KR20040034582A - 내공생체 세포소기관의 시험 및 그것에 의해 동정할 수있는 화합물 - Google Patents

내공생체 세포소기관의 시험 및 그것에 의해 동정할 수있는 화합물 Download PDF

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에베리네 카테리나 안나 클라시나 팀메르만스
안토니이 드론데
이레네 요한나 모니카 돕벨라에르
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Abstract

본 발명은 육안으로 볼 수 있거나, 또는 육안으로 볼 수 없는(미세) 생물체이며, 단세포 또는 다세포 특성인 세포성 생물체의 질병의 진단, 또는 그 기능을 결정하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 제 2 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물에 대한 상기 생물체로부터 얻은 샘플의 제 1 내공생체 세포성 생물체의 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어지는, 세포성 생물체의 기능을 결정하는 방법을 제공한다.

Description

내공생체 세포소기관의 시험 및 그것에 의해 동정할 수 있는 화합물{TESTING ENDOSYMBIONT CELLULAR ORGANELLES AND COMPOUNDS IDENTIFIABLE THEREWITH}
세포성 생물체의 기능(기능부전)을 연구하는 질병의 진단 의사들은 고전적으로기능 부전의 여러가지 태양에 대한 관련 정보를 얻기 위하여 상기 생물체로의 광범위한 침투(inroad)를 사용할 수 있다. 이들 침투는 매우 다양하며, 실시예들의 범위는 여러 환자들로부터 얻은 소변 샘플을 연구함으로서 신장 결석의 상대적 비율을 탐지하는 것, 내시경 검사를 통하여 소장의 궤양의 존재 또는 부존재를 탐지하는 것, 핵자기 공명(NMR)에 의해 탐지할 수 있는 종양을 정밀검사하는 것, 혈장내 인슐린 수준 및/또는 포도당 농도를 시험함으로서 당뇨병을 탐지하는 것으로부터 암유전자(oncogene)의 전사 수준을 결정함으로서 암의 소인을 결정하는 것 등에 이르기까지 다양하다.
최근, 동물 및 식물과 같은 고등 생물체의 질병 또는 기능 부전(반대로, 건강 및 적절한 기능)의 탐지는, 이들 생물체로부터 얻은 샘플을 시험하고 이들 샘플을 실험실에서 연구하는 것에 매우 많이 의존한다. 상기 생물체의 기능 부전의 질병(의 태양들)을 결정하고, 동정하고, 탐지할 수 있는 유리한 방법이 종종 발견될 때, 이것은 또한 상기 질병 또는 기능 부전(의 태양들)의 치료용 화합물 또는 방법에 대한 시험 또는 스크리닝에 유용하거나, 상기 질병 또는 기능 부전(의 태양들)을 야기하는데 관계되는 화합물 또는 방법에 대한 시험 또는 스크리닝에 유용한 것이 일반적이다; 진단에 사용된 것과 같거나 비슷한 방법을 사용함으로서, 본 질병 또는 기능 부전을 치료 및/또는 야기하는 후보 화합물 또는 방법의 유용성을 측정하는 것이 일반적으로 가능하다. 확실히, 생명과학 실험실은 언제나 질병 또는 기능부전 및 질병 또는 기능부전의 야기 및/또는 치료에 관한 화합물 및 방법을 얻기 위하여 생물체들에 대한 다른 침투를 필요로 한다.
본 발명은 육안으로 볼 수 있거나 또는 볼 수 없는(미세; micro) 생물이며, 다세포성 또는 단세포성 특성인, 세포성 생물체의 질병의 진단 및/또는 기능의 결정에 관한 것이다.
도 1은 DNA 및 RNA 표적 서열에 대한 표준 곡선의 예들을 나타낸 도이다.
도 2는 DDC 존재하에서 배양된 섬유아세포에서 미토콘드리아 DNA 및 염색체 DNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 3은 DDC 존재하에서 배양된 섬유아세포에서 미토콘드리아 RNA 및 염색체가 코드화하는 RNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 4는 DDC 존재하에서 배양된 섬유아세포에서 미토콘드리아 RNA 및 염색체 DNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 5는 DDC 존재하에서 배양된 섬유아세포에서 미토콘드리아(mt) RNA 및 미토콘드리아 DNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 6은 DDC 존재하에서 배양된 섬유아세포에서 염색체가 코드화하는 RNA 및 염색체 DNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 7은 4주 동안 DCC와 함께 배양된 후, DDC의 부존재하에서 배양된 섬유아 세포에서 미토콘드리아 DNA 및 염색체가 코드화하는 DNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 8은 4주 동안 DCC와 함께 배양된 후, DDC의 부존재하에서 배양된 섬유아 세포에서 미토콘드리아 RNA 및 염색체가 코드화하는 RNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 9는 5일 동안 DDC의 존재하에서 배양된 PBMCs의 미토콘드리아 DNA 및 염색체 DNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 10은 5일 동안 DDC의 존재하에서 배양된 PBMCs의 미토콘드리아 RNA 및 염색체가 코드화하는 RNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 11은 제한 효소 Msp I으로 전처리를 한 SNRNP DNA NASBA와, 전처리를 하지 않은 SNRNP DNA NASBA의 비교를 나타낸 도이다.
도 12는 미토콘드리아 DNA를 함유하는 플라스미드의 4x105(A) 분자, 2x105(B) 분자, 105(C) 분자, 5x104(D) 분자, 2.5x104(E) 분자, 또는 104(F) 분자와 혼합된, Snrp DNA를 함유하는 1000 분자의 플라스미드의 각 반응 시간에서의 형광을 나타낸 도이다. Snrp 핵 DNA에 대한 증폭된 미토콘드리아 DNA의 분자량 비율 곡선(G)은 각 시간에서의 형광에 상응하는 기울기의 비율에 대하여 플롯되었다.
도 13은 미토콘드리아 DNA를 포함하는 플라스미드의 4x105(A) 분자, 2x105(B) 분자, 105(C) 분자, 또는 5x104(D) 분자와 혼합된, Snrp DNA를 함유하는 1000 분자의 플라스미드의 각 반응 시간에서의 형광을 나타낸 도이다. 플라스미드 Snrp 핵 DNA에 대한 증폭된 플라스미드 미토콘드리아 DNA의 분자량 비율의 표준 곡선 (E)는 도 A-D로부터 유도된 바와 같이 시간 중 상응하는 형광의 기울기의 비율에 대하여 플롯되었고, 닫힌 동그라미(closed circles)는 데이타 포인트를 나타낸다. 도 F-I는 5 μM의 ddC의 존재하에서의(H, I), 그리고 부존재하에서의(F, G) PBMC의 1:10(F, H) 및 1:100(G, I) 희석물인 경우를 나타내는 도이다. 도 E에서, 정사각형은 ddC의 부존재하에서 배양된 PBMC 샘플을 나타내고, 마름모는 5 μM ddC의 존재하에서 배양된 PBMC 샘플을 나타낸다.
도 14는 젖산성 산성증으로 죽은 HIV-1 감염 환자의 4개의 혈액 PBMC 샘플에서 염색체 DNA 한 카피 당 미토콘드리아(mt) DNA 카피수를 나타낸 도이다. 시점에 대한 추가적인 설명은 본문을 참조하시오.
도 15A는 HIV-1 감염 개체의 CD4 양성 세포수 및 HIV-1 RNA 적재량을 나타낸 도이다. X축 아래에서 ddC 및 AZT로 표시된 막대(bar)는 이들 약물로 치료한 기간을 나타낸다. X축 아래쪽의 화살표 4개는 PBMC의 샘플이 미토콘드리아 DNA 함량 및 젖산-피루브산 비율에 대하여 분석된 시점을 나타낸다. 시점 4 이후 대략 한달 후에 환자는 젖산성 산성증으로 죽었다.
도 15B는 왼쪽 패널은 PBMC 샘플 1 내지 4의 젖산-피루브산 비율을 나타낸다. 젖산-피루브산 비율에서의 어떠한 증가도 이들 PBMC에서 측정할 수 없었다. 오른쪽 패널은 샘플 1 내지 4에서의 PBMC의 미토콘드리아 DNA 함량을 나타낸다. 이 실험에서, 미토콘드리아 DNA 함량에서의 명백한 감소가 관측되었다.
도 16는 입력(input)으로 염색체 DNA에 대한 미토콘드리아 DNA의 다른 비율을 사용하여 ROX(염색체 DNA, 회색선) 및 FAM(미토콘드리아 DNA, 검은색선) 형광 신호의 각 시간에서의 형광을 나타낸 도이다. 아래쪽 패널에서, 신호의 비율 및 DNAs의 비율사이에서의 선형관계를 나타낸다.
도 17은 처음 4주 동안 ddC의 존재하에서 배양되고, ddC의 존재하에서 그리고 부존재하에서 지속적으로 배양된 섬유아세포에서 측정된 젖산-피루브산 비율을 나타낸 도이다.
도 18은 ddC의 존재하에서 배양된 섬유아세포의 ROX(염색체 DNA, 회색선) 및 FAM(미토콘드리아 DNA, 검은색선) 형광 신호의 각 시간에서의 형광을 나타낸 도이다. 왼쪽 상단에서 오른쪽 상단까지의 패널은 각각 1, 2, 3 및 4주 동안 ddC의 존재하에서 배양된 것이다. 왼쪽 하단의 두 개의 패널은 각각 7주 및 10주 동안 ddC의 존재하에서 지속적으로 배양된 것이다. 오른쪽 하단의 두 개의 패널은 각각 7주 및 10주 동안 ddC의 부존재하에서 지속적으로 배양된 것이다.
도 19는 ddC의 존재하에서의(점무늬 막대), 및 부존재하에서의(줄무늬 막대) 배양 기간 중 PBMC에서 미토콘드리아의 퍼센트를 표시하는 막대를 나타낸 도이다. 대조구(DMSO)에서의 미토콘드리아 DNA의 양은 각각의 주어진 시점에서 100%로 고정되었다.
도 20은 각각 AZT, AZT+ddI 및 AZT+ddC로 치료된 3개의 환자군에서의 미토콘드리아 DNA 함량의 감소를 나타낸 도이다. 막대 위의 P-값은 치료의 시작, 제로 시점에 대하여 비교한 미토콘드리아 DNA 함량에서의 유의한 변화를 나타낸다.
도 21은 각각 AZT, AZT+ddI 및 AZT+ddC로 치료 중 3명의 개별적인 환자의 미토콘드리아 DNA 함량을 나타낸 도이다.
도 22는 입력으로서 염색체 DNA에 대한 미토콘드리아 RNA의 다른 비율을 사용하여 ROX(염색체 DNA, 회색선) 및 FAM(미토콘드리아 RNA, 검은색선)의 각 시간에서의 형광을 나타낸 도이다. 아래쪽 패널에서는, 신호의 비율 및 RNA 및 DNAs의 비율 사이에서의 선형 관계를 나타낸다.
도 23은 처음 8주 동안 ddC의 존재하에서 배양한 다음, 16주 까지 ddC의 존재하에서, 그리고 부존재하에서 지속적으로 배양된 섬유아세포에서의 미토콘드리아 RNA의 양을 표시하는 막대를 나타낸 도이다.
도 24는 부작용 때문에 항-레트로바이러스 치료를 바꾸는 환자의 ATHENA-연구를 나타낸 도이다.
도 25는 DNA-NASBA 증폭에 대한 도식적인 표현을 나타낸 도이다.
도 26은 표 1에서 나타낸 바와 같이 증폭 프라이머의 일부가 위치한 곳을 나타내는 두 개의 영역을 갖는 미토콘드리아 DNA의 유전학적인 지도를 나타낸 도이다. 표 1에서 나타낸 다른 증폭 프라이머는 미토콘드리아 게놈의 다른 영역에 위치하고, 여기에서는 나타내지 않는다.
본 발명은 상기 세포로부터 얻은 샘플에 존재하는 다른 핵산 또는 유전자 산물에 대하여 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어진, 세포성 생물체의 기능(기능 부전)을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 용어에서, "상대적 비율"이라 함은 상기 제 2 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양에 대한 상기 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양을 의미한다. 상기 상대적 비율은 예를 들면 상기 제 1 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양을 제 2 핵산 또는 그들의 유전자 산물의 양으로 나누거나 또는 그 반대로 나눔으로서 결정될 수 있다. 또한 한쪽 또는 양쪽화합물의 양을 기준 값에서 빼거나, 또는 기준값으로 나눌 수 있다. "세포성 생물체의 기능을 결정한다" 라고 함은 본 발명에서 상기 세포성 생물체이 그들의 자연적 건강 상태에 있는지, 또는 상기 미생물이 예를 들면 질병 및/또는 (독성) 화합물에 의하여 다소 영향을 받는지를 결정한다는 의미로 사용되었다. 상기 질병 및/또는 (독성) 화합물은 임상적 징후가 존재할 정도로 상기 생물체에 영향을 미칠 수 있다. 다시 말하면 상기 질병 또는 (독성) 화합물은 임상적 징후가 (아직) 발현되지 않더라도 상기 생물체에 대하여 영향력을 가질 수 있다.
내공생체(endosymbiont) 세포소기관은 진핵 세포의 진화에서 매우 초기에 원핵 세균에서 유래된 것으로 생각되는 진핵 세포의 소기관들이다; 이들 세균은 (생각되기로는) 초기 진핵 세포와의 공생에 관여했었고, 현재는 이들 내공생체 소기관을 포함하는 진핵 세포는 일반적으로 그들이 없이는 살아갈 수 없다; 현재 어떤 진핵 세포도 미토콘드리아 없이는 적절하게 기능을 할 수 없고, 대부분의 식물 세포는 전색소체(proplastids), 또는 엽록체, 황백체(etioplast), 백색체(amyloplast), 지방체(elioplast), 또는 잡색체(chromoplast)와 같은 그로부터 유래한 소기관이 존재하지 않을때, 적어도 기능부전을 보일 것이다. 이들 소기관은 일반적으로 적어도 부분적으로는 비록 일부 핵의 조절을 받기는 하지만 여전히 유의한 자율성을 갖는 자가복제 개체라고 보여진다.
특히, 본 발명은 상기 내공생성 세포소기관 핵산(DNA 또는 RNA 인) 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율이 상기 샘플에서 탐지할 수 있는 본질적으로 핵의 핵산(DNA 또는 RNA 인)의 양에 대하여, 또는 예를 들면 상기 샘플의 핵 또는 세포질의 분획 또는 그들의 일부 등에 존재하는 상기 핵의 핵산(본 발명에서의 핵산은 염색체 DNA 및 그들로부터 전사된 RNA를 포함한다)의 유전자 산물(mRNA 또는 (폴리)펩티드와 같은 전사 및/또는 번역에 의하여 유래할 수 있는)의 양에 대하여 결정되는 방법을 제공한다. 작은 핵 리보뉴클레오트로테인(SNRNP)의 요소들을 코드하는 DNA 또는 그에 대응하는 mRNA, 또는 염색체 DNA로부터 유래한 본질적으로 통상의 다른 핵산이 그들의 편재적인(ubiquitous) 존재 때문에 시험에 특히 유용하다. 이런 방식으로 본 발명은 미토콘드리아 및/또는 전색소체 관련 질병과 같은 내공생체 세포소기관 관련 질병을 연구하기 위한 방법을 제공한다. "내공생체 세포소기관 관련 질병"이라 함은 본 발명에서 상기 내공생체 세포소기관 핵산 및 그들의 유전자 산물의 양 및/또는 적어도 하나의 성질이 천연적 상황에 비해 변하는 경우를 의미한다. 예를 들면, 상기 핵산의 발현이 감소될 수 있다. 상기 소기관의 DNA에서의 결함에 의하여 코드화되는 등의 내공생체 세포소기관 관련 질병은, 많은 다른 징후들이 나타나며, 돌연변이형과 야생형 핵산이 하나의 세포 내에서 발견되고 그들의 배열이 달라질 수도 있는 이종조직성 (heteroplasmy) 때문에 종종 그들의 발현이 변한다(따라서, 일반적으로 임상적 매개변수 단독의 시험으로는 발견하기 어렵다). 내공생성 세포소기관 관련 질병은 종종 발병한 개체의 나이가 많아질수록 악화된다. 내공생체 세포소기관 관련 질병은 또한 다양한 약제로 다른 질병을 치료한 후에 종종 관찰될 수 있으며, 이것은 치료하는 동안 피하는 것이 좋을 약제들의 각종 부작용에 기인한다. 이들 부작용은 지금 본 발명에서 제공된 방법을 사용하여 좀더 잘 연구될 수 있다.
나아가, 본 발명은 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율이 상기 샘플에서 탐지될 수 있는 제 2(다른) 내공생체 세포소기관 핵산(DNA 또는 RNA인)의 양에 대하여, 또는 상기 내공생체 세포소기관 핵산의 유전자 산물(mRNA 또는 (폴리)펩티드와 같은 전사 및/또는 번역에 의하여 얻을 수 있는)에 대하여 결정되는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 태양에서,방법은 미토콘드리아 DNA와 같은 소기관 DNA와 관련 미토콘드리아 RNA 또는 그들의 유전자 산물 등의 상응하는 전사적으로 유도할 수 있는 소기관 RNA 사이의 비율을 결정하는데 관여한다. 이런 방식으로 전사 및/또는 번역의 수준이 결정될 수 있다. 전사 및/또는 번역의 천연적 수준에 비교한 전사 및/또는 번역의 수준에서의 변화는 상기 소기관의 변형된 기능에 대한 징후이다. 질병 때문에 및/또는 특정 치료의 부작용 때문에, 상기 변형된 기능은 상기 소기관의 기능 부전일수 있다. 상기 기능부전은 예를 들면 감소된 수준의 전사를 포함한다. 대체적으로, 예를 들면 내공생체 세포소기관 관련 질병의 치료 및/또는 치유 동안, 상기 변형된 기능은 상기 기능의 개선된 기능일 수 있다.
상기 기능부전은 또한 증가된 수준의 전사를 포함할 수 있다. 질병 또는 질병의 치료는 내공생체 세포소기관 DNA의 양의 감소와 관련될 수 있다. 그러나, 상기 감소는 적어도 상기 질병의 제 1단계에서, 상기 DNA의 전사에서의 증가에 의하여 적어도 부분적으로 보충될 수 있다. 이런 방식으로 상기 내공생체 세포소기관 DNA으로부터 유래한 RNA 양은 상기 내공생체 세포소기관 DNA의 양에 비하여 전혀 감소하지 않거나, 또는 상대적으로 적게 감소한다. 따라서, 상기 질병 또는 치료의징후적 부작용은 아직 (완전히) 인식되지 않을 수 있다. 그러나, 상기 내공생체 세포소기관 DNA 양의 추가적 감소 시, 상기 DNA로부터 유래한 RNA 양도 결국은 상당한 수준으로 떨어질 것이다. 부작용은 그 후에 일어날 수 있다. 통상적으로 부작용의 발현시에, 질병이 치료되거나, 또는 치료가 감소되거나 중단된다. 그러나, 이런 통상적 방식으로, 환자는 이미 부작용(들)으로 고통받는다. 그러나 본 발명의 방법을 이용하면, 임상적 징후를 포함하는 부작용이 예견될 수 있다. 예를 들면, 내공생체 세포소기관의 전사 및/또는 번역의 변화된 수준은 세포성 생물체의 변화된 기능, 예를 들면 (미래의) 부작용에 관한 상기 생물체의 기능 부전을 암시한다. 핵의 핵산 또는 그들의 유전자 산물의 양에 대한 내공생체 새포소기관 DNA 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율의 변화도 또한 세포성 생물체의 변화된 기능을 암시한다.
본 발명의 다른 태양에서, 다른 두 소기관 DNA들 또는 관련된 유전자 산물들 사이의 비율이 결정된다. 한 태양에서, 본 발명의 방법은 상기 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및 상기 제 2 내공생체 세포소기관 핵산이 같은 종류의 소기관으로부터 얻을 수 있도록 제공된다. 예를 들면 상기 소기관이 미토콘드리아를 포함한다.
본 발명의 방법은 질병의 단계 결정(staging)에 특히 적합하다. 임상적 징후가 전혀 없거나 기본적으로 거의 나타나지 않은 동안에도, 생물체는 이미 질병에 걸려있을 수 있다. 그러나, 임상적 징후가 기본적으로 존재하지 않더라도, 제 2 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양에 대한 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율은 이미 변화했을 수 있다. 실시예에서 나타나듯이, 젖산 피루브산 비율의 결정과 같이 임상적 징후 및/또는 통상적 시험이 생물체의 변화된 기능을 나타내기 이전에, 상기 상대적 비율의 상기 변화가 결정될 수 있다. 따라서, 상기 상대적 비율은 특정 질병의 단계를 결정하는데 매우 유용하다. 본 발명은 그러므로 한 태양에서, 질병의 단계를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 이는 상기 질병으로 고통받거나 또는 상기 질병이 발병할 위험이 있는 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어진다.
질병의 단계를 결정하는 본 발명의 방법은 진단에 사용될 수 있다. 예를 들면, 사람들은 특정한 시간 간격을 두고 본 발명의 방법에 의하여 정기적으로 테스트 받을 수 있다. 다른 방법으로는 사람들은 그들이 일부 임상적 징후를 가지고 있는 때 테스트 받을 수 있다. 상기 상대적 비율에서의 변화는 질병의 특정한 정도를 나타낸다. 상기 질병의 종류는 본 발명의 방법에 의하여 진단될 필요가 없다.
본 발명의 다른 가능한 용도는 항-기생충제 화합물, 항생제 화합물, 세포정지제 화합물 등과 같은 가능한 의약 또는 약학적 조성물의 유리한 작용 및/또는 부작용에 대한 후보 약물 테스트에 있다. 예를 들면, 본 발명은 후보 화합물의 치료적 활성 및/또는 부작용을 결정하는 방법, 예를 들면 세포성 생물체의 기능 부전에 대한 치료에서의 유용성을 결정하는 방법을 제공하며, 이는 바람직하기는 상기 생물체, 또는 같은 종 또는 속에 속하는 본질적으로 관련된 생물체이며, 상기 화합물이 공급되어진 상기 생물체로부터 얻은 샘플에서의 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어진다. 상기 후보 화합물이 상기 생물체에 투여된 후 특정 생물체의 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율이 변한다면, 이것은 상기 화합물의 상기 생물체에 투여시의 상기 화합물에 관한 치료적 활성 및/또는 부작용의 징후이다. 부가적으로, 이것은 본질적으로 관련된 생물체에서의 상기 화합물에 관한 치료적 활성 및/또는 부작용의 징후이다. 따라서, 세포성 생물체의 기능 부전의 치료를 위한 후보 화합물의 치료적 활성 및/또는 부작용을 결정하기 위하여, 본 발명의 방법에서 정확하게 같은 생물체를 사용할 필요는 없다.
다른 태양에서, 본 발명은 상기 의약이 제공되어지고, 바람직하기는 상기 생물체인 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어진, 의약품의 치료적 활성 및/또는 그들의 유전자 산물을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 용어에서, "치료적 활성" 이라 함은 적어도 부분적으로 질병을 치료할 수 있는 능력을 의미한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 치료적 활성은 HIV-관련 질병 및/또는 종양 관련 질병에 대한 치료적 활성을 포함한다. 상기 의약은 예를 들면 선택적으로 다른 항레트로바이러스 치료와 결합된 세포정지제를 포함할 수 있다. 네덜란드의 ATHENA-연구에 의하면, 항-레트로바이러스 치료를 받고 있는 환자의 40%가 불리한 부작용 때문에, 항레트로바이러스 치료법을 바꿀 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 상기 방법이 (심각한) 임상적 징후가 기본적으로 존재하기 전부터 부작용을 탐지할 수 있으므로, 그 치료 동안에 매우 필요하다. 따라서 상기 치료법은 임상적 효과가 기본적으로 존재하기 전에 이미 중단되고 그리고/또는 변화될 수 있다. 그 경우에, 상기 임상적 징후가 나타나지 않거나 또는 감소된 정도로 나타날 수 있다. 이것은 많은 고통을 예방할 것이다. 따라서, 우선적 태양에서, 본 발명의 방법은 상기 부작용들이 상기 방법이 행하여질 때 필수적으로 발현되지는 않도록 제공된다. 본 발명의 용어에서, "필수적으로 발현되지는 않는" 이란 말은 상기 부작용이 임상적 징후에 의하여 발현되지 않거나, 또는 단지 부분적으로만 발현됨을 의미한다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 방법은 상기 화합물 또는 의약이 세포정지제를 포함하도록 제공된다. 통상적으로 사용되는 세포정지제는 예를 들면 알킬화 화합물, 항-유사분열저해성(antimitotoxic) 세포정지제, 항종양성 항생제, 및 토포아이소머라제 (topoisomerase) 저해제를 포함한다. 그들의 비제한적 예는 클로오람부실 (chloorambucil), 시클로포스파미드 (cyclofosfamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포사미드 (ifosamide), 멜팔란티오테파부술판 (melfalanthiotepabusulfan), 트레오술판카르무스틴 (treosulfancarmustine), 로무스틴시스프라틴 (lomustinecisplatine), 카르보플라틴 (carboplatine), 옥살리플라틴다카르바진 (oxaliplatinedacarbazine), 프로카르바진 (procarcazine), 테모졸로미드 빈블라스틴 (teozolomide vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신도세탁셀 (vindesinedocetaxel), 파크리탁셀다우노루비신 (paclitaxeldaunourubicine), 독소루비신(doxorubicine), 에피루비신 (epirubicine), 이다루비신 (idarubicine), 미톡산트론블레오마이신 (mitoxanthronbleomycine), 닥티노마이신 (dactinoycine), 미토마이신이리노테칸 (mitomycineirinotecan), 토포테칸토포시드 (topotecanetoposide), 테니포시드 암사크린 (teniposide amsacrine), 아스파라기나제 (asparaginase), 클라드리빈 (cladribine), 히드록시카르바미드 (hydroxycarbamide), 펜토스타틴 메토트렉사트 (pentostatine methotrexaat) 및/또는 랄티트렉세드 (raltitrexed)를 포함한다. 항-레트로바이러스 치료 및/또는 종양 관련 질병의 치료 도중 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 유사체가 종종 사용된다. 이들 유사체들은 그들이 생물체의 복제 및/또는 전사 과정을 방해하기 때문에, 위험성이 높은 부작용과 관계된다. 게다가 내공생체 세포소기관 핵산의 양도 물론 종종 바뀔수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 생물체가 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 유사체와 관계되는 의약으로 치료될 때 매우 적합하다.
한 태양에서 본 발명은 상기 화합물 또는 의약이 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 본 발명의 방법을 제공한다. 그 유사체들의 비제한적 예는 플루다라빈 (fludarabine), 머캅토퓨린 (mercaptopurine), 티오구아닌 (thioguanine), 사이타라빈 (cytarabine), 플루오로우라실 (fluorouracil), 및/또는 겜사이타빈 (gemcytabine)이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 화합물 또는 의약이 AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC 및/또는 테노포피르 (tenofofir)를 포함하도록 제공된다. 본 발명의 방법에서, 상기 생물체 또는 본질적으로 관계되는 생물체는 바람직하기는 상기 화합물 또는 생물체가 제공되어졌었다.
특정 질병, 예를 들면 HIV-관련 질병의 치료는 장기간 동안 행하여져야 한다. 본 발명의 방법은 장기간 동안의 질병의 치료 도중에 특히 적합하다. 상기 장기간 동안 많은 부작용이 진행될 수 있고, 환자는 임상적 징후가 존재하지 않는 경우에도 이제 주기적으로 관찰될 수 있다. 따라서, 한 태양에서, 본 발명의 방법은 상기 의약이 적어도 3개월 동안, 바람직하기는 6개월 동안, 보다 바람직하기는 12개월 동안 사용되어지도록 제공된다. 한 태양에서 상기 의약은 만성적 질병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에서 "만성적 질병" 이라 함은 완전히 치유될 수 없는 질병을 의미한다. 일단 개체가 상기 질병에 걸리기만 한다면, 임상적 징후가 매우 다양하게 변하더라도 질병은 항상 상기 개체에 존재한다. 상기 징후들이 상기 개체에 의하여 인식조차 되지 않을 수 있다. 예를 들면 만성적 질병은 HIV-관련 질병을 포함한다.
"화합물의 부작용" 이라 함은 본 발명에서 상기 화합물의 목적이 아닌 다른 효과를 의미한다. 상기 부작용은 원하지 않는 효과일 수 있다. 예를 들면 치료적 화합물이 질병과 반작용하여, 동시에 생물체의 대사를 감소시킬 수 있다. 따라서 상기 대사 작용의 상기 감소는 (부정적) 부작용이라고 언급된다. 대체적으로, 화합물의 부작용은 예를 들면 다른 질병에 대한 면역과 같은 유리한 효과일 수 있다.
또한 제초제, 살충제, 항-기생충제 화합물, 항생제 화합물 등의 시험용 (선별적) 독소(toxin)를 위한 사용이 본 발명에서 제공될 수 있다. 본 발명은 후보 화합물의 독성 활성을 결정하기 위한 방법, 예를 들면 세포정지성 또는 심지어 세포독성 효과를 갖는 등 세포성 생물체의 기능 부전을 야기하는데 대한 그들의 유용성의 결정 방법을 제공하며, 이는 상기 화합물이 제공되어온 생물체, 바람직하기는 상기 생물체 또는 관련 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 또한 본 발명에서 제공된 방법을 제 1 생물체에, 또는 필요하다면 다른 과 또는 목에 속하나 바람직하기는 적어도 다른 강 또는 문에 속하고, 가장 바람직하기는 다른 계에 속하는 본질적으로 관련되지 않은 제 2 생물체에 사용 또는 적용하여, 선별성을 시험한다. 선별성 측면은 예를 들면 선택적 독성 또는 선별적 치료적 효과를 결정하기 위하여, 상기 화합물을 예를 들면 포유동물 또는 식물인 본질적으로 관련되지 않은 제 2 생물인 숙주 또는 그들의 세포를 시험하는 것 뿐만 아니라 (세균이나 기생충과 같은) 제 1 표적 생물체(필요하다면 그들의 세포에만)에 시험함으로서, 또는 상기 화합물을 본질적으로 관련되지 않은 잡초 식물 또는 그들의 세포에 시험하는 것 뿐만 아니라 농작물 식물 또는 그들의 세포를 시험함으로서 테스트된다. 상기 개체, 또는 유사 또는 관련된 질병을 갖는 다른 개체들의 치료에 사용하기 위한 종양-특이적, 또는 적어도 선별적 세포정지성 또는 세포독성 화합물을 탐지 또는 스크리닝하기 위하여, 동일한 개체에서 유래한 종양 세포와 같은 비정상적(aberrant) 세포와 동시에, 또는 비교하여, 개체에서 유래한 정상적 세포를 시험하는 것이 또한 제공된다.
본 발명의 방법으로, 상대적 비율은 통상적으로 예를 들면 표적 핵산의 증폭과 같은 적어도 하나의 진행 단계 후에, 예를 들어 상기 샘플에 존재하는 상기 핵산 및/또는 유전자 산물의 양을 측정함으로서 결정된다. 상기 상대적 비율은 상기 양이 측정된 후에, 하나의 양을 다른 양으로 나눔으로서 결정될 수 있다.
효소적 증폭을 사용함으로서 적은 양의 표적 핵산이 탐지되고 정량될 수 있다. 효소적 증폭 기술의 예에는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 핵산 서열-기초증폭(NASBA), SDA, TMA 등이 있다. 표적 핵산 서열의 특이적 증폭은 반응에 두개의 프라이머를 첨가함으로서 성취할 수 있다. 증폭된 영역은 상기 증폭된 영역에 특이적인 프로브에 의하여 증폭반응의 종결시 탐지될 수 있다. 대체적으로 증폭된 영역은 상기 증폭반응 중에 상기 증폭된 핵산의 생성 동안 탐지될 수 있다. 후자의 프로토콜에서, 프로브에 붙은 표지의 신호가 상기 프로브가 상보적 핵산에 혼성화된 후 탐지가능하게 될 수 있다. 증폭반응에서 실시간 상동적 탐지를 가능하게 하는 프로브의 예로서는 TaqMan 및 Molecular Beacon 프로브가 있다.
표적 핵산 서열의 정량은 통상적으로 경쟁자 분자(competitor molecule)를 첨가함으로서 성취될 수 있으며, 이 분자는 동일한 프라이머를 사용하여 증폭하고, 경쟁자와 표적 핵산 서열 간의 구별을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 증폭된 경쟁자와 표적 핵산 서열 사이의 비율은 상기 표적 핵산 서열을 정량하는데 사용될 수 있다. 경쟁자 또는 표적 핵산 서열의 탐지는 예를 들면 경쟁자 또는 표적 핵산 서열의 상기 증폭된 영역에 특이적인 프로브에 의하여 증폭반응의 종결시에, 또는 증폭반응에서 상기 증폭된 핵산의 생성 도중에 성취될 수 있다. 후자의 프로토콜에서, 프로브에 붙은 표지의 신호는 프로브가 상보적 표적 핵산과 혼성화한 후, 및 상기 표적이 한계 수준을 초과할 때 탐지될 수 있다; 양성(positivity)에 대한 시간 또는 싸이클 횟수. 정량을 위한 다른 방법에서는, 양성에 대한 시간이 경쟁자의 첨가 없이도 정량을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 다른 것을 가운데에서도 세포성 생물체의 기능(기능부전) 결정, 후보 약물의 시험, 및 선별적 독소의 시험에 매우 적합하다. 많은 반응들이유용한 수단이라고 판명된(실시예를 참조하라) 본 발명의 방법을 사용하여 수행되어 왔다. 결과에서의 이중적 확장(duble spreading in the result)을 피할 때, 본 발명의 방법을 사용하면 훨씬 정확한 결과가 얻어지기도 한다. 일반적으로 본 발명의 방법의 결과에서 이중적 확장은 다른 반응 혼합물의 환경의 다양성 때문에 얻어진다. 예를 들면 샘플에 존재하는 특이적인 핵산을 탐지하고 정량할 수 있기 위하여, 증폭 단계는 종종 필요하다. 그러나 핵산 1의 반응 혼합물의 온도는 핵산 2의 반응 혼합물의 온도보다 조금 높을 수 있다. 이것은 핵산 1의 더 높은 수율로 나타나며, 따라서 반응 혼합물 1의 온도가 반응 혼합물 2의 온도와 정확히 같다면 얻어지는 것보다 핵산 2에 대한 핵산 1의 양의 비율이 더 높게 나타난다. 상기 반응 혼합물에서의 상기 온도의 차이 때문에, 결정된 비율이 초기의 샘플에 존재하는 두 가지 핵산의 실제 비율과 정확히 같지는 않다. 마찬가지로, 첨가된 효소의 양 등, 다른 환경에서의 작은 변화가 핵산 1 및 2의 결정된 양에서 변화를 유발할 수 있다. 따라서, 핵산 1 및 2의 측정된 양이 각자 다른 것과는 독립적으로 달라질 수 있다. 상기 결정된 양에서의 독립적 변화는 상기 측정된 양의 계산된 비율에서 휠씬 큰 변화로 나타날 수 있다. 이것을 결과에서의 이중적 확산이라고 부른다. 따라서, "이중적 확산" 이라 함은 본 발명에서 적어도 2개의 반응 혼합물에서의 적어도 하나의 반응 환경의 다양성 때문에, 얻어진 결과에서의 적어도 하나의 변화를 의미한다. 예를 들면, 또한 부피의 총량이 두 반응 혼합물 간에 조금 달라질 수 있다.
일부 특별한 경우에, 결과에서의 이중적 확산은 특정 질병 또는 치료법에 기인한, 생물체에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적비율의 변화를 초과한다. 예를 들면, 바이러스성 중합효소의 저해제는 종종 HIV의 치료에 사용된다. 바이러스성 중합효소의 저해제는 또한 미토콘드리아성 중합효소 감마에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 미토콘드리아성 중합효소 감마의 양은 HIV의 상기 치료 동안 감소되어, 세포당 미토콘드리아의 감소된 양으로 나타날 것이다. 예를 들면 미토콘드리아의 50%의 감소는 부작용으로 나타날 수 있다. 핵 DNA 대 미토콘드리아 DNA의 비율은 2배 감소될 수 있다. 그러나, 미토콘드리아 DNA의 2배의 감소는 일부의 경우에 환경에서의 언급된 변화 때문에 상기 비율 측정의 이중적 확산의 범위 내에 있을 수 있다. 따라서 미토콘드리아의 양에서의 이들 생물학적으로 중요한 차이가 결과에서의 이중적 확산 때문에 신뢰할 수 있도록 탐지될 수 없다. 따라서, 이중적 확산은 일부 경우에 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 비율에서의 생물학적으로 중요한 차이를 탐지하는데 대한 신뢰성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구현예는 결과에서의 이중적 확산이 없이도 세포성 생물체의 기능을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 이는 제 2 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양에 대한 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어진다. 상기 이중적 확산은 본 발명의 우선적 구현예에서 동일한 검사법(assay) 내에서 상기 비율의 결정에 의하여 방지될 수 있다. 이것은 진행 단계 및/또는 적어도 두개의 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양의 측정이 동일한 검사법 내에서 행하여지는 것을 의미한다. 본 발명의 용어에서, 검사법은 전형적으로 하나의 반응 혼합물을 사용한다. 바람직하기는 본 발명의 검사법의 모든 요소들이 상기 검사법에서 무작위적으로 혼합된다. 상기반응 혼합물은 하나의 반응 튜브에 존재할 수 있다.
그러나, 당업자는 결과에서의 이중적 확산을 방지하기 위한 더 많은 방법을 생각할 수 있다. 당업자는 예를 들면 (반)투과성 막에 의하여 다른 부분으로 분리되는 반응관을 사용할 수 있다. 적어도 하나의 반응 환경이 상기 다른 부분에 의존적으로 변하는 한, 이중적 확산을 피할 수 있으며, 얻어진 결과는 좀더 정확해질 것이다.
본 발명의 한 구현예에서, 적어도 두개의 표적 서열이 하나의 검사법에서 증폭된다. 상기 2개의 표적 서열은 상기 내공생체 세포소기관 핵산 및 상기 제 2의 핵산이라고 말할 수 있다. 따라서 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 방법은 동일한 검사법 내에서의 상기 내공생체 세포소기관 핵산 및 상기 제 2 핵산의 증폭을 포함한다. 적어도 2개의 표적 서열이 하나의 검사법이 증폭될 때, 상기 검사법에서 반응 환경의 다양성은 상기 검사법에 독립적으로 존재하는 각 서열의 얻어진 양에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 상기 검사법에 존재하는 각 서열의 얻어진 양은 동일한 온도, 동일한 총부피 등에 의하여 영향을 받을 것이다. 상기 2개의 프로브는 각각 상기 2개의 프로브들 사이에 구별을 가능하게 하여, 2개의 다른 표적 서열 간의 프로브 사이의 구별을 가능하게 하는 다른 표지를 갖는다. 정량화는 양쪽 실시간 증폭 반응의 상대적 형광의 증가 기울기, 뿐만 아니라 시간을 양성과 관계함으로서 얻을 수 있다. 바람직하기는, 참고 곡선은 그 전에 작성되었다. 상기 핵산의 정량화는 그 후 상기 참고 곡선과 얻어진 값을 비교함으로서 행하여질 수 있다. 따라서 예를 들면 경쟁자 물질과 같은 내부 기준에 대한 필요가 없다.하나의 검사법에서의 두개의 표적의 상대적 정량화 방법은 두개의 별도의 검사법에서의 정량화에 비하여 개선된 정확성을 가지며, 감소된 조작 시간 및 시약을 요한다. 본 발명자들은 한 튜브 내에서 두 증폭 반응이 이중화(duplexing)하는 것은 2개의 표적의 비율의 즉각적 징후가 되는 것을 발견하였다. 내부 또는 외부 측정기 (calculator)의 필요성 없이 이들 환경의 변화를 제거하여, 양쪽의 증폭 반응의 환경이 같다. 나아가, 이제 결과에서의 이중적 확산이 회피된다. 따라서, 본 발명의 한 태양에서, 상대적 비율이 하나의 핵산의 양을 다른 양으로 나눔으로서 직접적으로 결정되는 방법을 제공한다. 바람직하기는, 상기 상대적 비율이 참고 곡선과 비교하여 결정된다. 본 발명의 용어에서, "직접적으로 결정된다"라 함은 예를 들면 상기 2개의 특이적 프로브의 상기 2개의 다른 형광적 표지의 강도를 비교함으로서,두 표적의 비율에 대한 즉각적 예측이 가능하다는 것을 의미한다. 이 구현예에서, 핵산의 한 양을 다른 양으로 나누는 것은 상응하는 형광 표지의 강도를 다른 표지로 나눔으로서 행하여진다. 어떤 내부 기준도 상기 상대적 비율이 직접적으로 결정되는 본 발명의 방법에 사용되지 않는다.
한 태양에서, 본 발명의 방법은 상기 세포 소기관의 핵산, 그들의 상기 유전자 산물, 상기 제 2 핵산 및/또는 그들의 상기 유전자 산물이 말초혈 단핵구 (PBMC) 및/ 섬유아세포(fibroblast)로부터 얻어진다. 특히, 상기 생물체로부터 의 혈액 샘플이 그후에 사용될 수 있으므로, PBMC의 사용이 선호된다. 혈액 샘플은 얻기 쉬우며, 종종 상대적으로 많은 용량을 사용할 수 있다. 따라서, 우선적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 샘플이 혈액 샘플을 포함하도록 제공된다.
본 발명의 방법은 특히 일정 수준인 표적 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물에 대한 다양한 수준인 표적 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물을 정량하는데 유용하다. 실시예는 핵 유전자의 DNA의 일정한 세포내 용량(이배체 세포당 2개)에 대한 미토콘드리아 DNA의 다양한 세포내 용량의 정량화이다. 다른 실시예는 스플라이싱에 관한 RNA를 코드하는 SNRP U1A, 또는 편재적으로 존재하는 핵 DNA로에서 유래한 본질적으로 통상적인 다른 핵산과 같은 세포의 생존에 필수적인 구조적 발현 RNA에 대한, 미토콘드리아 RNA와 같은 다양하게 발현되는 RNA의 정량을 포함한다. 본 발명자들은 2배 내지 3배의 상대적 비율을 결정하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
한 태양에서, 본 발명은 상기 제 1 핵산이 RNA를 포함하며, 상기 제 2 핵산이 DNA를 포함하는 본 발명의 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 예를 들면 U1A와 같은 핵 유전자의 DNA의 세포내 용량에 대한 미토콘드리아 RNA의 세포내 용랭의 정량화에 특히 적합한다. 이것은 실시예 22에서 나타난다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 적어도 하나의 수단을 포함하는 진단용 킷트를 제공하며, 상기 키트는 내공생성 세포 소기관에 관련되거나 또는 그로부터 유래한 핵산의 증폭 및 탐지에 선택적인 적어도 하나의 프라이머, 또는 프로브 셋트, 필요하다면 본 발명의 상세한 설명에서 예시되어 있거나, 또는 그렇지 않다면 당업자에게 알려져있는 필요한 증폭제를 포함한다. 특히 본 발명은 상기 킷트가 세포소기관에 관계되는 핵산 서열의 증폭을 위한 1 이상의 프라이머 또는 프로브 셋트를 포함하는 진단용 킷트를 제공하며, 바람직하기는SNRP 특이적 프라이머 또는 프로브와 같은 염색체에 관계된 핵산의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브 셋트가 보충되어 있다. 특히 본 발명은 세포소기관에 관련된 핵산 서열의 증폭을 위한 표 1로부터의 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 킷트를 제공한다. 상기 증폭제는 킷트에 제공될 때, 물론 PCR 또는 NASBA 증폭에 요구되는 역전사 효소 활성을 갖는 효소를 포함하는 것이 바람직하다. 물론, 본 발명에 따른 방법에서의 용도를 위하여 핵산 이외의 유전자 산물의 탐지를 위한 수단을 포함하는 킷트가 또한 본 발명에서 제공된다.
본 발명은 나아가 의약, 제초제, 살충제, 항기생충제, 세포정지제 등의 제조에서의 본 발명의 방법의 사용, 및 본 발명에 따른 방법에 의하여 얻을 수 있거나 또는 유도될 수 있거나 탐지할 수 있는 의약, 제초제, 살충제, 항기생충제 등을 제공한다.
본 발명은 대부분의 실시예가 예증으로 세포에서 에너지의 공급과 사용의 중심에 있는 미토콘드리아의 시험에 관하여 설명하는 본 발명의 상세한 설명에서 더욱더 설명되지만, 동일한 원칙이 주로 식물 세포에 탄수화물을 공급하는 엽록체와 같은 또 다른 내공생적 소기관을 사용하는 시험에 응용하는 것은 쉽게 이해될 것이다.
사용된 성분 및 일반적인 방법론
표1에서 실시예에 사용된 프라이머와 프로브들을 요약했다. 표준 NASBA 핵산 증폭 반응은 20㎕ 반응부피에서 수행되었고, 이는 Tris-pH 8.5 40mM, 염화칼륨 70mM, 염화마그네슘 12mM, 디치오트레이톨(dithiotreitol) 5mM, (각) dNTP'S 1mM, (각) rNTP'S 2mM, (각) 프라이머 0.2μM, 분자 비콘(beacon)0.05μM, 솔비톨 375mM, 소혈청알부민 0.105㎍/㎕, AMV RT 6.4 단위, T7 RNA 중합효소 32단위, RNAse H 0.08단위, 및 투입 핵산을 포함한다. 효소, 솔비톨 및/또는 소혈청 알부민을 제외한 완전한 혼합물을 효소 혼합물에 첨가하기 전에, RNA에서 2차 구조를 변형하고 프라이머들이 어닐링되도록 하기 위하여, 65℃에서 2분간 가열하였다. 혼합물을 41℃로 냉각한 후 효소를 첨가하였다. 증폭은 41℃에서 90분간 형광계(fluorimeter, CytoFluor 2000)에서 이루어졌고, 형광 신호는 매분마다 측정되었다(필터 세트 530/25nm 및 485/30nm 이용). DNA 표적 서열의 증폭을 위해 65℃ 변성 단계가 2 ~ 5분간의 95℃ 변성단계로 대체되었다.
정량화를 위해서, 특별한 프라이머 세트에 대한 일련의 희석된 표적 서열이 증폭되었고, 반응이 양성이 되는 시점(time to positivity, TTP)을 핵산의 투입 양에 대해 플롯되였다. 이 방법의 정량 곡선이 만들어져서, 미지의 투입량에 대한 반응의 TTP 치를 읽어 투입량을 추론할 수 있었다. RNA 및 DNA의 정량에 대한 전형적인 표준 곡선의 예를 도 1에 나타내었다.
표적 서열의 일부에 대해서는 결정된 신뢰할만한 절대적 카피 양을 가진 일련의 희석들을 얻을 수 없었다. 이들 시리즈는 DNA나 RNA 카피 대신에 측정치로서, 예를 들면 세포-등가 또는 ET-단위 등의 임의적인 단위를 제공하였다. 결과로서 때로는 예측한 것과 정 반대로, DNA보다 RNA가 더 적은 것처럼 보인다.
세포(섬유아세포 및 PBMC's)를 약물이나, 실시예에서 정의된 대로 추정되는 독성 또는 자극성 화합물을 첨가하여 당업자들에게 알려진 표준 배지에서 표준 조건하에 배양하였다. 핵산은 Boom et al에 의해 서술된 방법(Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J, 1990. 핵산의 정제에 대한 빠르고 간편한 방법.J clin Microbiol; 28(3);495-503)에 의해, 또는 Qiagen으로 부터 구입한 정밀한 분리 킷트(Qiagen GmbH, Max Volmer Strasse 4, 40724 Hilden, Germany)를 생산자의 프로토콜에 따라 이용하여 세포로부터 분리하였다. 분리된 핵산의 소량의 분취량을 아가로스 겔에서 분석하였고, 나머지는 향후 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. 일반적으로 핵산은 물에 10배 희석하였고, 대개 희석된 핵산 5㎕가 NASBA 증폭 반응의 투입량으로 이용되었다.
실시예 1
본 실시예에서는 어떤 종류의 비율이 본 발명에 의한 방법으로 측정될 수 있는지와, 진단적인 관점에서 그들이 가질 수 있는 의미를 설명하고 있다.
예를 들어 발명은 염색체 DNA에 대한 세포소기관 DNA의 상대적인 비율을 결정하는 것을 제공한다. 이 비율은, 정상 수치와 비교하거나 적당한 때의 적어도 시간에 대한 두 점에서 결정되었을 때, 세포당 세포소기관의 감소 또는 증가를 보인다. 또한 염색체 코드화 RNA에 대한 소기관 RNA의 비를 결정하는 것도 제공된다. 정상치와 비교하거나 또는 적당한 적어도 두 시점에서 결정된 때, 세포의 활성적인 상태(즉, 전사 상태)에 대해 표준화된 세포당 세포소기관 전사 활성의 감소 또는 증가를 보인다.
염색체 DNA에 대한 세포소기관 RNA의 비를 결정하는 것이 또한 제공되었다. 이 비율은 정상치와 비교하거나 적당한 때의 적어도 두 점에서 결정되었을 때, 세포당 세포소기관 전사 활성의 감소 또는 증가를 보여준다.
세포소기관 RNA에 대한 세포소기관 DNA의 비율을 결정하는 것 또한 제공된다. 이 비율은 정상치와 비교하거나 적당한 때의 적어도 두 점에서 결정되었을 때, 세포소기관에서 전사의 감소 또는 증가를 보이는 데, 이는 어떤 mRNA(및 단백질) 수준에 도달하기 위한 전사 수준에서의 조절을 나타낸다.
염색체 코드화된 RNA에 대한 세포소기관 DNA의 비를 결정하는 것 또한 제공되었다. 이 비율은 정상치와 비교하거나 적당한 때의 적어도 두 점에서 결정되었을 때, 염색체 RNA 전사수준과 관련하여, 세포에서 전사의 감소 또는 증가를 나타내며, 이는 세포소기관의 활성 상태를 가리키고, 염색체 RNA가 세포소기관 단백질이나 그들의 다른 조성물을 코드화 한다는 것이 결정될 때 특히 유용하다.
실시예 2
섬유아세포를 4주 동안 각각 3μM 및 30μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, 에티듐 브로마이드를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양 역시 시행하였다. 에티듐 브로마이드는 세포로부터 완전하게 미토콘드리아 DNA를 고갈시키는 것으로 알려져 있고, 세포의 미토콘드리아 양에 영향을 미치는 관점에서 양성 대조군이다. 일주일 간격으로 세포들의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 미토콘드리아 DNA(프라이머 MtD p1 및 MtD p2, 프로브 MtD mb) 및 염색체 DNA(프라이머 SnrpD p1 및 SnrpD p2, 프로브 SnrpD mb)의 양을 분석하였다. AZT, D4T를 첨가하거나 비첨가한 배양은 4주간의 배양기간 동안 염색체 DNA에 대한 미토콘드리아 DNA의 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. 에티듐 브로마이드와의 배양은 예상한 대로 미토콘드리아 DNA 양의 감소를 보였다. DDC에 대한 결과는 도 2에 나타나 있다.
도 2에서의 데이타는 2 log이상으로 세포당 미토콘드리아 DNA 양에서 감소와 항바이러스제 DDC의 미토콘드리아 독성을 명확하게 나타낸다.
실시예 3
섬유아 세포를 4주 동안 각각 3μM 및 30μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, 에티듐 브로마이드를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양 역시 시행하였다. 에티듐 브로마이드는 완전하게 세포로부터 미토콘드리아 DNA를 고갈시키는 것으로 알려져 있고, 세포의 미토콘드리아 양에 영향을 미치는 관점에서 양성 대조군이다. 일주일 간격으로 세포들의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 미토콘드리아 RNA(프라이머 MtR p1 및 MtR p2, 프로브 MtR mb) 및 염색체 코드화 RNA(프라이머 SnrpR p1 및 SnrpR p2, 프로브 SnrpR mb)의 양을 분석하였다. AZT, D4T를 첨가하거나 비첨가한 배양은 4주간의 배양기간 동안 염색체 코드화 RNA에 대한 미토콘드리아 RNA의 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. 에티듐 브로마이드와의 배양은 예상한 대로 미토콘드리아 RNA 양의 감소를 보였다. DDC에 대한 결과는 도 3에 나타나 있다. 도 3에서의 데이타는 적어도 2 log 정도의 세포당 미토콘드리아 RNA 양에서 감소와 항바이러스제 DDC의 미토콘드리아 독성을 명확하게 나타낸다. 3주 시점에서 매우 낮은 수준을 보였고, 아마 이는 아웃라이어 측정의 일부이다.
실시예 4
섬유아세포들을 4주 동안 각각 3μM 및 30μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, 에티듐 브로마이드를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양을 역시 시행하였다. 에티듐 브로마이드는 완전하게 세포로부터 미토콘드리아 DNA를 고갈시키는 것으로 알려져 있고, 세포의 미토콘드리아 양에 영향을 미치는 관점에서 양성 대조군이다. 일주일 간격으로 세포들의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 미토콘드리아 RNA(프라이머 MtR p1 및 MtR p2, 프로브 MtR mb) 및 염색체 RNA(프라이머 SnrpD p1및 SnrpD p2, 프로브 SnrpD mb)의 양을 분석하였다.
AZT, D4T를 첨가하거나 비첨가한 배양은 4주간의 배양기간 동안 염색체 DNA에 대한 미토콘드리아 RNA의 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. 에티듐 브로마이드와의 배양은 예상한 대로 미토콘드리아 RNA 양의 감소를 보였다. DDC에 대한 결과는 도 4에 나타나 있다.
도 4에서의 데이타는 거의 3 log 정도의 세포당 미토콘드리아 RNA 양에서 감소와 항바이러스제 DDC의 미토콘드리아 독성을 명확하게 나타낸다. 3주 시점에서 매우 낮은 수준을 보였고, 아마 이는 아웃라이어(outlier) 측정의 일부이다.
실시예 5
섬유아 세포를 4주 동안 각각 3μM 및 30μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, 에티듐 브로마이드를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양 역시 시행하였다. 에티듐 브로마이드는 세포로부터 미토콘드리아 DNA를 완전히 고갈시키는 것으로 알려져 있고, 세포의 미토콘드리아 양에 영향을 미치는 관점에서 양성 대조군이다. 일주일 간격으로 세포들의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 미토콘드리아 RNA (프라이머 MtR p1 및 MtR p2와 프로브 MtR mb)및 미토콘드리아 DNA(프라이머 MtD p1 및 MtD p2, 프로브 MtD mb)의 양을 분석하였다.
AZT, D4T를 첨가하거나 비첨가한 배양은 4주간의 배양기간 동안 미토콘드리아 DNA에 대한 미토콘드리아 RNA의 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. 에티듐 브로마이드와의 배양은 예상한 대로 미토콘드리아 RNA 및 DNA 양의 감소를 보였다. DDC에 대한 결과는 도 5에 나타나 있다.
도 5에서의 데이타는 미토콘드리아 RNA에 대한 DNA의 비가 지난 4주 기간에 걸쳐 유의할만한하게 변화하지 않는다는 것을 명확하게 보여준다. 도 5에서 3주 시점에서 미토콘드리아 RNA에 대한 두드러지게 낮은 수준을 보이며, 아마 이는 아웃라이어 측정의 일부이다.
실시예 6
섬유아 세포를 4주 동안 각각 3μM 및 30μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, 에티듐 브로마이드를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양을 역시 시행하였다. 에티듐 브로마이드는 완전하게 세포로부터 미토콘드리아 DNA를 고갈시키는 것으로 알려져 있고, 세포의 미토콘드리아 양에 영향을 미치는 관점에서 양성 대조군이다. 일주일 간격으로 세포들의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 염색체 코드화 RNA(프라이머 SnrpR p1 및 SnrpR p2, 프로브 SnrpR mb) 및 염색체 DNA (프라이머 SnrpD p1 및 SnrpD p2, 프로브 SnrpD mb)의 양을 분석하였다.
AZT, D4T를 첨가하거나 비첨가한 배양은 4주간의 배양기간 동안 염색체 DNA에 대한 미토콘드리아 RNA의 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. DDC에 대한 결과는 도 6에 나타나 있다.
도 6에서의 데이타는 염색체 RNA에 대한 DNA의 비가 지난 4주 기간에 걸쳐유의할 만한 변화는 없다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 7
섬유아 세포를 4주 동안 30μM의 농도에서 항 바이러스제인 DDC의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 그 기간 후 세포 배양은 계속되었으나, DDC는 첨가하지 않았다. DDC 없는 배양 기간 동안 세포의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 12주 동안 2주 간격으로 미토콘드리아 DNA(프라이머 MtD p1 및 MtD p2, 프로브 MtD mb) 및 염색체 DNA(프라이머 SnrpD p1 및 SnrpD p2, 프로브 SnrpD mb)의 양을 분석하였다. 분석의 결과는 도 7에 나타나 있다.
도 7에서의 결과는 세포당 미토콘드리아의 양이 DDC를 배양액으로 부터 제거한 후에 2 log 이상 증가한 것을 명확하게 보여준다.
이 결과는 만약 새로 자라나는 세포를 재생산하기 위하여 여전히 몇몇 미토콘드리아가 남아있는 세포가 있다면 DDC의 독성 효과는 반전될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 8
섬유아 세포를 4주 동안 30μM의 농도에서 항 바이러스제인 DDC의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 그 기간 후 세포 배양은 계속되었으나, DDC는 가하지 않았다. DDC 없는 배양 기간 동안 세포의 일부를 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 12주 동안 2주 간격으로 미토콘드리아 RNA(프라이머 MtR p1 및 MtR p2, 프로브 MtR mb) 및 염색체 코드화 RNA (프라이머 SnrpR p1 및 SnrpR p2, 프로브 SnrpRmb)의 양을 분석하였다. 분석의 결과는 도 8에 나타나 있다.
도 8에서의 결과는 세포당 미토콘드리아의 양이 DDC를 배양액으로 부터 제거한 후에 2 log 이상 증가한 것을 명확하게 보여준다. 이 결과는 DDC의 독성 효과는 반전될 수 있으며, 미토콘드리아의 기능은 RNA 및 연이은 단백질의 합성에 의해 보여진 바와 같이 돌아올 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 9
건강한 혈액 기증자로 부터의 신선한 말초혈 단핵구(PBMC's)를 5일간 각각 6μM 및 60μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, DMSO를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양 역시 시행하였다. DMSO는 약물이 용해된 용액의 일부이다. 5일 후 세포는 세포들을 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 염색체 미토콘드리아 DNA(프라이머 MtD p1 및 MtD p2, 프로브 MtD mb) 및 염색체 DNA (프라이머 SnrpD p1 및 SnrpD p2, 프로브 SnrpD mb)의 양을 분석하였다.
AZT, D4T, DMSO를 첨가하거나 비첨가한 배양은 5일간의 배양기간 동안 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. DDC에 대한 결과는 도 9에 나타나 있다.
도 9에서의 결과는 PBMC's의 세포당 미토콘드리아 DNA가 5일의 배양기간 동안 1 log 이상 감소한 것을 명확하게 보여준다.
실시예 10
건강한 혈액 기증자로 부터의 신선한 말초혈 단핵구(PBMC's)를 5일간 각각 6μM 및 60μM의 두 농도에서 항 바이러스제인 DDC, AZT 및 D4T의 존재하에 생체외에서 배양하였다. 대조군으로, DMSO를 첨가하거나 약물을 첨가하지 않은 세포 배양 역시 시행하였다. DMSO는 약물이 용해된 용액의 일부이다. 5일 후 세포는 세포들을 취해서 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 미토콘드리아 RNA(프라이머 MtR p1 및 MtR p2, 프로브 MtR mb) 및 염색체 코드화 RNA (프라이머 SnrpR p1 및 SnrpR p2, 프로브 SnrpR mb)의 양을 분석하였다.
AZT, D4T, DMSO를 첨가하거나 비첨가한 배양은 5일간의 배양기간 동안 비에서 측정가능한 변화를 보이지 않았다. DDC에 대한 결과는 도 10에 나타나 있다. 흥미롭게도, 도10에서의 결과는 최고농도의 DDC 존재하의 5일의 배양기간 동안 세포당 미토콘드리아 RNA의 PBMC's의 뚜렷한 감소를 보이지 않았다. 이는 실시예 9에서 보여준 미토콘드리아 DNA와 대조적인 결과이다. 미토콘드리아 DNA에서의 감소는 아마 미토콘드리아 RNA 수준을 유지하는 전사의 증가에 의해 상쇄된 것으로 보인다. 본 기전은 미토콘드리아 RNA의 감소를 지연시킨다.
그 결과로서, 미토콘드리아 RNA는 미토콘드리아의 기능성의 현 상태를 반영하는 것이며 미토콘드리아 DNA는 미토콘드리아 기능의 (가까운) 미래에 일어날 일의 징후가 되는 것이며, 따라서 더 전조적인(prognostic) 형질이다.
실시예 11
프라이머와 프로브 Rubisco-DNA p1, Rubisco-DNA p2, Rubisco-DNA MB,Rubisco-RNA p1, Rubisco-RNA p2 및 Rubisco-RNA-MB(표1)를 이용하여Oryza sativum(쌀)의 엽록체 DNA 및 RNA를 정량할 수 있고, 염색체 RNA 및 DNA에 대한 비는 프라이머 및 프로브 OryzaDNA p1, OryzaDNA p2, OryzaDNA mb, OryzaRNA p1, OryzaRNA p2, OryzaRNA mb(표1)를 이용하여 결정될 수 있다. 제초제 (또는 기타) 화합물을 적용하는 동안 식물의 조건은 PCR 같은 증폭 방법 및 당업자 들에게 알려진 NASBA를 이용하여 세포의 염록체 핵산의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 동시에 잡초에 적절한 프라이머 세트를 이용하여, 불필요한 식물들의 퇴보를 모니터 할 수 있다. 이들 분자적 기술들은 다른 식물군은 아닌 한 군을 특별히 공격하는 새로운 제초제의 연구에 매우 적합함이 명확하다.
실시예 12
본 예에서 DNA 표적 서열에 대한 NASBA 핵산 증폭 반응은 20㎕ 반응부피에서 수행하였고, 이는 Tris-pH 8.5 40mM, 염화칼륨 70mM, 염화마그네슘 12mM, 디치오트레이톨(dithiotreitol) 5mM, (각) dNTP'S 1mM, (각) rNTP'S 2mM, (각) 프라이머 0.2μM, 분자 비콘(beacon)0.05μM, 제한효소 Msp I 1.5 단위, 소르비톨 375mM, 소혈청알부민 0.105㎍/㎕, AMV RT 6.4 단위, T7 RNA 중합효소 32단위, RNAse H 0.08단위, 및 투입 핵산을 포함한다. 효소를 제외한 복잡한 혼합물, 솔비톨 및/또는 소혈청 알부민은 효소 혼합물에 첨가되기 전에, DNA를 변형하고 프라이머들이 어닐링되도록 하기 위하여, 37℃에서 25분간 배양하고 연이어 95℃에서 2분간 가열하였다. 혼합물을 41℃로 냉각한 후 효소 혼합물이 첨가되었다. 증폭은 41℃에서90분간 형광계(fluorimeter, CytoFluor 2000)에서 이루어졌고, 형광 신호는 매분마다 측정되었다(필터 세트 530/25nm 및 485/30nm 이용).
정량화를 위해서, 특별한 프라이머 세트에 대한 표적 서열의 희석 시리즈가 증폭되었고, 반응이 양성이 되는 시점(time to positivity, TTP)을 핵산의 투입 양에 대해 플롯 하였다. 이 방법의 정량곡선이 만들어져서, 미지의 투입량에 대한 반응의 TTP 치를 읽어 투입을 추론할 수 있었다.
건강한 혈액 기증자로 부터의 신선한 말초혈 단핵구(PBMC's)를 5일간 생체외에서 배양하였다. 5일 후 세포들을 취해서 "사용된 성분 및 일반적인 방법론" 장의 NASBA 프로토콜에 기록된 대로 염색체 DNA(프라이머 SnrpD p1 및 SnrpD p2, 프로브 SnrpD mb)의 양을 분석하였고 본 예에서 기술된 NASBA와 비교되었다. 도 11에서 명확하게 볼 수 있는 것 처럼 제한 효소의 전-처치가 있는 DNA NASBA반응이 없는 것 보다 훨씬 더 잘 수행한다. 본 관찰의 이론적 근거는 Msp I 만들어진 3'으로 부터 p1 프라이머의 T7 프로모터에 걸친 직접적인 연장이다.
실시예 13
프라이머와 프로브 tRNA-L-D p1, tRNA-L-D p2, tRNA-L-D MB, petB RNA p1, petB RNA p2 및 petB RNA MB(표 1)를 이용하여Oryza sativum(쌀)의 엽록체 DNA 및 RNA를 정량할 수 있고, 염색체 RNA 및 DNA에 대한 비는 프라이머 및 프로브 OryzaDNA p1, OryzaDNA p2, OryzaDNA mb, OryzaRNA p1, OryzaRNA p2, OryzaRNA mb(표 1)를 이용하여 결정될 수 있다. 제초제(또는 기타) 화합물을 적용하는 동안 식물의 조건은 PCR 같은 증폭 방법 및 당업자들에게 알려진 NASBA를 이용하여 세포의 엽록체 핵산의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 동시에 잡초에 적절한 프라이머 셋트를 이용하여, 불필요한 식물들의 퇴보를 모니터 할 수 있다. 이들 분자적 기술들은 다른 식물군이 아닌 한 군을 특별히 공격하는 새로운 제초제의 연구에 매우 적합함이 명확하다.
실시예 14
Snrp DNA를 포함하는 1000 개의 분자들을 4×105, 2×105, 105, 5×104, 2.5×104, 또는 104의 미토콘드리아 DNA를 포함하는 플라스미드 분자와 혼합하였고 혼합물은 반응을 위한 투입으로 사용되었다. 반응 혼합물은 한 튜브 내에서 Snrp-핵 및 미토콘드리아 DNA를 증폭시키기 위해 프라이머 및 비콘이 다른 것을 제외하고는, 실시예 12의 것과 유사하게 만들어졌다. 반응 혼합물(이중 혼합물)은 (ROX-표지된) SnrpD mb 및 (FAM-표지된) MtD mb_2(각 0.05μM)의 비콘을 갖는 SnrpD p1와 SnrpD p2, 및 MtD p1_2와 MtD p2_2 (각 0.2μM)의 두 세트의 프라이머와 비콘을 포함한다. 제한 효소 소화, 증폭 및 검출은 실시예 12에서와 같이 행했다.
형광계(CytoFluor 2000)의 필터 세트가 FAM 및 ROX-표지(FAM을 위한 485/20 및 530/25; ROX를 위한 590/20 및 645/40)를 동시에 측정하기 위해 도입되었다. 두 경쟁적인 증폭을 하는 이중 반응에서, 시간에서 형광 곡선의 기울기의 비는 각 증폭된 종류의 분자량의 비에 비례한다(도 12참고).
실시예 15
PMBC를 5μM ddC의 존재 및 부존재 하에 배양하였다. 5일 후 PBMC 샘플을 취했다. 핵산은 Boom et al에 의해 기술된 방법에 따라 105PBMC로 부터 분리되었고 DNAse 및 RNAse가 없는 물 50㎕에 용해시켰다. 1:10 및 1:100 희석을 하였고, (각각 1000 또는 100 PBMC와 등가인) 희석액 5㎕를 특별한 표적을 증폭시키기 위한 반응 혼합물에 넣었다. 동시에, Snrp DNA를 포함하는 플라스미드 103개 분자를 4×105, 2×105, 105, 또는 5×104의 미토콘드리아 DNA를 포함하는 플라스미드 분자와 혼합하였고 혼합물은 반응을 위한 투입으로 사용하였다. 반응 혼합물은 한 튜브 내에서 Snrp-핵 및 미토콘드리아 DNA를 증폭시키기 위해 프라이머 및 비콘이 다른 것을 제외하고는, 실시예 12의 것과 유사하게 만들어졌다. 반응 혼합물(이중 혼합물)은 (ROX-표지된) SnrpD mb 및 (FAM 표지된) MtD mb_2(각 0.05μM)의 비콘을 갖는 SnrpD p1와 SnrpD p2, 및 MtD p1_2와 MtD p2_2 (각 0.2μM)의 두 세트의 프라이머와 비콘을 포함한다. 제한 효소 소화, 증폭 및 검출은 실시예 12에서와 같이 행했다. 형광계(CytoFluor 2000)의 필터 세트가 FAM 및 ROX-표지(FAM을 위한 485/20 및 530/25; ROX를 위한 590/20 및 645/40)를 동시에 측정하기 위해 도입되었다. 두 경쟁적인 증폭을 하는 이중 반응에서 시간에서 형광 곡선의 기울기의 비는 각 증폭된 종류의 분자량의 비에 비례한다. 플라스미드 snrp/미토콘드리아 DNA 혼합물의 데이타는 5μM ddC 부존재 및 존재 하에 1:10 및 1:100의 희석액 중에서PBMC 샘플의 snrp 핵 DNA에 대한 미토콘드리아 DNA의 미지의 비가 평가될 수 있는 표준 곡선을 만드는데 사용되었다. (도 13참고)
실시예 16
심한 젖산성 산성증의 결과로 사망한 HIV-1 감염 환자로 부터의 4 혈액 샘플을 말초혈 단핵구(PBMC)의 미토콘드리아 양을 위해 분석하였다. 샘플 1은 사망 1년 전에 채취되었고, 샘플 2는 사망 3개월 전에, 샘플 3은 사망 1.5개월 전에 및 샘플 4는 사망 직전에 채취되었다. 혈액을 Ficoll-Isopaque 정제에 의해 말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 만드는데 이용하였다. PBMC는 +5% DMSO 배지에서 생육가능하게 냉동되어서 사용시까지 액체질소 중에 보존하였다. 핵산은 Boom 방법을 이용하여 105PBMC로부터 추출하였다. 1000 PBMC 등가인 핵산은 미토콘드리아 DNA(프라이머 MtD p1 및 MtD p2와 프로브 MtD mb)를 측정하는 NASBA 및 염색체 DNA(프라이머 SnrpD p1 및 SnrpD p2와 프로브 SnrpD mb)를 측정하는 NASBA를 위한 투입으로 사용되었다. 프라이머 및 프로브 서열은 표1을 참조. 본 분석의 결과는 염색체 DNA 카피 당 미토콘드리아 DNA 카피로 표현되었다. (도 14 참조)
실시예 17
플라스미드에서 표적 미토콘드리아 및 염색체 DNA의 다른 비율을 본 실시예에서 분석하였다. 2×103U1a DNA / 8×103Mt DNA, 2×103U1a DNA / 2×104MtDNA, 2×103U1a DNA / 4×104Mt DNA, 2×103U1a DNA / 105Mt DNA, 2×103U1a DNA / 2×105Mt DNA, 2×103U1a DNA / 4×105Mt DNA, 및 2×103U1a DNA / 8×105Mt DNA 분자를 포함시켰다. 반응 혼합물은 한 튜브 내에서 염색체 및 미토콘드리아 DNA를 증폭시키기 위해 프라이머 및 비콘을 제외하고는 실시예 12에서와 비슷하게 만들어졌다. 반응 혼합물(이중 혼합물)은 (FAM-표지된) SnrpD mb_2 및 (ROX-표지된) MtD mb_3(각각 0.04μM)의 비콘을 갖는 SnrpD P1과 SnrpD2 P2(첫 프라이머 세트, 각 0.2μM) 및 MtD P1_2 및 MtD P2_2(두번째 프라이머 세트, 각 0.3μM)를 포함한다. 프라이머 및 프로브 서열은 표1 참조. 제한 효소 소화, 증폭 및 검출은 실시예 12에서와 같이 행했다. 형광계(CytoFluor 2000 또는 EasyQ analyzer)의 필터 세트가 FAM 및 ROX-표지(FAM을 위한 485/20 및 530/25; ROX를 위한 590/20 및 645/40)를 동시에 측정하기 위해 도입되었다. 두 경쟁적인 증폭을 하는 이중 반응에서 시간에서 형광 곡선의 기울기의 비는 각 증폭된 종류의 분자량의 비에 비례한다. 이 결과는 도16에 나타나 있다. FAM과 ROX 신호의 기울기 비 사이의 관계는 투입에서 미토콘드리아 DNA와 염색체 DNA의 비와 1차원적인 관계에 있다. 이 결과는 정량 곡선을 만드는 데 사용할 수 있으며, 세포당 미토콘드리아 DNA 카피의 수는 이 표준 정량 곡선으로 부터 계산할 수 있다.
실시예 18
섬유아 세포를 4주 동안 항-레트로바이러스제인 ddC(30μM)의 존재하에 배양하였다. 그 기간 후 ddC 존재하의 세포 배양은 계속되었으나, 다른 6주간은 ddC 부존재 하에 배양하였다. 배양하는 동 기간동안 세포의 일부를 취해서 당업자에게 알려진 표준 방법을 이용하여 젖산-피루브산의 비율을 분석하였다. 젖산-피루브산 비 측정치의 결과는 도 17에 나타나 있다.
도17에서 데이타는 ddC 존재 하에 젖산-피루브산 비가 증가하였으나, 현저한 증가는 배양의 4주 후에만 관찰할 수 있다. ddC 존재 하에 계속된 배양기간 동안 젖산-피루브산 비는 높게 유지되었으나, ddC 부존재 하에서 4주 후 계속된 배양에서는 젖산-피루브산 비가 정상 수준으로 감소하였다.
나아가, 동일한 샘플을 실시예 17에 서술된 미토콘드리아 DNA 및 염색체 DNA의 비를 결정하는데 사용하였다. 결과는 도 18에 나타나 있다.
도18에서 데이타는 ddC 존재하에 섬유아세포는 그들의 미토콘드리아 DNA를 소실(위 패널에서 검은 선의 감소)한다는 것을 보여준다. 미토콘드리아 DNA 양에서 현저한 감소는 이미 2주 후에 관찰될 수 있으며 ddC 존재 하의 3주 후 배양에서는 어떤 미토콘드리아 DNA도 거의 관찰할 수 없다. 이들 데이타는 4주 후에 현저한 변화를 관찰할 수 있는 전통적인 젖산-피루브산 측정치와 대조적이다. 이들 결과는 시점에서 기능성에 대한 효과를 위한 미토콘드리아 DNA의 측정의 예측치를 명확하게 보여준다.
ddC 존재 하의 계속된 배양에서 미토콘드리아 DNA의 양은 매우 낮다 (아래의 왼쪽 두 패널). ddC 부존재 하에 계속된 배양은 섬유아세포에서 미토콘드리아 DNA 양에서 명확한 반동을 보여준다(아래의 오른쪽 두 패널).
실시예 19
대조군으로 항-레트로바이러스제인 ddC(5μM)의 존재하에서나 약물의 용매(DMSO)의 상응하는 농도 하에서 PBMC's를 11일 동안 배양하였다. 그 기간 동안, 매 2일마다 세포들의 일부를 취해서 실시예 17에서 기술된 대로 미토콘드리아 DNA와 U1a DNA의 비를 분석하였다. 그 결과는 도19에 있다.
본 실험의 결과는 ddC 존재 하에 배양에서 PBMC의 DNA양이 급격히 감소함을 명확히 보여준다. 2일째에 ddC 존재 하에 배양된 PBMC의 미토콘드리아 DNA양은 대조군 배양과 비교하면 약 20% 감소하였다. 나아가 PBMC에서 수 또는 미토콘드리아 카피는 ddC 존재 하에 배양 11일 째에 감지할 수 없는 수준으로 저하되었다.
실시예 20
HIV-1 감염 환자 48명 중 무작위로 AZT, AZT+ddI 또는 AZT+ddC 중 하나로 항바이러스성 치료를 하였다. 치료를 시작하고 나서 0, 4, 24 및 48주에 혈액을 채혈하였다. 채혈된 혈액은 Ficoll-Isopaque 정제법을 이용하여 말초혈 단핵구(PBMC)를 제조하는 데에 사용하였다. PBMC를 5% DMSO를 첨가한 배지에서 생육할 수 있게 냉동하고 다음에 사용할 때까지 액체 질소에서 보관하였다.
핵산은 Boom 방법을 사용하여 105PBMC로부터 추출하였다. 1,000 PBMC에 상당하는 핵산은 실시예 17에서 기재한 바와 같이 미토콘드리아 DNA 및 염색체 DNA모두를 측정하는 단일-튜브 실시간 복식-NASBA을 위한 투입물로 사용하였다. 이러한 검사법의 결과는 환자 샘플의 세포(즉, PBMC) 당 미토콘드리아 DNA로서 표현된다. 상기 결과는 표 2에서 요약하였다.
치료 시작시의 환자의 PBMC의 미토콘드리아 DNA 함량을 4, 24 및 48주째의 미토콘드리아 DNA 함량과 비교하고, 정적으로 현저한 변화에 대해 분석하였다(표 3 및 도 20 + 21). 상기 데이타는 AZT+ddI 및 ddC를 함유하는 치료를 진행한 환자는 그들의 PBMC의 미토콘드리아 DNA 함량에서 현저한 감소를 경험한다는 것을 나타낸다.
실시예 21
플라스미드에서 미토콘드리아 RNA 표적 및 염색체 DNA 표적은 이번 실시예에서 분석되었다: 2x103Ula DNA/5x104Mt RNA 분자, 2x103Ula DNA/2.5x105Mt RNA 분자, 2x103Ula DNA/5x105Mt RNA 분자, 2x103Ula DNA/2.5x106Mt RNA 분자, 2x103Ula DNA/5x106Mt RNA 분자, 2x103Ula DNA/107Mt RNA 분자, 2x103Ula DNA/2.5x107Mt RNA 분자들이 포함되었다. 반응 혼합물은 하나의 튜브에서 염색체 DNA 및 미토콘드리아 RNA을 증폭하기 위하여 프라이머와 비콘이 다르다는 것을 제외하고는 실시예 12의 것과 유사하게 제조하였다. 상기 반응 혼합물(이중 혼합물)은 프라이머 및 표지의 두 세트를 포함한다: (ROX-표지된) Snrp D mb 및 MtR mb(FAM-표지된)(각각 0.04μM)의 비콘을 갖는 SnrpD P1와 SnrpD2 P2(첫 번째 프라이머 세트, 각각 0.1 μM), 및 MtR P1_2와 MtR P2_2(첫 번째 프라이머 세트, 각 0.4 μM). 프라이머및 프로브 서열에 대하여는 표 1를 참조하시오. 제한 효소 소화, 증폭 및 탐지는 실시예 12에서와 같이 수행하였다. 형광계의 여과기 세트(CytoFluor 2000 또는 EasyQ)는 FAM 및 ROX-표지화(FAM에 대하여는 485/20 및 530/25; ROX에 대하여는 645/40)를 동시에 측정하기 위해 적용하였다. 두 경쟁적인 증폭을 갖는 이중 반응에서, 시간 중 형광 곡선의 기울기의 비율은 각각 증폭된 종의 분자량의 비율에 비례한다. 결과는 도 22에서 나타낸다. FAM 및 ROX 신호의 기울기의 비율 사이에서의 관계는 투입물에서 미토콘드리아 RNA 및 염색체 DNA의 비율에 선형을 이룬다. 이러한 결과는 교정 곡선을 만들기 위해 사용될 수 있고, 세포 당 미토콘드리아 RNA의 수는 이 표준 교정 곡선으로부터 계산될 수 있다.
실시예 22
섬유아세포를 8주 동안 항-레트로바이러스 약 ddC(30 μM)의 존재 한에서 배양하였다. 그 기간 후에, 상기 세포는 또 다른 8주 동안 ddC의 존재하에서, 그리고 또한 ddC의 부존재 하에서 지속적으로 배양되었다. 이러한 배양 기간 후에, 상기 세포의 일부는 다른 시점에서 채취되었고, 실시예 21에서 기재한 바와 같이 미토콘드리아 RNA 및 염색체 DNA의 비율에 대하여 분석하였다. 결과는 도 23에서 나타낸다.
도 23에서의 데이타는 ddC의 존재하에서의 섬유아세포가 그들의 미토콘드리아 RNA를 손실한다는 것을 명백히 나타낸다. 지속된 배양에서, ddC의 존재하에서의 미토콘드리아의 RNA의 양은 매우 낮게 남는다. ddC의 부존재 하에서 지속된 배양은 섬유아세포에서 미토콘드리아 RNA의 양의 명백한 회복(rebound)을 보여준다(10,12, 14 및 16주 시점).
실시예 23
HIV-1 감염 환자 두 명(환자 1 및 2)은 항바이러스 치료요법(AZT+ddI)로 치료하고, 그들의 PBMC에서 미토콘드리아 RNA 함량에 대하여 분석하였다. 치료를 시작하고 나서 0, 4, 24 및 48주에 혈액을 채혈하였다. 채혈된 혈액은 Ficoll-Isopaque 정제법을 이용하여 말초혈 단핵구(PBMC)를 제조하는 데에 사용하였다. PBMC를 5% DMSO를 첨가한 배지에서 생육할 수 있게 냉동하고 다음에 사용할 때까지 액체 질소에서 보관하였다.
핵산은 Boom 방법을 사용하여 105PBMC로부터 추출하였다. 1,000 PBMC에 상당하는 핵산은 실시예 21에서 기재한 바와 같이 미토콘드리아 RNA 및 염색체 DNA 모두를 측정하는 단일-튜브 실시간 복식-NASBA(one-tube real-time duplex-NASBA)을 위한 투입물로 사용하였다. 이러한 분석의 결과는 환자 샘플의 세포(즉, PBMC) 당 미토콘드리아 RNA로서 표현된다. 상기 결과는 표 4에서 요약하였다.
환자 1 및 2의 PBMC의 미토콘드리아 RNA 함량은 이번 연구에서 그리고 적용된 치료요법(약 및 복용량)을 갖고 현저하게 다양할 수 있는 것으로 보이지 않는다. 현재의 연구는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 치료요법으로 야기되는 미토콘드리아 RNA의 변화의 더 나은 평가를 갖도록 더 많은 개체 및 다른 치료요법을 포함하도록 확장될 것이다.
표 1. 실시예에서 사용된 프라이머 및 프로브의 서열
1. 프라이머 p1 서열의 T7 프로모터 부분은이탤릭체로 나타내고, 분자 표지 프로브의 근간 서열은볼드체로 나타낸다. 분자 표지 서열을 DABCYL(종결자)로 3' 말단을, 그리고 6-FAM(형광 표지)로 5' 말단을 표지화하였다.
표 2. 48주 추적 검사 동안 다른 치료요법을 진행한 환자의 PBMC에서의 미토콘드리아 DNA 함량
주 중간값 사분위 범위
AZT 0 196 111-252
4 157 103-191
24 182 123-224
48 155 110-224
AZT/ddI 0 174 150-243
4 126 89-235
24 93 42-200
48 112 66-170
AZT/ddC 0 132 83-200
4 48 36-76
24 68 29-107
48 74 51-83
표 3. 다른 치료요법을 진행한 환자의 PBMC의 미토콘드리아 DNA 함량에서의 유의한 변화의 분석
항-바이러스성 약물 주 감소 % p-값
AZT 4 11% 0.22
24 1% 0.80
48 5% 0.55
AZT+ddI 4 13% 0.04
24 24% 0.09
48 16% 0.02
AZT+ddC 4 22% 0.002
24 22% 0.06
48 25% 0.04
표 4. 48주 추적 검사 동안 다른 치료요법을 진행한 환자의 PBMC에서의 미토콘드리아 RNA 함량
주 환자 1 환자 2
0 632 680
4 1482 605
24 516 1106
48 448 명확하지 않음
표 5. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 HIV-1 RT-저해제의 미토콘드리아 독성 (출처: A. Carr, DA Cooper. Lancet 2000; 356; 1423-1430)
영향을 받은 기관 임상적인 특징 실험적 특색 비율(%) 약물
근육 피로,근육통,근위수척,쇠약 크레아틴 키나제↑ 17 AZT
심장 확장성 심장근질환 희박 AZT
신경 말단 통증,무감각,감각이상,감퇴된,반사/능력 10-30 ddC = d4T >ddI > 3TC
간 간비대,구토, 복수,부종,호흡곤란,뇌질환 젖산성 산성증혈청 젖산↑간 효소↑음이온차↓중탄산염↑ <1 3TC, ABC를 제외한 모든 것들
췌장 복통 아밀라제 <1-6 ddI>3TC/ddC
지방 말초 위축성 지방이상증(peripheral atropy lipodystrophy) 50 d4T > 그 외의 것들
참고문헌

Claims (41)

  1. 세포성 생물체의 기능을 결정하는 방법으로, 상기 생물체로부터 얻은 샘플에서 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의, 제 2 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양에 대한 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상기 상대적 비율이 상기 샘플에서 검출될 수 있는 핵의 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 양에 대하여 결정되는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 핵의 핵산이 DNA를 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 핵의 핵산이 작은 핵 리보뉴클레오프로테인의 성분 또는 그들의 단편을 코드하는 DNA를 포함하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 핵의 핵산이 RNA를 포함하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 핵의 핵산이 작은 핵 리보뉴클레오트로테인의 성분 또는 그들의 단편을 코드화하는 RNA를 포함하는 방법.
  7. 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물이 RNA를 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상기 상대적 비율이 상기 샘플에서 검출될 수 있는 제 2 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물에 대하여 결정되는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 제 1 핵산이 DNA를 포함하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 제 1 핵산이 RNA를 포함하는 방법.
  11. 제 1항, 2항 또는 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 핵산이 DNA를 포함하고, 상기 제 2 핵산이 RNA를 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 제 2 핵산이 본질적으로 상기 제 1 핵산의 전사에 의하여 유래될 수 있는 것인 방법.
  13. 제 8항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 내공생체 세포소기관 핵산 및 제 2 내공생체 세포소기관 핵산이 동일한 종류의 소기관으로부터 얻어진것인 방법.
  14. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 제 1 핵산이 RNA를 포함하고, 상기 제 2 핵산이 DNA를 포함하는 방법.
  15. 질병의 단계를 결정하는 방법으로, 상기 질병으로 고통받거나 또는 상기 질병에 걸릴 위험이 있는 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  16. 세포성 생물체의 기능부전의 치료를 위한 후보 화합물의 치료적 활성 및/또는 그것의 가능한 부작용을 결정하는 방법으로, 상기 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  17. 의약의 치료적 활성 및/또는 그것의 가능한 부작용을 결정하는 방법으로, 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 의약이 적어도 3개월 동안 사용되는 방법.
  19. 제 17항 또는 18항에 있어서, 상기 의약이 만성적 질병의 치료에 사용되는 것인 방법.
  20. 제 16항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 행하여지는 순간에 상기 부작용이 필수적으로 발현되지는 않는 방법.
  21. 제 16항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 활성이 HIV-관련 질병 및/또는 종양-관련 질병에 대한 치료적 활성을 포함하는 방법.
  22. 제 16항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 의약이 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 유도체가 플루다라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 사이타라빈, 플루오로우라실, 및/또는 겜사이타빈을 포함하는 방법.
  24. 제 16항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 의약이 AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC 및/또는 테노포피르를 포함하는 방법.
  25. 제 16항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물체 또는 본질적으로관련되는 생물체에 상기 화합물 또는 의약이 제공되는 방법.
  26. 세포성 생물체의 기능부전을 야기하는 후보 화합물의 독성 활성을 결정하는 방법으로, 생물체로부터 얻은 샘플에서 내공생체 세포소기관 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물의 상대적 비율을 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 생물체 또는 본질적으로 관련되는 생물체에 상기 화합물이 제공되는 방법.
  28. 제 1 생물체에 대항하는 후보 화합물의 선별적 활성을 결정하는 방법으로, 제 16항 또는 20항 내지 25항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 후보 화합물의 치료적 활성 및/또는 가능한 부작용을 결정하고, 그리고/또는 제 26항 내지 27항에 따른 방법으로 독성 활성을 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 본질적으로 관련되지 않은 제 2 생물체에 상기 화합물을 제공하는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 제 1 생물체가 병원균을 포함하고, 상기 제 2 생물체가 상기 병원균의 숙주를 포함하는 것인 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 제 1 생물체가 잡초 식물을 포함하고, 상기 제 2 생물체가 농작물 식물을 포함하는 것인 방법.
  32. 제 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상대적 비율이 동일한 검사법에서 결정되는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 동일한 검사법 내에서 상기 내공생체 세포소기관 핵산 및 상기 제 2 핵산의 증폭을 포함하는 방법.
  34. 제 32항 또는 33항에 있어서, 상기 상대적 비율이 핵산의 한 양을 다른 양으로 나눔으로서 직접적으로 결정되는 방법.
  35. 제 1항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상대적 비율이 참고 곡선과 비교하여 결정되는 방법.
  36. 제 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포소기관 핵산, 상기 그들의 유전자 산물, 상기 제 2 핵산 및/또는 그들의 유전자 산물이 말초혈 단핵구 및/또는 섬유아세포로부터 얻어지는 것인 방법.
  37. 제 1항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 방법을 행하기 위한 적어도 하나의수단을 포함하는 진단용 킷트.
  38. 제 37항에 있어서, 내공생체 세포소기관에 관련되거나 또는 그로부터 유래한 핵산의 증폭 및 검출에 선택적인 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 킷트.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브가 표 1에 나열되어 있는 것인 킷트.
  40. 의약, 제초제, 살충제, 항-기생충제, 세포정지제, 또는 세포독성제의 제조에 있어서 제 16항 또는 20항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 얻어질 수 있거나 선별될 수 있는 화합물의 용도.
  41. 제 16항 또는 20항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 얻어질 수 있거나 선별할 수 있는 의약, 제초제, 살균제, 항기생충제, 세포정지제, 또는 세포독성제.
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