KR20030091821A - Novel microbacteria having the nicotine degradation activity - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 니코틴을 고효율로 분해하는 활성이 있는 신규한 균주에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 기존의 화학적 처리 또는 생물학적 숙성에 의한 니코틴의 처리 방법에 비하여 니코틴 분해능이 우수하고, 대량으로 배양하여 니코틴의 분해 목적에 이용할 수 있기 때문에 저니코틴의 담배를 대량으로 생산하는데 유용하게 이용할 수 있으며, 담배 폐기물의 처리 시 2차 폐기물을 생성하지 않아 환경적으로도 안전하게 이용할 수 있는 니코틴 분해활성이 있는 신규한 균주에 관한 것이다.The present invention relates to a novel strain having the activity of breaking down nicotine with high efficiency. More specifically, the present invention has a superior nicotine resolution compared to conventional methods for treating nicotine by chemical treatment or biological aging, and can be used for the purpose of nicotine degradation by mass cultivation, thus producing a large amount of low nicotine tobacco. The present invention relates to a novel strain having nicotine degrading activity, which can be usefully used and does not generate secondary waste during the treatment of tobacco waste and can be used safely in the environment.
담배에는 인체에 치명적인 30여 가지의 유독성 물질이 함유되어 있는데, 암 유발인자로 밝혀진 타르성분 및 니코틴이 대표적이다. 특히, 니코틴은 중독성이 강하여 흡연자들이 금연하기 어려운 원인이 될 뿐만 아니라, 자체 독성이 매우 강하여 흡연자들의 건강을 해치는 주범이다. 이에, 흡연으로 인한 질병문제가 사회적인 문제로 크게 부각됨에 따라 니코틴 함량이 낮은 순한 담배에 대한 선호도가 상승하게 되었다.Tobacco contains about 30 toxic substances that are fatal to the human body, and tar and nicotine are known to be cancer causing factors. In particular, nicotine is a highly addictive cause not only difficult for smokers to quit smoking, but also has a very strong self-toxicity, which is a major culprit for the health of smokers. Accordingly, as the disease problem caused by smoking has been highlighted as a social problem, the preference for mild tobacco having low nicotine content has increased.
이러한 요구를 충족시키고 흡연자들의 건강을 개선시키고자 저니코틴의 담배를 생산하기 위한 다양한 시도가 있어 왔다. 등록특허 제10-289111호에는 물과 술의 혼합액에 담배잎을 침지하거나 분무한 다음 증자 및 건조시킴으로써, 니코틴, 타르 및 기타 유독 성분의 함량이 저하된 담뱃잎을 가공하는 방법이 공지되어 있으나, 상기 발명은 니코틴의 함량은 감소시킬 수 있으나 담배의 상품 가치를 떨어뜨리는 단점이 있다. 등록특허 제10-0217828호에는 잎담배 추출물을 알칼리 수용액으로 처리하고 이를 유기용매로 분획 추출하여 니코틴을 제거한 저니코틴 담배 추출물의 제조방법이 공지되어 있으나, 그 공정이 복합하여 이용하는데 어려움이 있다. 또한, 공개특허 제2001-100113호에는 엿기름을 담뱃잎에 첨가하고 숙성시키는 방법에 의하여 제조된 기호성이 뛰어난 담배의 제조방법이 공지되어 있으나, 이 방법은 미생물을 이용한 생물학적 처리방법이기는 하지만 선별된 고활성의 니코틴 분해 균주를 이용한 방법이 아니기 때문에 대량으로 제조하는데 어려움이 있으며, 그 효율 또한 떨어지는 단점이 있다. 이에, 니코틴의 함량이 낮아 흡연 시에도 안전한 저니코틴 담배의 대량 제조에 대한 요구가 크게 증대되고 있는 실정이다.Various attempts have been made to produce tobacco of low nicotine to meet this need and to improve the health of smokers. Patent No. 10-289111 discloses a method of processing tobacco leaves having a reduced content of nicotine, tar and other toxic components by dipping or spraying tobacco leaves in a mixture of water and liquor and then increasing and drying the tobacco leaves. The invention can reduce the content of nicotine but has the disadvantage of lowering the value of tobacco products. Patent No. 10-0217828 discloses a method for preparing a low nicotine tobacco extract, in which a leaf tobacco extract is treated with an aqueous alkali solution and fractionated with an organic solvent to remove nicotine, but the process is difficult to use in combination. In addition, Patent Publication No. 2001-100113 discloses a method for producing palatable tobacco prepared by adding malt to tobacco leaves and aging, but this method is a biological treatment method using microorganisms, but it has been selected for high activity. Since it is not a method using a nicotine degradation strain, there is a difficulty in preparing in large quantities, and the efficiency is also disadvantageous. Accordingly, the demand for low-volume manufacturing of low nicotine tobacco, which is safe even when smoking due to the low content of nicotine, has been greatly increased.
이에, 본 발명자들은 기존의 저니코틴 담배 생산 기술에 대한 문제점을 해결하고 저니코틴 담배에 대한 요구에 부응하기 위해 연구한 결과, 연초 제조창의 필터로부터 분리한 본 발명 균주 아스로박터 sp. Nico1이 니코틴을 분해하는 활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 종래의 화학적 처리나 효모를 이용한 숙성 처리가 아닌 분리된 고활성의 미생물을 니코틴 분해에 이용하는 간단하고 단순한 생물학적 공정에 의하여 니코틴이 제거된 순한 담배를 제조할 수 있고, 아울러 잎담배 가공 과정 중 생성되는 니코틴 함량이 높은 다량의 고형 폐기물을 안전하게 분해 및 처리할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have studied to solve the problems of the existing low nicotine tobacco production technology and to meet the demand for low nicotine tobacco, the present invention strain Aslobacter sp. Not only does Nico1 have excellent activity to break down nicotine, but it also produces mild nicotine-free tobacco by a simple and simple biological process that uses isolated high-activity microorganisms for nicotine decomposition rather than conventional chemical treatment or aging with yeast. In addition, the present invention has been found to be capable of safely decomposing and treating a large amount of solid waste having a high content of nicotine generated during the leaf tobacco processing.
따라서, 본 발명의 목적은 니코틴 분해활성이 있는 신규한 균주를 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a novel strain having nicotine degradation activity.
본 발명의 다른 목적은 상기 니코틴 분해활성이 있는 신규한 균주를 이용하여 니코틴을 제거하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for removing nicotine using the novel strain having the nicotine degradation activity.
도 1은 광주 연초 제조창의 Biofilter(담채 상·중·하단, 침출수) 또는 대전 하수 처리장 활성 슬러지로부터 추출한 미생물원의 동정 결과 분리된 균주들의 호기성 니코틴 분해활성 측정 결과이다.1 is a result of determination of aerobic nicotine degrading activity of isolated strains of microorganisms extracted from biofilters (top, middle, bottom, leachate) or activated sludge of Daejeon sewage treatment plant of Gwangju tobacco.
도 2는 위상차 현미경을 이용하여 본 발명 균주 아스로박터 sp. Nico1 (Arthrobactersp. Nico1)의 형태학적 특징을 관찰한 결과로서, 2A 및 2B는 각각 배양 후 3일 경과 후 및 7일 경과 후 관찰한 결과이다.Figure 2 using the phase contrast microscope of the present invention strain Aslobacter sp. As a result of observing the morphological characteristics of Nico1 ( Arthrobacter sp. Nico1), 2A and 2B were observed after 3 days and 7 days after incubation, respectively.
도 3은 본 발명 균주 아스로박터 sp. Nico1과 아스로박터(Arthrobacter)에 속하는 다른 종균들의 16S rDNA 서열에 기초하여 작성한 계통수(Phylogenetic tree)이다.Figure 3 is the present invention strain Asrobacter sp. Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of Nicol and other species belonging to Arthrobacter .
도 4는 본 발명 균주 아스로박터 sp. Nico1의 니코틴 분해활성을 알아보기 위하여, 각 니코틴 농도 구배에서의 니코틴 농도 변화를 시간의 경과에 따라 측정한 결과이다.4 is The present invention strain Asrobacter sp. In order to examine the nicotine degrading activity of Nico1, the change of nicotine concentration in each nicotine concentration gradient was measured over time.
도 5는 본 발명 균주 아스로박터 sp. Nico1의 각 니코틴 농도 구배에서의 세포생장 변화를 시간의 경과에 따라 측정한 결과이다.5 is the present invention strain Asrobacter sp. The change in cell growth in each nicotine concentration gradient of Nico1 was measured over time.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 니코틴의 분해활성이 뛰어난 신규한 균주를 분리하고, 이 균주의 니코틴 분해활성을 측정하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the present invention is characterized by separating a novel strain excellent in the degradation activity of nicotine, and measuring the nicotine degradation activity of this strain.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에 따른 신규한 균주는 형태학적 특징, 대사 활성, 탄소원 이용 활성 등의 생리적 특징 및 16S rDNA의 서열분석을 통한 분자생물학적 동정 결과, 아스로박터(Arthrobacter) 속 종균임이 밝혀졌다. 본 발명에서는 이를 아스로박터 sp. Nico1(Arthrobactersp. Nico1)이라 명명하고, 한국미생물보전센터에 기탁번호 KFCC-11305로 기탁하였다.The novel strain according to the present invention was found to be a species of the genus Arthrobacter , as a result of molecular physiological characteristics such as morphological characteristics, metabolic activity, carbon source utilization activity and sequencing of 16S rDNA. In the present invention, this is Asrobacter sp. It was named Nicol ( Arthrobacter sp.
본 발명은 니코틴 분해활성이 있는 상기 균주를 처리함으로써 담배의 니코틴을 제거하는 방법 및 니코틴의 함량이 적은 저니코틴 담배를 제공할 수 있다. 아울러, 고농도의 니코틴을 함유하는 폐기물의 처리 방법을 제공할 수 있다.The present invention can provide a method for removing nicotine from tobacco by treating the strains having nicotine degrading activity and low nicotine tobacco with a low content of nicotine. In addition, a method for treating waste containing high concentration of nicotine can be provided.
본 발명에 따른 니코틴 분해 활성이 있는 신규한 균주는 니코틴을 고효율로 분해하는 특성이 있기 때문에 잎담배 제조 시 사용할 경우 니코틴이 다량 제거되어 안전한 담배를 생산할 수 있고, 균주를 배양하여 담배에 바로 처리할 수 있기 때문에 처리 공정이 단순하여 경제적이며, 담뱃잎 가공 중 발생하는 니코틴 함량이 높은 다량의 고형 폐기물 처리에 이용할 경우 2차 폐기물을 생성하지 않아 안전하게사용할 수 있는 장점이 있다.Since the novel strain having nicotine degradation activity according to the present invention has the property of degrading nicotine at high efficiency, a large amount of nicotine is removed when used in the manufacture of leaf tobacco, so that a safe tobacco can be produced, and the strain can be cultured and immediately processed on tobacco. Therefore, the treatment process is simple and economical, and when used for treating a large amount of solid waste having high nicotine content generated during tobacco leaf processing, there is an advantage that it can be safely used because it does not generate secondary waste.
이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
〔실시예 1〕니코틴 분해성 미생물의 분리Example 1 Isolation of Nicotine Degradable Microorganisms
니코틴을 분해하는 미생물 균주를 분리하였다.Microbial strains that degrade nicotine were isolated.
균주의 분리용 배지로는 K2HPO42.6g, KH2PO41.3g, NaCl 7.0g, MgSO4·7H2O 0.1g, CaCl2·H2O 0.05g을 증류수 1ℓ에 넣고 고온멸균한 후, Trace element 1.0㎖, Vitamin Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 각 0.1㎖, 니코틴 1.0㎖(최종 농도 6.2mM)를 첨가하여 제조한 최소 염 배지(Minimal Salt Medium, MSM)를 이용하였다. 고체 배양시에는 상기 배지에 2.0% 아가(agar)를 첨가하여 평판배지로 제조하여 사용하였다.As a medium for isolation of the strain, K 2 HPO 4 2.6g, KH 2 PO 4 1.3g, NaCl 7.0g, MgSO 4 · 7H 2 O 0.1g, CaCl 2 · H 2 O 0.05g in 1L of distilled water After that, a minimum salt medium (Minimal Salt Medium, MSM) prepared by adding 1.0 mL of trace elements, 0.1 mL of each of Vitamin I, II, and III, and 1.0 mL of nicotine (final concentration 6.2 mM) was used. In solid culture, 2.0% agar was added to the medium to prepare a plate medium.
250㎖ 삼각 플라스크에 상기 MSM-니코틴 배지 90㎖를 넣고 여기에 광주 연초 제조창의 Biofilter(담채 상·중·하단, 침출수) 또는 대전 하수 처리장 활성 슬러지로부터 추출한 미생물원을 10㎖ 분주한 후 진탕배양기(shaking incubator)에서 150rpm, 30℃ 조건으로 3일간 배양하였다.90 ml of the MSM-nicotine medium was added to a 250 ml Erlenmeyer flask, and 10 ml of the microorganisms extracted from Biofilter (Tea top, middle, bottom, leachate) or activated sludge in Daejeon sewage treatment plant were dispensed with shaking culture machine. shaking incubator) was incubated at 150rpm, 30 ° C for 3 days.
배지 내의 니코틴이 완전히 분해된 것을 확인한 후 플라스크 내의 배양액 10㎖를 새로운 MSM배지 90㎖에 첨가하여 3회 반복 배양하였다. 미생물의 생장이 확인된 배양액을 MSM배지에서 차례로 희석하고 고체평판배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 평판배지 위에 미생물의 군집이 성장함을 확인한 후 각각의 콜로니들의니코틴 분해능을 확인하기 위하여 다시 새로운 MSM 배지에 접종하여 배양하였다.After confirming that the nicotine in the medium was completely decomposed, 10 ml of the culture solution in the flask was added to 90 ml of fresh MSM medium, and the culture was repeated three times. The culture medium in which the growth of microorganisms was confirmed was diluted sequentially in MSM medium, plated on a solid plate medium, and cultured at 30 ° C. After confirming that the colonies of microorganisms grow on the plate medium, inoculation was again inoculated in fresh MSM medium to confirm nicotine degradation of each colony.
배양 결과, 도 1 에서와 같이 니코틴 분해활성이 서로 다른 5종의 균주가 분리되었다(도 1의 control은 미생물을 접종하지 않은 MSM-니코틴 배지). 이 중 활성테스트를 거쳐 니코틴 분해활성이 가장 뛰어난 균주 1종을 선발하였다.As a result of the culture, five strains having different nicotine-degrading activity were isolated as shown in FIG. 1 (control of FIG. 1 is MSM-nicotine medium not inoculated with microorganisms). Among them, one of the best strains of nicotine degradation activity was selected through an activity test.
〔실시예 2〕니코틴 분해성 미생물의 동정Example 2 Identification of Nicotine Degradable Microorganisms
니코틴 분해활성이 있는 것으로 밝혀진 상기 미생물 균주를 동정하였다.The microbial strains found to have nicotine degrading activity were identified.
위상차 현미경을 이용하여 균주의 형태학적 특징을 배양 후 3일(도 2A), 7일(도 2B) 경과 후 관찰한 결과, 원통형의 운동성이 있는 균주의 형태가 구형으로 변화함을 확인할 수 있었다(도 2). 이러한 형태는 아스로박터(Arthrobacter) 속의 대표적 특징이다.The morphological characteristics of the strains were observed after 3 days (FIG. 2A) and 7 days (FIG. 2B) after incubation using a phase contrast microscope. 2). This form is a representative feature of the genus Arthrobacter .
또한 동정결과를 구체화하기 위하여 그람 염색과 API 20 E/NE, ID 32 GN kit(bioMerieux)을 이용한 대사 활성과 탄소원 이용 확인 실험을 수행하고 그 결과를 표 1에 나타내었다. 균주를 화학적으로 분류하기 위하여 세포막 구성성분 중 펩티도글리칸 타입(peptidoglycan type), 당(sugar)을 추출하여 분석하였으며, 균체지방산조성과 Isoprenoid quinone을 확인하였다. 표 2는 본 발명 Nico1과 아스로박터 속에 속하는 대표 종들과의 생리적 특징의 비교이다. 표 3은 본 발명 Nico1과 계통학적으로 가장 유사한 세 균주와의 특징 비교 결과이다.In addition, in order to elaborate the identification results, the experiments using gram staining, API 20 E / NE, and ID 32 GN kit (bioMerieux) for metabolic activity and carbon source confirmation were performed, and the results are shown in Table 1. In order to classify the strain chemically, the peptidoglycan type and sugar were extracted from the cell membrane components, and the cell fatty acid composition and Isoprenoid quinone were identified. Table 2 is a comparison of the physiological characteristics of the present invention Nico1 and representative species belonging to the genus Asrobacter. Table 3 shows the results of the feature comparison with the three strains most similar to the present invention Nico1.
한편, 분자 생물학적으로 미생물을 동정하기 위하여 DNA 염기조성 분석(G+C content)을 수행하였으며, 16S rDNA의 서열분석을 하기 위해 DNeasy Tissue Kit(Qiagen, Valencia, Calif.)를 이용하여 균체에서 genomic DNA를 획득한 후Universal primer인 9F, 1512R을 이용하여 PCR을 수행하였다. 획득한 PCR 결과물을 다시 QIAquick PCR purification Kit(Qiagen, Valencia, Calif., USA)를 이용하여 정제한 후 ABI PRISM BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction Kit(Applied Biosystems, Foster, Calif., USA)를 이용하여 반응물을 만든 후 ABI Prism 3700 DNA analyzer를 이용하여 16S rDNA의 전체 염기서열을 분석하였다.On the other hand, DNA base composition analysis (G + C content) was performed to identify microorganisms in molecular biology and genomic DNA in cells using DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, Calif.) For sequencing of 16S rDNA. After obtaining the PCR using a universal primer 9F, 1512R. The obtained PCR result was purified again using QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Valencia, Calif., USA), and then reacted with ABI PRISM BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction Kit (Applied Biosystems, Foster, Calif., USA). After the preparation, the entire nucleotide sequence of 16S rDNA was analyzed using an ABI Prism 3700 DNA analyzer.
그 결과, 1434개의 뉴클레오티드로 구성된 염기서열을 획득할 수 있었다(서열번호 1).As a result, a nucleotide sequence consisting of 1434 nucleotides could be obtained (SEQ ID NO: 1).
상기 분석한 염기서열을 GenBank database BLAST search program을 이용하여 기존의 데이터들과 비교하고 계통수를 작성하였다(도 3).The analyzed nucleotide sequence was compared with existing data using GenBank database BLAST search program and the phylogenetic tree was prepared (FIG. 3).
상기와 같이 분리한 니코틴 분해능이 뛰어난 본 발명의 균주를 아스로박터 sp. Nico1(Arthrobactersp. Nico1)이라 명명하고, 2002년 5월 22일자로 한국미생물보전센터(KCCM)에 기탁번호 KFCC-11305번으로 기탁하였다.Asobacter sp. Strain of the present invention excellent in the nicotine resolution is isolated as described above. Nicol ( Arthrobacter sp. Nicol) was named and deposited on May 22, 2002 with the accession number KFCC-11305 to the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM).
〈시험예 1. 니코틴 분해능 측정〉Test Example 1. Measurement of Nicotine Resolution
용매추출법 및 자외선 흡광도 측정법을 약간 변형한 방법을 사용하여 상기 실시예 1에서 동정한 니코틴 분해활성이 있는 본 발명 균주의 니코틴 분해능을 측정하였다.The nicotine degrading ability of the strain of the present invention having nicotine degrading activity identified in Example 1 was measured using a slightly modified method of solvent extraction and ultraviolet absorbance measurement.
상기 동정한 본 발명 균주 배양액 10㎖을 시험관에 넣고 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 1.0㎖를 첨가한 후 물중탕에서 5분간 가열하고3000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리된 상등액을 0.5N HCl로 희석한 다음 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 259㎚에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에 의한 니코틴의 농도를 계산하는 한편, 6mM, 9mM, 12mM 및 30mM 농도구배의 니코틴 배지에 대한 본 발명 균주의 세포생장 변화를 시간의 경과에 따라 관찰하여 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.10 ml of the strain culture solution of the present invention was added to a test tube, and 1.0 ml of 10% trichloroacetic acid was added thereto, followed by heating in a water bath for 5 minutes and centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes. The diluted supernatant was diluted with 0.5 N HCl, and then absorbance was measured at 259 nm using a spectrophotometer to calculate the concentration of nicotine according to the standard curve, while nicotine with a concentration of 6 mM, 9 mM, 12 mM and 30 mM The cell growth change of the strain of the present invention with respect to the medium was observed over time, and the results are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
도 5를 통하여, 시간이 지남에 따라 본 발명 균주의 생장률이 증가하였으며, 농도 12mM까지는 니코틴의 농도가 증가할수록 생장률이 증가함을 확인할 수 있었다. 그러나 니코틴 분해활성이 있는 본 발명 균주는 30mM의 니코틴 농도에서는 성장이 저해됨을 확인할 수 있었다.5, the growth rate of the strain of the present invention increased over time, it was confirmed that the growth rate increases as the concentration of nicotine increases up to a concentration of 12mM. However, the present invention strain with nicotine degradation activity was confirmed that growth is inhibited at the nicotine concentration of 30mM.
이상에서 설명한 바와 같이, 니코틴을 고효율로 분해하는 활성이 있는 신규한 균주에 관한 본 발명은, 기존의 화학적 처리 또는 생물학적 숙성에 의한 니코틴 처리 방법에 비하여 우수한 니코틴 제거 방법을 제공할 뿐만 아니라, 균주를 대량으로 배양하여 니코틴의 분해 목적에 이용할 수 있기 때문에 저니코틴의 담배를 대량으로 생산하는데 유용하며, 담배 폐기물의 처리 시 2차 폐기물을 생성하지 않아 환경적으로도 안전하게 이용할 수 있는 등의 뛰어난 효과가 있으므로, 담배 제조 산업 및 폐기물 처리 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention relates to a novel strain having activity that degrades nicotine with high efficiency, as well as providing a method for removing nicotine superior to the nicotine treatment method by conventional chemical treatment or biological aging, It can be used for the decomposition of nicotine by culturing in large quantities, which is useful for producing low nicotine cigarettes in a large quantity. Therefore, it is a very useful invention for the tobacco manufacturing industry and the waste disposal industry.
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