KR20030095154A

KR20030095154A - 식물플랑크톤(미세조류)의 장기 계대 배양액(kepⅱ) 개발

Info

Publication number: KR20030095154A
Application number: KR1020020033076A
Authority: KR
Inventors: 김미경
Original assignee: 김미경
Priority date: 2002-06-10
Filing date: 2002-06-10
Publication date: 2003-12-18

Abstract

본 발명은 축산폐수(돼지 뇨)를 이용하여 호기성 미생물과 미네랄로 발효시킨 액(생물활성수)을 기존의 상용 배양액(f/2)에 3%를 첨가 후, KEPⅡ (KIM ＆ ECOPEACE) 배양액을 개발하여 식물플랑크톤(예:Phaeodactylum tricornutum)을 장기간(1 개월이상) 계대 배양 시에 개체량(biomass)를 최대화하고 세포의 생리생화적 활성을 증대시키는데 그 목적이 있다. KEPⅡ 배양액을 사용 시에 일반 배양액과는 달리 장기간 배양에도 불구하고 새로이 영양원을 재공급하지 않고도 식물플랑크톤이 지속적으로 세포분열 현상이 나타난다. KEPⅡ 배양액에서 자란 식물플랑크톤의 세포는 생리학적인 활성도가 월등히 높고, 생화학적 대사물질(엽록소, 엽황소인 베타-카로틴, 크산토필)도 일반 배양액에서 자란 식물플랑크톤 보다도 최고 약 300%이상 높게 합성이 된다. 이 발명은 오늘날 수질오염의 주원인이 되는 축산폐수를 재활용하여 수질오염을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, KEPⅡ 배양액의 활용으로 항산화제, 생리활성물질과 영양원이 다량 함유된 식물플랑크톤을 대량배양하여 항암제 및 면역강화제와 같은 의약품, 건강보조식품, 화장품, 음료수 및 식품 첨가물, 천연조미료와 사료개발에 응용이 가능하여 산업적 부가가치가 높은 기술이다.

Description

식물플랑크톤(미세조류)의 장기 계대 배양액(KEPⅡ) 개발 {Development of batch culture medium (KEPⅡ) of phytoplanktons (microalgae) for long term)}

유전자 재조합 기술로만 형질이 전환되는 육상 고등식물과 해조류의 특징과는 달리 식물플랑크톤(phytoplankton)은 생장환경과 배양조건 및 배양액의 특성에 따라 생리적, 생화학적인 대사작용이 민감하게 스스로 변화하는 특징을 지니고 있어 육상식물에 비해 환경에 대한 적응력이 뛰어난 미세조류(microalga)이다. 미세조류는 수계(담수, 해수)에 높은 생산력을 지니고 있고, 폐수의 오염원(영양염과 중금속) 제거 생물로 이용될 뿐만 아니라 어류의 사료, 건강 및 대체식품, 식품첨가물, 의약품과 화장품 제조의 원료로 이용되고 있다. 특히 본 발명에 사용된 규조류인Phaeodactylum tricornutum은 전복과 같은 치패의 초기먹이 생물로 이용되는 종으로써 세계 어디에서나 서식하는 보편종이고, 해수에 가장 많이 서식하는 우점종인 부착 저서종이다. 지금까지는 이들의 식물플랑크톤을 대량배양하기 위해 지속적으로 영양원(미네랄과 비타민 등)을 주입하는 연속배양 (continous culture) 방법을 이용하고있다. 이러한 방법은 배양시간이 지남에 따라 배양액 내에 영양원을식물플랑크톤이 섭취함으로 영양원의 고갈현상이 심화되기 때문에 지속적으로 배양액을 투입하여야 하는 번거러움과 연속배양 장치를 지속적으로 유지해야 하는 비용이 많이 들어 경제성이 떨어질 뿐만 아니라 새로이 유입되는 배양액에 대한 적응력을 향상시키기 위해 식물플랑크톤의 생리ㆍ생화학적인 활성이 낮아져 산업적인 응용 효율이 떨어지는 단점이 있다.

상기의 연속배양의 단점을 보완하고 식물플랑크톤의 산업적인 효율성을 증가시키기 위해 KEPⅡ 배양액을 이용함으로 지속적인 영양원을 주입하지 않고도 장기간(최하 1개월 이상) 동안 식물플랑크톤을 대량배양하여 산업적인 부가가치를 최대화하고자 한다. 종래의 상용 배양액(f/2)(Guillard and Ryther 1962)만을 이용했을 때보다 KEPⅡ배양액을 이용함으로 계대배양에서 미네랄의 고갈현상이 없이 지속적으로 식물플랑크톤의 세포분열이 일어나고, 광합성의 광계 Ⅱ의 광합성 효율(대조구: 0.33; KEPⅡ: 0.71)을 나타내는 생리학적인 활성도가 월등히 높고, 세포의 성장주기에 있어 정체기인 세포의 노화가 시작하는 시기가 연장이 된다. 엽록소a,c, 카로티노이드(β-카로틴, 디아디노크산틴, 푸코크산틴, 비오락산틴)의 2차 생화학적 대사물질도 상용 배양액에서 자란 식물플랑크톤 보다 최고 300%이상 높게 합성이 되지만 지질과 지방산은 오히려 상용 배양액에서 자란 식물플랑크톤 보다 낮게 합성되는 것으로 보아 KEPⅡ배앵액에서 배양된 미세조류가 세포의 활성이 높다는 것을 반증해 준다. 이 결과는 식물플랑크톤을 항암제 및 면역강화제화 같은 의약품, 건강보조식품, 화장품, 음료수 첨가물, 천연조미료와 사료로 개발할 수 있는중요 생물자원으로 이용이 가능하여 산업적 부가가치가 높다.

제1도는 대조구 배양액과 KEPⅡ배양액에서 44일간 계대 배양된Phaeodactylum tricornutum의 생장률의 변화 (생장률: 대조구 - 0.14; KEPⅡ - 0.31)

제2도는 대조구 배양액과 KEPⅡ배양액에서 44일간 계대 배양된Phaeodactylum tricornutum의 ATP (아데노신 트리포스페이트: adenosine triphosphate) 농도의 변화

제3도는 대조구 배양액과 KEPⅡ배양액에서 44일간 계대 배양된Phaeodactylum tricornutum의 엽록소의 농도변화

제4도는 대조구 배양액과 KEPⅡ배양액에서 44일간 계대 배양된Phaeodactylum tricornutum의 엽황소 농도 변화. KEPⅡ에서 배양된P. tricornutum의 Xanthophylls의 함량은 무려 263 mg/g dry wt로 농축

제5도는 대조구 배양액과 KEPⅡ배양액에서 44일간 계대 배양된Phaeodactylum tricornutum의 크산토필의 종류와 농도 변화

제6도는 대조구 배양액과 KEPⅡ배양액에서 44일간 계대 배양된Phaeodactylum tricornutum의 지방산의 농도 변화

제7도는 44일간 장기 배양 시에 대조구 배양액(A)에서 자란Phaeodactylum tricornutum의 세포는 엽록소가 파괴되어 색소의 색상이 탈색되었으나 KEPⅡ배양액에서 자란P. tricornutum의 세포는 엽황소의 다량 축적으로 짙은 갈색을 나타낸다.

제1표는 상용 배양액인 f/2배양액의 구성 성분

KEP 배양액의 개발을 위해서 상용 배양액(f/2)(표 1)에 각각 0.05%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 9%의 생물활성수(Bacteria Mineral Water)(히로시 1998)를 첨가하여 동일한 생장 조건(광주기: 14h-명/10h-암; 광도: 2250±20Lux; 온도: 17℃)의 배양실에서 규조류인Phaeodactylum tricornutum을 44일간 배양한 결과, 3%의 생물활성수를 첨가한 배양액, 즉 KEPⅡ배양액에서 성장한P. tricornutum의 세포가 가장 왕성하게 생장이 일어난다(도 1). 생물활성수는 돼지의 뇨를 암석 펠르트(pellet)의 미네랄과 폭기조에 의한 호기성 박테리아로 발효시킨 축산폐수를 재활용한 활성수로 상용 배양액에 3%의 생물활성수를 추가하는 것이 가장 최적 농도였다. 이 KEPⅡ배양액의 효과를 비교하기 위해 상용 배양액인 대조구(Control)를 동시에 이용하여P. tricornutum의 배양을 시도했지만 도 1에서와 같이 KEPⅡ배양액의 생장률(0.31)이 높았는데 이는 대조구 배양액의 생장률(0.14)보다 3배가 높게 나타난다.

KEPⅡ배양액에서 자란P. tricornutum의 세포가 생리적으로나 생화학적으로 활성도가 우세한지를 증명하기 위해 기존의 분석 방법들을 다음과 같이 실시하였다. 광합성 효율을 측정하기 위해 엽록소형광측정기(Phyto-PAM:Walz)를 이용하였고, 생체 에너지를 나타내는 ATP(아데노신 트리포스페이트: adenosine triphosphate)의 농도 측정은 발광계(TD-20/20; Turner Designs, 2000)로 분석하였고, 엽록소의 농도 측정은 기존의 방식(De Louraet al., 1987)을 이용, 카로티노이드는 김과 이(1998)의 방법으로 HPLC기기(SPD-M6A; Simadu)를 이용하여 분석하였다. 지방산 분석은 김 등(Kimet al., 1996)의 방법으로 가스 크로마토그라프 기기(HP 6890 Series)로 분석하였다.

Phyto-PAM에 의한 광효율은 대조구 배양액에서 44일간 자란P. tricornutum은 0.33이었으나 KEPⅡ배양액에서 자란P. tricornutum의 광효율은 0.71이었다.

도 2는 KEPⅡ배양액에서 자란P. tricornutum의 ATP의 농도도 배양 44일 후에 높게 나타난다.

도 3은 배양 44일 후에 KEP배양액에서 성장한P. tricornutum의 엽록소a와c농도가 훨씬 높았다. 특히 배양 44일의 KEP배양액에서 자라는P. tricornutum의 시료는 엽록체 내에 엽황소가 높게 축적되어 대조구 보다 짙은 갈색을 띄었다(도 7).

오늘날 항산화제와 항암제로 연구되는 엽록소와β-카로틴, 디아디노크산틴, 푸코크산틴, 비오락산틴도 KEPⅡ배양액에서 자란P. tricornutum이 가장 높게 나타난다(도 4와 5). 하지만 지질을 구성하는 지방산은 KEPⅡ배양액에서 자란P. tricornutum이 가장 낮은 농도를 나타낸다(도 6).

〈참고문헌〉

De Loura I.C., J.P. Dubacq and J.C. Thomas 1987.Plant Physiol.83: 838--843.

Guillard R.R.L. and J.H. Ryther 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I.Cyclotella nanaHustedt andDetonula confervaceaCleve.Can. J. Microbil.8: 229-239.

Kim M.K., J.P. Dubacq, J.C. Thomas and G. Giraud 1996. Seasonal variations of triacylglycerols and fatty acids inFucus serratus. Phytochemistry43: 49-55.

Kim M.K., and H.W. Lee 1998. Changes of beta-carotene content between fresh and dry thalli inUndaria pinnatifidaandEnteromorpha compressaform Korea.Algae13: 151-155.

Turner Designs (2000) A TD-20/20 luminometer method for ATP measurements.Turner Designs Biotechnologypp.1--4.

나가사키 히로시 1998. 세균이 지구를 구한다 - BMW 기술의 도전. 도서출판 푸른평평화, 216pp.

상기의 KEPⅡ배양액은Phaeodactylum tricornutum뿐만 아니라 모든 식물 플랑크톤에 적용이 가능하고, 배양 시에 생장조건(광량, 광주기, 광질, 온도, 성장호르몬 등)을 다양화하여 상기의 결과에 시너지효과를 가할 수 있는 잇점이 있다. 따라서 KEPⅡ 배양액을 변형한 다양한 KEP series 고안 배양액을 개발하여 미세조류의 세포 활성을 강화할 수 있는 효과를 창출할 수 있다. 또한 상기의 분석물질 외에 KEPⅡ 배양액의 효과를 밝히기 위해 생리활성물질과 면역조절물질 분석(bioassay)하여 항암효과와 건강보조식품, 화장품, 음료수 첨가물, 천연조미료와 사료로 개발할 수 있는 중요 생물자원으로 이용이 가능하다.

Claims

상용 배양액(f/2)에 돼지의 뇨를 발효시킨 액(생물활성수) 3%를 추가하여 KEPⅡ 배양액 개발. 계대배양에 이용 시에 연속 배양처럼 지속적인 배양액을 추가할 필요가 없이 연속배양보다 경제성이 뛰어나고, KEPⅡ배양액에서 생장한 식물플랑크톤(Phaeodactylum tricornutum)은 상용배양액에서 생장한 식물플랑크톤의 세포보다 생리ㆍ생화학적인 효율성이 약 300% 높음. 본 발명에서 개발한 KEPⅡ배양액에서 생장한 식물플랑크톤은 의약품, 건강 보조식품, 화장품, 음료수 및 식품 첨가물, 천연조미료와 사료로 개발 가능.