KR20040001552A

KR20040001552A - 디엔에이 결합 단백질 비에 대한 자가항체에 결합할 수있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 전신성 경화증진단용 조성물, 이를 이용한 상기 자가항체의 검출 방법및 전신성 경화증 진단 방법

Info

Publication number: KR20040001552A
Application number: KR1020020036806A
Authority: KR
Inventors: 송영욱; 정두일; 이성은; 김종완; 임윤; 김대기; 김해영; 이은봉
Original assignee: 주식회사 인투젠; 송영욱
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-01-07

Abstract

본 발명은 디엔에이 결합 단백질 비에 대한 자가항체(이하 항-dpbB 자가항체라 한다)에 결합할 수 있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 전신성 경화증(systemic sclerosis, 이하 'SSc'라 한다) 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은, 피검 대상의 체액 시료에서 dbpB 항원을 이용하여 항-dbpB 자가항체를 면역학적 검사법으로 검출함을 특징으로 한다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은 기존에 비해 SSc의 발병 여부를 높은 민감도로 진단할 수 있게 하며, 다른 자가면역질환과 구별하여 SSc를 특이적으로 진단할 수 있게 한다.

또한 항-dbpB 자가항체에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물은 SSc의 예방 또는 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

디엔에이 결합 단백질 비에 대한 자가항체에 결합할 수 있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 전신성 경화증 진단용 조성물, 이를 이용한 상기 자가항체의 검출 방법 및 전신성 경화증 진단 방법 {Composition comprising of the proteins binding to the autoantibody against to DNA binding protein B, and the detection of the antibody and the diagnosis of systemic sclerosis thereby}

본 발명은 전신성 경화증(systemic sclerosis, 이하 'SSc'라 한다) 진단용 조성물, 이를 이용한 항-dbpB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법에 관한 것이다.

SSc는 활성화된 섬유아세포(fibroblast)가 콜라겐(collagen) 등의 결합조직 구성물질을 과도하게 생성하는데 기인하는 질환이다. SSc는 피부를 비롯하여 혈관,위장관 계통, 폐, 신장 및 근육 관절 등의 결합 조직에 변화를 일으켜 그 기능의 결함을 초래한다.

SSc는 그 발병 부위에 따라, 피부 경화가 팔꿈지 이하의 손, 무릎 이하의 발, 얼굴에서만 발생되는 제한성(limited) 타입과, 이보다 더 많은 부위, 즉 팔꿈치 이상, 무릎 이상의 피부와 몸통에서도 피부가 딱딱해지는 변화가 나타나면서 신장, 폐 등의 내부 장기 침범이 동반되는 미만성(diffuse) 타입으로 크게 분류된다.

제한성 SSc를 보이는 환자는 90% 이상의 5년 생존율을 보이나, 미만성 SSc를 보이는 환자의 예후는 좋지 않아 50∼70% 정도에 그치는 5년 생존율을 나타낸다. 우리나라에서도 SSc가 점차 증가하는 추세를 보이고 있어, SSc에 대한 진단, 예방 및 치료에 대한 필요성이 증대되고 있다.

SSc의 병변은 조직의 섬유증(tissue fibrosis), 세소혈관(細小血管, small blood vessel)의 맥관 장애(vasculopathy), 자가항체에 의한 특이적 자가면역반응 (autoimmune disease) 등의 증상으로 특징될 수 있다.

특히 자가면역반응은 면역 체계의 이상에 의하여 외부의 물질이 아니라 인체 내에 존재하는 물질에 대해 항체를 형성함으로써 여러 가지 면역질환을 일으키는 현상으로, 자가면역에 의한 질환은 SSc를 비롯하여 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome) 및 근염(myositis) 등이 있다.

SSc에 있어서, 제한성 SSc의 경우 중심체 단백질(centromere proteins, CENP A-C)에 대한 자가항체가 발견되며, 미만성 SSc의 경우 토포이성질화효소Ⅰ(topoisomerase I, Scl-70), 피브릴라린(fibrillarin) 및 RNA 중합효소 I, II, III(RNA polymerases I, II, III)에 대한 자가항체가 발견된다. 이러한 자가항체들은 SSc 환자에서만 특징적으로 나타나기 때문에, SSc 진단시 표지인자(marker)로 사용될 수 있다.

그러나 현재까지 개발된 진단 방법들은, 실제 환자에서 표식 인자를 제대로 검출하지 못하는 경우도 많아 민감도 면에서 문제점을 안고 있으며, SSc 이외의 다른 자가면역질환을 지닌 환자, 나아가서는 정상인에서도 어느 정도의 양성 반응이 검출되는 경우가 많아 SSc만을 특이적으로 진단하지 못하는 실정이다.

또한 SSc에 대해 뚜렷한 예방 및 치료 효과를 나타내는 조성물이 알려져 있지 않아, 현재의 SSc 치료는 대표적 병변인 염증과 경피증을 억제할 수 있는 여러 가지 약물을 혼합하여 병의 진행을 다소 막는 수준에 그치고 있다.

따라서, 높은 특이성과 민감도로 SSc를 진단할 수 있는 방법, 그리고 SSc를 진단, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 대한 발명이 요구되어지고 있다.

상기 과제를 달성하기 위해, 본 발명에서는 SSc 환자에서 특이적으로 나타나는 자가항체를 밝히고, 상기 자가항체를 검출할 수 있는 조성물을 이용하여 SSc를 진단하는 방법을 제시하는 한편, SSc를 예방 또는 치료할 수 있는 조성물도 함께 제공하고자 한다.

도 1은 NC 막 상에서 dbpB 단백질과 SSc 환자의 혈청 간의 면역 반응에 대한 대표적인 양상을 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 진단 방법 중 웨스턴 분석법을 수행하여 일반인(a)과 SSc 환자(b)로부터 얻은 혈청 중의 항-dbpB 자가항체 존재 여부를 확인한 도이다.

본 발명은 SSc 진단용 조성물, 이를 이용한 항-dbpB 자가항체의 검출 방법및 SSc 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 디엔에이 결합 단백질 비(DNA binding protein B, 이하 dbpB라 한다)에 대한 자가항체(이하 항-dpbB 자가항체라 한다)에 결합할 수 있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 SSc 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물에서, 항-dbpB 자가항체에 결합할 수 있는 단백질은 dbpB 단백질 및 그 단편 중 항-dbpB 자가항체에 결합할 수 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물의 유효 성분인 dbpB는 미생물에서 발현된 dbpB 또는 생화학적으로 합성된 dbpB 중 어느 것도 가능하며, 미생물에서 발현된 dbpB가 바람직하다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물은 dbpB나 그 단편 대신 이들과 비슷한 기능을 지닌 물질, 유도체 및 그 단편 중 하나 이상의 성분을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 다른 유효 성분도 추가로 함유할 수 있다.

또한 본 발명에서는, 항-dbpB 자가항체에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 SSc 예방 또는 치료용 조성물을 함께 제공한다.

본 발명의 SSc 예방 또는 치료용 조성물에서, 항-dbpB 자가항체에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 단백질은 항-dbpB 자가항체에 대한 항체 또는 그 단편 중 항-dbpB 자가항체에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물은 항-dbpB 자가항체에 대한 항체 또는 그 단편 대신 이들과 비슷한 기능을 지닌 물질, 유도체 및 그 단편 중 하나 이상의 성분을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 다른 유효 성분도 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비교적 무독성이다.

본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 성인의 경우 정맥 투여시 일일 0.5∼50 ㎎을사용하는 것이 바람직하며, 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병행하여 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기 SSc 진단용 조성물을 이용하여 SSc 환자의 항-dbpB 자가항체를 검출하는 방법 및 전신성 경화증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법은 SSc의 발병 여부를 진단하고자 하는 피검 대상의 체액 시료를 대상으로 하여 항-dbpB 자가항체를 면역학적 검사법으로 검출함을 특징으로 한다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법에서, 체액 시료는 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액을 비롯하여 림프액, 세포간액 등 피검 대상으로부터 얻은 체액을 사용할 수 있다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법에서 항-dpbB 자가항체의 검출을 위한 면역학적 검사법은, 혈청 스크리닝법(allogenic sera screening), 웨스턴 분석법(Western analysis), 면역침전법(immnoprecipitation), ELISA 분석법(Enzyme-linked immuno assay), 면역형광법(immunoflourescence) 및 방사성 동위원소 표식법(radioactive isotope labelling)을 포함하여, 기존의 면역학적 검사법은 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법에서는 상기의 방법 중 선택된 하나 이상을사용할 수 있으며, 예를 들어 1차 검사와 확인 검사의 두 단계에 의해 SSc를 진단하고자 할 경우, 1차 검사로 혈청 스크리닝법(allogenic sera screening)을 사용하며, 양성반응과 위양성반응을 구별하기 위한 확인 검사로 웨스턴 분석법(Western analysis)을 사용할 수 있다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법은, 동일한 피검 대상으로부터 얻은 시료에 대해 상기 방법 중 어느 방법들을 사용하든지 각 결과들의 일치도가 높기 때문에, 정확하게 SSc를 진단할 수 있게 한다.

이하 본 발명의 검출 또는 진단 방법에 대해, 혈청 스크리닝법과 웨스턴 분석법을 사용하는 경우를 예로 들어 상세히 설명한다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법 중 혈청 스크리닝법을 사용하는 경우의 방법은 다음과 같다.

dbpB를 발현할 수 있는 미생물로부터, 적절한 막(membrane)으로 단백질들을 전이(transfer)시킨다. 상기 막을 대장균/파아지의 용해액과 반응시켜 블로킹(blocking)한다. 피검 대상으로부터 얻은 혈액을 적절한 비율로 희석하여, 막과 반응시킨 후, 혈액과 막 상의 단백질 간의 면역 반응을 확인할 수 있도록 표지된 이차 항체와 반응시켜, 면역 반응을 확인한다.

상기 방법에서 dbpB를 발현할 수 있는 미생물이란, dbpB 유전자가 삽입된 파아지 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 또는 일반 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 및 곰팡이로 정의된다.

상기 방법에서 단백질을 전이시킬 막은 NC(nitrocellulose), 나일론(nylon), PVDF 막 등 단백질에 대한 부착능을 지닌 막은 모두 사용할 수 있다.

상기 방법에서 단백질들을 막으로 전이시킬 때는, 파아지 발현 벡터로 형질전환된 미생물의 경우, 플라그가 형성된 후에 막을 배지 위에 부착시켰다가 분리시키는 방식으로 단백질을 전이시키며, 일반 발현 벡터로 형질전환된 미생물의 경우, 막을 배지 위에 부착시켰다가 분리한 후 상기 막을 급속 동결시켰다가 해동시켜 세포벽을 파괴함으로써 막 상에 단백질이 노출되도록 준비한다.

상기 방법에서 피검 대상으로부터 얻은 혈액을 막과 반응시킬 때는, 혈액의 점도에 따라 그 희석 비율을 조절하며, 보통 1:200으로 희석하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 방법에서 면역 반응을 확인할 때는, 효소를 이용한 발색 반응법, 형광 발현법, 방사능 측정법 등 기존에 이용되어 온 면역조직화학법은 모두 이용할 수 있으며, 바람직하게는 방법의 신속성 및 간편성을 위해 효소를 이용한 발색 반응을 사용한다.

효소를 이용한 발색 반응법은, 특정 기질로부터 발색 물질을 생성할 수 있는 효소를 부착한 이차항체를 항원-항체 반응체에 결합시킨 후, 효소의 종류에 따라 적절한 기질을 첨가하여 발색 반응 여부를 확인하는 방법이다. 본 발명의 진단 방법에서 사용가능한 효소는 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 페록시다아제(peroxidase), 또는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase) 등 기존의 효소 발색 반응법에 사용된 효소는 모두 사용할 수 있다.

형광 발현법은 형광 물질이 부착된 이차 항체를, 방사능 측정법은 방사성 동위원소로 표지된 이차항체를 항원-항체 반응체에 결합시켜 반응 여부를 확인하는 방법이다.

한편, 본 발명의 검출 또는 진단 방법에서 웨스턴 분석법을 사용하는 방법은 다음과 같다.

융합 단백질을 생성할 수 있도록 제조된 적절한 발현 벡터에 dbpB 유전자를 클로닝하고, 상기 재조합 플라스미드로 대장균을 형질전환시킨다. 대장균으로부터 추출한 단백질에 대해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 적절한 막으로 단백질들을 전이시킨다. 이후 피검 대상의 혈액과 막을 반응시키는 단계는 상기 혈청 스크리닝법과 동일하다.

상기 방법에서, dbpB 유전자의 클로닝에 사용될 발현 벡터로는 GST(glutathione-S-transferase) 또는 베타 갈락토시다아제(β-galactosidase) 등의 유전자를 함유하며, 대장균 내에서 안정하게 발현될 수 있는 벡터를 사용한다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법의 검출 대상인 항-dpbB 자가항체는 일반인의 체액보다 SSc 환자의 체액에서 현저하게 높은 빈도로 검출된다. 항-dpbB 자가항체는 기존의 자가면역질환의 진단 표식 인자로 사용되던 항-토포이성질화효소 I 자가항체, 항-중심체 단백질 자가항체 및 ANA와 별다른 상관관계를 나타내지 않고 독자적으로 검출된다. 또한 항-dbpB 자가항체는 다른 자가면역질환 환자에서와는 달리 SSc 환자의 혈청에서만 특이적으로 검출된다.

이러한 특성으로 인해, 본 발명에서 항-dpbB 자가항체는 SSc의 고유한 진단 표식 인자로서 이용될 수 있다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은 기존에 비해 SSc의 발병 여부를 훨씬 높은 민감도로 진단할 수 있다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은 SSc 이외의 다른 자가면역질환인 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 및 근염 등에 대해서는 양성 반응(positive reaction)을 나타내지 않아, 이들 질환과 구별하여 특이적으로 항-dpbB 자가항체를 검출하고 SSc를 진단할 수 있다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은 SSc의 초기 진단 및 모니터링에 사용되어 SSc에 대한 역학 조사 및 대책 수립이 가능하게 함에 따라, 국민 보건 향상에 기여할 수 있다.

이하 실시예에서 본 발명을 보다 상세히 설명하되, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 국한되는 것은 아니다.

[실시예] 본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 및 SSc 진단

본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 및 SSc 진단을 위해, 실험군으로 서울의대 류마티스 클리닉에 내원한 SSc 환자 37명과, 그 대조군으로 건강한 일반인 41명을 선택하였다.

SSc 환자들의 평균 연령은 47 ±12.3 세이며, 성별은 여성이 86%를 차지했고, 발병기간은 5.2 ±4.7 년이며, 그 중 20명(54%)은 제한성 SSc를, 17명(46%)은 미만성 SSc를 앓고 있었다. 상기 SSc 환자 및 일반인으로부터 혈청을 각각 얻어, SSc의 진단에 사용하였다.

1) 본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출

본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출을 위해, 우선 질환 관련 유전자를 검색하는 방법인 SEREX(Serological analysis of the cDNA expression library)를 수행하여 SSc에 관련된 자가항원을 동정하였다.

SEREX 분석에 사용될 cDNA 발현 라이브러리를 제조하기 위해, Stratagene 사의 cDNA 발현 라이브러리 제조 키트를 이용하여, 사람의 폐암 세포주 NCI H1703, 피부 조직 및 신장 조직으로부터 mRNA를 얻었다. 각 세포주 및 조직으로부터 얻은 mRNA를 5㎍씩 취해 cDNA로 전환한 후, EcoRⅠ 부위를 추가하였다. DNA들을 XhoⅠ으로 절단하여 한 방향을 지니는 cDNA 발현 라이브러리를 제조하였다. 각 라이브러리의 역가(titer)는 2 ×10⁶p.f.u.(plaque forming unit)/㎖이었다. 이 중 5 ×10⁵p.f.u.를 면역반응 검색에 사용하였다.

각 cDNA 발현 라이브러리를 λ-ZAP 발현 벡터에 삽입하여 cDNA 파아지미드(phagemid) 라이브러리를 제조한 후, 이를 이용하여 대장균을 형질전환시켰다. 고체배지 상에서 배양하면서 플라그가 생성되는 것을 관찰하다가, 각 플라그에 존재하는 단백질들을 NC 막으로 전이시켰다. 면역 반응시 배경활성(background activity)을 없애기 위해, 상기 NC 막을 대장균과 파아지의 용해액에 미리 반응시키는 블로킹 과정을 수행하였다.

SSc 환자 5명으로부터 얻은 혈청을 1:200으로 희석한 후, 상기와 같이 처리된 NC 막을 담가 반응시켰다. 이후, 알칼린 포스파타아제가 부착된 항인간 IgG 항체를 1:3,000으로 희석한 용액에 NC 막을 반응시켰다. 혈청 속의 단백질과 반응한 플라그를 검색하기 위해, 0.3㎎/㎖ NBP와 0.15㎎/㎖ BCIP를 사용하여 발색반응을 수행하였다.

SSc 환자의 혈청과 반응하는 것으로 나타난 플라그에 대해서는, 플라그를 분리하여 플라스미드를 추출한 후, 염기서열 분석기(ABI Prism 310 automatic sequencer, Perkin Elmer)를 이용하여 그 염기서열을 분석하였다.

그 결과, SSc 환자의 혈청과 반응하는 클론은 dbpB를 비롯하여 포스포글리세레이트 뮤타아제(phosphoglycerate mutase), U1snRNP 70 KDa(U1 small nuclear ribonucleoprotein) 및 중심체 자가항원 C(centromere autoantigen C)인 것으로 나타났다.

각 클론의 민감도 및 특이도를 결정하기 위해, 상기에서 선택된 SSc 환자 중 18명의 혈청을 임의로 골라, 각 클론과의 반응성을 확인하였다. 이때 어떤 cDNA도 삽입되지 않은 λ-ZAP 발현 벡터를 확인 대상 클론과 1:1의 비율로 혼합한 후, 이들을 이용하여 대장균을 형질전환시켰다. 이후 상기와 같은 방법으로 혈청과 클론 간의 면역 반응을 수행하였으며, 이를 3번 반복하여 각 클론에 대해 양성반응을 나타내는 혈청수 및 전체 혈청수에 대한 비율을 표 1에 나타내었다.

검사대상 자가항체	dbpB	포스포글리세레이트뮤타아제	U1snRNP70 KDa	중심체자가항원 C
양성반응을 나타낸 혈청수(전체 혈청수에 대한 비율)	12명(66.7%)	1명(5.6%)	3명(16.7%)	1명(5.6%)

표 1에 나타난 바와 같이, dbpB가 18명의 SSc 환자 중 12명의 혈청과 면역 반응을 일으켜 66.7%라는 높은 반응 빈도를 나타냈다. NC 막 상에서 dbpB 클론과 SSc 환자의 혈청 간의 면역 반응 양상은 도 1에 나타나 있다.

반면 포스포글리세레이트 뮤타아제, U1snRNP 70 KDa 및 중심체 자가항원 C는 dbpB에 비해 상대적으로 매우 낮은 빈도를 나타냈다.

상기 결과를 통해 SSc 환자의 혈청에서 항-dbpB 자가항체가 특히 높은 빈도로 검출된다는 것을 알 수 있으며, 이와 같은 높은 민감도에 의해 항-dbpB 자가항체는 SSc의 진단 표식 인자로 이용될 수 있다.

한편, dbpB에 대한 자가항체와, 이전부터 자가면역질환의 표식 인자로 이용되어 온 다른 자가항체들 간의 상관 관계를 확인하기 위해, 항-dbpB 자가항체가 검출된 SSc 환자의 혈청 또는 검출되지 않은 SSc 환자의 혈청에 대해, 항-토포이성질화효소 I 자가항체, 항-중심체 단백질 자가항체 및 항-핵 항체(anti-nuclear antibody, 이하 ANA라 한다)의 존재 여부를 각각 확인하였다.

항-토포이성질화효소 I 자가항체는 ELISA 분석법을 수행하여 검출하였으며, 항-중심체 단백질 자가항체와 ANA는 면역형광법에 의해 검출하고, 각 클론에 대해 양성반응을 나타내는 혈청수 및 전체 혈청수에 대한 비율을 표 2에 나타내었다.

검사대상 혈청＼검사대상 자가항체	항-토포이성질화효소 I자가항체	항-중심체 단백질 자가항체	ANA
양성반응을 나타낸혈청수(전체 혈청수에 대한 비율)	항-dbpB 자가항체가검출된 SSc 환자(n=15)	12명 (80%)	1명 (6.7%)	3명 (20%)
양성반응을 나타낸혈청수(전체 혈청수에 대한 비율)	항-dbpB 자가항체가검출되지 않은 SSc 환자(n=22)	12명 (54.5%)	1명 (4.5%)	4명 (18.2%)
합계	24명	2명	7명

표 2에 나타난 바와 같이, SSc 환자의 혈청에서 항-토포이성질화효소 I 자가항체, 항-중심체 단백질 자가항체 및 ANA의 검출 여부는 항-dbpB 자가항체의 검출 여부와 일치하지 않아, 이들 사이에는 별다른 상관 관계가 없음을 알 수 있다.

이러한 결과는 항-dbpB 자가항체가 다른 자가항체와의 연관없이 SSc의 발병에 관여할 것임을 시사한다.

2) 본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 SSc 진단 방법의 자가면역질환에 대한 특이성 평가 1

본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 SSc 진단 방법의 자가면역질환에 대한 특이성을 평가하기 위해, SSc를 비롯하여 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 또는 근염 등 자가면역질환을 지닌 환자들에 대해 본 발명의 진단 방법 중 혈청 스크리닝법을 이용하여 항-dpbB 자가항체의 검출 여부를 각각 확인하였다.

λ-ZAP 발현 벡터에 삽입된 dbpB 유전자로 대장균을 형질전환시키고, 플라그가 생성될 때까지 배양한 후, 각 플라그에 존재하는 단백질들을 NC 막으로 전이시켰다. 상기 NC 막을 대장균과 파아지의 용해액과 반응시켜 블로킹하였다.

각 환자들로부터 얻은 혈청을 1:200으로 희석한 후, 블로킹 과정까지 수행한 NC 막과 반응시켰다. 이후, 알칼린 포스파타아제가 부착된 항인간 IgG 항체를 1:3,000으로 희석한 용액에 NC 막을 반응시켰다. 면역 반응을 검색하기 위해, 0.3㎎/㎖ NBP와 0.15㎎/㎖ BCIP를 사용하여 발색반응을 수행하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

＼검사대상 환자검사대상 혈청	양성반응을 나타낸 혈청수 (전체 혈청수에 대한 비율)
＼검사대상 환자검사대상 혈청	건강대조군	SSc	전신성홍반성루푸스	류마티스관절염	쇼그렌증후군	근염
혈청 스크리닝 결과	1명/68명(1.5%)	12명/18명(66.7%)	5명/50명(10%)	0명/50명(0%)	0명/19명(0%)	0명/37명(0%)

표 3에 나타난 바와 같이, SSc 환자에서는 dbpB와 면역 반응을 일으키는 환자 수가 18명 중 8명으로 66.7%에 달했으나, 그 외의 다른 자가면역질환의 경우, 전신성 홍반성 루푸스 환자에서 10%의 빈도로 dbpB와의 면역 반응을 나타냈을 뿐, 다른 자가면역질환 환자 및 일반인에서는 거의 검출되지 않았다.

따라서 본 발명의 진단 방법을 통해 SSc를 특이적으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

3) 본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 SSc 진단 방법의 자가면역질환에 대한 특이성 평가 2

본 발명의 SSc 진단용 조성물을 이용한 SSc 진단 방법의 자가면역질환에 대한 특이성을 평가하기 위해, SSc를 비롯하여 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 또는 근염 등 자가면역질환을 지닌 환자들에 대해 본 발명의 진단 방법 중 웨스턴 분석법을 이용하여 항-dpbB 자가항체의 검출 여부를 각각 확인하였다.

생체로부터 직접 얻은 사람의 dbpB cDNA를 pGEX4T-2에 클로닝하였다. 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시키고, 대장균으로부터 단백질을 추출한 후, 10% SDS-PAGE를 수행하여 60KDa 크기의 GST 혼합 단백질을 얻었다. 이 단백질을 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry)를 수행하여 동정한 결과, 상기 GST 혼합 단백질은 dbpB임을 확인하였다.

GST-dbpB 혼합 단백질을 200ng씩 취하여 10% SDS-PAGE를 수행한 후, 젤을 4℃, 200㎃, 2시간의 조건 하에서 PVDF 막으로 전이시켰다. 1시간 후 블로킹(blocking)을 수행하고, 상기 실시예에서 사용한 SSc 환자와 일반인의 혈청을 1:200으로 희석한 용액에 1시간 동안 담가 반응시켰다.

반응 후 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS 완충액으로 30분간 막을 세척하고, 알칼린 포스파타아제가 부착된 항인간 IgG 항체를 1:3,000으로 희석한 용액에서 1시간 반응시켰다. 아머샴(Amersham) 사의 ECL 키트를 사용하여 항원-항체 반응을 확인하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

＼검사대상 환자검사대상 혈청	양성반응을 나타낸 혈청수 (전체 혈청수에 대한 비율)
＼검사대상 환자검사대상 혈청	건강대조군	SSc	전신성홍반성루푸스	류마티스관절염	쇼그렌증후군	근염
웨스턴 분석 결과	3명/41명(7.3%)	15명/37명(40.5%)	6명/41명(14.6%)	1명/15명(6.7%)	0명/12명(0%)	1명/17명(5.9%)

표 4에 나타난 바와 같이, SSc 환자로부터 얻은 혈청에서는 GST-dbpB 혼합 단백질과 반응하는 단백질 밴드가 관찰된 반면, 일반인에서는 단백질 밴드가 거의 나타나지 않았다. 상기 결과의 대표적 양상은 도 2에 나타나 있다.

37명의 SSc 환자 중 40.5%인 15명에서 도 2와 같은 단백질 밴드가 관찰되었으며, 특히 상기 실시예 2에서 혈청 스크리닝을 거친 환자 18명 중에서는 44.4%인 8명에서 양성 반응이 나타났다. 이처럼 두 분석 방법 간의 결과 일치도가 56%에 달하기 때문에, 본 발명의 진단 방법은 어느 방법을 사용하든지 그 결과에 신뢰성이 있음을 알 수 있다.

한편 일반인의 경우에는 41명 중 7.3%에 해당하는 3명의 혈청만이 양성 반응을 나타냈다. 카이 스퀘어 테스트(chi-squre test) 결과, 항-dpbB 자가항체는 일반인보다 SSc 환자에서 통계적으로 유의하게 높은 빈도로 존재한다는 것을 알 수 있다(p<0.0005).

다른 자가면역질환의 경우, 전신성 홍반성 루푸스 환자 중 일부에서 항-dbpB 자가항체가 검출되긴 하였으나, 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다(p<0.289).

한편, 그 일부가 제거된 dbpB 단백질 또한 생체로부터 얻어, GST 혼합 단백질을 제조하여 상기와 같은 실험을 수행한 바, 비슷한 결과를 얻을 수 있었다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은 SSc 환자에서 균일하게 나타나는 표식 인자인 항-dbpB 자가항체를 높은 민감도로 검출할 수 있어, 기존에 비해 SSc의 발병 여부를 훨씬 효율적으로 진단할 수 있게 한다.

본 발명의 SSc 진단용 조성물, 그리고 이를 이용한 항-dpbB 자가항체의 검출 방법 및 SSc 진단 방법은 다른 자가면역질환과 구별하여 SSc를 특이적으로 진단할 때 효과적으로 이용될 수 있다.

또한 항-dbpB 자가항체에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물은 SSc의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

디엔에이 결합 단백질 비에 대한 자가항체(항-dpbB 자가항체)에 결합할 수 있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 전신성 경화증 진단용 조성물
제 1항에 있어서, 항-dbpB 자가항체에 결합할 수 있는 단백질은 dbpB임을 특징으로 하는 전신성 경화증 진단용 조성물
제 2항에 있어서, 항-dbpB 자가항체에 결합할 수 있는 단백질은 미생물에서 발현된 dbpB임을 특징으로 하는 전신성 경화증 진단용 조성물
항-dbpB 자가항체에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 단백질을 유효 성분으로 함유하는 전신성 경화증 예방 또는 치료용 조성물
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여, 전신성 경화증 환자의 항-dbpB 자가항체를 검출하는 방법
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여, 전신성 경화증을 진단하는 방법
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 피검 대상의 체액 시료를 대상으로 하여 항-dbpB 자가항체를 면역학적 검사법으로 검출함을 특징으로 하는 방법
제 7항에 있어서, 상기 체액 시료는 피검 대상으로부터 채취하여 분리한 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액, 림프액, 또는 세포간액 중 선택된 하나임을 특징으로 하는 방법
제 8항에 있어서, 면역학적 검사법은 혈청 스크리닝법, 웨스턴 분석법, 면역침전법, ELISA 분석법, 면역형광법 및 방사성 동위원소 표식법 중에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용함을 특징으로 하는 방법
제 9항에 있어서, 혈청 스크리닝법은 dbpB를 발현할 수 있는 미생물로부터 적절한 막으로 단백질들을 전이시키고, 상기 막을 대장균/파아지의 용해액과 반응시켜 블로킹한 후, 피검 대상으로부터 얻은 혈액을 적절한 비율로 희석하여 막과 반응시키고, 혈청과 막 상의 단백질 간의 면역 반응 여부를 표지 수단에 의해 확인함을 특징으로 하는 방법
제 9항에 있어서, 웨스턴 분석법은 융합 단백질을 생성할 수 있도록 제조된 적절한 발현 벡터에 dbpB 유전자를 클로닝하고, 상기 재조합 플라스미드로 대장균을 형질전환시킨 후, 상기 대장균으로부터 추출한 단백질에 대해 SDS-PAGE를 수행하여 적절한 막으로 단백질들을 전이시키고, 상기 막을 대장균/파아지의 용해액과 반응시켜 블로킹한 후, 피검 대상으로부터 얻은 혈액을 적절한 비율로 희석하여 막과 반응시키고, 혈청과 막 상의 단백질 간의 면역 반응 여부를 표지 수단에 의해 확인함을 특징으로 하는 방법