプ発現とｉｎ ｖｉｖｏにおける身長との相関
ハプロタイプの特異的なＧＨ１近位プロモーターのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現を１２４人の成人男性コーカサス人の身長と相関させることを試みた。各ハプロタイプの平均発現値は、正規化されたｉｎ ｖｉｔｒｏの発現データから求め（表３）、上記２のハプロタイプの平均Ａ_ｘ ＝（μ_{ｎｏｒ，ｈ１}＋μ_{ｎｏｒ，ｈ２}）／２を各個体について計算した。Ｈ１についてホモ接合性である個体は分析から除いた、なぜならそれらのＡ_ｘ 値（１．０）は偶然に生じた多様性に寄与していないであろうからである。好適な遺伝形質を有する１０９人の身長の既知の個体サンプルを得た（表７）。身長の中央値（１．７６５ｍ）よりも高い及び低い身長をＡ_ｘ 値の中央値（０．９）よりも高い及び低いＡ_ｘ 値と比較したところ、身長とｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＨ１近位プロモーターのハプロタイプに相関した発現との相関が明らかとなった（Ｘ^２ ＝４．８１６、１ｄ．ｆ．， ρ＝０．０２８）。このことにもかかわらず、２次多項式を用いた回帰分析は上記２のμ_ｎｏｒ 値が自身の身長の予測について比較的劣ったものであることを示した。決定係数がｒ^２ ＝０．０３３（ｐ＞０．５）であったため、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＨ１遺伝子近位プロモーターハプロタイプに関しては身長の分散の約３．３％を占めていると結論しうる。
【００６７】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）の多型及び近位プロモーターの強度
調査されたグループからランダムに選ばれた１００人についてのスクリーニングにおいて３の新規な多型的変化をＧＨ１ ＬＣＲの部位Ｉ及びＩＩ（下垂体特異的な発現に必要である：Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）中に発見した。これらはヌクレオチド９９０位（Ｇ／Ａ；０．９０／０．１０）、１１４４位（Ａ／Ｃ；０．６５／０．３５）及び１１９４位（Ｃ／Ｔ；０．６５／０．３５）に位置していた［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９ に従って番号をつけた］。１１４４位及び１１９４位における多型は全連鎖不平衡にあり、以下の３の異なるハプロタイプ：ハプロタイプＡ（９９０Ｇ、１４４４Ａ、１１９４Ｃ；０．５５）、ハプロタイプＢ（９９０Ｇ、１１４４Ｃ、１１９４Ｔ；０．３５）及びハプロタイプＣ（９９０Ａ、１１４４Ａ、１１９４Ｃ；０．１０）が観察された。
【００６８】
上記３のＬＣＲハプロタイプが下流のＧＨ１遺伝子の発現に差次的な効果を及ぼすか否かを決定するために、多数の異なるＬＣＲ−ＧＨ１近位プロモーター構築物を作成した。上記３の選択的な１．６ｋｂ ＬＣＲを含むフラグメントをｐＧＬ３中、３の異なるタイプの近位プロモーターハプロタイプ、すなわち“高発現プロモーター”（Ｈ２７）、“低発現プロモーター”（Ｈ２３）及び“正常発現プロモーター”（Ｈ１）、の直接上流にクローン化し、全部で９の異なるＬＣＲ−ＧＨ１近位プロモーター構築物を得た。これらの構築物をその後ラットＧＣ細胞及びＨｅＬａ細胞の両者中で発現させ、その結果としてのルシフェラーゼ活性を測定した。ＧＣ細胞中では、ＬＣＲの存在は、近位プロモーター単独の場合に比較して、２．８倍まで発現を促進する（表８）。しかし、この反応誘発効果の程度は、連鎖されたプロモーターハプロタイプに依存する。分散二元分析（表９）は、両主要効果及びプロモーター ^＊ＬＣＲ相互反応が有意であり（ｐ＜０．０００１）、近位プロモーターが主要な効果を及ぼしていることを明らかにした。各プロモーターハプロタイプ個別に実施された９５％の有意性レベルにおけるＴｕｋｅｙのスチューデント化された範囲試験の結果もまた表８に含まれる。プロモーターハプロタイプ１と結合することにより、ＬＣＲハプロタイプＡの活性は、Ｎ（近位プロモーターを含むがＬＣＲを欠く構築物）の活性と有意に異なるが、ＬＣＲハプロタイプＢ及びＣの活性とはそれほど異ならない；ＬＣＲハプロタイプＢ及びＣは互いに、そしてＮと有意に異なる。しかし、プロモーター２７においては、ＬＣＲハプロタイプ間で有意な差は見い出されなかった。ＬＣＲを介した発現の誘発は、ＨｅＬａ細胞中の近位プロモーターハプロタイプにおいては認められなかった（データは示していない）。
【００６９】
ＬＣＲと近位プロモーターＳＮＰｓ間の物理的な距離が、物理的なハプロタイプを形成する連鎖を許容するには大きすぎるため、それらの間の連鎖不平衡（ＬＤ）を近位プロモーターについてのＳＮＰ間ＬＤ分析に含まれた１００人からの遺伝形質データを用いて最尤法により評価した。プロモーターＳＮＰｓ及びＬＣＲハプロタイプ間の対のＬＤはＳＮＰ１６を除くすべてのＳＮＰｓについて高いことが見い出された（表５）。したがって、ＳＮＰ１６は、ＳＮＰ１６と唯一強い連鎖不平衡にあることが発見されたＳＮＰであるＳＮＰ９の発生に先立って、くり返し突然変異を受けると結論した。ＳＮＰｓ４、８及び１６との連鎖不平衡の面でＬＣＲハプロタイプ間に実質的な相違があることは、ハプロタイプＡとは反対にＬＣＲハプロタイプＢが比較的若年であることを示唆している。
【００７０】
結論
ハプロタイプの分割は、６のＳＮＰｓ（番号１、６、７、９、１１及び１４）がＧＨ１遺伝子発現レベルの主要な決定因子であることを、さらなる６のＳＮＰｓがごくわずかに情報を与えるものである（番号３、４、８、１０、１２及び１６）こととともに同定した。すべての１６のＳＮＰｓの機能的特性をＥＭＳＡアッセイにより研究し、ＧＨ１近位プロモーター中の６の多型性部位が核酸結合タンパクと相互作用することを示した；これら部位のうちの５［−７５（ＳＮＰ８）、−５７（ＳＮＰ９）、−３１（ＳＮＰ１０）、−１（ＳＮＰ１２）及び＋２５（ＳＮＰ１５）］については、選択的対立遺伝子は差次的なタンパク結合を示した。これらの５の部位の中で、ＳＮＰ９のみが、帰納的分割により、ＧＨ１遺伝子発現レベルの主要な決定因子でもあることも同定された。この明らかな矛盾は、全４０ハプロタイプ中に現れるすべての遺伝的多様性を考慮した回帰ツリー分析によって説明しうる。さらに、分割手順においては、個々のＳＮＰｓは、発現レベルに対するそれらの総効果を基礎として評価され、直接測定可能な機能的特性を通じてではない。これは、対立遺伝子特異的なタンパク結合以外の因子が回帰ツリー中の個々のＳＮＰｓの位置を決定するのに働いていた可能性のあることを意味する。
【００７１】
ＧＨ１遺伝子プロモーターの強度におけるハプロタイプ依存性の相違の分子的基礎は、したがって、複数の転写因子のそれらの同族の結合部位のオルターナティブ配列への特異的な結合の総効果にある。これらの配列は、これらに含まれる、観察されたプロモーターハプロタイプを組み合わせによって構成する多様なＳＮＰｓの異なる対立遺伝子に基づいて相異なる。いくつかの転写因子はシス−作用を有するＤＮＡ配列モチーフにより直接的に調和させられ、他は３次元のジグソーパズルになぞらえられるタンパク−タンパク相互作用により間接的に調和させられる：ＤＮＡ配列モチーフはパズルテンプレートを供給し、転写因子はパズルピースを構成する。プロモーターのこのモジュール景観は、一定のハプロタイプ中の異なるＳＮＰの組み合わせの効果が、転写因子の結合、トランスクリプトソームの会合及び従って遺伝子発現に特異的な効果を及ぼすためにどのように伝達されるかを想像することを助ける。したがって、例えばＧＨ１プロモーターＳＮＰｓの遺伝子発現に対する観察された非付加的効果は、一定のタンパクの１のＳＮＰにおける対立遺伝子特異的な差次的な結合が今度は２番目のタンパクの別のＳＮＰ部位、それ自身対立遺伝子特異的なタンパク結合に働く、への結合に影響することによって理解されうる。
【００７２】
ＧＨ遺伝子クラスターの上流にあるＬＣＲはエンハンサー活性を有し、発現の組織特異性を与え、そしてヒストンのアセチル化の伝播を通じて長い範囲の遺伝子の活性化を促進する配列要素を有する（Ｓｈｅｗｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｓｈｅｗｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。成長ホルモン産生細胞特異的なＬＣＲの決定因子は、ＧＨ１遺伝子の−１４．５ｋｂ上流の１．６ｋｂの領域内（部位Ｉ及びＩＩ）に存在する（Ｓｈｅｗｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９ ）。我々のシステムにおいては、この１．６ｋｂ ＬＣＲフラグメントの導入は、ＧＨ１近位プロモーターの活性を２．８倍まで亢進したが、亢進の程度は、連鎖した近位プロモーターハプロタイプの同一性に依存することが発見された。逆に、所定のハプロタイプの近位プロモーター活性の亢進もまた、ＬＣＲハプロタイプの同一性に依存することが発見された。合わせて考えると、これらの発見はＧＨ１遺伝子発現における個体間での相違の遺伝的基礎は、非常に複雑であるらしいことを意味している。
【００７３】
【表１】

【００７４】
【表２】

【００７５】
【表３】

【００７６】
【表４】

【００７７】
【表５】

【００７８】
【表６】

【００７９】
【表７】

【００８０】
【表８】

【００８１】
【表９】

【００８２】
【表１０】

Claims (34)

1. 個体における成長ホルモン異常の存在又は成長ホルモン異常に対する感受性を診断する方法であって、以下のステップ：
   （ａ）試験されるべき個体から、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の近位プロモーター領域をコードする核酸分子の試験サンプルを得ること；
   （ｂ）前記核酸分子を、以下の６のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４（表１に示す）、のうちの複数又はその対応するハプロタイプ（同様に表１に示す）；又はそれとの連鎖不平衡における多型
   について調べること；そして
   （ｃ）複数の前記ＳＮＰ’ｓ、又はそれらの前記対応するハプロタイプ、或いはそれらの前記対応する多型が存在する場合、前記個体が成長ホルモン異常を患っているか、又は成長ホルモン異常に対する感受性があるかについて決定すること、
   を含む前記方法。
2. 前記多型が前記遺伝子の遺伝子座制御領域の１１４４位にある、請求項１に記載の方法。
3. 前記多型が前記遺伝子の遺伝子座制御領域の１１９４位にある、請求項１に記載の方法。
4. 個体における成長ホルモン異常の存在又は成長ホルモン異常に対する感受性を診断する方法であって、以下の：
   （ａ）試験されるべき個体から、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の近位プロモーター領域をコードする核酸分子の試験サンプルを得ること；
   （ｂ）前記核酸分子を、以下の表１中のハプロタイプであって番号３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９で示されたうちの１又はそれ以上について調べること；そして
   （ｃ）前記ハプロタイプが存在する場合、個体が成長ホルモン異常を患っているか、又は成長ホルモン異常に対する感受性があるかについて決定すること、
   を含む前記方法。
5. 上述の前記試験ステップ（ｂ）が前記遺伝子のＰＣＲ増幅法を含む、先の請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 以下の：
   ＧＧＧ ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＣ（ＧＨ１Ｆ）；及び／又は
   ＴＧＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ Ｃ（ＧＨ１Ｒ）、
   で表わされるプライマーが１又はそれ以上使用される、請求項５に記載の方法。
7. 前記プライマーが増幅された産物の検出の便宜のためにラベルされる、請求項６に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の診断方法を実行するための好適なキットであって、以下の：
   （ａ）成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の近位プロモーター領域を検出し、及び／又は増幅するための以下のプライマー：
   ＧＧＧ ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＣ（ＧＨ１Ｆ）；
   ＴＧＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ Ｃ（ＧＨ１Ｒ）；
   の中の少なくとも１、そして、場合により、
   （ｂ）患者のＤＮＡの望ましい領域を増幅するためのＰＣＲを実行するのに好適な１又はそれ以上の試薬、
   を含む前記キット。
9. 請求項８に記載のキットであって、ここで１、６、７、９、１１及び１４と定義されたＳＮＰ’ｓを含む遺伝子の選択された領域に相補的な他のプライマーが付加的に又は代替的に用いられる、前記キット。
10. 以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４のうち複数を含むＧＨ１の近位プロモーター領域を少なくとも含むベクター。
11. 前記領域が少なくともＳＮＰ’ｓ６及び９を含む、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記領域が少なくともＳＮＰ’ｓ１０及び１２を含む、請求項１０に記載のベクター。
13. 前記領域が少なくともＳＮＰ’ｓ８及び１１を含む、請求項１０に記載のベクター。
14. 前記領域が表１に示された以下のハプロタイプ：３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９のうちのいずれか１又はそれ以上を含むことに特徴を有する、請求項１０に記載のベクター。
15. さらにここで記載された通りＧＨ１遺伝子座制御領域近位プロモーターの融合構築物を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
16. 請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のベクターであって、前記近位プロモーター領域が、選択された遺伝子のコード領域に機能的に連鎖しており、ここで上記遺伝子において前記近位プロモーターの活性がモニターされることができる、前記ベクター。
17. 請求項１６に記載のベクターであって、前記近位プロモーター領域が成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）のコード領域と連鎖している、前記ベクター。
18. 請求項１６又は１７に記載のベクターであって、前記遺伝子中の前記近位プロモーター領域が、さらに前記遺伝子の発現及びそれによる前記近位プロモーター領域の活性をモニターすることのできるタグに連鎖している、前記ベクター。
19. 前記タグがタンパクタグである、請求項１８に記載のベクター。
20. 成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の少なくとも１のさらなる近位プロモーター領域を有する請求項１０〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
21. 前記追加の近位プロモーター領域が、最初のプロモーター領域と異なる、請求項２０に記載のベクター。
22. 各近位プロモーター領域が異なるコード配列に連鎖している、請求項２１に記載のベクター。
23. 請求項２１又は２２に記載のベクターであって、各近位プロモーター領域が直接的又は間接的に、前記各プロモーター活性をモニターすることのできる、異なるタグに連鎖している、前記ベクター。
24. 請求項１０〜２３のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
25. 遺伝子組み換え細胞株であって、レポーター分子を発現するように設計されており、ここで上記レポーター分子の発現は、表１に示す以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１又は１４のうちの複数及び／又は以下のいずれの１又はそれを越えるハプロタイプ：３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９を含む成長ホルモン遺伝子の近位プロモーターに制御されている、前記細胞株。
26. 非ヒトトランスジェニック動物であって、表１に示した以下のＳＮＰ’ｓ：１、６、７、９、１１及び１４のうちの複数を含むＧＨ１プロモーターを有する結果として、及び／又は、前記プロモーターが表１に示した以下のハプロタイプ：３、４、５、７、１１、１３、１７、１９、２３、２４、２６又は２９のうちの１に特徴を有する結果として、成長ホルモンの過少発現している前記動物。
27. 前記プロモーターがハプロタイプ２３に特徴を有する、請求項２６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
28. 前記プロモーターがハプロタイプ２７に特徴を有する、請求項２６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
29. 前記プロモーターがハプロタイプ１に特徴を有する、請求項２６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
30. ハプロタイプＡＧＧＧＧＴＴＡＴ−ＡＴＧＧＡＧに特徴を有する、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の合成近位プロモーター領域。
31. ハプロタイプＡＧ−ＴＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴに特徴を有する、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の合成近位プロモーター領域。
32. ハプロタイプＡＧ−ＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴに特徴を有する、成長ホルモン遺伝子（ＧＨ１）の合成近位プロモーター領域。
33. 成長ホルモン異常の治療に用いることのできる治療的に活性のある薬物のスクリーニングのための方法であって、
    それぞれ請求項２４又は２５に記載の細胞又は細胞株を候補薬物にさらすこと、そして
    候補薬物が、成長ホルモン遺伝子のプロモーター領域の活性に影響を及ぼしたかどうか、そしてそれにより、細胞株の場合には、レポーター分子の発現に影響を及ぼしたかどうかを決定すること、
    を含む前記方法。
34. 成長ホルモン異常の治療に用いることのできる、治療的活性のある薬物のスクリーニングのための方法であって、
    請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補薬物にさらすこと、そして
    その後、前記動物の成長をモニターすること、そして
    動物の成長によって、候補薬物が正の効果を示した場合には、前記成長は、前記候補薬物の治療的活性を示唆するものであると結論付けること、
    を含む前記方法。

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