KR20040010541A - 친화성 포착 탠덤 질량 분광계를 위한 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 친화성 포착 프로브 인터페이스, 레이터 탈착 이온화원 및 탠덤 질량 분광계를 포함하는 분석장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 장치를 이용하는 분자 상호 작용의 특징화와 단백질 발견 및 확인을 위한 새로운 방법을 제공한다.

Description

친화성 포착 탠덤 질량 분광계를 위한 장치 및 방법{APPARATUS AND METHODS FOR AFFINITY CAPTURE TANDEM MASS SPECTROMETRY}

개선된 성능 및 저 비용의 질량 분광계와 커플링된 전기 분무 이온화(ESI) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 기법의 출현은 지난 십년간 질량 분광계(MS)를 착체 생물학 시스템으로부터 정제된 단백질을 비롯한 생물학적으로 적절한 거대 분자의 연구에서 표준 분석 기구 사이에 자리잡게 하였다.

예를 들면, 펩티드 질량 지문법으로 알려진 기법에서, 질량 분광계는 생물학적 시료로부터 정제된 단백질을 확인하는 데 사용된다. 확인은 정제된 단백질의 단백질 분해 단편의 질량 스펙트럼을 데이타베이스로 이미 액세스된 제1 서열로부터 예측되는 질량과 정합함으로써 수행된다[Roepstorff, TheAnalyst117: 299-303 (1992); Pappin 등,Curr. Biol.3 (6): 327-332 (1993); Mann 등,Biol. Mass Spectrom.22: 338-345 (1993); Yates 등,Anal. Biochem.213: 397-408 (1993); Henzel 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 5011-5015 (1993); James 등,Biochem. Biophys. Res. Commun.195: 58-64 (1993)].

충돌 유도 해리(CID) 또는 MALDI 포스트-소스 붕괴(post-source decay; PSD)로부터 얻은 단편 질량 스펙트럼을 사용하여 정제된 단백질을 확인하는 유사한 데이타베이스-마이닝 접근법이 개발되어 왔다[Eng 등,J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5: 976-989 (1994); Griffin 등,Rapid Commun. Mass Spectrom.9: 1546-1551 (1995); Yates 등, 미국 특허 제5,538,897호 및 제6,017,693호; Mann 등,Anal. Chem.66: 4390-4399 (1994)].

또한, 분리된 단백질의 적어도 일부의 새로운 서열화를 허용하는 질량 분석 기법이 개발되어 왔다[Chait 등,Science262: 89-92 (1993); Keough 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.96: 7131-6 (1999);reviewed inBergman,EXS88: 133-44 (2000)].

현재, 단백질 질량 스펙트럼의 해석과 공개 도메인 서열 데이타베이스의 마이닝을 촉진하는 소프트웨어 자원은 단백질 확인을 촉진하기 위해 인터넷으로 쉽게 액세스할 수 있다. 이들 중에서, 단백질 프로스펙터(Protein Prospector; http://prospector. ucsf/edu), PROWL(http://prowl. rockefeller. edu), 및 마스코트 검색 엔진(Mascot Search Engine; 영국 런던에 소재하는 매트릭스 사이언스 리미티드, www. matrixscience. com)이 있다.

고정밀 질량 지정이 전술한 기법에 의해 정제된 단백질의 확인을 촉진시키는 유용한 정보를 제공할 지라도, 예를 들면 이러한 정보는 결코 한정되지 않는다. 중요한 추가의 분석력은, MS 분석과 표적 단백질의 효소적 및/또는 화학적 변형의 결합, 구조적 성분의 해석, 전사후 변성 부여 및 단백질 확인의 진행에 의하여 자유롭게 될 것이다.

또한, 복합 생물학적 재료, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 간질액, 소변, 배설물, 전체 세포, 세포 용해물 및 세포 분비 산물은 통상적으로 직접 질량 분광계 분석이 불가능한 수백가지 생물학적 분자와 유기 및 무기 염을 함유한다. 따라서, 중요한 시료 제조 및 정제 단계는 MS 조사 전에 통상적으로 필요하다.

통상적으로, 시료 정제의 전형적인 방법, 예컨대 액체 크로마토그래피(이온 교환, 크기 배제, 친화 및 역상 크로마토그래피), 막 투석, 원심 분리, 면역 침강 및 전기 영동은 대량의 출발 시료를 요구한다. 이러한 양의 시료가 이용 가능할지라도, 부성분은 이러한 정제 공정에서 손실될 수도 있는데, 비특이성 결합 및 희석 효과로 인해 분석물 손실을 겪게 된다. 또한, 이 방법은 종종 상당히 노동 집약적이다.

따라서, 유체상 정제 전에 과도하게 요구되지 않으면서, 불균질 시료에 존재하는 주 및 부 단백질의 질량 분석 검출을 촉진하는 방법 및 장치가 확실히 필요하다. 또한, 손쉬운 시료 정제뿐만 아니라, 질량 분광계 분석 전에 일련 및 병렬 시료 변형 접근을 허용하는 MS 플랫폼이 더 필요하다.

친화성 포착 레이저 탈착 이온화 접근법의 개발에 의해 부분적으로 이러한 요구가 충족되어 왔다[Hutchens 등,Rapid Commun. Mass Spectrom.7: 576-580 (1-993); 미국 특허 제5,719,060호, 제5,894,063호, 제6,020,208호 및 제6,027,942호]. 거대 분자의 MS 분석용의 새로운 전략은 1 이상의 표면 상에서 친화성 시약을 갖는 신규한 레이저 탈착 이온화 프로브를 사용한다. 친화성 시약은 불균질 시료로부터 소정 분석물을 흡수하고, 후속의 레이저 탈착 이온화에 적합한 형태로 프로브 표면 상에서 상기 시료들을 농축시킨다. 분석물의 흡착 및 탈착의 커플링은 보다 작은 초기 시료의 분석을 허용하며, 또한 질량 분광계 분석 전에 직접 프로브 표면 상에 시료 변성 접근을 촉진시키는, 오프라인 정제 접근을 제거한다.

친화성 포착 레이저 탈착 이온화 접근은 질량 분광계를 면역 분석[Nelson 등,Anal. Chem.67: 1153-1158 (1995)], 및 친화 크로마토그래피[Brockman 등,Anal. Chem.67: 4581-4585 (1995)]를 비롯한 다수의 전형적인 생분석적 분석에 적용할 수 있게 한다. 친화성 포착 레이저 탈착 이온화 접근은 펩티드 및 단백질 [Hutchens 등,Rapid Commun. Mass Spectrom.7: 576-580 (1993); Mouradian 등,J. Amer. Chem. Soc.118: 8639-8645 (1996); Nelson 등,Rapid Commun. Mass. Spectrom.9: 1380-1385 (1995); Nelson 등,J. Molec. Recognition12: 77-93 (1999); Brockman 등,J. Mass Spectrom.33: 1141-1147 (1998); Yip 등,J. Biol. Chem.271: 32825-33 (1996)]뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드[Jurinke 등,Anal. Chem.69: 904-910 (1997) ; Tang 등,Nucl. Acids Res.23: 3126-3131 (1995); Liu 등,Anal. Chem.67: 3482-90 (1995), 박테리아, Bundy 등,Anal. Chem.71: 1460-1463 (1999)] 및 소형 분자[Wei 등,Nature399: 243-246 (1999)]의 연구에 적용되었다. 상업적인 수준에서, 친화성 포착 레이저 탈착 이온화는 Ciphergen's ProteinChip(등록 상표) 시스템(미국 캘리포니아주 프레몬트에 소재하는 시퍼겐 바이오시스템즈 인코포레이티드)에서 구현된다.

친화성 포착 레이저 탈착 이온화 기법이 이 분야에서 중요한 문제를 해결할지라도, 난점은 여전히 남아있다.

이 접근이 생물학적 시료로부터 단백질을 포착하는 데 적용되는 경우, 포착된 총 단백질의 약 1 피코몰을 조사하는 것이 일반적이며, 후속의 분석에 유용할 수 있다. 통상적으로, 크로마토그래피 표면 바이오칩 상의 친화성 포착은 완전한 정제를 결과하지 않는다. 또한, 고체상 추출 시료에서 나타나는 분해 효율은 유리 용액 또는 2-D 겔의 변성 환경에서 수행된 분해에 비하여 불량하다. 따라서, 약 50%가 관심 대상의 단백질이고, 이 단백질의 약 10%를 분해시키는 데 성공하였다면, 많아야 약 50 펨토몰의 펩티드만이 검출에 이용 가능할 것이다.

데이타베이스 마이닝 실험에서 소의 페투인의 실제 트립신 분해를 사용하면, 예를 들면 1.0 ppm의 극도의 정밀도(대부분의 MS 기법에 의해서는 현재 달성될 수 없는 수준)로, 불량한 신뢰 단백질 ID 정합은, 이 복합체, 즉 진핵 게놈에 대해 조사하는 경우 단일 펩티드 질량으로 달성된다. 2 개의 펩티드의 경우, 저 신뢰 결과들도 또한 달성된다. 3 개의 펩티드가 제시된 후에만, 신뢰 결과는 300 ppm 오차 미만의 질량 지정으로 귀착된다. 이 경우에, 대부분의 장치는 내부 표준 보정이 필요할 것이다. 그러나, 5 개 이상의 펩티드로는, 1000 ppm 오차보다 나은 질량 정밀도로 추가의 신뢰도가 주어지지 않는다.

또한, 다중 단백질이 동시에 분해되는 경우, 불균질 펩티드 풀(pool)이 생성되고, 성공적인 데이타베이스 마이닝은 극도의 정밀도뿐만 아니라, 다수의 예에서제1 서열 정보를 필요로 한다. 탠덤 MS/MS 접근은 제1 서열 정보를 제공하는 데에 상당한 유용성을 입증하였다[Biemann 등,Acc. Chem. Res.27: 370-378 (1994); Spengler 등,Rapid Commun. Mass Spectrom.1991, 5: 198-202 (1991); Spengler 등,Rapid Commun. Mass Spectrom.6: 105-108 (1992); Yates 등,Anal. Chem.67: 1426-1436 (1995); Kaufman 등,Rapid Commun. Mass. Spectrom.7 : 902-910 (1993); Kaufman 등,Intern. J. Mass Spectrom. Ion Processes131: 355-385 (1994)].

그러나, 최근까지 분석을 기초로 한 레이저 탈착에 이용할 수 있는 유일한 MS/MS 접근은 포스트-소스 붕괴 분석(PSD)이다. PSD는 피코몰 수준의 펩티드에 대해 타당한 서열 정보를 제공할 수 있으나, 이 단편화 공정의 총효율은 낮으며; 이 접근 동안 종종 입증되는 불량한 질량 정밀도 및 민감도와 결합된 경우, 친화성 포착 레이저 탈착 이온화 프로브법으로 종종 발견되는 저 풍부 단백질의 분석에 대한 이것의 적용성은 크게 제한된다. 최근에, 충돌 유도 해리(CID) MS/MS 분석을 수행할 수 있는 레이저 탈착 이온화 4극자 비행시간 질량 분광계(LDI Qq-TOF)가 개발되어 왔다[Krutchinksy 등,Rapid Commun. Mass Spectrom.12: 508-518 (1998)].

따라서, 친화성 포착 레이저 탈착 질량 분광계의 민감도 및 질량 정밀도를 증가시킬 장치 및 방법이 필요하다. 프로브 상의 분해 효율을 증가시키고 단백질의 비균질 혼합물의 분해에 의해 발생된 펩티드를 분해하는 방법 및 장치가 필요하다. 친화성 포착 레이저 탈착 탠덤 지량 분광계 분석의 효율성을 증가시킬 장치 및 방법이 필요하다.

발명의 개요

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 친화성 포착 레이저 탈착 이온화 질량 분광계 분석의 민감도, 질량 정밀도, 질량 분해능을 증가시키는 장치 및 방법을 제공하고, ms/ms 능력을 추가하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 이것들의 개선된 분석적 능력을 활용하는 생분자 분석의 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 제1 양태에서, 분석 장치를 제공함으로써 당 분야에서 상기 목적과 기타 목적 및 요구들을 충족시킨다.

본 발명의 분석적 장치는 레이저 탈착 이온화원, 친화성 포착 프로브 인터페이스 및 탠덤 질량 분광계를 포함하며, 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스는 친화성 포착 프로브를 연결할 수 있고, 레이저 탈착원에 의해 신호 전달하면서, 탠덤 질량 분광계와 신호를 주고 받을 수 있도록 될 수 있도록 프로브를 위치 설정함으로써 프로브로부터 탈착된 이온이 질량 분광계로 진입할 수 있게 된다.

통상적으로, 레이저 탈착 이온화원은 레이저 여기원 및 레이저 광학 트레인을 포함하며; 상기 레이저 광학 트레인은 레이저 여기원으로부터 여기된 광자를 프로브 인터페이스로 전송하는 기능을 한다. 이러한 구체예에서, 레이저 광학 트레인은 통상적으로 신호 전달된 프로브 표면의 평방 mm 당 약 20 내지 1000 μJ의 에너지를 전달한다.

레이저 여기원은 연속 레이저 및 펄스 레이저로 구성된 군 중에서 선택되고, 각종 구체예에서, 질소 레이저, Nd:YAG 레이저, 에르븀:YAG 레이저 및 CO₂레이저로 구성된 군 중에서 선택된다. 현재 바람직한 구체예에서, 레이저 여기원은 펄스 질소 레이저이다.

일군의 구체예에서, 레이저 광학 트레인은 렌즈, 거울, 프리즘, 감쇠기 및 빔 스플리터로 구성된 군 중에서 선택되는 광학 소자를 포함한다.

다른 군의 구체예에서, 레이저 광학 트레인은 입력단 및 출력단을 지닌 광섬유를 포함하고, 상기 레이저 여기원은 상기 광섬유 입력단에 커플링된다.

임의의 광섬유 레이저 광학 트레인 구체예에서, 레이저 광학 트레인은 광학 감쇠기를 더 포함한다. 감쇠기는 레이저 여기원과 광섬유의 입력단 사이에 위치 설정될 수 있거나, 레이저 여기원을 광섬유의 입력단에 커플링할 수 있으며, 또는 광섬유 출력단과 프로브 사이에 위치 설정될 수 있다.

특정한 광섬유 광학 트레인 구체예에서, 광섬유 출력단은 최대 직경이 약 200 내지 400 ㎛이고, 입력단은 직경이 약 400 내지 1200 ㎛이다.

또한, 분석 장치는 프로브를 프로브 인터페이스에 연결한 후 가시화되게 하기 위해서 프로브 조망(viewing) 광학기를 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 레이저 광학 트레인은 레이저 여기원을 광섬유 입력단에 커플링하는 레이저 커플러를 포함할 수 있다. 상술된 바와 같이, 상기 커플러는 광학 감쇠기로서 기능할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 커플러는 프로브 인터페이스에 연결된 후, 프로브의 가시화를 촉진하는 기능을 수행할 수 있다.

이 후자의 구체예에서, 커플러 또는 섬유는 분기되고, 상기 레이저 여기원으로부터 일부의 에너지를 분할한다. 대안적으로, 이러한 분기는 가시 광선을 도입하여 탈착 부위를 조명할 수 있다.

가시화 광학기가 광학 트레인에 포함되는 경우, 또는 섬유 함유 레이저 광학 트레인이 이분기 또는 삼분기를 포함하는 경우, 분석 장치는 상기 프로브로부터 반사된 광을 검출하도록 위치 설정된 CCD 카메라를 더 포함할 수 있다.

통상적인 구체예에서, 친화성 포착 프로프 인터페이스는 친화성 포착 프로브를 연동할 수 있는 프로브 홀더를 포함한다. 또한, 인터페이스는 통상적으로 그 자체로 프로브 홀더를 연동할 수 있는 프로브 도입 포트를 포함한다.

통상적인 구체예에서, 프로브 인터페이스는 프로브 위치 감쇠기 어셈블리 및 인터페이스 이온 수집 시스템을 더 포함한다. 프로브 홀더가 도입 포트에 연결되는 경우, 이것은 프로브 위치 감쇠기와 접촉하여 배치되고; 프로브 위치 감쇠기는 순차로 레이저 이온화원(통상적으로, 레이저 광학 트레인에 관함) 및 이온 수집 시스템에 대하여 프로브 홀더(통상적으로, 적용된 프로브를 지님)를 가동적으로 위치 설정할 수 있다. 통상적인 구체예에서, 액츄에이터는 상기 프로브 홀더를 병진 및 회전 가능하게 위치 설정할 수 있다.

또한, 프로브 인터페이스는 통상적으로 프로브가 대기압보다 낮은 압력에서 레이저 탈착 이온화원에 의해 신호 전달되는 프로브 도입 포트에 커플링된 진공 배출 시스템을 포함한다.

본 발명의 분석 장치는 각종 구체예에서 QqTOF MS, 이온 트랩 MS, 이온 트랩 TOF MS, TOF-TOF MS 및 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 MS로 구성된 군 중에서 선택되는 탠덤 질량 분광계를 포함한다. 현재, QqROF MS가 본 발명의 분석 장치로 사용하기에 바람직하다.

바람직한 구체예에서, 탠덤 질량 분광계는 QqTOF MS이고, 레이저 여기원은 펄스 질소 레이저이며, 프로브에서의 레이저 플루언스는 최소 탈착 역치의 2 내지 4 배이고, 탠덤 질량 분광계는 약 20 내지 50 ppm의 외부 표준 질량 정밀도를 가진다.

본 발명의 분석 장치는 친화성 포착 레이저 탈착 이온화 프로브를 연결하도록 설계된다. 따라서, 임의의 전술한 구체예는 친화성 포착 프로브 인터페이스에 연결된 친화성 포착 프로브를 포함할 수 있다.

통상적으로, 이 구체예에서 친화성 포착 프로브는 시료 흡수 표면이 크로마토그래피의 흡수 표면 및 생분자 친화성 표면으로 구성된 군 중에서 선택되는, 레이저원에 신호 전달 가능한 관계로 위치 설정된 1 이상의 시료 흡착 표면을 가질 것이다. 통상적으로, 이러한 크로마토그래피 흡수 표면은 역상, 음이온 교환, 양이온 교환, 고정된 금속 친화성 포착 및 혼합 모드 표면으로 구성된 군 중에서 선택되고, 생분자 친화성 표면의 이분자는 항체, 수용체, 핵산, 렉틴, 효소, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 스타프 단백질 A 및 스타프 단백질 G로 구성된 군 중에서 선택된다.

친화성 포착 레이저 탈착 이온화 프로브는 레이저원에 대한 신호 전달 가능한 관계로 배치될 수 있는, 다수의 개별 처리 가능한 시료 흡수 표면을 지닐 수 있고, 2 개 이상의 다른 흡수 표면을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 분석 장치는 탠덤 질량 분광계의 검출기가 인터페이스된 디지탈 컴퓨터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 장치는 또한 컴퓨터에 로컬 작용하거나 컴퓨터에 액세스하여 신호를 주고 받을 수 있는 디지탈 컴퓨터로 수행할 수 있는 소프트웨어 프로그램을 더 포함한다. 이러한 구체예에서, 소프트웨어 프로그램은 레이저 탈착 이온화원을 제어하거나, 또는 탠덤 질량 분광계에 의해 1 이상의 양태의 데이타 획득을 제어하거나, 또는 상기 탠덤 질량 분광계에 의해 획득된 데이타를 통해 1 이상의 분석 루틴을 수행하거나, 이러한 작용들의 임의의 부분을 실시할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 1 이상의 테스트 단백질을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 (a) 친화성 포착 단백질 바이오칩 상에서 테스트 단백질 또는 단백질을 포착하는 단계, (b) 단백질 분해제를 사용하여 단백질 바이오칩 상에서 테스트 단백질의 단백질 분리 산물을 생성하는 단계, 및 (c) 1 이상의 단백질 분리 산물을 탠덤 질량 분광계로 분석하는 단계를 포함한다. 이 양태의 구체예에서, 분석 단계는 (i) 해당 모체 이온 펩티드를 생성하기 위하여 단백질 바이오 칩으로부터 단백질 분리 산물을 기체상으로 탈착시키는 단계, (ii) 제1 질량 분광계로 후속의 단편화를 위한 모체 이온 펩티드를 선택하는 단계, (iii) 산물 이온 단편을 제조하기 위하여 기체상에서 선택된 단편화 조건 하에서 선택된 모체 이온 펩티드를 단편화시키는 단계 및 (iv) 산물 이온 단편의 질량 스펙트럼을 발생시키는 단계를 포함한다. 이 양식으로, 질량 스펙트럼은 테스트 단백질의 분석을 제공한다.

본 발명의 이 양태의 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 추가의 단계 (d)데이타베이스에서 단백질의 질량 스펙트럼 및 이론적 질량 스펙트럼 사이의 근사 적합치(closeness-of-fit)를 기준으로 한 데이타베이스에서 테스트 단백질에 대한 1 이상의 단백질 신원 후보를 확인하는, 단백질 데이타베이스 마이닝 프로토콜에 질량 스펙트럼을 따르게 하여 테스트 단백질에 대한 1 이상의 단백질 신원 후보를 결정하는 단계를 더 포함한다.

특히, 이 구체예에서 단계 (d)는 테스트 단백질의 질량 및 테스트 단백질의 기원 종을 프로토콜에 따르게 하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (e) (i) 단계 (b)의 단백질 분리 산물의 질량 스펙트럼을 발생시키고, (ii) 단백질 분리 산물의 질량 스펙트럼을, 단백질 분해제를 사용하여 발생할 것으로 예견된 신원 후보의 분리 산물의 이론적 질량 스펙트럼과, 단백질 분리 산물의 질량 스펙트럼 사이의 근사 적합치를 결정하는 컴퓨터 프로토콜에 제시함으로써, 신원 후보와 테스트 단백질을 비교하는 단계를 더 포함하고, 이로써 측정치는 테스트 단백질에 상응하는 단백질 바이오칩 상의 단백질 분리 산물을 나타낸다.

그러나, 본 발명의 방법의 다른 구체예는 (f) 선택된 모체 이온 펩티드가 신원 후보로부터 예견된 단백질 분리 산물에 일치하지 않는 단계 (c)를 반복하는 단계와, 그 다음, 단계 (f)의 선택된 모체 이온 펩티드에 대해 단계 (d)를 반복하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 테스트 단백질은 제1 및 제2 생물학적 시료 사이에서 우선적으로 발현되는 단백질일 수 있다. 몇 가지 이러한 구체예에서, 제1 및 제2생물학적 시료는 정상 및 병변원으로부터 유도된다.

제3 양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 분자 결합 파트너 사이의 결합 상호 작용을 특징화하는 방법을 제공한다.

이 양태에서, 본 발명의 방법은 제2 결합 파트너를 레이저 탈착 이온화 프로브의 표면에 고정된 제1 결합 파트너에 결합시키는 단계; 제2 결합 파트너를 단편화시키는 단계; 및 그 다음 탠덤 질량 분광계 측정에 의해서 1 이상의 단편을 검출하는 단계를 포함하며, 이로써 검출된 단편의 질량 스펙트럼은 결합 상호 작용을 특징화한다.

본 발명의 이 양태의 특정 구체예에서, 제1 결합 파트너는 제2 결합 파트너가 제1 결합 파트너에 결합되기 전에 친화성 포착 프로브의 표면에 우선 고정된다.

이러한 고정화는 제1 파트너를 친화성 포착 프로브에 공유 결합과 같이 직접 결합시킴으로써 될 수 있다. 통상적인 공유 결합 구체예는 제1 결합 파트너의 아민 및 상기 프로브의 카르보닐디이미다졸 부분 사이에, 그리고 상기 제1 결합 파트너의 아미노 또는 티올 및 프로브 표면의 에폭시기 사이에 공유 결합을 포함한다.

또한, 고정화는 직접 비공유 결합, 예컨대 프로브 표면의 제1 결합 파트너와 금 또는 백금과 같은 금속의 배위 결합에 의할 수 있다. 또한, 고정화는 제1 결합 파트너를 역상, 음이온 교환, 양이온 교환, 고정된 금속 친화성 포착 및 혼합 모드 표면으로 구성된 군 중에서 선택되는 크로마토그래피 흡착 표면에 상호 작용시킴으로써 이루어질 수 있다.

대안적으로, 고정화는 간접적일 수 있고, 비록 간접적이긴 하나 공유결합일수 있다. 이 후자의 특정 구체예에서, 제1 결합 파트너는 분리 가능한 링커와 같은 링커를 통한 공유 결합에 의해서 고정화될 수 있다. 또한, 간접 고정화는 비공유, 예컨대 바이오틴/아비딘, 바이오틴/스트렙타비딘 상호 작용을 통하여 프로브에 고정화될 수 있다.

본 발명의 이 양태에서, 제1 분자 결합 파트너는 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다. 통상적으로, 제1 결합 파트너는 다세포성 진핵세포, 단일 세포 진핵 세포, 원핵세포 및 바이러스로 구성된 군 중에서 선택되는 유기물로부터 천연 발생하는 단백질일 수 있거나, 합성적으로 발생하는 단백질, 예컨대 재조합 융해 단백질일 수 있는 단백질일 것이다.

제1 결합 파트너가 단백질인 구체예에서, 단백질은 항체, 수용체, 번역 인자, 세포 골격 단백질, 세포 주기 단백질 및 리보솜 단백질로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다.

전형적인 구체예에서, 제2 결합 파트너의 고정화된 제1 결합 파트너로의 결합은, 제1 결합 파트너를 생물학적 시료와 접촉시킴으로써 수행되고; 상기 시료는 혈액, 림프, 소변, 뇌척수액, 활액, 우유, 타액, 유리액, 수양액, 점액 및 정액 또는 세포 용해물 또는 다른 형태의 임의의 시료로 구성된 군 중에서 선택되는 유체일 수 있다.

제1 결합 파트너가 단백질인 구체예를 비롯한 각종 구체예에서, 제2 결합 파트너는 단백질일 수 있다. 대안적으로, 제2 결합 파트너는 결합 라이브러리에 존재하는 화합물일 수 있고, 여기서 제2 결합 파트너의 제1 결합 파트너로의 결합은제1 결합 파트너를 화학적으로 합성된 결합 라이브러리의 분액에 접촉시킴으로써 수행된다. 그 외의 다른 대안예에서, 제2 결합 파트너는 생물학적으로 표현된 결합 라이브러리의 성분, 예컨대 파지로 표현된 라이브러리일 수 있다.

통상적인 특정 구체예에서, 단편화는 제2 결합 파트너를 효소와 접촉시킴으로써 수행되고; 상기 제2 결합 파트너는 단백질이고, 효소는 통상적으로 특이성 엔도프로테아제, 예컨대 트립신, Glu-C(V8) 프로테아제, 엔도프로테이나제 Arg-C(세린 프로테아제), 엔도프로테이나제 Arg-C(시스테인 프로테아제), Asn-N 프로테아제 및 Lys-C 프로테아제이다. 대안적으로, 단편화는 상기 제2 결합 파트너를 액상 화학 물질, 예컨대 CNBr과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.

임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 제2 결합 파트너의 상기 제1 결합 파트너로의 결합 후, 그리고 제2 결합 파트너의 단편화 전에 제2 결합 파트너를 변성시키는 단계를 더 포함한다.

각종 구체예에서, 본 발명의 방법은 제2 결합 파트너를 단편화한 후, 제1 용리액 및 제2 용리액으로 프로브를 세척하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 제2 용리액은 pH, 이온 강도, 세척 강도 및 소수성과 같은 1 이상의 용리 특성이 제1 용리액과 다르다.

통상적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 단편화 후 그리고 제2 결합 파트너의 단편의 검출 전에, 에너지 흡수 분자를 프로브에 적용하는 단계를 더 포함한다. 바람직한 구체예에서, 그 후, 프로브는 본 발명의 분석 장치의 친화성 포착 프로브 인터페이스 및 장치의 레이저원을 사용하여 프로브로부터 이온화되고 흡수된 제2결합 파트너의 단편에 적용된다.

본 발명의 장치는 모든 이온 질량들의 측정, 단편의 부분의 질량들의 측정, 및 단일 이온 조사 측정을 포함하는, 이 방법에서 수 가지 유형의 유용한 측정을 하는 데 사용될 수 있다.

유용하게도, 본 발명의 방법의 구체예는 제2 결합 파트너의 단편의 질량 분광계 측정 후, 단편 측정치를 단편화 효소의 분리 규칙을 제2 결합 파트너의 제1 아미노산 서열에 적용하여 예측된 것과 비교하는 단계를 포함하고, 이로써 이러한 비교를 분자간 상호 작용을 특징화시킨다.

제2 결합 파트너의 신원이 알려지지 않은 경우, 본 발명의 방법은 이러한 비교를 하기 전에, ms/ms 분석을 통하여 제2 결합 파트너를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 MS/MS 분석은 제2 결합 파트너의 제1 단편을 질량 분광법으로 선택하는 단계; 제2 결합 파트너 제1 단편을 기체상에서 해리시키는 단계; 제2 결합 파트너 제1 단편의 단편 스펙트럼을 측정하는 단계, 및 그 다음, 상기 단편 스펙트럼을 데이타베이스에 접근하기 전에 아미노산 서열 데이타로부터 예측된 단편 스펙트럼과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 아미노산 서열 데이타는 경험 및 예측 데이타로 구성된 군 중에서 선택될 수 있고, 통상적인 구체예에서 해리는 충돌 유도된 해리이다.

본 발명의 방법의 임의의 구체예에서, 제1 결합 파트너는 항체, T 세포 수용체 및 MHC 분자로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 제1 결합 파트너는 수용체 이고, 제2 결합 파트너는 수용체의 작동물질, 수용체의 부분 작동물질,수용체의 길항물질, 및 수용체의 부분 길항물질로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 제1 결합 파트너는 당단백질 수용체이고, 제2 결합 파트너는 렉틴이다.

제4 양태에서, 본 발명은 분석물을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 친화성 포착 프로브를 본 발명의 분석 장치의 분석물이 결합된 친화성 포착 프로브 인터페이스에 적용하는 단계; 상기 장치의 레이저원을 사용하여 프로브로부터 이의 분석물 또는 단편을 탈착 및 이온화시키는 단계; 및 그 다음, 탈착된 이온에 대해 탠덤 질량 분광기 측정함으로써 분석물을 검출하는 단계를 포함한다.

이 양태에서, 본 발명의 방법은 탈착 및 이온화 단계 후 및 검출 전에 상기 탈착된 이온의 충돌 유도된 해리를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 해리 전에, 임의의 구체예에서 이온의 부분은 충돌 해리에 대해 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 단계는 분석물을 프로브에 흡수하도록 수행될 수 있다. 이외의 다른 구체예에서, 단계는 분석물의 흡수 후 및 상기 프로브 인터페이스에서 상기 프로브를 적용하기 전에 상기 프로브 및 상기 분석물을 에너지 흡수 분자와 부착 접촉시키도록 수행될 수 있다.

본 발명은 화학 및 생화학 분석의 분야에 속한 것으로서, 특히 탠덤 질량 분광계에 의한 분석물 간의 친화성 상호 작용 및 분석물의 개선된 확인 및 특징화를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 및 기타 목적과 이점은 첨부 도면과 함께 하기 상세한 설명을 고려하면 명백해질 것이며, 도면에서 동일한 도면 번호는 동일한 부재를 의미한다.

도 1은 본 발명의 분석 장치의 구체예를 개략 도시한 것이다.

도 2는 본 발명의 분석 장치에 사용하는 데 바람직한 직각 QqTOF 탠덤 질량 분광계의 구성요소를 보다 상세히 도시한다.

도 3은 단일 BPH 및 전립선암 환자의 생식 유체 단백질 프로필을 나타낸다.

도 4는 도 3에서 검출될 수 있는 상향 조절된 단백질 중 하나의 프로브 상의 분리의 결과를 도시한다.

도 5는 트립신을 사용하여 풍부한 바이오마커 후보를 계내 분해에 노출시킨 후 단일상의 MS 분석에 의하여 검출된 펩티드를 도시한다.

도 6은 본 발명의 분석 장치에서 동일한 정제된 단백질 펩티드의 LDI Qq-TOF MS 분석을 도시한다.

도 7은 풍부한 바이오마커 후보의 선택된 이중 전하 이온의 본 발명의 분석 장치로부터 얻은 MS/MS 결과를 도시한다.

I. 정의

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특히 아래 설명된 용어는 하기 정의를 갖는다. 달리 정의되지 않았다면, 본 명세서에서 사용된 모든 정의는 본 발명이 속하는 영역의 당업자에게 통상적으로 이해될 수 있는 의미를 갖는다.

"분석물"은 검출되기에 바람직한 시료의 임의의 성분을 말한다. 상기 용어는 시료 내 단일 성분 또는 다수의 성분으로 언급할 수 있다.

"프로브"는 장치를 의미한다. 레이저 탈착 이온화원과 신호 전달 가능한 관계로, 및 대기압 또는 대기압보다 낮은 압력에서 기체상 이온 분광계와 신호를 주고 받도록 위치 설정적으로 연결된 경우, 분석물로부터 유도된 이온을 분광계에 도입하는 데 사용될 수 있는 장치를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프로브"는 통상적으로 프로브 인터페이스에 의해 연동될 수 있다.

"친화성 포착 프로프"는 프로브가 비균질 혼합물로부터 분석물을 추출하고 농축시키기에 충분한 상호 작용을 통하여 분석물을 결합시키는 프로브를 의미한다. 정제를 위한 농축은 필요치 않다. 통상적으로, 결합 상호 작용은 프로브의 흡수 표면에 분석물을 흡수시킴으로써 매개된다. 용어 ProteinChip(등록상표) 어레이는 본 발명에 사용되는, 미국 캘리포니아 프레몬트에 소재하는 시퍼겐 바이오시스템즈즈 인코포레이티드에서 시판되는 친화성 포착 프로브를 의미한다.

"흡착"은 분석물의 흡수제로의 검출 가능한 비공유 결합을 의미한다.

"흡수제"는 분석물을 흡수할 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 용어 "흡수제"는 단일 물질("모노플렉스 흡수제")(예컨대, 화합물 또는 작용기) 및 다수의 다른 물질("멀티플렉스 흡수제")를 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 멀티플레스 흡수제에서 흡수제 물질은 "흡수종"으로서 언급된다. 예를 들면, 프로브 기재 상의 레이저 처리 가능한 흡착 표면은 상이한 결합 특징을 갖는 다수의 상이한 흡수종(예컨대, 음이온 교환 물질, 금속 킬레이트화제 또는 항체)을 특징으로 하는 멀티플렉스 흡수제를 포함할 수 있다.

"흡수 표면"은 흡수제를 가진 표면을 의미한다.

"크로마토그래피 흡수 표면"은 분석물의 분리 또는 분석물 중에서 크로마토그래피 구별이 가능한 흡수제를 가진 표면을 의미한다. 따라서, 이 용어가 크로마토그래피 분야에서 이해되는 것과 같이, 이 상은 음이온 교환 부분, 양이온 교환 부분, 역상 부분, 금속 친화성 포착 부분 및 혼합 모드 흡수제를 가진 표면을 포함한다.

"생분자 친화성 표면"은 특이성 결합을 할 수 있는 생분자를 포함하는 흡수제를 가진 표면을 의미한다.

"특이성 결합"은 불균질(비균질) 시료에 동시에 존재하는 2 종의 분자종이 시료 내의 다른 분자종과의 결합에 비하여 서로 우선적으로 결합하는 능력을 의미한다. 통상적으로, 특이성 결합 상호 작용은 2 배 이상, 더욱 일반적으로는 10 내지 100 배까지의 반응 내 외래 결합 상호 작용을 통하여 구별될 것이다. 분석물을 검출하는 데 사용되는 경우, 특이성 결합은 불균질(비균질) 시료에서 분석물의 존재의 결정시 충분히 식별력이 있다. 통상적으로, 10^-8M 이상 내지 약 10^-9M 이상의 친화성 또는 결합성을 가진, 보다 특이성인 특이성 결합 반응물과의 특이성 결합 반응의 친화성 또는 결합성은 약 10^-7M 이상이다.

"에너지 흡수 분자" 및 동일한 두문자어 "EAM"은 프로브에 부착되는 경우, 레이저 탈착 이온화원으로부터 에너지를 흡수한 후, 여기에 접촉하여 분석물의 탈착 및 이온화에 기여할 수 있는 분자를 의미한다. 상기 용어는 미국 특허 제5,719,060호, 제5,894,063호, 제6,020,208호 및 제6,027,942호에 언급된 모든 분자를 포함하며, 상기 특허의 개시 내용은 본 명세서에서 그 전체를 참고로 인용한다. 상기 용어는 신남산 유도체, 시나핀산("SPA"), 시아노 히드록시신남산("CHCA") 및 디히드록시벤조산을 명백히 포함한다.

"탠덤 질량 분광계"는 이온 혼합물에서 2 개의 연속 단계 m/z을 기초로 한 이온의 식별을 수행할 수 있는 임의의 기체상 이온 분광계를 의미한다. 상기 용어는 2 개의 질량 분광계뿐만 아니라, 질량 분석 전에 이온의 선택적 획득 또는 보유할 수 있는 단일 질량 분광계를 지닌 것을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 QqTOF 질량 분광계, 이온 트랩 질량 분광계, 이온 트랩-TOF 질량 분광계, TOF-TOF 질량 분광계 및 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분광계를 명백하게 포함한다.

"용리액"은 제제, 통상적으로 분석물을 흡수 표면의 흡수제로 흡수시키는 것을 수행 또는 개질하는 데 사용되는 용액을 말한다. 또한, 용리액은 "선택성 역치 개질제"로서 본 명세서에서 언급된다.

"용리 특성"은 흡수 표면의 흡수제로의 분석물의 흡수를 작용 또는 개질시키는 능력을 분배하는 용리액의 물리적 또는 화학적 특징을 의미한다. 2 개의 용리액은 분석물 및 흡수제와 접촉시킨 경우 흡수제에 대한 분석물의 친화성의 정도가 다르면, 다른 용리 특성을 갖는다. 용리 특성은, 예를 들면 이온 강도, 카오트로피즘(chaotropism)의 정도, 세척 강도 및 온도를 포함한다.

"생물학 시료" 및 "생물학적 시료"는 복제 가능한 유기물의 일부 이상으로부터 유도된 시료를 동일하게 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생물학적 시료는 바이러스, 원핵 생물, 단일 세포화 진핵 세포 및 다세포성 진핵 세포를 포함하는, 임의의 공지 분류계로부터 유도될 수 있다. 생물학적 시료는 유기물의 전체 또는 이의 부분 및 이의 배양된 부분으로부터 유도될 수 있다. 생물학적 시료는균질물, 아세포성 단편, 용해물 및 유체를 비롯하여, 본 명세서에 적당한 임의의 물리적 형태로 존재할 수 있다.

"생분자"는 생물학적 시료로부터 반드시 유도될 필요는 없지만, 여기서 발견될 수 있는 분자를 의미한다.

"유기 생분자"는 생물학적 시료, 예컨대 스테로이드, 아미노산, 뉴클레오티드, 당, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 복합 탄수화물 및 지질로부터 반드시 유도될 필요는 없지만 여기서 발견될 수 있는 유기 분자를 의미한다.

"소형 유기 분자"는 약제에 일반적으로 사용되는 유기 분자에 필적할 만한 크기의 유기 분자를 언급한다. 상기 용어는 유기 생중합체(예컨대, 단백질, 핵산 등)를 제외한다. 통상적으로, 본 명세서에서 사용된 소형 유기 분자는 약 5000 Da 이하, 약 2500 Da 이하, 약 2000 Da 이하 또는 약 1000 Da 이하의 크기이다.

"생중합체"는 생물학 시료, 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당 및 폴리글리세리드(예컨대, 디글리세리드 또는 트리글리세리드)로부터 반드시 유도될 필요는 없지만 여기서 발견될 수 있는 중합체를 의미한다.

"단편"은 분석물의 화학적, 효소적 또는 물리적 파괴의 산물을 의미한다. 단편은 천연 또는 이온 상태로 존재할 수 있다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 단량체(잔기)를 포함하는 천연 발생 또는 합성 중합체를 의미하는 것으로 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 여기서 아미노산 단량체는 펩티드 결합에 참여할 수 있는 천연 발생 아미노산, 천연 발생 아미노산 구조 변형체 및 합성 비 천연 발생 유사체를 포함한다.폴리펩티드는, 예컨대 탄수화물 잔기를 첨가하여 당단백질을 형성함으로써 개질될 수 있다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 당단백질뿐만 아니라 비당단백질을 포함한다.

"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 뉴클레오티드 단량체(염기)를 포함하는 천연 발생 또는 합성 중합체를 동일하게 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA"), 뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비천연 발생 염기를 포함하는 것과, 뉴클레오티드 단량체가 천연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 다른 것에 결합된 것을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포로아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNAs) 등이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "분자 결합 파트너", 동일하게는 "특이성 결합 파트너"는 특이성 결합을 나타내는 분자의 쌍, 통상적으로 생분자의 쌍을 의미한다. 비제한적인 예로는 수용체 및 리간드, 항체 및 항원, 바이오틴 및 아비딘, 그리고 바이오틴 및 스트렙타비딘을 들 수 있다.

"수용체"는 생물학 시료로부터 반드시 유도될 필요는 없지만, 여기서 발견될 수 있으며, 리간드와의 특이성 결합에 참여할 있는 분자, 통상적으로 거대 분자를 의미한다. 상기 용어는 특이성 리간드 결합할 수 있는 나머지 단편 및 유도체를 더 포함한다.

"리간드"는 지정된 수용체 또는 항체와의 특이성 결합에 참여할 수 있는 임의의 화합물을 의미한다.

"항체"는 1 이상의 리간드와의 특이성 결합에 참여할 수 있는 면역 글로불린 유전자 또는 1 이상이 면역 글로불린 유전자의 단편에 의해서 실질적으로 암호화되는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 천연 발생 형태뿐만 아니라, 단편 및 유도체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에서 단편은, 단편이 표적 분자에 특이성 결합할 수 있는 한, 각종 펩티다제, 예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab)'2 단편으로 분해시킴으로써 생성된 것과, 화학적 분해, 화학적 분리 및 재조합에 의해 생성된 것을 포함한다. 예를 들면, 상 디스플레이에 의해 생성되는 것과 같은 통상적인 재조합 단편은 단쇄 Fab 및 scFv("단쇄 가변 영역") 단편을 포함한다. 상기 용어의 범위 내의 유도체는 서열에서 개질된 항체를 포함하지만, 이종간의 키메릭 및 인간화 항체를 비롯한 표적 분자에 특이성 결합할 수 있게 남아 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체는 천연 B 림프구, 하이브리도마, 상 디스플레이에 의한 재조합 발현 시스템 등의 세포 배양물로부터의 회수를 포함하는 임의의 기법에 의하여 제조될 수 있다.

"항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 리간드를 의미한다. 항체와 접촉하는 항원의 부분은 "에피토프"로 명명된다.

"플루언스"는 신호 전달된 영상의 단위 면적 당 전달된 에너지를 의미한다.

II. 친화성 포착 프로브 탠덤 질량 분광계

제1 양태에서, 본 발명은 고 정밀도, 고 질량 분해능, 탠덤 질량 분량계의이점을 지닌 친화성 포착 레이저의 탈착 이온화 시료 도입의 이점을 조합한 분석 장치를 제공한다. 상기 조합은 공지된 기법을 수행하는 기존의 장치에 비하여 상당한 이점을 제공한다. 또한, 본 발명의 신규한 장치는 단백질 발견의 새로운 방법을 가능하게 하고, 기존의 접근법보다 더욱 효율적이며, 동시에 더욱 민감한, 특이성 결합 파트너 사이 및 특이성 결합 파트너 중에서 분자 상호 작용을 확인 및 특징화하는 새로운 방법을 만들 수 있다. 상기 장치는 우선 전체적으로 간단히 기재될 것이고; 이후에 친화성 포착 프로브 인터페이스의 특징은 매우 상세하게 기재될 것이다.

간략하게, 도 1을 참조하면, 장치(100)는 레이저 탈착/이온화원(13); 친화성 포착 프로브 인터페이스(10) 및 탠덤 질량 분광계(14)를 포함한다. 레이저원(12)이 펄스 질소 레이저이며, 탠덤 질량 분광계(14)가 직각 4극자 비행시간법 질량 분광계(QqTOF) 탠덤 MS인 바람직한 구체예는 도 1에 도시된다.

레이저 탈착/이온화원

레이저 탈착/이온화원(13)은 적절하게 제어 및 유도되도록 친화성 포착 프로브(16)에 부착된 단백질 및 다른 분석물을 탈착 및 이온화시키는 강력한 광자를 생성한다. 레이저 탈착/이온화원(13)은 레이저원(12), 레이저 광학 트레인(11) 및 임의로 프로브 조망 광학기(18)를 포함한다.

레이저 탈착/이온화원(13)은 펄스 레이저(12)의 사용을 통하여, 또는 대안적으로 연속 레이저(12)로부터 빔을 기계적 또는 전자적으로 쵸핑하여 펄스 레이저 에너지를 생성한다. 통상적으로, 펄스 레이저가 바람직하다. 바람직한 펄스 레이저원은 질소 레이저, Nd:YAG 레이저, 에르븀:YAG 레이저 및 CO₂레이저를 포함한다. 간단한 족문 및 비교적 저 비용으로 인하여 펄스 질소 레이저가 현재 바람직하다.

레이저(12)로부터 방사된 광자는 레이저 광학 트레인(11)에 의해 프로브(16)의 표면에 충돌한다. 광학 트레인(11)은 각 레이저 펄스를 수집, 유도, 집속, 세분 및 제어하여, 탈착 에너지의 초점의 형태로 적당한 탈착 플루언스가 프로브(16)에 전달되도록 작용하는, 렌즈, 거울, 프리즘, 감쇠기 및/또는 빔 스플리터의 배열로 구성될 수 있다.

대안적으로, 광학 트레인(11)은 각 레이저 펄스의 에너지를 수집, 유도 및 세분하도록 작용하는 섬유 광학 어레이로 구성될 수 있다.

이 구체예에서, 레이저(12)의 출력은 광학 커플러를 사용하여 광섬유의 입력측으로 커플링되고; 상기 커플러는 통상적으로 초점 거리 및 직경이 섬유의 입력 유효 개구수에 적당한 렌즈를 포함한다.

섬유로 들어오는 에너지의 양은 섬유에 대한 렌즈 위치의 신중한 조절에 의해 제어될 수 있고; 이 예에서, 섬유 광학 커플러는 광학 감쇠기로 겸용될 수 있다. 또 다른 바람직한 배열에서, 레이저의 총 출력 에너지는 섬유에 커플링되고, 감쇠기는 광학 섬유의 출력측 및 광학 트레인의 탈착점 집속 소자 사이에 배치된다. 이외의 다른 바람직한 배열에서, 광학 감쇠기는 레이저 및 광섬유 커플러 사이에 배치된다. 모든 예에서, 광학 감쇠기를 적용하여 레이저(12)의 출력 에너지와 관계없이, 프로브(16)의 표면에 적당한 레이저 플루언스의 전달을 보장한다. 통상적인 레이저 플루언스는 20 내지 1000 μJ/㎡ 정도이다.

섬유 광 구성요소가 레이저로부터 집속된 에너지를 수용하는 경우, 종종 손상될 수 있다고 널리 입증된 바와 같이, 투사 레이저 에너지의 플루언스가 상기 섬유의 손상 역치 이하로 되도록 섬유의 입력측의 수용 영역을 최대화시키는 것이 유리하다. 또한, 후자는 레이저 및 광섬유에 대하여 광학 커플러의 상대적인 부분을 조절하는 경우, 광섬유로 레이저 빔의 정렬을 단순화시킨다. 그러나, 프로브(16)에서 타당한 탈착 플루언스 수준을 얻기 위하여, 400 ㎛의 최대 출구측 섬유 직경은 약 200 μJ/레이저 펄스의 최대 에너지를 전달하는 통상적인 질소 레이저를 사용하는 경우를 초과하지 않아야 한다. 이 문제에 대한 해결책은 입력측이 400 내지 1200 미크론 정도의 직경을 갖고, 출력측이 200 내지 400 미크론의 직경을 갖는 테이퍼진 광섬유의 도입이다.

통상적으로, 탈착점은 탈착 및 이온화를 유도하기 위해 충분한 플루언스를 유지하는 동안 프로브(16)의 가장 큰 영역을 신호 전달함으로써 각 펄스에 대해 이온의 발생을 최대화시키는 크기로 집속되어야 한다. 4극자-4극자-비행시간 탠덤 질량 분광계에 커플링된 레이저 탈착/이온화원에서 약 200 μJ의 최대 에너지를 전달하는 통상적인 질소 레이저를 사용하는 동안, 최적 레이저 점 영역은 0.4 내지 0.2 ㎟ 범위로 결정되었다.

레이저 탈착/이온화원(13)은 통상적으로 광학 트레인(11)의 필요한 부분으로서 프로브 조망 광학기(18)를 포함한다. 조망 광학기(18)는 탈착 부위, 즉 프로브(16)의 영역의 조명 및 조망이 레이저에 의해 신호 전달되게 하기 위하여 조광원, 렌즈, 거울, 프리즘, 이색성 거울, 대역 여파기 및 CCD 카메라를 포함할 수있다.

레이저 광학 트레인(11)은 광섬유를 포함하는 경우, 조망 광학기(18)는 이의 광섬유로부터 광을 이용할 수 있다.

예를 들면, 섬유 광학 커플러는 분기되어 레이저 여기 에너지의 소단편으로 분할시켜 인가된 레이저 에너지를 모니터하는 수단으로써 사용되거나, 이것은 분기되어 가시 광선이 탈착 부위에 도입되게 할 수 있다.

이러한 2 가지 구체예 중 제1 구체예에서, 소단편의 여기 에너지는 프로브(16)로 전달된 레이저 에너지의 실제량을 반영하도록 보정된 레이저 에너지 회로의 일체 구성성분인 광자 검출기에 작용하도록 유도된다. 제2 구체예에서, 가시 광선은 CCD 카메라에 커플링된 광자 광학기의 별도의 세트를 통하여, 또는 CCD 카메라 쪽으로 광섬유의 주 분기에서 상향 반사된 광을 유도하는, 광섬유 및 레이저 여기원 사이에 프리즘 또는 이색성 거울의 적용에 의해, 이러한 가능 영역을 조망하는 탈착 부위를 조명하도록 유도된다. 대안적으로, 프리즘 또는 이색성 거울은 이 분기에 결합된 임의의 후반사 영상이 CCD 카메라로 작용되게 유도하기 위하여 광섬유의 조광 섬유 분지와 조명원 사이에 일렬로 배치된다. 이외의 다른 구체예서, 상기 섬유는 삼분기되어서, 제1 분기는 탈착/이온화 레이저 펄스를 전달하고, 제2 분기는 탈착 부위를 조명하기 위하여 가시 광선을 전달하며, 제3 분기는 탈착 부위로부터 CCD 카메라까지 반사광을 투과시킨다. 각각의 이러한 조망 설계를 위하여, 적당한 대역 여파기는 CCD 카메라 및 조망 광학 트레인 사이에 전개되어서, 프로브 표면 상의 입사 레이저 펄스의 직접 반사로서 발생하거나, 입사 레이저 펄스에 의해 전자 여기의 직접 결과로서 프로브 표면으로부터 방사된 제2 광자인 고 에너지 광자를 가능하게 손상시키는 투과를 방지해야 한다.

프로브 인터페이스

친화성 포착 프로브 인터페이스(10)는 레이저원(12)에 대한 신호 전달 가능한 관계로 및 동시에 탠덤 질량 분광계(14)와 신호를 주고 받도록 프로브(16)를 위치 설정한 친화성 포착 프로브(16)에 연동할 수 있고, 통신은 대기압 내지 대기압 보다 낮은 압력을 지탱한다.

프로브 인터페이스(10)는 프로브 홀더, 프로브 도입 포트, 프로브 위치 설정 액츄에이터 어셈블리, 진공 및 기압 어셈블리 및 인터페이스 이온 수집 시스템을 포함한다.

프로브 홀더는 프로브(16)의 형태 인자에 정합하도록 성형된 프로브 인터페이스(10)의 구성요소이다. 프로브(16)가 ProteinChip(등록 상표) 어레이(미국 캘리포니아 프레몬트에 소재하는 시퍼겐 바이오시스템즈 인코포레이티드)인 경우, 프로브 홀더는 ProteinChip(등록 상표) 어레이의 형태 인자에 정합한다.

프로브 홀더는 단일 프로브(16) 또는 다수의 프로브(16)를 파지할 수 있다. 홀더는 각 프로브(16)를 레이저 탈착/이온화원(13)에 의해 신호 전달될 적당한 방향으로, 그리고 인터페이스 이온 수집 시스템에 대하여 위치시킨다.

프로브 홀더는 위치 설정 액츄에이터 어셈블리와 초기 접촉한다.

액츄에이터 어셈블리는 프로브의 다른 영역이 신호 전달될 수 있고, 탠덤 질량 분광계(14)로의 도입을 위하여 수집된 이러한 조사로부터 이온을 발생시키도록레이저 탈착/이온화원(13) 및 인터페이스 이온 수집 시스템에 대하여 프로브(16)의 상대 위치를 이동시킨다.

액츄에이터는 프로브(16)의 병진 및/또는 회전 운동을 지지하는 한편, 레이저 탈착/이온화원 및 이온 수집 시스템 상수에 관하여 프로브의 위치를 유지하는 전자-기계 장치로 구성된다. 이러한 전자-기계 장치는 선형 동작 액츄에이터, 선형 또는 원형 동작 가이드 레일, 짐발, 베어링 또는 차축과 직간접적으로 신호를 주고 받는 기계식 또는 광학 위치 센서, 솔레노이드, 스테퍼 모터, DC 또는 AC 동기 모터를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

프로브 도입 포트는 로딩된 프로브(16)를 포함하는 프로브 홀더가 과도한 수준의 대기 가스를 프로브 표면(10) 및 탠덤 질량 분광계(14)에 도입하지 않으면서, 프로브 위치 설정 액츄에이터 어셈블리에 위치 설정되게 한다.

후자를 달성하기 위하여, 프로브 도입 포트는 칩을 작동 위치로 이동시키기 전에 표적 포트 압력을 달성하도록 진공 배출 시스템(프로브 도입 포트 배출 시스템)을 사용하여 대기 가스를 펌핑 배출한다. 프로브 교환 동안, 프로브 액츄에이터 어셈블리는 작동 위치(레이저 탈착원(13) 및 이온 수집 시스템과 정렬하는 위치)로부터 교환 위치로 프로브를 이동시킨다. 이렇게 행하여, 대기압력으로 곧 상승될 교환 포트와 질량 분광계의 입구 사이에 밀봉부를 제공할 수 있다. 질량 분광계 입구를 밀봉한 후, 대기 가스를 프로브 도입 포트 가압 시스템에 의해 프로브 도입 포트로 도입시킨다. 이것은 프로브 홀더의 대기 표면과 도입 포트 사이의 압력차를 제거하고, 프로브 홀더가 프로브 위치 설정 액츄에이터 어셈블리로부터 제거되게한다.

이미 분석된 프로브(16)의 제거 및 새로운 프로브(16)의 설치 후, 프로브 홀더는 이것의 위치 액츄에이터로 대체되고, 시료 로딩 공정이 시작된다. 전술한 바와 같이, 프로브 도입 포트는 배출 시스템에 의해 대기압보다 낮은 압력 아래로 펌핑될 수 있다. 표적 시료 도입 압력에 도달하면, 프로브 액츄에이터 시스템은 교환 위치로부터 작동 위치로 프로브(16)를 이동시키고, 이렇게 하여 질량 분광계 입구의 밀봉부를 개방한다.

대안적으로, 이온이 대기압으로 유지된 탈착 챔버에서 발생하여, 결국 질량 분광계 입구로 이온을 도입하는 이온 광학 어셈블리로 유도되는 경우, 이것은 대기압에서 유지될 것이므로 프로브 도입 포트를 배출 및 가압할 필요가 없다.

프로브 도입 포트 배출 시스템은 일제히 작동하는 경우 프로브(16)가 작동 위치로 이동될 수 있도록 시료 교환 후 도입 포트 내에 포함된 대기 가스의 배출을 제어하는 진공 펌프, 압력 센서, 진공 호환성 배관 및 연결 피팅뿐만 아니라, 진공 호환성 밸브로 구성된다. 진공 펌프는 단단계 또는 다단계 오일 기계 펌프, 스크롤 펌프 또는 오일이 없는 다이아그램 펌프일 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 진공 호환성 밸브는 전기적으로 제어된 솔레노이드 밸브이다. 동일한 구체예에서, 압력 센서는 대기압 내지 1 mtorr 범위의 압력에서 조작할 수 있는 전자 센서이다. 이러한 압력 센서는 열전쌍 게이지 및 피라니 게이지를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 동일한 구체예에서, 이 시스템의 협동 조작은 전체 장치 조작의 부분으로서 시료 포트의 자동화 배출을 할 수 있도록 압력 게이지 및 위치 센서로부터 입력을 조정하는 아날로그 논리 회로 또는 디지탈 마이크로프로세서에 의해 제공된 논리 제어 하에서 수행된다.

프로브 도입 포트 가압 시스템은 일제히 작동하는 경우, 교환 포트를 가압하여 액츄에이터 어셈블리로부터 프로브 홀더를 제거하는 기체의 제어된 도입을 허용하는 기체 공급원, 압력 센서, 기체 전도 배관 및 피팅, 및 기체 호환성 밸브로 구성된다.

한 가지 구체예에서, 기체 공급원은 미처리된 대기 가스이다. 또 다른 구체예에서, 기체 공급원은 흡습제 트랩을 통하여 먼저 유도되고, 임의로 가압 시스템으로 도입하기 전에 미립자 필터를 통하여 두번째 유도된 대기 가스이다. 또 다른 구체예에서, 가스를 가압하는 것은 대기 가스를 사용하는 대신에 질소와 같은 건조 불활성 기체 또는 임의의 저비용의 희가스의 정제된 공급원에 의해 제공된다.

바람직한 구체예에서, 기체 유도 배관, 장치, 몇 가지 밸브의 피팅 및 가압 시스템의 압력 센서는 배출 시스템에서 사용되는 것이다. 동일한 구체예에서, 이 시스템의 협동 조작은 전체 장치 조작의 부분으로서 시료 포트의 자동화 가압을 할 수 있도록 압력 게이지 및 위치 센서로부터의 입력을 이용하는 아날로그 논리 회로 또는 디지탈 마이크로프로세서에 의해 제공된 논리 제어 하에서 수행된다.

프로브 인터페이스 압력 조절 시스템은 프로브(16)의 시료 제공(흡착) 표면과 이온 수집 시스템 사이에 존재하는 탈착 챔버에 선택적 백그라운드 기체 압력을 제공하도록 작용한다. 허용 가능한 탈착 챔버 압력 범위는 대기압 내지 0.1 μtorr이다. 바람직한 압력 범위는 1 torr 내지 1 mtorr이다. 프로브 인터페이스 압력 조절 시스템은 기체 공급원, 기체 유도 배관 및 피팅, 기체 유동 변조기 및 압력 센서로 구성된다. 기체 공급원은 미처리된 대기 가스일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 기체 공급원은 흡습제 트랩을 통하여 먼저 유도되고, 임의로 제어 시스템으로 도입 전에 미립자 필터를 통하여 이후 유도되는 대기 가스이다. 또 다른 구체예에서, 조절 기체는 질소와 같은 건조 불활성 기체 또는 저비용의 임의의 희가스의 정제된 공급원에 의해 제공된다. 기체 유동 변조기는 수동 제어된 유동 수축기일 수 있다. 대안적으로, 기체 유동 조절은 전자식 제어된 유동 수축기를 사용함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 바람직한 탈착 챔버 압력의 폐쇄 루프 제어는 압력 게이지로부터 예정된 판독을 달성하기 위하여 자동화된 기체 유동 변조기와 활발히 상호 작용하는 아날로그 논리 회로 또는 디지탈 마이크로프로세서에 의해 제공된 논리 제어 하에서 자동화된 양식으로 달성된다.

인터페이스 이온 수집 시스템은 정전기 이온 수집 어셈블리, 광학 기압 이온 수집 어셈블리 및 정전기 또는 RF 이온 가이드로 구성된다. 정전기 이온 수집 어셈블리는 탈착 챔버 내에서 흡수된 이온을 수집하고, 질량 분광계 흡입구 쪽으로 이들을 유도하도록 작용하는 DC 정전기 렌즈 구성요소의 배열로 구성된다.

한 가지 구체예에서, 이 어셈블리는 2 개의 정전기 구성요소로 구성된다. 제1 구성요소는 프로브 홀더 및 프로브 표면을 포함하고, 제2 구성요소는 추출기 렌즈이다. 추출기 렌즈는 어레이의 표면으로부터 0.2 내지 4 mm 이격되도록 배열된다. 이 추출기 렌즈는 탈착 부위의 중앙으로부터 질량 분광계 흡입구의 중앙으로 연장하는 법선 축 주위에 공심 위치된, 직경에서 2 mm 내지 20 mm 범위의 유효 구경을 포함한다. 독립적인 DC 전위는 이 어셈블리의 각 구성요소에 적용된다.

바람직한 구체예에서, 추출기 렌즈는 10 mm 직경 유효 구경을 포함하고, 어레이 표면으로부터 1 mm 이격되어 위치된다. 동일한 바람직한 구체예에서, 10 V 전위차는 추출기 및 어레이 사이에서 설립된다.

기압 이온 수집 어셈블리는 기체 공급원, 유도 배관, 배관 연결기, 기체 유동 변조기, 기체 압력 센서 및 기체 방출 포트로 구성된다. 소정 기체 유동을 생성하여, 탈착 챔버 내에서 질량 분광계 흡입구로 탈착된 이온의 벌크 전달을 도울 수 있다.

기체 공급원은 미처리 대기 가스일 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 기체 공급원은 흡습제 트랩을 통하여 먼저 유도되고, 필요한 경우 시스템에 도입되기 전에 미립자 필터를 통하여 후에 유도되는 미처리된 대기 가스일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이온 수집 기체는 질소와 같은 건조 불활성 기체 또는 비용 효율적인 임의의 희가스의 정제된 공급원에 의해서 제공된다.

기체 유동 변조기는 수동 제어되는 유동 수축기일 수 있다. 대안적으로, 기체 유동 조절은 전자식 제어된 유동 수축기를 사용함으로써 달성될 수 있다. 압력 센서는 열전쌍 게이지 및 피라니 게이지일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기체 방출 포트는 프로브(16) 뒤에 위치하여, 탈착 부위 및 질량 분광계 입구 사이에 공심 위치된, 프로브 주위 및 법선 축 아래에 벌크 기체 유동을 유도한다.

바람직한 구체예에서, 기체의 유동은 적당한 이온-세척 유동이 탈착 챔버의 과가압없이 발생하도록 아날로그 또는 디지탈 제어 회로를 사용함으로써 자동 폐쇄된 루프 제어 하에 있다.

인터페이스 이온 수집 시스템의 최종 구성요소는 이온 가이드이다. 이온 가이드는 수집된 이온을 질량 분광계(14)로 전달하도록 작용한다. 이것은 정전기적 또는 RF 변형일 수 있다. 바람직한 구체예는 다극성 RF 이온 가이드이다. 후자의 예로는 4극자 또는 6극자 이온 가이드이다. 이하에 보다 상세하게 기재된 바람직한 Qq-TOF 장치에서, 이온 가이드는 4극자 RF 이온 가이드이다. 이온은 정전기 및 기압 이온 수집 시스템에 의해 개별적으로 생성된 정전기 및 기압 가속력에 의해서 이온 가이드로 유도된다. 바람직한 구체예에서, 이온 가이드의 DC 정전기 전위는 통상적으로 추출기 렌즈의 것보다 10 내지 20 볼트 작다.

탠덤 질량 분광계

본 발명의 분석 장치는 탠덤 질량 분광계(14)를 더 포함한다. 탠덤 질량 분광계(14)는 직각 4극자 비행시간(Qq-TOF), 이온 트랩(IT), 이온 트랩 비행시간(IT-TOF), 비행시간 비행시간(TOF-TOF), 및 이온 사이클로트론 공명(ICR) 변형을 포함하는 군 중에서 유용하게 선택될 수 있다.

직각 Qq-TOF MS가 현재 바람직하고, 또한 이하에 상세히 설명하기로 한다.

QqTOF MS의 주 강점은 현저한 질량 정밀도 및 분해력; 펩티드에서 강화된 민감도 및 저 mw 범위; 및 저 에너지 충돌 유도 해리(CID)의 적용에 의한 뛰어난 ms/ms 성능이다. 전기 분무 이온화원을 지닌 직각 QqTOF는 에이비/엠디에스 시엑스(미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 AB/MDS-Sciex에서 시판하는 QSTAR(등록상표))로부터 시판된다.

도 2와 관련하여, QqTOF의 원리 및 특징을 개략 설명한다.

이온은 제1 4극자 렌즈 "q0" 전에 탈착 챔버에서 생성된다. 통상적으로, q0 내의 압력은 약 0.01 내지 1 torr에서 유지되지만, 또한 대기압에서 유지될 수도 있다. 이러한 방식으로, 탈착된 이온은 이들의 형성 후 바로 백그라운드 기체와 충돌함으로써 신속하게 냉각된다.

이온 개체의 냉각 또는 댐핑은 3 가지 주요한 이점을 제공한다.

첫째, 냉각은 탈착된 이온의 초기 에너지 분배를 제거하고, 이들의 총 에너지를 이들의 열 에너지의 근사치 아래로 감소시킨다. 이것은 이온 위치 및 에너지의 변형을 보상함으로써 최종 분해력을 향상시키는 직각 추출 요건을 단순화시킨다. 이 개선된 분해의 직접적인 결과로 인해 질량 정밀도는 저 ppm 수준 이하로 향상된다.

충돌 냉각의 두번째 주요 이점은 장기간 이온 붕괴 속도를 감소시키는 능력이다. 가스 충돌은 내부 여기를 이완시키고, 펩티드 및 단백질 이온의 안정성을 향상시킨다. 이 안정화 효과는 이온이 약 1 torr 압력의 백그라운드 기체의 존재 하에서 생성되는 경우 최소화되는 것으로 나타난다. 다른 것에 의해 공표된 측정치는 소부분 및 백그라운드 단편화의 손실이 실질적으로 제거될 수 있고, 고 mw 단백질 및 다른 불안정한 생중합체(즉, 글리코컨쥬게이트, DNA 등)의 투과를 향상시킨다. 보다 빠른 붕괴 메카니즘(신속하고, 공급원내 타입 붕괴)는 여전히 발생한다.

q0 충돌 냉각의 마지막 이점은 질량 분광계로의 이온의 유사-연속 흐름의 발생에 있다. q0에서의 이온 충돌은 탈착 클라우드(cloud)를 q0의 축을 따라 확산되게 한다. 이 확산은 각종 탈착 이벤트로부터의 이온이 중복되기 시작하여 전자 분무와 같은 분석기로의 이온의 연속적인 도입을 형성하는 상태를 생성한다.

q0를 통하여 통과한 후, 이온은 제2 4극자(22)("Q1")로 들어간다. 이 4극자는 이온 가이드 또는 질량 필터로서 작용한다. 이것은 여기서 ms/ms 또는 단일 이온 모니터링(SIM) 실험을 위해 이온 선택을 생성하는 것이다.

Q1을 나온 후, 이온은 충돌 셀(26)에 위치된 제3 4극자(24)("q2")로 들어간다. 간단한 실험 동안, q2는 간단한 rf 이온 가이드로서 조작된다. ms/ms 실험을 위하여, q2는 저 에너지 CID를 증진시키기 위하여 약 10^-2torr의 압력에서 충돌 기체로 충전된다.

q2를 나온 후, 이온은 q2의 출구와 집속 격자(28) 사이에 적용된 DC 전위차에 의해서 약간 가속된다. 이 가속은 Y 축에서 이온의 속도를 "바이어스"되게 하여, 이제, 이들의 속도는 m/z의 제곱근에 역비례한다. 이것은 m/z가 다른 모든 이온이 직각 추출 및 자유 비행 후, 검출기에 충돌하는 경우에 달성되어야 한다. 이러한 바이어스가 달성되지 않는 경우, m/z이 다른 이온들은 동일한 Y 축 속도로 직각 추출 영역으로 진입한다.

항시 비행시간에서와 같이, m/z이 보다 낮은 이온은 m/z이 보다 큰 이온이 충돌 하기 전에 검출기에 충돌할 것이다. Y 축에서의 절대적인 변위의 정도는 z축 및 이온 Y축 속도에서의 이온 비행시간의 산물일 것이다. 검출기가 중간 mw 이온에 대해 최적화된 몇 가지 위치에 배치되고, 발광 이온은 도 2에서 검출기의 우측에 도달하는 검출기를 이르지 못하게 할 것이다. 역으로, m/z가 보다 큰 이온은 검출기를 지나치고, 도 2에 검출기의 좌측에 도달한다. 결과적으로, 모든 이온이 통상의 검출점에 충돌하는 경우, 모든 이온은 Z- 및 Y축 속도의 일정비를 유지할 필요가 있다. 상기 기재된 격자 바이어스 방법은 이것을 달성한다.

집속 격자(28)를 통과한 후, 이온은 직각 추출 원소의 변조기 영역(30)에 도달한다. 변조기(30)는 10,000 펄스/초(10 kHz)에 근접한 비율로 펄스된다. 이온은 이온 광학기의 가속 칼럼(32)으로 압박되고, 직각 비행시간(O-TOF)의 유리 비행 영역(34)로 나온다. 에너지 보정은 이온이 이온 거울(36)에 진입하는 경우 달성된다. 거울에서, 이온은 회전되고, 급속 반응, 셰브론(chevron) 어레이 마이크로채널 평판 검출기(38)에 충돌하게 된다.

이 기본 배열에 대한 대안이 사용될 수 있다.

예를 들면, 상기 제시된 기하 구조는 고 가속 에너지로 O-TOF를 수행하는 데 곤란성을 나타낸다. 펩티드 및 단백질에 대한 이온 검출 민감성이 총 이온 에너지 증가량을 기준으로 향상된다는 것은 잘 입증되어 있다. 인간 인슐린(MW=5807.65 Da)의 경우, 검출 효율은 통상적인 마이크로채널 평판 검출기를 사용하는 경우, 35 keV의 이온 에너지에서 100% 도달한다. 이온이 20 또는 30 keV의 에너지로 가속되어야 하는 경우, 자유 비행 관 라이너(40)와 다른 해당 구성요소은 각각 -20 kV 또는 -30 kV로 부유되어야 한다. 이러한 전위에서 간단한 이온 광학 소자 상에서 안정한 전기 절연을 제공하기에 곤란한 점은 공지되어 있다. 이 전위에서 다수의 구성요소를 안전하게 그리고 신뢰할만 하게 부유시키는 것은 곤란하다. 하나의 용액은 후-가속 기법을 적용한 것이다.

상기 기재된 장치와 다르게, 이러한 대안적 장치는 가속 후 검출기(도시하지 않음)를 적용한다. 이온은 수직 추출 구성요소를 방치한 후 약 4 keV의 에너지로 가속되고, 자유 비행 영역은 -4 kV로 부유된다. 이온이 후 가속 검출기 어셈블리로 진입함으로써 가속이 더 달성된다. 이 어셈블리에서, 이온은 라이너 전위에서 유지된 장 보유 그리드를 통하여 통과한다. 그 다음, 이온은 장 보유 격자 및 검출기의 제1 이온 변환 표면 사이에 설립된 장에서 추가의 가속을 얻는다. 이러한 가속 장은 4 내지 10 mm 거리에 걸쳐서 10 내지 20 kV에 속한다.

직교 디자인은 이온 형성으로부터의 비행시간법 측정과 커플링하지 않기 때문에, 다수의 이점이 구현된다.

레이저 플루언스 관련 문제, 예컨대 이온 차폐 및 이온 가속 장 붕괴로 인한 피크 폭 증대는 제거되는데, 탈착 플룸(plume)의 이온이 확장된 시간대 TOF 질량 분광계로 직교 추출 및 가속 전에 확장 및 냉각하는데 장기간 통상적으로 수 밀리초 소요되기 때문이다. 또한, 직교 추출은 고 레이저 에너지의 개시에서 나타나는 대형 험프(hump)와 기준선 이형의 대부분, 즉 EAM의 과도한 중립자 로드에 의해서 생성된 화학 노이즈로 인한 통상의 추출 스펙트럼을 제거한다. 중립자는 변조기 영역에서 추출되지 않기 때문에, 이온만이 검출기 아래로 전송되고, 화학 노이즈는 현저하게 감소된다.

이 인자는 병렬 연속 또는 지연된 이온 추출 접근 동안에 대체로 사용되는 것보다 2 내지 3 배 큰 레이저 플루언스를 사용할 수 있다. 순 결과는 불량한 시료-EAM 균질성의 존재 하에서도 "스위트 점"에 대해 추적 및 조사할 필요성을 거의 완전히 제거할뿐만 아니라, 외부 표준 질량 정밀도 측정(통상적인 오차는 20 내지 50 ppm임), 정량적 재생성 및 신호 대 노이즈 비를 개선시킨다. 추가의 이점은 저 및 고 레이저 에너지 스캔을 수행하여 넓은 m/z 범위의 이온을 분석할 필요성을 제거한다는 것이다. 단일 레이저 플루언스는 미지의 혼합물이 분석을 매우 간단하게 하는 저 및 고 mw 이온을 확인하기 위하여 현재 적용될 수 있다.

통상의 병렬 추출 접근법과 비교한 경우, 이 장치의 가장 인상적인 이점 중 하나는 엄격한 시료 위치 요건에 대한 필요성을 제거하는 능력에 있다. TOF 측정은 이온 형성 공정으로부터 실질적으로 제거되기 때문에, 이온의 원래 위치는 더 이상 중요치 않다. 또한, 이온 형성이 고압 환경에서 고 전위 추출 장의 동시 적용 없이 달성되므로, 고체 상태 시료 입구 시스템의 설계 요건은 매우 완화된다. 간단한 접근법은 우수한 외부 표준 질량 정밀도 성능을 유지하면서 2-차원 시료 조작기를 적용하는 것으로 취할 수 있다. 또한, 시료 존재 표면은 더이상 금속 또는 기타 전도 매체로 구성될 필요가 없다.

요약하면, 레이저 탈착 이온화(LDI) Qq-TOF MS는 기존의 LDI-TOF MS 기법에 비하여 (1) 증가된 외부 표준 질량 정밀도(통상적으로, 20 내지 50 ppm); (2) 향상된 분해; (3) 개선된 ms/ms 효율성; (4) 고 및 저 에너지 스캔에 대한 필요성을 제거한 단일 고 레이저 에너지 레벨을 사용하여 개선된 신호 생성의 개선된 용이성; (5) TDC 기법의 사용을 통한 개선된 정량적 능력 및 최소 탈착 역치의 2 내지 4 배의 레이저 플루언스; (6) 2-차원 시료 액츄에이터에 대한 감소된 요건; (7) 시료 제공 프로브 표면을 위해 플라스틱 구성요소의 사용을 위한 전위(예를 들면, 사출성형된 2 차원 프로브 어레이); (8) 단일 이온 모니터링을 사용함으로써 감소된 화학 노이즈 및 EAM 화학 노이즈 영역에서 이온에 대해 측정하는 향상된 능력의 이점을 갖는다.

레이저 탈착 이온화(LDI) Qq-TOF MS는 단백질 특성화 및 확인에서 기존의 MALDI-PSD 접근법에 비하여 하기 이점을 갖는다.

LDI-QqTOF는 고 질량 분해력 및 질량 정밀도를 제공한다; 데이타베이스 마이닝 접근법에서, 이 증가된 능력은 잘못된 정상 데이타 히트의 수를 감소시켜서 확인을 간소화한다. 또한, QqTOF도 PSD MS/MS로 얻어질 수 있는 민감성보다 그 10 배 정도의 범위보다 크게 제공한다.

본 발명의 분석 장치는 인상적인 MS/MS 능력과, 단일 MS 분석에 대한 20 ppm 미만의 질량 지정 오차를 입증한다. 후자는 단일 친화성 포착 프로브의 표면 상에서 동시에 보유된 다수의 단백질의 확인을 하게 한다.

다른 구성요소

통상적으로, 친화성 포착 프로브 탠덤 MS 장치(100)는 탠덤 질량 분광계 검출기와 인터페이스된 디지탈 컴퓨터를 더 포함한다. 통상적으로, 디지탈 컴퓨터도 컴퓨터가 이온 발생을 제어하고 데이타 획득 및 분석에 참여하게 하는 레이저 탈착원(12)과 인터페이스된다.

분석 소프트웨어는 컴퓨터에 로컬 작용할 수 있거나 원격 작용할 수 있지만, 컴퓨터에 신호를 주고 받을 수 있게 액세스할 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터는 분석 패키지, 예컨대 월드 와이드 웹 상에서 이용 가능한 단백질 프로스펙터, PROWL 또는 마스코트 검색 엔진을 사용할 수 있는 인터넷에 연결될 수 있다. 또한, 분석 소프트웨어는 LAN 또는 WAN 서버 상에서 원격 상주할 수 있다.

친화성 포착 프로브

하기 섹션에 상세하게 기재된 것과 같이 분석을 수행하기 위하여, 분석물을 흡수하는 1 이상의 친화성 포착 프로브(16)는 레이저 탈착/이온화원(13)에 의하여 신호 전달되거나, 탈착된 이온을 탠덤 질량 분광계(14)로 전달하기 위하여 프로브 인터페이스(10)에 연결된다.

통상적으로, 프로브(16)는 표면(18a, 18b, 18c, 18d)이 서로 다를 수 있는 1 이상의 흡수 표면(18)을 갖는다. 통상적으로, 다수의 흡수 표면(18)이 있는 경우, 프로브(16)의 통상면 상에 모두 노출된다.

통상적으로, 흡착 표면(18)은 크로마토그래피 흡수 표면 또는 생분자 친화성 표면이다.

크로마토그래피 친화성 표면은 분석액 중에서 크로마토그래피 분별을 할 수 있거나 분리할 수 있는 흡수제를 갖는다. 따라서, 이러한 표면은 음이온 교환 부분, 양이온 교환 부분, 역상 부분, 금속 친화성 포착 부분, 및 혼합 모드 흡수제를 포함하고, 이러한 용어들은 크로마토그래피 분야에서 이해된다. 생분자 친화성 표면은 특이성 결합을 할 수 있는 생분자를 포함하는 흡수제를 지닌다. 따라서, 이러한 표면은 항체, 수용체, 핵산, 렉틴, 효소, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 스타프 단백질 A 및 스타프 단백질 G를 포함할 수 있다. 또한, 흡수제 표면은 하기 섹션에서 더 설명한다.

인터페이스(10)는 레이저 탈착/이온화원(13)에 신호 전달 가능한 관계로 프로브(16)를 위치시킨다. 통상적으로, 레이저는 프로브 흡수 표면(18)에 신호 전달하는 것이 바람직하다. 따라서, 인터페이스(10)은 프로브(16) 흡수 표면(18)을 레이저 탈착/이온화원(13)에 신호 전달 가능한 관계로 위치 설정한다. 흡수 표면(18)이 프로브(16)의 한 면에만 위치 설정되는 경우, 인터페이스(10)의 프로브(16) 및/또는 프로브 홀더는 비대칭적으로 크기 설정되므로, 흡착 표면(18)을 레이저 탈착원(13)에 제공하는 배향으로 프로브(16)를 삽입시킨다.

프로브(16)가 다수의 흡착 표면(18)을 가진 경우, 레이저원(12)은 각각의 흡착 표면(18)을 분리하여 처리할 수 있는 것이 바람직할 것이다. 이것은 레이저원(12) 및 인터페이스(10) 사이에 삽입된 광학기에 의해, 레이저원(12) 및/또는 인터페이스(10)를 이동 가능하게 함으로써, 또는 이의 조합에 의해서 달성될 수 있다.

프로브(16)는 단일 MS 분석(예컨대, 미국 캘리포니아주 프레몬트에 소재하는 시퍼겐 바이오시스템즈, 인코포레이티드로부터 시판되는 것)에 현재 사용되는 것과 같은 친화성 포착 프로브일 수 있다.

III. 친화성 프로브 탠덤 MS 장치의 적용

본 발명의 전술한 분석 장치는 중요한 이점을 제공하고, (1) 단백질 발견 및 확인 및 (2) 특이성 결합 쌍 사이의 상호 작용의 특징화를 위한 새로운 방법을 제공하며, 이제 차례로 설명하고자 한다.

일반적으로, 전술한 분석 장치의 이점은 친화성 포착 프로브 기법, 특히 특이성 수용체 결합 시스템과 결합된 단일 질량 MS 및 탠덤 MS 모드에서 고 질량 정밀도 측정을 행하는 능력을 포함한다.

A. 단백질 발견 및 확인

1. 본 발명의 방법의 이점

단백질 생물학자들이 해결하려고 시도하는 한 가지 관련 문제점들은 단백질 발견, 확인 및 분석 개발이다. 단백질 발견은, 단백질이 진단 마커로서 작용하거나 중요한 세포 기능을 수행하기 때문에, 생물학적으로 흥미로운 시스템에서 단백질을 찾는 공정이다. 단백질 확인은 발견된 단백질이 확인을 측정하는 공정이다. 분석 개발은 단백질을 검출하는 신뢰할 만한 분석을 개발하는 공정이다. 본 발명의 방법은 이전 기법과 비교하여 상기 공정을 수행하는 데 참여하기 위한 이점을 제공한다.

본 발명의 제1 이점은 단백질 발견으로부터 단백질 확인, 분석 개발까지의 공정 단계를 수행하는 단일 플랫폼을 제공하는 것이다. SELDI 기법을 기초로 한 단일 플랫폼의 제공은 발견 및 분석 입증 사이의 시간을 상당히 감소시킨다: 이전 기법을 사용하여 수개월 걸던 것이 이제는 수 주 또는 수 일만 소요될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 실험을 수행하는 데 필요하는 시료의 양을 상당히 감소시킨다. 기존의 방법이 마이크로몰의 분석물을 요구한 반면, 본 방법은 피코몰의 분석물로 동일한 실험을 수행할 수 있다. 이것은 시료가 부족하거나 규모 확대가 곤란한 경우 중요한 장애를 극복한다.

기존에, 단백질 발견 및 분리는 2D 겔 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 달성되었다. 그러나, 우선적으로 발현된 단백질을 검출하기 위해 겔들을 서로 비교하는 것은 어려운 절차이다.

발견된 단백질은 질량 분광계 방법을 사용하여 현재 확인될 수 있다. 관심 대상의 단백질은 분리될 수 있고, 최종적으로 프로테아제로 겔에서 단변화될 수 있으며, 펩티드 단편은 질량 분광계 및 적당한 생물 정보 과학 방법에 의해 분석될 수 있다. 그러나, 겔은 기존의 질량 분광계 방법과 호환되지 않으므로, 펩티드 단편은 겔로부터 제거되어야 한다. 후자의 공정은 부득이 시료 손실을 발생시키기 때문에, 이 접근법은 대량의 출발 단백질 및 물질이 요구된다. 중요한 단백질일 수 있는, 단백질이 희박한 경우, 이것은 공정의 곤란성을 증가시킨다.

확인되면, 실시자는 신뢰할 만한 분석을 개발하여 단백질을 검출할 필요가 있다. 통상적으로, 이것은 ELISA 분석을 개발하는 것을 포함한다. 순차적으로, 이 기법은 항체의 제조를 필요로 한다. 이것은 특히 면역을 위한 양으로 생산하기 곤란한 관심 대상의 단백질인 경우 시간 소모적인 일일 수 있다.

따라서, 종래 기법은 단백질 발견, 단백질 확인 및 단백질 분석을 달성하기 위하여 3 가지 상이한 기법을 필요로 하였다. 본 발명의 방법은 하나의 기법으로 이것을 달성할 수 있다.

2. 단백질 발견 확인 및 분석 개발의 방법

단백질 발견, 확인 및 분석 개발을 위한 본 발명의 방법은 단백질 또는 관심 대상의 단백질을 발견하기 위하여 차등 지도를 제조하는 단계, 친화성 포착 프로브 탠덤 MS에 의해 단백질을 확인하는 단계 및 친화성 포착 프로브 레이저 탈착 이온화 크로마토그래피 표면 분석 또는 친화성 포착 프로브 레이저 탈착 이온화 생체 특이성 표면 분석을 사용하여 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 공정은 하기와 같이 진행될 수 있다. 관심 대상의 단백질을 제공하거나, 예를 들면 투석유물(retentate) 연구의 차등 지도화를 사용함으로써 발견된다. 이러한 방법들은 예컨대 WO 98/59362호(Hutchens 및 Yip)에 기재되어 있다. 간략하게도, 몇 가지 중요한 면(예컨대, 정상군 대 질환군; 작용성 대 비작용성)에서 차이가 나는 2 가지 생물학적 시료는 투석유물 크로마토그래피 방법에 의해 검출된다. 방법은 시료를 다수의 다른 크로마토그래피 친화성 및 세척 조건에 노출시킨 후, 친화성 포착 프로브 레이저 탈착 이온화에 의해 "보유 단백질"의 검출하는 것을 포함한다. 2 가지 시료 사이에서 차등 발현된 단백질은 추가의 검출에 대한 후보이다. 이들은 질량 분광계 상에서 검출되므로, 이러한 후보 단백질의 분자량은 공지되어 있다.

일반적으로, 관심 대상의 단백질 이외의 단백질의 스코어는 칩 상에서 보유될 것이다. 따라서, 다음의 임의의 단계는 단백질 및 관심 대상의 단백질이 추가의 분석을 위해 시료를 간소화하도록 보유되는 친화성 및 세척 조건을 정제하는 것이다(또한, 상기 공보(Hutchens 및 Yip)에 기재됨). 관심 대상의 단일 단백질의 포착이 이상적인 경우, 검출 가능한 10 종 이하의 단백질이 포착되는 것이 바람직할 수 있다. 정제된 방법은 관심 대상의 단백질에 대해 개선된 크로마토그래피 분석을 제공할 수 있다.

그 다음, 보유된 단백질은 정선한 단백질 분해제를 사용하여 프로브 상에서단편화시키고, 이후의 연구를 위해 펩티드의 풀을 제조한다. 분리 패턴이 공지되고, 데이타베이스에 저장된 단백질의 인 실리코(in silico) 분리를 포함하는 생물 정보 과학 방법과 호환성이기 때문에, 트립신과 같은 특이성 엔도프로테아제에 의한 분해가 유리하다. 그 다음, 생성된 펩티드는 고 분해능, 고 정밀도 MS-MS(예컨대, 100만 당 20 부 미만의 질량 지정 오차를 지님)에 의해 분석된다. 이 점에서, 특별한 펩티드 단편이 관심 대상의 단백질의 분리 산물인지, 또는 다른 보유된 단백질 중 하나의 분리 산물인지 명백하지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 분석은 펩티드 단편 중 하나를 선택하고(가능한 한 무작위로, 가능한 한 이것이 관심 대상의 단백질에 해당하는 정보를 기초로 함), 펩티드를 기체상 단편화함으로써 진행된다. 한가지 이러한 방법은 충돌 유도 해리(CID)이다. MS-MS 장치가 질량 분광계 내 다른 펩티드로부터 중요한 펩티드를 분리하기 때문에, 펩티드는 칩으로부터 분리될 필요가 없다. 이것은 선택된 펩티드 단편의 단편화 패턴을 더 발생시킬 것이다.

데이타베이스 마이닝 프로토콜과 같은 이 분야에서의 기존의 방법을 사용하여, 단편화 패턴으로부터의 정보는 단백질 데이타베이스를 신호 전달하여, 펩티드 단편이 유도되는 단백질에 대한 1 이상의 추정 동일성 후보를 발생시키는 데 사용된다. 일반적으로, 프로토콜은 단백질의 예상된 질량 스펙트럼이 선택된 단편의 실제 질량 스펙트럼과 일치하는 정도를 측정하는 적합한 접근 분석을 수행한다. 그 다음, 데이타베이스 내 단백질은 단백질 단편이 데이타베이스 단백질에 해당하는 신뢰 측정을 기준으로 평가할 수 있다. 이미 공지된 모체 단백질 및 기원 종의 질량의 지식은 발생된 동일성 후보의 수를 제한하는 것을 도울 것이다.

그 다음, 펩티드 단편이 발생되는 단백질의 추정 확인은 입증된다. 추정 동일성 후보의 제1 서열 및 사용된 단백질 분해제의 분리 패턴의 데이타베이스로부터의 지식을 이용하여, 단백질 분해제에 의한 분리 동일성 후보의 분리로부터 발생되어야 하는, 펩티드 단편, 특히 이들의 분자량을 예측할 것이다. 그 다음, 이 예측된 단편 세트는 이들의 질량을 기준으로, 칩상에 보유된 단백질의 단백질분해 분리 후에 발생된 실제 세트의 단편과 비교한다. 상기 예측된 단편이 설명되는 경우, 그 다음 하나는 추정 동일성 후보가 칩 상에 보유된 단백질 중 하나의 확인과 실제 일치하는 것으로 확신한다. 그렇지 않은 경우, 하나는 단편이 발생되는 단백질이 확인될 때까지 제거 공정을 통하여 기타의 추정의 동일성 후보를 테스트해야 한다. 이점에서 확인된 단백질과 일치하는 발생된 단편은 설명된 바와 같이 발생된 세트의 단편으로부터 제거될 수 있다.

하나의 단백질만이 친화성 및 세척 조건을 정제한 후 보유되는 경우, 모든 펩티드 단편은 설명될 것이고, 공정은 종결된다. 그러나, 1 이상의 단백질이 보유되는 경우, 상태는 더욱 복잡하게 될 것이다. 예를 들면, 분석에 사용된 상기 단편이 관심 대상의 단백질로부터 발생될 수 있거나, 이것은 칩 상에 보유되지만 관심 대상의 단백질이 아닌 단백질에 의해서 발생될 수도 있다. 이 경우에, 기술된 MS-MS 방법에 의하여 관심 대상인 단백질이 확인되거나 모든 보유된 단백질이 확인될 때까지 설명되지 않은 펩티드 단편의 분석 단계를 반복하는 것이 유용하다.

최종적으로, 관심 대상의 단백질은 단백질을 보유하는 것으로 이미 결정된 크로마토그래피 표면을 사용하여 친화성 포착 프로브 레이저 탈착 이온화 방법에의해 평가될 수 있거나, 생체특이성 표면이 친화성 포착 프로브 레이저 탈착 이온화 평가에 사용하기 위하여 개발될 수 있다. 생체특이성 표면의 형성은 항체와 같은 확인된 단백질에 대한 결합 파트너 또는, 수용체가 공지된 경우의 수용체를 제공하고, 이것을 칩 표면에 부착시키는 것을 포함한다. 그 다음, 관심 대상의 단백질은 전술한 SELDI에 의해 분석될 수 있다.

B. 분자 상호 작용의 특성화

본 발명의 분석 장치는 특이성 결합 파트너 사이의 상호 작용의 연구에 대한 민감성이고, 효율적인 단일 플랫폼 접근을 처음으로 가능하게 한다.

특이성 결합 파트너 상호 작용은 생물학적 공정들의 넓은 스펙트럼의 중심에 있다. 따라서, 이러한 상호 작용을 측정하고 특징화하는 능력은 이러한 공정을 완전히 이해하는 데 필수적인 필요 조건이며; 임상 수준에서, 이러한 상호 작용을 측정하고 특징화하는 능력은 이 공정에서 병리학적 변이의 이해 및, 이러한 상호 작용을 제어하거나 폐기하는 데 사용될 수 있는 작용제의 합리적인 설계에서 중요하다.

조직화된 진핵세포 조직의 수준에서, 예를 들면 포유동물 신경 시스템에서의 세포간 신호는 신경 전달 물질과 이들의 동일 기원과의 상호 작용을 통하여 매개된다. 이러한 결합 상호 작용의 분자 성질의 이해는 이러한 신호 메카니즘의 완전한 이해를 위해 필요하다. 임상적 수준에서, 이러한 결합 상호 작용이 분자 성질의 이해는 신호 병변의 메카니즘의 완전한 이해를 위해, 그리고 이러한 신호 병변을 완화시키는 작용제, 즉 파킨슨 질병으로부터 정신 분열증까지, 강박 장애로부터 간질에 이르는 범위의 질병의 치료에 유용한 작용제의 합리적인 설계를 위하여 필요하다.

순환계 수준에서, 예를 들면 B 세포 수용체와 순환 항원과의 상호 작용은 B 세포 클론 확장, 분화 및 항원 특이성 체액 면역 반응을 유발하는 데 필요하다. 항원 인지에 기여하는 항원 에피토프의 이해는 면역 반응성을 완전히 이해하는 데 중요하다. 임상적 수준에서, 이러한 이해는 건장한 체액 면역을 주는 백신의 설계에서 중요하다. 유사하게도, 항원 주개 세포 상에서 MHC와 관련하여 나타나는 T 세포 수용체와 펩티드의 반응은 세포 면역의 유발에 중요하다. 항원 인지에 기여하는 T 세포 에피토프의 이해는 건장한 세포 면역을 주는 백신의 설계에 중요하다.

개개의 세포의 수준에서, 세포외 신호에 대한 표현형 반응은 1 이상의 세포 표면 수용체와 리간드의 개시 상호 작용으로부터 신호를 핵으로 변환하는 세포질 내 상호 작용, 즉 단백질 번역 인자와 DNA의 상호 작용의 세포 내 상호 작용 후, 관찰된 표현형 반응을 유도하는 유전자 발현의 변형된 패턴의 다단계에 의해서 1 회 이상, 대부분은 종종 매개된다.

예를 들면, 난소 세포에 의한 에스트로겐과 프로게스테론의 식별 결합은 배란을 위해 필요하다. 한편으로는, 스테로이드 호르몬 수용체와 호르몬 리간드 사이, 다른 한편으로는 게놈에서 리간드 수용체와 스테로이드 호르몬 수용체 호르몬 반응 요소 사이의 결합 상호 작용의 분자 성질의 이해는 호르몬 반응의 이해를 위해 중요하다. 또한, 이러한 이해는 불임의 이해와, 배란, 이식 및/또는 태아 생존력을 폐기하려고 하는 RU486과 같은 작용제의 합리적인 설계에 중요하다.

이러한 상호 작용은 진핵 생물 시스템뿐 아니라, 원핵 생물 시스템에서, 그리고, 원핵생물과 진핵 생물의 상호 작용에서 발견된다. 예를 들면, 특정 그램 음성 박테리아는 진핵 생물 유레트라(eurethra)의 침입에 필요한 섬모를 만드는데, 이러한 상호 작용의 이해는 병리학적 과정의 완전한 이해에 중요하며, 이러한 침입을 방지할 수 있는 제제의 합리적인 설계에 중요하다.

다수의 기법들이 이 분야에서 특이성 결합 파트너 사이에서 이러한 세포내 상호 작용을 연구하고 지도를 만드는 데 사용된다. 각각은 중요한 이점을 갖는다.

이러한 제1 방법에서, 특이성 결합 쌍의 한 일원은 크로마토그래피 칼럼에 패킹된 흡수제 상에 고정된다. 제1(결합된) 결합 파트너와 접촉하는 제2(자유) 결합 파트너의 구조 내의 위치를 지도화하기 위하여, 제2(자유) 파트너는 분리된다. 통상적으로, 이러한 분리는 특이성 단백질분해 효소에 의해 특이성 화학적 분리(예를 들면, CNBr에 의해) 또는 비특이성 화학 가수분해를 통하여 행해질 수 있다. 이후에, 분해는 제1(고정) 파트너에 여전히 결합된 제2(자유) 파트너의 이러한 부분을 결합시키기 위하여 컬럼을 통하여 통과된다.

그 다음, 제2 파트너의 펩티드를 통상적으로 염 또는 pH 구배를 사용하여 용리시키고, 통상적으로 MALCI 또는 전자 분무 이온화를 사용하여 펩티드를 질량 분광계로 도입함으로써 확인한다.

이러한 접근은 널리 공지된 수 가지 심각한 문제점을 갖는다. 첫째, 대량의 정제된 제1 결합 파트너가 특이성 흡수제를 생성하기 위하여 요구된다. 둘째, 이러한 각각의 단계들이 희석 효과 및 분석물 손실을 수반하기 때문에, 통상적으로 정제된 대량의 제2 결합 파트너는 분해, 흡착 및 용리에 필요하다. 또한, 이후의 질량 분광계 분석이 고 민감성일지라도, 유체상 분석을 MS에 인터페이스 하는 것도 분석물 손실을 야기할 것이다.

추정상, 보다 기본적인 단점은 제1 파트너에 결합하기 전에 제2 결합 파트너를 분리시킴으로써 펩티드 단편에 적당하게 유지된 제2 결합 파트너 상의 이들 분자 구조만이 결합되고, 이후에 검출되는 것이다. 예를 들면, 항체가 선형이 아닌 불연속 에피토프에서 항원과 결합하는 경우, 이러한 불연속 에피토프는 단편화에 의해서 파괴될 수 있으며; 고정된 항체를 지지할 수 없고, 이러한 항원 에피토프는 검출될 수 없다.

이 분야에서 통상의 제2 접근법은 점 돌연변이를 사용하여, 단백질 결합 파트너 내에서 분자 내 결합에 기여하는 이 잔류물들을 지도화하는 것이다.

이 후자의 접근법은 단백질 결합 파트너가 클로닝되는, 소정 점 돌연변이의 발생, 개조된 단백질의 재조합 발현 및 이의 정제를 필요로 한다. 이후에, 개조된 단백질의 다른 파트너에 대한 결합 운동 에너지를 측정하여, 분자 내 상호 작용에서 돌연변이된 잔류물의 영향을 결정한다.

보다 덜 자주 사용되는 결합 파트너 사이의 접촉의 성질은 결합된 파트너의 X-선 결정학에 의해 밝혀질 수 있다. 이 기법은 매우 효과적이고, 원자 수준의 해상도를 제공하지만, 각 결합 파트너가 고도로 정제될 필요가 있으며, 또한 적합한 공결정이 형성될 필요가 있다.

본 발명의 친화성 포착 탠덤 질량 분광계 장치는 훨씬 덜한 출발 물질을 필요로 하고, 점 돌연변이 분석, 즉 결정화를 방지하고, 순도 요건을 실질적으로 감소시키는 개선된 접근법을 제공한다.

제1 단계는 결합 파트너 중 하나를 친화성 포착 프로브 상에 고정시키는 것이다.

파트너는 고정될 수 있지만, 이것은 결합 접촉에 대한 구조 정보가 얻어질 자유 파트너이다. 접근법의 예로서 수용체/리간드 상호 작용을 사용하여, 리간드를 프로브 상에 고정시키는 것은 리간드를 결합시키는 데 참여하는 수용체의 영역을 확인할 수 있을 것이고; 수용체를 프로브 상에 고정하는 것은 수용체에 결합하는 데 참여하는 리간드의 영역을 확인할 수 있을 것이다. 리간드가 단백질, 예컨대, 단백질 호르몬, 시토킨 또는 케모킨인 경우, 각각의 파트너를 순차적으로 사용하는, 별도의 실험은 분자간 접촉의 쌍방의 이해를 얻을 것이다.

프로브 결합된 파트너는 공유 또는 강한 비공유 상호 작용을 사용하여 고정될 수 있다. 선택은 고정될 파트너 및 프로브의 표면의 화학 성질에 적합한 반응 군의 유용성에 좌우될 것이다. 적당한 화학물들은 분석 분야에서 공지되어 있다.

예를 들면, 고정될 결합 파트너는 유리 아미노기를 가지며, 공유 결합은 결합 파트너의 유리 아미노기와 프로브 표면의 카르보닐디이미다졸 부분 사이에 형성될 수 있다. 유사하게도, 결합 파트너의 유리 아미노기 또는 티올기는 파트너를 에폭시기를 지닌 프로브 표면에 공유 결합시키는 데 사용할 수 있다. 강한 배위 결합은 결합 파트너의 유리 설프히드릴기와 프로브 표면 상의 금 또는 백금 사이에 형성될 수 있다.

임의로, 프로브 표면 상에 남아 있는 반응성 부위는 이후 차단되어서, 활성화된 프로브 표면에 대한 비특이성 결합을 감소시킨다.

그 다음, 제2(자유) 결합 파트너는 친화성 포착 칩에 접촉되고, 제1(고정) 결합 파트너에 결합하게 한다.

제2(자유) 결합 파트너는 공지되어 이용 가능한 경우, 용액 내에 순수하게 존재할 수 있거나, 더욱 통상적으로는 불균질 혼합물, 예컨대 제2 결합 파트너를 포함할 것으로 예측된 생물학적 시료로부터 포착될 것이다. 전술한 생마커 발견 접근법에서와 같이 생물학적 시료는 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 세포간액, 소변, 배설물은 세포 용해물, 세포 분비액 또는 이들의 부분적으로 분획되고 정제된 부분일 수 있다.

그 다음, 프로브는 한정된 용리 특성을 갖는 1 이상의 용리액으로 세척된다. 이 세척은 비특이적으로 프로브에 결합하는 종의 수를 감소시키는 역할을 수행한다.

그 다음, 에너지 흡수 분자를 통상적으로 액체상으로 적용하고, 건조시킨다. 에너지 흡수 분자의 적용은 친화성 포착 프로브의 존재하는 사용과 같이 동일한 방식으로 수행하고; Proteinchip(등록상표) 어레이(미국 캘리포니아주 프레몬트에 소재하는 시퍼겐 바이오시스템즈 인코포레이티드)를 사용하고, 에너지 흡수 분자는 제조가 지침에 따라 적용한다.

그 다음, 친화성 포착 프로브에 비공유적으로 결합한 종, 예컨대 제1(고정) 결합 파트너에 특이적으로 결합한 제2 결합 파트너, 프로브 표면에 비특이적으로결합한 분자, 제1 결합 파트너에 비특이적으로 결합한 분자는 레이저 탈착 이온화 질량 분광계의 제1 상에서 검출된다.

질량 분광계는 단일 단계 친화성 포착 LDI-MS 장치, 예컨대 시퍼겐 바이오시스템즈 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)로부터의 PBS II일 수 있다. 그러나, 본 발명의 친화성 포착 탠덤 MS는 고 질량 정밀도 및 고 질량 해상도를 제공하므로 바람직하다.

통상적으로, 제2(자유) 결합 파트너는 초기 연구로부터 공지되어 있으며, 이의 존재 또는 부재는 질량 분광계에 의해 즉시 확인할 수 있다. 제2(자유) 결합 파트너가 알려져 있지 않은 경우, 프로브에 결합된 각각의 종은 순차적으로 조사될 수 있다. 검출 가능한 종의 수가 너무 많은 경우, 친화성 포착 프로브는 다른 용리 특성(통상적으로, 증가된 긴축성(stringency))을 가진 용리액으로 세척하여 분석에 대해 존재하는 종의 수를 감소시킬 수 있다.

제1(고정) 결합 파트너에 대한 제2("자유") 결합 파트너의 결합이 확인되는 경우, 제2 결합 파트너는 단편화된다. 통상적으로, 이것은 제2 결합 파트너(즉, 이 점에서 제1 결합 파트너에 비공유적이나 특이적으로 결합하고, 프로브 표면 상에 순차로 고정됨)를 특이성 엔도프로테아제, 예컨대 트립신, Glu-C(V8) 프로테아제, 엔도프로테이나제 Arg-C(세린 프로테아제 또는 시스테인 프로테아제 Arg-C 효소), Asn-N 프로테아제 또는 Lys-C 프로테아제와 접촉시킴으로써 달성된다.

분해 후, 펩티드는 질량 분광계에 의해 검출된다.

제2 결합 파트너의 모든 단편을 확인하려는 경우, 예컨대 펩티드 질량 지문분석에 의해 제2 결합 파트너의 동일성을 확인하려는 경우, 에너지 흡수 분자는 적용되고, 프로브는 레이저 탈착 이온화에 의해 펩티드를 질량 분광계로 도입시킨다. 이러한 목적으로, Ciphergen PBS II 단일 가속 단계 선형 TOF MS가 사용되고; 보다 뛰어난 질량 정밀도 및 질량 해상도를 제공하는 본 발명의 탠덤 MS는 바람직하고, 이로 인해, 증가된 해상도 및 정밀도가 임의의 소정 데이타베이스 조회에서 임의의 소정 신뢰 수준으로 회복된 추정상 "히트"의 수를 감소시킨다.

그러나, 보다 통상적으로, 고정된 제1 결합 파트너에 가장 밀접하게 결합하는 제2 결합 파트너의 이러한 단편을 분석하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에서, 프로브는 에너지 흡수 분자의 첨가 전에 1 이상의 용리액으로 세척된다.

이 점에서, 프로브는 본 발명의 탠덤 MS의 인터페이스로 삽입되고, 제2 결합 파트너의 단편(통상적으로 펩티드)은 검출된다.

제2(자유) 결합 파트너의 동일성이 공지된 경우, 검출된 단편의 질량은 효소를 단편화시키는 공지된 분리 법칙을 제2 결합 파트너의 제1 아미노산 서열에 적용함으로써 예측된 것과 비교할 수 있다. 이 양식에서, 각 단편은 확인될 수 있고, 이로써 제2 결합 파트너의 구조 내에 제1 결합 파트너로의 결합을 초래하는 이 부분을 위치시킨다.

이론적으로, 단일 단계 MS 장치가 사용될 지라도, 실제로 제2 결합 파트너로부터 발생하는 것 이외의 단편이 존재하여, 이러한 분석을 혼동시킨다. 통상적인 경우에서 결정적인 확인은 본 발명의 장치의 고 질량 해상도 및 질량 정밀도로부터 유리하게 되며, 또한 ms/ms 분석으로부터 유리하게 된다.

제2(자유) 결합 파트너가 알려지지 않은 경우, 파트너는 ms/ms 분석에 의해 확인될 수 있다.

통상적으로, 이러한 분석은 MS의 제1 단계에서 제1 모체 펩티드를 선택하고, 선택된 펩티드를 단편화한 후, MS 분석의 제2 단계에서 단편 질량 스펙트럼을 발생시키는 형식을 취할 수 있다. 단편화는 기체상으로, 바람직하게는 충돌 유도 해리에 의해 수행된다. 본 발명의 친화성 포착 탠덤 질량 분광계의 바람직한 구체예에서, CID는 약 10^-2torr에서 질소 기체와 충돌함으로써 q2에서 수행된다.

그 다음, 단편 스펙트럼은 공지된 알고리즘, 예컨대 미국 특허 제5,538,897호 및 제6,017,693호, Yates 등에 기재되고, 단백질 프로스펙터 MS-TAG (http://prospector. ucsf/edu) 모듈에서 사용된 것을 사용하여 서열 데이타베이스를 테스트하는 데 사용된다.

또한, 추정적 확인은 모든 펩티드가 확인 가능한 모체로부터 유도되도록 확증 하는 데 필요하는 바와 같이 제2 모체 펩티드를 선택하고, 상기 접근을 반복함으로써 입증될 수 있다.

그 후, 제2 결합 파트너가 확인되는 경우, 세포 내 분자 상호 작용의 성질은 전술한 바와 같이 연구될 수 있다. 효소(또는 화학 물질, 예컨대 CNBr)를 단편화시키는 공지된 분리 법칙은 현재 확인된 제2 결합 파트너의 제1 서열에 적용하고, 실험적으로 측정된 펩티드는 이론적 분해로 지도화하며, 따라서 결합된 펩티드를 확인하고, 따라서 천연 분자에서 고정된 제1 결합 파트너에 대한 결합에 기여한다. 그리고, 상기와 같이, 실험은 세척의 긴축성을 증가시켜서 반복하여 더욱 단단히결합된 이들 펩티드를 확인할 수 있다.

다른 섭동법을 수행하여 세포내 결합의 추가 성질을 밝혀낼 수 있다.

제2 결합 파트너의 단편화 후 프로브를 세척하기 위한 용리액의 용리 특성은 상호 작용에 가장 강하게 기여하는 단편을 확인하거나, 결합에 기여하는 pH 의존성 또는 염 의존성을 확인하도록 변경할 수 있다.

물론, 그 원리는 크로마토그래피 및 분자 생물학 분야에 널리 공지되어 있으며, 세척의 증가된 긴축성(예컨대, 증가된 염 농도, 고온)으로, 고정된 제1 결합에 덜 밀접하게 결합된 이들 단편들은 제1 결합 파트너를 용리 제거할 것이다. 본 기하 구조에서, 이러한 불량하게 결합한 단편은 프로브를 용리 제거하고, 이후의 질량 분광계 분석으로부터 손실될 것이다. 따라서, 일련의 실험은 프로브 또는 동일한 대응 프로브가 긴축성을 증가시키도록 세척되고, 따라서 제2 결합 파트너의 단편의 등급별 일련의 부분을 생성시키는데, 각 연속 부분은 더욱 밀접하게 결합하는 단편의 보다 작은 부분을 갖는다.

전술한 바와 같이, 제1(고정) 및 제2(자유) 결합 파트너는 상호 교환될 수 있으며, 다른 파트너의 결합 접촉은 명백해질 것이다.

추가의 유용한 섭동은 결합 파트너의 하나 또는 모두에서 후 전사 변형의 제거 또는 개조이다. 예를 들면, 제1 결합 파트너가 당단백질인 경우, 제2 결합 파트너의 결합 전후에 1 이상의 특이성 또는 비특이성 글리코시다제로 처리하는 것은 당 잔류물의 결합으로의 공헌을 명백하게 하는 것을 도울 것이다.

유사하게도, 결합 파트너 중 하나는 핵산이고, 다른 결합 파트너의 결합 후에, 핵산 결합 파트너를 뉴클레아제로 처리하는 것은 결정적인 결합 잔류물을 확인하는 것을 도울 것이다.

세포 내 상호 작용을 특성화하기 위하여 전술한 접근법은 다중 플랫폼이고, 노동 집약적인 종래기술의 비민감성 기법을 단일 플랫폼의 능률적인 민감성 접근법으로 대체한다. 이 접근법은 각종의 다른 생물학적 시스템 및 문제에 적용할 수 있다.

상기 제시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 에피토프 지도화를 위하여, 즉 항체, T 세포 수용체 또는 MHC로의 결합에 기여하는 항원 내에서 접촉하는 것을 확인하기 위하여 사용할 수 있다. 상기 방법은 다단백질 착체에서 생물 리간드와 이들의 수용체, 번역 인자와 핵산, 번역 인자와 다른 번역 인자로의 결합의 특성을 명백하게 하는 데 사용될 수 있다.

단백질/단백질 상호 작용에 관하여 구체적으로 상기 논의되었지만, 본 발명의 방법은 렉틴 및 당단백질, 단백질 및 핵산 및 소형 분자 및 수용체 사이의 결합 상호 작용을 명백하게 하기 위하여 실시될 수 있다.

특히, 소형 분자 리간드에 관하여, 또한 상기 방법은 공지된 수용체의 작용제 및 길항 물질의 설계를 적용할 수 있다.

지난 10년에 걸쳐서, 1 이상의 생물 과정에 영향을 미치는 능력에 대한 각종의 균질하고 살아 있는 세포 분석에서 다수의 소형 분자를 조합적으로 발생시키고, 이러한 분자를 스크리닝하기 위한 기법들이 개발되어 왔다. 예를 들면, 균질한 섬광 근접 분석은 공지된 수용체에 대한 결합에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있고; 디지탈 영상을 기초로 한 세포 분석은 하류 효과, 예컨대 수용체의 세포질/핵 전달, 세포 내 칼슘 분배의 변화, 세포 운동성의 변화를 위한 조립 라이브러리로부터 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있다.

그러나, 이러한 납 분자가 확인되는 경우, 이 수용체와 소형 분자의 상호 작용의 상세한 이해는 개선된 약물 동력학 및 치료학적 지수로 분자의 정보 처리 기능을 지닌 설계를 촉진할 것이다. 본 발명의 기법은 이러한 용도에 적절하다.

소형 분자가 에너지 흡수 분자에 의해 제공된 신호를 제공하는 경우, MS는 조합 라이브러리 구성성분에 대해 공지된 질량만을 조사하는 단일 이온 모니터링으로 수행된다.

전립선암 생마커의 확인

전통적으로, 전립선 암종은 전립선 특이성 항원(PSA)의 상승된 혈중 수치의 발견 후 생검을 통하여 진단된다. 정상 남성에게서, PSA는 1 ng/ml 미만의 수치로 존재한다. BPH 및 전립선 암종의 경우, PSA 수치는 4 내지 10 ng/ml로 상승된다[Chen 등,J. Urology157: 2166-2170 (1997); Qian 등,Clin. Chem.43: 352-359 (1997)]. PSA는 티로신 및 루신의 C-말단에서 분리되는 키모트립신 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다[Qian 등,Clin. Chem.43: 352-359 (1997)].

BPH로 진단된 환자뿐만 아니라 전립선 암종으로 진단된 환자로부터의 생식 혈장은 ProteinChip(등록상표) 구별 디스플레이의 기법을 사용하여 분석하였다. 도 3은 단일 BPH 및 전립선 암 환자의 생식 유체 단백질 프로필을 나타내었다. 실제겔 디스플레이는 시료 간의 가시적 비교를 향상시키는 데 사용한다. 전립선암-BPH의 단백질 프로필에 대한 차등 플롯은 겔 조망 점 아래에 나타난다. 전립선 암에서 상향 조절된 단백질은 양성적으로 대체된 차등 플롯의 신호를 나타내고, 음성 피크는 단백질 조절 아래로 전립선암을 나타낸다. 가능한 전립선암 생마커를 나타내는 수 개의 독특한 상향 조절된 신호를 검출하였다.

이 상향 조절된 단백질 중 하나의 칩 상에서의 분리는 혼합 모드 표면 및 중성 pH 완충 세척을 사용하여 달성시켰다(도 4 참조). 이 경우에, 단백질을 풍부하게 하여 균질성에 근접하게 하였다. 그 다음, 풍부한 생마커 후보를 트립신을 사용하여 계내 분해에 노출시켰다. 항온 처리 후, CHCA(매트릭스)의 포화용액을 첨가하고 후속의 분해 산물을 SELDI-TOF로 분석하였다.

수 개의 펩티드를 검출하였다(도 5 참조). 생성 펩티드 신호를 단백질 데이타베이스 분석에 대해 제시하고, 인간 세메노겔린 I을 예비 확인하였다. 생마커가 세메노겔린 I의 것(MW 52,131 Da)보다 훨씬 낮은 약 5751 Da의 분자량을 가지므로 이 확인은 다소 복잡하였다.

동일한 정제 단백질을 ProteinChip LDI Qq-TOF MS 검출을 위해 제시하였다(도 6 참조). 5751 Da에서의 모체 이온은 LDI-Qq-TOF MS/MS 분석에 대한 현행 질량 한계치(3000 M/z) 보다 낮기 때문에, 이중 전하 이온은 CID MS/MS 순서계획을 위해 사용하였다(도 7 참조). CID MS/MS 결과를 사용하여 단백질 데이타베이스 마이닝을 수행하였다. 26 개의 ms/ms 이온 중 15 개는 인간 생식 기초 단백질(SBP), 즉 이 후보 생마커의 한정적 확인을 제공하는 세메노겔린 I의 단백질 분해 유도된 단편으로 지도 작성하였다.

이것들이 잠재적인 생마커를 신속하게 밝혀내는 것과 같은 초기 연구 동안, 임의이 생마커의 완전한 확인은 발현 및 확산에 대한 통계적으로 중요한 정보를 얻기 위하여 다수 또는 수백의 적절한 시료의 분석을 필요로 한다.

본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 공보 및 기타의 발행된 참고문헌은 본 명세서에서 개별적으로 특별하게 인용될 지라도, 본 명세서에서 전적으로 참고로 인용한다. 이 문서에서 각종 참고 문헌의 인용에 의하여, 본 출원인은 임의의 특정 참고 문헌이 이들의 발명에 대하여 "종래 기술"임을 나타내는 것은 아니다.

특별한 실시예가 제공되는 경우, 상기 기재는 예시적일 뿐이지 한정하려는 것은 아니다. 상기 기재된 구체예의 임의의 1 이상의 특성은 임의의 방법으로 본 발명 내의 임의의 다른 구체예의 1 이상의 특징과 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 많은 변형예는 본 명세서를 검토한 당업자들에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 기재를 참고로 결정되는 것이 아니라, 그 대신, 이들의 등가물의 완전한 범주와 함께 첨부된 청구항을 참고하여 결정되어야 한다.

Claims (63)

1. 레이저 탈착 이온화원;

   친화성 포착 프로브 인터페이스; 및

   탠덤 질량 분광계를 포함하며, 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스가 친화성 포착 프로브와 연결 가능하고, 상기 프로브를 상기 레이저원에 대해 신호 전달 가능한(interrogatable) 관계로 및 동시에 상기 탠덤 질량 분광계와 신호를 주고 받도록 위치 설정할 수 있는 분석 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 레이저 탈착 이온화원은 레이저 여기원과 여기된 광자를 상기 레이저 여기원으로부터 상기 프로브 인터페이스로 전송할 수 있는 레이저 광학 트레인을 포함하는 것인 분석 장치.
3. 제2항에 있어서, 상기 레이저 광학 트레인은 상기 레이저 여기원으로부터 신호 전달된 프로브 표면 ㎟ 당 약 20 μJ 내지 1000 μJ의 에너지를 전달하는 것인 분석 장치.
4. 제2항에 있어서, 상기 레이저 여기원은 연속 레이저 및 펄스 레이저로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
5. 제2항에 있어서, 상기 레이저 여기원은 질소 레이저, Nd:YAG 레이저, 에르븀:YAG 레이저 및 CO₂레이저로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
6. 제2항에 있어서, 상기 레이저 여기원은 펄스 질소 레이저인 분석 장치.
7. 제3항에 있어서, 상기 레이저 광학 트레인은 렌즈, 거울, 프리즘, 감쇠기 및 빔 스플리터로 구성된 군 중에서 선택되는 광학 소자를 포함하는 것인 분석 장치.
8. 제3항에 있어서, 상기 레이저 광학 트레인은 입력단 및 출력단을 가진 광섬유를 포함하며, 상기 레이저 여기원은 상기 광섬유 입력단에 커플링된 것인 분석 장치.
9. 제8항에 있어서, 상기 레이저 광학 트레인은 광학 감쇠기를 더 포함하는 것인 분석 장치.
10. 제9항에 있어서, 상기 감쇠기가 상기 레이저 여기원과 상기 광섬유 입력단 사이에 위치 설정되는 것인 분석 장치.
11. 제9항에 있어서, 상기 감쇠기는 상기 레이저 여기원을 상기 광섬유 입력단에 커플링하는 광학 커플러인 분석 장치.
12. 제9항에 있어서, 상기 감쇠기는 상기 광섬유 출력단과 상기 프로브 사이에 위치 설정되는 것인 분석 장치.
13. 제8항에 있어서, 상기 광섬유 출력단은 최대 직경이 약 200 내지 400 ㎛인 분석 장치.
14. 제13항에 있어서, 상기 광섬유 입력단의 직경이 약 400 내지 1200 ㎛인 분석 장치.
15. 제2항에 있어서, 상기 레이저 탈착 이온화원은 프로브 조망 광학기를 더 포함하는 것인 분석 장치.
16. 제8항에 있어서, 상기 레이저 여기원을 상기 광섬유 입력단에 커플링하는 광학 커플러를 더 포함하는 것인 분석 장치.
17. 제16항에 있어서, 상기 커플러 또는 상기 섬유는 분기되고, 상기 레이저 여기원으로부터 에너지의 일부를 분할시키는 것인 분석 장치.
18. 제17항에 있어서, 상기 커플러 또는 상기 광섬유는 분기되고, 가시 광선을도입하여 탈착 부위를 조명하는 것인 분석 장치.
19. 제15항 또는 제18항에 있어서, 상기 프로브로부터 반사된 빛을 검출하도록 위치 설정된 CCD 카메라를 더 포함하는 것인 분석 장치.
20. 제1항에 있어서, 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스는 상기 친화성 포착 프로브를 연동할 수 있는 프로브 홀더를 포함하는 것인 분석 장치.
21. 제20항에 있어서, 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스는 상기 프로브 홀더를 연동할 수 있는 프로브 도입 포트를 더 포함하는 것인 분석 장치.
22. 제21항에 있어서, 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스는 프로브 위치 설정 액츄에이터 어셈블리 및 인터페이스 이온 수집 시스템을 더 포함하며, 상기 프로브 위치 설정 액츄에이터는 상기 프로브 홀더가 상기 인터페이스에 연결되는 경우, 상기 프로브 홀더와 접촉할 수 있고, 상기 레이저 이온화원 및 상기 이온 수집 시스템 둘다에 대하여 상기 프로브 홀더 및 상기 프로브를 가동적으로 위치 설정시킬 수 있는 것인 분석 장치.
23. 제22항에 있어서, 상기 액츄에이터는 상기 프로브홀더를 병진 및 회전 가능하게 위치 설정할 수 있는 것인 분석 장치.
24. 제22항에 있어서, 상기 인터페이스는 상기 프로브 도입 포트에 커플링된 진공 배출 시스템을 더 포함하는 것인 분석 장치.
25. 제24항에 있어서, 상기 진공 배출 시스템은 상기 프로브 인터페이스에서 대기압보다 낮은 압력을 생성할 수 있는 것인 분석 장치.
26. 제1항에 있어서, 상기 탠덤 질량 분광계는 QqTOF MS, 이온 트랩 MS, 이온 트랩 TOF MS, TOF-TOF MS 및 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 MS로 구성되는 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
27. 제26항에 있어서, 상기 탠덤 질량 분광계는 QqTOF MS인 분석 장치.
28. 제2항에 있어서, 상기 탠덤 질량 분광계는 QqTOF MS이고, 상기 레이저 여기원은 펄스 질소 레이저인 분석 장치.
29. 제1항에 있어서, 상기 탠덤 질량 분광계는 외부 표준 질량 정밀도가 20 내지 50 ppm인 분석 장치.
30. 제1항에 있어서, 상기 프로브에서의 레이저 플루언스는 최소 탈착 역치의 약2 내지 4 배인 분석 장치.
31. 제1항에 있어서, 친화성 포착 프로브를 더 포함하며, 상기 친화성 포착 프로브는 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스에 연결되고, 상기 레이저원에 대해 신호 전달 가능한 관계로 및 동시에 상기 탠덤 질량 분광계와 신호를 주고 받도록 위치 설정되는 것인 분석 장치.
32. 제31항에 있어서, 상기 친화성 포착 프로브는 상기 레이저원에 대해 신호 전달 가능한 관계로 위치 설정된 1 이상의 시료 흡착 표면을 갖는 것인 분석 장치.
33. 제32항에 있어서, 상기 1 이상의 시료 흡착 표면은 크로마토그래피 흡착 표면 및 생분자 친화성 표면으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
34. 제33항에 있어서, 상기 1 이상의 시료 흡착 표면은 크로마토그래피 흡착 표면인 분석 장치.
35. 제34항에 있어서, 상기 크로마토그래피 흡착 표면은 역상, 음이온 교환, 양이온 교환, 고정된 금속 친화성 포착 및 혼합 모드 표면으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
36. 제33항에 있어서, 상기 1 이상의 시료 흡착 표면은 생분자 친화성 표면인 분석 장치.
37. 제36항에 있어서, 상기 생분자는 항체, 수용체, 핵산, 렉틴, 효소, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 스타프 단백질 A 및 스타프 단백질 G로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
38. 제31항에 있어서, 상기 친화성 포착 프로브는 상기 레이저원에 대해 신호 전달 가능한 관계로 위치 설정된 개별 처리 가능한 다수의 시료 흡착 표면을 가진 것인 분석 장치.
39. 제38항에 있어서, 각각의 상기 개별 처리 가능한 시료 흡착 표면은 역상 크로마토그래피 흡착 표면, 음이온 교환 크로마토그래피 흡착 표면, 양이온 교환 크로마토그래피 흡착 표면, 고정된 금속 친화성 포착 크로마토그래피 흡착 표면, 혼합 모드 크로마토그래피 흡착 표면, 항체 친화성 표면, 수용체 친화성 표면, 핵산 친화성 표면, 렉틴 친화성 표면, 효소 친화성 표면, 바이오틴 친화성 표면, 아비딘 친화성 표면, 스트렙타비딘 친화성 표면, 스타프 단백질 A 친화성 표면 및 스타프 단백질 G 친화성 표면으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 분석 장치.
40. 제38항에 있어서, 상기 다수의 개별 처리 가능한 시료 흡착 표면은 2 이상의상이한 흡착 표면을 포함하는 것인 분석 장치.
41. 제1항에 있어서, 상기 탠덤 질량 분광계의 검출기와 인터페이스된 디지탈 컴퓨터를 더 포함하는 것인 분석 장치.
42. 제41항에 있어서, 상기 디지탈 컴퓨터로 실행할 수 있는 소프트웨어 프로그램를 더 포함하는 것인 분석 장치.
43. 제42항에 있어서, 상기 소프트웨어 프로그램은 상기 컴퓨터에 대하여 로컬로 작용하는 것인 분석 장치.
44. 제42항에 있어서, 상기 소프트웨어 프로그램은 상기 컴퓨터에 대하여 로컬로 작용하지는 않지만, 액세스하여 신호를 주고 받을 수 있는 것인 분석 장치.
45. 제42항에 있어서, 상기 소프트웨어 프로그램은 상기 레이저 탈착 이온화원을 제어할 수 있는 것인 분석 장치.
46. 제42항에 있어서, 상기 소프트웨어 프로그램은 상기 탠덤 질량 분광계에 의한 1 이상의 양태의 데이타 획득을 제어할 수 있는 분석 장치.
47. 제42항에 있어서, 상기 소프트웨어 프로그램은 상기 탠덤 질량 분광계에 의해 획득된 데이타에 대해 1 이상의 분석 루틴을 수행할 수 있는 것인 분석 장치.
48. 제42항에 있어서, 상기 소프트웨어 프로그램은 상기 레이저 탈착 이온화원을 제어할 수 있고, 상기 탠덤 질량 분광계에 의한 1 이상의 양태의 데이타 획득을 제어할 수 있으며, 상기 탠덤 질량 분광계에 의해 획득된 데이타에 대해 1 이상의 분석 루틴을 수행할 수 있는 것인 분석 장치.
49. (a) 테스트 단백질 또는 단백질들을 친화성 포착 단백질 바이오칩 상에 포착하는 단계;

    (b) 단백질 분해제를 사용하여 단백질 바이오칩 상에서 테스트 단백질(들)의 단백질 분해 산물을 발생시키는 단계; 및

    (c) (i) 단백질 분해 산물을 단백질 바이오칩으로부터 가스상으로 탈착시켜, 해당 모체 이온 펩티드를 발생시키고,

    (ii) 제1 질량 분광계로의 후속 단편화를 위하여 모체 이온 펩티드를 선택하며,

    (iii) 선택된 모체 이온 펩티드를 가스상 내에서 선택된 단편화 조건 하에 단편화하여 산물 이온 단편을 생성하고,

    (iv) 산물 이온 단편의 질량 스펙트럼을 발생시키는 것

    을 포함하는, 1 이상의 단백질 분해 산물을 탠덤 질량 분광계로 분석하는 단계

    를 포함함으로써, 상기 질량 스펙트럼이 테스트 단백질의 분석을 제공하는 것인 1 이상의 테스트 단백질의 분석 방법.
50. 제49항에 있어서, (d) 데이타베이스에서 단백질의 질량 스펙트럼과 이론적인질량 스펙트럼 사이의 근사 적합치를 기준으로 데이타베이스에서 테스트 단백질에 대해 1 이상의 단백질 동일성 후보를 확인하는 단백질 데이타베이스 마이닝 프로토콜에 질량 스펙트럼을 제시함으로써 1 이상의 단백질 동일성 후보를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 단계 (d)는 테스트 단백질의 질량과 테스트 단백질의 기원 종을 프로토콜에 제시하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
52. 제50항에 있어서, (e) (i) 단계 (b)의 단백질 분해 산물의 질량 스펙트럼을 발생시키고, (ii) 단백질 분해제를 사용함으로써 발생될 것으로 예견되는 동일성 후보의 분해 산물의 이론적인 질량 스펙트럼과 상기 단백질 분리 산물의 질량 스펙트럼 사이의 근사 적합치를 결정하는 컴퓨터 프로토콜에 상기 단백질 분리 산물의 질량 스펙트럼을 제시함으로써 동일성 후보를 테스트 단백질과 비교하는 단계를 더 포함하며, 상기 측정치가 테스트 단백질에 해당하는 단백질 바이오칩 상에서 단백질 분리 산물을 나타내는 것인 방법.
53. 제52항에 있어서, (f) 선택된 모체 이온 펩티드가 동일성 후보로부터 예견된 단백질 분해 산물에 해당하지 않는 경우 단계 (c)를 반복하는 단계; 및

    (g) 단계 (f)의 선택된 모체 이온 펩티드에 대해 단계 (d)를 반복하는 단계

    를 더 포함하는 것인 방법.
54. 제49항에 있어서, 테스트 단백질은 제1 및 제2 생물학적 시료 사이에서 차등 발현된 단백질인 방법.
55. 제54항에 있어서, 제1 및 제2 생물학적 시료는 정상 및 병변원으로부터 유래된 것인 방법.
56. 분석물이 결합된 친화성 포착 프로브를 제1항의 분석 장치의 친화성 포착 프로브 인터페이스 내에 연결하는 단계;

    상기 레이저원을 사용하여 상기 프로브로부터 상기 분석물 또는 이의 단편을 탈착 및 이온화시키는 단계; 및 이어서,

    상기 탈착된 이온에 대한 탠덤 질량 분광계 측정에 의해 상기 분석물을 검출하는 단계

    를 포함하는 분석물의 검출 방법
57. 제56항에 있어서, 상기 탈착 및 이온화 단계 후 및 상기 검출 단계 전에, 상기 탈착된 이온의 충돌 유도 해리를 수행하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 탈착 및 이온화 단계 후 및 상기 탈착된 이온의 충돌 유도 해리를 수행하는 단계 전에, 충돌 분리하고자 하는 이온의 부분을 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 친화성 포착 프로브를 상기 친화성 포착 프로브 인터페이스에 연결하기 전에, 상기 분석물을 상기 프로브에 흡착시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 분석물을 상기 프로브에 흡착시키는 단계 후 및 상기 프로브를 상기 프로브 인터페이스에 연결하기 전에, 상기 프로브 및 상기 분석물을 에너지 흡수 분자와 부착 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
61. 친화성 포착 프로브 홀더;

    친화성 포착 프로브 도입 포트;

    친화성 포착 프로브 위치 설정 액츄에이터 및 어셈블리;

    진공 및 기압 어셈블리; 및

    인터페이스 이온 수집 시스템을 포함하며, 친화성 포착 프로브를 연결하고상기 프로브를 레이저원에 대해 신호 전달 가능한 관계로 및 동시에 탠덤 질량 분광계와 신호를 주고 받을 수 있도록 위치 설정 하기 위한 친화성 포착 프로브 인터페이스로서, 친화성 포착 프로브 홀더가 상기 도입 포트에 의해 연결 가능하고, 상기 프로브 홀더가 상기 포트에서 연결된 경우, 상기 친화성 액츄에이터 및 어셈블리에 접촉하도록 배치되며, 상기 진공 및 기압 어셈블리는 상기 포트에 연결되는 경우 상기 프로브 주위의 압력을 감소시킬 수 있고, 상기 액츄에이터는 상기 이온 수집 시스템에 의한 이온 수집을 위해 상기 프로브 홀더를 위치 설정할 수 있는 친화성 포착 프로브 인터페이스.
62. 제22항에 있어서, 상기 이온 수집 시스템은 정전기 이온 수집 어셈블리, 기압 이온 수집 어셈블리 및, 정전기 이온 가이드 및 RF 이온 가이드로 구성된 군 중에서 선택되는 이온 가이드를 포함하는 것인 분석 장치.
63. 제24항에 있어서, 상기 도입 포트 배출 시스템은 진공 펌프, 압력 센서, 진공에서 사용할 수 있는 배관과 연결 피칭 및 진공에서 사용할 수 있는 밸브를 포함하는 것인 분석 장치.