KR20040011237A - Ｐｄｇｆ, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을함유하는 신경세포 보호 및 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈소판유래성장인자(Platelet derived growth factor ; 이하 PDGF), 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 신경세포의 보호, 성장촉진 및 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 신경줄기세포에서의 세포사멸 방어효과, 분화된 신경세포주에서의 세포사멸 방어효과, 신경줄기세포에서의 신경세포로의 분화 유도효과, 신경돌기의 재생효과, 중추신경재생 효과, 말초신경재생효과, 줄기세포 치료 및 유전자치료에서 신경세포의 생존 및 분화증진 효과, 치매 및 뇌허혈 등 퇴행성 뇌질환 모델에서 신경 세포사멸 방어와 재생효과가 우수하였다.

따라서 본 발명은 다양한 종류의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료제와 줄기세포 및 유전자 치료 향상제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＰＤＧＦ, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 신경세포 보호 및 재생용 조성물{A COMPOSITION FOR THE PROTECTION AND REGENERATION OF NERVE CELLS CONTAINING PDGF DERIVATIVES}

본 발명은 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 신경세포의 보호, 성장촉진 및 재생용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 신경질환 또는 신경손상 질환의 치료와 신경줄기세포 및 신경의 유전자 치료에 유용한 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 다양한 종류의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료제와, 신경줄기세포 및 신경의 유전자 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

포유동물의 뇌는 신경줄기세포(neuronal stem cell)의 분열과 분화 및 생존과 사멸(apoptosis) 그리고 시냅스 형성 등 일련의 과정을 거쳐 체계적인 신경회로망(neural network)을 발생(development)함으로서 복잡한 기능을 수행할 수 있게 된다. 동물의 성체시기에도 뇌신경세포에서는 신경성장에 필요한 많은 물질을 생산하여 축색돌기(axon)과 수상돌기(dendrite)가 성장하게 되고 새로운 학습과 기억을 할 때마다 시냅스 연결과 신경회로망(neural network)을 끊임없이 재구성(synaptic remodeling)하므로 성체에서도 계속 분화(differentiation)하고 있다고 할 수 있다. 신경세포는 세포분화하고 시냅스를 형성하는 과정에서 신경성장인자와 같은 표적유래 생존인자(target-derived survival factor)를 받지 못하면 세포사멸하며 스트레스와 세포독성물질(cytotoxic agent)에 의한 세포사멸은 퇴행성뇌질환의 주요원인이 된다.

특히 최근에 사회가 고령화됨에 따라 선진국에서 퇴행성 뇌질환의 의료 비용은 천문학적 수치를 기록하고 있으며 사회문제화되고 있고 한국에서도 평균수명이 급속도로 증가하고 있다. 선진국의 통계에 따르면 85세 이상의 노인에서 50%가 노인성 치매에 걸리므로 이에 대한 대비가 시급하다고 하겠다. 신경재생물질로 가장 가능성있는 후보물질은 신경성장인자(neurotrophic factor)이다. 1940 년대에 Hamburger와 Levi-Montalcini들이 Chick embryo limb의 분화과정에서 운동신경세포 생존에 결정적인 물질로 NGF(nerve growth factor)를 발견하였고, 그 후에 뇌에 존재하는 BDNF(brain-derived neurotrophic factor), NT-3(neurotrophic factor-3) 등의 뉴로트로핀(neurotrophin)들이 발견되었다. 아울러 각 분화신경세포 집단의 생존에 어떤 종류의 신경성장인자들의 공급이 필수적인지에 대해서도 일부 형질전환 동물실험상에서 밝혀져 있다. 최근에는 이외에도 fibroblast growth factor(FGF), neuregulin, insulin, ciliary neurotrophic factor(CNTF), glia-derived neurotrophic factor(GDNF) 등 여러 성장인자들이 신경세포의 생존에 관여하므로 신경성장인자(neurotrophic factor)로 불리며 또한 여러 종류의 싸이토카인(cytokine)들도 참여하고 있음이 밝혀지고 있다.

말초신경계는 손상되었을 때는 중추신경계와 달리 축색이 오랜 시간에 걸쳐 재생한다. 신경 상해 부위의 뒤쪽 축색은 월러변성(Wallerian degeneration)으로 알려진 과정에 의해 퇴화되고 신경의 세포체는 축색의 성장(axonal regrowth)을 다시 시작하며 슈반세포는 분열한 후 생존과 사멸에 의해 표적신경을 결정하고 다시 분화하는 등, 발생과정을 다시 거쳐 재생하게 된다.

최근에는 성체에도 신경줄기세포가 있다는 것이 확인되고 있으며 줄기세포가 성체의 뇌에서 발생분화하는 과정은 바로 재생(regeneration)과정이라 할 수 있다(Johansson, C. B., Momma S., Clarke D. L., Risling M., Lendahl U., and Frisen J. (1999) Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system,Cell96, 25-34). 신경줄기세포는 주로 측뇌실(lateral ventricle)과 맞닿는 줄무늬체(striatum)의 부뇌실 구역(subventricular zone)에서 발견되고 또한 해마(hippocampus)의 치상회에 있는 subgranular zone에서 줄기세포들이 분열하여 과립세포로 되며 이 세포들이 분화하여 기능을 가질 수 있다(van Praag, H., Schinder, A. F., Christie, B. R., Toni, N., Palmer, T. D. & Gage, F. H. (2002) Functional neurogenesis in the adult hippocampus.Nature415, 1031-1034). 따라서 신경줄기세포의 발생과 분화를 증진하면 신경재생을 촉진할 수 있다.

포유동물의 뇌 발생과정에서는 생성된 신경세포의 반 이상이 세포사멸 한다. 또한 신경세포는 신경계 질환에서 뿐 아니라 정상 성인의 뇌에서도 매일 많은 숫자가 죽어가며 노화하는 신경계에서는 말할 나위도 없다(Yuan J. and Yankner, B. A. (2000) Apoptosis in the nervous system.Nature.407, 802-809). 따라서, 신경세포의 세포사멸을 극복하는 것은 중추신경계의 퇴행성 뇌질환 뿐 아니라 척수손상및 말초신경계 손상 등 거의 모든 신경계 질환에서 중요한 문제가 된다. 최근 유럽에서는 퇴행성뇌질환 환자 특히 파킨슨씨병 환자의 경우 태아에서 얻은 신경줄기세포를 이식하는 것이 임상적으로 적용되고 있는데 이식 후에 환자는 매우 빨리 회복되어 행동이 좋아지지만 3달 후면 대부분의 이식된 세포가 사멸하여 다시 이식해야 하는 것이 문제이다(Olanow C. W., Kordower J. H., Freeman T. B. (1996) Fetal nigral transplantation as a therapy for Parkinson's disease.Trends Neurosci.19, 102-109). 신경계에서 장기적 생존을 증진하기 위해서는 결국 이식된 세포가 그 조직에 적합한 종류의 신경세포로 분화하여 표적세포와 시냅스를 만들고 전기적 신호전달에 참여하여 표적세포로부터 계속해서 생존인자를 공급받아야 가능하다.

신경세포 사멸에 대한 연구는 분화된 신경세포에서는 많이 연구되어왔으나 신경줄기세포에서는 연구 보고가 거의 없으며 신경세포 사멸을 극복할 수 있는 물질에 대한 연구도 아직 미비하다.

신경줄기세포는 분열하여 자기 자신과 또는 분화할 세포를 만드는데 이때 세포분열이 잘못되었거나 필요 없는 세포는 자연사(apoptosis)하게 되고 생존하게 된 세포는 앞으로 어떤 세포로 분화할 것인지 운명을 결정하게 된다. 신경세포로 분화하는 신경전구세포(neuronal precursor 또는 neuroblast)는 그 장소에 적합한 신경전달물질을 분비하는 세포로 분화하게 되고 신경교세포로 분화하는 신경교 전구세포(glial precursor)는 신경별교세포와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화한다. 이들은 신경세포를 보조하는 세포로 신경별교세포는 기계적 대사적으로 지지하고 성체 뇌의 70-80%를 이루며, 희소돌기아교세포는 축색돌기를 둘러싸서 신경전달을 빠르게 하는 지방물질인 미엘린(myelin)을 생산한다. 태아와 성체의 중추신경계 신경줄기세포는 뇌조직 내의 삼차원적 환경과 그들이 전달받는 신호의 종류에 따라 세 가지 종류 뇌세포를 모두 만들 수 있다. 중추신경계 줄기세포로 세 가지 종류가 보고되었는데 이들 모두 설치류 성체 뇌에 존재하고 인간의 성체 뇌에도 존재할 것으로 보인다. 한 종류는 뇌실 구역과 부뇌실 구역으로 알려진 뇌실(ventricle)과 맞닿는 부위의 뇌조직에 존재한다. 뇌실은 뇌척수액(cerebrospinal fluid)이 흐르는 공간이다. 태아 발생과정에서 뇌실 주변 조직은 세포 분열이 매우 활발히 일어나는 부위이고 성체에도 이 부위에 줄기세포가 존재하나 조직이 훨씬 작아져 있다. 줄기세포가 존재하는 두번째 부위는 사람에서는 아직 발견되지 않은 부위로 측뇌실과 후각망울(olfactory bulb)을 연결하는 길다란 틈을 이루는 부위(rostral migratory stream)이고, 세번째 부위는 기억의 형성에 관계하는 뇌 부위인 해마로 성체 쥐와 사람의 뇌에서 존재한다.

해마에서 줄기세포가 있는 부위는 치상회의 subgranular zone이다. 쥐에서 BrdU(bromodeoxyuridine)로 분열하는 세포를 표지했을 때 표지된 세포의 반 정도가 치상회의 과립세포로 분화하고 15%는 신경교세포로 분화하며 나머지는 확실한 표현형을 갖지 않는다.

사람과 쥐의 치상회에서 BrdU표지된 일부 세포들은 신경세포 표지자인 NeuN, neuron-specific enolase, 또는 칼빈딘 등을 발현하며 이들 신경 유사세포들은 치상회의 과립세포와 형태적으로 유사하였다. 다른 BrdU 표지된 세포들은 신경별교세포 표지자인 GFAP를 발현하였다. 최근 연구에서는 진단 목적으로 BrdU를 주입한 다섯 암 환자(57-72세)의 뇌조직에서 BrdU 표지된 세포를 조사한 결과 가장 나이 많은 환자의 뇌에서 가장 많은 수의 BrdU 표지된 세포가 발견되었으며 이는 해마에서의 신경세포 형성이 생애 마지막까지도 계속된다는 것을 의미한다.

신경성장인자들은 포유동물의 신경발생과정에서 신경줄기세포의 분열·분화와 사멸의 운명결정, 신경과 신경교세포로의 운명결정, 그리고 시냅스 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 신경성장인자들은 성장인자(growth factor)의 일종으로, 구조적으로 연관된 gene families를 이루고, 세포막 수용체를 활성화하여 신호전달을 조절하며 세포질내 신호단백질들의 인산화를 조절하여 신경세포의 반응을 나타낸다. Platelet-derived growth factor (PDGF) A와 B, insulin, NGF family인 BDNF와 NT-3는 각기 PDGF receptor, insulin receptor 및 TrkB와 TrkC를 통해 신호를 전달한다.

신경성장인자 PDGF는 fibroblast mitogen으로 알려져 왔으나 최근 배아와 성체의 뇌 신경에서 가장 많이 발현되는 것으로 알려졌으며 A와 B 모두 신경세포에서 분비된다. PDGF α수용체는 쥐 뇌의 glia 세포에서 발현되는 반면, β수용체는 신경세포에서만 발견된다. 특히 해마의 pyramid 신경세포에서 가장 많이 발현되며 PDGF B 역시 pyramid 세포와 granule 신경세포에서 가장 많이 발현되므로 PDGF B와 PDGF α수용체는 신경세포에서 autocrine loop를 형성하고 PDGF B와 PDGF β수용체는 glial 세포에서 paracrine loop를 형성하여 신호를 전달할 것으로 추측된다(Sasahara, M., Fries, J.W.U., Raines, E.W., Gown, A.M., Westrum, L.E., Frosch M.P., Bonthron, D.T., Ross, R. and Collins, T. 1991. PDGF B-chain in neurons of the central nervous system, posterior pituitary, and in a transgenic model. Cell 64, 217-227; Smits, A., Kato, M., Westermark, B., Nister, M., Heldin, C,-H. and Funa, K. 1991. Neurotropic activity of PDGF: Rat neuronal cells possess functional PDGF beta receptors and respond to PDGF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8159-8163).

PDGF 수용체를 통한 신호전달경로는 fibroblast가 세포분열하는 과정에서 매우 잘 연구되어 있으므로 신경계에서 PDGF 수용체의 신호전달계를 비교 연구하는 데에 좋은 자료가 될 수 있다. Fibroblast에서 PDGF의 세포내 신호전달은 주로 focal adhesion에 있는 Src, Fak, Cas 등이 활성화되어 Myc을 induction하는 경우와 PLCγ, SH-PTP2, Shc 등이 Ras-> raf -> MEK -> Erk 를 통해 c-fos를 induction하는 경우, 그리고, PI3kinase→AKT→bad와 14-3-3가 세포생존에 관여하는 경우로 크게 나누어 볼 수 있다.

해마는 뇌의 측두엽에 연결된 부위로 학습과 기억에 관여하며, 해마의 주된 세포인 흥분성 pyramid 신경세포는 E16에서 분열하기 시작하여 E18부터 E20 사이에 발생하고, dentate granule 신경세포들은 E18에 이동과 분열을 시작하여 대부분이 출생 후에 발생한다(Altman J., Bayer. S. A., 1990. Mosaic organization of the hippocampal neuroepithelium and the multiple germinal sources of dentate granule cells. J. Comp. Neurol. 301. 365-381). 해마의 pyramid 신경세포가 발생하기 시작하는 E16에 신경간세포를 1차배양하고 neurotrophic factor인 FGF를 처리하면 세포의 분열이 증가하고 분화하여 약 30%가 신경세포로, 나머지는 glia 세포로 발달한다. McKay group은 PDGF를 처리하면 약 80%가 신경세포로 분화하도록 운명이 제한되고 NT-3를 처리하면 신경세포로 분화하여 neuronal marker를 발현하며, 또한 FGF와 EGF를 처리한 후 CNTF를 처리하면 신경교세포로 분화하며 thyroid hormone T3는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로의 분화를 촉진한다고 발표하였다(Johe, K. K., T. G. Hazel, T. Muller, M. M. Dugich-Djordjevic, and R. D. Mckay. 1996. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes & Dev.10, 3129-3140). 이는 PDGF가 원시신경세포 발생의 매우 초기에 neurotrophic factor로 작용하여 neuronal cell fate를 결정하는 것을 의미한다.

이 연구에서 사용하는 해마원시신경세포주들은 pyramid 신경세포가 처음분열을 시작하는 E16에 일차세포배양한 후 ts-SV40 T antigen을 retrovirus infection하여 clone되었다(Renfranz, P., Cunningham, M. and RD, M., 1991. Region-specific differentiation of hippocampal stem cell line HiB5 upon implantation into the developing mammalian brain. Cell 66, 713-729). 따라서, permissive temperature(33℃)에서는 계속 분열하고, nonpermissive temperature인 쥐의 체온(39℃)에서는 분열을 멈추고 분화운명을 들어서면서 많은 세포들이 사멸하는데 본 발명자는 대부분의 세포가 apoptosis하는 것을 DNA fragmentation, TUNEL staining, Annexin staining 등으로 확인하였다. HiB5 세포주는 유전자치료를 위해 세포이식을 목적으로 만들어 졌으며 성체의 뇌에 이식하면 이동하여 그 주변의 환경에 따라 pyramid 신경세포 또는 astrocyte등으로 분화한다. 즉, 주변에서 오는신경성장인자등에 의해 운명이 결정되는 것으로 보인다.

흰쥐의 해마에서 neurogenesis가 시작되는 E16 배아를 일차 배양하면 거의 모든 세포들이 nestin을 발현하고 serum 없는 defened media에서도 상당한 세포 분열을 하며 3-7일 후에 신경과 glia로 분화한다. 이 때 pyramid 신경세포들은 bFGF에 의해 생존이 증진된다. 또한 PDGF가 90%의 세포들을 neuronal lineage로 바꾸는 시기이므로 이 시기는 원시신경세포가 운명을 결정하는 시기라 할 수 있으며 HiB5와 같은 신경세포주는 세포 분열, 세포 사멸, 세포분화의 운명을 결정하는 기작을 연구하고 그 신호전달을 연구하기에 좋은 system이다. 그외에도 세포주이기 때문에 분화생물학적, 생화학적 연구에 필요한 많은 수의 세포를 얻는 것이 가능하고 그러한 기작을 분석, 연구하는데 필수적인 genetic manipulation할 수 있는 점들이 장점으로 부각된다.

PDGF가 fibroblast의 세포사멸을 막고 생존을 증진시키는 기작은 주로 PI3kinase를 통한 경로가 잘 연구되어 왔는데, PDGF가 PI3kinase를 인산화시키면 Akt가 직접 결합하여 인산화되고 다른 serine/threonine protein kinase의 도움으로 완전히 activation되면 비로소 Bad를 인산화 시킨다.Bad가 속하는 Bcl2 family는 세포의 생존을 결정하는 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 그중 Bcl-2 와 Bcl-XL은 mitochondria에서 세포의 생존을 유지하고, Bad나 Bax는 Bcl-2나 Bcl-XL과 heterodimer를 형성하여 이러한 기능을 저해한다. mitochondria에서 bcl-XL과 결합하고 있던 Bad는 두 부위가(Serine-112, Serine-136) 인산화되면 cytosol로 방출되어 phosphoserine-binding protein인 14-3-3과 결합하고 남아있는 Bcl-XL은 Bad의저해기능이 사라졌으므로 세포의 생존을 촉진하게 된다.

Apoptosis는 DNA fragmentation, 핵과 세포질의 축소 등의 형태적 특징을 수반하는 세포사멸의 한 형태로 그 과정을 크게 시작(initiator), 효과발현(effector), 분해 (degradation)의 3 단계로 나눌 수 있다. 신경세포에서는 DNA 상해, 삼투압의 교란등 세포 내의 신호와 serum deprivation, 가용성인자들에 의한 세포외부의 신호등, 다양한 형태로 apoptosis 시작신호가 전달 될 수 있는데 근접한 세포들에서 각 세포 표면에 있는 TNF-receptor family와 그 ligand에 의한 신호전달이 neurodegenative diseases에서의 세포사멸, 또는 발달단계에서 볼 수 있는 세포 사멸의 중요한 부분을 차지한다. Apopotsis를 통한 세포사멸 과정에는 caspase protease의 활성과 mitochondira pathway의 2 가지의 중심 pathway가 있다.

Caspase는 4개의 amino acid로 구성된 인지 motif 내의 Aspartic acid에서 단백질을 절단하는 cystein protease이다. 이 단백질들은 비활성의 zymogen 상태에서 apoptosis 과정 중 절단에 의해 활성화되는데 initiator 단계에서 작용하는 caspase, upstream caspase (e.g. caspase 2 ,8, 10)와 effector 단계에서 활성화되는 downstream caspase (caspase-3, 6, 7)로 구분된다. Initiator caspase는 effector caspase를 절단함으로써 활성화시키고, effector phase의 caspase들은 DNA 상해회복에 필요한 poly (ADP-ribose) polymerase나 핵의 구조 단백질인 lamin등을 분해하여 자살의 길로 들어서게 된다. 여러 사멸신호의 전달은 death domain (DD)을 갖고 있거나 그렇지 않은 FADD, TRADD 나 RIP 등의 adaptormolecule을 통하여 upstream effector들을 활성화시킨다.

Mitochondira pathway를 통한 apoptosis 과정은 Bcl-2 family 단백질들에 의해 조절된다. Bcl-2 gene family는 세포사멸을 촉진시키는 군과 억제시키는 군으로 나눌 수 있는데 이들은 활성화 경로나 조직 특이적 발현 pattern, 그리고 그 구조에 차이를 보인다. Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1과 Bag-1은 세포사멸을 억제하는 반면 (anti-apoptotic), Bad, Bax, Bik, Bcl-X_S와 Bak은 세포의 사멸을 촉진 (pro-apoptotic)시키는 것으로 알려져 있다. 사멸신호가 전달되면 pro-apoptotic Bcl-2 family 단백질들은 위치를 이동하여 mitochondria 막의 투과성을 변화시켜, 결국 mitochondria 막전위를 교란시키고, cytochrome c 의 유출, 활성산소를 생성하게 된다. 이는 전자전달계의 기능을 무력하게 하여 ATP의 고갈로 이어져 necrosis로 이른다. anti-apoptotic family member들은 mitochondria 외막에 위치하여 이와 반대 작용을 하게 된다. Bcl-2 family member의 단백질에는 Bcl-2 homology domain (BH1부터 BH4)이라 불리는 아미노산 서열이 있는데 어떤 BH domain을 갖느냐에 따라 결합할 수 상대 단백질이 결정된다. Bcl-2 family member의 단백질들은 각 BH domain을 이용해 homodimer나 heterodimer를 형성 할 수 있고 세포사멸 촉진인자와 억제인자와의 비율에 따라, 즉 어떤 상대와 결합하느냐에 따라 세포사멸의 억제 또는 촉진의 기능을 나타낸다.

Mitochondria와 caspase pathway는 긴밀히 연결되어 있다. Caspase-8은 Bcl-2family인 Bid를 절단하고, 절단된 Bid는 (tBid)는 Bad와 함께 Cyt.c를 유출시킨다. 유출된 Cyt.c는 caspase adaptor인 Apaf-1이 effector caspase인 caspase-9과 3를 활성화시키도록 한다.

신경성장인자들은 신경간세포의 분열개시, 분열한 세포의 수를 사멸과정으로 조절하는 동시에 분화를 시작하도록 하며, 표적유래성장인자로서 정향 이동된 세포의 생존과 잘못된 방향으로 이동된 세포의 사멸을 유도하여 시냅스전 신경세포의 생존을 조절하는 한편 새로운 시냅스 형성과 재구성을 조절한다. 또한 성체의 신경 생존과 시냅스 가소성 및 신경손상 시 재생하는 과정에서도 유사한 기능을 가질 것으로 추측된다. 이러한 신경성장인자를 신경질환 치료에 이용하는 방법으로는 줄기세포에 직접 처리하여 이식할 수도 있으나 유전자 전달 벡터로 바이러스를 이용하여 치료 유전자를 전달하는 유전자 치료를 이용할 수 있다.. 본 실험에 사용된 재조합 아데노바이러스(recombinant adenovirus)는 E1B 부위가 결손된 복제결핍바이러스매개체(replication defective viralvector)로서 최근 실경계 질환에 치료 유전자의 주입으로서 질환부위에 대한 치료 효과를 거두기 위해 연구되고 있다.

아데노바이러스의 장점은 분열하는 세포에만 감염되는 레트로바이러스(retrovirus)와는 달리 신경이나 근육 세포와 같이 최종적으로 분화한 다양한 종류의 세포에도 감염이 가능하다는 것이다.(Breakefield X.O (1993) Gene deliver into the brain using virus vector, Nature genetics 3,187-189 ; Heistad D.D, Faraci F.M (1997) Gene therapy for cerebral vascular disease, Stroke 27, 534-539) 그리고 다른 바이러스 매개체에 비해 세포독성이 낮아 안전하며 높은 농도로 정제될 수 있다. 또한 8kb의 비교적 큰 수용능력을 지녔으며 생산하기도 쉽다는 장점을 가지고 있다. 또한 레트로바이러스와 달리 insertional mutagenesis의 위험도가 낮다는 장점도 있다.

이미 보고된 다른 논문에서 아데노바이러스는 폐의 상피세포와 피부, 근육으로의 escherichia coli LacZ 유전자의 발현 유도시 높은 정도로 발현이 된다는 것을 확인하였다.(Jaffe H.A et al (1992) Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat liver, Nature genetics 1, 372-378 ; Mastrangeli A et al (1993) Diversity of airway epitherial cell target for in vivo recombinant adenovirus-mediated gene transfer, J.Clin. Invest 91, 225-234 ; Setoguchi Y et al(1994) Intraperioneal in vivo gene transfer in the skin using replication-deficient receombinant adenovirus vector, J.Invest.Dermatol. 102, 415-421 ; Yang Y et al (1996) Immonology of gene therapy with adenoviral vectors in mouse skeletal muscle, Hum.Mol. 5 1703-1712). 본 발명자는 재조합 LacZ 아데노바이러스가 HiB5 신경줄기세포에 잘 감염되며 쥐의 신경계에 잘 감염되고 6주 이상 발현되는 양상을 보고한 바 있다(Joung I., Kim H. S., Hong J.S., Kwon H., and Kwon Yunhee Kim. (2000). Effective gene transfer into regenerating sciatic nerves by adenoviral vectors: potentials for gene therapy of peripheral nerve injury.Mol. cells.10 (5):540-545.). 따라서 재조합 PDGF 아데노바이러스를 제조하고 줄기세포에 감염하고 이식하거나 퇴행성뇌질환의 재생에 직접사용할 수 있다.

인간의 경우 중추신경계는 물론 말초신경계도 재생이 어려워 퇴행성 뇌질환 뿐만 아니라 현대사회의 산업재해 및 교통사고, 전쟁불구자 등이 누적되면서 사회문제화 되고 있으므로 신경계의 재생에 관한 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.

또한 선진 사회의 문제 중의 하나는 고령화로 인한 여러 가지 만성, 난치성 질환들로 인한 사회적, 경제적 부담일 것이다. 그 중 신경 계통의 질환은 뇌기능 연구에 대한 신경과학의 전반적인 연구가 아직 부진한 상태이므로 각종 만성 신경계 질환의 치료 약제개발 또한 난관에 처해 있다. 특히 신경줄기세포의 사용은 이제까지와는 전혀 다른 관점에서 질환을 원인적으로 치료하는 의료계의 혁명적인 새로운 치료법으로 인식되고 있으나 그를 위한 뇌신경줄기세포의 발생과 분화에 대한 연구가 부진하여 그 효과에 한계가 있다. 신경줄기세포의 장기적 생존 및 이식 부위에 적합한 신경세포 종류로의 분화의 증진은 이러한 치료를 현실화하고 대중화할 수 있을 것이다.

본 발명의 목적은 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 신경의 보호, 성장촉진 및 재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 신경질환 또는 신경손상 질환의 치료에 유용한 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 다양한 종류의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 직접 치료제와 이들의 신경줄기세포 및 유전자 치료제를 제공하는 것이다.

도 1a는 신경줄기세포인 HiB5 세포가 분화하는 과정에서 세포생존이 크게 감소하며 여러 신경 성장인자를 처리했을 때 PDGF가 다른 신경성장 인자에 비해 가장 세포생존의 증진 효과가 높은 것을 정량적으로 (MTT 분석법) 보여주는 그래프이다. 도 1b 내지 1d는 PDGF가 신경줄기세포인 HiB5 세포의 세포사멸(cell death 또는 apoptosis)을 방어(block)하는 것을, 시간에 따라 일어나는 전형적 세포사멸 특징을 통해 증명하는 그림이다. 도1b는 세포사멸이 시작되는 초기(3시간)에 일어나는 phosphatidyl serine의 세포막표면으로의 이동을 PDGF가 방어하는 것을 annexin V로 형광염색하여 보여주는 그림이고 (X400 배율), 도1c는 세포사멸이 시작된 18시간에 DNA 절편화(fragmentation) 정도가 PDGF에 의해 줄어드는 것을 보여주는 전기영동사진이다. 도 1d는 24시간이 지나면서 활성화된 caspase3에 의해 잘리는 poly (ADP-ribose) polymerase(PARP) 단백질을 immunoblot 분석법으로 보여주는 사진이다.

도 2a는 PDGF에 의해 HiB5 신경줄기세포가 신경세포로 분화 유도되는 것을 신경특이적 표지자인 neurofilament와 acetylated tubulin을 면역세포화학법(immunocytochemistry)으로 염색하여 보여주는 사진이다(X400 배율). 도2b는 PDGF를 처리한 후 시간이 지남에 따라 neurotrophin인 BDNF와 NT-3의 mRNA 발현량을 RT-PCR로 보여주는 전기영동 사진이다. 도 2c는 PDGF가 HiB5세포에서 신경분화를 유도하는 동안 BDNF와 NT-3의 수용체인 TrkB와 TrkC의 mRNA 발현 증가가 유도되는 것을 RT-PCR로 보여주는 사진이다.

도 3a는 신경줄기세포 HiB5가 분열시 3b는 분화하는 과정에서 H₂O₂를 처리하여, 퇴행성뇌질환과 허혈성뇌졸증에서 공통적인 경로로 알려져 있는 oxidative stress에 노출하고 이때 유도되는 세포사멸에서 PDGF가 신경보호(protection)효과가 있음을 MTT분석법을 통해 보여주는 그래프이다.

도 4a는 신경줄기세포 HiB5가 분열시 4b는 분화하는 과정에서 stress hormone인 덱사메타손을 처리했을 때 유도되는 세포사멸에서 PDGF가 신경보호효과가 있음을 MTT분석법을 통해 보여주는 그래프이다.

도 5는 분화하는 HiB5세포에서 PDGF의 신경보호 효과에 대한 세포내 기전을 보여주는 그림이다. 도 5a는 세포내 신호전달계에서 특이적인 효소저해제를 사용하여 PDGF가 PI3kinase와 MEK을 통해 세포보호 효과를 나타내는 것을 MTT분석법으로 보여주는 그래프이고, 도 5b는 PI3kinase 경로를 따라 PI3kinase ?? AKT ?? Bad(apoptotic gene)가 시간단계적으로 티로신인산화되면서 신호가 증폭되는 것을 immunoblot분석법으로 보여주는 그림이다. 도 5c는 PDGF를 처리하였을 때 MEK경로를 통해 Erk가 인산화되어 세포의 생존을 증가하는 것을 보여주는 그림이다. 도 5d는 혈청제거 스트레스시에 anti-apoptotic gene인 Bcl-2와 Bcl-xL이 감소하나 PDGF가 발현을 증가시키며 apoptotic gene인 Bax는 스트레스하에서 변화가 없음을 immunoblot분석법으로 보여주는 그림이다. 도 5e는 혈청제거 스트레스시 apoptotic gene인 Bad와 Bax에 의해 미토콘드리아에 채널이 형성되고 cytochrome c가 방출되는 것을 PDGF가 감소시켜 신경보호효과를 가지는 것을 cytochrome C에 대한 immunoblot분석법으로 보여주는 그림이다.

도 6a는 신경줄기세포 HiB5를 유전자치료용 재조합 LacZ 아데노바이러스(recombinant LacZ adenovirus)로 감염하여 표지한 후 흰쥐 해마에 이식하고 3일에서 8주가 지난 후에 지질친화적 표지인자인 DiI와 X-gal 로 염색하여 줄기세포의 이동경로를 보여주는 그림이다( X2에서 X100 배율). 도 6b는 PDGF를 처리한 군과 처리하지 않은 신경줄기세포를 이식한 후 1주에서 12주가 지난 후에 각각 DiI 양성 세포수와 LacZ 양성 세포수를 세어 생존률을 나타낸 그래프이다.

도 7a는 신경줄기세포 HiB5를 DiI로 표지하여(DiI; 붉은색) 이식하고 4주 후에 신경세포(NeuN, MAP2, NF), 신경교세포(astrocyte, GFAP)와희소돌기아교세포(oligodendrocyte, O4) 각각의 세포특이적 표지자(FITC;녹색)로 염색하여 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.(배율: X400) 도 7b는 이식 4주 후에 해마에서 각각의 세포로 분화한 HiB5 세포의 수를 센 후 분화양상을 나타낸 그래프이다.

도 8a는 뇌이식 후 6주 후에 HiB5 세포(DiI; 붉은색)를 글루타메이트(Glutamate)와 가바(GABA), 글루타메이트 수용체 2(Glutamate receptor2), 엔엠디에이 수용체(NMDA receptor 2A)와 시냅신(synapsin)을 검출하는 항체를 사용하여 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다(배율: X400). 도 8b는 도 8a의 실험에서 염색된 세포 수를 세어 나타낸 분화양상 그래프이다.

도 9a는 신경독(neurotoxin)인 ibotenic acid를 뇌에 주입하여 치매를 유도하거나 유전자 치료용 재조합 LacZ 아데노바이러스를 함께 뇌에 주입한 흰쥐의 뇌조직을 신경특이적 표지자인 칼빈딘(calbindin) 항체로 형광염색하여 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다(배율: X200). 도9b는 도 9a에서 칼빈딘으로 염색된 세포수를 세어 세포생존율을 그래프로 나타낸 것이다.

도 10a는 손상받지 않은 좌골신경에서, 도 10b는 손상받은 좌골신경에서 재조합 LacZ 아데노 바이러스에 의한 LacZ 유전자 발현을 5주까지 X-gal 염색으로 관찰한 사진이다. 도 10c는 좌골신경 수술 후 2일에서 5주가 지난 후 X-gal 염색하고양성세포수를 세어 LacZ 발현 양상을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염의 신경세포 성장촉진 및 신경세포 재생용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 신경계의 물리적 손상 및 퇴행성 신경질환, 허혈성 뇌신경 손상, 말초신경 손상에 대한 치료제, 그리고 신경줄기세포 및 유전자 치료제로 매우 유용하게 이용 될 수 있다.

본 발명의 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염에 있어서, PDGF는 공지된 PDGF의 A쇄 또는 B쇄 또는 이들의 결합 단백질을 포함하며, 보다 바람직하게는 하기 아미노산 서열 1의 B쇄이다.

아미노산 서열 1(PDGF-B의 아미노산 서열)

1 mslgsltiae pamiaecktr tevfeisrrl idrtnanflv wppcvevqrc sgccnnrnvq

61 crptqvqlrp vqvrkieivr kkpifkkatv tledhlackc etvaaarpvt rspggsqeqr

121 aktpqtrvti rtvrvrrppk gkhrkfkhth dktalketlg a1

또한 본 발명은 PDGF의 일부서열이 치환, 손실, 부가된 형태인 것을 포함한다.

또한 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 염산, 질산, 브롬산, 황산, 인산, 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

한편 PDGF는 AA, AB, BB 형태가 있으며, 의약품으로는 상피세포 손상 재생제로 개발되어 있다.

본 발명에서는 체외(in vitro) 배양된 신경줄기세포와 신경세포주의 스트레스 모델(혈청제거 및 산화적 스트레스)과 체내(in vivo)실험에서 치매와 뇌졸중 동물모델을 사용하여 PDGF의 효과를 조사하였다. PDGF에 대하여, 인간의 신경아세포종(human neuroblastoma ; SH-SY5Y), 흰쥐의 신경줄기세포(rat neuronal stem cell ; HiB5) 및 인간의 신경줄기세포(HNC) 등을 사용하여 세포들에 대한 재생 및 분화 촉진여부, 신경독에 대한 방어능 등을 종합적으로 실험하고 알츠하이머성 치매 모델등 퇴행성뇌질환으로 인한 뇌세포 파괴에 대한 신경세포의 복구 및 방어능, 신경줄기세포 및 유전자 치료를 이용한 신경세포의 세포사멸 극복, 생존 및 분화의 증진 등을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염은 신경계발달장애나 퇴행성 뇌질환 등 신경계 질환 및 손상을 치료하고 줄기세포와 유전자 치료를 이용한 신경손상 재생에 유용할 것으로 판단된다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. PDGF에 의한 항 세포자살 효과 확인

본 실험에서는 신경세포의 분화와 재생에서 PDGF의 효과를 조사하기 위해서 흰쥐의 해마에서 유래하는 HiB5 신경줄기세포주를 사용하였다.

PDGF가 신경줄기세포의 세포사멸을 감소시키고 세포생존을 증가시키는 보호효과를 가지는지 조사하기 위해 HiB5세포를 분화시작 조건에서 배양하면서 PDGF를 처리하여 HiB5세포의 세포사멸 방어효과를 MTT (3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법으로 측정하였다. 대조군으로는 같은 조건에서 신경성장인자 bFGF를 처리하여 세포사멸을 막고 생존을 증진하는 양성대조군(positive control)으로 하였다.

그 결과 HiB5세포는 성장인자를 첨가하고 3일이 지났을 때 PDGF를 넣은 경우 2.5배 증가하였고 신경간세포의 세포분열을 증진하는 bFGF를 넣은 경우도 1.8배 증가하였다. 신경분화인자인 NT-3와 glia세포의 생존을 증진하는 GGF는 생존을 증가시키지 않았고, bFGF와 함께 신경간세포의 세포분열을 증진하는 EGF와 중추신경의 신경생존 및 분화를 증진하는 BDNF는 20-30%의 증가를 보였다(도 1a 참조). 또한 PDGF에 의한 세포생존은 시간이 지남에 따라 그 효과가 더욱 크게 나타나는 것을 볼 수 있다.

또한 PDGF가 HiB5 신경줄기세포에서 세포자살을 막고 세포생존을 증진하는지 조사하기 위해 세포사멸의 marker를 조사하였다(도 1b, 1c, 1d). 먼저 세포사멸 현상에서 가장 일찍 일어나는 현상으로 세포사멸 유도 3시간 후에 세포막의 지질 이중막에서 세포질 쪽에만 분포하던 phosphatydyl serine이 세포막에서 세포외 기질 쪽으로 분포하게 되므로 이를 annexin V를 사용하여 검출하고 형광을 내는 rhodamin을 붙여놓은 이차항체를 사용하여 형광염색하였다. 세포가 분열하고 있을 때는 (도1b의 a, b, c) annexinV로 검출되지 않았으나 분화하는 세포에서는 (도1b의 d, e, f) 염색되었고, PDGF를 처리한 경우에는 염색되지 않았다 (도1b의 g, h, I). 세포핵을 푸른 형광을 내는 DAPI염색약과 (도1b의 a, d, g), annexinV로 이중염색하여 (도1b의 b, e, h), 겹쳐 사진을 찍어서 HiB5세포가 염색된 것을 보여준다.

또한 세포가 사멸할 때 12시간 이후에 일어나는 세포사멸의 가장 특징적인 현상으로 DNA 절편화(fragmentation) 현상을 조사한 결과 분화시작 후 18시간에는 DNA gel에서 DNA 절편이 증가하였으나 PDGF를 처리했을 경우에는 그러한 현상이 줄어드는 것을 알 수 있었다(도 1c 참조). 세포사멸이 시작된 후에 24시간이 지나면 세포사멸에서 공통적으로 활성화되는 caspase3가 DNA 보수에 작용하는 PARP를 자르는데 이 현상이 일어나면 세포사멸은 돌이킬 수 없게된다(도 1d).

따라서 PDGF는 성체의 신경줄기세포가 분화하는 과정에서 일어나는 세포사멸을 감소시키고 생존을 증진하는 신경보호 효과(neuroprotective effect)가 있는 것으로 판단된다.

2. PDGF에 의한 신경줄기세포의 분화 촉진 효과

PDGF에 의해서 신경줄기세포가 신경세포로 분화한다는 사실을 확인하기 위해서 neuron specific marker인 neurofilament와 acetylated tubulin으로 세포를 염색해 본 결과 PDGF를 처리하면 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 알 수 있다. (도 2a참조) 또한 PDGF를 처리한 후 신경성장 조절인자 들의 발현양상을 시간대별로 관찰 해본 결과 후기 발생인자인 neurotrophin(BDNF, NT-3)과 그들의 수용체인 TrkB와 TrkC의 유전자 발현을 유도하여 신경세포의 분화를 유도하였다. (도 2b, 2c 참조)

따라서 PDGF는 신경보호 효과 뿐만 아니라 신경세포로 분화가 일어나게 하며 이는 neurotrphin과 그 수용체의 발현을 유도하여 일어나는 것이다.

3. 분화된 신경간세포주에서 스트레스에 의한 세포사멸 방어 효과

1) 산화적 스트레스 상태에서 신경줄기세포의 생존과 분화에 미치는 영향

- 퇴행성 뇌질환은 신경세포의 세포사멸이 원인이며 세포사멸의 공통적 기전으로 산화적 스트레스를 들 수 있다. H₂O₂는 강력한 산화제로서 세포에 산화적 스트레스를 유발하므로 뇌졸중 및 치매등 퇴행성 뇌질환의 세포모델로 공통적으로 사용된다. 신경줄기세포 HiB5가 분열 또는 분화하는 과정에서 H₂O₂를 농도별로 30분간 처리하여 산화적 스트레스를 준 후 PDGF를 처리했을 때의 효과를 조사하였다. 그 결과 H₂O₂는 분열하는 줄기세포에서는 큰 영향이 없어서 150-300uM 에서도 세포 생존이 20%정도만 감소하였으나(도 3a 참조) 분화하는 세포에서는 농도에 비례하여 세포생존이 크게 감소하였으며 150uM에서 이미 25%까지 세포생존이 줄어들었다. 이때 PDGF는 높은 농도의 H2O2를 처리했을 때는 효과가 없었으나 10과 50uM에서는 세포생존율을 유지하여 50uM에서는 2배의 세포생존율을 보여주었다. (도 3b 참조)

따라서 PDGF는 oxidative stress에 의해 죽는 신경세포에 대해 신경보호효과를 가진다.

2)글루코코르티코이드(glucocorticoid)스트레스 상태에서 신경줄기세포의 생존과 분화에 미치는 PDGF의 효과

- 글루코코르티코이드는 부신에서 분비되는 지방성호르몬으로 당대사외에 많은 물질대사에 관여하며 특히 스트레스를 받으면 많이 분비되어 뇌에서는 신경줄기세포의 세포분열이 감소되고 신경세포의 세포사멸을 일으킨다. 따라서 HiB5 세포에 글루코코르티코이드의 유도체인 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하여 스트레스 상태를 유도하고 HiB5 세포의 생존과 분화에 미치는 효과를 MTT분석법으로 조사하였다. 덱사메타손은 농도별로 PDGF와 함께 배양액에 첨가하여 스트레스를 유도한 후 신경재생 하였다. 그 결과 덱사메타손은 분열하는 신경줄기세포에서는 그 영향이 크지 않았으나 (도4a 참조) 분화하는 줄기세포에서는 농도에 비례하여 세포생존이 99%에서 70%까지 감소하였으며 0.1mM에서는 갑자기 큰 폭으로 감소하였다. 여기에 PDGF를 처리했을 경우에 1.5배 정도의 세포생존율 증가를 보였으며 역시 농도에 비례하여 증가하였다. (도4b 참조)

따라서 PDGF가 stress hormone에 의해 죽는 신경세포에 대해 신경보호효과를 가지는 것으로 보인다.

3) 혈청제거 스트레스 상태에서 PDGF가 신경줄기세포의 세포생존을 증진하는 신호전달 기작 연구.

신경줄기세포에서 혈청을 제거하면 세포사멸하여 3일 후에는 20-30%가 생존하는데 PDGF를 처리하면 도 5a에서 보는 것처럼 2.5배 이상의 생존율을 보인다. 그 신호전달계를 발견하기 위해 PI3kinase와 MEK의 저해제인 wortmannin과 PD98059를 처리하면 세포생존이 감소한다. 도5b에서는 PI3kinase 저해제가 세포생존을 감소하였으므로 PI3kinase 경로의 신호전달 단백질의 인산화를 조사하였다. PI3kinase는 PDGF 처리후 3분내에 tyrosine에 의해 인산화되어 15분에 사라졌고 AKT는 phosphoAKT 항체로 immunoblot 한 결과 인산화가 15분 까지 유지되었으며, Bad를 transfection한 후 인산화를 phosphoBad 항체로 조사한 결과 s136과 s112 부위에서 15분에 가장 증가하여 2시간까지 유지되었다. 또한 Bad는 AKT(s112)와 MEK의 downstream인 Rsk(s136)에 의해 인산화되고 AKT는 PI3kinase, MEK은 ras경로에 의해 인산화되므로 이들 신호전달 단백질의 인산화를 조사하고 PI3kinase의 저해제인 wortmannin을 처리 후 Bad의 인산화를 조사하였다. Bad는 PDGF를 처리한 후 3분에 인산화되어 15분에 더욱 증가하였으며 PI3kinase의 저해제인 wortmannin에 의해 인산화가 감소하였다. 따라서 PI3kinase 경로와 ras경로에 의해 Bad가 인산화되고 세포는 생존하게 되는 것으로 보인다. 도 1c는 MEK의 신호전달경로에서 MEK에의해 인산화되는 ERK1과 ERK2 단백질의 인상화를 조사하였는데 예상대로 PDGF에의해 인산화되었고 dnldml en 저해제에 의해서도 인산화가 감소하였으므로 ERK가 MEK뿐 아니라 PI3kinase에 의해서도 영향받는 것으로 나타났다. 도 5d는 항세포사멸유전자와 세포사멸 유도유전자의 단백질 발현을 immunoblot분석법으로 조사한 것으로 항세포사멸유전자인 Bcl-2와 Bcl-xL의 단백질 발현이 혈청제거시 감소하나 PDGF에 의해 증가하며 세포사멸 유도유전자 Bax의 단백질 발현은 변화하지 않은 것을 볼 수 있다. 또한 세포사멸의 마지막 중요한 단계로서 미토콘드리아에서 Bad가 Bcl-xL과 결합하면 채널을 형성하여 cytochrome c를 방출하여 caspase들을 활성화시키고 돌이킬 수 없는 단계에 들어가게 되는데, 위의 도 5b에서 PDGF신호전달계에서 인산화된 Bad가 도 5d에서 발현이 증가된 Bcl-xL과 결합하지 못하고 미토콘드리아 막에 채널을 형성하지 못하므로 cytochrome c의 방출이 감소하였다(도 5e). 결국 PDGF는 이러한 신호전달경로를 통해 신경줄기세포를 세포사멸로부터 방어하는 것으로 보인다.

4. 쥐의 해마에 주입된 신경간세포의 생존과 분화에 미치는 영향

(1) 생존에 미치는 효과

신경줄기세포인 HiB5 새포를 학습과 기억을 담당하는 해마에 주입하기 전에 내생세포와 구별하기 위해 DiI와 재조합 LacZ 아데노바이러스를 사용하여 이중표지 하였다. 주입 2시간 전에 PDGF(20ng/ml)를 처리한 후 흰쥐 등쪽 해마에 주입하였다.(도 6a의 A 참조) 주입후 3일,5일,2주에서 DiI에 표지된 HiB5 세포가 alveus를 따라 이동하며 점차적으로 치상회(Dentate gyrus) 방향으로 내려오는 것을 관찰할 수 있으며(도6a의 B-E 참조. B-D배율 :X20, E배율 :X200) 음성대조군으로 사용하기 위해 PDGF를 처리한 HiB5 세포를 냉각시켜 동일 부위에 주입하여 5일, 2주에 조직을 적출하여 관찰하였으나 세포는 발견되지 않았다.(도 6a의 F,G 참조) PDGF를 처리한 HiB5 세포는 2주에 alveus를 따라 이동하며(도 6a의 I 참조, 배율:X20) alveus에서 추상세포층으로 이동하는 세포를 고배율에서 관찰할 수 있었다.(도 6a의 J 참조.배율:X200) 4주에는 CA3 끝부위에서 DG 부위로 이동하는 것을 관찰할수 있었으며 추상세포층에 주입한 세포들이 위치하고 있는 것을 관찰할 수 있었다.(도 6a의 L참조 . 배율:X200) 8주에는 주입한 HiB5 세포들이 해마에 전체적으로 분포하고 있는 것을 볼 수 있다.(도6a의 O참조. 배율:X20, 도6a의 P참조, 배율:X200) 그에 반해 PDGF를 처리하지 않은 세포를 주입했을 때 처리한 군에 비해 세포수가 현저히 떨어지는 것을 관찰할 수 있다.(도6a의 H,K,N참조. 배율:X20) 해마에 주입된 DiI 표지된 세포수와 LacZ 염색된 세포수를 세어 비교하였다. PDGF 처리군의 세포수가 4주에서는 처리하지 않은 군에 비애 2배, 12주에서는 3배 이상 많은 것을 관찰할수 있다.(그림 6 b 참조)

(2) 분화에 미치는 효과

HiB5 세포를 주입한 후 4주 후 DiI와 세포특이인자로 이중염색을 하였다. PDGF를 처리한 HiB5 세포의 70%가 NeuN 항체로 검출되었으며 이는 PDGF가 신경줄기세포의 신경분화에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이에 비해 처리하지 않은 HiB5 세포는 신경보다는 신경별교 세포로 분화하여 신경아교섬유산성단백질(Glial fiblilary acidic protein ; GFAP)를 발현하는 것을 볼수 있다. 이 결과로 PDGF가 신결줄기세포의 신경으로의 분화를 촉진한다는 것을 나타낸다.(도 7 참조)

HiB5 세포 주입 후 6주 후 CA1 부위에 위치한 HiB5 세포들은 CA1의 주로 분포하고 있는 신경세포 유형인 glutamate성 신경과 GABA성 신경으로 분화하였으며 PDGF를 처리한 HiB5 세포는 주로 Glutamate성 신경, 또는 Glutamate 수용체를 가진 신경으로 분화하였다. 이 결과로 PDGF가 신경줄기세포인 HiB5 세포를 Glutamate를 발현하거나 그에 반응하는 신경으로 분화시킨다는 것이 밝혀졌다.(도 8 참조) 이 결과로 급 만성 뇌신경질환 발병에 가장 주목받고 있는 신경회로인 글루타메이트성 신경회로에 효과를 보일 것으로 판단된다.

6. 치매동물모델 제조.

알츠하이머 환자에서 초기에 발견되는 공통되는 특징은 기억손상이며 학습과 기억을 담당하는 대뇌변연계(limbic system)에서도, 단기기억과 장기기억의 형성에 관여하는 해마는 전뇌(forebrain)와 함께 환자의 뇌에서 가장 퇴행이 심각하고 노인성 반점(senile plaques)이 많이 발견되는 부위이다. 특히 해마의 CA1 부위와 entorhinal cortex에서 신경세포의 퇴행이 두드러진다. 기저전뇌(basal forebrain)의 콜린성 뉴런(cholinergic neuron)들은 해마로 뻗어있고 표적유래 신경성인자(target-derived neurotrophic factor)인 NGF와 BDNF에 의해 생존이 유지되므로 알츠하이머병에서 심각한 퇴행을 일으킨다.

그 동안 많은 연구실에서 알츠하이머병의 원인적인 치료를 위해 발병인자를 연구하여 노인성 반점의 주성분인 베타-아밀로이드(b-amyloid)나 세포사멸하는 신경세포내에서 발견되는 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangle)에서 많이 발견되는 tau 단백질의 비정상적인 인산화와 apoE4 등이 관련된다는 실험적 증거들이 제시되어 왔으나 관련유전자가 매우 많고 환자에서 공통되는 발병원인이나 유전자변이 등은 발견되지 않고 있다. 따라서 그동안 사용되어온 치료제는 알츠하이머병 환자에서 현저하게 줄어들어 있는 콜린성 신경전달계 활성을 높여주기 위해 아세틸콜린 에스테라제(acetylcholine esterase) 억제제 또는 아세틸콜린 에스테라제 합성전구체를 투여하거나, 신경세포의 energy 대사를 개선시키는 약물등을 투여한다. 이러한 방법들은 일시적으로 증세를 경감시켜줄 뿐이므로 알츠하이머병의 진행을 늦추거나 원인적 치료를 위해 신경세포의 생존을 증가시키는 뉴로트로핀(neurotrophin) 또는 신경세포자극물질이 연구되고 있다. 신경성장인자는 많이 주목받고 있으나 그동안 임상적으로 시도되었던 NGF는 콜린성 뉴런에서 일부 효과가 나타나기도 하였으나(Knusel, B. and Gao, H. (1996) Neurotrophins and Alzheimer's disease: beyond the cholinergic neurons. Life Sci. 58, 2019-2027; Lapchak, P.A. (1993) Nerve growth factor phamacology: application to the treatment of cholinergic neurodegeneration in the Alzheimer's disease. Exp Neurol 124, 16-20) 큰 효과는 보지 못하였다(Neve et al., (1996) A comprehensive study of the spatiotemporal pattern of beta-amyloid precursor protein mRNA and protein in the rat brain : lack of modulation by exogenously applied nerve growth factor. Brain Res Mol Res. 39, 185-197). 따라서 신경세포의 사멸을 막아주고 생존과 재생을 증진하거나 신경줄기세포의 생존과 분화를 증진하는 물질을 선별하는 것이 필요하다.

본 발명에서는 학습과 기억을 담당하는 해마에 있어서 알츠하이머병에 의한 신경퇴행의 진전을 늦추고 신경재생을 촉진하기 위하여 PDGF의 직접주입 및 PDGF의 세포 치료 적용, 유전자 치료를 이용한 세포사멸 방어 및 신경 재생 효과를 적용하기 위한 기초 단계로 치매동물 모델을 제조하였다.

즉, 본 발명은 치매 모델로 kanate 유도체인 ibotenic acid를 흰쥐 성체 뇌의 entorhinal cortex에 stereotaxic frame을 사용하여 미세주입(microinjection)하는 동물 모델을 사용하였다.

그 결과 ibotenic acid를 주입한 해마와 entorhinal cortex에서 칼빈딘 양성 신경세포들이 2주 후 감소하는 것을 볼수 있었다. 해마의 CA1 부위보다 치상회 부위의 세포들은 좀더 천천히 감소하는 경향을 보였다. 이와 같이 제조된 치매 동물 모델을 통해 앞으로 PDGF의 효과가 더욱 명확히 밝혀질 것으로 판단된다.

7. 말초신경계의 좌골신경에서 재조합 아데노바이러스를 이용한 유전자 전달

인간의 경우 중추신경계는 물론 말초신경계도 재생이 어려워 퇴행성 뇌질환 뿐만 아니라 현대사회의 산업재해 및 교통사고, 전쟁불구자 등이 누적되면서 사회문제화 되고 있으므로 신경계의 재생에 관한 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.

말초신경계가 발생하고 재생하는 과정에서 슈반세포는 중요한 역할을 한다. 배아가 발생하는 동안에 신경릉(neural crest)에서 기원하는 슈반세포는 축색이 점유하게 될 곳을 따라 미리 분열하므로 말초 신경계의 축색이 슈반세포에 의존하여 성장하게된다. 특히 슈반세포는 영양인자(trophic factors)를 생산하여 신경의 생존과 신경돌기 성장을 조절한다. 또한 신경은 축색에서 뉴레글린(neuregulin)을 분비하여 슈반세포의 생존을 증진하고 축색과 슈반세포의 비율을 조절하며 이때 축색의 영향을 받지 못한 슈반세포는 사멸한다. 발생후기에 슈반세포는 미엘린 수초를 생산하여 축색을 감싸서 슈반세포의 분화가 완성된다.

신경발생이 끝난 성체에서, 말초신경이 다친 경우에는 그 상해 부위에서 신경말단 쪽의 축색부분(distal stump)은 월러퇴행(Wallerian degeneration)이라고 알려진 과정을 통해 점차 퇴화한다. 이때 상해 부위로부터 세포체 쪽의 축색(proximal stump)은 재성장을 시작한다. 상해 부위의 신경말단 쪽의 축색부분에서는 퇴화한 축색과 수초물질을 제거하고 상해 부위로부터 세포체 쪽의 축색부분은 축색이 새롭게 자랄 수 있도록 환경을 조성한다(Kwon, Y. Kim, Bhattacharyya, W.V., Cheon, K., Stiles, C.D., and Pomeroy, S.L. (1997) Activation of ErbB2 during Wallerian degeneration of sciatic nerve, J. Neurosci. 17, 8293-8299; Joung, I., Kim, H.S., Hong, J.S., Kwon, H., and Kwon, Y.K. (2000) Effective gene transfer into regenerating sciatic nerves by adenoviral vectors: potentials for gene therapy of peripheral nerve injury. Mol. Cells 10, 540-545).

신경이 다친 후 슈반세포는 즉시 급격한 분열을 하는데 이것은 축색과의 접촉 상실이나 축색이 분비하는 성장인자에 의해 촉진되는 것으로 생각되어왔다. 축색이 재성장하는 동안에 슈반세포가 축색에 접촉하면 다시 분화하여 수초를 재생한다. 세포 표면에서의 상호작용 이외에도 슈반세포는 멀리서도 재생하는 축색에 영향을 줄 수 있다. 신경이 절단된 후 1cm만큼 떨어져 있어도 축색은 distal stamp를 향해 재생한다. 이 때의 축색의 정향운동은 distal stump에 살아있는 슈반세포가 존재해야 일어난다.

말초신경계의 재생과정에서는 먼저 슈반세포가 절단된 축색으로부터 분리되어 다시 분열능력을 얻게되는 탈분화(dedifferentiation) 과정, 상처부위로 부터 신경세포의 축색이 다시 자라나오는 과정, 그리고 다시 자라나온 축색을 슈반세포가 미에린 수초로 감싸는 재분화(redifferentiation) 과정과 축색이 근육까지 자라서 다시 근육세포에 신경근 접합부(neuromuscular junction)를 만드는 과정으로 크게 나눌 수 있다.

본 발명에서는 말초신경계에서 가장 신경섬유가 많이 지나가는 좌골신경을 사용하여 말초 신경계에서 재조합 아데노 바이러스를 이용한 유전자 치료에 적용하기 위한 기초 실험으로서 LacZ 유전자를 가진 재조합 아데노 바이러스를 흰 쥐의 좌골신경에 주입하였다.

본 발명에서는 흰쥐의 좌골신경에 poximal과 distal stump 방향으로 PBS(phosphate-buffered saline)각각 5ul 씩 총 10ul를 주입하였으며 LacZ 재조합아데노바이러스(10¹⁰pfu/ml)를 동일 방향, 동량 주사한 뒤 봉합하여 2일부터 5주까지 LacZ 유전자의 발현 정도를 관찰하였다. 좌골신경에 주입된 재조합 LacZ 아데노바이러스에 의해 beta-galactosidase 가 2일째 발현되는 것을 볼수 있었으며(도10a의 B참조. 배율: X100, 도10a의 C참조. 배율 :X200) 5주까지도 발현이 지속되는 것이 관찰되었다.(도10a의 E참조. 배율 :X100, 도10a의 F참조. 배율:X200) 이에 반해 PBS를 주입한 음성대조군에서는 2일과(도 10a의 A참조. 배율:X100), 5주(도 10a의 D참조. 배율:X100)에 beta-galactosidase 가 발현되지 않았다. 또한 좌골신경을 손상시킨 후 슈반세포(Schwann cell)의 분열이 가장 활발히 일어나는 5일째다시 수술부위를 절개하여 재조합 LacZ 아데노바이러스를 주입하였다. 주입후 2일째(도10b의 B참조. 배율:X100, 도10b 의 C참조. 배율:X200)와 5일째(도10b의 E참조. 배율:X100, 도10b의 F참조. 배율:X200)에 beta-galactosidase 가 발현되는 것이 관찰되었으며 역시 5주까지 발현이 지속되었다.(도10b의 H참조. 배율:X100, 도 10b의 I참조. 배율:X200) 신경 손상후에 주입된 재조합 LacZ 아데노바이러스에 의해 발현된 beta-galactosidase 양성 세포수를 세어 바이러스 주입부위와 그 주변부위를 나누어 그래프로 나타낸 결과 주입부위에 더 많은 beta-galactosidase 양성 세포가 존재함을 알수 있었으며 5주까지도 그 발현이 지속되는 것을 알수 있었다.(도 10c) 따라서, 재조합 LacZ 아데노 바이러스는 일반적인 상태의 신경세포 뿐 아니라 분열하는 세포에도 유전자를 전달할 수 있음을 알 수 있다.

한편, 흰쥐를 이용한 생체실험에서 PDGF은 일반적인 급성독성 및 간기능에 부작용을 나타내지 않았으며 매우 안전하였다. 본 발명에 따른 PDGF의 신경계 투여용량은 통상적으로 1일 0.3 -3 mg/60kg(체중) 정도 투여하는 것이 바람직하며 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 건강상태에 따라 증감될 수 있다.

PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염은 통상적인 방법에 따라 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용 할 수도 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 PDGF, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염은 각종 신경계 질환의 예방 및 치료 목적으로 약학제제로 제조되거나 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 또한 본 발명은 치매, 만성 간질, 중풍, 허혈성 뇌질환, 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease)등의 퇴행성 뇌질환의 치료효과를 나타내는 의약품 또는 식품(각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류)으로 제공될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하겠으나, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명의 일반적인 실험방법

1) PDGF는 (platelet derived growth factor, Product #: PHG0045, Bio-source사, 미국)을 사용하였다.

2) 신경세포주 배양

흰쥐 배아의 해마에서 기원하는 HiB5 세포는 온도 민감성(temperature sensitive) SV40 T-항원(antigen)을 레트로바이러스로 감염시켜(retrovirus infection) 만들었으므로 34^oC에서 배양할 때는 세포분열하나 쥐의 정상체온인 39^oC로 옮기면 분열을 멈춘다. 여기에 PDGF(20ng/ml)를 넣어주면 생존이 증가하고 신경세포로 분화하여 신경세포 표지분자를 발현한다. 배지는 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, sodium pyruvate(0.11g/L)를 첨가하여 사용하고, 39^oC에서 분화시 에는 무혈청 배지(serum-free media)인 N2 (DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, Putreseine, BSA 포함 ;Botten Stein & Sato., 1979)에 피루베이트(pyruvate)를 첨가하여 사용한다.

3) 신경세포주의 MTT 분석

산화적 스트레스 및 덱사메타손, 글루타메이트에 의한 세포손상의 정도를 MTT 분석법으로 평가한다. MTT 분석을 위해 세포를 2×10⁴개로 심고 N2 배지에서 신경독(neurotoxin)이나 신경성장인자를 첨가하고 분화시킨 후 0.1 부피의 4mg/ml MTT를 넣고 37℃에서 3-4시간 보존한 뒤 300ul의 용해버퍼(solubilization buffer)를 넣고 다시 24시간 보존하여 ELISA 분석기로 O.D.값을 측정한다.

4) 면역침전법과 immunoblot분석법

Bad, cytochrome c의 발현을 검증하기 위하여 항체를 이용하여 세포추출물을 면역침전한 후 면역침전물을 SDS-PAGE로 전기영동하고 항 인산화단백질 항체를 이용히여 immunoblot (Western blot)분석법을 시행한다.

PI3kinase, AKT, ERK의 인산화 정도나 Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Caspase, PARP degradation 등은 특이적 항체를 이용한 immunoblot 분석법을 수행하여 ECL로 검출한다. 준비된 세포에 NP-40포함 lysis buffer (Tris buffered saline에 NP-40, pyrophosphate ortho-vanadate, fluoride, aprotinin, pepstatin, Leupeptin 첨가)를 넣어 세포를 추출한다. 30분간 얼음에서 반응한 후 10분간 원심분리기로 핵을 제거한다. 그 상층액을 단백질 정량한 후 각 항체로 면역침전하고SDS-polyacrylamide gel로 분획한 후 Immobilon-P에 단백질 이전하고 대응하는 항체나 항인산화항체로 immunoblot한다.

5) Annexin III 면역화학 염색법(Immunocyto-, histochemistry-double staining)

신경세포특이적 표적단백질(neurofilament, acetylated tubulin, synaptophysin등)과 신경교세포특이적 표적단백질(O4,GFPD)의 발현을 조사하기 위해, 배양된 세포나 조직을 4% paraformaldehyde로 20분간 고정한 후 0.5% NP-40로 5분간 permeablization하고, 1% BSA 용액을 사용하여 30분간 blocking한다. 서로 다른 oringin인 두 종류의 primary antibody로 37℃에서 1시간동안 incubation 한후 각 primary antibody를 검출하기위하여 FITC-conjugated 혹은 TRITC-conjugated secondary antibody를 dark chamber에서 incubation하여 형광현미경을 이용해 관찰한다.

Apoptosis-Annexin III staining

배양된 세포를 4% paraformaldehyde로 고정한 후, annexin buffer로 wash하고 annexinV-biotin(clonetech)을 첨가한다. humid atmosphere에서 15분간 보존한 후 wash하고 streptavidin-texas red를 첨가하고 20분간 보존한다. 3번 세척하고 다시 DAPI로 counter staining하여 형광현미경으로 관찰한다.

뇌조직은 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 40 um로 동결박절(cryosection) 한 후 0.5% Triton X-100으로 20분간 permeablize한 후 15% blocking serum을 사용하여 2시간 동안 차단(blocking)한다. anti-calbindin 항체를 사용하여 4℃에서 약 16시간 반응한 후, FITC로 표지된 이차항체 또는 rhodamin(TRITC)으로 표지된 이차항체로 1시간 다시 반응하고 슬라이드에 고정하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.

6) DNA fragmentation 분석

배양된 세포(1.5×10⁶cells/5 cm plate)를 serum을 첨가하지 않은 화학배지에서 growth factor를 처리하지 않고 배양하거나 PDGF를 처리하였다가 제거한 뒤, apoptosis가 일어나는 지를 확인하기 위해 DNA fragmentation 분석을 실시한다.일정시간이 지난 후, 140mM의 NaCl과 20mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)가 포함된 용액으로 배양된 세포를 두 번 씻고, 400㎕의 lysis buffer(200mM Tris-HCl, pH 8.3, 100mM EDTA, 50㎍/ml proteinase K, pH 7.5, and 1% SDS)를 첨가한 뒤 37℃에서 4시간동안 배양한다. 분리한 DNA를 동일 부피의 phenol/chloroform으로 두 번 추출하고, 다시 chloroform만으로 두번 추출한다. 추출된 상층액은 10mM Tris-HCl, pH 7.5와 1mM EDTA로 된 용액에 대하여 하루 동안 투석한다. DNA 용액에 RNase A(50㎍/ml)를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양한다. proteinase K(120㎍/ml)을 첨가한 후 다시 3시간을 배양한다. phenol/chloroform으로 두번, 그리고 chloroform으로 두번 DNA를 추출하여 ethanol로 침전시킨다. pellet을 50㎕ H₂O에 녹인 후 260nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 결정하고, 각 DNA 표본(3㎍)은 1.5% agarose gel에 전기영동하여 ethidium bromide staining으로 band를 확인한다.

7) 치매 모델 제조

치매 동물모델을 만들기 위해 stereotaxic frame을 사용하여 흰쥐의 뇌 위치를 고정한 뒤 entorhinal cortex에 ibotenic acid 1.5 ul(1mg/ml)와 PBS 또는 재조합 LacZ 아데노바이러스 1.5 ul (1mg/ml)를 미세주입기(microinjector)로 주입하였다. 수술 2주 후에 동물을 관류(perfusion)하였다.

8) 재조합 LacZ 아데노바이러스의 주입 및 흰쥐의 좌골신경 손상모델에의 적용

Sprague-Dawley 흰쥐(male 약 200g)를 pentobarbital(50mg/kg)로 마취시킨 후 왼쪽 좌골(sciatic notch)를 노출시키고, 좌골신경에서 동맥을 제외하고 신경섬유를 자르거나 #9 혈관봉합사로 양쪽을 묶고 가운데를 홍채 절제 가위(iridectomy scissors)로 자른다. 신경 손상 5일 후에 바이러스를 주입하거나 일반적인 상태의 손상을 주지 상태의 좌골신경에 proxiaml과 distal stump에 5.0ul씩 총 10ul를 주사한 후 여러 시간대(2,5, 7,10일 3,4,5주)에서 좌골신경조직을 각각 얻어 X-gal 염색에 적용한다.

9) RT-PCR 방법

대뇌 조직 100 mg당 TRI Reagent(상품명,Molecular Research Center Inc., USA) 1 ㎖를 넣고 균질화 시킨 후 상온에 10분간 방치하였다. 균질액 1 ㎖당 0.1 ㎖의 BCP (Sigma, USA)를 넣고 1분간 잘 혼합하고 4℃에 10분간 방치하였다가 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 차가운 isopropanol을 넣고 -20℃에서 16시간 이상 방치하였다. 그 후 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 얻은 RNA 침천물을 DEPC (diethylpyrocarbonate) 처리된 차가운 75% 에탄올로 세척하고 SpeedVac을 이용하여 건조시켰다. 건조시킨 RNA를 DEPC 처리된 증류수를 넣어 녹인 후 260 nm 파장에서 분광광도계로 농도 및 순도를 측정하고 -20℃에 보관하여 사용하였다.

Total RNA 2 ㎍에 대하여 4.0 ㎕의 5X RT buffer, 1.0 ㎕의 oligo(dT₁₆) (100 pmoles/㎕), 4 ㎕의 10 mM dNTPs (Promega, USA), 0.5 ㎕의 RNasin (40 Units/㎕, Promega, USA), 1.0 ㎕의 MMLV reverse transcriptase (200 units/㎕, Promega, USA)를 혼합하고 반응액의 전체부피가 30 ㎕되게 DEPC 처리된 증류수를 첨가하였다. 이 반응액을 DNA thermal cycler (Perkin Elmer 2400, USA)에서 42??에서 1시간동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

RT 산물 1 ㎕ 기준으로 sense 및 antisense primers (각 10 pmoles), 1 ㎕의 10 mM dNTPs, 2 ㎕의 10X buffer (20 mM Tris-Cl, 1.5 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 0.1 ㎎/㎖ gelatin, pH 8.4), 1 unit의TaqDNA polymerase (Promege, USA)를 첨가하여 반응액의 전체부피가 25 ㎕가 되게 증류수를 첨가하여 DNA thermal cycler (Perkin Elmer 2400, USA)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다.

증폭된 PCR 산물 10 ㎕를 2 % agarose gel에 전기영동하여 gel documentation system (Bio-Rad Lab, USA)을 이용하여 밀도를 측정, 비교하였다.

실시예 2. PDGF가 신경줄기세포의 생존과 분화에 미치는 영향

본 실험에 사용한 HiB5 세포주는 온도 민감성 SV40 T-항원을 흰쥐 배아(embryonic day 16)의 해마에서 일차배양한 세포에 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)로 감염하여 만든 것이므로 32℃에서는 계속 세포분열하지만 쥐의 체온인 39℃에서는 세포분열을 멈추고 원래의 세포운명으로 돌아가 분화를 시작한다(분화시작조건).흰쥐 배아의 해마는 배발생 16일에 소수의 GABAegic neuron은 분화하고 있는 상태이며 글루타메이트성 피라미드 세포 전구체(glutamatergic pyramidal cell precursor)는 아직 분열하고 있고 이들 일부가 배발생 18일에 치상이동경로(dentate migration pathway)를 통해 치상회 부위로 침투하여 글루타메이트성 과립세포(glutamatergic granule cell)로 분화한다. (Altman J., Bayer. S. A. (1990a) Prolonged sojourn of developing pyramidal cells in the intermediate zone of the hippocampus and their settling in the stratum pyramidale.J Comp Neurol. 301, 343-64.; Altman J., Das G. D. (1965) Post-natal origin of microneurones in the rat brain,Nature. 28, 953-956. )

이들이 세포분열을 멈추고 분화를 시작할 때 세포사멸이 많이 일어나는데 HiB5 세포주에서도 체내의 경우와 유사하게 세포사멸이 대량으로 일어나 분화조건에서 2일이 지나면 60 내지 70%가 세포사멸한다.

PDGF가 신경줄기세포의 세포사멸을 감소시키고 세포생존을 증가시키는 보호효과를 가지는지 조사하기 위해 HiB5세포를 분화시작조건에서 배양하면서 PDGF를 20ng/ml 농도로 처리하여 HiB5세포의 세포사멸 방어효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. (도 1a, 표 1,2,3 참조)

[표1]

[표2]

[표3]

HiB5세포에서 대조군에 비해 PDGF는 세포사멸 방어 효과를 보였다.

이러한 방어효과는 통계처리에서 모두 유의한 것으로 나왔다(P<0.05).

따라서 PDGF는 성체의 신경줄기세포가 분화하는 과정에서 일어나는 세포사멸을 감소시키고 생존을 증진하는 신경보호 효과가 있는 것으로 판단된다.

실시예 3. 분화된 신경세포주에서 스트레스에 의한 세포사멸 방어 효과

1) 산화적 스트레스 상태에서 HiB5 세포의 생존에 미치는 영향

　HiB5 세포에 H₂O₂를 30분간 처리하여 세포 손상를 주었으며 PDGF를 배양액에 넣어 보호 효과를 조사하였다(표4, 도3a,b참조).

[표4]

실험결과 PDGF는 산화적 스트레스에 대해 최고 2배의 세포 보호 효과를 보임이 관찰되었다.

따라서 신경세포주의 스트레스 모델인 산화적 스트레스 상태에서 PDGF는 신경줄기세포의 세포사멸을 방어하고 생존을 증진하는 효과를 보인다.

2) 글루코코르티코이드 스트레스 상태에서 HiB5 세포의 생존에 미치는 PDGF의 효과

　글루코코르티코이드는 부신에서 분비되는 지방성호르몬으로 당대사외에 많은 물질대사에 관여하며 특히 스트레스를 받으면 많이 분비되어 뇌에서는 신경줄기세포의 세포분열이 감소되고 신경세포의 세포사멸을 일으킨다. 따라서 HiB5 세포에 글루코코르티코이드의 유도체인 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하여 스트레스 상태를 유도하고 PDGF의 효과를 조사하였다. 덱사메타손(1 uM)을 배양액에 첨가하여 스트레스를 유도한 후 바로 PDGF를 처리하여 2일 간 신경재생하였다(표5, 도4a, b참조).

[표5]

PDGF 처리시 분열시보다 분화시 최고 1.5배의 세포생존률을 보였다.

따라서 덱사메타손 스트레스 상태에서 PDGF는 HiB5 세포의 생존을 증진, 보호하는 효과가 있음을 확인 할 수 있다.

3) 혈청제거 스트레스 상태에서 흰쥐 신경간세포의 생존에 미치는 영향 　

스트레스에 대한 PDGF의 신경보호 작용의 기전을 이해하고 그 신호전달 경로가 PDGF가 신경세포의 세포 생존과 분화를 증진하는 경로와 관계있는지 조사하기 위해서 혈청제거 스트레스를 주고 각 시간대별로(3min, 15min, 30min, 120min) PDGF를 처리하여 cell extract를 얻어 Erk의 활성을 조사하였다. 그 결과 PDGF를 처리한 경우 혈청제거 스트레스 상태에 있을 때보다 Erk의 인산화가 증가하는 것을 볼 수 있다. PI3kinaes와 MEK의 저해제인 wortmannin과 PD98059를 각각 전처리 한 후PDGF를 15min간 처리한 경우에는 PDGF만 처리하고 15min이 지났을 때에 비해서 Erk의 인산화가 줄어드는 것을 볼 수있다. 이는 PDGF가 PI3kinase경로와 MEK을 통해서 생존을 증가시킨다고 생각된다. 또한 스트레스 하에서 PDGF가 mitochondria에서의 cytochromeC의 방출을 조절하여 세포생존을 증진하는지 조사하기 위하여 HiB5 세포에 PDGF를 처리하고 DNA fragmentation이 일어나는 18시간 보다 빠른 16시간에 cell extract를 얻어 핵과 mitochondria를 centrifugation으로 제거하고 세포질에 방출된 cyt.C를 항체를 사용하여 immunobloting 하였다. 이때 cyt.c방출은 PDGF에 의해 감소하였다. (도 5 참조)

실시예 4. 신경세포의 분화에 미치는 PDGF의 재생효과

먼저 신경줄기세포에서 PDGF가 세포분화를 유도하는지 조사하기 위해 HiB5세포를 분화시작조건에서 1일간 배양한 후 PDGF를 처리하고 다시 2일간 배양한 뒤 신경특이적 표지자로 면역염색(immunostaining)하고 공초점 현미경를 사용하여 관찰하였다. 신경세포의 분화정도는 신경특이적 표지자인 항-신경세사(anti-neurofilament) 항체와 항-acetylated tubulin 항체, FITC(녹색)로 표지된 이차항체를 사용하여 신경돌기를 염색하였다.

PDGF를 처리하면 신경세포로의 분화가 유도되어 세포체가 작아지고 축색돌기와 수상돌기의 전구체인 신경돌기가 나와 길이가 길어진다. PDGF를 처리한 경우 신경세포로의 분화가 유도된 세포수가 증가하였다.(도2a 참조)

또한 PDGF를 처리한 후 신경성장 조절인자 들의 발현양상을 시간대별로 관찰 해본결과 후기 발생인자인 neurotrophin(BDNF, NT-3)과 그들의 수용체인 TrkB와 TrkC의 유전자 발현을 유도하여 신경세포의 분화를 유도하였다. (도 2b, 2c 참조)

따라서 PDGF는 신경으로의 분화효과가 있다고 생각된다.

실시예 5. 치매동물모델의 제조.

본 발명에서는 치매 모델로 이보테닉산(ibotenic acid)을 흰쥐 성체 뇌의 entorhinal cortex에 stereotaxic frame을 사용하여 미세주입하는 동물 모델을 사용하였다. 치매에서 심각한 퇴행을 보이는 entorhinal cortex에 이보테닉산을 주입하면 이 부위로 뻗어 있는 CA부위의 피라미드 세포와 치상회의 과립세포들이 함께 세포사멸하므로 화학적 병변(chemical lesion) 모델로 사용된다.

먼저 흰쥐 성체를 깊이 마취하고 머리를 stereotaxic frame을 사용하여 뇌의 위치를 고정한 뒤 entorhinal cortex부위에 이보테닉산을 1.5 ul (1mg/ml) 주입하여 치매모델을 만들고, 양성대조군으로 PBS(1.5ul)를 주입하였으며 재조합LacZ 아데노바이러스(1.5ul, 10¹⁰pfu/ml)를 같은 부위에 주입하였다. 수술 2주 후에 뇌 절편을 얻어 신경특이적 표지자인 칼빈딘 항체로 형광염색한 뒤 신경세포의 생존율을 조사하였다.(표6, 도9 참조)

[표6]

도 9에서 보는 바와 같이 이보테닉산만을 주입한 경우에는 해마와 entorhinal cortex에서 칼빈딘 양성 신경세포(calbindin-positive neuron)들이 PBS를 주입한 양성 대조군에 비해 감소하였으며 4 주 후 일부 회복되는 경향을 보였다. 해마의 CA1 부위보다 치상회 부위의 세포들은 좀더 천천히 감소하는 경향을 보였다. 그러나 PBS와 재조합 LacZ 아데노바이러스를 주입한 경우에는 칼빈딘 양성 신경세포의 생존율이 비슷하였다. (도9 참조). 이와 같이 제조된 치매모델쥐를 이용하여 세포치료와 유전자 치료에 적용할수 있을 것으로 판단된다.

실시예 6. 말초신경계의 좌골신경에서 재조합 LacZ 아데노바이러스를 이용한 LacZ 유전자 전달

흰쥐를 깊이 마취하고 각각 손상을 주지 않거나, 손상을 가해 세포분열을 유도한 후 5일째가 되는 좌골신경에 PBS 또는 재조합 LacZ 아데노바이러스를 proximal, distal stump 양 방향으로 5ul씩 총 10ul를 주사한 뒤 봉합하여 2일부터 5주까지의 조직을 적출하여 LacZ 유전자 발현 정도를 관찰하였다. 동물을 관류(perfusion)하고 좌골신경을 얻어 7-10um로 동결박절하고 X-gal 염색한 뒤 관찰하여 바이러스에 감염되어 LacZ을 발현하는 세포 수를 정량화 하였다(도10 참조).

따라서, 재조합 LacZ 아데노바이러스는 일반적인 말초신경 뿐만 아니라 말초신경 재생과정에서 세포분열과 상관없이 숙주 세포에 감염되어 유전자를 5주까지 발현 시킬수 있음을 알 수 있다.

상기 한 바와 같이, 본 발명에 따른 PDGF는 신경세포의 생존 및 분화를 촉진시킴으로써 신경세포 손상에 대한 보호작용과 성장촉진작용 및 신경세포의 재생작용이 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 종류의 퇴행성 신경질환 또는 신경손상 질환의 치료에 효과가 있으며, 특히 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 간질, 중풍, 말초신경 손상 등의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

Claims (10)

1. 혈소판유래성장인자(Platelet derived growth factor ; PDGF), 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 신경세포의 보호, 성장촉진, 재생 또는 신경손상, 신경질환의 치료용 조성물
2. 신경세포의 보호, 성장촉진, 재생 또는 신경손상, 신경질환의 예방 및 치료를 위하여 혈소판유래성장인자, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 신경세포에 전처리하는 것을 특징으로 하는 조성물
3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈소판유래성장인자가 A쇄 또는 B쇄 또는 이들의 결합임을 특징으로 하는 조성물
4. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈소판유래성장인자가 일부서열의 치환, 손실, 부가 형태인 것을 특징으로 하는 조성물
5. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경세포가 신경줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물
6. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경손상, 신경질환이 뇌손상 또는 뇌질환인 것을 특징으로 하는 조성물
7. 제 6항에 있어서, 상기 뇌손상 또는 뇌질환이 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 간질, 중풍, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 퇴행성 뇌질환 또는 기억력 감퇴인 것을 특징으로 하는 조성물
8. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경손상, 신경질환이 말초신경손상, 근위축성 축색 경화증, 또는 말초신경질환인 것을 특징으로 하는 조성물
9. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 유전자 치료 방법으로 투약되는 것을 특징으로하는 조성물
10. 제 1항 내지 제9항에 있어서, 상기 조성물이 식품 또는 의약품인 것으로 특징으로 하는 조성물