KR20040010606A - 표적 세포로의 ｄｎａ 도입에 대한 스크리닝 방법 - Google Patents

표적 세포로의 ｄｎａ 도입에 대한 스크리닝 방법 Download PDF

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KR20040010606A
KR20040010606A KR10-2003-7011814A KR20037011814A KR20040010606A KR 20040010606 A KR20040010606 A KR 20040010606A KR 20037011814 A KR20037011814 A KR 20037011814A KR 20040010606 A KR20040010606 A KR 20040010606A
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프란시스케빈피.
도일티모시씨.
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제노젠 코퍼레이션
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Abstract

본 발명은 표적 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법을 제공하는데, 여기에서 방법은 리포터로서 작용하는 광발생 단백질 코딩 서열을 사용한다. 여기에서 설명된 방법의 중요한 장점은 약물 내성 표적 세포 또는 유용한 영양요구성 마커를 갖지 않는 표적 세포가 효과적으로 트랜스포메이션될 수 있다는 것이다. 본 발명은 또한 여기에서 설명된 방법에 의해 제조된 트랜스포메이션된 세포를 포함한다. 광발생 단백질 코딩 서열 변형, 다양한 벡터, 및 본 발명의 트랜스포메이션된 세포의 이용 방법 또한 설명된다.

Description

표적 세포로의 ＤＮＡ 도입에 대한 스크리닝 방법{METHODS OF SCREENING FOR INTRODUCTION OF DNA INTO A TARGET CELL}
외인성 DNA로 성공적으로 트랜스포메이션된 세포를 신속하고 효과적으로 식별하는 검정은 예를 들어, 세포주 및/또는 형질전환 생물의 식별 및 고효율 약물 스크리닝을 포함하는 광범위한 적용에 유용하다. 사실, 외인성 DNA의 삽입은 세포주 또는 형질전환 생물이 약품 개발, 생화학적 경로의 평가, 독성 연구 등을 위한 동물 모델로서 사용될 수 있는가에 대하여 단 한번만 확인된다.
외인성 핵산이 표적 세포내로 도입되었는가를 검출하기 위해 가장 통상적으로 사용되는 방법은, 도입된 DNA에 의해 보충되는 영양적 결핍에 의하거나 또는 약물 내성에 의한 선별에 의한 것이다. 영양요구성 돌연변이체의 보완을 위하여, 수용 세포는 그 유전자 기능이 결핍되어야 한다. 약물 내성을 위하여, 세포는 그 약물에 민감해야 한다. 불행하게도, 다수의 세포 (예를 들어, 병원체)는 약물 선별 기술에 내성을 갖는다.Candida albicans는 예를 들어, 히그로마이신, 베노밀, 시클로헥시미드, 미토마이신 C 및 투니카마이신에 내성을 나타낸다. 이와 유사하게, 다른 병원성 생물 (예를 들어, 메티실린-내성Staphylococcus aureus(MRSA), 및M. tuberculosis의 몇몇 변체)은 평이하게 사용되는 이들 다수의 항생제에 대한 내성을 발달시켰다. 따라서, 이들 세포를 트랜스포메이션하여 성공적인 통합 사건을 검출하는 것은 매우 어려운 것으로 증명되었다.
Staphylococcus aureus(MRSA)의 메티실린-내성 균주는 세계적으로 가장 보편적인 원내 병원균이다. MRSA는 큰 규모의 미국 대학 부속 병원에서 원내 포도상 구균 감염의 40% 이상을 초래한다. 이들은 더 작은 병원에서는 물론이고 (200 내지 500 침상을 갖는 병원에서 20%의 발병율), 사립 요양원에서 우세해진다 (Wenzel et al., 1992, Am. J. Med. 91 (Supp 3B): 221-227). An unusual property of MRSA 균주의 특이한 성질은 화학요법에서 유용한 항생제에 대한 이들 균주의 작은 또는 전무한 감수성을 일으키는 추가적인 내성 인자를 흡수하는 능력이다. 이러한 박테리아의 다중-내성 균주는 세계적으로 널리 퍼져있으며 이들 병원체 중 최악은 가용한 항박테리아제의 하나(즉, 반코마이신)외에 전부에 대하여 내성 기작을 갖는다 (Blumberg et al., 1991, J. Inf. Disease (63: 1279-1285)).
또다른 원내 병원체인Enterococcus faecium은, 그 능력이 하나의 세포로부터 또다른 세포로 반코마이신 내성과 같은 플라스미드-유래 내성 인자를 이동시키는 것으로 공지된다. 내성 인자의 이동을 위한 이러한 기작은 공지된 항생제에 대하여 점점 더 많은 박테리아 내성을 일으킬 것이다. 고수준의 반코마이신 내성을 갖는 E. faecium 균주는 1986년 영국에서 처음 분리되었다. 1990년대에, 반코마이신-내성 장내구균 (VRE)이 전 세계에 걸쳐 퍼져 있는 것으로 보고되었다. 고농도의 앰피실린 또는 겐타마이신, 또는 반코마이신에 대한 내성이 있는 다중약물-내성 균주의 동정은, 심각한 딜레마를 도입한다. 또한, 항생제에 대한 감수성의 부재는, 특히 대부분의 박테리아 트랜스포메이션 벡터가 항생제 내성 선별에 의지한다는 사실의 관점에서, 이들 생물을 조작하는 능력을 크게 방해한다. 항생제 내성에 대한 기초 및 내성 균주의 출현의 더욱 완전한 설명은 문헌에서 찾을 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,136,587 Tomasz, 등. October 24,2000; Ohno, A. 등, Nippon Rinsho (2001) 59 (4): 673-680).
특정 생물에서 효과적인 스크리닝 시스템의 부족은 후보 약물을 스크리닝하는 노력을 심각하게 감약시킬 수 있다. 일부는 면역타협된 환자의 증가하는 수로 인해, 약물-내성 생물로의 감염 및 통상적으로 양성인 생물로의 전신 진균성 감염은 증가하는 추세이고, 예를 들어, 다수의 이러한 감염은 정상 인간 플로라인Candida albicans로 인한 것이다.Candida종은 현재 원내 혈류 감염에 있어서 네번째로 통상적인 원인이다 (Edmond et al. (1999)Clin Infect Dis.29 (2): 239-44). 심각한Candida감염에 걸린 사람 수에서의 증가는 항진균 화합물에 대한 내성 균주의 발생빈도 증가와 같은 정도이다 (White, Marr, et al., (1998)Clin Microbiol Rev11 (2): 382-402). 이를 저지하기 위하여, 새로운 분류의 항진균 화합물 및 그들의 가능한 표적이 연구되어야만 한다.
유전적 접근법을 이용한,Candida albicans에서 항진균 공격을 할 수 있는 새로운 표적의 연구는 몇몇 인자에 의해 방해되어 왔다. 첫째로,Candida albicans로 사용된 플라스미드는 보통 세포 내에 종열 카피로서 존재하고 선택적인 압력없이 빠르게 소실된다 (Cannon et al. (1992)Mol Gen Genet.235 (23): 453-457; Kurtz et al. (1987)Mol Cell Biol.7 (1) : 209-17; Pla et al. (1995)Gene165 (1) : 115-20). 또한,Saccharomyces cerevisiae와는 달리, 어떤 선별없이 유지되는 에피솜 플라스미드를 허용할 수 있는 어떠한 동원체성 서열 및 자동 복제 서열도 클로닝되지 않았다.
C. albicans의 연구 및 효과적인 치료의 생성을 방해한 또다른 인자는 이 생물이 그 생활사 전반에 걸쳐 2배체인 것으로 생각된다는 점이다. 최근에서야 Candida가 접합하도록 강요될 수 있다는 것이 밝혀졌고 (Magee (2000)Science289 (5477): 310-313; Hull et al. (2000)Science289 (5477): 307-310), 4배체 시기를 거칠 수 있다는 것으로 나타났다.S. cerevisiae의 접합 유전자좌와 유사한 유전 요소의 존재는 감수 분열이 1배체 세포를 야기할 수 있다는 것을 제시하였으나, 이러한 1배체 분리가 관찰되지는 않았다. 따라서, 새로운 항진균 표적을 연구하기 위하여, 후보 유전자의 양쪽 염색체 카피 모두는 세포 상에서 그것의 효과를 참조하여 비활성화되어야 한다. 양쪽 카피를 넉아웃 시키기 위하여, "ura 블라스터"라는 구조물이 개발되었다 (Alani (1987)Genetics117 (1) : 5-12; Fonzi et al. (1993)Genetics134 (3): 717-28). 세포는 URA3에 대하여 영양요구성이 되어야 하고, 일반적으로 병독성을 감소시키는 임상적 분리물로부터 영양요구성 균주를 생성하는 것은 이것을 유의하게 또는 전체적으로 폐지한다 (Lay et al. (1998)Infect Immun.66 (11): 5301-6; Kirsch et al. (1991)Infect Immun.59 (9): 3297-300; Polak (1992)Mycoses35 (1-2): 9-16; Cole et al. (1995)FEMS Microbiol Lett.126 (2): 177-80). 독성 균주에서 조차도, URA3 기능의 회복은 필연적으로 야생형 수준까지 병독성을 회복시킬 수 없다는 것이 연구결과 나타났다 (Lay et al. (1998),supra).
세번째 논점은C. albicans에서는 그것의 비정상적인 코돈 사용 (류신 대신 세린을 코딩하는 CTG)으로 인해 매우 적은 수의 이종 유전자가 발현된다는 것이다 (Leuker (1994)Mol Gen Genet.245 (2): 212-7). 이종 유전자가Candida albicans에서 기능적으로 발현되게 하기 위하여, 유전자 내의 모든 CTG 코돈은 다른 류신 코돈으로 돌연변이 되어야 한다 (Morschhauser et al. (1998)Mol Gen Genet.257 (4): 412-20). 따라서, 이들 및 다른 어려움은 URA3 또는 다른 영양 마커가 넉 아웃된 균주를 위한 Candida 유전자의 연구를 제한해 왔다. 다수의 리포터 유전자는 발현을 위해 이들을 돌연변이 유발해야 하는 노력으로 인해 사용되지 않는다.
미국 특허 5,650,135 호에 설명된 방법은, 동물을 절개하거나 또는 그렇지 않으면 개방하지 않고 ("생체내 모니터링") 살아있는 동물에서 생물발광 박테리아의 검출을 가능하게 만드는데, 빛은 고도로 민감한 카메라를 사용하여 근육, 피부, 모피 및 다른 전통적으로 "불투명한" 조직을 통해 검출된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)은C. albicans에서 발현됨에도 불구하고 (Cormack, Bertram, et al., (1997)Microbiology143 (Pt 2): 303-11; Morschhauser, Michel, et al., (1998) Mol Gen Genet 257 (4): 412-20), GFP 생산C. albicans세포는 살아있는 동물 내에서 아직까지 표현되지 않았다. Srikantha 등은 ((1996)J Bacteriol.178 (1) : 121-9)C. albicans에서 바다 팬지인Renilla reniformis의 루시퍼라제 발현을 보고하였으나, 기질인 코엘렌트라진의 비용으로 인해 살아있는 생물에서의 사용은 비실용적이다.
C. albicans외에 다수의 다른 병원성 생물은 대부분 또는 모든 항생제에 대하여 내성이 생겨났고, 그럼으로써 약물 내성 유전자를 포함한 DNA를 도입하고 트랜스포메이션에 사용된 DNA에 의해 부여되는 약물 내성에 대해 선별하는 전통적인 방법에 의한 이들 생물의 트랜스포메이션을 불가능하게 만들거나 어렵게 한다.
따라서, 표적 세포의 트랜스포메이션을 검출하는 방법, 특히 선별가능한 마커를 포함하지 않는 방법에 대한 필요성이 남아있다. 본 발명은 이러한 방법들 중에서도 특히, 시험관내 및 전체 동물 내에서 감염 및/또는 병원론에 관련된 연구에 적합한 병원성 생물 (예를 들어, MRSA, 항생제-내성 박테리아 및Candida albicans)과 같은 발광 생물의 생성에 유용한 발현 카세트, 트랜스포손 카세트 및 다른 도구를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 세포 내로 관심있는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법에 관련되는데 여기에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 식별하기 위해 선별가능한 마커를 사용하기 보다는 광 발생에 대한 스크리닝을 이용한다. 본 발명은또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포는 물론이고, 이러한 세포의 사용에도 관련된다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포는 본 발명의 방법에 의해 트랜스포메이션된 항생제 내성 박테리아, 예를 들어Staphylococcus aureus의 메티실린-내성 균주, 및 반코마이신-내성 장내구균 (VRE) 균주이다.
본 발명의 한 양태는 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법이고, 이것은 표적 세포를 트랜스포메이션하는 방법이다. 이 방법에서 세포의 집단이 제공된다. 세포의 집단은 적어도 세포의 하위집단에 의한 폴리뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에서 관심있는 폴리뉴클레오티드로 처리된다. 관심있는 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질 코딩 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 광발생 단백질 코딩 서열은 루시퍼라제와 같은 생물발광 단백질을 암호화한다. 표적 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 많은 방법이 사용될 수 있고, 이는 지질-중재 이동법 (예를 들어, 중성 및 양이온 지질을 포함하는 리포솜을 이용), 직접 주입법 (예를 들어, 미세주입), 세포 융합법, 미세추진 충격법 (microprojectile bombardment, 예를 들어 DNA 입자 충격과 같은 유전자 방법), (예를 들어, 인산 칼슘, 또는 아세트산 리튬과 함께) 공동-침전법, DEAE-덱스트란- 또는 폴리에틸렌 글리콜-중재 이동법, 및 바이러스 벡터-중재 이동법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포의 집단은 그 다음 관심있는 폴리뉴클레오티드를 흡수한 세포의 하위집단에 대하여 스크리닝 된다. 이들 세포는 관심있는 폴리뉴클레오티드를 포함한 광발생 단백질 코딩 서열을 발현하는 능력에 의해 식별된다. 광발생 세포를 분리한다. 이들 광발생 세포는 폴리뉴클레오티드가 도입된, 즉 트랜스포메이션된 세포이다. 이러한 광발생 세포는 그 다음 예를 들어, 단일 콜로니를 위한 희석 또는 획선에 의해, 광-발생 세포의 실질적으로 순수한 콜로니 (즉, 클론)를 제공하도록 분리된다.
본 발명의 트랜스포메이션 방법에 사용된 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 이러한 광발생 단백질은 예를 들어, 생물발광이거나 형광 단백질일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 생물발광 단백질은 (예를 들어,luc 또는 lux 서열에 의해 암호화되는) 루시퍼라제이다.
어떤 트랜스포메이션이 가능한 세포도 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 전형적으로 이러한 세포는 트랜스포메이션 전에 빛을 방출하지 않지만, 만약 세포가 주어진 파장의 빛을 이미 생산한다면, 상이하고 식별가능한 파장의 빛을 내는 단백질을 생산하는 광발생 단백질 코딩 서열이 이러한 세포를 트랜스포메이션하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 세포는, 원핵 세포 (예를 들어, 그람-양성, 그람-음성 박테리아는 물론이고 다른 원핵 생물), 및 진핵 세포 (예를 들어, Candida 또는 Saccharomyces와 같은 효모; 식물 세포; 동물 세포; 종양 세포; 조직특이성 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 곤충 세포 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 세포의 집단은 예를 들어, Staphylococcus aureus의 메티실린-내성 균주, 및 반코마이신-내성 장내구균 (VRE) 균주와 같은 항생제 내성 박테리아를 포함한다. 표적 세포는, 폴리뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드로 처리한 후, 세포 타입 및 세포가 빛의 생산에 대해 스크리닝될 배지의 종류 (예를 들어, 액체 또는 고체)에 기초된 적절한 스크리닝 밀도로 플레이팅 된다.
본 발명의 한 구체예에서, 세포내로 도입되는 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질을 암호화하는, 프로모터 비함유 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 표적 생물의 게놈에 있는 내인성 프로모터에 인접한, 표적 생물의 게놈 내로 통합된 후 발현된다. 다수의 벡터는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이는 통합 벡터, 트랜스포손 (또는 TY 또는 마리너와 같은 다른 이동성 유전 요소)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또다른 양태에서, 표적 세포 내로 도입되는 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다수의 벡터가 이러한 프로모터-함유 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이는 통합 벡터, 트랜스포손 (또는 TY 또는 마리너와 같은 다른 이동성 유전 요소), 복제 플라스미드, 비-복제 플라스미드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 플라스미드는 예를 들어, 표적 세포의 트랜스포메이션에 사용되는 폴리뉴클레오티드의 충분한 양을 준비하기 위해 세포 타입에서의 통과를 허용하는 셔틀 벡터 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구성체에 사용된 프로모터는 표적 세포에서 기능성이 있다.
광발생 단백질 코딩 서열은 트랜스포메이션된 세포를 스크리닝하는데에 사용되며, 따라서 다른 관심있는 서열이 광발생 단백질 코딩 서열과 (예를 들어, 동일한 벡터 구성체에서) 결합될 수 있다. 관심있는 다른 서열은 광발생 단백질을 발현하는데 사용된 제어 요소의 동일한 세트와 결합될 수도 있고, 대안으로는 이러한관심있는 서열의 발현이 관심있는 서열(군)과 결합된 독립적인 제어 요소에 의해 중재될 수도 있다. 예를 들어, 광발생 단백질 코딩 서열의 발현은 제 1 프로모터에 의해 중재될 수 있고 관심있는 그 이상의 서열의 발현은 적어도 제 2 프로모터에 의해 중재될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 여기에서 설명된 방법에 의해 효모가 트랜스포메이션된다. 예를 들어 Candida 세포의, 효모 트랜스포메이션은 광발생을 향상시키는 배지 상에 플레이팅될 수 있고, 예를 들어 트랜스포메이션된 세포 집단의 스크리닝은 YPD 플레이트 (예를 들어, 50 ug/ml 유리딘으로 보충되고, 600 ug/ml 루시페린을 함유한 SD-ura 플레이트)보다는 SD상에 세포를 플레이팅함으로써 수행될 수 있다. 효모 세포는 물론이고, 다른 타입의 세포 또한 초기 스크리닝을 위한 다양한 농도, 예를 들어, 대략 2.5 x 105세포/140 mm 플레이트의 농도로 플레이팅될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 스크리닝은 고체 배지의 플레이트 상에서 일어난다. 트랜스포메이션된 세포의 분리는 광발생 세포를 포함하는 고체 배지 플레이트의 구역으로부터 세포의 샘플을 채집하는 단계, 액체 배양물 내로 샘플을 접종하는 단계, 액체 배양물에서 세포를 배양하는 단계, 각 액체 배양물의 분주를 광발생에 대하여 평가하는 단계, 광발생 세포를 포함하는 액체 배양물을 식별하는 단계, 액체 배양물을 희석하고 플레이팅하여 분리된 단일 광발생 세포를 얻는 단계, 및 단일 광발생 세포로부터 유래된 단일 콜로니를 식별하는 단계를 포함하는, 다수의 방법으로 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포의 집단 중 트랜스포메이션된 세포의 스크리닝 방법을 제공하는데, 여기에서 방법은 예를 들어, 세포의 집단을 제공하는 단계 (여기에서 상기 세포는 빛을 낼 수 없다), 광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포의 집단을 트랜스포메이션하는 단계, 및 트랜스포메이션된 세포의 집단을 광발생 세포에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하는데, 여기에서 상기 광발생 세포는 트랜스포메이션된 세포이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성되는 트랜스포메이션된 세포 및 그것의 사용을 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 구체예는 여기 개시의 관점에서 당업자에게 손쉽게 발생할 것이다.
본 발명은 일반적으로 외인성 핵산으로 트랜스포메이션된 어떠한 표적 세포 또는 생물을 선별가능한 마커의 필요없이 검출하는데 유용한 조성물 및 방법에 관련된다. 이들 조성물 및 방법은 어떤 트랜스포메이션이 가능한 세포 타입으로의 DNA 도입 및 약물 또는 다른 화합물의 고효율 스크리닝을 위한 이러한 세포의 차후 사용을 허용한다.
도 1은Candida albicans에 있는 코딩 서열의 발현을 위한 루시퍼라제의 부위 특이적 돌연변이 유발에 사용된 상보적인 올리고뉴클레오티드 쌍을 나타낸다.
도 2A 및 2B는Candida albicans의 트랜스포메이션에서의 사용을 위한 루시퍼라제 발현 벡터를 제조하는데에 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 도 2C는 합성 링커 A 및 합성 링커 B의 정렬을 나타낸다.
도 3A, 3B 및 3C는 pGTV-ENO 플라스미드 벡터의 구성을 도식적으로 나타낸다.
본 발명의 실행은, 다른 지시가 없을 경우, 당업계 범위 내에 있는, 화학, 생화학, 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래 기술을 이용할것이다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995)); METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. McPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds., 1995) 및 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney. Ed., 1987)를 참조한다.
본 발명을 상술하기에 앞서, 본 발명은 특정 공식 또는 프로세싱 파라미터에 제한되는 것이 아니며, 이러한 것은 변화할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 여기에서 사용된 술어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위함일 뿐, 제한하도록 의도된 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
정의
본 발명을 설명하는데 있어서, 하기 용어가 사용될 것이고, 아래 지적된 것과 같이 정의되도록 의도된다. 다른 지적이 없으면, 여기에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 업자에 의해 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 단수형은 문맥상 명백하게 다른 것으로 지적되지 않는다면 복수형을 포함한다. 따라서 예를 들어, "항원"은 둘 이상의 이러한 작용인자의 혼합물을 포함한다.
용어 "트랜스포메이션", "트랜스포메이션 방법" 및 "세포의 트랜스포메이션 방법"은 표적 세포가, 트랜스포메이션 후, 핵산 분자를 포함하도록 하기 위해 벡터 구성체와 같은 핵산 분자를 표적 세포 내로 이동 또는 도입시키는 것을 지칭한다.전형적으로 트랜스포메이션 방법은 세포의 집단에 적용되는데 여기에서 세포의 하위집단은 궁극적으로 핵산 분자를 포함한다. 도입된 핵산 분자를 포함하는 세포의 하위집단은 전형적으로, 예를 들어 선별 (예를 들어, 선택 배지 상에서의 성장 능력) 또는 스크리닝 (예를 들어, 도입된 핵산을 포함하는 세포 대 도입된 핵산을 함유하지 않은 세포의 식별을 허용하는 표현형의 발현)에 의해 식별된다. "트랜스포먼트"는 트랜스포메이션에 의해 생성된 세포 (예를 들어, "트랜스포메이션된 세포") 또는 생물이다. 세포 내로의 이러한 핵산 분자의 도입은 "세포성 트랜스포메이션"과 구분하기 위하여 "유전적 트랜스포메이션"으로 지칭될 수 있다. 세포성 트랜스포메이션은 정상 세포가 신생 (또는 종양) 세포로 전환되는 것을 지칭하는데 이 세포는 전형적으로 암유전자의 상이한 분류의 통제 하에서 일어난 사건의 결과로서 발생한다. 구체적으로 다르게 지적되지 않는다면, 여기에서 사용될 때 용어 "트랜스포메이션"은 유전적 트랜스포메이션, 즉 표적 세포로의 핵산 분자의 도입을 지칭한다.
용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 호환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 하나, 또는 그것의 유사체에 있어서, 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 중합체적 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 3차원적 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 또는 공지되지 않은 어떤 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 제한되지 않는 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 어떤 서열의 분리된 DNA, 어떤 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 전형적으로 4가지 뉴클레오티드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T) (폴리뉴클레오티드가 RNA일 때는 티민 (T) 대신 우라실 (U))의 특이적 서열로 구성된다. 따라서, 용어 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표시이다. 이 알파벳 표시는 중앙 처리 장치를 갖는 컴퓨터의 데이터베이스 내로 입력되어 기능 유전체학 및 상동체 검색과 같은 생명정보학에 이용될 수 있다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "암호화"하는 서열은, 숙주 시스템에서 적절한 조절 서열 (또는 "제어 요소")의 통제 하에 놓일 때 (DNA의 경우) 전사되고 (mRNA의 경우) 폴리펩티드로 번역되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노)말단에 있는 시작 코돈 및 3'(카르복시)말단에 있는 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 바이러스, 원핵세포, 또는 진핵세포 mRNA로부터 유래된 cDNA, 바이러스, 진핵세포, 또는 원핵세포 DNA로부터 유래된 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다.
전형적으로 "제어 요소"는 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결 신호, 및 폴리아데닐화 서열과 같은 전사 조절자; 및 번역 개시의 최적화를 위한 서열 (예를 들어, Shine-Dalgarno(리보솜 결합 부위)서열), 및 번역 종결 서열과 같은 번역 조절자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 프로모터는 (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석대상물, 보조인자, 조절 단백질 등에의해 유도되는) 유도성 프로모터, (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석대상물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는) 억제성 프로모터, 및 구조적 프로모터를 포함할 수 있다.
이중-가닥 DNA 분자는 "반대 배향"을 갖는 두 가닥의 DNA를 포함하는데, 한 가닥은 5'에서 3'으로 나타내며; 두번째 가닥은 이것의 보체이다. 따라서, 제 1 가닥에 있는 제 1 코딩 서열 및 상보 가닥에 있는 제 2 코딩 서열은 서로에 대하여 "반대" 배향을 갖는 것으로, 즉 제 1 및 제 2 코딩 서열은 서로에 대하여 반대 배향으로 있다.
"분리된 폴리뉴클레오티드" 분자는 그 분자를 원래 가지고 있는 전체 생물로부터 분리된 핵산 분자이다. 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드는 원래 그것과 정상적으로 결합된 서열의 전부 또는 일부가 결여될 수 있다.
"폴리펩티드"는 가장 넓은 의미로 둘 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티도미메틱스의 화합물을 지칭하도록 사용된다. 서브유닛은 펩티드 결합 또는, 예를 들어 에스테르, 에테르 등과 같은 다른 결합에 의해 연결될 수 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "아미노산"은 자연적 및/또는 비자연적 또는 합성 아미노산을 지칭하며, 이는 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱스를 포함한다.
"작동가능하게 연결된"은 요소의 정렬을 지칭하는데 여기에서 이렇게 설명된 성분은 그들의 일반 기능을 수행하도록 배열된다. 따라서, 코딩 서열 (예를 들어, 리포터 유전자)에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적당한 효소가 존재할시 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있다. 프로모터 또는 다른 제어 요소는, 그들이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작용하는 한, 코딩 서열에 연속적일 필요는 없다. 예를 들어, 전사되었으되 아직 번역되지는 않은 개재 서열은 프로모터 서열 및 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 고려될 수 있다.
여기에서 사용될 때 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 예를 들어, 클로닝, PCR 증폭, 플라스미드 분리, 발현 시스템의 사용 등에 의한, 분자 생물학의 기술을 이용하여 얻는 핵산 분자를 설명한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 사용될 때 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다.
"재조합 숙주 세포", "숙주 세포", "세포", "세포주", "세포 배앙물" 및 단세포체로서 배양된 원핵 세포성 미생물 또는 진핵 세포주를 나타내는 이러한 다른 용어는, 호환적으로 사용되고, 재조합 벡터 또는 다른 이동 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되었던 세포를 지칭하며, 트랜스포메이션 되어있는 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 친세포의 자손은 우연적 또는 계획적 돌연변이로 인해, 형태학적으로나 게놈에 있어서 또는 전체 DNA 보체가 원래 친세포와 완전하게 동일할 필요는 없다는 것으로 이해된다. 원하는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 존재와 같은, 관련된 성질에 의해 특성결정되는데 있어서 친세포와 충분히 유사한 친세포의 자손은, 이러한 정의로 의도된 자손에 포함되며, 상기 용어에 의해 적용된다.
핵산 및 아미노산의 "서열 동일성"을 결정하는 기술 또한 업계에 공지된다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자의 mRNA 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 및/또는 그것에 의해 암호화된 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 이들 서열을 제 2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 일반적으로, "동일성"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 각각 지칭한다. 둘 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 "동일성 백분율"을 측정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든, 두 서열의 동일성 백분율은 두 정렬된 서열 사이에 정확히 매치되는 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 수이다. 핵산 서열에 있어서 적절한 정렬은 Smith 및 Waterman,Advances in Applied Mathematics2: 482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C., USA에 의해 개발되고, Gribskov,Nucl. Acids Res.14 (6): 6745-6763 (1986)에 의해 표준화된 스코어링 매트릭스를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 백분율을 측정하기 위한 이 알고리즘의 예시적 실행은 "BestFit" 유틸리티 적용에서 Genetics Computer Group (Madison, WI)에 의해 제공된다. 이 방법에 대한 디폴트 파라미터는Wisconsin Sequence Analysis Package ProGram Manual, Version 8 (1995) (Genetics Computer Group, Madison, WI로부터 구입가능)에서 설명된다. 본 명세서에 있는 동일성 백분율을 확립하는바람직한 방법은 University of Edinburgh이 저작권을 가지며, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되고, IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)사에 의해 배포된 MPSRCH 패키지 프로그램을 이용하는 것이다. 이 패키지의 스위트로부터, 득점 표 (예를 들어, 12의 갭 개방 벌점, 1의 갭 신장 벌점, 및 6의 갭)에 디폴트 파라미터가 사용될 때 Smith-Waterman 알고리즘이 이용될 수 있다. 생성된 데이터로부터 "매치" 수치는 "서열 동일성"을 반영한다. 서열간의 동일성 또는 유사성 백분율을 계산하는데 있어서 다른 적합한 프로그램은 업계에 공지되는데, 예를 들어 또다른 정렬 프로그램은 BLAST로서, 디폴트 파라미터로 사용된다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 하기 디폴트 파라미터를 사용하여 이용될 수 있다: 유전 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 기대치 = 10 ; 매트릭스 = BLOSUM62; 기재 = 50 서열; 분류 방법 = 고득점; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상술은 하기 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
"유전자"는 특정 생성물 (예를 들어, 폴리펩티드, 단백질 또는 RNA)를 암호화할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적으로, 용어 "유전자"는 생성물의 발현에 연관된 제어 서열을 포함한다. "용어 "유전자좌"는 생물의 게놈에서 유전자의 물리적 위치를 지칭한다. 여기에서 설명된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어떤 것도 그들이 연관된 유전자의 더 큰 단편 또는 전장 코딩 서열을 식별하는데 사용될 수 있다. 더 큰 단편 서열을 분리하는 방법은 당업자에게 공지된다.
두 핵산 분자 간의 서열 관련 정도는 이러한 분자 간의 혼성화 사건의 효율 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 완전히 동일한 서열이 표적 분자에 혼성화되는 것을 적어도 부분적으로는 저해할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화 저해는 업계에 공지된 혼성화 검정법을 이용하여 평가될 수 있다 (예를 들어, 서던 블롯, 노던 블롯, 용액 혼성화 등, Sambrook, et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.를 참조한다). 이러한 검정법은 예를 들어, 저긴축으로부터 고긴축으로 변화하는 조건을 이용한, 선별 정도의 변화를 이용하여 수행될 수 있다. 저긴축 조건을 이용하면, 비-특이적 결합의 부재는 서열 동일성의 부분적인 정도조차도 없어서, 비-특이적 결합 사건의 부재에서 2차 프로브가 표적에 혼성화되지 않을 2차 프로브 (예를 들어, 표적 분자와 30% 미만의 서열 동일성을 갖는 프로브)를 이용하여 평가될 수 있다.
혼성화-기초 검출 시스템을 이용하면, 표적 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브를 선택한 다음, 적절한 조건의 선택에 의해 프로브 및 표적 서열은 서로 "선택적으로 혼성화" 또는 결합하여 혼성체 분자를 형성한다. "중간 긴축" 하에서 표적 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 대략 70%의 서열 동일성을 갖는, 길이로 적어도 약 10 내지 14 뉴클레오티드의 표적 핵선 서열의 검출을 허용하는 조건 하에서 전형적으로 혼성화된다. 긴축 혼성화 조건은 전형적으로 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90 내지 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 길이로 약 10 내지 14 뉴클레오티드의 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브 및 표적이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 포르브/표적 혼성화에 유용한 혼성화 조건은, 업계에 공지된 것과 같이 결정될 수 있다 (예를 들어,Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press 참조).
혼성화를 위한 긴축 조건에 관하여, 다수의 동등한 조건은 예를 들어 하기의 인자를 변화시킴으로써 특정 긴축을 확립하는데에 이용될 수 있다는 것이 업계에 주지된다: 프로브 및 표적 서열의 길이 및 성질, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 다른 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 중 차단제의 존재 여부 (예를 들어, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 및 폴리에틸렌 글리콜), 혼성화 반응 온도 및 온도 파라미터는 물론이고, 세척 조건. 특정한 세트의 혼성화 조건의 선택은 업계의 표준 방법을 따라 선택된다 (예를 들어, Sambrook, et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y. 참조).
연속적인 핵산의 정의된 서열을 포함하는 핵산은 상응하는 폴리펩티드 도는 RNA 생성물을 "암호화한다". 예를 들어, 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA 서열은 그의 오픈 리딩 프레임에 상응하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 예로서, DNA 서열은 상응하는 rRNA, tRNA 또는 mRNA 서열을 암호화할 수 있다.
"정제된 폴리뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드와 자연적으로는 결합되어 있는 단백질이 본질적으로 없는, 예를 들어 약 50% 미만, 바람직하게는 약 70% 미만, 및 더욱 바람직하게는 약 90% 미만으로 함유한 관심있는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 단편을 지칭한다. 관심있는 폴리뉴클레오티드를 정제하기 위한 기술은 업계에 주지되며, 예를 들어, 카오트로픽 작용인자를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 함유한 세포의 분쇄 및 밀도에 따른 이온-교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및 침강법에 의한 폴리뉴클레오티드 및 단백질의 분리를 포함한다.
"벡터"는 표적 세포로 유전자 서열을 이동시킬 수 있다 (예를 들어, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 미립자 담체 및 리포솜). 전형적으로, "벡터 구성체"는 표적 세포 내로 관심있는 서열을 이동시킬 수 있는 핵산 벡터를 지칭한다. 핵산 벡터는 표적 세포에서 일시적으로 존재하거나 복제될 수 있다. 일시적 벡터는 전형적으로 표적 세포에서 작용할 수 있는 복제 개시점을 갖지 않거나, 또는 표적 세포 내의 특정 조건 하에서는 기능하지 않는 복제 개시점 ("조건부" 복제 개시점)을 갖는다.
"핵산 발현 벡터"는 관심있는 서열 또는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 집합체를 지칭한다. 핵산 발현 벡터는 관심있는 서열 또는 유전자(군)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 조절 요소 또한 존재할 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트의 성분 외에, 플라스미드 구성체는 또한 하나 이상의 박테리아성 복제 개시점, 하나 이상의 선별가능한 마커, 플라스미드가 단일-가닥 DNA로서 존재하도록 하는 신호 (예를 들어, M13 복제 개시점), 다중 클로닝 부위, 및 "포유동물"의 복제 개시점 (예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 복제 개시점)을 포함할 수 있다.
"발현 카세트"는 세포에서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드 유전자(군) 또는 서열(군)을 함유하는 어떠한 핵산 구성체를 포함한다. 발현 카세트는, 관심있는 폴리뉴클레오티드 유전자(군) 또는 서열(군) 외에, 추가적으로 전사, 번역 또는 다른 조절 또는 제어 요소를 함유할 수 있다. 이러한 카세트는 발현 카세트를 표적 세포 내로 이동시키기 위하여, 전형적으로 "벡터", "벡터 구성체" 또는 "발현 벡터" (즉, "핵산 발현 벡터") 내에 구성된다.
여기에서 사용될 때 "트랜스포존"은 하나의 유전자좌에서 또다른 곳으로 (예를 들어, 하나의 염색체 지점에서 또다른 염색체 지점으로, 또는 하나의 에피솜 지점에서 염색체 지점으로) 이전할 수 있는 반복 요소를 포함하느 폴리뉴클레오티드를 정의하고, 다시 말해 트랜스포존은 이동성 유전 요소이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, "트랜스포존 카세트"는 전위에 필요한 최소 단위를 포함한다 (예를 들어, 적어도 트랜스포사제를 포함하는 내부 폴리뉴클레오티드 서열에 인접한 제 1 및 제 2 트랜스포존의 역반복 서열, 여기에서 이 트랜스포사제는 상기 트랜스포존 역반복에 의해 중재되는 전위를 유도할 수 있다). 대안으로, 트랜스포존 카세트는 내부 폴리뉴클레오티드 서열에 인접한 제 1 및 제 2 트랜스포존 역 반복 서열일 수 있는데, 여기에서 트랜스포사제 기능은 트랜스로 제공되며 트랜스포존 카세트의 외부에서 (즉, 내부 폴리뉴클레오티드 서열에 인접한 두 개의 트랜스포존 역 반복의 외부에서) 암호화된다. 여기에서 사용될 때, 트랜스포존 카세트는 내부 구역에 인접한 적어도 두개의 역 반복 서열을 포함한다. 내부 구역은 트랜스포사제 코딩 서열 및/또는 다른 관심있는 서열을 함유할 수 있다. 트랜스포존 카세트의 도식적 표시는 다음과 같다: IR-내부 구역-IR, 여기에서 IR은 역 반복을 나타낸다. 또다른 구체예에서, 표시는 다음과 같다: IR-tnp-IR, 여기에서tnp는 트랜스포사제 유전자를 나타낸다. 또한, IR-관심있는 서열-tnp-IR은, IR 서열에 의해 중재되는 전위를 유도할 수 있는 또다른 구체예를 나타낸다. 또한, 역 반복의 서열 5' 및 3'은 지적된 트랜스포존 카세트에 포함될 수 있다. 숙주 생물에서 "기능적인" 트랜스포존 카세트는 그 생물에서 전위를 겪을 수 있는 것이다. 용어 "트랜스포전트"는 전형적으로 트랜스포존이 세포의 게놈 내로 통합된 세포를 지칭한다.
"광발생 단백질" 또는 "광-방사 단백질"은 전형적으로 200 nm 내지 1100 nm의 범위, 바람직하게는 가시광선 범위 (즉, 대략 400 nm와 750 nm 사이)에서 광발생할 수 있는 생물발광 또는 형광 단백질이다. 생물발광 단백질은 (전형적으로 기질, 에너지원, 및 산소를 필요로 하는) 화학 반응을 통해 빛을 생산한다. 형광 단백질은 (녹색 형광 단백질과 같이) 방사의 흡수 및 재-방사를 통해 빛을 생산한다. 생물발광 단백질의 예는 하기의 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 다른 설명이 없으면 원핵 생물 (예를 들어, 박테리아 lux-암호화) 및 진핵 생물 (예를 들어, 반딧불이 luc-암호화, 또는 Renilla 루시퍼라제) 루시퍼라제는 물론이고, 상이한 색의 빛을 내는 루시퍼라제와 같은, 변화되거나 변경돤 광학 성질을 갖는 변체를 포함하는 "루시퍼라제" (예를 들어, Kajiyama, N., and Nakano, E.,Protein Engineering4 (6): 691-693 (1991)); 및 예를 들어, 칼슘 활성화 광단백질과 같은 "광단백질" (예를 들어, Lewis, J. C., et al., FreseniusJ Anal. Chem.366 (67): 760-768 (2000)). 형광 단백질의 예는 녹색, 황색, 청록색, 청색 및 적색 형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Hadjantonakis, A.K., et al.,Histochem. Cell Biol.115 (1) : 49-58 (2001)).
"광-발생 단백질 기질" 또는 "광-방사 단백질 기질"은 ATP 또는 FMNH2와 같은 에너지원, 및 산소의 첨가로 에너지학적으로 붕괴된 기질 (예를 들어, 루시페린) 및, 빛의 광자를 생성하는 광-발생 단백질, 예를 들어, 루시퍼라제 효소의 기질을 설명한다. 이러한 기질의 예는, 박테리아 lux 시스템에서의 데카날, 반디불이 루시퍼라제 (luc) 시스템에서의 4,5-디히드로-2-(6-히드록시-2-벤조티아졸릴)-4-티아졸카르복시산 (또는 간단히 루시페린), 생물발광 진균류인 Panellus stipticus 시스템에서의 "패날" (Tetrahedron 44: 1597-1602,1988) 및 지렁이인 Diplocardia longa 시스템에서의 N-이소-발레릴-3-아미노프로판올 (Biochem. 15: 1001-1004,1976)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몇몇 시스템에서는, 여기에서 설명된 것과 같이, 알데히드가 광-발생 단백질을 위한 기질로서 사용될 수 있다.
"빛"은 여기에서, 다른 설명이 없을 경우 약 200 nm (예를 들어, UV-C)에서 약 1100 nm (예를 들어, 적외선)사이의 파장을 갖는 전자기 방사선으로서 정의된다. 가시 광선의 파장은 대략 400 nm 내지 대략 750 nm 사이(즉, 약 4,000 옹스트롬에서 약 7,500 옹스트롬 사이)의 범위이다.
"동물"은 전형적으로 비-인간 동물을 지칭하며, 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 가축; 흰족제비, 산토끼 및 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐 및 기니아 돼지와 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물; 침팬지를 포함하는 비-인간 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어"동물"은 닭, 칠면조, 오리, 거위 등과 같은 가금, 야생조 및 엽조를 포함하는 조류는 물론이고, 양서류, 어류, 곤충류, 파충류 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 용어는 특정 연령을 나타내지 않는다. 따라서, 성체, 배아, 태아, 및 신상 개체가 포함되도록 의도된다.
"형질전환 동물"은 유전적으로 엔지니어링된 동물 또는 유전적으로 엔지니어링된 동물의 새끼를 지칭한다. 형질전환 동물은 보통 바이러스, 미생물, 식물, 또는 다른 동물과 같은 적어도 하나의 관련되지 않은 생물로부터 유래된 물질을 함유한다. 용어 "키메라 동물"은 이종 유전자가 발견되거나, 또는 이종 유전자가 동물의 모든 세포에서가 아닌 일부에서 발현되는 동물을 지칭한다.
여기에서 사용될 때, 용어 "선별가능한 마커"는 선별가능한 마커 코딩 서열로 트랜스포메이션된 생물에게 배지 위의 비-트랜스포메이션된 생물에 비하여 성장 이익을 부여하는 코딩 서열을 설명한다. 선별가능한 마커의 예는 (i) 기능성 유전자에 의한 돌연변이체 유전자의 보완, ura3-돌연변이체 (이러한 돌연변이체는 유리딘 또는 유라실의 부재하에서 성장할 수 없다)를 보완하기 위한 URA3 유전자의 사용과 같은, 영양요구성 돌연변이의 보완, (ii) 세포 내로 우성의 선별가능한 표현형을 제공하는 코딩 서열, 예를 들어, 약물 내성 리보솜 단백질을 암호화하는 서열의 도입, 및 (iii) 세포 내로, 엠피실린을 함유한 배지에서 박테리아 (E. coli)의 성장을 허용하는 베타-락타마제와 같은, 배지에 첨가된 약물에 대한 내성을 부여하는 코딩 서열의 도입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 선별가능한 마커는 광발생 능력과 같은, 비-성장-관련 검정에 의해 점수 매겨져야 하는 표현형을 부여하는 마커는 포함하지 않는다. 여기에서 사용될 때, 콜로니는 그들의 광발생 능력에 대하여 "스크리닝"된다.
여기에서 사용될 때 "분석대상물"은 그 효과 (예를 들어, 특이적 프로모터의 유도 또는 억제)가 본 발명의 시험 동물 및 방법을 이용하여 평가될 수 있는 어떠한 화합물 또는 물질을 지칭한다. 이러한 분석대상물은 화학적 화합물, 약제학적 화합물, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 유사체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 많은 단체 (예를 들어, National Institutes of Health, 제약 및 화학 회사)는 천연 또는 합성 공정, 또는 발효 육즙 또는 추출물로부터 유래된 화학적 또는 생물학적 화합물의 거대한 라이브러리를 갖는다. 이러한 화합물/분석대상물은 본 발명의 실행에 사용될 수 있다.
발명의 수행 방식
본 발명을 상술하기에 앞서, 본 발명은 특정 공식 또는 프로세싱 파라미터에 제한되는 것이 아니며, 이러한 것은 변화할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 여기에서 사용된 술어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위함일 뿐, 제한하도록 의도된 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
여기에서 설명된 것과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 재료가 본 발명의 실행에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 재료 및 방법은 여기에서 설명된다.
발명의 일반적인 개관
본 발명의 조성물 및 방법은 선택된 생물 또는 세포에 광발생 성질을 부여하는 능력을 돕는다. 또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 표적 세포 또는 생물의 트랜스포먼트를 식별하기 위한 스크리닝 머커로서 광발생 단백질을 암호화하는 서열을 이용하여 표적 세포 도는 생물 내로 관심있는 어떠한 폴리뉴클레오티드의 도입을 허용한다. 관심있는 폴리뉴클레오티드를 갖는 세포의 트랜스포메이션에 대한 스크리닝으로서 광발생 단백질을 사용하는 능력은 예를 들어, 세포 또는 생물을 트랜스포메이션 하기가 어려울 때 선별가능한 마커의 필요성을 제거한다. 광발생 단백질을 암호화하는 서열은 관심있는 어떠한 이종 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있고, 따라서, 광발생은 관심있는 이종 유전자로 세포를 성공적으로 트랜스포메이션하였는가에 대한 리포터로서 작용할 수 있다.
본 발명의 한 양태는 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 즉 표적 세포의 트랜스포메이션 방법을 포함한다. 이 방법에서 세포의 집단이 제공된다. 세포의 집단은 적어도 세포의 하위집단에 의한 폴리뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에서 관심있는 폴리뉴클레오티드로 처리된다. 관심있는 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질 코딩 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 광발생 단백질 코딩 서열은 루시퍼라제와 같은 생물발광 단백질을 암호화한다. 표적 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 다수의 방법이 사용되며, 이는 하기의 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 지질-중재 이동법 (예를 들어, 중성 및 양이온 지질을 포함하는 리포솜을 이용), 직접 주입법 (예를 들어, 미세주입), 세포 융합법, 미세추진 충격법 (microprojectile bombardment, 예를 들어 DNA 입자 충격과 같은 유전자 방법), (예를 들어, 인산 칼슘, 또는 아세트산 리튬과 함께) 공동-침전법, DEAE-덱스트란- 또는 폴리에틸렌 글리콜-중재 이동법, 및 바이러스 벡터-중재 이동법. 세포의 집단은 그 다음 관심있는 폴리뉴클레오티드를 흡수한 세포의 하위집단에 대하여 스크리닝된다. 이들 세포는 관심있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 광발생 단백질 코딩 서열을 발현하는 그들의 능력에 의해 식별된다. 광발생 세포를 분리한다. 이들 광발생 세포는 그 안에 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포, 즉 트랜스포메이션된 세포이다. 이러한 광발생 세포는 그 다음, 예를 들어, 단일 콜로니를 위한 희석 또는 획선법에 의해 광발생 세포의 실질적으로 순수한 콜로니 (즉, 클론)을 제공하도록 분리된다.
게다가, 광발생 단백질을 암호화하는 이러한 서열을 갖는 생물은, 예를 들어 다양한 감염 모델에서의 생체내 모니터링에 따르거나 또는 감염 및/또는 병인의 추적에서, 예를 들어 식품 산업에서 사용될 수 있다. 특히, 어떤 이용가능한 선별 방법에 대하여 내성이 있는 생물 상에 이러한 광발생 성질을 부여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 어떤 편재하는 병원체 (예를 들어,Candida albicans및Staphylococcus의 몇몇 종)는 항생제 또는 다른 선별가능한 마커에 대하여 내성이 있다. Chlamydia, Treponema pallidum, Heliobacter pylori와 같은 생물, 및 조작하기가 어렵고 종래에는 약제학적으로 중재할 수 없었던 다른 생물 상에 광발생 성질을 부여하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
본 발명은 관심있는 생물의 유전적 조작을 용이하게 하기 위한 플라스미드 및 발현 카세트 (예를 들어, 변형된 루시퍼라제 오페론 및Tn4001,Tn917, 등을 포함한 트랜스포존 카세트)의 사용을 교시하는데, 이 관심있는 생물은, 그람-음성 박테리아 (Heliobacter pylori 등을 포함); 그람-양성 박테리아 (Chlamydia 및 Treponema pallidum과 같은 관련된 생물 포함) 및 효모 (Candida albicans등을 포함)와 같은 진핵 생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
한 양태에서, 본 발명은 루시퍼라제 유전자를 함유한 구성체에 관련된다. 특히 본 발명은 진핵 생물의 루시퍼라제, 예를 들어Photinus pyralis로부터 유래된 루시퍼라제의 리엔지니어링을 포함한다. 이들 루시퍼라제 오페론의 리엔지니어링은 예를 들어, 코돈 용법을 변경 (예를 들어, 최적화)하기 위한 부위-특이적 돌연변이 유발을 포함한다. 선택된 광발생 단백질을 암호화하는 핵산 코딩 서열은 본 발명의 교시의 관점에서 업계에 공지된 방법에 의해 표적 세포에서의 발현에 대하여 최적화될 수 있다.
예로서, 대부분의 진핵생물에서는 CTG가 아미노산 류신을 코딩하는 반면, Candida에서는 CTG가 아미노산 세린을 코딩하는 것으로 공지된다. 이종 유전자가 Candida에서 발현되도록 하기 위하여, 진핵생물 루시퍼라제에 있는 CTG 코돈은 류신-암호화 서열 (예를 들어, TTG)로 돌연변이 되어야 하는 것으로 나타난다. 리엔지니어링된 루시퍼라제 오페론은 그 다음 루시퍼라제-암호화 서열에 작동가능하게 연결된 하기의 것: (1) 표적 세포에서 활성이거나 고도로 전사되는 프로모터(군) (예를 들어,C. albicans에놀라제 (ENO1) 프로모터); (2) 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, C. albicans 액틴 (ACT1) 폴리아데닐화 신호); 및 (3) 관심있는 이종 유전자 중 하나 이상을 포함하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 어떤 구체예에서, 프로모터(군) 및/또는 폴리아데닐화 신호(군)은 루시퍼라제 오페론에 인접한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 관심있는 생물을 트랜스포존에 의한 이들 생물의 게놈 내로 카세트를 통합시킴으로써 광발생 표현형으로 트랜스포메이션하기 위한, 프로모터 비함유 루시퍼라제 카세트의 사용에 관련되는데, 여기에서 통합은 표적 생물에 있는 내재성 프로모터에 인접하여 발생한다. 예를 들어, 프로모터 비함유 루시퍼라제 (예를 들어,lux) 카세트는 Tn4001 트랜스포존 내로 삽입되고, 관심있는 세포는 그 다음에 Tn4001 루시퍼라제 구성체를 운반하는 셔틀 벡터로 트랜스포메이션 된다. 트랜스포메이션 후에 일어나는 전위 사건은 숙주 생물의 게놈 내로 루시퍼라제 카세트의 통합 및 광발생 생물의 능력을 초래하였고; 활성 프로모터 뒤로 다른 프로모터 비함유 카세트의 통합은 광발생 표현형을 갖는 숙주 생물을 산출하였다. 이 접근법을 이용하여 몇몇 상이한 속의 그람-양성 박테리아를 상시적으로 또는 유도적으로 광발생하도록 만들었다.
여기에서 설명된 구성체 (예를 들어, 변형된 루시퍼라제 플라스미드 및 트랜스포존 구성체)는 적당한 백본 (예를 들어, 셔틀 벡터)내로 삽입될 수 있고 그럼으로써 숙주 세포 게놈에 있는 활성 프로모터 구역 뒤쪽에 관심있는 코딩 서열 (예를 들어, 광발생 단백질 코딩 카세트)의 통합 후, 관심있는 코딩 서열의 생성물을 생산하는 능력을 부여한다 (광발생 단백질의 경우에서는, 또한 세포 또는 동물에서의 광발생 능력을 부여한다. 한 양태에서, 여기에서 설명된 구성체는 광발생 생물 (예를 들어, 그람-양성 박테리아)의 생성 및 동물 모델에서 이 생물의 사용을 허용한다.
광발생 단백질 서열의 많은 타입은 본 발명의 실행에 유용하며 전형적으로는표적 생물에서의 발현에 최적화된다.
따라서, 여기서 제공되는 것은 선별가능한 마커의 필요없이 표적 세포 내로 핵산 (예를 들어, 관심있는 이종 유전자)의 도입을 스크리닝하는 방법이다. 이것은 특히,Candida또는 내성 박테리아와 같은 병원성 균주에서 유용한데, 이에 사용할 수 있는 선별가능한 마커는 없다. 표적 숙주 세포는 여기에서 설명된 구성체로 트랜스포메이션되어 핵산의 그 다음 통합을 위한 기회를 제공한다. 트랜스포존 카세트 뒤의 프로모터 구역의 성질에 의존하여 상시적, 유도적 또는 억제적일 수 있는 결과 광발생 표현형은, 그 다음에 성공적인 트랜스포메이션을 검출하는데에 사용될 수 있다.
이러한 트랜스포메이션된 세포는 그 다음에, 예를 들어 시험관내 및 동물 모델에서 후보 작동체 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 감염에 의해 유도되는 프로모터의 활성에 기인한 광발생을 나타내는 세포 (또는 콜로니)는 효과적인 약제학적 작용인자를 식별하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 광발생을 나타내는 세포는 실험 및 대조 동물을 감염시키는데 사용된다. 실험 동물은 그 다음에 관심있는 약제학적 작용인자로 처리된다. 실험 동물 및 대조구 모두는 광발생 및, 예를 들어 광발생 능력을 잃게 하는 것으로서 확인된 유효한 작용인자에 대하여 모니터링 된다.
본 발명의 장점은, (i) 그람-양성 박테리아, 항생제 내성 생물,Candida,등을 포함하는 다양한 생물의 트랜스포메이션; (ii) 예를 들어, 시험관내 및 생체내에서 발생된 빛의 좀더 민감한 검출을 허용하는, 이들 트랜스포메이션된 생물에서광발생 단백질 발현의 고수준 획득; (iii) 예를 들어, 병인에 관련된 프로모터의 식별을 허용하는, 광발생 단백질을 암호화하는 서열이 숙주 세포 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 숙주 염색체 내로 카세트의 통합; 및 생리학적 온도 (예를 들어, 37℃-42℃)에서 이러한 생물로부터의 적당한 광발생을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법 및 구성체의 특이적 양태는 아래에서 고찰된다.
1. 광발생 단백질
본 발명의 실행은 전형적으로 광발생 단백질을 암호화하는 사용할 것이다. 여기에서 설명된 광발생 리포터 유전자를 사용할 때, 발현은 이전에 설명된 것과 같이 정확하고 비침해적으로 평가될 수 있다 (예를 들어, Contag, P. R., et al., (1998) Nature Med. 4: 245-7; Contag, C. H., et al., (1997) Photochem Photobiol. 66: 523-31 ; Contag, C. H., et al., (1995) Mol Microbiol. 18: 593-603 참조).
본 발명의 한 양태에서, 광발생 단백질은 루시퍼라제이다. 생물발광은 박테리아 감염의 연구에 있어서 강력한 리포터 시스템을 제공한다 (예를 들어, 미국 특허 No. 5,650,135). 루시퍼라제는 기질 (예를 들어, 루시페린, 장쇄 알데히드 또는 코엘렌트라진), 에너지원 (예를 들어, ATP 또는 FMNH2) 및 산소가 제공될 때 빛을 발하는 성질을 공유하는 다양한 효소 패밀리의 구성원에 적용되는 용어이다. 루시퍼라제는 넓게는 (luc유전자에 의해 암호화되는) 진핵 생물 루시퍼라제 및 (lux유전자에 의해 암호화되는) 원핵 생물 루시퍼라제로 분류될 수 있다. 진핵생물 루시퍼라제 ("luc")는 전형적으로 단일 유전자에 의해 암호화된다 (예를 들어, de Wet, J. R., et al., (1985),Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82: 7870-7873; de Wet, J. R, et al., (1987)Mol. Cell. Biol.7: 725-737 참조).
박테리아 루시퍼라제 ("lux")는 전형적으로lux오페론에 있는 두개의 상이한 유전자(luxA및luxB)에 암호화되는 두개의 서브유닛(α및 β)으로 구성된다. 오페론 상에 존재하는 세개의 다른 유전자 (lux C, lux D및luxE)는 알데이드 기질의 생합성에 필요한 효소를 암호화한다. 박테리아lux는 특정 생물발광 그람-음성 박테리아 (예를 들어,Photorhabdus luminescens)에 존재하며 야생형 오페론은 CDABE 순서이다.
그 외에,Vibrio fischeri균주 Y1로부터 분리된, 또다른 박테리아 유전자luxY는 황색 형광 단백질 (YFP)을 암호화하는데, 이는 루시퍼라제 효소에 의해 작용될 때 450 nm의 최대 파장을 갖는 황색광을 방사하는 기질이다. Baldwin, T. O., et al. (1990)Biochem29: 5509-5515를 참조한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 광발생 단백질은 예를 들어, 청색, 청록색, 녹색, 황생 및 적생 형광 단백질과 같은 형광 단백질이다.
몇몇 광발생 단백질 코딩 서열은 시중 구입가능하고, 하기의 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Clontech (Palo Alto, CA)는 루시퍼라제 및, 청색, 청록색, 녹색, 황색, 및 적색 형광 단백질을 포함하는 다양한 형광 단백질에 대한 코딩 서열을 제공한다. 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP) 변체는 포유동물 시스템에서 양호하게 발현되며 야생형 GFP보다 더 밝은 형광을 나타내는 경향이 있다. 강화 형광 단백질은 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP), 강화 청록색 형광 단백질 (ECFP), 및 강화 황색 형광 단백질 (EYFP)을 포함한다. 나아가, Clontech는 빠른 대사회전 속도를 특징으로 하는 불안정화된 강화 형광 단백질 (dEFP) 변체를 제공한다. dEFP 변체의 더 짧은 반감기로 인해 이들은 역학 연구에서 그리고 정량 리포터로서 유용하다. DsRed 코딩 서열은 Clontech (http://www.clontech.com/techinfo/vectors/vectorsD/text/ pDsRed.txt)로부터 구입가능하다. DsRed는 발현 연구에 유용한 형광 단백질이다. 또한, Fradkov,A.F. 등은 유일한 원적색 형광을 갖는 Discosoma coral 유래의 신규 형광 단백질 및 그것의 돌연변이체를 설명한다 (FEBS Lett. 479(3), 127-130 (2000)) (mRNA 서열, GENBANK Accession No. AF272711, 단백질 서열, GENBANK Accession No. AAG16224). Promega (Madison, WI)는 또한 (예를 들어, pGL3 벡터에 포함된 것으로서) 반딧불이 루시퍼라제에 대한 코딩 서열을 제공한다. 또한, 다수의 형광 단백질에 대한 코딩 서열은 GENBANK로부터, 예를 들어, 기탁 번호 AY015995, AF322221, AF080431, AF292560, AF292559, AF292558, AF292557, AF139645, U47298, U47297, AY015988, AY015994, 및 AF292556로 이용가능하다.
그 외에, 예를 들어 세포에서의 발현을 평가할 때, 그 이상의 광발생 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 Luminescent 베타-갈락토시다제 Genetic Reporter System (Clontech)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
1A. Lux -암호화 카세트
본 발명의 한 양태에서, 구조적 및 기질-암호화lux유전자-생성물 모두를암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유전자 카세트가 제공된다. 본 발명을 지지하여 수행된 실험은lux유전자를, 예를 들어 야생형인 CABDE에서 ABCDE로 재배열하는 것, 및 발현이 요망되는 표적 생물에 기초하여 선택된 전사 및/또는 번역 제어 서열을 삽입하는 것은 결과적 루시퍼라제에 향상된 광발생 능력을 부여한다는 것을 예증한다. 예를 들어, 그람-양성 박테리아의 트랜스포메이션에 사용될 때, 그람-양성 Shine-Dalgarno 서열은 코딩 서열의 상류에 삽입된다. 다른 생물의 트랜스포메이션에 이용될 때 전사 및/또는 번역 향상 서열이 사용될 수 있다 (예를 들어, 진핵 세포에서의 Kozak 서열, 그람 음성 생물을 위한 그람 음성 Shine-Dalgarno 서열). 몇몇 생물, 예를 들어 진핵생물에서, 각lux유전자는 분리된 프로모터의 전사 제어 하에 위치할 수 있다.luxABCDE카세트는 루시퍼라제 뿐만 아니라,lux루시퍼라제의 기질-알데히드의 합성에 필요한 생합성 효소도 발현한다. 따라서, 이러한 카세트를 사용할 때 생물발광에 있어서 유일한 외부 필요 요소는 산소이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 카세트에luxY가 첨가될 수 있다. 예를 들어,luxABCDE유전자 카세트에luxY유전자를 첨가하면 생물발광 도중 방사되는 빛의 파장 범위를 가시광선 스펙트럼의 적색광 말단 쪽으로 확장된다. 장파장의 빛은 단파장의 빛에 비하여 살아있는 조직을 더욱 쉽게 침투하므로, 본 발명의luxABCDE유전자 카세트의 선택된 구체예는 리포터 수단으로서 생물발광을 사용하는 적용의 민감성을 증가시키는 수단으로서,luxY코딩 서열을 추가적으로 포함할 것이다.
한 양태에서,luxAB유전자 카세트가 제공된다. 그람 양성 생물의 트랜스포메이션에 사용될 때,luxAB카세트는 전형적으로luxA및B를 암호화하는 각 폴리뉴클레오티드의 상류에 작동가능하게 연결된 리보솜 결합 부위 ("Shine-Dalgarno" 서열이라고도 함)를 함유한다. 다른 생물의 트랜스포메이션에 사용될 때는 적절한 전사 및/또는 번역 향상 서열이 사용될 수 있다 (예를 들어, 프로모터 서열, 진핵 세포에서의 Kozak, 그람 음성 생물에 있어서 그람 음성 Shine-Dalgarno 서열).luxAB카세트를 갖는 숙주 생물은 외재성 알데히드 기질이 제공될 때 생물발광을 나타낸다.LuxAB카세트는 특히Stapholococcus또는Streptococcus와 같은 그람 양성 박테리아에서 발현될 때, 기존의 공지된 구성체에서 발견되는 것보다 더 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 부여한다.
lux암호화 유전자의 코딩 서열은 표적 생물에서의 발현에 대하여 최적화될 수 있다. 예를 들어,lux유전자의 폴리펩티드 생성물의 서열이 주어질 때, 적절한 코돈은 이러한 코돈이 표적 생물에서의 바람직한 코돈 사용법에 기초하여 선택되는 폴리펩티드를 암호화하도록 선택될 수 있다.
변형된lux코딩 서열은 Xenogen Corporation사가 2001년 5월 15일에 공개한 WO 01/18195에 또한 설명되었다.
대안적 구체예에서, 둘 이상의 파장에서 방사되는 빛을 내는 둘 이상의 광발생 폴리펩티드를 생산하는 서열은 개별적인 트랜스포존 카세트에 있는 관심있는 제 1 서열로서 제공될 수 있고; 트랜스포존 카세트는 차례로 단일 벡터 백본이나 다중 벡터 백본에 제공될 수 있다. 이러한 구성체는 예를 들어, 트랜스포존 카세트가상이한 파장에서 빛을 방사하는 광발생 폴리펩티드를 각각 암호화할 수 있는, 본 발명의 다중 트랜스포존 카세트를 갖는 단일 미생물을 생성하는데 사용될 수 있다.
1B. Luc -암호화 카세트
본 발명은 또한 표적 세포에서 진핵 생물 루시퍼라제의 발현을 허용하는 유전자 카세트를 포함한다. 상기 언급된 것과 같이, 다양한 진핵 생물 루시퍼라제가 식별되었고 시중 구입가능하며, 예를 들어, 플라스미드 pGL2 (Promega, Madison, WI)는Photinus pyralis루시퍼라제를 포함한다.
다양한 루시퍼라제 암호화 유전자는: B. A. Sherf 및 K. V. Wood, 미국 특허 No. 5,670,356, 1997년 9월 23일; Kazami, J. 등, 미국 특허 No. 5,604,123, 1997년 2월 18일; S. Zenno, 등, 미국 특허 No. 5,618,722; K. V. Wood, 미국 특허 No. 5,650,289, 1997년 7월 22일; K. V. Wood, 미국 특허 No. 5,641,641, 1997년 6월 24일; N. Kajiyama 및 E. Nakano, 미국 특허 No. 5,229,285, 1993년 7월 20일; M. J. Cormier 및 W. W. Lorenz, 미국 특허 No. 5,292,658, 1994년 3월 8일; M. J. Cormier 및 W. W. Lorenz, 미국 특허 No. 5,418,155, 1995년 5월 23일; de Wet, J. R. 등,Molec. Cell. Biol.7: 725-737,1987; Tatsumi, H. N. 등,Biochim. Biophys. Acta1131: 161-165,1992; 및 Wood, K. V., et al,Science244: 700702,1989에서 식별되었지만 이에 제한되지 않는다. 생물발광 단백질의 또다른 집단은 에쿼린 패밀리의 광발생 단백질을 포함한다 (Prasher, D. C., et al., Biochem. 26: 1326-1332 (1987)). 루시퍼라제는 물론이고 에쿼린-유사 분자는 ATP, NAD(P)H 등과 같은 에너지원, 및 루시페린 또는 코엘렌트라진과 같은 기질,및 산소를 필요로 한다.
야생형 반딧불이 루시퍼라제는 전형적으로 약 550 nm에서의 방사 최고치를 갖는다. 별개의 방사 최고치를 갖는 다수의 변체들 또한 연구되었다. 예를 들어, Kajiyama 및 Nakano (Protein Eng. 4 (6): 691-693,1991; 미국 특허 No. 5,330,906, 1994년 7월 19일)는Luciola cruciata루시퍼라제 코딩 서열에 있어서 단일 아미노산 변화에 의해 생성된 5개의 변체 반딧불이 루시퍼라제를 교시한다. 변체는 558 nm, 595 nm, 607 nm, 609 nm 및 612 nm의 방사 피크를 갖는다. 약 540 nm의 방사 피크를 갖는 황록색 루시퍼라제는 pGL3이라는 상품명으로 Promega, Madison, WI로부터 구입가능하다. 약 610 nm의 방사 피크를 갖는 적색 루시퍼라제는 예를 들어,Contag 등의 (1998)Nat. Med.4: 245-247 및 Kajiyama 등의 (1991)Port. Eng.4: 691-693에서 설명된다.Renilla muelleri로부터 유래된 루시퍼라제의 코딩 서열 또한 설명된다 (mRNA, GENBANK Accession No. AY015988, 단백질 Accession AAG54094).
여기에서 설명된 구성체 및 방법에서는, 코돈 사용이 표적 세포에서 더욱 자주 사용되는 이들 코돈을 반영하도록 진핵생물 루시퍼라제를 변형하는 것이 바람직하다. 코돈 변형은, 예를 들어http://www.kazusa.or.jp/codon/에 있는 월드 와이드 웹에서 이용가능한 Codon Usage Database를 사용함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어,Candida에 있는 코돈 CTG는 세린 잔기로서 발현되지만, 반면 다른 많은 진핵생물에 있는(P. pyralis포함) CTG는 류신 잔기로서 발현된다. 따라서,P. pyralis에 있는 CTG 코돈은 TTG (또는Candida에서 류신으로서 발현되는 다른 어떤코돈)로 변형되는 것이 바람직하다.
루시퍼라제 오페론의 바람직한 부위-특이적 돌연변이 방법은 PCR의 이용에 의한 것이다. PCR을 위한 일반적인 방법은 MacPherson 등의 PCR: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at Oxford University Press, (1991))에 교시된다. 각 적용 반응에 있어서 PCR 조건은 실험적으로 결정될 수 있다. 다수의 파라미터가 반응의 성공에 영향을 준다. 이들 가운데에서 파라미터는 어닐링 온도 및 시간, 확장 시간, Mg2+ 및 ATP 농도, pH, 및 프라이머, 주형 및 데옥시리보뉴클레오티드의 상대적 농도이다. 예시적인 프라이머 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머)는 아래 실시예에서 설명된다. 증폭 후, 결과적 단편은 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출된 다음, 에티딘 브로미드 및 자외선 조사로 가시화될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 유발 또한 아래 실시예에서 설명되며 도 1은P. pyralis의 부위-특이적 돌연변이 유발에 사용된 올리고뉴클레오티드 쌍을 나타낸다. 바람직하게는, 변화가 결과 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다.
변형된 루시퍼라제를 획득하기 위한 또다른 방법은 아미노산을 무작위로 변경한 후, 효과적인 발광을 나타내는 클론을 스크리닝하는 무작위 돌연변이 유발이다. 무작위 돌연변이 유발은, 예를 들어 표적 DNA 서열을 무작위로 변경하도록 올리고뉴클레오티드를 생성함으로써 수행될 수 있다.
2. 벡터
광발생 단백질을 암호화하는 서열은 그 다음 표적 세포의 트랜스포메이션에 사용하기 위해 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. 몇몇 이러한 구성체는 실시예에서 설명된다. 본 발명에서의 사용을 위한 벡터는 두 집단으로 나뉠 수 있는데, 프로모터 비함유 구성체 및 프로모터 함유 구성체가 그것이다.
어떤 구체예에서, 구성체는 프로모터가 없을 것이다 (예를 들어, 아래 상술된 트랜스포존 셔틀 벡터). 그러나 다른 구체예에서는, 구성체가 루시퍼라제 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함할 것이다. 바람직하게는, 프로모터가 표적 세포에서 활성인 것이다. 표적 생물에서의 프로모터 기능은 (예를 들어,Candida에 대하여 아래 예시된 것과 같이)표적 생물에 관련된 종래 기술을 검토함으로써 확인될 수 있다. 이와 유사하게 더 나아간 전사 및/또는 번역 제어 요소는 표적 생물로부터 유래되는 것이 바람직하다.
광발생 단백질 코딩 서열과 결합된 프로모터 비함유 구성체는 표적 생물의 게놈 내로 통합시키는 것이 바람직할 때 유용한 트랜스포메이션 벡터이다. 이러한 상황에서, 광발생 단백질의 발현 및 이후의 광발생은 내재성, 활성 프로모터에 인접한 광발생 단백질 코딩 서열의 통합에 의존한다. 프로모터 비함유 이러한 광발생 단백질 코딩 서열을 함유한 벡터 구성체는 직선형 또는 고리형일 수 있다. 특정 게놈 지점에서의 통합을 표적화하기 위한 서열을 포함할 수 있고, 이러한 통합은 부위 특이적 통합에 의해 중재될 수 있다 (예를 들어, 고리형 벡터 내에 상동 서열로의 단일 교차 사건; 또는 두 교차 사건이 실질적으로 게놈 세그먼트를 대치하도록 발생하는 상동성 재조합). 대안으로, 게놈 내로 무작위적으로 통합되는 직선형 또는 고리형 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있다. 이러한 프로모터 비함유 구성체는, 아래에 설명된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가적인 요소를포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 광발생 단백질 코딩 서열이 선택된 프로모터의 전사 제어 하에 있는 벡터 구성체(즉, 프로모터 함유 구성체)를 사용한다. 프로모터 비함유 구성체에 대하여 상기 설명된 것과 같이, 프로모터 함유 구성체는 직선형 또는 고리형일 수 있고 이들은 하나 이상의 부위에서 통합을 지시하는 요소를 포함할 수 있거나, 또는 이러한 벡터는 표적 세포 및 트랜스포먼트를 얻기 위해 이용된 무작위 통합에 도입될 수 있다.
따라서, 여기에서 설명된 광발생 단백질 코딩 서열은 (1) 하나 이상의 폴리아데닐화 신호, (2) 하나 이상의 통합 표적화 서열, (3) 하나 이상의 복제 개시점, (4) 하나 이상의 전사 종결 요소, 및 (5) 하나 이상의 관심있는 코딩 서열 중 하나 이상을 더욱 포함하는, 프로모터 비함유 벡토 또는 프로모터 함유 벡터 내로 삽입될 수 있다. 관심있는 코딩 서열은 전형적으로 그들 자신의 전사 및/또는 번역 제어 요소를 포함한다. 예를 들어, 프로모터 비함유 광발생 단백질 구성체를 사용하고 표적 생물에 있는 프로모터의 기능이 관심있는 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 때, 벡터는 관심있는 코딩 서열과 연결된 전사 제어 요소로부터 광발생 단백질 암호화 서열의 통독 전사를 막기 위하여 전사 종결 서열을 더욱 포함할 수 있다. 또다른 예시적 구체예에서, 예를 들어 그람 양성 박테리아를 트랜스포메이션할 때, 관심있는 프로모터 비함유 코딩 서열은 프로모터 비함유 광발생 단백질 코딩 서열과 직렬로 있을 수 있는데, 여기에서 관심있는 코딩 서열은 작동가능하게 연결된 그람 양성 Shine-Dalgarno 서열을 포함하여, 실질적으로 폴리시스트로닉 메세지를제공하는 서열을 생성한다.
본 발명의 한 양태에서 프로모터 비함유 구성체는 전위가능 또는 이동성 유전 요소를 포함한다.
2A. 전위가능 또는 이동성 유전 요소
한 양태에서, 본 발명의 실행은 전위가능 또는 이동성 유전 요소를 사용한다. 특정 전위가능 또는 이동성 요소는 표적 생물에 기초하여 선택된다. 예시적 표적 생물 및 관련된 전위가능 또는 이동성 유전 요소는 하기의 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:박테리아 (예를 들어, 그람-양성, 그람-음성), 효모 (예를 들어, Saccharomyces cerevisiae Ty elements, Boeke, Garfinkel et al. (1985)Cell40 (3): 491-500), 식물 (예를 들어, 옥수수), 및 곤충 (예를 들어, Drosophila에서의 마리너). 본 발명에서의 사용을 위하여, 전위가능 또는 이동성 유전 요소는 프로모터 비함유 광발생 단백질 구성체 또는 프로모터 함유 광발생 단백질 구성체 중 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 전위가능 또는 이동성 유전 요소는 나아가, 관심있는 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열과 같은 다른 요소를 포함하도록 변형될 수 있다. 전형적으로, 전위가능 또는 이동성 유전 요소에 첨가되는 모든 성분은, 예를 들어 역 반복체와 같은, 작동하는 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소의 경계 사이에 포함되는데, 이 역 반복체는 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소가 첨가된 성분을 재위치시킬 때 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소와 함께 이동한다.
본 발명에서의 사용을 위한 예시적 트랜스포존 중 하나는 Tn4001로서, 이는Staphyloccus aureus로부터 분리된 분류 I 혼성-타입 트랜스포존이다 (GeneBank Accession No. M18086, 서열의 염기쌍 1-1,324; Byrne, M. E., Rouch, D. A., and Skurray, R. A. (1989) Gene 81: 361-367 참조). 이 요소는 그람 양성 생물의 박테리아 염색체 내로 고도의 무작위성으로 삽입될 수 있다. 본 발명을 지지하도록 수행된 실험은 트랜스포존이 그람-음성 숙주 세포에서도 마찬가지로 기능한다는 것을 가리킨다.
Tn4001 트랜스포존의 성분은 (1) 역 반복체로서 존재하는, 그 사이에서 삽입 서열을 규정하는 IS256 삽입 서열의 두 개의 동일한 카피 (IR's) 및 (2) 삽입을 규정하는, 역 반복체 내에 위치한 트랜스포사제 유전자를 포함한다. 일반적으로, 트랜스포존을 지칭할 때, 역 반복체는 기능적 트랜스포존 단위의 경계인 것으로 고려된다. 이 기본 구조는, 아래 고찰된 것과 같이 더욱 변형되고 다양한 벡터 백본 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 관심있는 추가적인 서열은 역 반복체의 사이 (예를 들어, 5'-IR-광발생 단백질 코딩 서열--관심있는 서열-IR 3')는 물론이고, 광발생 단백질 코딩 서열에도 삽입될 수 있다. 한 구체예에서, 추가적인 관심있는 서열은 결합된 프로모터 구역이 없다. 이 경우에서 전사 향상 서열은 (폴리시스트로닉 메세지를 생성하도록) 각 단백질 코딩 서열 사이에 첨가될 수 있다. 대안의 구체예에서, 표적 생물에 있는 프로모터 기능은 관심있는 서열에 작동가능하게 연결된다.
광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 프로모터 비함유 구성체를 사용할 때, 광발생 단백질 코딩 서열 및 어떤 추가적인 관심있는 서열은 Tn4001 트랜스포존 내로 도입되어, 삽입된 서열에 대한 전사의 방향이 트랜스포사제 코딩 서열의 그것과 반대이고, 그럼으로써 트랜스포사제 프로모터의 영향 하에 있지 않도록 하는 것이 바람직하다. 그러므로, 서열은 활성 또는 활성가능 프로모터 구역 뒤에 있는 삽입 서열의 통합이 일어나기 전까지는 전사되지 않을 것이다. 결과적으로, 이것은 관심있는 서열 및 트랜스포사제에 대한 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 서열이 DNA에서 반대 방향으로 있다는 것을 의미한다. 대안으로, 트랜스포사제 서열은 관심있는 서열과 동일한 방향으로 존재할 수 있는데, 이는 내재성 트랜스포사제 프로모터로부터의 통독 및 통합에 앞선 광발생 단백질 유전자 생산의 발현을 회피하기 위하여, 이 서열의 하류에 위치하도록 제공된다.
본 발명의 실행에서 프로모터 비함유 구성체가 사용될 때, 광발생 단백질 서열은 전형적으로 전위가능 요소 내에 함유된 프로모터의 부재하에서 사용된다. 이는 어떠한 프로모터 서열도 광발생 단백질의 전사를 중재할 수 있는 트랜스포존 내에 전형적으로 존재하지 않는다는 것이다. 바람직한 구체예에서, 광발생 단백질 서열은 5' 역 반복 서열의 3' 말단에 인접하거나 거의 접하도록 삽입된다 (예를 들어, 5'-IR-광발생 서열-IR-3'). 또한, 서열은 트랜스포사제 서열의 방향과 반대로 삽입되어, 트랜스포사제 서열의 전사가 일어날 때조차도 활성 숙주 프로모터 구역에 인접한 관심있는 생물의 게놈 내로의 통합에 앞서 관심있는 서열 (예를 들어, 광발생 폴리펩티드 코딩 서열)의 전사는 일어나지 않는다.
트랜스포존 카세트는 전형적으로 다량의 벡터 DNA 제조 및 분리의 경우에 있어서 셔틀 벡터 내로 클로닝된다. 다수의 이러한 셔틀 벡터가 시중 구입가능하다(예를 들어 pAUL-A (Chakraborty, et al. (1992)J. Bacteriol.174: 568-574); pE194 (Sozhamannan, s. 등 (1990)J. Bacteriol.172: 4543-4548; 이 벡터의 지도를 위하여http://phage.atcc.org/vectors/gifs/68359.gif참조; 전체 서열을 위하여ftp ://ftp.atcc.org/pub/vectorseqs/pE194.html참조); pMK4 (Sullivan, M., et al., (1984)Gene29: 21-26), pDL289 (Buckley, N., et al., (1995)J. Bacteriol177 : 5028-5034), pSK+ BLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA); 및 pSUM 시리즈 미코박테리아 셔틀 벡터 (Ainsa, J. A., et al., (1996) Gene 176: 23-26)). 이와 유사하게 벡터 백본은 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소가 도입되는 숙주 세포 (즉, 표적)에 기초된 어떤 주어진 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소에 대하여 선택될 수 있다.
TN4001에 있어서, 이러한 벡터 백본은, (1) (조건부일 수 있는, 예를 들어 온도-민감성인) 그람 음성 복제 개시점, (2) (조건부일 수 있는, 예를 들어 온도-민감성인) 그람 양성 복제 개시점, (3) 폴리링커 구역, 및 (4) 전사 종결 구역을 포함할 수 있다.
실시예 1은, 프로모터 비함유 광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 트랜스포존인, 본 발명의 예시적인 전위가능 요소의 구성체를 설명한다. 실시예 2는 다수의 상이한 박테리아 내로 트랜스포존을 도입하는데 유용한 다수의 벡터 내로 트랜스포존을 도입하는 것을 설명한다. 실시예 3은 트랜스포메이션된, 생물발광 콜로니를 획득하기 위한 벡터/트랜스포존 구성체 중 하나의 사용을 설명한다. 본 발명의 방법에 의해 트랜스포메이션된 세포는 시각 검출 및 수동 분리를 이용하여 고체배지 상에 고밀도로 플레이팅된 콜로니들 가운데서 분리된다.
본 발명의 한 양태에서, 숙주 생물의 DNA 내로 카세트가 통합되기에 앞서 광발생 폴리펩티드가 발현되는 것을 막기 위하여, 벡터 백본은 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소의 한쪽 또는 양쪽에 인접한 전사 종결 서열을 포함한다. 예를 들어, Henkin, T. M., (1996)Ann Rev Genet30: 35-37; MacDonald L. E., et al. (1993)J. Mol. Biol.232: 1030-1037 ; Jeng, S. T., et al. (1997)Can J Microbiol43: 1147-1156을 참조한다.
복제 개시점이 그람-음성 및 그람-양성 생물 모두에서 기능하는 바람직한 구체예에서, 그람-음성 복제 개시점의 존재는 그람-음성 생물에 있는 벡터의 복제를 허용하며, 그럼으로써 삽입된 서열의 제조를 용이하게 하는 반면 그람-양성 숙주 생물의 제한효소인 엔도뉴클레아제 시스템을 회피함은 물론, 다량의 벡터 구성체 DNA의 분리를 허용한다. 이 경우에서, 선별가능한 마커가 벡터 내에 포함되어 그람-음성 생물에서의 이동을 용이하게 할 수 있는데, 여기에서 결과적 DNA는 그람-양성 생물의 트랜스포메이션에 사용된다. 선별가능한 마커는 다량의 DNA를 얻기 위하여 숙주 생물에서 이동 벡터로 사용된다. 본 발명의 이러한 양태에서, 선별가능한 마커는 트랜스포먼트를 식별하는데 사용되지 않으며, 오히려 광발생 단백질 서열의 표적 세포에서의 발현이 트랜스포먼트를 식별하는데 사용된 스크리닝법이다.
대안으로, 예를 들어 어떤 Streptomyces 플라스미드 (예를 들어, pCKl)에 존재하는 복제 개시점과 같이, 그람-양성 및 그람 음성 생물에서 기능하는 복제 개시점이 사용될 수 있다.
트랜스포존 또는 이동성 유전 요소를 갖는 벡터에 있는 복제 개시점은 계속적으로 활성이거나 아니면 대신에, pAUL-A 셔틀 벡터에서 발견되는 것과 같이, 예를 들어 pE194 유래 온도-민감성 개시점과 같은 조건부일 수 있다. 본 발명의 벡터 구성체에 조건부 복제 개시점을 포함시키는 장점은 이러한 요소가 허용 조건 하에서 성장한 관심있는 숙주 생물에서 벡터 구성체의 안정화를 허용하는 반면 제한 조건 (예를 들어, 전위가 일어난 후 비-허용 수준으로 상승한 온도) 하에서 성장할 때는 숙주 세포가 "치유"되도록 허용한다는 것이다.
따라서, (광발생 단백질을 암호화하는 프로모터 함유 또는 비함유 서열을 포함하는) 트랜스포존 또는 이동성 유전 요소로 표적 생물을 트랜스포메이션 한 후, 트랜스포먼트는 빛을 내는 능력에 의해 식별된다. 전형적으로, 트랜스포메이션 후에 프로토콜 세포는 플레이팅 되고 광발생 세포를 함유한 플레이트의 영역이 식별된다. 이들 구역은 그 다음 광발생 단백질 코딩 서열을 발현하는 트랜스포메이션된 세포의 더욱 순수한 배양물을 제공하도록 통과된다. 이러한 조작은, 예를 들어 마이크로티터 플레이트를 사용한 액체 또는 반-고체 배양 재료에서도 수행될 수 있다.
2B. 벡터 및 플라스미드
본 발명의 방법은 선택된 발현 제어 요소를 포함하는 적절한 발현 벡터를 이용하여 다양한 타입의 세포를 트랜스포메이션 하는데에 이용될 수 있다. 어떤 주어진 세포 타입에 있어서 적절한 벡터 및 제어 요소는 본 발명의 교시의 관점에서당업자에 의해 그리고 발현 벡터 업계에 공지된 정보에 의해 선택될 수 있다.
예를 들어, 광발생 단백질 코딩 서열은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 요소를 포함하는 벡터 내로 삽입될 수 있는데, 이는 선택된 세포-타입에서 유전의 발현을 허용한다. 포유동물 세포 발현에서의 사용을 위한 예시적 프로모터는, SV40 초기 프로모터, CMV 프로모터, HIV-LTR, 마우스 유방암 바이러스 LTR 프로모터 (MMLV-LTR), FIV-LTR, 아데노바이러스 주 후기 프로모터 (Ad MLP), 및 헤르페스 단순 바이러스 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 쥐의 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 프로모터와 같은, 다른 비-바이러스 프로모터 또한 포유동물의 발현에 사용될 수 있다. 전형적으로, 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열 또한 번역 중지 코돈의 3'에 위치하여 존재한다. 바람직하게는 코딩 서열의 5'에 위치한, 번역 개시의 최적화를 위한 서열이 또한 존재한다. 전사 종결암호/폴리아데닐화 신호의 예는 Sambrook 등,supra에 설명된 것과 같은, SV40로부터 유래된 것은 물론이고, 소 성장 호르몬 종결암호 서열을 포함한다. 스플라이싱 공여체 및 수용체 부위를 함유한 인트론 또한 본 발명에 사용된 구성체 내로 디자인될 수 있다 (Chapman 등,Nuc. Acids Res.(1991)19:3979-3986).
인핸서 요소는 포유동물 벡터 구성체의 발현 수준을 증가시키는데에 사용될 수 있다. 예시적인 인핸서는 Dijkema et al.,EMBO J.(1985)4: 761에 설명된 것과 같은 SV40 초기 유전자 인핸서, German et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982b)79: 6777에 설명된 것과 같은 Rous Sarcoma Virus의 장구간 말단 반복 (LTR)로부터 유래된 인핸서/프로모터, 및 Boshart et al.,Cell(1985)41: 521에설명된 것과 같이, CMV 인트론 A 서열에 포함된 요소와 같은 인간 CMV로부터 유래된 요소 (Chapman et al.,Nuc. Acids Res.(1991)19: 3979-3986)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적당한 원핵생물 벡터는 예를 들어,E. coli에서 복제할 수 있는 플라스미드 (예를 들어, pBR322, ColEl, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, CA) 등)를 포함한다. 이러한 플라스미드는 Sambrook에 의해 개시되며 ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual,"second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) 참고) 다수의 이러한 벡터가 시중 구입가능하다. Bacillus 플라스미드는 pC194, pC221, pT127, 등을 포함하며, Gryczan에 의해 개시된다 (The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). 적합한 Streptomyces 플라스미드는 plilOl (Kendall et al., J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987), 및 □C31과 같은 Streptomyces 박테리오파지 (Chater 등, Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54)를 포함한다. Pseudomonas 플라스미드는 John 등 (Rev. Infect. Dis. 8: 693-704,1986), 및 Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742,1978)에 의해 개설된다.
적합한 진핵생물 플라스미드는, 예를 들어, BPV, EBV, 박시니아, SV40,2-미크론 서클, pcDNA3.1, pcDNA3.1/GS, pYES2/GS, pMT, p IND, pIND (Spl), pVgRXR (Invitrogen), 등 또는 그것의 유도체를 포함한다. 이러한 플라스미드는 업계에 공지된다 (Botstein et al., Miami Wntr. SyTnp. 19: 265-274,1982; Broach,In:"The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 445-470, 1981; Broach, Cell 28: 203-204,1982; Dilon et at., J. Clin. Hematol. Oncol. 10 : 39-48, 1980; Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608,1980).
광발생 단백질 암호화 서열은 어떤 수의 시중 구입가능한 벡터 내로 클로닝되어 적절한 숙주 시스템에서 트랜스포메이션의 마커로서 사용되는 광발생 폴리펩티드의 발현을 생성할 수 있다. 이들 시스템은 하기의 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 배큘로바이러스 트랜스포메이션용 벡터 (Reilly, P. R., et al.,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL(1992), Beames, et al.,Biotechniques11: 378 (1991), Pharmingen; Clontech, Palo Alto, CA); 박테리아 트랜스포메이션용 벡터 (Ausubel, F. M., et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc., Media PA, Clontech); 효모 트랜스포메이션용 벡터 (Rosenberg, S. 및 Tekamp-Olson, P., 미국 특허 No. RE35, 749, 1988년 5월 17일, Shuster, J. R., 미국 특허 No. 5,629,203, 1997년 5월 13일, Gellissen, G., et al.,Antonie Van Leeuwenhoek,62(1-2): 79-93 (1992), Romanos, M. A., et al.,Yeast 8(6): 423-488 (1992), Goeddel, D. V.,Methods in Enzymology 185(1990), Guthrie, C., and G. R. Fink,Methods in Enzymology 194(1991)); 포유동물 세포 트랜스포메이션용 벡터 (Clontech; Life Technologies/Gibco-BRL,Grand Island, NY, Haynes, J., et al.,Nuc. Acid. Res. 11: 687-706 (1983), Lau, Y. F., et. al.,Mol. Cell. Biol. 4: 1469-1475 (1984), Kaufinan, R. J.,"Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells",Methods in Enzymology, vol. 185, pp537-566, Academic Press, Inc., San Diego CA (1991); 및 식물 세포 트랜스포메이션에서의 사용을 위한 벡터인, 식물 클로닝 벡터 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, and Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Pistcataway, NJ, Hood, E., et al.,J. Bacteriol.168: 1291-1301 (1986), Nagel, R., et al.,FEMS Microbiol. Lett.67: 325 (1990), An, et al.,"Binary Vectors", 및 다른 것들 (Plant Molecular Biology ManualA3: 1-19 (1988), Miki, B. L. A., et al., pp. 249-265,Plant DNA Infectious Agents(Hohn, T., et al., 편저) Springer-Verlag, Wien, Austria, (1987),Plant Molecular Biology : Essential Techniques,P. G. Jones and J. M. Sutton, New York, J. Wiley, 1997, Miglani, GurbachanDictionary of Plant Genetics and Molecular Biology, New York, Food Products Press, 1998, Henry, R. J.,Practical Applications of Plant Molecular Biology,New York, Chapman & Hall, 1997).
광 발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 벡터는, 또한 표적 생물의 게놈으로의 단일 부위 재조합을 촉진하는 서열(촉진된 통합에 이용된 표적 게놈에서의 하나 이상의 부위에 동종인 단일 DNA 서열) 또는 동종의 재조합을 촉진하는 서열(예를 들면, 표적 게놈에서의 유전위에 동종인 두 개의 서열, 이때 두 서열은 어떤 관련 조절 요소 또는 추가의 관심 서열뿐만 아니라, 광 발생 단백질 코딩 서열의 측면에 위치한다)을 포함한다. 일단 식별되면, 표적 서열은, 예를 들면, 프라이머의 고안 및 PCR에 의한 서열 증폭에 의해 쉽게 분리될 수 있다. 다음으로 증폭된 광 발생물은 광 발생 단백질 코딩 서열-함유 구조체로, 예를 들면 통합되도록 요구되는 서열의 측면에 위치하여 삽입될 수 있다. 벡터는 원형 또는 선형으로 통합될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법들을 이용하여, 광 발생 단백질 코딩 서열을 운반하는 벡터(및 추가의 관심 서열뿐만 아니라 관련 조절 요소들)는 세포로 도입될 수 있으며, 임의의 통합은 표적 세포의 트랜스포메이션 및 트랜스포먼트의 식별에 의해 검출될 수도 있다.
실시예 4는Candida albicans에 대한 통합적 게놈성 표적 벡터의 구조화를 설명하며, 이때 표적 벡터는 프로모터 함유 광 발생 단백질 코딩 서열을 포함한다. 또한, 실시예 4는 이 벡터를 이용하여 수행한 트랜스포메이션 시험들을 설명한다. 실시예 4에서의 결과는, 광 발생 단백질 코딩 서열-함유 구조체가 선택가능한 마커를 보정할 수 없는 세포에서 리포터 구조체로서 이용될 수 있음을 나타낸다. 실시예 4에서 설명된 방법은C. albicans에서 발현하도록 대체된 개똥벌레Photinus pyralis로부터의 루시퍼라제 유전자를 이용한다. 트랜스포메이션된Candida albicans세포는 어떤 영양요구성 선택 또는 약물-기재 선택의 이용없이 광 발생에 대한 스크리닝의해 분리된다.
여기서 설명된 고밀도 스크리닝은 선택을 포함하지 않았으며 트랜스포먼트를 얻기 위한 효율적인 방법을 제공하였다. 성공적인 트랜스포메이션은 진동수 약5×10-5내지 10-6(5-10 생물발광 콜로니/20 플레이트: 실시예 4)에서 일어난다. 과량의 비-트랜스포메이션 세포중에서 트랜스포먼트(예를 들면, 광 발생 세포)의 식별은 간단하고 반복가능하다. 여기 나타내어진 성공적인 트랜스포메이션은 ATCC로부터의 여러 독성 세포주로 반복되었다. 본 발명의 일 구현예에서, 트랜스포메이션 혼합물을 루시페린을 함유하는 비-선택적 배지위에 플레이팅하였다. 선택되지 않은 세포들이 성장하였다. (예를 들면, Xenogen Corporation IVISTM이미지화 시스템(Xenogen Corporation, Alameda, CA)을 이용하여) 광 발생에 대해 론을 이미지화하여 광 발생 단백질 코딩 서열(예를 들면, 루시퍼라제 유전자)을 함유 또는 발현하는 세포 부분을 식별하였다. 플레이트 위 각각 밝은 영역으로부터 4내지 8의 작은 샘플들을 채집하고 오버나이트 액체 배양물을 접종하는데 사용하였다. 다음으로 오버나이트 배양물의 작은 일정 표본을 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 루시페린과 혼합하고, 광 발생에 대해 각각의 일정 표본들을 평가하였다. 광 발생 단백질 코딩 서열 함유/발현 세포들을 포함하는 오버나이트 배양물을 희석하고, 단일 콜로니 분리물을 얻기 위해 플레이팅하였다.
따라서, 이들 결과는 광 발생 단백질 코딩 서열-함유 구조체을 고밀도 스크리닝하는데 이용하여, 트랜스포메이션 사건을 검출하고, 추가적으로 전체 동물에서 관찰할수 있음을 나타낸다.
광 발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 벡터는, 키트내로 제형화될 수 있다. 이같은 키트의 구성요소들은, 컨테이너, 설명서, 용액, 완충액, 일회용품및 하드웨어를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지는 않는다. 모범적인 하드웨어는 증폭된 광자-계수 카메라 또는 냉각 통합형 카메라를 포함할 수도 있다.
따라서, 트랜스포메이션된 세포중의 벡터의 존재를 결정하는데 통상적인 선택 또는 스크리닝 방법을 이용하는 대신에, 광-기재 스크리닝 방법을 이용할 수도 있다. 일 구현예(예를 들면, 프로모터 함유 구조체)에서, 광 발생 폴리펩티드 코딩 서열을 관심 생물에서 활성인 프로모터의 통제하에 둔다. 이같은 조절 요소는 본질적일 수도 또는 조건부일 수도 있다. 예를 들면, 관심 표적 생물에서 기능적인 프로모터 서열에 이용가능하게 연결된luxABCDE카세트를, 적당한 벡터내로 도입할 수도 있다. 다음으로 관심 생물을 트랜스포메이션하고, 얻어진 생물을 그들의 광 발생 능력에 대해 스크리닝하였다. 이 방법에서, 관심 트랜스포먼트를 식별하는데 광 발생을 이용할 수 있다. 광 발생 콜로니(또한, 박테리아의 첩부물)는 전형적으로 표준 방법(예를 들면, 마이크로타이터 웰의 이용하는 희석 플레이팅, 또는 단일 콜로니에 대한 회선)에 의해 클로닝된다. 본 발명의 한 양태는 관심있는 표적 생물에서 기능하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 광발생 폴리펩티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 그러한 벡터를 사용하는 것은 선택성 마커(약물 내성 마커와 같은)를 이용할 수 없는 생물의 트랜스포메이션을 위한 수단을 제공한다.
2C. 광발생 단백질 구성체의 제조 방법
여기에 설명된 광발생 단백질 카세트, 트랜스포존 카세트 및 셔틀 벡터 구성체는 본 명세서에 교시된 관점에서 분자생물학 분야에 공지된 방법을 이용하여 조립될 수 있다(예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in MolecularBiololgy, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA(1995), 또는 Sambrook, et al.). 전형적으로, 광발생 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 유전자 카세트가 조립된다. 프로모터, 콘트롤 요소, 및/또는 다른 뉴클레오티드 서열이 또한 적합한 위치에서 그 구성체에 도입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 적합한 조절 서열 및 짧은 무작위 뉴클레오티드 서열을 얻는 바람직한 방법은 PCR이다. 일반적인 PCR 과정은 Macpherson et al., PCR: A PRACTICAL APPROACH,(Oxford University Press의 IRL Press (1991))에 교시된 바와 같다. 각 적용 반응에 대한 PCR 조건은 실험적으로 결정될 수 있다. 많은 수의 파라미터가 반응의 성공에 영향을 미친다. 이들 파라미터 중에 아닐링 온도 및 시간, 확장 시간, Mg2+및 ATP 농도, pH, 및 프라이머, 주형 및 디옥시리보뉴클레오티드의 상대 농도가 있다. 전형적인 프라이머가 하기 실시예에 설명된다. 증폭 후, 결과의 단편은 아가로스겔 전기영동 후 에티듐 브로마이드 염색 및 자외선 조명으로 시각화하여 검출될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 얻는 다른 방법은, 예를 들어 효소 처리에 의한 것이다. 원하는 벡터의 구성요소가 어떤 적합한 배향 및/또는 입체배열로 조직될 수 있다.
2D. 표적 세포에 핵산을 도입하는 방법
세포(또는 효모 또는 식물 세포벽의 약화 또는 제거 후의 그러한 세포 원형질체)에 핵산을 도입하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 제한은 없지만 지질-매개 트랜스퍼(예를 들어, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는, 리포솜을 사용), 직접 주사(예를 들어, 미세주사), 세포 융합, 미세투사 충격(예를 들어, DNA 입자 충격과 같은 바이오리스틱법), 공동-침전(예를 들어, 인산칼슘 또는 리튬 아세테이트 사용), DEAE-덱스트란- 또는 폴리에틸렌 글리콜-매개 트랜스퍼, 및 바이러스 벡터-매개 트랜스퍼)를 포함한다.
트랜스포메이션법은 전형적으로 세포 종류 및 그 방법에 사용되는 이용가능한 핵산의 양에 따라 선택된다. 트랜스포메이션 후 세포는 광발생 스크리닝을 용이하게 하는 밀도로 평판될 수 있다. 세포는, 예를 들어 트랜스포메이션된 세포 집단의 일련의 희석물을 제조함으로써 많은 밀도로 플레이팅될 수 있다. 세포 평판 밀도는 세포 종류에 의해 차이가 있으나, 트랜스포메이션법에 의해 처리된 세포 집산에서 트랜스포메이션된 세포를 검출할 가능성을 증가시키기 위해서는 초기 스크리닝을 위한 고밀도 평판이 일반적으로 바람직하다.
당업자는 여기에서 제시된 가이던스와 조합된 어떤 선택된 트랜스포메이션법을 필수적으로 사용하는 본 발명의 광-기초 스크리닝법을 적용할 수 있다.
3. 세포 배양물에서 광발생 폴리펩티드 서열의 평가
상기 설명된 그리고 실시예에서 설명된 것과 같은 광발생 단백질 코딩 서열 구조체를 사용하여 여러 가지 숙주 세포를 트랜스포메이션하고, 성공적인 트랜스포메이션 사건을 분석할 수 있다. 적합한 숙주 세포는, 제한은 없지만 진핵 세포(예를 들어, 칸디다 및 사카로미세스와 같은 효모); 식물 세포; 포유류 세포(예를 들어, BHK, VERO, HT1080, 293, RD, COS-7, 또는 CHO 세포); 조직-특이적 세포; 종양 세포; 곤충 세포; 그램-음성 박테리아, 그램-양성 박테리아 및 전술한 부류 중 어느 것에도 포함되지 않는 다른 속과 같은 원핵 세포(예를 들어,Rickettsia spp.;Rochalimaea spp. Coxiella spp.; Treponema spp., Treponema pallidum포함, 매독을 일으키는 생물;Mycoplasma spp., 및Chlamydia spp.)를 포함한다.
그램-음성 숙주 세포와 관련하여, 제한은 없지만, 본 발명의 구성체를 사용하여,Clostridium spp., Vibrio spp., Brucella spp., Bordetella spp., Campylobacter spp., Pseudomonas spp., Escherichia spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.,및Yersinia spp.를 포함하는 유기체를 트랜스포메이션할 수 있다.
그람-양성 숙주 세포와 관련하여, 본 발명의 구조체는 다음의 것에 한정되지 않지만, 다음의 것을 포함하는 생물을 트랜스포메이션하는데 이용될 수도 있다:
그람-양성 구균과의Micrococcaceae(Micrococcus spp., Stomatococcus spp., Planococcus spp.,및Staphylococcus spp.),Deinococcaceae (Deinococcus spp.)의 멤버들,및Streptococcus spp.(예를 들면, 화농성 용혈streptococci spp., 구강streptococci spp., Enterococci spp., 젖산streptococci spp.,혐기성Streptococci spp.,및Streptococci의 다른 종들);Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Aerococcus spp., Gemella spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Ruminococcus spp., Coprococcus spp.,및 Sarcina 속의 종들을 포함하는 다른 구균 속의 종들.
Bacillus spp., Sporolactobacillus spp., Clostridium spp.,Desulfotomaculum spp., Sporosarcina spp.,및Oscillospira속의 종들:을 포함하는 내포자-형성 그람-양성 간균 및 구균.
Lactobacillus spp.,(식료품 중, 음료수 중 및 음식 제조면 위에서 오염물질로서 발견되는 병원성Listeria monocytogenes종을 포함하는)Listeria spp.,Erysipelothrix spp.속,Brochothrix spp., Renibacterium spp., Kurthia spp.,및Caryophanon속의 종들을 포함하는 규칙형, 비포자성, 그람-양성 간균.
(식물 병원성Corynebacterium종을 포함하는)Corynebacterium,Gardnerella spp., Arcanabacterium spp., Arthrobacter spp., Brevibacterium spp., Curtabacterium spp., Caseabacter spp., Microbacterium spp., Aureabacterium spp., Cellulomonas spp., Agromyces spp., Arachnia spp., Rothia spp., Propionibacterium spp., Eubacterium spp., Acetobacterium spp., Lachnospira spp., Butyrivibrio spp., Thermoanaerobacter spp., Actinomyces spp.,및Bifidobacterium속의 종들을 포함하는, 불규칙형, 비포자성, 그람-양성 간균.
Mycobacteriaceae과의 생물, 예를 들어Mycobacterium spp..
Nocardia spp., Rhodococcus spp., Nocardioides spp., Pseudonocardia spp., Oerskovia spp., Saccharopolyspora spp., Micropolyspora spp., Promicromonospora spp.,및Intrasporangium속의 종들을 포함하는, nocardioforms.
특별한 관심의 생물:Clostridium spp., Vibrio spp., Brucella spp., Bordetella spp., Campylobacter spp., Pseudomonas spp., Escherichia spp.,Enterobacter spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.,및Yersinia spp.을 포함한다.
원핵 세포 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 트랜스포메이션 방법은 기술 분야(예를 들면 Sambrook, et al.)에서 알려져 있으며, 인산 칼슘 침전, 미량주사법 또는 일렉트로포레이션을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 적절한 조절 요소들 및 다중 클로닝 부위를 함유하는 벡터들이 널리 상업적으로 이용가능하며(예를 들면 Stratagene, La Jolla, Calif.; Clontech, Palo Alto, Calif.) 광 발생 단백질 코딩 서열을 운반하는 백본 벡터로서 이용될 수 있다.
상기에서 설명된 바와 같이, 여기서 설명되는 어떤 발현 카세트는 광 발생을 위해 외인성 기질의 첨가를 필요로 한다(예를 들면,luc및luxAB발현 카세트). 본 발명의 일 구현예에서, 기질은 알데히드이다. 세포에 투여될 때, 알데히드는 배양 배지를 둘러싸는 대기중 증기로서 적용되거나 또는 배양 배지에 액체 또는 고체로서 직접 적용될 수도 있다.
광 발생의 검출 및 정량화는 예를 들면, 증폭된 광자-계수 카메라(Hamamatsu Photonics Model 2400-32)를 이용하여 이루어진다. 본 발명의 방법에 의해 광 발생된 트랜스포먼트를 스크리닝하는데 특히 유용한 시스템은 Xenogen Corporation (Alameda, CA)사로부터 입수가능한 IVISTM이미지 시스템이다. IVISTM이미지 시스템은 고감도의 카메라(예를 들면, 냉각 통합형 카메라(Roper Scientific Model LN/CCD 1300-EB/1; Spectral Instruments model 620 냉각 CCD 카메라, SpectralInstruments, Inc., Tucson, Arizona로부터 입수 가능), 특별히 고안된 이미지 챔버 및 그것 모두를 작동시키기 위한 소프트웨어를 포함한다. 덧붙여, LivingImageTM소프트웨어는 데이터를 분석하고, 조직하고, 저장한다. 시스템의 구성요소에 대한 전형적인 설명들은 다음의 표 1과 같다.
이미지 구성요소 설명 주석
센서 배경 조명 등급 1 CCD
이미지 픽셀 1340 x 1300
픽셀 크기 20um 평방
양자 효율 ~85%> 50% 450-700nm350-900nm
노이즈 판독 < 5 electrons RMS
암전류 < 100 electrons/s/cm2
최소 검출가능한 발광 < 100 photons/s/sr/cm2 300초 노출,10 비닝,10cm 시계
렌즈 f/. 95-f/16
CCD 작동 온도 -120℃
시계 10-25 cm
IVIS 암실 치수 46cm x 46cm x 51 cm L x W x H
전력 요건 120V에서 15A
다중 광 발생 단백질 코딩 서열은 여기서 설명된 구조체 및 방법들을 사용하여 단일 생물내로 통합될 수도 있다. 일 구현예에서, 각각의 카세트는 서로에 대해 다른 특징적인 파장에서 광을 방출하는 광 발생 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 한편, 특징적인 파장에서 광을 방출하는 광 발생 폴리펩티드를 운반하는 여러 카세트들을 이용할 수도 있다. 광 발생 단백질 코딩 서열을 포함하고, 다른 특징적인 파장에서 광을 방출하는 광 발생 폴리펩티들의 이러한 여러 다양한 혼합물들을 갖는, 카세트의 조합물들을 본 명세서의 기술적인 면에서 구조화할 수도 있다.
4. 동물에서의 루시퍼라아제 발현 벡터의 평가
선택된 세포 또는 세포 타입의 트랜스포메이션에 이용하기 위한 본 발명의 구조체 및 방법들에 덧붙여, 광 발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 구조체를 운반하는 미생물은 전체 동물들에서 비침습적 이미지화에 유용하다. 전체 동물들에서의 비침습적 이미지화는 Contag,et al.의 공동 소유된 미국 특허 제5,650,135호에 설명되어 있다(또한, Contag,et al.,(1998)Nature Medicine4(2): 245-247; Contag,et al., (1996)OSA Tops on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics3: 220-224; Contag,et al., (1997)Photochemistry and Photobiology, 66 (4): 523-531; 및 Contag,et al., (1995)Mol. Microbiol. 18: 593-603를 보라).
이미지화 방법에서, 접합체는 생체적합한 본체(예를 들면, 그 게놈으로 통합된 본 발명의 구조체을 운반하는 트랜스포메이션된 박테리아) 및 광 발생 부분(예를 들면, 루시퍼라아제 효소)을 함유한다. 광-방출 접합체는 전형적으로 다양한 방법들 중 어떤 것으로 대상체에 투여되며, 대상체내에 편재화되고 이미지화된다. 이미지화, 또는 대상체로부터의 광자 방출 측정은, 수십분까지 지속될 수도 있기 때문에, 필수적이지는 않으나, 이미지화 프로세싱 동안에 대상체는 전형적으로 고정된다.
광-방출 본체의 이미지화는 극단적으로 낮은 수준의 광--전형적으로 단일 광자 사건--을 검출하고 이미지가 구조화될 수 있을 때까지 광자 방출을 통합할 수 있는 사진 검출기의 이용을 포함한다. 이같은 감광성의 사진 검출기의 예는 단일 광자 발생이 카메라에 의해 검출되기 전, 단일 광자를 증대시키는 장치, 및 검출시스템 중에서의 고유한 배경 잡음에 대해 단일 광자를 검출할 수 있는 (예를 들면, 액체 질소로 냉각된)카메라를 포함한다.
광자 방출 이미지가 일단 발생되면, 방출된 광자의 생성원에 대한 기준 프레임을 제공하기 위해 전형적으로 "선명하게" 반영된 대상체의 광 이미지 위에 이중인화된 유사한 색상의 이미지로서 발현된다 (예를 들면 대상체에 대해 광-방출 접합체를 편재화한다). 다음으로 이같은 "합성물" 이미지를 분석하여 대상체에서 리포터 유전자의 위치 및/또는 발현 정도를 결정한다.
4A. 동물의 감염
여기서 설명된 카세트들은 동물에서 다양한 원핵 및 진핵 세포들을 평가하는데 유용하다. 예를 들면, 설명된 카세트들은 병원성 생물의 게놈내로 통합될 수 있으며(예를 들면,Candida, 그람-양성 박테리아, 등), 이후 전체 동물내로 도입될 수 있다. 다음으로 동물은 생체내 감염프로세싱을 추적하고 감염 억제에 대한 효율성에 대해, 신규한 항생제와 같은, 잠재적인 항-감염성 약제를 평가하는데 이용될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 여기서 설명된 발현 카세트는 (예를 들면, 루시퍼라아제 발현 카세트를 운반하는 박테리아 또는 곰팡이 세포들에 의해 감염된)포유류의 대상체에서 비침습적 이미지화 및/또는 광-방출 접합체의 검출에 유용하다. 트랜스포메이션된 세포들은 세포 또는 조직 타입에 편재화될 수 있도록 시험 대상체에 투여될 수 있다. 한편, 트랜스포메이션된 세포들은 대상체에서 균일하게 분포할수 있도록 투여될수 있다.
4B. 기질 투여
상기에서 설명된 바와 같이, 여기서 설명된 어떤 발현 카세트들은 광 발생을 위한 외인성 기질(예를 들면, 루시페린)의 첨가를 필요로 한다(예를 들면,luc및LuxAB발현 카세트). 본 발명의 일 구현예에서, 기질은 알데히드이다. 기질은 또한 전체 동물에 투여될 수도 있다. 기질의 적절한 농도는 구조화된 시험 동물의 각 주에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 기질(전형적으로, 루시페린)은 관심 분석대상체의 투여 전, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 기질의 투여 경로는 분석대상체에 대해 설명된 바와 같다. 기질에 대한 바람직한 투여 경로는, 정맥내 또는 국소 투여, 또는 예를 들면 증기와 같이 대기중에서 기질을 제공하는 것을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
5. 본 발명의 구조체의 이용
일 양태에서, 본 발명은 다양한 세포 타입에 대한 트랜스포메이션 벡터로서 이용된 프로모터 함유의 또는 프로모터 비함유의, 광 발생 단백질 코딩 서열 구조체에 관련된다. 본 발명은 본 발명의 구조체가 성공적으로 도입된 세포를 식별하도록 한다. 트랜스포메이션의 리포터로서 광 발생을 이용하는, 여기에서 설명된 방법은, 예를 들면, 항생제 내성 박테리아, 영양요구성 마커를 가지지 않은 효모균과 같이, 이용될 수 있는 선택가능한 마커가 알려져 있지 않은 세포 타입의 트랜스포메이션에 특히 유용하다. 본 발명의 트랜스포메이션 방법은 다음의 단계들을 포함한다. 첫째 바람직한 표적 세포의 세포 모집단을 준비하고, 다음으로 광 발생 단백질 코딩 서열 구조체를 기술분야에서 알려진 트랜스포메이션 방법, 예를 들면 (칼슘 침전; 폴리에틸렌 글리콜 침전; 아세트산 리튬/폴리에틸렌 글리콜 트랜스포메이션, Braun 및 Johnson (1997)Science277 (5322): 105-9; 및 일렉트로포레이션, De Backer, Maeset al. (1999)Yeast15 (15): 1609-18)을 이용하여 세포를 트랜스포메이션하는데 이용한다. 광 발생 단백질 코딩 서열 구조체를 취하고, 광발생 단백질을 발현하는 세포를, 예를 들면, 이미지 시스템을 이용하여 식별하였다. 트랜스포메이션된 세포들은 본질적으로 트랜스포메이션된 세포의 순수 배양물을 생성하기 위해, 예를 들면, 단일 콜로니에 대해 희석 플레이팅하거나 스트레이킹함으로써 전형적으로 더 정제한다.
본 발명의 일 양태에서, 프로모터를 가지지 않은 광 발생 단백질 코딩 서열 구조체를 이용한다. 이 경우, 광 발생 단백질 코딩 서열의 발현은 전형적으로 표적 세포의 게놈으로의 통합에 의존하며, 대체로 통상적으로 통합 사건은 표적 세포에서의 활성의 전사 조절 요소들에 인접하고 있다.
본 발명의 또 하나의 양태에서, 프로모터 함유 광 발생 단백질 코딩 서열 구조체를 이용한다. 이 경우, 광 발생 단백질 코딩 서열은 표적 세포의 게놈에 통합되거나, 플라스미드(또는, 다른 에피소멀 또는 염색체외 벡터) 상으로 운반될 수 있다.
본 발명의 카세트는 폭넓고 다양하게 적용하는데 유용하다. 예를 들면, 이들은 표적 세포가 관심 유전자 또는 핵산 서열로 트랜스포메이션되었는지 여부를 감정하기 위해 관심 유전자 또는 핵산 서열과 함께 이용될 수도 있다. 다시 말해, 광은 예를 들면 일렉트로포레이션, 또는 파아지-매개 형질 도입 또는 접합을 통해 표적 세포(예를 들면, 병원성 생물)의 성공적인 트랜스포메이션을 나타내는 리포터로서의 일한다. 이는 트랜스포메이션 사건에 대해 감정하는데 전형적으로 이용되는 선택가능한 마커를 사용할 수 없는(약 내성과 같은) 세포에 특히 유용하다.
트랜스포먼트는 유효한 약학적 약제를 식별하고 그들의 작용점을 결정하는데 또한 이용될 수도 있다. 성공적으로 트랜스포메이션된 표적 세포들을 분리한 후, 다음으로 각 군들이 하나이상의 관심 유전자 또는 핵산 서열 및/또는 활성 프로모터를 함유하는, 복수의 군의 실험동물을 감염시키는데 표적 세포를 이용할 수 있다. 다음으로 군을 관심 약제로 처치하고, 시험 동물들 및 감염된, 비처치의 대조 동물들 둘 모두를 광 발생에 대해 모니터링하였다. 전사 및/또는 번역(직접이든 간접이든)을 억제하는데 유효하거나 또는 트랜스포메이션된 세포의 능력을 정상적으로 기능하도록 동요시키는 약제는, 처치된 시험 동물들에서 광 발생을 억제하는 반면, 대응하는 감염된, 비처치의 대조 동물들에서는 광 발생이 관찰될 것이다. 한편, 광 발생을 강화하는 화합물들이 또한 식별될 수도 있다.
본 발명에 의해 알게된 바와 같이 빛을 발생하기 위해 변형된 생물들은 예를 들면, 감염물들, 식료품, 음료수 중 및 식품 제조면 상에서 미생물의 존재를 모니터링하는데 이용될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법들은 트랜스포먼트를 선택하기 어려운 세포들, 예를 들면, 병원성 진핵 생물(예를 들면, Candida), 및 원내 병원체들(예를 들면,Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium의 메티실린 내성 세포주, 및 다른 항생제 내성enterococci)를 포함하지만 이들에 한정되지는 않는 항생제-내성 박테리아로 핵산(예를 들면, DNA)를 도입하는데 유용하다.
하기는 본 발명을 수행하기 위한 구체적인 구현예들의 실시예들이다. 실시예들은 단지 설명을 목적으로 제공되었으며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
재료 및 방법
다르게 지시되지 않은 한, 세포, 단백질 및 핵산(예를 들면, DNA)에 대한 조작은 표준 방법들, 예를 들면 Sambrook,et al., 및 Ausubel, F. M.,et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley 및 Sons, Inc., Media, PA (1995)에서 설명된 대로 수행하였다. 다르게 지시되지 않는 한, 제한 효소들은 New England Biolabs로부터 입수되었으며, 변형 효소들은 Promega 또는 Boehringer Mannheim로부터 입수되었으며, 다른 실험 화학 물질들은 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)로부터 입수하였다.
이용된 수치들(예를 들면, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 확보하기 위해 노력하였으나, 몇몇 실험적인 오차 및 편차는 물론 인정되어야한 한다.
A. 외인성 알데히드의 존재에서의 생체내 스크리닝
luxCDE유전자를 함유하지 않는 박테리아의 플레이트 또는 배양물을 이미지화하기에 앞서서 외인성 알데히드 기질을 첨가하였다. 플레이트를 이미지화하기 위해, n-데실 알데히드(decanal; Sigma Chemical Company)를 이미지화될 박테리아를 함유하는 플레이트를 덮는 리드의 내측 면에 대해 분사하고("알데히드 증기 이미지"), 다음으로 플레이트를 미국 특허 제 5,650,135호에 설명된 대로 본질적으로 증폭된 CCD 카메라(Hamamatsu Photonics model 2400-32)를 이용하여 이미지화하였다. 액체 배양물을 이미지화하기 위해, (50% 에탄올 중)1% 데카날 용액 1㎕를 적절한 배양물의 약 10배 희석물 1ml에 첨가하였다.
B. DNA 및 클로닝의 제조
다르게 지시된바가 없으면, 하나 이상의 제한핵산 내부가수분해효소로 다이제스쳔한 후, DNA 샘플들을 85℃에서 15분 동안 가열하여 제한효소를 불활성화하였다. 16℃에서 밤새 리게이션을 행하였다.
C. 박테리아 세포들의 트랜스포메이션
항체반응을 일으키는 세포들의 제조.다르게 지시되지 않는 한, 박테리아 세포를 다음과 같이 트랜스포메이션하였다. 박테리아 배양물을 LB에서 밤새 증식시켰다. 5ml의 각 배양물을 500ml부피의 플레쉬 LB를 접종하는데 이용하였다. 이들 배양물들을 37℃에서, O.D(600nm)가 약 0.6에 이를 때까지 흔들었다. 다음으로 세포들을 30분동안 얼음으로 냉각하고, 4℃에서 10분동안 3,000 x g에서 원심분리하여 수집하였다. 세포들을 찬 0.5 M 수크로스(S. aureus) 또는 ddH20(E. coli) 중 어느 것 50ml에 재현탁한 후, 재-원심분리하고 찬 0.5M 수크로스(S. aureus) 또는 ddH20(E. coli)중 어느 것 5ml에 재현탁하였다. 이 단계에서, 세포들을 30분동안 얼음위에 둔 후, 다음으로, 재-원심분리하고 5ml의 찬 10% 글리세롤중에 재 현탁하였다. 각 세포 타입의 일정 표본들을 얼리고 -80℃에서 저장하였다.
일렉트로포레이션.플라스미드 DNA를 Qiagen 컬럼을 이용하여 정제하고, 투석하고 "GenePulser" (BioRad)를 이용하여 항체반응을 일으키는 세포로 일렉트로포메이션하였다. 25μF, 2.5kV, 및S. aureus에 대해서는 저항 100ohms 또는E. coli및S. pneumoniae에 대해서는 저항 400ohm으로 세팅하였다. 세포들을 회복시키기 위해 37℃에서 2시간 1ml의 배양 배지에 둔 후, 필요한 선택 항생제를 함유하는 적당한 한천 위에 플레이팅하였다.
D. 샘플 이미지화
본질적으로 Contag,et al.,의 미국특허 제 5,650,135호에 설명된 대로, 아래 지시된 바와 같이 최소의 변형으로 샘플들을 이미지화하였다.
(아래 설명된) 본 발명을 지지하기 위해 수행된 시험예들에서, 샘플에 의해 발생된 광의 양을 증폭된 광자-계수 카메라 (Hamamatsu Photonics Model 2400-32) 또는 냉각 통합형 카메라를 이용하여 정량하였다. 냉각 통합형 타입의 카메라와 관련하여, 이용된 특정의 기구는 세개의 제품/모델: (1) Princeton Instruments Model LN/CCD 1340-1300-EB/l; (2) Roper model LN-1300EB 냉각 CCD 카메라 (Roper Scientific, Inc., Tucson, Arizona로부터 입수가능); 및 (3) Spectral Instruments model 600 또는 model 620 냉각 CCD 카메라(Spectral Instruments, Inc., Tucson, Arizona로부터 입수가능) 중에서 선택되었다. 바람직한 장치는 각각 Hamamatsu Photonics camera number XEN-3 및 Princeton Instruments camera number XEN-5이며, 둘 모두 Xenogen Corporation, Alameda, California에 위치한다. 두 카메라 타입들 모두 선택된 단위 면적 당 광자수에 비례하는 시그널을 형성하기 위해 충전-커플링 장치 배열(CCD 배열)를 이용한다. 선택된 단위 면적은 단일 CCD 픽셀에 의해 검출되는 것 만큼이나 작거나, 또는 비닝이 이용된 경우, 어떤 선택된 픽셀군에 의해 검출되는 것 만큼 작을 수도 있다. 이 시그널은 선택적으로 Hamamatsu Photonics로부터 입수가능한 Argus와 같은, 이미지 프로세스를 통해 경로화될 수도 있으며, 다음으로 "LivingImage" (Xenogen Corporation, Alameda, CA)와 같은, 이미지-프로세싱 소프트웨어 업무를 수행하는 컴퓨터(PC running Windows NT (Dell Computer Corporation; Microsoft Corporation, Redmond, WA) 또는 맥킨토시(Apple Computer, Cupertino, CA))에 전송된다. 소프트웨어 및/또는 이미지 프로세서는 이미지를 포착하는데 이용되고, 컴퓨터 데이터 파일로서 저장된다. 데이터는 일반적으로 (x, y, z)값의 형태를 취하며, 이때 x 및 y는 시그널이 수집되는 지점 또는 부분의 공간적인 좌표를 나타내며, z는 지점 또는 부분에서의 시그널 양을 나타내며, "상대적인 광 단위 (RLUs)로서 표현된다.
해석을 돕기 위해, 데이터는 전형적으로 "유사한 색상" 이미지로서 디스플레이되며, 이때 특정 지점에서 z값(시그널 양)을 정의하는데 컬러 스펙트럼이 이용된다. 또한, 유사한 색상의 시그널 이미지는 전형적으로 반사된 광 또는 "선명한" 이미지를 위해 이중인화되어 기준 프레임을 제공하도록 한다.
안정한 광자-방출 기준(예를 들면, Xenogen Corporation로부터 입수 가능)를 이용하여 눈금 표시된 카메라에 시그널이 포착된 경우, 어떤 카메라에서의 RLU 시그널 값은 동일한 광자-방출 기준를 이용하여 눈금 표시된 어떤 다른 카메라에서의 RLUs과 비교될 수 있는 것이 적절할 것이다. 또한, 절대적인 광자 플럭스(단위 시장내에 단위 면적에서 방출된 광자들)에 대해 광자-방출 기준을 눈금 표시한 후, 기술 분야에서의 기술자는 이같은 카메라에서의 RLU 값을 광자 플럭스 값으로 전환할 수 있으며, 다음으로 단위 시간 당 샘플 중 트랜스포메이션된 세포에 의해 방출된 광자의 수를 계산한다.
E. 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용한 광 산출량의 정량화
용액의 희석물들을 96-웰 플레이트의 웰에 플레이팅하고, 상기 설명된 대로 플레이트를 Xen-3 카메라에서 이미지화함으로써, 용액중 세포에 의해 발생된 광의 양을 정량화하였다. 다음으로 LivingImage 소프트웨어를 이용하여 특정 웰에서의 광에 대응하는 시그널을 나타내는 이미지 각각의 부분을 둘러싸 한정하는 테두리를 이중인화하였다. 이들 각 부분으로부터의 시그널을 정량화하고, 각 웰에 대한 단일 RLU 값으로 표현하였다. 이들 RLU는 실시예 13, 14 및 15를 포함한, 하기 상세화된 여러 연구들에 이용되었다.
실시예 1
그람-양성 lux 트랜스포손의 구조화: Tn4001 luxABCDE km R
다음과 같이luxABCDE km R카세트를 구조화하였다: pDL289 (Buckley, N. D., et al. (1995)J. Bacteriol.177: 5028-5034)로부터 얻은 그람-양성 카나마이신 카세트를 프라미어 KanF2 (5'-CTG TAG ACT CGA GGA GGG AAA TAA TAA ATG GC; SEQ ID NO: 1; 진하게 된 글자는XhoI 부위를 나타낸다) 및 KanR2 (5'-CAG AGTGTC GACAGT TGC GGA TGT AC; SEQ ID NO: 2; 진하게 된 글자는SalI부위를 나타낸다)를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭은 95℃에서 15초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 2분동안에 30의 가열/냉각 사이클로 수행하였다.
얻어진 증폭 생성물은 프로모터가 없는km R항생제 내성 유전자를 제공하였다. 다음으로 증폭 생성물을XhoI/SalI로 절단하고luxABCDE카세트의 바로 아래 pSK-luxABCDE플라스미드 구조체(플라스미드 구조화에 대한 보다 상세한 것을 위해서는 공동-미결의 및 공동-소유된 미국 특허출원 Serial No. 09/657,289를 보라)의SalI 부위로 리게이션하였다.
pSKluxABCDE km R플라스미드 구조체를E. coliDH5α 세포로 일렉트로포레이션하고, 트랜스포메이션된 박테리아를 25㎕/ml 카나마이신을 함유하는 LB플레이트 위에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 얻어진 트랜스포먼트를 광자-계수 CCD 카메라(Hamamatsu Photonics, Shizuoka Pref., Japan; model 2400-32)를 이용하여 광 발생(재료 및 방법을 보라)에 대해 스크리닝하였다.E. coli(그람음성)중 카나마이신 내성 및 생물발광 둘 모두의 발현을 pBluescript II SK+ 또는 SK- 벡터 백본에서 발견된lacZ프로모터로 중재하였다. DNA를 생물발광 콜로니로부터 제조하였다.luxABCDE코딩 서열에 대해 카나마이신 카세트(예를 들면, 코딩 서열)의 정방향을SalI에 의한 DNA의 제한 다이제스쳔 및 얻어진 제한 패턴의 분석에 의해 확인하였다.
lux및km R유전자를 함유하는 Tn4001카세트를 구조화하기 위해,luxABCDE km R카세트를SpeI/SalI를 이용하여, 상기 제조된 pSKluxABCDE km R구조체로부터절단하였다. 절편 말단을 뉴클레오타이드로 채워 두가닥-말단 분자를 생성하도록 하였다. 이들 분자들을 플라스미드 pMGC57(Lyonet al.(1998)EMBOJ.17: 6263-6275)의EcoRV 부위로 리게이션하고, 구조체들을 DH5α 세포로 일렉트로포메이션하였다. 트랜스포메이션된 박테리아를 15㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 LB배지 위에 플레이팅하였다. 얻어진 트랜스포먼트들을 광 발생, 클로람페니콜-내성(CmR) 및 카나마이신 내성(KanR)에 대해 스크리닝하였다. 광-발생, CmR, KanR 콜로니로부터 DNA를 제조하였다.luxABCDE km R카세트의 정방향, 예를 들면 Tn4001트랜스포손의 5'말단에 대한luxA서열의 5'말단의 위치를 DNA의 PCR분석에 의해서 뿐만 아니라 제한 다이제스쳔(XhoI/NdeI 및XhoI/EcoRV) 및 제한 패턴 분석에 의해 확인하였다. 앞서 상세화된 조건하에서 프라이머 MGC-CAT-F1 (5'-GGT GTC CCT GTT GAT ACC G-3', SEQ ID NO: 3) 및 LuxA-Rev (5'-CCA CAC TCC TCA GAG ATG CG-3', SEQ ID NO : 4)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 절편 크기로 정방향을 식별하였다.
실시예 2
Tn 4001 luxABCDE km R 다용도 벡터 구조체의 구조화
A.pAUL-A Tn 4001 luxABCDE km R 다용도 벡터 구조체의 구조화
lux및km R유전자를 함유하는 Tn4001카세트(IRluxABCDE km R tnpIR를 의미하며 이때, IR은 역전된 반복물을 나타내며 tnp는 Tn4001유전자 전위 효소를 암호화하는 유전자를 나타낸다)를 그람 음성 복제 원형 및 (본질적이거나 또는 조건부의, 예를 들면 온도-민감성의)그람 양성 복제 원형을 갖는 폭넓은 범위의 다용도 벡터로 삽입하였다. 이 같은 다용도 벡터의 한 예가 그람양성 및 그람-음성 박테리아 둘 모두에서 기능적인 에리트로마이신 내성 유전자를 함유하는 pAUL-A 벡터(Chakraborty, et al. (1992)J. Bacteriol.174: 568-574)이다. 이 벡터는 그람-음성 복제 원형 및 온도-민감성 pE194 그람-양성 복제 원형 둘 모두를 함유한다.
여기서, 본 발명의 트랜스포손 카세트를, 하기와 같이 개략적으로 나타내었다. 역전된 반복물(IR)은 일반적으로 트랜스포손가능한 요소의 말단을 지시한다. 따라서 트랜스포손을 위한 한 지시가 IR-tnp-IR이고, tnp는 유전자 전위 효소를 암호화하는 유전자를 의미한다. 추가의, 요소들이 트랜스포손에 첨가될 수 있으며, 예를 들면luxABCDE km R카세트의 첨가를 개략적으로 IRluxABCDE km Rtnp IR로 나타내는 것처럼 유사하게 지시한다.
IRluxABCDE km R tnpIR 카세트를 효소EcoRI/XhoI를 이용하여 pMGC57로부터 절단하고, pAUL-A 다용도 벡터의EcoRI/SalI 부위로 리게이션하여 다용도 벡터 구조체 pAUL-A Tn4001 luxABCDE km R를 제공한다.
E. coli세포(DHa5)를 일렉트로포레이션에 의해 다용도 벡터 구조체로 트랜스포메이션하고, 150㎛/ml의 농도로 에리트로마이신을 함유하는 LB플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 얻어지는 트랜스포먼트를 광 발생, 에리트로마이신-내성(EmR) 및 카나마이신-내성(KanR)에 대해 스크리닝하였다.다음으로 플라스미드 DNA를 광-발생, ErR, KanR 콜로니로부터 분리하였다.
B. pSK Tn 4001 luxABCDE km R pE194 다용도 벡터의 구조화
Tn4001 luxABCDE구조체에 대한 수송 시스템으로써 pAUL-A를 이용하는 대신에, 플라스미드 pSK 및 pE194를 조합하여 이용하였다.
Tn4001카세트를 다음과 같이 pMGC57로부터 pSK로 옮겼다: Tn4001카세트를XhoI/PstI를 이용하여 pMGC57로부터 절단하고, 유사하게 절단된 pSK로 리게이션하였다. 이 리게이션을 항체반응을 일으키는E. coliDH5α로 일렉트로포레이션하고, 100㎍/ml 암피실린, IPTG, X-gal을 함유하는 LB에 대해 트랜스포먼트를 선택하였다. 흰색 콜로니들을 Tn4001유전자 전위 효소 유전자로부터 프라이머 포함 서열을 이용하여 PCR에 의해 스크리닝하였다. PCR에 의해 양성이 되도록 지시된 콜로니를 프라이머 프랩하고 이들 DNA를XhoI/PstI로 절단하고 올바른 크기의 절편들을 함유하는지를 확인하였다.
다음으로luxABCDE km R카세트를 두개의 IR서열 사이에 놓여지도록 pSK Tn4001로 옮겼다. 첫째, 암피실린 카세트를 효소AhdI/KpnI를 이용하여 (pSK Tn4001로의lux카세트의 후속적 클로닝을 추가하기 위해)pSKluxABCDE km R로부터 제거하였다. 다음으로luxABCDE km R카세트를BamHI/XhoI로 암피실린 제거된 pSK 백본으로부터 절제하였다. 다음으로 pSK Tn4001DNA를EcoRV로 절단하고, 두가닥-말단luxABCDE km R카세트로 리게이션하였다.
리게이션은 항체반응을 일으키는E. coliDH5α로 일렉트로포레이션하고 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB에 대해 트랜스포먼트를 선택하였다. 광 트랜스포먼트를 클로람페니콜 또는 카나마이신 위에 첩부하고, 양성 콜로니의 정방향을 프라이머 M13F 및 LuxA-R를 이용하여 PCR에 의해 확인하였다.
다음으로, pSK Tn4001 luxABCDE km R을SacI으로 선형화하고 두가닥-말단화 하였다. 마지막으로, 이 DNA를 다음으로 두가닥-말단 Clal-절단 pE194로 리게이션하여, pSK Tn400l luxABCDE km RpE194 다용도 벡터 구조체를 얻었다.
이 구조체를 항체반응을 일으키는E. coliDH5α로 일렉트로포메이션하였다. 150㎍/ml 에리트로마이신을 함유하는 LB에 대해 트랜스포먼트를 선택하였다. 얻어진 광 콜로니는 다음으로 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 및 50㎍/ml 카나마이신 또는 15㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 LB 위로 첩부하였다.
C. pE194 Tn 4001 pSK luxABCDE km R' 다용도 벡터의 구조화
Tn4001 luxABCDE km R다용도 벡터를 구조화하고, 이때 그람-음성 원형을 두 IR서열 사이에 위치시켰다. 첫째로, 플라스미드 pMGC57를 함유하는 그람-음성 Tn4001를 그람-양성 에리트로마이신 내성 플라스미드 pE194와 연결하였다. pMGC57를PstI/BamHI로 절단하고 두가닥 말단화하였다. 동시에, pE194을 CIaI로 절단하고 두가닥 말단화하였다. 다음으로 이들 두 선형화된 플라스미드를 리게이션하고, 이 혼합물을 항체반응을 일으키는E. coliDH5α로 일렉트로포메이션하고 150㎍/ml 에리트로마이신을 함유하는 LB에 대해 트랜스포먼트를 선택하였다.
두번째로, 클로람페니콜 내성 카세트 및 그람-음성 원형을 pMGC57/pE194 혼성물로부터 제거하였다. 다수의 상기 에리트로마이신 내성 콜로니들로부터 정제된 플라스미드 DNA를KpnI/XhoI로 절단하고(클로람페니콜 내성 카세트 및 그람-음성 원형을 떼어내는 부위), 올바른 크기의 플라스미드를 식별하기 위해 각 다이제스트의 배분을 아가로스 겔에서 수행하였다. 올바른 크기가 되는 것처럼 보이도록 플라스미드 다이제스트의 나머지를 두가닥 말단화하고 리게이션하였다. 이 리게이션을S. aureusRN4220로 일렉트로포레이션하고 0.3㎍/ml 에리트로마이신을 함유하는 초콜렛 한천 위에 플레이팅하였다.
마지막으로, pSKluxABCDE km플라스미드를 Tn4001의 IR내로 도입하였다. 10 개의 pMGC57/pE194 ori cmR S. aureus클론으로부터 정제된 플라스미드 DNA를EcoRV로 절단하고, 각 다이제스트에 대한 배분을 아가로스 겔에서 수행하여 올바른 크기의 플라스미드를 식별하였다. 올바른 크기(약 6kb)를 나타내는 플라스미드 다이제스트의 나머지를 두가닥-말단BamH1 절단 pSKluxABCDE kmDNA로 리게이션하였다. 이 리게이션을 DH5α로 일렉트로포메이션하고 150㎍/ml 에리트로마이신을 함유하는 LB에 대해 트렌스포먼트를 선택하였다. 생물발광 콜로니를 50㎍/ml 카나마이신 또는 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 플레이트상에 이중으로 첩부하여 후자의 항생제 카세트의 활성을 확인하였다. 정방향에서 전자의 플라스미드로 리게이션하는 pSKluxABCDE km의 가능성이 약 50%가 되어야 하기 때문에, 이같은 변형체는S.aureus(단지, 트랜스포지션에 의해 생물발광을 나타내는 정방향에서 lux를 갖는 플라스미드)에서 표현형에 의해 식별될 수 있다.
실시예 3
생물 발광 트랜스포젼트의 고밀도 스크리닝
선택적인 배지의 이용에 대한 대안으로서, 생물발광 콜로니를 선택적 검출 및 수동 분리를 이용하여 고체 배지상에 고밀도로 플레이팅된 콜로니로부터 분리하였다.
S. aureus8325-4 세포를 pE194Tn40001 luxABCDE로 트랜스포메이션하고, 플레이트당 104내지 105세포의 밀도로 고체의 비선택적인 배지 플레이트 위에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 증식시켰다. ICCD 카메라를 이용하여 강력한 생물발광 단일 콜로니를 검출하고, 그들 콜로니를 일회용 마이크로 피펫 끝을 이용하여 수집하였다: 바람직한 콜로니의 광 발생 표현형을 카메라를 이용하여 확인하였다. 콜로니를 액체 성장 배지 부피를 접종하는데 이용하고, 다음으로 플래쉬 배지 플레이트상에 회선하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 회선한 플레이트위의 단일 콜로니중에서 본질적으로 균일한 광 강도를 관찰하는 것에 의해 순수 콜로니의 분리를 확인할 때까지 프로세스를 반복하였다.
앞서의 것은 본 발명의 트랜스포손 카세트로 트랜스포메이션된 관심 생물의 분리 수단으로서 항생제 선택에 대한 요구를 막는 방법을 나타낸다.
실시예 4
Candida albicans에 대한 통합성 게놈 표적화 벡터의 구성
C. albicans 의 트랜스포메이션과 스크리닝 및 트랜스포메이션된 균주의 사용
A. 벡터 구성
Candida albicans에서 루시페라제를 발현하기 위해서, 루시페라제 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)에서 CTG 코돈은 하기와 같이 변경되었다. 먼저, μgL2-Basic에서의 루시페라제 유전자를 두 조각으로 절단하여 모든 9개 CTG 코돈의 TTG 코돈으로의 돌연변이 유발을 촉진시킨다. 하나의 단편은 4개의 CTG 코돈을 함유하고 나머지 5개는 CTG 코돈을 함유하였다. 이들은 개별적으로 pBluescript II KS(+)으로 클로닝되었다. 코돈은 QuikChangeTM부위 특이적 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)를 사용하여 변경되었다. 각각의 돌연변이 유발 단계 후에, 생성물을 서열분석하여 원하는 돌연변이가 포함되어 있다는 것을 확인하였다.
간략히,Photinus pyralis루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드 pgL2-Basic(Promega)를XbaI및EcoRI로 제한시키고 루시페라제 오픈 리딩 프레임에서 CTG 코돈중 4개를 함유하는 540 bp 단편은 pBluescript II KS(+)(Stratagene)로 클로닝되었다. 둘째로, 나머지 5개 CTG 코돈을 함유하는 751 bpEcoR I-EcoR V단편을 개별적으로 pBluescript II KS(+)로 클로닝하였다. 이들 9개 CTG 코돈을 QuikChangeTM부위 특이적 돌연변이 유발 키트(Stratagene)에 의해 TTG로 돌연변이시켰다. 상보적 프라이머의 쌍은 부위 특이적 돌연변이 유발 키트와 함께 사용을 위해 구성되었다. 도 1은 루시페라제의 부위 특이적 돌연변이 유발에 사용된 상보적 올리고뉴클레오티드 쌍을 나타낸다. 이들 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유발에 의한 잠재성 돌연변이를 pgL2 Basic의Photinus pyralis루시페라제 유전자 안으로 포함시켰다. 굵은 글씨체로 표시한 뉴클레오티드는 변화 CTG -> TTG에 필요한 변화이다. 밑줄 표시한 뉴클레오티드는 프라이머 안정성에 필요한 염기 변화이다. 이들 변화는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는다. 더욱이, 프라이머 RR45T 및 RR45B에 대해, CTG가 TTG로의 두가지 돌연변이는 충분히 가까워서 양쪽이 하나의 반응에 포함되었다.
모든 9개 코돈의 돌연변이 유발후에, 돌연변이를 함유하는Xba I-EcoR I및EcoR I EcoR V단편을 pBluescript II KS(+)로부터 잘라내고 pgL2-Basic으로 다시 클로닝하여 pLucT9를 제조하였다.
루시페라제 코돈을 변경시키는데 더하여, 구성체는 또한 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하도록 만들어지고, 양쪽 모두Candida으로부터 유도되었다. 이러한 목적을 위해, pBluescript II KS+를 Not I으로 커팅하고, 단부를 채우고, 포스포릴화 Asc I 링커 (5'-AGGCGCGCCT-3' ; SEQ ID NO : 21)를 뭉뚝한 부위안으로 결찰시켜 pBS-ASC를 제조하였다. 9개 TTG 코돈을 함유하는 루시페라제 오픈 리딩 프레임을 PCR에 의해 프라이머 LUCB 및 LUCP를 갖는 pLucT9로부터 증폭시켜(도 2A),Bam HI및Pst I부위에 의해 직접적으로 측면에 위치한 변형된 루시페라제 오픈 리딩 프레임을 함유하는 생성물을 제조하였다. 증폭된 생성물을Bam HI및Pst I으로 제한시키고 pBS-ASC으로 클로닝하여 플라스미드 pBS-L를 제조하였다. C. albicans 작용(ACT1) 유전자의 전사 말단 영역(Delbruck and Ernst (1993) MolMicrobiol 10 (4): 859-66)은 PCR에 의해 프라이머 ACT-TP 및 ACT-TH를 갖는 CAI4 게놈 DNA로부터 증폭되고(도 2A),Pst I및Hind III으로 절단되고, pBS-L로 결찰하여 pBS-LA를 제조하였다.
C. albicans Enolase 유전자(ENO1)의 프로모터 (Sundstrom and Aliaga (1992) JBacteriol 174 (21): 6789-99)는 PCR에 의해 프라이머 ENOA and ENOB 를 갖는C. albicans균주 CAI4 DNA (도 2A)로부터 증폭되었다. 그것이 규제되지 않은 구성요소 발현을 가지는 것으로 나타났기 때문에 ENO1 프로모터가 선택되었다 (Postlethwait and Sundstrom (1995) JBacteriol 177 (7): 1772-9).
증폭된 PCR 생성물을Asc I및Bam HI으로 절단하고 동일한 제한 효소로 절단된 pBS-LA로 클로닝하여 pBS-ELA를 제조하였다. 따라서, ENO1 프로모터는 루시페라제 시작 코돈의 바로 상류에 삽입된 Bam HI 부위를 통해, 변경된 루시페라제 오픈 리딩 프레임에 융합되었다. Pst I 부위는 루시페라제 유전자의 스톱 코돈 직후에 놓였다.
Not I부위로부터Xho I부위로의 pBluescriptII KS(+)의 다중 클로닝 부위는 제한 효소 부위Not I, Asc l, Hind III, Fse 1, SbfI,및Xho I를 함유하는 합성 링커로 대체하여(도 2A; 합성 링커 A, SEQ ID NO : 34; 합성 링커 B, SEQ ID NO : 35; 및 도 2C는 이들 두개의 합성 링커의 상보적 쌍형성을 나타낸다) pBS-NX를 제조하였다. 프로모터-루시페라제 종결 암호 카세트를Asc I및Hind III로 pBS-ELA로부터 잘라내고 pBS-NX으로 클로닝하여 pNX-ELA를 제조하였다. URA3 유전자는C. albicans-E. coli셔틀 플라스미드 pRC2312 (Cannon (1992), 상기)로부터 프라이머 URAH 및 URAF를 갖는 PCR에 의해 증폭되었다(도 2A). 증폭된 생성물을Hind III및Fse I로 절단하였고 pNX-ELA로 결찰시켜 pNX-ELAU를 제조하였다.
ura3::imm434/ura3::imm434CAI4 균주에서의 모의 실험을 위해, 표적화 벡터는 완전 C. albicans URA3 유전자를 함유하였고, 그것은 그 세포에 대한 우라실 원영양균을 저장하였다. 고밀도 스크리닝에서 (하기 참조), URA3 기능에 대한 선별은 임상 분리체 ATCC 32032,10261, 및 90234로 수행되지 않았다.
모든 플라스미드 분리 및 효소 반응을 표준 조건 하에서(Ausubel, supra ; Sambrook, 상기) 또는 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 모든 라이게이션을Escherichia coli균주 DH5α(Life Technologies, Rockville MD)안으로 포함시키고, ml당 100 μg의 암피실린을 함유하는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 상장시켰다. PCR를 Geneamp PCR System 9700 자동 열 싸이클러 (Applied Biosystems)로 수행하였다. 25 pmole의 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (Operon), 5 μl의 10X PCR 완충액 (Taq DNA 폴리머라제로 공급됨; Life Technologies), 2 mM MgCl2, 0.2 mM의 각각의 데옥시뉴클레오시데트리포스페이트 (dCTP, dGTP, dTTP, and dATP ; Amersham), 1U의 Taq DNA 폴리머라제 (Life Technologies) 및 1 ng의 템플릿 DNA를 함유하는 50μl의 부피로, 얇은 벽 200 μl PCR 튜브에서 반응을 수행하였다. 증폭을 하기 조건하에서 수행하였다: 94℃에서 30 초동안 40 주기, 50℃에서 30초동안, 1-2 분동안 72℃에서 (생성물의 예상 크기에 의존한다) 및 72℃ 5분동안의 최종 확장 단계. PCR 생성물의 제한 전에, 반응 혼합물을 스핀 칼럼을통과시켰다(PCR 정제 키트;Qiagen).
C. albicans표적화 서열이 또한 선택되고 벡터안으로 삽입되었다. 표적화 벡터을 구성할때, C. albicans 게놈 DNA를 함유하는 6 코스미드의 서열을 GenBank로부터 다운로드하였다 (등록 번호: AL033501, AL033497, AL033503, AL033502, AL033396, 및 AL033391). 서열 데이타 주석으로부터 DNA 구성 키트 2TM(Textco, West Lebanon, NH)를 사용하여 추정 오픈 리딩 프레임을 매핑하였다. 어떠한 추정 오픈 리딩 프레임도 함유하지 않는 대략 3 kb의 몇가지 영역을 반복 Candida 서열 (Chibana, Magee, et al., (1998) Genetics 149 (4): 1739-52) 또는 다른 가능한 오픈 리딩 프레임에 상동인(ORFs)에 대해 조사하였다. 어떠한 추정 오픈 리딩 프레임을 함유하지 않는 큰 영역 (~3 kb)을 500 bp 섹션으로 분할하고 각각은 그때 모든 공지된 Candida 서열(스탠포드 DNA서열 및 기술센터 웹사이트 주소http://www-sequence.stanford. edu/group/candida)의 블라스트 리서치(Altschul, S. F., et al., (1990) JMol Biol 215 (3): 403-10; Altschul, S.F.,et al.,(1997) Nucleic Acid Res.25 (17): 3389-3402)에 사용되었다.
공지된 유전자에 상당히 상동이거나 반복된 서열을 갖는 영역은 고려하지 않았다. 뉴클레오티드 2356 내지 5858로부터의 코스미드 CA41C10(GenBank 등록 번호 AL033501)에서의 영역을 선택하였다. 인접 오픈 리딩 프레임으로부터 존재할수 있는 어떠한 프로모터를 포함하지 않도록, 이러한 3502 bp 영역에서 첫번째 그리고 마지막 1000 bp을 고려대상에서 제거하였다. 벡터의 5' 및 3'표적화 영역에 대해선택된 단편들은 Candida 게놈에서 125 bp에 의해 분리시킨다. 사용된 균주의 게놈 표적화 영역을 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 생성물로부터 서열분석하였다. ATCC 32032가 뉴클레오티드 4745에서 구아닌 잔기 대신에 아데닌 잔기를 갖는다는 점을 제외하고는, 공개된 코스미드 서열에서의 영역과 ATCC 32032는 동일하였다. 다른 3개의 균주는 뉴클레오티드 3942에서 구아닌, 뉴클레오티드 4645에서 티미딘 및 뉴클레오티드 4007-4131의 탠덤 복제를 가졌다.
선택된 표적화 영역들을 루시페라제 발현 카세트 및 URA3 유전자에 측면에 위치하는 표적화 벡터로 클로닝하였다. 특히, CA41C10의 뉴클레오티드 3852 내지 4307를 프라이머 TAR5N 및 TAR5A만큼 CAM DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다(도 2B). 증폭된 생성물을Not I및Asc I로 절단하고 pNX-ELAU으로 클로닝하여 pNX-5ELAU를 제조하였다. 뉴클레오티드 4436로부터 4789까지의 또다른 영역은, 프라이머 TAR3F 및 TAR3S에 만큼 CAI4 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다 (도 2B). 증폭된 생성물을Fse I및Sbf I로 절단하고 pNX-5ELAU으로 클로닝하여 μgTV-Eno을 제조하였다.Kpn I부위는 각각의 이들 표적화 영역의 외측 말단 근처에 위치한다. 구성체는Candida albicans의 트랜스포메이션을 위해 그것을 사용하기 전에Kpn I로 절단하였다.
pGTV-ENO의 구성은 도 3A, 3B, 및 3C에 그래픽으로 나타낸다.
B. Candida albicans 균주의 트랜스포메이션
그후 표적화 구성체를 Braun 및 Johnson의 방법 (Braun and Johnson (1997) Science 277 (5322):105-9) (http://www.sacs.ucsf.edu/home/JohnsonLab/burk/burk.html)의 변형을 사용하여Candida albicans를 트랜랜스포메이션하는데 사용하였고 모든 Candida albicans 트랜스포메이션에 대해 사용되었다. 100 ml 배양균을 밤새 30℃에서 50 mg/ml 우리딘으로 보충된 YPD 에서 성장시켰다(Sigma). 밤새 세포 배양균을 동일한 배지에 희석시키고 1-1.5O의 D600로 성장시켰다. 세포를 5분 동안 4000 rpm에서 펠릿화하고 20 ml LATE 완충액에 재현탁시켰다 (100 mM 리튬 아세테이트, 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA). 세포를 다시 펠릿화하고, 1 ml의 LATE 완충액에 재현탁시켰다. 100 μl의 세포를 10 μl의 10 mg/ml 변성된, 전단된 연어 정자 DNA (Sigma) 및 1-10μg의Kpn I소화된 플라스미드 DNA와 혼합하였다. 700μl의 플레이트 (LATE 완충액중의 40% 폴리에틸렌 글리콜 3350)을 첨가하고 마이크로피페터로 부드럽게 혼합하였다. 트랜스포메이션 반응을 3 시간동안 30℃에서 배양하고 42℃에서 45분 동안 열충격 주었다. 세포를 펠릿화하고 400μ1의 YPD에서 재현탁하고 루시페린을 함유하는 비선택성 배지 위에 플레이팅하였다.
C.albicansCAI4(ura3::imm434/ura3::imm434) (Fonzi and Irwin (1993) Genetics 134 (3): 717-28)는 Dr. Judith Berman, University of Minnesota, USA에 의해 친절하게 제공되었다.C. albicans균주 ATCC 32032,10261,및 90234를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터 얻었다. YPD 배지(Qbiogene, Carlsbad, CA)는 2% (w/v) 펩톤, 1% (w/v) 효모 추출물, 및 2% (w/v) 클루코스를 함유한다. 합성 정의된(SD)(Qbiogene) 배지는 아미노산이 없는 0.17%(w/v) 효모 질소 염기, 0.5% (w/v) 암모늄 술페이트, 2% (w/v) 덱스트로스 (클루코스), 및 우라실(CSM-ura)이 없는 0.077% (w/v) 완전 보충 혼합물을 함유한다. CSM-ura를 위한 제제는 다음과 같이 mg/L으로 주어진 성분과 함께이다: 아데닌 10; L-아르게닌 50; L-아스파르트산 80; L-히스티딘-HCl 20; L-이소류신 50; L-류신 100; L-리신 50; L-메티오닌 20; L-페닐알라닌 50; L-트레오닌 100; L-트립토판 50; L-티로신 50; 및 발린 140; 총 770 mg. 770mg (.77g)의 이 분말을 1L의 SD에 첨가하여 SD-ura를 만든다. 플레이트에서의 성장을 위해 한천 (Difco, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)을 1.5% (w/v)로 첨가하였다.
C. 고밀도 스크리닝
고밀도 스크리닝을 위해, 트랜스포메이션된 세포를 선형화 pGTV-Eno 구성체로 트랜스포메이션하고 트랜스포메이션된 세포를 1 ml YPD에 재현탁시키고, 600 μg/ml 루시페린 (Biosynth, Naperville, IL) (대략 2.5 x 105세포/플레이트의 밀도로)을 함유하는 50 μg/ml 우리딘으로 보충된 20개 140 mm SD-ura 플레이트 상에서 플레이팅하고, 밤새 30℃에서 성장시켰다. 이 배지에서의 플레이팅은 (YPD 배지에서의 세포 플레이팅에 비해)더 나은 광 발생을 제공하였다. 사용된 배지는 트랜스포메이션되지 않은 세포와 트랜스포메이션된 세포 등의 성장을 허용하였고, 따라서 선택적인 압력을 제공하지 않는다. 그 결과, 선별되지 않은(a lawn of) 세포들이 각각의 플레이트 위에서 성장한다.
다음날 아침 플레이트를 IVISTM영상 시스템 (Xenogen Corporation)을 사용하여 5분동안 IVISTM 영상 시스템 위에서 이미지화하였다. LivinglmageTM소프트웨어(Xenogen Corporation, Alameda, CA)를 이미지를 얻고 분석하는데 사용하였다. 어떤 경우에는, 포톤 카운팅 증강 하전 커플 장치 (ICCD) 카메라 (모델 2400-32, Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ)을 사용하여 액체 배양균과 플레이트를 이미지화하였다.
생물 발광성인 적은 수의 트랜스포메이션된 세포는 많은 트랜스포메이션되지 않은 세포의 어두운 배경에 대해 검출가능하다. 고밀도의 플레이팅에서, 순수한 콜로니의 생물 발광 세포를 고르는 것은 어렵다. 따라서, 생물 발광 콜로니의 위치 및 그 주변에서 플레이트로부터 세포를 골랐고, 1.5 ml 미세원심분리기 튜브로 이동시키고 밤새 30℃에서 50 μg/ml 우리딘으로 보충한 SD-ura에서 성장시켰다. 각각의 튜브로부터의 알리콧을 600 μg/ml의 루시페린을 함유하는 SD-ura와 함께 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣었다. 플레이트를 5분 동안 이미지화하고 생물 발광 세포를 함유하는 배양균을 희석시키고 단일 콜로니 분리를 위해 50 μg/ml 우리딘으로 보충된 SD-ura 플레이트 위에 펼쳤다. 결과의 생물 발광 세포는 반복하여 통과되었고 신호의 손실없이 안정하였다. 게다가, 표적화 영역에서 통합된 구성체를 함유하는Candida의 성장 속도는 모체 세포와 동일하다.
D. 서던 블롯법
임상적 효모 균주 ATCC 32032, 10261, 및 90234의 트랜스포먼트로부터의 게놈 DNA를 Fujimura 및 Sakuma (Fujimura and Sakuma (1993) Biotechniques 14 (4): 538-40)에 따라 분리시켰다. 게놈 DNA를 서던 블롯팅하고 게놈 표적화 영역을 스패닝하는 단편으로 프로브하였다. 모든 3개의 트랜스포메이션된 균주에서 구성체는게놈에서 정확한 위치에서 통합되었다.
E. 질 감염
암컷 BALB/c 마우스(> 6 주 나이)를 사용하였다. 위(거짓)-발정 현상을 유발하기 위해, 100 μl의 에스트라디올 발레레이트를 2mg/ml에서 세삼 오일에 용해시키고 감염전 72 내지 96 시간에 그후에는 매주 복강내 주사하였다.Candida albicans균주의 50 ml 배양균을 밤새 30 ℃에서 성장시켰다. 세포를 4,000 rpm에서 10분동안 펠릿화하고, 25 ml 포스페이트 완충화 염수 (PBS)에서 재현탁시키고 10ml PBS에서 2회 반복하였다. 그후 혈구계산판으로 세포의 수를 세고 감염을 위한 적절한 밀도로 PBS에 희석시켰다. 20μ1의 접종물 (5 x l04세포를 포함)을 피펫으로부터 질 공간안으로 투여하였다. 동물을 접종후에 1분 동안 거꾸로 그대로 유지하였다 (Romani (1999) Current Protocols in Immunology : 19.6.1-19.6.16). 접종물은 첫번째 이미지를 얻기 전에 6시간동안 그 위치에 방치하였다.
예를 들어, 감염된 마우스는 Candida의 광-발생 균주로 감염후 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 13, 15 및 21일에 이미지화되었다 (이미지화는 마우스를 고정시키고 기질의 투여를 포함하여 여기서 상기 기술한 과정에 따름으로써 수행되었다). 생체내의 일련의 시간은, 전체 마우스 이미지는 광 발생 Candida를 모니터함으로써 분명히 이미지화된 감염의 진행 과정을 보여주었다. 21일째 동물을 안락사시키고 질 조직을 잘라내고 조사하였다. 이러한 조직을 이미지화하였고, 광-발생 Candida인 전염성 약제의 존재가 분명히 증명되었다.
이미지화 직전에, 마우스를 5분동안 이소플루란으로 마취시키켰다. 상기한 전신 이미지화에 더하여, 잠들었을때, 각각의 마우스를 거꾸로 고정시키고 16.6 mg/ml 루시페린 및 16.6 mM ATP을 함유하는 100 μ1의 PBS 으로 세척하였다. 피펫 끝을 질공간에 삽입하고 세척 용액을 배출시켰다. 세척 용액을 위아래로 빨아들어 관 벽을 헹구었다. 세척에 이어, 대부분의 루시페린 용액을 제거하고 미세원심분리 튜브에 저장하고, 약 10-20μl를 질공간에 남겨두었다. 3마리 마우스의 각각의 그룹으로부터의 세척을 모으고 이미지화하였다. PBS에서의 연속 희석(lOx, 100x 및 1000x)을 50 mg/ml 우리딘 및 15 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 YPD위에 플레이팅하였다. 플레이트를 24-48시간동안 30℃에서 성장시키고 수를 세었다. 세척으로부터 얻어진 세포의 세포 형태의 광 분석에 의한 조사는 독성, 균사-형태의 Candida 세포의 존재를 드러내었다.
따라서, 이들 결과는 루시페라제-함유 구성체가 선택가능한 마커에 순응하지 않는 세포에서 리포터 구성체로서 사용될 수 있다는 것을 증명하였다. 게다가, 이들 결과는 루시페라제-함유 구성체가 트랜스포메이션 발생을 검출하는 고밀도 스크리닝에 사용되고, 추가적으로, 전체 동물에서 관찰을 허용한다는 것을 증명하였다. 반딧불이로부터의 루시페라제 유전자를 사용함으로써,Photinus pyralis는 변경되어 C. albicans에서의 그것의 발현을 허용하고, 트랜스포메이션된 Candida albicans 세포는 유전 선별을 사용 (즉, 선택가능한 마커를 채용함)하지 않고 광 발생을 위한 스크리닝에 의해 분리되었다. 전형적으로 트랜스포메이션된 세포의 검출을 위한 방법은 도입된 DNA에 의해 대체되는 영양 결핍에 의해, 또는 약물 내성에 의해 선택을 채택한다. 영양요구성 돌연변이체의 대체를 위해, 수용자 세포는 그 유전자에서 결핍되어야만 한다. 약물 내성을 위해, 세포는 그 약물에 대해 민감해야 한다. 그러나,Candida albicans는 하이그로마이신, 베노밀, 시클로헥시미드, 미토마이신 C 및 튜니카마이신에 내성이 있다 (Beckerman, Chibana, et al., (2001) Infect Immun 69 (1) : 108-114). 여기서 기술한 고밀도 스크리닝은 유전 선별을 수반하지 않고 트랜스포먼트를 얻기 위한 효과적인 방법을 제공하였다. 성공적인 트랜스포메이션은 약 5 x 10-5내지 10-6(5-10 생물 발광 콜로니/5 마이크로그램의 절단 DNA)의 진동수에서 발생하고 크게 초과하는 트랜스포메이션 되지 않은 세포들 중에서 트랜스포먼트(즉, 광 발생광 발생 검출하는데 아무런 문제가 없었다. 여기서 증명된 성공적인 트랜스포메이션은 ATCC로부터 몇개의 다른 독성 균주로 반복되었다.
C. albicans감염의 모든 현 동물 모델은 마지막에 죽음 또는 동물을 희생시키는 단계, 조직을 수확하는 단계, 세포 카운트를 위해 호모제네이트를 플레이팅/또는 미세구조를 위해 조직을 절개하는 단계를 포함한다. 이런한 접근은 일반적으로 질병 프로세스에서 단일의, 늦은 시점에 주목하고 단일 동물에서 감염의 과정을 따르는 것을 허용하지 않는다. 본 발명은 살아있는 감염된 동물에서 그후 이미지화할 수 있는 생물 발광 세포를 제공하는 방법을 기술한다. 이것은 감염의 시간적 공간적 관점의 많은 검토를 허용하며, 이는 다른 방법으로 가능하다.
본 발명의 바람직한 구체예가 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항에의해 정의된 바와 같은 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않게 명백한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 이해된다.

Claims (24)

  1. 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 방법으로서, 상기 방법은
    세포의 집단을 제공하는 단계;
    적어도 세포의 하위-집단에 의한 폴리뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하는 조건하에서 상기 세포의 집단을 광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 처리하는 단계;
    빛을 내는 세포에 대하여 상기 세포의 집단을 스크리닝하는 단계; 및
    빛을 내는 세포를 분리하는 단계 (여기에서 빛을 낼 수 있는 세포는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포이다)를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 광발생 단백질은 생물발광 또는 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 생물발광 단백질은 루시퍼라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 집단은 원핵 세포의 집단인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 원핵 세포는 항생제-내성 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 원핵 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 원핵 세포는 그람-양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 그람-양성 박테리아는Staphyolcoccus종인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 집단은 진핵 세포의 집단인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포의 집단은 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 효모는 Candida albicans인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질을 암호화하는 프로모터 비함유 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 통합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전위가능 또는 이동성 유전 요소를 포함하고, 여기에서 상기 전위가능 또는 유전 요소는 상기 광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 광발생 단백질을 암호화하는 상기 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 통합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전위가능 또는 이동성 유전 요소를 포함하고, 여기에서 상기 전위가능 또는 유전 요소는 상기 광발생 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 상기 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 고리형 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 플라스미드는 상기 세포에서 기능하는 복제 개시점을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 관심있는 제 1 코딩 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 관심있는 제 1 코딩 서열은 상기 세포에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝은 고체 배지의 플레이트 상에서 일어나고 상기 분리는 빛을 내는 세포를 포함하는 고체 배지플레이트의 영역으로부터 세포의 샘플을 채집하는 단계, 액체 배양물에서 세포를 성장시키는 단계, 각 액체 배양물의 분주를 광발생에 대하여 평가하는 단계, 빛을 내는 세포를 포함하는 액체 배양물을 식별하는 단계, 액체 배양물을 희석하고 플레이팅하여 빛을 내는 분리된 단일 세포를 얻는 단계, 및 빛을 내는 단일 세포로부터 유래된 단일 콜로니를 식별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 세포의 집단에서 트랜스포메이션된 세포를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은,
    빛을 낼 수 없는 세포의 집단을 제공하는 단계;
    적어도 세포의 하위-집단에 의한 폴리뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하는 조건 하에서 상기 세포의 집단을 광발생 단백질 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 처리하는 단계; 및
    상기 처리한 세포의 집단을 빛을 내는 세포에 대해 스크리닝하는 단계 (여기에서 빛을 내는 상기 세포는 트랜스포메이션된 세포이다)를 포함하는 스크리닝 방법.
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