KR20030092044A - 면역증강성 뮤신 펩티드 - Google Patents
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Abstract
포유류에 투여할 때 면역반응을 증강시키는, 인체 MUC1의 분비된 형태에서 발견되는 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 분리된 펩티드 또는 폴리펩티드, 이 펩티드를 포함하는 조성물, 이 펩티드를 생산하는 숙주세포 및 이용방법이 개시된다. 이 펩티드 또는 폴리펩티드는 담체 단백질과 결합될 수 있고 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 백신 또는 면역원성 조성물의 성분으로서 투여될 수 있다.
Description
MUC1 유전자는 몇 가지 종류의 인간 종양 및 정상적인 상피에서 발현되고, 유방암에서 매우 높은 수치로 발현된다(1). 이 유전자의 주요 생산물은 부피와 질량이 큰 글리코실화된 세포외 영역, 트랜스멤브레인(transmembrane) 영역, 및 72 아미노산 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 포함하는 다형성 타입 1 트랜스멤브레인 분자이다(2). 이 다형성은 주로 세포외 영역에 존재하는 20개 아미노산의 직렬 반복 단위의 수의 다양성으로부터 유래된다. 분비된 MUC1 동형(isoform)(MUC1/sec)(3)도 발견되는데, 이는 인트론 2의 서열을 포함하고, 이 인트론 내부에 있는 정지 코돈에서 미리 종결되고, 따라서 트랜스멤브레인 영역이 없다.
MUC1과 그 단편들과 이들의 유도체는 항암 백신 및 암 치료에 있어서의 이용가능성을 위하여 보편적으로 연구되었다. 미국특허 제 6,344,203호는 MUC1과 유사하고 IB4 렉틴과 안티-Gal.알파(1,3)Gal 항체에 결합하는 암 백신용 펩티드를 개시하고 있다. 이 펩티드는 T 세포의 도움을 자극하기 위하여 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 또는 산화된 KLH와 같은 운반 단백질과 결합한다.
미국특허 제 5,827,666호는 MUC1의 적어도 두 개의 20-아미노산 직렬 반복단위를 포함하여 글리코실화 없이도 고유의 배열을 얻을 수 있는 합성 MUC1 펩티드를 개시하고 있다. 또한, 이 합성 펩티드는 유용한 것으로 나타났는데, 그 중에서도 특히 항원결정기(epitope)에 아미노산 서열도 포함하는 백신에 유용함을 지적하고 있다. 미국특허 제 5,989,552호는 면역치료 용도의 MUC1 폴리펩티드 또는 그 직렬반복단위 및 산화된 만난(mannan)의 결합을 개시하고 있다.
미국특허 제 6,080,725호는 백신내 종양-관련 항원으로서 MUC1과 그 펩티드 단편을 이용할 수 있는 사포닌 동족체 보조제를 개시하고 있다.
예를 들어, 미국특허 출원공개 제 20020009759호, 제 20020012931호, 제 20020022235호, 및 제 20010051351호에 개시된 바와 같이, MUC1은 암세포 결정요소 또는 표지로서도 기술되고 이용하여 왔다.
상기 개시에서 MUC1, 그 단편 및 유사체는 백신이나 면역원성 조성물을 위한 종양-관련 항원 또는, 진단 테스트용 표지로서 이용되거나 간주된다.
본 발명에서는 MUC1의 변형 분비성 동형이 보조제의 성질을 갖고, 따라서 항원의 그것과는 성질이 다른 면역증강성을 지닌다는 점에서 예상치 못한 발견이 이루어졌다.
본 발명은 면역증강성 뮤신 펩티드, 이 펩티드를 함유하는 약학적 조성물, 그리고 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
도 1은 106의 형질감염되지 않은 DA-3 포유류 종양세포, 또는 네오마이신 벡터만으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/neo), 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/TM), 또는 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/sec)의 이식 후 intact BALB/c 마우스의 생존을 나타낸다.
도 2는 형질감염되지 않은 DA-3 포유류 종양세포, 네오마이신 벡터만으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/neo), 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/TM), 또는 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/sec)의in vitro성장 동력학을 나타낸다.
도 3은 106의 형질감염되지 않은 DA-3 포유류 종양세포, 네오마이신 벡터만으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/neo), 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포 (DA-3/TM) 또는 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포 (DA-3/sec)가 이식된 BALB/c (nu+/nu+) 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다.
도 4는 106의 형질감염된 DA-3 포유류 종양세포, 네오마이신 벡터만으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/neo), 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/TM) 또는 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/sec)의 접종 후 누드 BALB/c 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다.
도 5는 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/TM)와 DA-3/sec 세포의 혼합물의 BALB/c 마우스 종양에서의 성장에 대한, 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/sec)에 의한 백신접종의 효과를 나타낸다.
도 6은 네오마이신 벡터만으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/neo)와 분비된 DA-3 sec 세포의 혼합물의 BALB/c 마우스 종양에서의 성장에 대한, 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/sec)에 의한 백신접종의 효과를 나타낸다.
도 7은 RENCA 신장 세포 암종과 DA-3/sec 세포 혼합물의 BALB/c 마우스에서 의 성장에 대한, 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 포유류 종양 세포(DA-3/sec)에 의한 백신접종의 효과를 나타낸다.
도 8은 K7 골육종 세포와 DA-3/sec 포유류 종양 세포 혼합물의 BALB/c 마우스에서의 성장에 대한, 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 포유류 종양 세포(DA-3/sec)에 의한 백신접종의 효과를 나타낸다.
도 9는 인간 트렌스멤브레인 MUC1(MUC1/TM)과 인간 분비된 MUC1(MUC1/sec) isoform의 cDNA 서열 모식도이다.
도 10은 펩티드 백신접종. 네오마이신 벡터만으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/neo) 또는 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/TM)를 갖는 KLH-결합된 유니크 펩티드 혼합물의 성장에 대한, 분비된 인간 MUC1 isoform의 KLH가 결합된 유니크 11 아미노산 펩티드를 이용한 백신접종의 효과를 나타낸다.
도 11은 BALB/c 마우스에서의 RENCA 신장 세포(왼쪽) 또는 C57/BL6 마우스에서의 루이스(Lewis) 폐 암종(오른쪽) 중 어느 하나를 갖는 KLH-결합된 유니크 펩티드 혼합물의 성장에 대한, 분비된 인간 MUC1 isoform의 KLH-결합된 유니크 아미노산 펩티드의 효과를 나타낸다. 도면은 MUC1/sec 펩티드 백신접종의 효능이 종(strain)에 제한되지 않음을 나타낸다.
도 12는 종양 성장에 대한 DA-3/sec 세포를 갖는 소수의 세포(DA-3/TM)를 포함하는 혼합물 투여의 효과를 나타낸다. 도면은 소수의 공격 세포가 백신접종 없이 효과적인 방어를 허용하는 것을 보여준다.
도 13은 DA-3 종양 세포 표적에 대한, DA-3/sec 주입 마우스의 비장세포의세포독성 활성을 나타낸다.
도 14는 DA-3/sec 비장세포의 세포독성에 대한 페르포린(perforin) 저해 코카나마이신 A(concanamycin A)의 효과를 나타낸다. 도면은 페르포린이 활성화된 비장세포에 의해 DA-3/sec 종양 세포의 용해를 중개하는 것을 보여준다.
도 15는 DA-3/sec 표적 및 양성 대조군에 대한, DA-3/sec 활성화된 비장세포의 세포독성에서 anti-Fas 항체의 효과를 나타낸다. 도면은 Fas/FasL이 DA-3/sec 세포동성에서 어떠한 역할도 하지 않음을 보여준다.
도 16은 YAC-1 표적에 대한 클래식 NK 활성에서의in vivoDA-3/sec 노출의 효과를 나타낸다.
도 17은 D1-DMBA-3 종양 소유자의in vitro(왼쪽) 및in vivo(오른쪽) 면역 반응에서 MUC1/sec 펩티드의 효과를 나타낸다. 도면은 MUC1/sec 펩티드가 D1-DMBA-3 종양 소유자의 면역 반응을 자극함을 나타낸다.
도 18은 YAC-1(왼쪽) 및 EL-4(오른쪽) 표적 세포의 용해에서 MUC1/sec 펩티드가 있거나 없는 정상 BALB/c 비장세포의 효과를 나타낸다.
도 19는 DA-3/sec 종양 세포의 용해에서 MUC1/sec 펩티드가 있거나 없는 상이한 마우스 종의 정상 비장세포의 효과를 나타낸다.
아미노산 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 펩티드, 그 유사체 및 유도체는in vivo면역조절 활성을 나타낸다. 이들을 코딩하는 펩티드와 핵산(예를 들면, RNA, DNA)은, 당업계에 공지된 체액성 또는 세포성 기준으로 분석한 바와 같이, 피검체인 동물 또는 인체에서 면역 반응을 자극하거나, 달리는 증강시키기 위한 보조제로 이용될 수 있다. 예를 들어, 항체 생성의 증진, 이들의 가용성 면역 개자(예를 들면, 사이토카인)의 분비, 항원 제시, 효과기 세포 생성 또는 기능(예를 들면, 세포독성), 그 외에 공지된 면역 반응 방법, 또는 그 조합이 효능을 나타내기 위하여 이용될 수 있다. 특히, 펩티드 또는 핵산은in vivo에서 면역 반응을 증진시키고, 하나 또는 그 이상의 세포 소집단의 분열유발인자(mitogen)로서in vivo및/또는in vitro에서 사이토카인 생성을 유도하기 위하여, 또는 세포독성을 증진시키기 위하여 백신 보조제로 이용할 수 있다. 본 발명의 목적의 하나는 면역조절과 증강을 위한 신규의 분자를 제공하는 것이다.
항원-특이 면역 반응을 자극하거나 또는 증진시키기 위하여, 이 펩티드는 항원(예를 들면, 종양 항원, 또는 박테리아, 바이러스, 원생동물, 진균류, 곰팡이 또는 효모와 같은 감염성 병원체에서 유도된 것)을 갖는 백신제제에 도입되거나 당해 항원과 결합될 수 있다. 핵산은 항원 및/또는 항원을 코딩하는 발현 벡터를 갖는 유전성 백신용 제제에 도입되거나; 또는 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 코딩하는 뉴클레오티드 배열, 또는 그것의 유사체 또는 유도체는 항원을 코딩하는 영역과 연결되거나 또는 떨어져 있는 발현 벡터에 포함될 수 있다. 또한 다른 보조제 및/또는 사이토카인과 같은 백신 제제의 성분이 당해 제제를 포함할 수 있다. 그러므로, 이들 조성물은 세포성, 비세포성, 분획되거나 정제된, 재조합, 단백질 베이스의, 또는 "naked DNA" 백신에 결합될 수 있다.
치료 가능한 종양 형태는 육종(sarcomas)과 암종(carcinomas)이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 백혈병, 림프종 또는 뇌암 등과 같은 암은 치료 가능하다. 일반적으로, 항체-베이스의 또는 다른 면역성 치료가 본 발명에 의해 증진될 수 있다.
본 발명은 면역 반응의 증강을 위하여 다른 보조제보다 독성이 적고 효과적인 대체물질을 제공한다. 이는 의학 또는 수의학적 치료 목적의 생물제제를 위한 기준을 만족하는 조건하에서 생산가능하며, 치료 및 예방 용도의 제제와 생체내 적합성이 우수하다.
여기에 사용되는 용어 "펩티드(peptide)", "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 상호혼용가능하며, 각각 천연적으로 존재하는 아미노산의 서열을 의미한다. 일반적으로 "펩티드"는 20개 보다 적은 아미노산 잔기의 서열을 의미하고, "폴리펩티드"는 20개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 서열을 의미하며, 여기에서는, 단백질을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 바람직하게는 11 내지 200개, 더욱 바람직하게는 11 내지 100개, 그보다 바람직하게는 11개 내지 50개, 가장 바람직하게는 11,12,13,14,15,16,17,18,19 또는 20개의 아미노산 잔기를 포함한다.
여기에서 사용되는 용어 "분리된(isolated)"는 그것의 원래 환경(예를 들면, 자연적 환경으로부터 제거된, 천연적으로 존재하는)으로부터 제거된 물질을 말한다. 이러한 물질은 벡터 또는 조성물의 일부가 될 수 있으며, 또는 상기 벡터, 조성물, 또는 세포가 물질의 원래 환경에 존재하지 않는다면, 세포에 포함될 수 있다.
본 발명의 목적의 하나는 아미노산 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)을 포함하는 분리된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 또는 그 유사체 또는 유도체를 제공하는 것이다. 본 발명의 펩티드는 면역증강성을 가지며, 약학적 조성물 및 백신에 이용할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "유사체(analog)"는 동일 또는 유사한 기능적 특성(즉, 면역조절 효과의 생성)을 가지는 서열 변형체를 의도한다. 이러한 변형체는 아미노산 잔기의 단일 또는 복수의 (2-3) 치환, 바람직하게는 보존적 치환기를 가질 수 있어, 이 변형체가 "모체" 화합물의 면역조절 특성을 보유한다.
여기에서 사용된 용어 "유도체(derivative)"는 적어도 하나의 부가그룹의 부가에 의하여 변형되고, 모체 화합물의 면역조절 특성을 보유하는 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 의미한다. 바람직한 실시예에서 유도체는 본 발명의 펩티드의 복수 복제본(multiple copies)이 결합된 KLH 분자를 포함한다. 또한, 유도체는 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질이 부착된 항원일 수 있다. 유도체의 다른 예로는 이 펩티드의 복수 복제본과 결합된 OVA 및 BSA가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한 펩티드는 정제 형태로 이용하여야 한다. 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 화학 합성법 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 숙주 미생물을 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편으로 형질감염할 수 있고, 펩티드를 배양액으로부터 수집할 수 있다. 숙주는, 예를 들어, 박테리아, 효모, 바이러스 벡터, 또는 포유류세포가 될 수 있는데, 이에 의해, 목적 DNA 단편이 숙주 생물의 게놈 내로 통합되거나 또는 숙주 생물 내에서 복제 가능한 적절한 발현 벡터로 삽입된다. DNA 단편은 적절한 전사 및 번역 신호를 포함하는 영역의 제어 하에 있다. 이들 수단에 의한 폴리펩티드 획득방법은 본 분야의 당업자에게 익숙하다.
본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 그 유도체 또는 유사체를 제공하는 것이다. 본 발명의 핵산은 재조합하거나, 합성하여, 또는 본 분야의 당업자가 이용할 수 있는 수단에 의하여 수단에 의하여 생산될 수 있으며, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 클로닝될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "핵산(nucleic acid)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)", 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일사슬 또는 이중 형태의 하나 이상의 뉴클레오티드의 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 혼성(hybrid) 서열을 포함되도록 의도되고, 상호혼용가능하다.
여기에서 사용된, 용어 "상보적(complementary)", "이의 상보체(complement thereof)"는 상보적 영역에 걸쳐 다른 특정 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 Watson & Crick 염기 형성이 가능한 폴리뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 이 용어는 그들의 서열에만 기초한 폴리뉴클레오티드 쌍에 적용되고, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 실제로 결합한 특정 조건을 의미하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 그 유사체 또는유도체를 포함하는 면역원성 약학적 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제 또는 담체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 약학적 조성물은 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 종양 항원을 포함한다. 종양 항원은 예를 들어, 자가이식 종양 세포, 동종이계(allogeneic) 종양 세포, 갱글리오사이드, 발암초기(carcinoembryonic) 항원, 전립선 특이 항원, 흑색종 관련 항원 및 p53뿐 아니라 본 분야의 당업자에게 익숙한 그 외의 종양 항원을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 그 외의 항원에는 유두종바이러스(papillomaviruses), B형 및 C형 간염 바이러스, HIV, 및 HTLV-1로부터 유래된 것과 같은 바이러스 항원, 그리고 박테리아 및M. tuberculosis와 같은 다른 감염성 미생물로부터 유래된 항원이 포함된다.
본 발명은 또한, 백신, 및 면역 반응의 유도 또는 증강 방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 이 백신은 본 발명의 면역조절 펩티드나 폴리펩티드, 또는 그 유사체나 유도체, 항원, 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제 또는 담체를 포함한다. 특히, 바람직한 실시예에서 항원은 종양 항원이다.
백신 제제화는 일반적으로, 당업계에 공지되어 있고, 기술문헌(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA.)에 보편적으로 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 면역원성 약학적 조성물 또는 백신은 BCG, KLH, IL-2, GM-CSF 및 사이톡산(cytoxan)과 같은 부가적 보조제 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있는데, 이들 보조제는 본 발명의 면역조절 펩티드 또는 폴리펩티드와 선택적으로 결합될 수 있다. 하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 면역조절 펩티드는malaimide-활성화된 KLH를 갖는 KLH와 결합한다. 펩티드가 결합하는 보조제에 따라 사용될 수 있는 많은 결합 방식(package)이 당업계에 공지되어 있다. 일반식은 R-HNCO-X 또는 R-HCNO-X로 될 것이며, 여기에서, R은 선택적 보조제이고, X는 펩티드이다.
또한, 본 발명의 목적은, 본 발명의 백신 또는 약학적 조성물의 안전하고 효과적인 용량의 투여에 의한 질병 또는 장애의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다. 본 분야의 당업자는 부당한 실험 없이 본 발명의 약학적 조성물 및 백신의 안전하고 효과적인 용량을 결정할 수 있다. 안전하고 효과 있는 복용량은 당업자에게 수용 불가능한 부작용을 야기하지 않고 대상의 면역 반응에 유리한 효과를 생산하도록 대상에게 투여될 수 있는 양으로 사료된다. 이러한 모든 부작용은 본 발명의 치료, 대체 가능한 치료, 및 당업자에게 익숙한 다른 인자의 이익에 대하여 균형을 이루는 것으로 이해될 것이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 종양, 특히 암 종양의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
정의된 항원을 이용하여 포유류 종양 세포에 대한 면역 반응을 연구하기 위하여, 본 발명자는 BALB/c 마우스 숙주의 전이성 병변 및 사망을 일으키는 포유류 종양 세포주인 DA-3 세포를 트랜스멤브레인 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포(DA-3/TM), 분비형으로(DA-3/sec), 또는 네오마이신 벡터만으로(DA-3/neo) 형질감염시켰다. 누드 BALB/c 마우스에서는 DA-3 세포가 성장하는 한편, MUC1 분비형 형질감염은 DA-3 세포를 intact BALB/c 마우스에서 성장할 수 없도록 만든다. DA-3 세포의 백신접종은 DA-3/TM 또는 DA-3/neo 세포의 접종에 대하여, 그리고 BALB/c 마우스와도 공통 유전자인 두개의 관련 없는 종양에 대한 보호를 야기한다. 분비 MUC1 isoform에 존재하는 유니크 11 아미노산 펩티드는 보호적 효과와 관련되며, 면역증강 분자로서의 역할을 한다.
재료 및 방법
마우스 및 종양.Intact BALB/c는 마이애미 의과대학 실험실에서 형제-자매 교배로 보존하였다. BALB/c nu+/nu+는 Taconic Lab.으로부터 구입하였다. DA-3 종양 세포주는 종양 BALB/c 마우스와 공통 유전자인 D1-DMBA-3 포유류 종양으로부터in vivo로 유도하였다(4). DA-3 세포는 BALB/c 마우스에서 종양을 생성하고 폐에서 전이성 병변을 일으킨다. 이 세포주는 5％ FCS(fatal calf serum), 100U 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 5×10-5M 2-베타-머캡토에탄올(2-BME), 2mM L-글루타민, 1％ 미필수 아미노산, 1％ 필수 아미노산, 및 1％ 피루브산 나트륨(모두 GIBCO BRL, Gaithersburg로부터 입수)을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 성장하고, 일련과정으로 보존된다. 이들 세포는 Limulus amebocyte lysate (Pyrogent® plus; Whittaker M. A. Bioproducts, Inc., Walkersville, MD)를 이용한 통상의 분석에 의해 확인한 바와 같이, 내독성이 없다.
펩티드 단편 및 항체의 제조.H23으로지정된단일클론 항체가 MUC1/TM 및 MUC1/sec 양쪽에 공통인 반복서열을 검출하는데 이용되었다. Malaimide-활성화된 KLH(keyhole limpet hemocyanin)을 갖는 KLH에 결합된 MUC1/sec 특이적 펩티드 VSIGLSFPMLP(서열 1)로 닭을 면역시키는 것에 의해, 항체 1709(Aves Labs, Tigard, OR)를 제조하였다. 면역에는 KLH 분자당 적어도 150 펩티드 분자의 자유 펩티드 농도와 결합이 이용된다. 면역 전에 수집된 난자로부터 전-면역 IgY 항체가 제조되었다.
DA-3 세포의 형질감염.DA-3 마우스 포유류 종양 세포내 네오마이신 플라스미드(pSV2 neo) 선택 표지를 갖는 분비된 형태 MUC1/sec cDNA 또는 MUC1/TM 중 어느 하나를 포함하는 발현 플라스미드를 상호 형질감염시킴으로써, MUC1 isoform을 발현하는 안정한 형질감염물을 생성하였다. 대조군으로서, 비어 있는 플라스미드로 세포를 형질감염시키고 네오마이신 내성을 선택하였다.
in vivo 종양 성장.모체의 DA-3 세포, 네오마이신 대조군 및 MUC1 isoform으로 형질감염된 세포를 세척하고, 수를 세고, 세포 106개를 공통유전의 intact 또는 누드 (nu+/nu+) BALB/c 마우스에 피하주사(s.c)하였다. 2-3일마다 종양의 성장을 모니터링하고, 캘리퍼스로 측정하여 10mm보다 큰 종양을 가진 마우스를 종양 양성으로 기록하였다.
백신접종 프로토콜.생리학적 식염수내 106DA-3/sec 종양 세포로 BALB/c마우스를 2주 간격으로 2-3회 백신접종하였다. 마지막 백신접종 2주 후, 동물은 네오마이신 벡터만으로 또는 MUC1 트랜스멤브레인 isoform으로 형질감염되거나 형질감염되지 않은 DA-3 세포로 면역반응을 일으켰다. 몇몇 실험에서 면역반응에 이용된 종양은 신장 세포 암종, RENCA, 또는 골육종 K7 세포였다. 106개의 종양 세포는 106DA-3/sec 세포와 혼합된 각각의 면역반응에 이용하였다.
다른 연구에서, 분비된 MUC1 isoform에 존재하는 유니크 11 아미노산 펩티드는 Aves Labs, Inc.(Tigard, OR)에서 합성되어, KLH에 결합되었다. KLH에 대한 펩티드의 정확한 비율은 각각의 합성에서 다양하다; 각각의 투여에서 동일한 양의 펩티드를 전달아도록 제제를 표준화하였다. 백신으로서 KLH 펩티드를 2주 간격으로 사용하였다. 최초 백신접종를 위해 완전 프로이드의 보조제와 함께 펩티드 50㎍을 BALB/c 마우스에 투여하였다. 2주 후 불완전 프로이드와 함께 펩티드 25㎍을 투여하였다. 2주 후 보조제 없이 펩티드 25㎍이 혼합된 106DA-3/sec 또는 DA-3/neo 세포로 마우스에 면역반응을 일으켰다.
모든 연구에서 대조군 역할을 하도록 백신접종하지 않은 마우스에서 실험용 그룹과 동일한 종양 면역반응을 일으켰다. 2-3일 마다 종양 성장을 모니터링하고, 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다.
실시예 1
재료 및 방법에서 기술한 바와 같이, 인간 MUC1의 트랜스멤브레인 및 분비된 isoform 중 어느 하나로 DA-3 포유류 종양 세포를 형질감염시켰다. 이 서열에 특이적인 H23항체를 이용하여 MUC1 직렬 반복단위의 존재를 위한 세포 착색에 의해 형질감염의 성공을 입증하였다(5). 결과로서 얻어진 세포주를 BALB/c 마우스에서 종양 발생의 빈도 및 시기를 결정하기 위하여in vivo실험에 이용하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 마우스에 DA-3, DA-3/neo, 및 DA-3/TM 포유류 종양 세포의 이식은, 7일까지 거의 동일한 크기의 촉진 가능한 종양을 발생시켰고, 15일까지는 실질적으로 모든 동물이 상당한 크기의 종양을 갖게 되었다. 다음 표 1은 BALB/c 마우스에서 종양 발생 빈도 및 시기를 나타낸다.
| 종양 종류 | 종양 발생 인자 | ||||
| 7 | 15 | 25 | 37 | 12개월 후 | |
| DA-3 | 32/38 | 38/38 | |||
| DA-3/neo | 17/25 | 24/25 | 25/25 | ||
| DA-3/TM | 29/36 | 33/36 | 35/36 | 36/36 | |
| DA-3/sec | 0/70 | 0/70 | 1/70 | 1/70 | 1/70 |
놀랍게도, MUC1 분비된 형태(DA-3/sec)로 형질감염된 DA-3 세포는 종양 발생을 야기하지 못하였다. 특히, 도 1에 나타난 바와 같이, DA-3 세포의 다른 세 가지 종류를 가진 동물이 100일 경과 후 생존하지 못한 반면, 이들 동물은 이식 후 12개월이 지나도 종양이 없는 상태로 남아있었다. 접종당 1×107세포 농도까지 DA-3/sec 종양 세포를 이식한 마우스에서 종양 성장이 관찰되지 않은 것에 주목하여야 한다.
실시예 2
이들 결과에 대한 명백한 설명으로는, 형질감염 과정이 DA-3/sec 세포의 성장 잠재력을 선택적으로 손상시켰다는 것이 가능하다. 이 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자는 DA-3 종양 세포 4가지 종류의in vitro성장 특성을 조사하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 모체 세포주와 모든 다양한 형질감염물은in vitro에서 유사한 동력학을 가지고 성장하였다. 사실상, DA-3/sec 세포는 다른 세포주보다 더욱 증식을 잘하는 듯이 보였는데, 이는 이들 세포의in vitro성장 잠재력이 형질감염 조작에 의해 변형되지 않았음을 나타낸다.
실시예 3
DA-3/sec 세포가in vivo모든 종양 발생 잠재력을 잃었는지 여부를 결정하기 위하여, nu+/nu+BALB/c 마우스에 모든 4개 DA-3 세포주를 이식하고 다양한 시기에 종양 발생 빈도와 종양 크기를 측정하였다. 도 3은 DA-3, DA-3/neo 및, DA-3/TM 세포가 BALB/c 누드 마우스에 이식 후 7일까지 촉진 가능한 종양을 발생시켰고, 이들이 intact BALB/c 동물의 그것과 유사한 방식으로 성장하는 것을 나타낸다. 표 1 및 도 1의 결과와는 반대로, DA-3/sec 종양 세포는 14일까지 모든 누드 마우스의 30％에서 종양을 발생시켰고, 25일까지는 이들 모든 동물이 종양을 갖게 되었다. 따라서, DA-3/sec 세포를 이식한 intact BALB/c 마우스에서 종양 성장의 결여는, 면역적으로 제어되는 듯이 보이는데, 이는 누드 마우스내 이 종양 이식이 비록 발생 시기가 늦지만, 100％ 종양 발생을 야기하기 때문이다. MUC1의 분비된 형태를 포함하는 발현 플라스미드에 의해 형질감염시킨 두개의 다른 DA-3 종양 세포를 이용하여 이 결과를 반복하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, MUC1-sec 유전자로 형질감염된 세 가지 개별 DA-3 세포 중 어느 것도 intact BALB/c 마우스에서 성장할 수없었다. 표 2는 BALB/c 마우스내 상이한 DA-3/sec 형질감염물의 종양 발생률을 나타낸다.
| 형질감염물 | 발생률 |
| DA-3/neo | 6/6 |
| DA-3/TM | 6/6 |
| DA-3/sec | 0/6 |
| DA-3/sec 11 | 0/14 |
| DA-3/sec 22 | 0/11 |
도 4는 면역결핍 마우스에서의 성장 동력학이 다소 상이함에도 불구하고, 3개의 개별 DA-3/sec 세포 형질감염물, 즉, DA-3/sec, DA-3/sec 11, DA-3/sec 22 모두가 BALB/c 누드 마우스에서in vivo성장할 수 있었음을 나타낸다. 흥미롭게도, 누드 BALB/c 동물에서 성장한 DA-3/sec 종양은 면역적으로 intact 누드 BALB/c 동물에 이식될 때는 성장하지 못했지만, 다른 누드 BALB/c 동물로 접종될 때는 성장한다.(데이터 제시안함).
이들 실험결과는 T 세포, 및 다른 종류의 T 세포 효과기(effector)가 낮은 정도로, MUC1의 분비된 형태로 형질감염된 종양 성장 제어에 관련됨을 암시한다.
실시예 4
본 발명자는 BALB/c 마우스내 DA-3/sec 세포 이식이 다른 MUC1 발현 종양 세포에 대한 보호를 부여할 수 있는가의 여부를 평가하였다. 또한, 뮤신을 발현하지않는 DA-3 세포(DA-3/neo)가 이 연구에 포함되었다. 실험군은 1×106DA-3/TM 세포 단독 또는 DA-3/neo 세포 단독 또는 DA-3/sec와 혼합한 것으로 면역반응을 일으키기 전, 1×106DA-3/sec 세포를 1주 간격을 두어 2회 또는 3회 주사를 받았다. 대조군으로서, 백신접종하지 않은 동물을 DA-3/neo 또는 DA-3/sec 세포 중의 어느 하나로 면역반응을 일으켰다. DA-3 sec (106세포)가 혼합되지 않은 주사액을 2회 주입한 동물은 DA-3/TM 세포만으로 면역반응시킬 때 종양 발생에서 단지 짧은 지연만을 야기하였는데, 즉, 대조군에서 1주에 13/14 마리에 비하여, 2주에 13/22 마리에서 종양이 나타났다. 면역반응 전에 106DA-3/sec 세포를 3회 주입한 마우스는 뜻밖에도 백신접종하지 않은 대조군과 비교하여, DA-3/TM 세포뿐만이 아니라 DA-3/neo 세포의 성장도 지연되었다. 놀랍게도, 면역반응에 사용된 DA-3/TM 종양 세포를 이식 당시에 DA-3/sec 세포와 혼합할 때(도 5), 대조군에 비하여 종양 발생 시기가 지연될 뿐 아니라, 백신접종한 마우스의 50％에서 DA-3/TM 종양 세포의 성장 결여를 일으키는 실질적인 보호가 존재하였다. 게다가, 이 예방은 MUC1 분자의 인식에 기인하여 발생한 것이 아니었는데, DA-3/sec 세포로 백신접종되고 DA-3/neo 세포와 DA-3/sec 포유류 종양 세포의 혼합물로 면역반응을 일으킨 동물에서 유사한 효과가 나타났기 때문이다.
실시예 5
DA-3/sec 세포로 백신접종하는 것이 DA-3 포유류 종양 배경에서와는 달리 종양의 성장에 대한 보호를 부여할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 추가로 연구를 수행하였다. BALB/c 마우스에 공통 유전성인 두개의 비관련 종양, 즉, 신장 세포 암종 세포주인 RENCA, 및 골육종인 K7 세포주를 이용하였다. 도 7은 백신접종하지 않은 대조군에 비하여 DA-3/sec 세포를 2회 백신접종하고 RENCA 세포와 DA-3/sec세포의 혼합물에 의한 면역반응을 일으킨 BALB/c 마우스에서 종양 성장의 실질적인 감소를 야기함을 보여준다. DA-3/TM과 DA-3/neo 세포의 실험의 경우와 마찬가지로, 면역반응 시기에 K7 세포의 첨가가 필요한데, 이는 비혼합된 RENCA 세포 성장이 손상되지 않았기 때문이다. K7 골육종 세포를 이용한 실험에서도 유사한 결과를 얻었다. 도 8에 나타난 바와 같이, K7과 DA-3/sec 세포의 혼합물을 이식한 백신접종하지 않은 마우스의 80％는 면역반응 후 21일까지 종양을 나타내었다. 그러나, 106DA-3/sec 포유류 종양 세포로 2회 백신접종된 마우스에서는 면역반응 후 40일까지 종양 발생의 지연과 종양 성장에 대한 보호가 있었다. 실제로, 백신접종된 마우스 50％ 미만에서는 면역반응 후 70일에 종양이 발생되었다.
실시예 6
MUC1의 미지 형태가 보호를 가능하게 하는 원인에 대한 가능한 단서가 MUC1 트랜스멤브레인과 분비된 isoforms의 구조 분석으로부터 얻어졌다. MUC1/TM 및 MUC1/sec isoform유래의 cDNA의 모식도를 도 9에 나타낸다. cDNA는 본 도면 왼쪽에 있는 5' 말단으로부터 나타난다. 직렬 반복단위 배열은 막대 줄무늬 영역으로 나타내고, 시그널 펩티드 코딩 영역, 트랜스멤브레인 영역, 사이토플라스미드 영역은 각각 SP, TM, 및 CYT으로 나타내고, 두 형태에 동일한 음영을 갖는다. MUC1/sec isoform 말단부의 아미노산 서열은 VSIGLSFPMLP이다(3). 중요하게는, 이 11 아미노산은 높은 stringency에서의 BLASTP 1.4.11 (6) 분석에서, 공지된 어떤 단백질 서열과도 동일하지 않으면서 인간 Ly 49E 리간드와 대략 50％ 동일성을 나타내었다.낮은 stringency에서는Mycobacterium leprae의 가상 단백질 MLCB4.30과, 그리고 두 식물종의 EF hand 단백질과 두Echinococcus종유래의 글루타치온 S-전이효소는 다소의 유사함이 있었다. 이 펩티드는 그의 친수성에 의해 항원성이 높은 듯하다. 분비된 MUC1 isoform으로 형질감염된 DA-3 세포에서 이 펩티드의 존재를 확인하기 위하여, KLH에 결합된 유니크 11 아미노산 펩티드에 대한 닭 IgY 항체를 준비하였다. 이 시약을 이용한 직접 ELISA가 DA-3/sec 배양물의 상등액에서 펩티드를 검출하기 위해 개발되었다. 간단히 말하면, 단백질 0.2-10.0㎍/㎖을 포함하는 코팅 완충액 50㎖ 또는 무혈청 배양물에서 얻은 조직 배양 상등액을 4℃에서 밤새 플레이트에 코팅하였다. 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 완충액을 첨가하고, 플레이트를 3회 세척하고, 1시간 또는 밤새 1차 항체를 배양하고; 3회 세척하고; 필요에 따라 1시간 동안, 2차 항체를 첨가하고; 3회 세척하고; visualization 용액을 첨가하고; 배양하고 판독하였다. 모든 분석에서 공지된 농도로 정제한 펩티드의 양성 대조군을 이용하였다. 모든 실험된 배양물은 이 분자에 대해 양성이 나타났다. (데이타는 나타내지 않음)
실시예 7
이 펩티드를 이용한 백신접종 가능한 유리한 효과를 평가하기 위하여 실험을 수행하였다(도 10). DA-3/TM 또는 DA-3/neo 세포 (106세포) 주사를 맞은 대조군 마우스는 보조제만의 존재 또는 부재에 따라 100％ 종양 성장을 일으켰다. 8일 간격으로, 보조제 존재에서 KLH-결합된 유니크 펩티드를 실험용 마우스에 2회 주사하였다. 2차 주입 8일 후 동물은 KLH-결합한 유니크 펩티드와 종양 세포의 혼합물에 의해 면역반응을 야기시켰다. DA-3/TM 세포가 혼합된 펩티드로 인한 면역반응은 12마리 중 단지 7마리에서 종양 성장을 야기하고, 4주에 한 동물에서 추가로 종양을 성장시켰다. KLH 결합된 펩티드와 DA-3/neo 세포의 혼합물로 백신접종된 마우스의 면역반응은 보다 큰 보호를 가능하게 하고, 동물의 40％에서만 종양을 성장시켰으며, 1달 경과된 후 종양 성장을 나타내는 마우스가 하나 추가되었다. 중요하게는, 생존 동물에서 DA-3/TM 또는 DA-3/neo 세포 중 어느 하나에 의한 원래의 면역반응 후 6개월에도 종양의 징후가 나타나지 않았다.
실시예 8
또 다른 연구에서도, 두 개의 다른 종양에서 펩티드 백신접종의 효과가 평가되었다. 도 11의 좌측 도면에서는 BALB/c 마우스에 RENCA 세포를 이식하였을 때, 이 프로토콜이 약간의 보호와 종양 발생의 지연을 나타냄을 볼 수 있다. 다른 마우스 종(C57/BL6 마우스)에서 백신접종 프로토콜로서 KLH 결합 면역증강성 펩티드가 사용되고, 매우 활동적인 루이스 폐 암종으로 면역반응을 일으켰을 때, 도 11의 우측 도면에 나타난 바와 같이, 보호 효과 또한 관찰되었다.
실시예 9
DA-3/sec 세포가 혼합된 보다 적은 수의 면역반응 세포가 종양 세포에 대한 보호를 제공하기 위해 후자에 사전 노출될 필요가 없을 것인가의 여부를 결정하기 위하여, 5×105DA-3/TM 세포를 동일한 양의 DA-3/sec 세포와 혼합하여 마우스에게투여하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 이 치료는 어떠한 사전 백신접종 없이 종양 성장에 대한 60％ 보호를 제공하였다.
실시예 10
효과기 세포가 DA-3/sec 종양 세포 성장에 대한 보호에 관련되는지를 결정하기 위하여, 이 세포를 입수하기 2주 전에 DA-3/sec 종양 세포의 접종을 받은 마우스의 비장세포를 사용하여51Cr 표지된 세포에 대한 세포독성 실험을 수행하였다. 10×106비장세포는 2×105∼2×106미토마이신-C(MMC) 처리한 DA-3/sec 세포의 존재 하에 5일 동안 배양하였다. DA-3/sec로 자극된 비장세포는 DA-3/sec 세포에 대한 강한 세포용해 활성을 나타내었다(도13). DA-3/sec로 자극된 비장세포에서는 DA-3/TM, DA-3/neo 및 DA-3 표적에 대하여 낮은 정도의 세포독성을 갖는다. 이들 결과는 DA-3/sec의 자극에 따라in vitro임파구의 군집이 팽창되어 DA-3/sec 표적에 대한 강력한 효과기 기능을 갖는 것을 암시한다.
실시예 11
면역계 세포는 사멸(killing)의 복합적 메카니즘을 갖는데, 여기에는 Fas-Fas 리간드 상호작용(7)과 페르포린-granzyme 매개의 사멸이 포함된다. DA-3/sec로 자극한 비장세포를 페르포린 매개의 사멸을 차단하는 H+ATPase의 차단을 통한 액포 산성화의 저해제인 콘카나마이신 A(CMA) 또는 항-Fas 항체로 처리하였다(9). CMA는 용량-의존적 방식으로 DA-3/sec 표적의 사멸을 효과적으로 차단하는 한편(도 14), 항-Fas 항체의 첨가로 인해서는 어떠한 세포독성에 대한 효과도 관찰되지 않았다
(도15). 이들 결과는 Fas/FasL이 DA-3/sec 세포의 세포독성에서 어떤 역할을 하지 만, 페르포린-granzyme 경로를 통하여 전달된다는 것을 나타낸다.
실시예 12
DA-3/sec 세포에 대한in vivo노출이 YAC-1 표적 세포(전형적인 쥐 NK-표적 세포)(10)에 대하여 보다 높은 NK 활성을 야기하는지 여부를 결정하기 위하여, DA-3/sec 세포에 3일 내지 10일in vivo노출한 비장세포와 비교하여 정상 비장세포에서 세포 용해를 유도하는 능력과 관련된 실험을 수행하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, DA-3 /sec 세포 분석 3일 전에 주사를 맞은 BALB/c 마우스의 비장세포에서는 정상 마우스의 비장세포에 비하여 YAC-1 세포에 대한 용해활성이 다소 높게 나타났다. 이러한 증가된 NK 반응성은 시험 10일 전 DA-3/sec 세포로 접종된 마우스에서 더욱 현저하다.
실시예 13
본 발명자 실험실의 다른 예비 연구에서, 트랜스멤브레인 형태가 아닌 인간 MUC1 분비된 형태로 형질감염된 DA-3 세포가in vivo및in vitro에서 DA-3/sec 세포에 대해 반응하도록 효과기 세포를 자극한다는 것이고 제안되고, 상기 언급한 바와 같이, MUC1/sec 단백질의 C-말단기에 존재하지만 MUC1/TM 단백질에는 존재하지 않는 유니크 11 아미노산 펩티드가 있다. 이 펩티드("면역증강성 펩티드" 또는 IEP로 칭하는)에 대응하여 합성 펩티드가 만들어지는데, 이것은 백신접종 프로토콜에서 이용될 때, DA3, DA3/neo, DA3-TM, K7 골육종, RENCA, 및 루이스 폐 암종에 대한 세포 보호 효과를 갖는 것이 밝혀졌다. 본 발명자는 세포독성 반응에서 펩티드의 가능한 효과를 조사하였다. 본 발명자는 다른 종양 모델, 즉, D1-DMBA-3 포유류 종양을 갖는 마우스에서도 이를 시험하였다. DA-3 세포주는 본래 이 종양으로부터 유래되는데, 이는 공통 유전의 BALB/c 마우스에서 본 실험실에서 일상적으로in vivo운반된다. 도 17에서는 정상 또는 D1-DMBA-3 종양 중 어느 하나를 갖는 마우스로부터의 비장세포에 MUC1/sec 유니크 펩티드를 5일 동안in vitro첨가하면, DA-3/sec 종양 표적에 대하여 유의적인 정도의 세포독성을 야기하는 것을 볼 수 있다. 상기 기술한 바와 유사한 백신접종 프로토콜은 D1-DMBA-3 종양의 성장에 대한 유의적인 보호를 제공하였다. NK 세포 분석에서는 면역 세포를 자극하는 당해 펩티드의 능력을 시험하였다. 선천성 면역 성분이 DA-3/sec 세포에 대한 직접 반응과 관련될 수 있음을 암시하는, 누드 마우스에서 성장 초기 단계 중에 DA-3/sec 종양이 억제된 관찰을 근거로 하여 당해 분석을 선택하였다. 따라서, 면역증강성 펩티드(IEP)의 면역조절활성을 시험하기 위하여, BALB/c 비장세포는 IEP 10㎍로 30-45분동안 전처리하고 이어서, 상기 기술한 바와 같이, 4-시간 분석 중에 크롬-표지된 YAC-1 또는 EL-4 표적을 첨가하였다(11). 도 18에 나타난 바와 같이, 펩티드 첨가는 전형적인 쥐 NK-표적 세포, YAC-1에 대항한 정상 비장세포의 세포독성 증가를 야기하였다. 게다가, 정상 비장세포에 의한 세포독성의 NK-형에 반응하지 않는 EL-4 표적 세포는 면역증강성 펩티드에 사전 노출될 때, 이들 효과기에 의해 쉽게 용해 가능하였다. 다른 실험에서 본 발명자는 MUC1/sec 유니크 펩티드에 대한 사전 노출에 의해 DA-3/sec 표적 세포를 사멸시키기 위하여, 정상 BALB/c 또는 C57 BL/6 (B6) 마우스의 비장 효과기 세포를 활성화할 수 있다(도 19).
실시예 14
관찰된 세포독성이 종양 세포상에서 유니크 11 아미노산 펩티드의 직접적인 독성 효과에 기인한다는 주장이 있다. 이 가능성을 시험하기 위하여 본 발명자는 몇몇 종양 표적에 IEP를in vitro첨가하고, 배양액에서 4일 후 세포의 생존능력을 결정하였다. 표 3에 나타난 바와 같이,in vivo또는 효과기 세포 매개의 세포독성 분석에서 노출된 세포보다 훨씬 고농도의 펩티드로 치료하는 것은 종양 세포에 대한 성장 저해 또는 세포살해 활성을 야기하지 않았다. 표 3은in vitro종양 성장에 대한 Sec 펩티드의 효과를 나타낸다.
| 종양 세포주 | 배지만 존재 | +KLh-Sec 펩티드1 |
| DA-3 | 3.7×106cell2 | 3.5×106cell |
| DA-3/neo | 3.9×106cell | 4.0×106cell |
| DA-3/TM | 3.1×106cell | 3.0×106cell |
| DA-3/sec | 2.9×106cell | 3.1×106cell |
150 ㎍/well
2배양 4일 후 총세포수
결론
여기에서 개시된 데이타는 신규의 분비된 MUC1 유전자(MUC1/sec)의 형질감염이 BALC/c 마우스에서 왕성한 면역원성 종양 세포주의 성장을 저해시킨다는 것을 나타낸다. 백신접종 프로토콜에 사용될 때, 이는 비특이적 방식으로 공통 유전성 종양에 대한 보호를 부여할 수 있다. MUC1/sec 분자에 존재하는 유니크 11 아미노산 펩티드가 보호 효과와 관련되며, 백신접종 프로토콜에 사용될 때 다양한 종양 세포주에 대하여 효과적으로 작용할 수 있다. 또한, 본 데이타는 선천 및/또는 적응성 면역 시스템의 효과기 세포에 의한 세포독성이 관찰된 결과와 관련됨을 제시한다. 이 펩티드의 효과는 주어진 종류의 종양 또는 마우스 종(strain)에 제한되지 않으므로, 다양한 종양에 대하여 단독으로 및/또는 다른 면역조절 분자와 조합하여 사용하는 것이 가능하다. 이 펩티드를 주사한 동물에서 세포독성은 검출되지 않았다. 이 IEP의 광범위한 작용 스펙트럼은 종양 뿐 아니라, HIV, 간염 B형 및 C형, 및 다른 미생물 감염(예를 들면, 결핵)과 같은 바이러스 또는 세균성 질병에 대하여 본 약제의 이용이 가능하도록 허용하는데, 면역 반응의 증강은 노출된 개체에서 긍정적인 효과를 줄 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예의 기술에서, 명료성을 위하여 특정 용어를 이용하였다. 그러나, 본 발명은 이와 같이 선택된 특정 용어로 제한되지 않는다. 각각의 특정 요소는 유사 목적을 달성하기 위하여 유사한 방법으로 작용하는 모든 기술적 등가율을 포함하는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에서 예시되고 논의된 실시예는 본 발명을 제조하고 이용하기 위해, 발명자에게 알려진 최선의 방법을 당업자에게 교시하기 위해서만 의도된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안될 것이다. 본 발명에서 예시된 실시예는 상기 교시에 비추어 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 발명으로부터 벗어나는 일이 없이 수정 또는 변경이 가능하고, 요소들의 첨가 또는 생략이 가능하다. 따라서, 청구의 범위 및 이의 균등물의 범위 내에서 특히 기술된 것과는 달리 본 발명이 실시될 수 있음이 이해된다.
여기서 인용한 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 다른 공개된 참고문헌은 여기에 참고로 도입된다. 참고문헌은 편의상 다음에 열거된다.
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포유류에 투여할 때 면역반응을 증강시키는, 인체 MUC1의 분비된 형태에서 발견되는 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 분리된 펩티드 또는 폴리펩티드, 이 펩티드를 포함하는 조성물, 이 펩티드를 생산하는 숙주세포 및 이용방법이 개시된다. 이 펩티드 또는 폴리펩티드는 담체 단백질과 결합될 수 있고 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 백신 또는 면역원성 조성물의 성분으로서 투여될 수 있다.
Claims (20)
- 포유류에 투여시 항체에 대한 면역반응을 증강시키는 특성을 나타내는, 아미노산 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 분리된(isolated) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체.
- 제 1항에 있어서, 11 내지 200개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 11 내지 20개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 단백질 담체와 결합된 아미노산 서열 VSIGLSFPMLP(서열 1)를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 카피를 적어도 하나 포함하는 유도체.
- 제 4항에 있어서, 담체가 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)인 유도체.
- 제 1항의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 여기에 상보적인 서열을 갖는 핵산.
- 제 1항의 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이 유도체 또는 유사체, 및 약학적으로 수용 가능한 첨가제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 제 8항에 있어서, 추가로 항원을 포함하는 약학적 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인 약학적 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 항원이 전립선 특이 항원, 흑색종 관련 항원 및 p53을 포함하는 그룹으로부터 선택된 약학적 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 펩티드가 VSIGLSFPMLP(서열 1)인 약학적 조성물.
- 제 7항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제 7항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제 14항에 있어서, MUC1/sec를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제 15항에 있어서, DA-3 세포인 숙주 세포.
- 제 1항의 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체, 항원, 및 약학적으로 수용 가능한 첨가제 또는 담체를 포함하는 백신.
- 제 8항 또는 제 9항의 약학적 조성물의 안전하고 유효한 양을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 암을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제 8항 또는 제 9항의 약학적 조성물의 안전하고 유효한 양을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 항원에 대한 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 항원이 포유류에게도 투여하는 방법.
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