JPH0525056A

JPH0525056A - 中枢神経系における神経成長因子合成の調節

Info

Publication number: JPH0525056A
Application number: JP2198053A
Authority: JP
Inventors: Dan Bjarne Lindholm; ダン・ブネヤルネ・リンドホルム; Hans Friedrich Erwin Thoenen; ハンス・フリードリツヒ・エルヴイン・テーネン; Bastian Hengerer; バステイアン・ヘンゲラー
Original assignee: MAX PLANCK INST fur SAIKAIATORII; MAX PURANKU INST FOR SAIKAIATO; MAX PURANKU INST FOR SAIKAIATORII
Current assignee: MAX PLANCK INST fur SAIKAIATORII; MAX PURANKU INST FOR SAIKAIATO; MAX PURANKU INST FOR SAIKAIATORII
Priority date: 1989-07-27
Filing date: 1990-07-27
Publication date: 1993-02-02
Also published as: WO1991002067A1; EP0484416A1

Abstract

(57)【要約】電子出願以前の本願であるので要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は中枢神経系における神経成長因子のレベルを調節する方法に関し、そしてこの発明は神経成長因子のインビボ合成が種々のサイトカインによって調節されうるという知見に基づいている。

詳細な態様においては、インターロイキン１、腫瘍細胞増殖因子−βおよび／または線維芽細胞増殖因子の脳室内注射によって神経成長因子およびそのｍＲＮＡの合成が高まる。本発明の方法はアルツハイマー病のような種々の神経学的疾病または障害の治療に有用である。

〔従来の技術〕

(1)神経成長因子神経成長因子（ＮＧＦ）は1950年代初期に発見された。ニワトリ胚の後根神経節からニワトリ体壁に植え込まれたマウス肉腫中へと神経突起が成長するという初期の観察（Bueker, 1948, Anat. Rec. 102:369-389）を拡大して、Levi-Montalcini およびHamburger(1951, J. Exptl. Zool. 116: 321-362; 1953, J. Exptl. Zool. 123:233-278）は、交感神経節もまた腫瘍内への神経の成長に関係することを示し、その作用は肉腫によつて生産される特異的成長因子によることを示した。

ＮＧＦの生化学、合成、および作用メカニズムはGreeneおよびShooter(1980, Ann. Rev. Neurosci. 3:353-402）およびThoenenおよびBarde(1980, Physiological Reviews 60:1284-1335）により総説としてまとめられている。ＮＧＦ分子は二つの非共有結合した同一のペプチド鎖からなる(Greene ら、1971,Neurobiology 1:37-48;Angelettiら、 1971, Biochemistry 10:463-469;Pignattiら、 1975, J.Neurochem. 25:155-159）。各鎖は、すでに配列決定された118個のアミノ酸残基を含有する（AngelettiおよびBradshaw, 1971,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 68:2417-2420; Angelettiら、 1973, Biochemistry 12:100-115）。その鎖はNH₂ −末端セリン残基、COOH−末端アルギニン残基、３個の内部ジスルフィド橋、およびチロシンおよびトリプトファンをそれぞれ２および３残基有する。ＮＧＦ鎖のアミノ酸配列はインシュリンの推定ＢおよびＡ鎖に対応する鎖の部分におけるプロインシュリンの配列と相同である（Frazierら、 Science 176:482-488）。さらに、インシュリンの鎖間ジスルフィド橋の一つがＮＧＦ構造に保存されている。この関係はホルモンのリラキシン（ScwabeおよびMcDonald, 1977, Sciense 197:914 -915）およびインシュリン様増殖因子ＩおよびII （RinderknechtおよびHumbel,1978, J.Biol.Chem. 253:2769-2776）にも及ぶ。

ＮＧＦをコードする遺伝子がクローニングされ、その構造的な構成が解明されている（Franckeら、 1983, Science 222:1248-1250; Scottら、1983, Nature 302:538-540; Ullrichら、1983, Nature 303:821-825）。

(1.1) 抹消神経系における神経成長因子ＮＧＦは正常な発育、および交感神経系およびある種の感覚性ニューロンの維持に必要である（Levi-Montalcini, 1964, Science 143:105-110）。

これらのニューロンのＮＧＦ源はそれらの末端標的組織である（KorschingおよびThoenen, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:3513-3516）。

ＮＧＦ−ｍＲＡＮは成体雄マウス顎下腺のような種々の交感神経支配末端器官で検出されている（SheldonおよびReichardt, 1984,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:7951-7955, Heumannら、 1984,EMBO J.3:3183-3189）。

ＮＧＦはフェクターと神経支配ニューロンの間の逆行性メッセンジャーとして作用する。ＮＧＦに対するニューロン応答には神経突起成長の増加および細胞体部の大きさの拡大が包含される Levi-Montalcini, 1966,上記）。交感神経節においては、ＮＧＦは酵素チロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ合成を増大させる（Thoenenら、1971,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68:1598-1602;ThonenおよびBarde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284-1335）。カテコールアミン作動性末梢感覚性ニューロンに対する向神経性因子である他に、ＮＧＦは末梢感覚系のペプチド作動性ニューロンにも作用する（Otten,19 84, Trends Pharmacol, 7:307-310; Yipおよび Johnson, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6245 -1249）。

インビトロ実験とインビボ実験の両方において、ＮＧＦが交感神経ニューロンおよび一部の胚感覚性ニューロンの生存に必須の役割を果たしていることが確立されている（Levi-Montalciniおよび Booker. 1960, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 46: 384-391）。ＮＧＦの薬理学的投与により、坐骨神経障害後の新生児ラットの後根神経節ニューロンにおけるニューロンの死が阻止される（Yipら、19 84, J.Neu-rosci. 4:2986-2992）。

(1.2)中枢神経系における神経成長因子末梢神経系と対照的に、中枢神経系（ＣＮＳ）のカテコールアミン作動性ニューロンはＮＧＦの特異的な逆行性軸索輸送を示さず（Schwabら、 1979, Brain Res. 168:473-483; Seileiおよび Scbwab, 1984,Brain Res. 300:33-39）、チロシンヒドロキシラーゼを誘導するＮＧＦに対しても応答しない（Schwabら、1979，上記）。ＣＮＳにおけるＮＧＦ−応答性ニューロンに関する早期の証拠はSchwabら（1979および1984，上記）によって提示されたが、かれらは放射性標識ＮＧＦを成体ラットの海馬および皮質に注射しその分布をオートラジオグラフィーにより追跡した。ＮＧＦは明らかに前脳基底部にあるマグノ細胞性（magno- cellular）コリン作動性ニューロンの細胞体部に特異的に輸送された。ヨウ素化されたＮＧＦおよび抗−ＮＧＦレセプター抗体が終始一貫してマグノ細胞性コリン作動性ニューロンと結合することが見いだされている（Richardsonら、1986, J. Neurosci, 6 2312-3221; Taniuchiら、1986,Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A 83:1950-1954）。さらに、新生ラットにＮＧＦの脳室内注射を反復することにより、海馬、皮質および中隔領域にコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が増加した（Gnahnら、1983, Dev. Brain Res. 9:45-52）。

マグノ細胞性コリン作動系と無関係の脳領域はかなり低レベルのＮＧＦしか含有しないことが見いだされた（Korschingら、1985, EMBO J. 4:1389-139 3)。前脳基底部のマグノ細胞性コリン作動性ニューロンは、局所解剖学的には新皮質、海馬、および嗅神経球に突出する（Wainerら、1984, Neur ochem.Int. 6:163-182）。空間記憶作業におけるラットの学習能力は、コリン作動性中隔海馬経路の損傷により著しく低下し、胎児中隔ニューロンの海馬への移植によりこれをもとに戻すことができる（Dunnetら、1982, Brain Res. 251:335-348）。

アルツハイマー病に於ては、前脳基底部神経核のコリン作動性ニューロンは、この疾病の初期段階で一様に冒され、認識力の欠損が主にこれらのコリン作動性ニューロンの機能障害によって決定されることは明らかである。（HeftiおよびWeiner. 1986, Ann. Neurol. 20:275-281）。これらの臨床的な観察はBjorklundおよび共同研究者らの、加齢ラットでは認識機能障害と前脳基底部神経核のコリン作動性ニューロンの退行性変化の程度との間に相関関係があるとの観察（Fischerら、1987, Nature 329:65-68）と一致する。

HeftiおよびWeiner (1986, Ann. Neurol. 20: 275-281）は、前脳基底部コリン作動性神経核の采 −脳弓損傷後の退行性変化をＮＧＦが阻止できることを観察した。さらにKromerら（1987, Science 233:214-216）は成体ラットの側脳室へのＮＧＦの連続的な注入により、内側中核から背海馬へ突出するコリン作動性ニューロンの両側損傷に続くニューロンの死が阻止されることを示した。

末梢に於けると同様に、ＮＧＦ応答性ニューロンによる神経支配の密度は、ＮＧＦおよびそのｍＲＡＮレベルと相関している（Korschingら、19 85, EMBO J. 4:1389-1399;Whittemoreら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 83:817-821; Large ら、1986, Science 234:352-355）。上皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞およびシュワン細胞のような非常に多様な細胞がＮＧＦ応答性ニューロンの突出野に於けるＮＧＦ合成に寄与する末梢とは対照的に、中枢神経系に於いてはＮＧＦ合成は星状細胞についてのみ疑問の余地なく明らかに示されている（Lindsay, 1979, Nature 282:80-82; Furu kawaら、1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 136: 57-63,1987,Biochem.Biophys. Res. Comm un. 142:395-402）。最近、in situハイブリッド形成実験によりラット海馬および新皮質の細胞に於けるＮＧＦ−ｍＲＮＡの所在がつきとめられ（RennertおよびHeinrich, 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 138:813; Ayer-LeLievreら、 1988, Science 240:1339-1341; Whittemoreら、 1988, J. Neurosci. Res. 20:403-410）、中枢神経系（ＣＮＳ）に於いてニューロンがＮＧＦ合成に寄与する可能性が開かれた。しかしながらグリア細胞およびニューロンの相対的な寄与はまだ確立されていない。

〔発明の要約〕

本発明はサイトカインの投与を含んでなる中枢神経系における神経成長因子レベルを調節する方法、および種々の神経学的疾患および障害の治療的処置におけるかかる方法の使用に関する。

本発明は、インビボ投与された種々のサイトカインがＮＧＦの発現レベルを変化させうるという発見に関する。

特定の実施態様に於いては、ＩＬ−１、ＴＧＦ −β、ＴＧＦ−α、またはＦＧＦのＣＮＳへの導入によりＮＧＦ−ｍＲＮＡ合成およびＮＧＦ生産を増大させることができ、アルツハイマー病のような痴呆を包含するがそれに限定されない神経学的疾患の治療に用いることができる。

また本発明は、サイトカインレベルを変化させ、そのことが次に神経成長因子レベルを変化させるものである物質が投与されることからなる被検者の中枢神経系における神経成長因子レベルを調節する方法に関する。たとえば、インターロイキン −１を阻害することによつて中枢神経系に於けるＮＧＦレベルを低下させるためにグリココルチコイドを用いることができる。

本発明は効果的な治療法に於いてＮＧＦ合成を調節するのに使用できるサイトカインの選択方法を提供する。

本発明で用いられる略語の説明ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＤＭＥＭ：ダルベッコ改良イーグル培地ＥＧＦ：表皮成長因子ＦＣＳ：ウシ胎児血清ＧＦＡＰ：グリア繊維酸性タンパク質ＩＬ−１：インターロイキン１ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ＮＧＦ：神経成長因子ＰＤＧＦ：血小板由来増殖因子ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水ＴＧＦ−α：腫瘍増殖因子−α ＴＧＦ−β：腫瘍増殖因子−β 〔図面の説明〕第１図はビメンチン(a)およびＧＦＡＰ(c)に対するマウスモノクローナル抗体を用いた精製星状細胞培養物の免疫細胞化学的特性決定を示す。(b)および(d)は無染色。

第２図は(a)マウスモノクローナル抗体０４および抗−Thy 1.1を用いた、および(b)Koskiら（1976, in "In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity" Academic Press, New York. P359）による非特異的エステラーゼ反応についてテストした、精製星状細胞培養物における非星状細胞の免疫細胞化学的特定決定を示す。(b)および(d)は無染色。

第３図はin situハイブリッド形成を示すものである、混合ラット脳一時培養物(a)、染色細胞(b) ＮＧＦ−ｍＲＮＡのin situハイブリッド形成オートラジオグラフを示す。

第４図は精製星状細胞培養物におけるウシ胎児血清のＮＧＦおよびＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用を示す。それぞれＥＬＩＳＡおよび定量的ノーザンブロットアッセイで測定した。

第５図は精製星状細胞培養物に於けるＥＧＦ，ＴＧＦ−α，ＦＧＦ，ＩＬ−１β，ノルエピネフリン（ＮＥ）および８−ブロモ−ＣＡＭＰのＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用を示す定量的ノーザンブロット分析結果を示す。

第６図はＩＬ−１βと24時間にわたってインキュベートした星状細胞培養物中におけるＮＧＦ− ｍＲＮＡレベルを定量的ノーザンブロット分析により測定した結果を示す。

第７図はノーザンブロット分析により測定した、星状細胞培養物におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす５ng/ml濃度のＴＧＦ−β１の作用を48 時間にわたり示す。

第８図はノーザンブロットにより測定した、星状細胞培養物におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす種々の濃度のＴＧＦ−β１の作用を示す。

第９図はＩＬ−１βおよび種々の増殖因子と24 時間インキュベートした星状細胞培養物中におけるＮＧＦレベルをＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。

第10図は定量的ノーザンブロット分析により測定した、ＴＧＦα、ＦＧＦ、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−１βの脳室内注射８時間後のラット海馬に於けるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを示す。

第11図は損傷後の坐骨神経および培養物中の神経セグメントにおけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの変化およびデキサメタゾンの作用を示す。

ラット坐骨神経を一側性に横に切開し、神経セグメトを６時間後に集めた（材料および方法の項参照）。デキサメタゾンを神経損傷の２時間前に数匹のラットに腹腔内注射した（斜線の棒グラフ）。

また坐骨神経セグメントを６時間デキサメタゾン（１μＭ）の非存在下（白ヌキ棒グラフ）または存在下（斜線の棒グラフ）で培養した。インキュベーションに続き、試料中のＮＧＦ−ｍＲＮＡ量をノーザンブロット分析およびオートラジオグラム走査によって測定した。値は３回以上の実験の平衡ＳＤである。棒は下記動物群を示す。

Ｃ：対照、無処置ラット；Ｄ：デキサメタゾン−処置ラット；Ｌ：神経損傷；Ｌ＋Ｄ：デキサメタゾン処置後、神経損傷；Ｓ：血清存在下でインキュベートした神経セグメント；Ｓ＋Ｄ：血清およびデキサメタゾンと培養した神経セグメント；Ｍ：培地（ＤＭＥＭ）のみで、無血清で培養した神経；Ｍ＋Ｄ：デキサメタゾン存在下にＤＭＥＭ中で培養した神経セグメント。

第12図は培養した線維芽細胞におけるＮＧＦ− ｍＲＡＮレベルに及ぼすデキサメタゾンの作用を示す。

デキサメタゾン（１μＭ）の非存在下または存在下でラット坐骨神経線維芽細胞をＩＬ−１（30 単位／ml）またはウシ胎児血清（10％、最終濃度）で処理した。３時間（ＩＬ−１）または４時間（血清）のインキュベーションに続き全細胞ＲＮＡを調製しノーザンブロット分析に供した。オートラジオグラムではＮＧＲ−ｍＲＮＡ（1.3kb）の存在および回収率を評価するために標準として用いられるそれより短いＮＧＦ転写物（0.51kb）の存在が示される（材料および方法の項参照）。

レーン１：対照、無処理細胞；レーン２：デキサメタゾン処理細胞；レーン３：ＩＬ−１処理細胞；レーン４：ＩＬ−１およびデキサメタゾンを一緒に添加；レーン５−６：血清処理細胞；レーン７：血清およびデキサメタゾン共存。

第13図は線維芽細胞におけるデキサメタゾンのＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用の時間的経過を示す。

ラット坐骨神経線維芽細胞を低血清に保ち、10 ％ウシ胎児血清を加えてＮＧＦ−ｍＲＮＡを誘導する。デキサメタゾン（１μＭ）も血清と同時にかまたは血清添加後時間を改めて添加した。総インキュベーション時間４時間の後、細胞のＲＮＡを抽出してノーザンブロットにより分析した。オートラジオグラムではＮＧＦ−ｍＲＮＡの存在および標準として用いられるそれより低いＮＧＦ転写物の存在が示される（材料および方法の項参照）。

レーン１：対照；レーン２：血清のみ４時間；レーン３：血清とデキサメタゾンを同時に添加；レーン４：血清添加１時間後デキサメタゾン添加；レーン５：血清添加２時間後デキサメタゾン添加；レーン６：血清添加３時間後デキサメタゾン添加；レーン７：低濃度のデキサメタゾン（0.01μＭ）を血清と同時に添加。

第14図はトランスフェクションされた坐骨神経線維芽細胞におけるデキサメタゾンのＮＧＦプロモーター活性に及ぼす作用を示す。

ラット坐骨神経線維芽細胞をプラスミドpBLPNC AT3を用いて一晩トランスフェクションさせた（材料および方法の項参照）。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、デキサメタゾン（１μＭ）の存在下または非存在下で24時間10％ウシ胎児血清とインキュベートした。

第14ａ図は血清およびデキサメタゾンを用いた代表的実験のオートラジオグラムを示す。

第14ｂ図は三つの独立した実験の結果をまとめて示す。

Ｍは培地（ＤＭＥＭ）のみで培養された線維芽細胞を表す。

Ｓは血清とインキュベートした線維芽細胞である。

Ｓ＋Ｄは血清およびデキサメタゾンと培養した線維芽細胞である。

Ｍ＋Ｄはデキサメタゾン存在下ＤＭＥＭ中でインキュベートした線維芽細胞である。

第15図は星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＴＧＦ−β１の作用を示す。

ラットの星状細胞をＴＧＦ−β１（2ng／ml）のみ、またはＴＧＦ−β１および他の薬剤で４時間処置した。細胞中のＲＡＮを抽出し、ノーザンブロットによって分析した。オートラジオグラムではＮＧＦ−ｍＲＮＡ（1.3kb）の存在、およびＲＮＡ抽出前に検体に加えられた短縮ＮＧＦ転写物（0.51kb）の存在が示される。

レーン１：対照レーン２：ＴＧＦ−β１レーン３：抗−ＴＧＦ−β−抗体の存在下におけるＴＧＦ−β１レーン４：シクロヘキシミド（10φg/ml）レーン５：ＴＧＦ−β１とシクロヘキシミド（10 φg/ml）レーン６：アクチノマイシンＤ（10φg/ml）とＴＧＦ−β１第16図は星状細胞中におけるＴＧＦ−β１によるＮＧＦ−ｍＲＡＮ誘導の時間的経過および薬量応答関係を示す。

第16ａ図：ＮＧＦ誘導の時間的経過星状細胞を種々の時間ＴＧＦ−β１（5ng／ml）で処理した。値は３回の実験の平均±ＳＤを示し、 pgＮＧＦ−ｍＲＮＡ／10⁶細胞、で表わされる。

白ヌキ丸はＴＧＦ−β１なしで48時間インキュベートした対照細胞を示す。

第16ｂ図：薬量応答曲線インキュベーションは種々の濃度のＴＧＦ−β １の存在下で24時間行なわれた。示されている値は２回の測定値の平均を示す。

第17図はトランスフェクションされたラット星状細胞中のＮＧＦプロモーター活動に及ぼすＴＧＦ−β１の作用を示す。

ラット星状細胞をマウスＮＧＦのプロモーター領域を含有するプラスミドpBLCAT3-ＮＧＦでトランスフェクションした。洗浄後、細胞をＴＧＦ− β１の存在下又は非存在下に24時間インキュベートし、次にＣＡＴ活性を測定した。

Ｃ：対照Ｂ１：ＴＧＦ−β１とインキュベートした星状細胞第18図は星状細胞の核標識に及ぼすＴＧＦ−β １の作用を示す。

対照およびＴＧＦ−β１処理細胞から単離された核をＲＮＡを標識する為に放射性ＵＴＰとインキュベートし、次にナイロンフィルター上にスポットされたｃＲＡＮプローブにハイブリッド形成させた。ｔＲＡＮを内部対照として用いた。

Ｂ１：ＴＧＦ−β１転写物ＮＧＦ(+)：アンチセンスＮＧＦＮＧＦ(-)：センスＮＧＦ転写物第19図はラット星状細胞中のＴＧＦ−β−ｍＲＮＡの存在および刺激を示す。

星状細胞をＴＧＦ−β１で４時間処理し、細胞ＲＮＡをＴＧＦ−β１特異的ｃＲＮＡプローブを用いてノーザンブロットにより分析した。星状細胞はＴＧＦ−β１の２つの転写物（2.5kbおよび 1.9kb）を含有する。Ｍ０はＴＧＦ−β１−ｍＲＮＡを発現することが知られているラットのマクロファージから単離された５φｇＲＮＡを示す。

第19ａ図：ＴＧＦ−β１遺伝子転写に及ぼすＴＧＦ−β１の作用星状細胞をマウスＴＧＦ−β１プロモーター領域を含有するＣＡＴ発現ベクターでトランスフェクションした。細胞をインキュベートし、そして第17図に記載のように分析した。

Ｃ：対照Ｂ１：ＴＧＦ−β１第20図は星状細胞のＴＧＦ−β３に及ぼすＴＧＦ−β１の作用を示す。

星状細胞をＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とインキュベートし、細胞中のＲＮＡをＴＧＦ−β ３に特異的なｃＲＮＡプローブとハイブリッド形成させノーザンブロットによって分析した。3.5 kbの転写物１個だけがラット星状細胞に存在する。

第21図はラットの海馬におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＴＧＦ−β１注射の作用を示す。

ＴＧＦ−β１（５ng）を８日令ラットの側脳室に注射した。24時間後ラットを頸部脱臼により殺し、そして海馬からのＲＡＮを調製してノーザンブロットによって分析した。オートラジオグラムでは海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルがＴＧＦ−β １によって増大することが示される。

〔発明の説明〕

本発明は中枢神経系における神経成長因子のレベルを調節する方法に関するものであり、神経成長因子のインビボ合成が種々のサイトカインによって調製されうるという知見に基づくものである。

本発明によれば、ＮＧＦ合成の調節を種々の中枢神経系の疾患および障害の治療に用いることができる。

限定するためでなく、明確にするために、詳細な説明を以下の項目に分けて行う： (a) ＮＧＦ合成の調節に有用なサイトカインの確認 (b) 医薬組成物および投与 (c) 治療上の使用 (1)ＮＧＦ合成の調節に有用なサイトカインの確認本発明は、ＮＧＦ合成を増大させるサイトカインのみならずＮＧＦ合成を低下させるサイトカインも含めた、ＮＧＦ合成を調節するサイトカインの使用に関する。本発明の詳細な実施態様に於いては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、酸性または塩基性）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮成長因子、インターロイキン６、インシュリン様増殖因子１または２、インターフェロンガンマまたは腫瘍増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を用いてＮＧＦ合成を調節することができる。本発明の好ましい実施態様に於いては、ＩＬ−１またはＴＧＦ−βを用いてＮＧＦ合成を増大させることができる。

本発明によれば、ＮＧＦ合成を調節する能力に関して調べることができるサイトカインには，中枢神経系で確認されたサイトカイン並びにまだ中枢神経系と関連付けられていないサイトカインが包含されるがそれらに限定されるわけではない。

使用に関して調べることができるサイトカインには下記第Ｉ表に挙げるものが包含されるがそれらに限定されるわけではない。

さらに、サイトカインレベルを変化させる物質を、ＮＧＦレベルを間接的に変えるために本発明により用いることができる。限定するためではなく、例証として挙げると、数多くの天然のＩＬ− １インヒビターが記載されている（Larrick, 1989, Immunolgy Today 10:61-666, 第II表）。これらＩＬ−１インヒビターはＩＬ−１レベルを低下させ、そしてそれによってＮＧＦレベルを低下させるために本発明に従つて用いることができる。これらの物質はサイトカインを介してＮＧＦレベルを変化させるので、それらの使用もＮＧＦレベル調節のためにサイトカインを用いる本発明に包含される。たとえば、グリココルチコイドはＩＬ− １の発現を減少させるので、本発明により中枢神経系のＮＧＦレベルを低下させるために使用できる（下記実施例２参照）。

好ましい実施態様に於いては、ＮＧＦ合成の調節に有効なサイトカインを確認するために、インビトロ並びにインビボ試験の両方が用いられる。

インビトロの結果は必ずしもインビボのサイトカインによるＮＧＦ合成調節の程度を反映しない（たとえばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βは、精製星状細胞培養物中ではインビボでＮＧＦ合成を刺激するより高度にＮＧＦ合成を刺激する；下記参照）。

サイトカインのＮＧＦ発現調節能のインビトロ試験は、好ましくはおよそ90％以上の星状細胞を含有し当業者に周知の方法によって調製されうる星状細胞培養物中で行うことができる（例えば下記実施例1(1.2)参照）。ＮＧＦ産生の調節に関する用量−応答関係を最適にするために、サイトカインを培養物に種々の濃度で種々の期間接種することができる。ＮＧＦ−ｍＲＮＡはin situハイブリッド形成、定量的「ドットブロット」またはフィルターハイブリッド形成分析、または定量的ノーザンブロット分析を包含する当業者に周知の標準方法によって測定できる。標準的な方法の中でも、バイオアッセイ、in situ抗−ＮＧＦ抗体結合、またはエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、ＮＧＦレベルを測定することができる。

ひとたびインビトロデータによって適当なサイトカインが示唆されると、ラットのような適当な実験動物でインビトロ試験で決定されたサイトカイン最適用量を包含する用量でインビボ試験を行うことができる。インビトロ最適値の前後の用量を検査することができる。標準的な方法にしたがって脳室内注射することにより、適当な担体中でサイトカインを試験動物に投与することができる。

一定期間の後、動物を殺し、脳を摘出してＮＧＦレベルを測定することができる。in situハイブリッド形成、「ドットブロット」またはノーザンブロット分析のような方法によりＮＧＦ−ｍＲＮＡを測定することができる。標準的な技法の中でもとりわけバイオアッセイ、in situ 抗−ＮＧＦ抗体結合またはＥＬＩＳＡによってＮＧＦのレベルを測定することができる。

(2)医薬組成物本発明の活性組成物（すなわちサイトカイン、サイトカインインヒビター、サイトカイン促進剤）は、中枢神経系に導入するのに適した任意の滅菌製剤担体中において投与できる。脳室内への注射は、たとえ一過性であるにせよ、比較的高い局所濃度を生ずるので好ましいが、活性組成物は脳室内および鞘内注射を含む任意の適当な経路によって脳脊髄液中に投与できる。脳室内注射は、例えば、オマヤ（Ommaya）貯蔵器のような貯蔵器に結合した脳室内用カテーテルにより促進されうる。

もし活性組成物が血液脳関門を効果的に通過することができるならば組成物を静脈内投与することもできる。

(3)治療上の使用サイトカインをＮＧＦ合成の調節に使用する本発明は、中枢神経系の種々の疾患および障害の治療に使用できる。

本発明の種々の態様においては、それらに限定されるわけではないが、中枢神経系が外傷、外科手術、虚血、感染、悪性腫瘍または有毒導剤により損傷を受けた場合を含む神経障害におけるＮＧＦ合成を調節するのにサイトカインを使用できる。

本発明は特に、損傷が海馬、綿状体または前脳基底部に起こった状態を治療するのに使用できる。

本発明の他の態様においては、サイトカインは先天性の状態、そして特にＮＧＦ欠乏に関連している可能性のある先天性の状態におけるＮＧＦ合成の調節に使用できる。従って本発明は或る種の先天性の学習障害に有用である。

本発明のさらに他の態様においては、サイトカインは神経変性性障害におけるＮＧＦ合成の調節に使用できる。特にサイトカインはアルツハイマー病のような痴呆の治療に使用できる。

本発明によれば、サイトカインは中枢神経系におけるＮＧＦ合成を増大させるかまたは減少させるのに使用できる。本発明の好ましい態様においては、ＩＬ−１又はＴＧＦ−βのようなサイトカインは中枢神経系におけるＮＧＦレベルを増大させるのに使用できる。

サイトカインレベルを変え、それにより間接的にＮＧＦ合成を調節する非サイトカイン物質も本発明により使用できる。

あるいはまたは他の態様においては、それらに限定されるものではないが、例えばグルココルチコイドホルモンを含むＩＬ−１の作用に拮抗する物質（第II表参照）を用いて中枢神経系におけるＮＧＦレベルを減少させるのにサイトカインを使用できる。ＮＧＦ合成を低下させる物質は、パーキンソン病のような、ＣＮＳコリン作動活性が相対的に優勢であることを特徴とする状態の治療に有用であろう。

本発明のひとつの利点はＮＧＦプロモーター活性化および／またはＮＧＦ発現をそれが必要な特定の領域に的をしぼって行うことが可能なことである。例えば、内因性ＣＮＳＮＧＦ産生の活性を増大させることにより、ＮＧＦレベルの増大によって利益を受けうる領域でＮＧＦが産生され、それによってＮＧＦに普通はさらされない領域を例えば全身的なＮＧＦ投与によりありうる不利な作用から守ることができる。

(4) サイトカインによるＮＧＦプロモーター活性の誘導本発明の他の態様においては、ＮＧＦプロモーターを関心のあるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列により連結でき、そして該関心のあるタンパク質の転写はＮＧＦの発現を調節する物質にＮＧＦプロモーターを露出させることによって制御できる。「関心のあるタンパク質またはペプチド」なる用語は治療上または診断上有用でありうるものであってそして／または生物学的または化学的活性を有する任意のペプチドまたはタンパク質を指すものと解釈されるべきであり、それらにはサイトカイン、ホルモン、酵素、抗体、または抗体フラグメント、レポーターまたはマーカータンパク質等が包含されるがそれらに限定されるわけではない。本発明の好ましい態様においては、関心のあるペプチドはＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、またはＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦもしくはＮＴ−３と相同（すなわち少なくとも約25％が同一である）の少なくとも約６個のアミノ酸を有するタンパク質またはペプチドを包含することがそれらに限定されない向神経性因子であることができる。本発明はＮＧＦの発現を調節する種々の物質を提供するものである（上記 (1)参照）。これら物質は、ＮＧＦプロモーター活性を増大させるかあるいはまた減少させるものであることができる。

本発明の組換え体構築物はＮＧＦ調節性物質に応答するＮＧＦプロモーター領域の少なくとも一部分を含有する。例えば、限定のためにあげるものではないが、ＮＧＦプロモーターの有用領域を実施例２の(1.4)に実質的に示されているようにしてクローン化しうる。基本的にはBalb／cマウスゲノムライブラリーをＮＧＦのプロモーター領域を含有するクローンを確認するためにＮＧＦ遺伝子（Selby M.J.,ら、1987, Mol. Cell. Biol 7: 3057-3064）の第１番目のエクソンを包含するオリゴヌクレオチドプローブを用いて選別することができる。約2.1kbのHincII／PuvIIフラグメントをかかるクローンから調製し、次に関心のあるタンパク質あるいはペプチドをコードする核酸配列に連結させることができる。生成する構築物は所望のアミノ酸配列を生成する翻訳読みとり枠を創り出すための適切な開始コドンを提供するものが好ましい。リボソーム結合部位を包含されうる。本発明の詳細な態様においては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）担持pB LCAT3発現ベクター（Hengererら、1990, Proc. Na tl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3899）のXbaＩ／Xh oＩ部位に該HincII／PvuIIフラグメントをクローン化することができる。

本発明のＮＧＦプロモーター担持組換え核酸構築物は細菌、酵母、または好ましく真核生物組織または細胞系に導入できるし、また遺伝子転移によって（例えばウイルスベクターを媒体として）、ヒトを含む生物またはトランスジェニック動物にトランスジーンとして組み込むこともできる。本発明の構築物の導入は、トランスフェクション、トランスダクション、燐酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーションまたはセル・ガン（cell gun）によって達成できる。本発明はまたこの発明のＮＧＦプロモーター構築物を包含する細胞、組織、細胞系およびトランスジェニック動物をも提供するものである。

ＮＧＦプロモーター構築物はＮＧＦ産生を調節する化合物を確認する系で使用できる。本発明の好ましい態様においては、この構築物は中枢神経系におけるＮＧＦの産生を調節する化合物を確認するのに使用できる。例えば、それに制限されるのではないが、本発明の構築物はＮＧＦプロモーターの活性化がＣＡＴ発現を増大させうるような様式でＮＧＦプロモーターおよびＣＡＴ遺伝子を含有しうる。この構築物は培養線維芽細胞または星状細胞のような適当な細胞または細胞系に導入できる。次にこれら細胞を試験薬剤に露出させることができる。それに続くＣＡＴ活性の増大はその試験薬剤によるＮＧＦプロモーターの活性化を示している。あるいはまたＣＡＴ活性が減少することは試験薬剤によるＮＧＦプロモーター活性の抑制を示している。

他の態様においては、本発明の構築物は中枢神経系の生理機能を研究する為の実験系を創り出すのに使用できる。例えばこの方法に限定されるわけではないが、ＢＤＮＦのような向神経因子をコードするヌクレオチド配列を包含する構築物を含有するヒト以外のトランスジェニック動物を作り出すことができる。ＮＧＦプロモーター活性を増加させる物質の投与によりかかる動物のＣＮＳ中のＢＤＮＦレベルが増大しよう。かかる動物に及ぼすＢＤＮＦの作用、およびＢＤＮＦとＮＧＦを合せた作用は、該構築物を有しないが同様にＮＧＦ誘導物質を投与された動物と比較することにより確認できる。

ヒト被検体へのＮＧＦ担持構築物の、たとえばウイルストランスダクションによる導入は、ＣＮＳ内でのタンパク質またはペプチドの生成に都合よく応答しうる状態を処置するために同じような方法で用いることができる。構築物のＮＧＦプロモーター誘導は外部から投与されるかまたは内因性物質によって達成できる。例えば、意図するタンパク質の発現を増加させるのは、本発明の構築物を担持する患者のＣＮＳにＮＧＦプロモーター活性を高める物質を投与することから生じるであろう。あるいはまた意図するタンパク質またはペプチドの発現は内在するメカニズムによっても制御できる。下記実施例３の(3)において、脳のＴＧＦ−β１のレベルは脳の損傷のあとに増加することが述べられている。それゆえ中枢神経系に反復して障害を受けている患者、例えば多発梗塞患者では本発明の構築物はＴＧＦ−β１応答性ＮＧＦプロモーターの制御下に、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ３またはＮＧＦのようなＣＮＳ修復を増強すると信じられているペプチドを含有しうる。それぞれ新たな障害でかかる患者の脳は増大した自己修復メカニズムを以って応答しよう。本発明のもうひとつの詳細な態様においては、パーキンソン病患者を、ＮＧＦプロモーター制御下のチロシンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含有する構築物のトランスダクションにより治療できる。

実施例１：星状細胞培養物およびインビボにおける神経成長因子（ＮＧＦ）合成に及ぼすインターロイキン−１、腫瘍細胞増殖因子−ベータおよび他の種々の成長因子の作用の比較 (1)材料および方法 (1.1)抗体およびサイトカインＥＧＦはSigmaから、ＰＤＧＦはBiochromから、そしてウシの基礎ＦＧＦはAmershamから入手した。

抗−Thy 1.1抗体はSerotecから、そして抗−ＧＦＡＰおよび抗−ビメンチンはBoehringer Mannheim から得た。０４抗体はI.Sommer博士から、ＩＬ− １−βはA.Gronenborn博士から、そしてＴＧＦ− αはW.Risau博士から提供された。ＮＧＦ−ＥＬＩＳＡ用のＮＧＦ−抵抗−ガラクトシダーゼ接合体およびその基質であるクロロフェノール−レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドはBoehringer Mannheimから入手した。ＴＧＦ−β１はＲ＆ＤSy stem, Inc., MNから入手した。

(1.2)細胞培養物ＤＭＥ培地およびペニシリン−ストレプトマイシン溶液はＧＩＢＣＯから得た。ウシ胎児血清は Boehringer Mannheimから得た。初代培養物はMc Carthyおよびde Vellis(1980, J. Cell. Biol. 85:890-902）の方法に従って新生児のラット脳から調製した。細胞は10％ウシ胎児血清、100μｇ／mlストレプトマイシンおよび100単位／mlペニシリンを補添したＤＭＥＭ中に保持し、そして10 ％CO₂／90％空気中で37℃で増殖させた。培地は４日毎にとり換えた。２〜３週間後に細胞は集密的となった。

精製した星状細胞培養物は下記操作により得られた：星状細胞単層の頂部で成育する寡突起神経膠細胞およびミクログリア細胞を培養フラスコを回転振盪器上37℃、180rpmで振盪することにより除いた。剥離した細胞は除去した。培養物を次いでＰＢＳ中の20mM ＥＤＴＡに15〜20分間さらした。

生成した細胞浮遊液を遠心分離しそして10％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させた。次の精製工程は、再塗布後ではミクログリア細胞は星状細胞よりもはるかに速やかに未被覆組織培養プラスチックに付着するという事実に基づく。30分後に未付着の星状細胞をとり出しそして最終的にポリ−Ｌ−リジン被覆組織培養皿上に塗布した（60 ×15mm）。それらが集密的となる迄、10％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に維持した。ＩＬ−１および種々の成長因子のＮＧＦ合成に及ぼす影響を調べるために、培養物を0.5％ＦＣＳを含有する培地中に 24時間保持してから（結果参照）下記化合物を４および24時間加えた：ＩＬ−１β（0.75および7.5 ng／ml）、ＥＧＦ（５ng／ml）、６ＦＧＦ（５ng ／ml）、およびＴＧＦ−α（10ng／ml）。培養物は５ng／mlの濃度でＴＧＦ−βにに合計48時間さらした。

(1.3)個々の神経膠細胞集団の確認細胞は免疫細胞化学により特定決定した。５％酢酸／95％エタノール中−20℃で固定および透過性化（permeabilization）を行い、そして１％ＢＳＡとプレインキュベーションした後、ＧＦＡＰおよびビメンチンに対するマウスモノクローナル抗体（Dahl, 1981, J. Neurosci. Res. 6:741-748）を室温で１時間インキュベーションした。若い寡突起神経膠細胞の細胞表面構成分と反応するマウスモノクローナル抗体０４（SommerおよびSchachner, 1981, Dev. Biol. 83:311-327）、および線維芽細胞の同定に使用されるマウスのモノクロナール抗体である抗−Thy 1.1(Raffら、1979, Brain Res. 174:283-308）を培養物中の細胞と１時間インキュベートし、次に４％パラホルムアルデヒド中で固定した。すべての細胞を、第二抗体として1:100に希釈したフルオレセイン標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリン（Gibco）と室温で30分間インキュベートした。培養物はZeiss蛍光顕微鏡を用いて検査した。

ミクログリア細胞はKoskiら（1976, in In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, B loom and David編、Academis Perss, New York, p3 59）の方法に従いそれらの非特異的エステラーゼ反応により確認した。簡単に説明すると、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定しそしてパラローザニリンおよびアルファ−ナフチルアセテートとともにインキュベートした。10〜20分後に暗赤褐色の沈澱を光学顕微鏡で見ることができた。

(1.4)in situハイブリッド形成どの細胞がＮＧＦ−ｍＲＮＡを発現するかを決定するために、混合初代ラット脳培養物に対するin situハイブリッド形成実験をBandtlowら（1987, EMBO J. 6:891-899）に従い実施した。

(1.5)ノーザンブロット分析 HeumannおよびThoenenの方法（1986, J. Biol. Chem. 261:9246-9249）に従い、ノーザンブロット定量分析を行つた。絶対的定量のためには、回収標準物（510b）および検量標準物（910b）を別々のレーンで同時に電気泳動した（Heumannおよび Thoenen、1986, 前出；Lindholmら、1988, J.Biol. Chem. 763:16348-16351）。ハイブリッド形成は、 50％ホルムアミド中の５×10⁶cpm／mlの^３２Ｐ標識ＮＧＦ−ｃＲＮＡプローブ（0.9kb）を用いて65 ℃で実施した。

(1.6)ＮＧＦ−ＥＬＩＳＡ上清中のＮＧＦを測定するために、0.1％ＢＳＡを試験化合物とともに加えた。24時間後に培地をとり出してサンドイッチエンザイムイムノアッセイを実施した。培地はNunc Immuno Quality １マルチタイタープレート上に被覆した27／21抗− ＮＧＦモノクローナル抗体とインキュベートした。

ＮＧＦは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに結合させた同じ抗体により検出した。酵素反応の基質はクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＣＰＲＧ）であった。吸光度は550nmで測定した。

(1.7)インビボ実験インビボ実験は10日令のWistarラットを使用して行った。動物をエーテル麻酔した後、15ng IL −１−β、20ng ｂＦＧＦ、20ng ＴＧＦ−α、 5ng ＴＧＦＢ１または対照としての４μl ＰＢＳを脳室内に注射した。８時間後に海馬および皮質をとり出してＮＧＦ−ｍＲＮＡ測定を行った。

(2)結果 (2.1)免疫組織化学的方法により評価された培養物の純度新生児ラットから得られた脳細胞の初代培養物を、それが集密的となるまで10％ウシ胎児血清補添ＤＭＥＭ中で増殖させた。精製後（方法参照）、第二代培養物は約95％の星状細胞から構成され、これらはすべてビメンクンを含有していたが、ＧＦＡＰについては70％が含有しているだけであった（第１図）。この観察は、未成熟星状細胞がＧＦＡＰ−であることを示したDahl(1981, J. Neurosci. Res. 6:741-748）と一致する。混入した細胞は１ −２％のThy-1⁺線維芽細胞および３−４％の04⁺ 寡突起神経膠細胞であった（第２ａ図）。非特異的エステラーゼに対する染色により示されるように、極めて少数のミクログリア細胞が存在していた（第２ｃ図）。ニューロンはこれら培養物中には存在しなかった。

(2.2)培養物のin situハイブリッド形成混合ラット脳初代培養物のin situハイブリッド形成により、寡突起神経膠細胞とミクログリアがＮＧＦ−ｍＲＮＡを発現しないことが明らかとなった。特異的な標識化は星状細胞に限定された。

非刺激培養物中の星状細胞に関するシグナルは極めて弱かったが、血清またはＴＧＦ−αで刺激した後では著しく増大した。寡突起神経膠細胞およびミクログリア細胞は未標識のままであった（第３図、矢印）。技術的理由から、同一の調製物においてin situハイブリッド形成と免疫化学とを組みあわせることはできなかった。

(2.3)ＮＧＦ合成に及ぼすウシ胎児血清の作用予備実験において我々はＦＣＳによるＮＧＦ− ｍＲＮＡ発現およびＮＧＦ−合成の誘導を見出した。10％ＦＣＳを加えた後、ＮＧＦおよびそのｍＲＮＡは少なくとも48時間増大した（第４図）。

この観察は、血清の添加後における培地中のＮＧＦ−レベルの増大を例証したFurukawaらの観察（1987, Biochem. Biophys. Res. Commun.142:395 -402）と一致する。血清はＰＤＧＦおよびＥＧＦのような、ＮＧＦ合成に関する種々のありうる調節分子を含有するので、細胞は0.5％ＦＣＳのみを含有する培地中に保持した。この低い濃度は増殖またはＮＧＦ−ｍＲＮＡ発現に何ら測定可能な影響を及ぼさなかったが、細胞を良好な状態に保持するのに必要であった。

(2.4)インビトロＮＧＦ合成に及ぼすｃＡＭＰおよびノルエピネフリンの作用ノルエピネフリンは、末梢すなわちラットの虹彩培養物中のＮＧＦ−合成を減少させる（Hellweg ら、1988, Exp. Cell. Res. 179:18-30）。これに対して、ｃＡＭＰはＣ６−神経膠腫細胞におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを増大させることが報告されている（Schwartz、 1988,Glia 1:282-285）。

我々の実験条件下においては、８−ブロモ−ｃＡＭＰによってもまたノエルピネフリンによってもＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの測定可能な変化は観察されなかった（第５図）。

(2.5) インビトロＮＧＦ合成に及ぼすＩＬ−１、ＴＧＦ−βおよびその他の成長因子の作用イムノアッセイ、免疫組織化学およびin situ ハイブリッド形成により示されるように、げっ歯動物の脳に存在することが報告されているＩＬ− １βおよび一連の成長因子（WilcoxおよびDerynck、 1988, J.Neurosci 8:1901-1904;Fallonら、1984, Science 224:1107-1109; GiulianおよびLachman、 1985,Science 228:497-499; Gospodarowicz、 1987, Endocrine Reviews 8:95-116）をＮＧＦ合成におよぼす作用に関して試験した。これらを飽和濃度、すなわちその報告されている分裂促進作用に関して最大量以上で使用した（Giulianら、1986, J. Exp. Med. 164:594-604; Gospodarowiczら、1987, Endocrine Reviews, 8:95-116; Avolaら、1988, J. Neurosci. Res. 19:230-238; Nobleら、1988, Nature 333:560-562）。さらに、単一の実験で用いられた高濃度での予備実験では、それ以上ＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルが増大しなかった。

ＩＬ−１βはＮＧＦ−ｍＲＮＡを約５倍増大させたが、ｂＦＧＦおよびＥＧＦは約７倍増大させた。ＴＧＦ−αは強力な作用を有しており、ノーザンブロット定量分析で測定してＮＧＦ−ｍＲＮＡを約９倍増大させた（第５図）。最大ＮＧＦ− ｍＲＮＡレベルには、7.5ngのＩＬ−１βと６時間インキュベーション後に達し、次に徐々に低下し、24時間後に対照レベルに近づいた（第６図）。

６時間および24時間後のＮＧＦ−ｍＲＮＡの相対的変化がＩＬ−１βの存在下におけるそれと同様であったので、ＴＧＦ−α、ｂＦＧＦおよびＥＧＦについても同様の時間的経過を想定した。

ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２はいずれもラットの星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを時間および濃度依存様式で強く刺激することが観察された（第７図および第８図）。ＴＧＦ−βの最大の作用（ＮＧＦ−ｍＲＮＡの50倍の増加）は添加後24時間でみられ、これはＩＬ−１βを含む他の成長因子で見られる状況、すなわち培養６時間後に最大ＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルとなり、そして比較的低いＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを誘導したことと対照的であった。

ＩＬ−１βおよび成長因子と24時間インキュベーションする間の培地中におけるＮＧＦ蓄積をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ−１β、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦはすべて培地中のＮＧＦ濃度を増大させた（第９図）。測定された絶対量はプロテアーゼインヒビター（11mM のロイペプチンおよび40Ｕのアプロチニン）を添加することにより、２−３倍高めることができた。

しかしながら、放出されたＮＧＦの絶対量はＮＧＦ−ｍＲＮＡの増大を反映した。

(2.6) インビボＮＧＦ合成に及ぼすＴＧＦ−β、ＩＬ−１βおよびその他の成長因子の作用インビトロ結果の生理学的重要性を証明するために、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１βを10日令ラット脳の側脳室へ薬理学的濃度で注射した。20ngのＴＧＦ−αおよびＦＧＦはいずれも小さな誘導作用を有するだけであったが、 16ngのＩＬ−１βは海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡを４〜５倍、そして５ngのＴＧＦ−β１は海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを３〜４倍増加させた（第10 図）。ＩＬ−１βもＦＧＦも新皮質のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに測定可能な変化を生じなかった。

(3)論考本研究の目的は、ＣＮＳにおけるＮＧＦ合成の関節に関与するメカニズムに関する情報を得ることであった。我々が星状細胞、寡突起神経膠細胞およびミクログリア細胞の混合し精製した培養物中においてＮＧＦ合成が星状細胞でしか起らないことを示した後で、高度に精製されたラットの星状細胞培養物におけるＴＧＦ−β、ＩＬ−１および一連の成長因子の作用を研究した。

成長因子およびＩＬ−１の選択はそれらが脳で合成される証拠に基づくものであった。ＴＧＦ− αがＥＧＦレセプターを介して作用しうるので、ＥＧＦが包含された。これらレセプターは免疫組織化学的操作により、種々の脳領域のニューロン（Gomez-Pinillaら、1988, Brain Res. 438:385 -390）および脳の損傷後に免疫反応性が高まる星状細胞（Nietro-Sampedroら、1988, Neurosci. Le tt, 91:276-282）に存在することが示されている。

ＩＬ−１および研究されたすべての成長因子で使用された濃度は最大量以上であった。試験されたすべての成長因子に関する作用はＴＧＦ−βを除いて）４−６時間後に最大に達することが予備実験で示されたので、我々は完全な時間的経過を確立させたＩＬ−１を除き、個々の因子の添加６〜24時間後までに実験を限定した。６時間後のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用は、ＩＬ−１に対する５倍の上昇からＴＧＦ−αに対する９倍の上昇の間で変動した。ＴＧＦ−βを除き、調査したすべての分子に関してＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルは24時間後に対照レベルに近づいた。６−24時間の間のＮＧＦ−ｍＲＮＡの減少が相当するレセプター−変換システムの脱感作によるものか、または添加したポリペプチドの分解によるものかを決定するために、我々は３種の実験で24時間後にＩＬ−１、ＴＧＦαおよびＦＧＦを再添加し、そしてＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの再上昇を観察した。

従って、添加した分子の不活性化が、ＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼす作用が衰微する主要な原因であると思われる。これは、ラット坐骨神経の培養物でＩＬ−１でなされた先の観察と一致する（Lindholm ら、1987,Nature 330:658-659）。

検査したＩＬ−１および他の成長因子とは対照的に、ＴＧＦ−β１は培養24時間後に最大ＮＧＦ −ｍＲＮＡレベルを生じた。さらに、高レベルのＮＧＦ−ｍＲＮＡは少なくとも48時間の培養の間維持された。第10図に示されるように、５ng／ml のＴＧＦ−βがＮＧＦ−ｍＲＮＡの最大の誘導と関わっていた。我々はまた、ＴＧＦ−βにより媒介されたＮＧＦ−ｍＲＮＡの増大はシクロヘキシミドで阻止でき（データは示されていない）、かつこの増大はＮＧＦ遺伝子の転写増強による確率が最も高いことを観察した。興味あることには、ノーザンブロット分析によりＴＧＦ−β１が成体ラット脳の多くの領域で発現されることが示された。

ＮＧＦ−ｍＲＮＡ増大は培地中に放出されたＮＧＦタンパク質の相当する増大に反映された。この観察は、ＮＧＦ−ｍＲＮＡの増加に続いてＮＧＦタンパク質の合成および放出が相当して増大するものである、ラット虹彩の初代培養物でなされた先のより詳細な実験と一致する（HeumannおよびTheenrn、 1986, J. Biol. Chem. 261:9246-92 49）。これとは対照的に、ノルエピネフリンも８ −ブロモ−ｃＡＭＰも我々の星状細胞培養物におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを変化させなかった。

以前に、ノルエピネフリンは、ラットの虹彩の器官培養物においてＮＧＦおよびＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの顕著な減少を生ずることが示されている（Hellwegら、1988, Exp. Cell. Res 179:18-30）。

加えて、Ｃ６神経膠腫細胞に関してノルエピネフリンおよび８−ブロモ−ｃＡＭＰの両方によるＮＧＦ−ｍＲＮＡの増大が報告されている（Schwartz、 1988, Glia. 1:282-285）。

星状細胞培養物におけるインビトロ実験の結果に基づきインビボ実験が実施された。すなわち、ＩＬ−１、ＴＧＦ−β、ＥＧＦおよびＴＧＦ− αがラット脳室内に注射された。インビボで得られた結果は星状細胞培養物でなされた観察を完全に反映するものではなかった。例えば、星状細胞培養物でＮＧＦ−ｍＲＮＡに有意の作用を生じたＴＧＦ−αの注射はインビボでは検出可能な作用を及ぼさなかった（ＴＧＦ−αのインビボ作用における不一致が脳室内注射後の急速な分解によるのか、または培養中の星状細胞の反応性がin situ のそれとは異なるかは決定できなかった）。しかしながら、ＴＧＦ−αとは対照的に、培養された星状細胞に及ぼすＴＧＦ−βおよびＦＧＦの作用は、脳室内注射後のＮＧＦ−ｍＲＮＡ増大にも反映された。但しインビボでの作用は星状細胞培養物で観察されたそれより小さかった。はじめに HeftiによりＮＧＦ注射後に観察されたと同様の様式で、采損傷の後にＦＧＦを注入すると中隔のコリン作動性ニューロンの変性が阻止されるという観察に鑑みて、インビトロおよびインビボの両方においてＦＧＦがＮＧＦ−ｍＲＮＡを増大させるという観察は特に興味がある（1986, Exp. Cell. Res. 179:18-30）。ＮＧＦに対するこれらのニューロンの直接の反応性は十分に確立されており Thoenenら、1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109:145-178;WhittemoreおよびSeiger、 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464）、そして本発明の実験はＦＧＦがインビトロのみならずインビボにおいてもＮＧＦの合成を高めることを示しているから、中隔のコリン作動性ニューロンに及ぼすＦＧＦの観察された保護作用の少なくとも一部は間接的なものであると思われる。特に興味あるのは、ＮＧＦ−ｍＲＮＡのインビボレベルに及ぼすＩＬ−１の著明な作用であり、一方星状細胞培養物においてはそれはＦＧＦのそれと同じ範囲内にあるがＴＧＦ−β、ＴＧＦ−αおよびＦＧＦの値よりは明らかに小さかったことである。従って、脳におけるＩＬ−１の作用が星状細胞におけるＮＧＦ合成の調節から生ずるのみならず、脳の他の細胞におけるＮＧＦ合成が関与するのではないかという問題が生ずる。事実、海馬の錐体ニューロンおよび歯状核の顆粒細胞はＩＬ−１レセプターを発現することが示されている。最近のin situ実験では、同じニューロンがＮＧＦ−ｍＲＮＡも発現することが示されている（Rennertおよび Heinrich、 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 38:813-818;Ayer-LeLievreら、1988, Science 240:1339-1341; Whittemoreら、1988, J.Neuros ci. Res. 20:403-410）。従って、星状細胞培養物に及ぼすその作用に比較してＩＬ−１の相対的に大きなインビボ作用は、ＣＮＳのこれらのニューロンにおけるＮＧＦ合成に及ぼすＩＬ−１の調節機能から生じる可能性がある。他の興味のある局面は、インビボにおけるＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＩＬ−１の比較的に大きな作用である。海馬の錐体細胞および歯状回の顆粒細胞はＩＬ−１β−ｍＲＮＡばかりでなくＩＬ−１レセプターおよびＮＧＦ−ｍＲＮＡも発現する（Bandtlowら、1987, EM BO J. 6:891-899）。ＩＬ−１レセプターおよびＮＧＦ−ｍＲＮＡがＩＬ−１ｍＲＮＡと同じニューロンに存在するという事実は、ＩＬ−１レベルがオートクリン様式で調節されうることを示唆している。

海馬におけるＩＬ−１のオートクリン調節は、ＩＬ−１の脳室内注射後にＮＧＦ−ｍＲＮＡの増加のみならずＩＬ−１β−ｍＲＮＡのかなりの増大があることを示す予備的観察により示唆される。

これは、ＩＬ−１β−ｍＲＮＡおよびＩＬ−１活性の特異な局在性とともに、ＩＬ−１が中枢神経系並びに末梢の両方において、ＮＧＦ合成の調節にある役割を果たしてるかもしれないことを示唆する。

実施例２：グリココルチコイドホルモンは神経成長因子発現を負に調節する坐骨神経の横切開（transection）により、軸索のまわりに非ニューロン細胞における神経成長因子（ＮＧＦ）生産の上方調節がもたらされる。神経において損傷により媒介されるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの増大は、動物を合成グルココルチコイドであるデキサメタゾンで前処置することにより阻止することができる。デキサメタゾンはまた、ウシ胎児血清またはインターロイキン−１（ＩＬ −１）で刺激された培養坐骨神経線維芽細胞および星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルをも減少させる。グルココルチコイドがどのレベルでＮＧＦ発現を下方調節するか研究するために坐骨神経線維芽細胞を、ＮＧＦプロモータおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を含有する構成物でトランスフェクションさせた。その結果は、デキサメタゾンがＮＧＦ遺伝子の転写を効果的に抑制し、従ってこの向神経分子の生産を阻害することを示している。

(1)材料および方法 (1.1)坐骨神経横切開両性のWistarラット（160-180g）をこの研究全体を通して使用した。ラットを麻酔し、そして坐骨神経を坐骨切痕部で鋭利なはさみで片側だけ切断した（Heumann, R.およびKorching, S., Bandtlow, C.およびThoenen, H, 1987, J. Cell. Biol. 104:1623-1631）。６時間後に断頭して動物を殺し、切断部位の近位および遠位で、0.5cmおよび１cmの神経セグメントをとり出し、ただちにドライアイスで凍結した。幾つかの実験においては、神経損傷２時間前に腹腔内に注射することによりデキサメタゾン（2.5mg／kg体重）でラットを予め処置した。対照ラットには同容量の0.9％ NaClを注射した。

(1.2)細胞および器官培養坐骨神経セグメント（３cm）を調製し、そして 10％（V/V）ウシ胎児血清を補添したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）１ml中で培養した。

血清の作用を研究するために、いくつかの培養物は血清を補添せずにインキュベートした。インキュベートは６時間行ない、そして図中で示したところでデキサメタゾン（１μＭ）を存在させた。

前に記載されるようにして、ラットの坐骨神経線維芽細胞を調製し、培養した（Lindholm, D., Heumann, R., Hengerer, B.およびThoenen,H., 1988, J. Biol. Chem. 263:16348-16351）。集密的細胞を低（１％）ウシ胎児血清中に保持し、ＩＬ−１（30単位／ml）または10％ウシ胎児血清を用いて刺激した。幾つかの培養物にはデキサメタゾン（μＭ）を加えた。

McCarthyおよびde Vellisの方法（1980, J. Cell. Biol. 85:890-902）に従い、新生児ラット脳から星状細胞を調製した。

(1.3)ＲＮＡ調製およびノーザンブロット分析先に記載されるように全ＲＮＡを線維芽細胞および凍結神経から調製した（Lirdholm, D., Henmann, R., Hengere,B.,およびThoene, H., 1988, J. Biol. Cehm. 263:16348-16351; Lindholm, D., Heumann, R., Meyer, M.,およびThoener, H,19 87, Nature 330:658-659）。すべての実験において、ＲＮＡ回収を測定するために短縮されたＮＧＦ標準物（0.52kb）を包含させた。ＲＮＡ試料をグリオキシル化し、そして1.5％アガロースゲルを通して電気泳動し、0.92kb ＮＧＦ転写物を別のレーンで同時に電気してオートラジオグラム定量ができるようにした（Lindholm, D., Heumann, R., Meger,M.,およびThoener, H. 1987, Nature 330:658-659;およびHeumann,R.,およびThoener, H,, 1986, J.BiolChem 261:9246-9249）。電気泳動に続いて、ＲＮＡを予めＵＶ照射したナイロン膜に移し、プレハイブリッド形成させそして先に記載されるようにしてハイブリッド形成させた（ Heumann,R.,およびThoener,H,, 1986, J.Biol . Chem. 261:9246-9249）。ＮＧＦｃＲＮＡプローブはリボプローブシステムおよびマウスＮＧＦ −ｃＤＮＡのPstI由来フラグメントを用いて調製した（Heumann, R.,およびThoener,H,, 1986, J. Biol. Chem. 261:9246-9249）。ハイブリッド形成後、フィルターを洗い、Ｘ線フィルムに露光させた。ＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの定量はＬＫＢレーザースキャナー上のオートラジオグラムを走査することにより行った。

(1.4)ＤＮＡ構築およびトランスフェクションＮＧＦプロモーターをクローニングするために、ＮＧＦ遺伝子の最初のエキソンを包含する33量体オリゴヌクレオチドを用いてBalb／ｃマウスゲノムライブラリーを選択した（Selby,M,J.,Edwards, R., Sharp, F.,およびRutter, W. J.,1987,Mol. Cell.Biol. 7:3057-3064）。プロモーター領域の 2.1kb HincII／PvuIIフラグメントをＣＡＴ−発現ベクターpBLCAT3のXbal／XhoI部位にクローン化し、遺伝子構築物（pBLPNCAT3）をトランスフェクションに使用した。

再塗布２日後、ラット坐骨神経線維芽細胞（80 -90％集密）を、リン酸カルシウム法を改良して使用して、10μｇのpBLPNCAT3で14日間トランスフェクションさせた。洗浄に続き、細胞をＤＭＥＭ独立、または10％ウシ胎児血清もしくはＩＬ− １のいずれかを含有するＤＭＥＭ中で24時間インキュベートした。デキサメタゾン（１μＭ）は第 14図の指示されたところで存在させた。細胞を収穫し、抽出物中の同量のタンパク質をＣＡＴ活性の測定に使用した。

(1.5) クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性の測定クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性はGormanらの方法に従い測定された（1982,Mol.Cell.Biol. 2:1044-1051）。

(1.6)試薬組み換えヒトＩＬ−１はA.Gronenborn博士（Mar- tinsried）の好意により提供された。デキサメタゾンはSigma Chemical Co.,から入手した。

(2)結果 (2.1) 坐骨NGF-mRNAの損傷により媒介された増大に及ぼすデキサメタゾンの作用先の実験において本発明者等は、坐骨神経損傷が切断部位に近位および遠位の神経セグメントにおけるNGFの合成を刺激することを示している（Heumann, R., Korsching, S., Bandtlow,C.およびThoenen, H., 1987,J. Cell. Biol, 104:16 23-1631;Heumann, R., Lindholm, D., Bandtlow, C., Meyer, M., Radeke, M., J., Misko, T.P., S hooter, E.,およびThoenen, H., 1987, Proc. N atl. Acad. Sci. U.S.A. 84:8735-8739）。加えて、坐骨NGF-mRNAの初期の増大は、坐骨神経セグメントが培養される際にも生じる（Heumann, R., Lind holm, D., Bandtlow, C., Meyer, M., Radeke, M. J., Misko, T.P., Shooter, E.,およびThoenen, H., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 8735-8739）。しかしながら、第11図に示されるように、坐骨NGF-mRNAレベルの損傷により媒介された増大は、動物をデキサメタゾンで予備処置することによつて完全に阻止できた。通常、2.5mg/kg 体重のステロイドが接種されたが、その効果はデキサメタゾン1mg/kgによっても観察された。デキサメタゾンは損傷後のNGF-mRNAレベル増大を抑制するのに非常に有効であるが、デキサメタゾンは、無傷の坐骨神経における低いNGF-mRNAの基礎レベルに影響しないようであった（第11図）。また、デキサメタゾンは、インビトロでインキュベートされた坐骨神経セグメントにおけるmRNA-mRNA レベルをも低減させた（第11図）。しかしながらインビトロにおけるNGF-mRNA増大のデキサメタゾンによる阻害の度合いは完全ではなかった。即ち、血清の非存在下または存在下のいずれかでインキュベートされた神経について約80％低減された（第11図参照）。第11図はまた、NGF-mRNAの増大は培養された神経セグメントで起こるものと比べるとインビボにおける横切開後では低いことも示している。これは、先の観察と一致しており（Heumann, R., Lindholm, D., Bandtlow,C., Me yer, M., Radeke, M., J., Misko, T.P., Shooter, E.,およびThoenen, H., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:8735-8739）、そしておそらく神経損傷後のストレス応答の際に放出された内因性グルココルチコイドの作用によるものであろう。

事実、予備実験では、坐骨神経損傷後の坐骨NGF- mRNAレベルの増大が対照動物と比較すると副腎摘出されたラットにおいてより高いことが示された。

興味深いことに、種々の実験条件下で培養された神経セグメントに関して、本発明者等は坐骨NGF- mRNAレベルの増大がウシ胎児血清の存在下においては非存在下におけるよりも高かったことを観察した（第11図）。これは、血清中に存在する因子が培養された坐骨神経セグメントで観察されるNG F-mRNAの上昇に寄与することを示している。

(2.2)デキサメタゾンによる線維芽細胞および星状細胞におけるNGF-mRNAレベルの減少デキサメタゾンが分離された細胞においてNGF- mRNAレベルの干渉に等しく有効であるかどうか調べるために、線維芽細胞をラット坐骨神経から調整した（Lindholm, D., Heumann, R., Hengerer, B.,およびThoenen, H., 1988, J. Biol. Chem. 263::16348-16351）。第12図に示されるように、デキサメタゾンは血清またはIL-1のいずれかで処置された細胞においてNGF-mRNAレベルを低下させた。デキサメタゾンによるNGF発現の阻害の度合いは、これらの培養液において約70％であった（第12図）。更に、対照細胞における低いのNGF- mRNAレベルも、デキサメタゾン処置により更に低減された（第12図、レーン２）。

第13図は、デキサメタゾンが刺激された線維芽細胞におけるNGF-mRNAの蓄積を迅速に低下させたことを示している。すなわち、血清の１または２時間後に添加されたデキサメタゾンは、血清により誘発されたNGF-mRNAの上昇をなおも阻止することができた（約70％）（レーン４および５）。しかしながら、血清の３時間後に添加されたステロイド（インキュベーション停止１時間前）は、NGF-mR NAのレベルを若干しか低下させなかった（約25％）（第13図、レーン６）。加えて、タンパク質合成を阻止するシクロヘキシミドはこれらの培養物におけるデキサメタゾンの作用を低下させなかった。

更に、第13図（レーン７）に示される通り、10nM のデキサメタゾンもこれらの細胞におけるNGF発現を効果的に阻害した。別の実験において、本発明者等は0.1nMのステロイドでもこの系においてなす阻害作用を有することを見出した。

デキサメタゾンが星状細胞におけるNGF発現も阻害するか否かを判定するために、培養液をＴＧＦ β_１（５ｎｇ／ｍｌ）および／またはデキサメタゾン
（１μ M）で処置した。この薬剤はNGF-mRNAレベルのTGF β_１により媒介された増大を抑制する（50％以上）ことが判明した。

(2.3)NGFプロモーター活性に及ぼすデキサメタゾンの作用デキサメタゾンがNGF遺伝子に干渉するか否かを決定するために、坐骨線維芽細胞を、GATレセプター遺伝子に連結されたNGFプロモーターを含有するベクター構成物でトランスフェクションした。血清をこれらの細胞に添加するとCAT活性が増大し、このことはデキサメタゾンにより著しく低減されたNGFプロモーター活性が増強されたことを反映している（第14図ａ）。血清および／またはデキサメタゾンで処置されたトランスフェクションされた細胞を用いて得られた結果を第14図ｂに要約する。即ち、ステロイドがこれらの細胞におけるCAT活性の血清により媒介された増大を完全に阻止するとが判明した。更に、デキサメタゾンはまた、未処置の対照線維芽細胞における低い基礎NGF遺伝子活性も抑制した（約40％）（第14 ｂ図）。IL-1刺激された線維芽細胞を使用して行われた実験では、デキサメタゾンがIL-1により誘発されたNGF遺伝子活性の増大も中和することが判った。これらの結果は、デキサメタゾンが遺伝子レベルでNGF-mRNA発現を効果的に調節することを示している。

(3)論考クルココルチコイドホルモンが特異的遺伝子の発現を刺激（Yamamoto, K. R., 1985,Annu. Rev. Genet. 19:209-252）、若しくは阻害する（Akerb lom, I. E., Slater, E.P., Beato, M., Baxter, J,D.,およびMellon, P.L., 1988, Science 241: 350-353）して多くの生理学的結果を招くことは周知である。特に、グルココルチコイドはヒトおよび実験動物における重要な抗炎症剤および免疫調節剤として作用する。例えば、グルココルチコイドはタンパク質リポコルチン-1(1ipocortin-1）の産生を誘発し（Flower, R.J.およびBlackwell,G.J. ,1979, Nature 178:456-459）、そしてこのことによりホスホリパーゼA2活性の阻害を生じ、そして炎症メジエーター、例えばプロスタグランジンおよびロイコトリエン産生の低下を招く。逆に、リンフォカインであるインターロイキン-1(IL-1) (Dinarello, C.A.,(1984), Rev. Infect. Dis. 6:51-87）は、プロスタグランジンの放出を増強させること（Dayer, J.-M., Goldring, S.R., Rob inson, D.R.およびKrane, S.M., 1979, Biochem. Biophys. Acta 586:87-105）およびホスホリパーゼA2を活性化すること（Chang, J. Gilman, S.およびLewis, A. J., 1986, J.Immunol. 136:1283 -1287）が知られている。従って、多くの系においてグルココルチコイドはIL-1の作用を相殺し、そして活性化されたマクロファージからのIL-1の放出を抑制する（Snyder, D.S.およびUnanue, E.R., 1982, J. Immunol. 129:1803-1805）。

最近本発明者等は、デキサメタゾン（dexa）が培養された坐骨線維芽細胞におけるIL-1により媒介されたNGF-mRNAレベル増大を阻止することを示している（Lindholm, D., Heumann, R., Hengerer, B.およびThoenen, H., 1988, J.Biol, Chem. 263::16348-16351）。しかしながら、NGF-mRNAに及ぼすデキサメタゾンのこの抑制効果に関するメカニズムは不明であり、そしてデキサメタゾンにより誘発されるリポコルチンによるホスホリパーゼA2の阻害を主に含むと考えられた（Lindholm, D., Heumann, R., Hengerer, B.およびThoenen, H., 1988, J. Biol, Chem.263::16348-16351）。

更に、グルココルチコイドがマウスL 929細胞におけるNGF-mRNAレベルを迅速に低減させることも最近報告されている（Winon, D., Houlgatte, R., およびBrachet, P., 1986, Exp. Cell. Res. 16 2:562-565; Siminoski, K., Murphy, R.A., Ren nert, P.およびHeinrich, G., 1987, Endocrinol ogy 121:1432-1437）。現在の研究においては本発明者等は、グルココルチコイドホルモンがNGF発現を抑制するメカニズムをより詳細に研究している。

その結果は、デキサメタゾンによる処置によりインビボ及びインビトロの両方において坐骨神経の NGF-mRNAレベルの低下を生ずることが示される。

更に、トランスフェクション実験に示される通り、デキサメタゾンの作用は主としてNGF転写の阻害によるものである。

この研究において、本発明者等はグルココルチコイドホルモンがNGF発現の有効な調節剤であり、インビボおよびインビトロの両方でNGF-mRNAのレベルを減少させることを示している。従って、デキサメタゾンがラット坐骨神経における損傷媒介 NGF-mRNA増大を弱め、そして培養された坐骨線維芽細胞におけるNGF-mRNAのレベルを低下させることを見出した。更に、NGF-mRNAレベルの増大を抑制することが観察されているデキサメタゾンが、星状細胞におけるNGF発現を抑制することが見出されている。NGF-CAT遺伝子構成物によるトランスフェクション研究の結果により、デキサメタゾンがNGF遺伝子の転写を効果的に阻害することが示された。この結果により更に、NGF転写のグルココルチコイドホルモン媒介による阻害に必要とされる配列がNGFプロモーターの2.klb内にあることが示された（以下参照）。

本発明者等は、IL-1が培養された線維芽細胞におけるNGF-mRNAの安定性を高めそしての転写を増強しうることを先に報告している（Lindholm,D., Heumann, R., Hengerer,B.およびThoenen, H., 1988, J.Biol, Chem.263::16348-16351）。ここに示される通し、デキサメタゾンはこれらの細胞におけるIL-1-媒介NGF-mRNA増大を部分的に阻止することができる。加えて、デキサメタゾンは、トランスフェクションされたNGF-CAT遺伝子構成物を用いて、IL-1によるNGF遺伝子の転写活性を阻害することも示された。本発明者等は先に、デキサメタゾンによる長時間（20時間）の予備処置が線維芽細胞NGF-mRNAのIL-1-媒介増大を完全に阻害したことを観察した（Lindholm, D., Heuman n, R., Hengerer, B.およびThoenen, H., 1988, J.Biol. Chem. 263::16348-16351）。第12図に示される通り、デキサメタゾンによる３時間後の線維芽細胞におけるNGF-mRNAの低下は約70％であり、このことは長時間のステロイド処置がNGF発現の阻害により効果的でさえあることを示唆している。

また、デキサメタゾンは培養された線維芽細胞の血清処置後に観察されるngfA-mRNAレベルの増大も低下させた。血清がマウスL-細胞（Wion, D., Ho ulgatte, R., Barbot, N., Barrand, P., Dicou, E.およびＢｒａｃｈｅｔ，Ｐ．，１９８７，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４９：５１０−５
１４）およびラット星状細胞（Furukawa, S., Furukawa, Y., Satoyoshi, E.およびHayashi, K., 1987,Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:395-402）におけるNGF合成を増大させることは早期に示されている。本発明者等は、GATレセプター遺伝子によって説明される通り（第４図）、血清の作用がRNA合成（アクチノマイシン-D-感受性）に依存し、そして転写を包含することを見出した。血清は、数多くの異なる成長因子を含有しており、そして種々の組合せは本明細書においてはこれ以上分析されなかった。

しかしながら本発明者等は、血小板由来生長因子がラット坐骨神経におけるNGF発現を増大させることを先に示している（Lindholm, D., Heumann, R., Meyer, M.およびThoenen, H.,1987, Nature 330:658-659）。

先の研究では、グルココルチコイドホルモンがマウス乳癌ウイルス（Chandler, V.L., Mater, B. A.およびYamamoto, K.R., 1983, Cell. 33:489-4 99）およびメタロチオネイン（Karin, M., Haslin ger, A.,Holtgreve, A., Richards, R.J., Kraut or, P., Westphal, H.M.およびBeato, M, 1984, Nature 308:513-519）を含む種々の遺伝子の転写を明確に調節しうることが示されている。分子研究では、グルココルチコイド-レセプター複合性が、転写のグルココルチコイドモジュレーションにおける増強剤として作用するグルココルチコイド応答性エレメント（GRE）と呼ばれる特異的なDN A配列に結合することが示されている（Yamamoto, K.R., 1985, Annu. Rev. Genet. 19:209-252; Tsai, S.Y., Garlstedt-Duke, J., Weigel, N.L., Dahlman, K.,Gustafsson, J.A., Tsai, M.J.およびO'Malley, B.W., 1988,Cell 55:361-369）。

しかしながら、グルココルチコイドは転写後の事象にも影響することができ、そして例えばこのホルモンが成長ホルモンをコードするmRNAの安定性を増大させることが示されているが（Peak, I.およびAxel, R., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1496- 1507）、グルココルチコイドはまたこの遺伝子の転写も増強することができる（Slater, E.P., Rab enau, O., Karin, M., Baxter, D.およびBeato, M, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:2984-2922.a）。

同様に、グルココルチコイドは、おそらくIL-1a 遺伝子の転写阻害およびIL-1mRNAの安定性の減少の両方を含むメカニズム（Slater, E.P., Raben au, O., Karin, M., Baxter, D.およびBeato, M, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:2984-2922.a;Lee, S. W.,Tsou, A.P., Chan, H., Thomas, J., Petrie, K., Eugui, E.M.およびAllison, A.,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:1204-1208）により、活性化されたマクロファージおよび単球による（S nyder. D.S.およびUnanue, E.R., 1982, J. Imm unol. 129:1803-1805）、IL-1aの放出を阻害することが知られている。更に、グルココルチコイドは、メタロプロテアーゼ、ストロメリシン（strom elysin)(Frisch, S. M.およびRuley, H.E., 198 7, J. Biol. Chem. 34:16300-16304）およびコラーゲンIUおよびIV型に関する遺伝子（Weiner, F.R., Gzaja. M.J., jefferson, D.M., Giambrone, M.A Tur-Kaspa, R., Reid., L.M.およびZern, M., 19 87, J. Biol. Chem. 262:6955-6958）の転写も阻害することが報告されている。

最近、グルココルチコイド-レセプター複合性がおそらくある種の正に作用する転写因子の結合を妨害することによつてヒトグルココルチコイドホルモンアルファサブユニットの転写を阻害することが示されている（Akerblom, I.E., Slater, E.P., Beato, M., Baxter. J.D.およびMellon, P.L., 1988, Science 241:350-353）。本研究において本発明者等は、グルココルチコイドが主として転写を阻害することによつて線維芽細胞におけるNGFの発現をダウンレギュレートさせることを示している。

実施例３：腫瘍細胞増殖因子−βはラットの中枢神経系における神経成長因子の発現を刺激する。

(1)材料および方法 (1.1)材料ブタの血小板ＴＧＦ−β１および中和性抗−ＴＧＦ−β抗体はＲ＆Ｄ Systems Inc.から入手した。

(1.2)動物および細胞培養物の処置両性のWistarラットを用いた。ＴＧＦ−β１（2 -10ng）を８日令の動物に側脳室内注射した。対照動物には同量の付形剤を与えた。星状細胞は新生ラットの脳から調製しそして10％（v/v）ウシ胎児血清を補添したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した（Sprangerら、1990、 Eur.J.Neurosci. 2:69-76）。混入するミクログリア細胞および寡突起神経膠細胞は集密的培養物から振盪により除去しそして培養物の純度を染色により評価した（Sprangerら、1990,Eur.J.Neurosci. 2:69-76）。ミクログリア細胞は非特異的エステラーゼを用いて染色することにより認識した。

(1.3)ＲＮＡ調製およびノーザンブロットＲＮＡは培養星状細胞および成体ラットの種々の脳領域から調製しそして定量的ノーザンブロット分析に供した（Lindholmら、1988,J.Biol.Chem. 263:16348-16351;Heumann, R.およびThoenen, H.,1986, J. Biol. Chem. 261:9246-9249）。電気泳動およびナイロンフィルターへのＲＮＡのブロッティングに続き、先に記載したように^３２Ｐ標識相補性ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プローブを用いてハイブリッド形成させた。フィルターを洗浄し、Ｘ線フィルムに露出させそして存在する特異的な転写物（ＮＧＦまたはＴＧＦ−β）の量をオートラジオグラムのレーザー走査により測定した。ＮＧＦ−ｃＲＮＡプローブはpGemベクター中に挿入されたマウスＮＧＦ−ｃＤＮＡクローンのライオン（run-on）転写から得た（Heumann, R.および Thoenen, H.,1986, J. Biol. Chem. 261:92 49）マウスＴＧＦ−β１のｃＤＮＡはF.Lee博士、 DNAX Inc., California、からの好意により提供され、そしてＳＭＡ１フラグメントはブルースクリプトベクター中にサブクローンした。ＴＧＦ− β２リボプローブはヒトＴＧＦ−β２−ｃＤＮＡ（deMartin等、1987, EMBO J. 60:3673-3677）を用いて得られそしてＴＧＦ−β３特異的リボプローブは単離したマウスＴＧＦ−β３ゲノムクローンから構築した。

(1.4)ＤＮＡ構築物および星状細胞のトランスフェクションＮＧＦ遺伝子のプロモーター領域をBalb／ｃマウスゲノムライブラリーから単離しそして2.1kb HincII／PvuIIフラグメントを配列決定し、ＣＡＴ発現ベクターpBLCAT3にサブクローンしそしてトランスフェクション調査に用いた（Hengererら、 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3899）。

マウスＴＧＦ−β１のプロモーター領域を単離するには、マウスＴＧＦ−β１（Derynckら、1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379）に関し知られた配列に従って合成された２種の30量体オリゴヌクレオチドを用いてマウスライブラリーを選抜した。

2kbゲノムクローンを配列決定しそして1.8kb XbaI／BalIIフラグメントをpBLCAT3ベクター中にサブクローンした。マウスＴＧＦ−β３をヒトＴＧＦ−β３ｃＤＮＡに関して入手しうるデータ（Derynckら、1988, EMBO J. 7:3737-3743; ten Dijkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 4715-4719）を用いて単離した。ラット星状細胞を先に記載の適当なプラスミド10μｇで一夜トランスフェクションさせた（Hengererら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3899）。細胞を洗浄しそして２ngＴＤＦ−β１の存在下もしくは非存在下に１％（v/v）ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で24時間インキュベートした。同量のタンパク質を用いて細胞抽出物中のＣＡＴ活性を測定した（Hengererら、1990, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3899）。対照およびＴＧＦ−β処置星状細胞（６時間）から単離された核を先に記載されたようにインキュベートした（Lindholmら、 1988, J. Biol. Chem.263:16348-16351）。次に標識された新生ＲＮＡをナイロンフィルター上にスポットされた過剰のｃＲＮＡハイブリッド形成させた（Lindholmら、1988, J. Biol. Chem.263: 16348-16351）。

(2) 結果 (2.1)星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＴＧＦ−βの作用げっ歯動物脳から調製された星状細胞培養物はＮＧＦを合成し培地中に放出し（Lindsay, R.M., 1979, Nature 282:80-82）そしてこれら細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルはＩＬ−１およびＦＧＦのような種々のサイトカインおよび成長因子により影響される（Sprangerら、1990,Eur.j.Neurosci. 2:69-76）。しかしながら星状細胞で検査されたすべての因子のうち、血清中に存在するＴＧＦ−β １（Childsら、1982, Proc. Natl. Acad. Sci.U. S.A. 79:5312-5316）がＮＧＦ−ｍＲＮＡを最も増大させた。第15図に示されるように、ＴＧＦ−β １は星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡを著明に（50 倍）高め（レーン２）、そしてこの刺激は抗−ＴＧＦ−β抗体により事実上消滅した（第15図、レーン３）。アクチノマイシンＤおよびシクロヘキシミドもＴＧＦ−β１の媒介によるＮＧＦ−ｍＲＮＡの増大を阻止し、このことはＲＮＡおよびタンパク質合成の両方が刺激に関与していることを示唆している（第15図、レーン５および６）。

シクロヘキシミドのみが星状細胞のＮＧＦ−ｍＲＮＡをわずかに高めた。ＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすシクロヘキシミドのこの安定化作用は培養ラット線維芽細胞でも以前に観察された（Lindholmら、 1988, J. Biol. Chem. 263:16348-16351）。第16 ａ図はＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＴＧＦ−β１の認識可能な作用はすでに0.2ng／mlのＴＧＦ−β １で存在することおよび約５ng／mlでプラトーに達することを示している。さらに、ＴＧＦ−βで刺激された星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルは24時間のインキュベーションで最大に達しその後わずかに低下した（第16ｂ図）。ＴＧＦ−β１はまた培地中に放出されるＮＧＦ量も増大させた。

ＴＧＦ−β１に対する相同タンパク質であるＴＧＦ−β２は（deMartinら、1987, EMBO J.60:3673 -3677）星状細胞中におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルをＴＧＦ−β１と同程度に増大させた。

(2.2)ＴＧＦ−β１はＮＧＦ遺伝子の転写を増大させるＴＧＦ−β１がＮＧＦ遺伝子の転写を高めるか否かを判定するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子に連結されたＮＧＦプロモーターを含有するＤＮＡ構築物で星状細胞をトランスフェクションさせた。第17図はＴＧＦ−β１がトランスフェクションされた細胞のＣＡＴ活性を増大させることを示しており、このことはＴＧＦ−β１によるＮＧＦプロモーター活性の刺激を表わしている。

ＴＧＦ−β１処置に続くＮＧＦ遺伝子の転写増強を示すこれらの結果は、対照およびＴＧＦ−β１刺激星状細胞からの核を用いる核ライオン実験でさらに実証された。第18図で示されるように、ＴＧＦ−β１はＮＧＦ、ｃ−fosおよびβ−アクチン（actin）の転写物の核標識を増大させたがｃ− mycのそれは高めなかった。

(2.3)グリア細胞におけるＴＧＦ−β−ｍＲＮＡの発現ＴＧＦ−βは非常に多種類の細胞により合成されることが知られているので（Spornら、1987, J. Cell. Biol. 105:1039-1045）、培養星状細胞がＴＧＦ−β１−ｍＲＮＡを発現するか否か検べた。第19図は対照ラット星状細胞がＴＧＦ−β １をコードするｍＲＮＡ（２種の転写物すなわち 2.5kbおよび1.9kbが存在する）を低レベルで含有すること（Derynckら、1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379）およびＴＧＦ−β１それ自体がこれら細胞中のＴＧＦ−β１−ｍＲＮＡを高めることを示している（第19図、レーン３）。星状細胞におけるＴＧＦ−β１によるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの増大の時間的経過はこの因子によるＮＧＦ− ｍＲＮＡの刺激に関してみられたと同様であった。

同じく、ＣＡＴレポーター遺伝子に連結されたマウスＴＧＦ−β１プロモーター領域を含有する構築物を用いるトランスフェクション実験では、ＴＧＦ−β１もＴＧＦ−β１転写を刺激することが示された（第19ｂ図）。第20図に示されるように、ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−β遺伝子族のもう一つの構成員であるＴＧＦ−β３のrhwｍＲＮＡレベルをも高めた（Derynckら、1988, EMBO J. 7:3737- 3743;ten Dijkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. 85:4715-4719）。しかしながら、ＴＧＦ−β２− ｍＲＮＡは対照においてもまた刺激された星状細胞培養物中においても検出されなかった。さらに培養物中のミクログリア細胞もＴＧＦ−β１−ｍＲＮＡを比較的多量に発現することが判った。

(2.4) インビボにおけるＴＧＦ−β１の作用培養ラット星状細胞で得られた結果を実証するために、ラット脳へのＴＧＦ−β１の注射が及ぼす作用について調べた。第21図は脳室に注射されたＴＧＦ−β１がたとえ星状細胞培養物におけるより程度は低くてもラット海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを増大させた（約３倍）ことを示している。

(3)論考前記した結果はラットＣＮＳにおけるＮＧＦ合成の調節におけるＴＧＦ−βの役割を裏書きするものである。ＴＧＦ−β１もＴＧＦ−β２も培養ラット星状細胞におけるＮＧＦ発現を50倍高め、そしてＴＧＦ−β１はインビボでラット海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルをも高めた。ＴＧＦ−βによる星状細胞ＮＧＦ−ｍＲＮＡの増大が転写の増強から生ずることは、ＮＧＦプロモーター／ＣＡＴレポーター遺伝子構築物を用いるトランスフェクション研究および対照およびＴＧＦ−β処置細胞からの核を用いる核ライオン研究で示された。

ＮＧＦ合成の活性化と同様にＴＧＦ−β１は星状細胞におけるそれ自身の発現をも増大させそしてＴＧＦ−β３−ｍＲＮＡを付加的に高めた。ＴＧＦ−β１発現のオートクリン刺激は最近星状細胞以外の細胞で報告されている（Van Obberghen- Schillingら、1988, J. Biol.Chem. 263:7741- 7746）。ＴＧＦ−βがＮＧＦ転写を増強するメカニズムははっきりしないが、ＴＧＦ−βは星状細胞のｃ−fos発現をも高め、そして本発明者らはＮＧＦプロモーターが転写調節に関与するＡＰ− １結合部位を含有することを最近示している（Hen- gererら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3899）。

ＴＧＦ−β１は線維芽細胞の足場依存性増殖を誘発させるタンパク質としてもともと同定された（Robertsら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 78:5339-5343）。続く研究はＴＧＦ−β１が多種類の生物学的作用を示し、このタンパク質が血小板および骨組織に特に豊富にあることが示されている（Spornら、1987, J. Cell. Biol. 105: 1039-1045;Massague, J.,1987,Cell 49:437-438）。

しかしながら、脳におけるＴＧＦ−β１の存在およびそれが果たす可能性のある役割は完全には調べられていない。先に、Robertsら、（1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:5339-5343）はウシの脳の酸−エーテル抽出物中におけるＴＧＦ−β １タンパク質の存在について報告したが、in situ ハイブリッド形成を用いる最近の研究の結果ではＴＧＦ−β１の転写物はマウスの脳には存在しないかまたは非常に低レベルでしか存在しないことが示された（Wilcox, J.N.およびPerynck, R.,19 88, J.Neurosci. 80:1901-1904）。しかしながら我々は最近になって、ノーザンブロット分析を用いて、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３−ｍＲＮＡの両方がラットの脳の全領域に低レベルで存在することを観察したが、これらｍＲＮＡを発現する細胞はまだ確認されていない。興味あることに、星状細胞と並んでミクログリア細胞も（少なくとも培養物中で）ＴＧＦ−β１−ｍＲＮＡを比較的多量に発現する。末梢マクロファージは先にＴＧＦ−β１を不活性形ではあるが生成することが示されている。

結論として、ＴＧＦ−β１は培養物中において星状細胞のＮＧＦ発現を刺激しそしてインビボでラット海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを増大させることが観察されている。以前に示されているとおり、ラットの脳へのＩＬ−１の注射によっても海馬のＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルが高まった（４〜倍）。ＩＬ−１は損傷後の脳組織で増大することが示されており（Giulian, D.およびLachman, L,B., 1985, Science 228:497-499）、そして我々はＴＧＦ−β１−ｍＲＮＡも脳損傷後に増大するという証拠を最近得た。このように、両サイトカインは向神経因子の産生を増大させることにより損傷した脳における重要な役割を果たしている可能性が最も高く、それにより損傷された応答性ニューロンの保護をもたらすのであろう。

本発明は、ここに記載される特定の実施態様によりその範囲に限定されるものではない。事実、本明細書に記載されたものに加えて本発明の種々の変更態様が、上記の記載並びに添付図面から当業者に明らかであろう。かかる変更態様は、特許請求の範囲の範囲内に該当することが意図される。

【図面の簡単な説明】

第１図はビメンチン(a)およびＧＦＡＰ(c)に対するマウスモノクローナル抗体を用いた精製星状細胞培養物の免疫細胞化学的特性決定を示す、(b)および(d)は無染色。第２図は(a)マウスモノクローナル抗体０４および抗−Thy1.1を用いた、および(b)非特異的エステラーゼ反応についてテストした。非星状細胞の免疫細胞化学的特性決定を示す。(b)および(d)は無染色。第３図はin situハイブリッド形成を示すものである、混合ラット脳一次培養物(a)、染色細胞(b) ＮＧＦ−ｍＲＮＡのin situハイブリッド形成オートラジオグラフを示す。第４図は精製星状細胞培養物におけるウシ胎児血清のＮＧＦおよびＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用を示す。第５図は精製星状細胞培養物におけるＥＧＦ，ＴＧＦ−α，ＦＧＦ，ＩＬ−１β，ノルエピネフリン（ＮＥ）および８−ブロモ−ｃＡＭＰのＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用を示す。第６図はＩＬ−１βインキュベートした星状細胞培養物中におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを示す。第７図は星状細胞培養物におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼすＴＧＦ−β１の作用を48時間にわたり示す。第８図は星状細胞培養物におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす種々の濃度のＴＧＦ−β１の作用を示す。第９図はＩＬ−１βおよび種々の増殖因子とインキュベートした星状細胞培養物中におけるＮＧＦレベルを示す。第10図はＴＧＦα、ＦＧＦ、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−１βの脳室内注射８時間後のラット海馬に於けるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルを示す。第11図は損傷後の坐骨神経および培養物中の神経セグメントにおけるＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルの変化およびデキサメタゾンの作用を示す。Ｃ：対照、無処置ラット；Ｄ：デキサメタゾン−処置ラット；Ｌ：神経損傷；Ｌ＋Ｄ：デキサメタゾン処置後、神経損傷；Ｓ：血清存在下でインキュベートした神経セグメント；Ｓ＋Ｄ：血清およびデキサメタゾンと培養した神経セグメント；Ｍ：培血（ＤＭＥＭ）のみで、無血清で培養した神経；Ｍ＋Ｄ：デキサメタゾン存在下にＤＭＥＭ中で培養した神経セグメント。第12図は培養した線維芽細胞におけるＮＧＦ− ｍＲＮＡレベルに及ぼすデキサメタゾンの作用を示す。レーン１：対照、無処理細胞；レーン２：デキサメタゾン処理細胞；レーン３：ＩＬ−１処理細胞；レーン４：ＩＬ−１およびデキサメタゾンを一緒に添加；レーン５−６：血清処理細胞；レーン７：血清およびデキサメタゾン共存。第13図は線維芽細胞におけるデキサメタゾンのＮＧＦ−ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用の時間的経過を示す。ラット坐骨神経線維芽細胞を低血清に保ち、10 ％ウシ胎児血清を加えてＮＧＦ−ｍＲＮＡを誘導する。デキサメタゾン（１μＭ）も血清と同時にかまたは血清添加後時間を改めて添加した。総インキュベーション時間４時間の後、細胞のＲＮＡを抽出してノーザンブロットにより分析した。オートラジオグラムではＮＧＦ−ｍＲＮＡの存在および標準として用いられるそれより低いＮＧＦ転写物の存在が示される（材料および方法の項参照）。レーン１：対照；レーン２：血清のみ４時間；レーン３：血清とデキサメタゾンを同時に添加；レーン４：血清添加１時間後デキサメタゾン添加；レーン５：血清添加２時間後デキサメタゾン添加；レーン６：血清添加３時間後デキサメタゾン添加；レーン７：低濃度のデキサメタゾン（0.01μＭ）を血清と同時に添加。第14図はトランスフェクションされた坐骨神経線維芽細胞におけるデキサメタゾンのＮＧＦプロモーター活性に及ぼす作用を示す。第14ａ図は血清およびデキサメタゾンを用いた代表的実験のオートラジオグラムを示す。第14ｂ図は三つの独立した実験の結果をまとめて示す。Ｍは培地（ＤＭＥＭ）のみで培養された線維芽細胞、Ｓは血清とインキュベートした線維芽細胞である。Ｓ＋Ｄは血清およびデキサメタゾンと培養した線維芽細胞、そしてＭ＋Ｄはデキサメタゾン存在下ＤＭＥＭ中でインキュベートした線維芽細胞である。第15図は星状細胞中のＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＴＧＦ−β１の作用を示す。レーン１：対照レーン２：ＴＧＦ−β１レーン３：抗−ＴＧＦ−β−抗体の存在下におけるＴＧＦ−β１レーン４：シクロヘキシミド（10φg/ml）レーン５：ＴＧＦ−β１とシクロヘキシミド（10 φg/ml）レーン６：アクチノマイシンＤ（10φg/ml）とＴＧＦ−β１第16図は星状細胞中におけるＴＧＦ−β１によるＮＧＦ−ｍＲＮＡ誘導の時間的経過および薬量応答関係を示す。第16ａ図：ＮＧＦ誘導の時間的経過第16ｂ図：薬量応答曲線第17図はトランスフェクションされたラット星状細胞中のＮＧＦプロモーター活動に及ぼすＴＧＦ−β１の作用を示す。Ｃ：対照Ｂ１：ＴＧＦ−β１とインキュベートした星状細胞第18図は星状細胞の核標識に及ぼすＴＧＦ−β １の作用を示す。Ｂ１：ＴＧＦ−β１転写物ＮＧＦ(+)：アンチセンスＮＧＦＮＧＦ(-)：センスＮＧＦ転写物第19図はラット星状細胞中のＴＧＦ−β−ｍＲＮＡの存在および刺激を示す。第19ａ図：ＴＧＦ−β１遺伝子転写に及ぼすＴＧＦ−β１の作用Ｃ：対照Ｂ１：ＴＧＦ−β１第20図は星状細胞のＴＧＦ−β３に及ぼすＴＧＦ−β２の作用を示す。第21図はラットの海馬におけるＮＧＦ−ｍＲＮＡに及ぼすＴＧＦ−β１注射の作用を示す。

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【手続補正書】

【提出日】平２．１０．２５

【特許請求の範囲】

【請求項５７】ヒト以外のトランスジェニック動物で
ある請求項53記載の生物。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平４．８．５ (3)明細書第１００頁第６〜７行目「示す。(b)および
(d)は無染色。」を「示す生物の形態写真であり、(b)および(d)
は無染色を示す生物の形態写真である。」と補正する。同頁第１０行目「テストした。非星状……」を「テストした生物の形態を示す写真である。非星状……」と補正する。同頁第１２行目「染色。」を「染色を示す生物の形態写真である。」と補正する。同頁第１６行目「−トラジオグラフを示す。」を「−ト
ラジオグラフを示す生物の形態写真である。」と補正す
る。同１０２頁下から第５行目「示す。」を「示す電気泳動写真である。」と補正する。同１０３頁第６行目「過を示す。」を「過を示す電気泳動写真である。」と補正する。同１０４頁第８行目「オートラジオグラムを示す。」を「オートラジオグラムを写す電気泳動写真である。」と補正する。同１０４頁下から第２行目「……の作用を示す。」を「……の作用を示す電気泳動写真である。」と補正す
る。同１０５頁下から第５行目「……の作用を示す。」を
「… …の作用を示す電気泳動写真である。」と補正する。同１０６頁第１行目「……の作用を示す。」を「……の
作用を示す電気泳動写真である。」と補正する。同頁第６行目「……および刺激を示す。」を「……およ
び刺激を示す電気泳動写真である。」と補正する。同頁第１２行目「作用を示す。」を「作用を示す電気泳
動写真である。」と補正する。同頁第１４行目「……作用を示す。」を「……作用を示
す電気泳動写真である。」と補正する。 (4)図面の第１〜３，１２〜１４Ａ，１５，１７〜２１
図（内容に変更なし。）

フロントページの続き (72)発明者ハンス・フリードリツヒ・エルヴイン・テーネンドイツ連邦共和国 8000ミユンヘン40・クレプリン４アー (72)発明者バステイアン・ヘンゲラードイツ連邦共和国 8032グラーフエルフイング・アム・ヴアツサーボーゲン39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効量のサイトカインを被検者に投与す
ることからなる被検者の中枢神経系における神経成長因子のレベルを調節する方法。
【請求項２】神経成長因子のレベルが高められる請求
項１記載の方法。
【請求項３】被検者が神経障害を有する請求項２に記
載の方法。
【請求項４】神経障害が痴呆からなる請求項３に記載
の方法。
【請求項５】神経障害がアルツハイマー病からなる請
求項３記載の方法。
【請求項６】神経障害が外傷による神経系への損傷か
らなる請求項３記載の方法。
【請求項７】神経障害が虚血による神経系への損傷か
らなる請求項３記載の方法。
【請求項８】神経障害が有毒薬剤による神経系への損
傷からなる請求項３記載の方法。
【請求項９】神経障害が感染による神経系への損傷か
らなる請求項３記載の方法。
【請求項１０】神経障害が悪性腫瘍による神経系への
損傷からなる請求項３記載の方法。
【請求項１１】神経障害が神経変性性障害からなる請
求項３記載の方法。
【請求項１２】神経障害が先天性障害からなる請求項
３に記載の方法。
【請求項１３】神経障害が学習性障害からなる請求項
３に記載の方法。
【請求項１４】サイトカインがインターロイキン−１
である請求項２記載の方法。
【請求項１５】サイトカインが線維芽細胞増殖因子で
ある請求項２記載の方法。
【請求項１６】サイトカインが腫瘍増殖因子アルファ
である請求項２記載の方法。
【請求項１７】サイトカインが腫瘍増殖因子ベータで
ある請求項２記載の方法。
【請求項１８】サイトカインが血小板由来成長因子で
ある請求項２記載の方法。
【請求項１９】サイトカインが表皮増殖因子である請
求項２記載の方法。
【請求項２０】サイトカインがインシュリン様成長因
子Ｉである請求項２記載の方法。
【請求項２１】サイトカインがインシュリン様成長因
子IIである請求項２記載の方法。
【請求項２２】投与の方法が脳室内注射からなる請求
項14、 15、16または17記載の方法。
【請求項２３】神経成長因子のレベルが低下される請
求項１記載の方法。
【請求項２４】被検者が神経障害を有する請求項23項
記載の方法。
【請求項２５】神経障害が神経変性性障害からなる請
求項24 項記載の方法。
【請求項２６】神経成長因子のレベルを変えるもので
あるサイトカインのレベルを変える物質の有効量を被検者に投与することからなる、該被検者の中枢神経系における神経成長因子のレベルを調節する方法。
【請求項２７】神経成長因子のレベルが高められる請
求項26 記載の方法。
【請求項２８】神経成長因子のレベルが低下される請
求項26 記載の方法。
【請求項２９】被検者が神経障害を有する請求項27ま
たは28 記載の方法。
【請求項３０】該物質がインターロイキン−１の阻害
剤である請求項29項記載の方法。
【請求項３１】該物質がグルココルチコイドである請
求項30 に記載の方法。
【請求項３２】該物質がデキサメタゾンである請求項
31記載の方法。
【請求項３３】 (A)ＮＧＦプロモーターまたはその応答性部分、および (B)関心のあるタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含有する組換え構築物をＮＧＦの発現を調節する物質に露出させることからなる、関心のあるタンパク質またはペプチドの発現を制御する方法。
【請求項３４】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＮＧＦである請求項33記載の方法。
【請求項３５】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＢＤＮＦである請求項33記載の方法。
【請求項３６】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＣＮＴＦである請求項33記載の方法。
【請求項３７】関心のあるタンパク質またはペプチド
がニューロトロフイン（neurotrophin）-3（ＮＴ−３）である請求項33記載の方法。
【請求項３８】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＮＧＦの少なくとも約６個のアミノ酸と相同のペプチドまたはタンパク質である請求項33記載の方法。
【請求項３９】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＢＤＮＦの少なくとも約６個のアミノ酸と相同のペプチドまたはタンパク質である請求項33記載の方法。
【請求項４０】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＮＴ −３の少なくとも約６個のアミノ酸と相同のペプチドまたはタンパク質である請求項33記載の方法。
【請求項４１】関心のあるタンパク質またはペプチド
がＣＮＴＦの少なくとも約６個のアミノ酸と相同のペプチドまたはタンパク質である請求項33記載の方法。
【請求項４２】関心のあるタンパク質またはペプチド
が酵素である請求項33記載の方法。
【請求項４３】関心のあるタンパク質またはペプチド
がコリンアセチルトランスフェラーゼである請求項33 記載の方法。
【請求項４４】ＮＧＦの発現を調節する物質が腫瘍細
胞増殖因子ベータ１である請求項33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42または43記載の方法。
【請求項４５】ＮＧＦの発現を調節する物質がインタ
ーロイキン１である請求項33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42または43記載の方法。
【請求項４６】ＮＧＦの発現を調節する物質が線維芽
細胞増殖因子である請求項33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42または43記載の方法。
【請求項４７】ＮＧＦの発現を調節する物質が腫瘍細
胞増殖因子ベータ２である請求項33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42または43記載の方法。
【請求項４８】ＮＧＦの発現を調節する物質が表皮成
長因子である請求項33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42または43記載の方法。
【請求項４９】ＮＧＦプロモーターまたはその応答性
部分、および神経成長因子以外の関心のあるタンパク質およびペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有してなる組換え核酸分子。
【請求項５０】関心のあるタンパク質またはペプチド
が脳由来の成長因子である請求項49記載の組換え核酸分子。
【請求項５１】関心のあるタンパク質またはペプチド
が毛様体向神経因子である請求項49記載の組換え核酸分子。
【請求項５２】関心のあるタンパク質またはペプチド
がニューロトロフィン−３である請求項49記載の組換え核酸分子。
【請求項５３】請求項49、50、51、または52記載の組
換え核酸分子を含有する生物。
【請求項５４】細菌である請求項53記載の生物。
【請求項５５】酵母である請求項53記載の生物。
【請求項５６】真核生物細胞である請求項53記載の生
物。
【請求項５７】ヒト以外のトランスジェニック動物で
ある請求項53記載の生物。