KR20030089846A - Novel Bacillus circulans KLP1 with antibiotic activity against phytophthora capsici and microorganism preparations containing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 고추역병에 대한 항균성을 가지는 신규한 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368) 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 미생물제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추역병의 병원균인 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 대한 항균성을 가지는 균주를 토양으로부터 분리·동정하고 이 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물제제에 관한 것이다.The present invention relates to a novel strain B. circulans KLP1 (KCCM 10368) strain having antimicrobial activity against red pepper disease and a microbial agent containing the same as an active ingredient. The present invention relates to a microbial agent that isolates and identifies a strain having antimicrobial activity against Phytophthora capsici from soil and contains the strain as an active ingredient.
고추역병은 유묘기부터 전 생육기에 걸쳐 발생되며 주로 뿌리와 줄기부위에 발생하지만, 병원균은 빗물에 튀어 올라 잎, 열매, 가지 등의 지상부에서 발생되는 것으로, 일단 유묘기에 감염되면 그루 전체가 심하게 시들어 죽게 되고, 생육 중기나 후기의 병든 그루는 처음에 시들다가 후에 적황색으로 변해 말라죽는다. 이러한 고추역병을 일으키는 병원균인 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)는 물을 좋아하는 반수생균으로 물속이나 배양기상에서 유주자낭을 쉽게 형성하는데, 여기서 유출된 유주자는 2개의 편모를 가지고 물속을 유영하며 전반된다. 고추역병의 병원균은 병든 식물체의 조직에서 균사나 난포자 상태로 월동한 후 다시 발아하여 1차 전염원이 된다. 이를 좀더 구체적으로 설명하면 고추역병은 육묘상에서부터 전 생육기에 걸쳐 발생되며 시설재배에서는 연중 발생되는 것으로, 토양이 장기간 과습하거나 배수가 불량하고, 침수되면 병 발생이 조장된다. 특히, 고추역병은 종자전염도 가능하나, 대부분의 전염원이 토양에서 유입되기 때문에 방제상에 어려움이 있게 된다.Cayenne pepper plague occurs from the seedling stage to the entire growing season, and mainly occurs in the roots and stems.However, pathogens spring up in the rainwater and occur on the ground, such as leaves, fruits, and branches. In the middle of the growing season and later stages of disease, the diseased tree is wilted at first and later turns reddish yellow. Phytophthora capsici , a causative agent of the causative pepper disease, is a water-loving hemi-aquatic bacterium that easily forms a zygote sac in water or on an incubator. . The causative agent of pepper disease is overwintered in the form of mycelium or follicle in the tissues of diseased plants and then germinated again to become the primary infectious agent. In more detail, red pepper disease occurs throughout the growing season from seedlings, and occurs throughout the year in facility cultivation. In particular, pepper blight is also possible seed transmission, but since most of the infectious agents are introduced from the soil is difficult to control.
이와 같은 고추역병의 방제를 위해 현재 저항성품종의 재배, 윤작 등이 행해지고 있는데, 지금까지 가장 효율적인 것으로 알려진 방제법은 살균제를 이용한 화학적 방제이다. 이러한 화학적 방제를 이용한 고추역병 방제를 위해 고추재배 토양에 사용되고 있는 살균제의 양은 83,000정보의 포장에 약 1,000 M/T(1993)로, 이렇게 사용된 화학농약의 과다사용으로 인하여 식물병원균의 화학농약에 대한 저항성 획득, 잔류독성, 토양의 산성화, 인축의 독성, 천적에 미치는 영향과 식수원의 오염 및 생태계 파괴 등 그 피해가 날로 심각해지고 있으며, 이로 인한 사회문제도 심각해지고 있다. 이러한 관점에서 볼 때, 상기 고추역병 식물병 방제에 사용할 수 있는 저독성이고 환경에 부작용을 일으키지 않는 무공해 살균제의 개발이 절실하게 요구되고 있고, 그것의 하나로 토양내의 길항 미생물에 의한 식물병원균의 억제방법인 생물방제법이 있다.Currently, cultivation and rotation of resistant varieties have been carried out for the control of red pepper disease, and the most effective control method so far is chemical control using fungicides. The amount of fungicide used in pepper cultivation soil for the control of red pepper disease using chemical control was about 1,000 M / T (1993) in the packaging of 83,000 information. The damages are becoming more serious, such as gaining resistance, residual toxicity, acidification of soil, poisoning of livestock, impact on natural enemies, pollution of drinking water and destruction of ecosystems. From this point of view, there is an urgent need for the development of a low-toxic and pollution-free fungicide that can be used for the control of pepper disease, which is one of the methods of inhibiting phytopathogens by antagonistic microorganisms in soil. There is biocontrol.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 토양으로부터 고추역병의 병원균인 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)에 대해 항균활성을 가지는 신규의 균주를 분리·동정하고, 이 균주를 함유하는 미생물제제를 제공함에 그 목적이 있다.The present invention has been made to solve the above problems, and isolated and identified a novel strain having antimicrobial activity against Phytophthora capsici , a pathogen of Cayenne pepper disease from soil, and containing the strain The purpose is to provide a microbial agent.
본 발명의 상기 목적은 고추역병의 병원균인 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)에 대해 항균활성을 가지는 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)을 분리·동정하고, 분리·동정한 균주 바실러스 써큐란스 (B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)에 대한 항균 활성과 항생제와 농약에 대한 저항성을 확인한 다음, 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)을 함유하는 미생물제제를 제조하여 고추 역병 발생 억제 효과를 확인함으로써 완성하였다.The object of the present invention is to isolate, identify, isolate and identify a strain B. circulans KLP1 (KCCM 10368) having antibacterial activity against Phytophthora capsici , a causative agent of red pepper disease. After confirming the antimicrobial activity of strain B. circulans KLP1 (KCCM 10368) to Phytophthora capsici and resistance to antibiotics and pesticides, B. circulans KLP1 (KCCM) A microbial preparation containing 10368) was prepared to confirm the inhibitory effect of pepper blight.
본 발명은 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 대해 항균 활성을 가지는 신규한 균주를 분리·동정하는 단계와; 분리된 신규한 균주의 항균작용을 확인하는 단계; 분리된 신규한 균주의 항생제와 농약에 대한 항균력을 조사하는 단계; 분리된 신규한 균주의 고추역병발생 억제효과를 검정하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of isolating and identifying a novel strain having antimicrobial activity against Phytophthora capsici ; Confirming the antimicrobial activity of the isolated new strain; Examining the antimicrobial activity against antibiotics and pesticides of the isolated new strains; It is composed of the steps of assaying the inhibitory effect of pepper strains isolated from the new strain.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 신규한 균주는 저 병해 포장의 토양으로부터 다음과 같은 과정을거쳐 분리·동정한다. 경북 영천근교의 저 병해 포장에서 토양샘플을 채집하여 10 g을 살균수 190mL를 첨가하고 30분간 진탕하여 10-7배로 희석한다. 그 희석액의 0.2 ml를 다양한 평판배지인 PDA, TSA, King's B media 등에 도말하여 28℃에서 48-74 시간 배양하여 싱글 콜로니(single colony)를 획득 후 분리 배양한다. 순수 분리를 위하여 상기 평판 배지에서 얻은 콜로니들을 다시 배지에 스트릭킹(streaking)하여 각각의 싱글 콜로니를 얻었으며 이 과정을 3-4회 반복한다. 분리균주의 세포막 지방산 메틸 에스터(fatty acid metyl ester) 분석결과 바실러스(Bacillus) sp.의 특성인 불포화지방산이 특이적으로 높고, 바실러스 써큐란스(Bacillus circulans)와 84.7%의 유사성을 보여 바실러스 써큐란스 (B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 신균주로 동정되었다.The novel strains of the present invention are isolated and identified from the soil of low disease pavement through the following process. Soil samples were collected from Yeongcheon, Gyeongbuk, Korea.-7Dilute with pear. 0.2 ml of the dilution is smeared on various flat media such as PDA, TSA, King's B media, and incubated at 28 ° C. for 48-74 hours to obtain single colony and then separated and cultured. Streaking the colonies from the flat medium again for pure separation to obtain each single colony and repeat this process 3-4 times. Analysis of cell membrane fatty acid methyl ester of isolate strainBacillusUnsaturated fatty acid, a characteristic of sp.Bacillus circulans)Wow 84.7% similarity to Bacillus Circus (B. circulans) Was identified as a new strain of KLP1 (KCCM 10368).
본 발명 신규한 균주 바실러스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 고추역병균 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 대한 항균 활성도를 측정하기 위하여 병원균 발육 억제거리 측정법, 아가 홀 디퓨전(Agar hole diffusion)법, 페이퍼 디스크(Paper disc) 침지법을 이용하여 측정한 결과 미생물 현탁액의 항균활성도는 95%이상으로 가장 뛰어나며 배양여액은 61%의 항균활성을 가지고, 이를 열처리 한 경우에도 56%의 항균활성을 가진다. 따라서 본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)은 고추의 심각한 주병인 고추 역병의 병원균인 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici)의 균사억제효과를 가지고, 균체 현탁액 뿐만아니라 배양여액을 처리한 경우에도 항균효과를 가지며, 열처리한 경우에도 항균효과가 유지됨을 알 수 있다. 따라서 배양여액은 세포 외로 유출되는 항균성 물질을 함유하고 있고, 이 물질은 열에 매우 안정하다는 것을 알 수 있다.In order to determine the antimicrobial activity of the novel strain B. circulans KLP1 (KCCM 10368) against phytophthora capsici , pathogen growth inhibition distance measuring method, Agar hole diffusion (Agar hole) As measured by diffusion method and paper disc immersion method, the antimicrobial activity of the microbial suspension is the highest (95% or more), and the culture filtrate has an antimicrobial activity of 61%. Have activity. Therefore, B. circulans KLP1 (KCCM 10368) of the present invention has a mycelial suppression effect of Phytophthora capsici , a pathogen of pepper blight, which is a serious causative agent of pepper, and not only cell suspension but also culture filtrate. It can be seen that even if the treatment has an antimicrobial effect, even if the heat treatment is maintained antibacterial effect. Therefore, it can be seen that the culture filtrate contains an antimicrobial substance that flows out of the cell, and the substance is very stable to heat.
본 발명 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 항생제와 농약에 대한 저항성은 본 발명 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)을 함유하는 미생물제제와 함께 사용할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 기존에 축적된 농약에 영향을 받지 않고 사용할 수 있도록 한다. 본 발명 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 항생제와 농약에 대한 저항성을 조사하기 위해 항생제에 페이퍼디스크를 침지시켜 균사억제거리를 측정하고, 제초제, 살충제, 살균제는 10μg/mL씩 처리하여 660nm에서 흡광도를 측정함으로써 균주 생장억제 정도를 대조구와 비교·산정한다. 그 결과를 살펴보면 항생제는 약 20%의 균주 생장억제도를, 제초제는 약 4~7%의 균주 생장억제도를, 살충제는 0%의 생장억제도를, 살균제는 97%의 생장억제도를 나타내므로 본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)은 살균제를 제외한 항생제와 제초제, 살충제에 대하여 높은 저항성을 가지고 있음을 알 수 있다.For use with microbial preparations containing the present invention, strains of Bacillus sseokyu lance (B. circulans) KLP1 resistance to antibiotics and pesticide (KCCM 10368) The present invention is strain Bacillus sseokyu lance (B. circulans) KLP1 (KCCM 10368 ) In addition, it can be used without being affected by the accumulated pesticides. In order to investigate the resistance against antibiotics and pesticides of the strain B. circulans KLP1 (KCCM 10368) of the present invention, the mycelial inhibition distance was measured by immersing the paper disc in the antibiotic, and the herbicide, insecticide, and fungicide were 10 μg / mL. By measuring the absorbance at 660nm after each treatment, the degree of strain growth inhibition is compared and calculated with the control. As a result, antibiotics showed about 20% strain growth inhibitory, herbicides about 4 ~ 7% strain growth inhibition, insecticides 0% growth inhibition, and fungicides showed growth inhibition 97%. Therefore, Bacillus circulans KLP1 (KCCM 10368) of the present invention can be seen that it has high resistance to antibiotics, herbicides, and insecticides except fungicides.
본 발명 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 고추역병 발생 억제 효과를 검정하기 위하여 균체현탁액과 배양여액으로 피복한 고추종자를 오염토양에 파종한 후 한달 동안 발병률을 검정한다. 토양에 관주하는 방법은 병해방지에 효과가 좋으나 많은 양의 물질이 필요하고 병 방제 후 토양 오염의 문제가 있으므로, 병해방지의 효과가 극대화되고 토양 오염의 문제가 없는 종자피복법을 이용한다. 상기 과정에 의한 실험결과를 살펴보면 고추종자를 배양여액에서 2시간 처리했을 때 고추역병발생의 억제효과가 가장 뛰어남을 알 수 있다.In order to test the inhibitory effect of the bacterium Bacillus circulans KLP1 (KCCM 10368) to inhibit the development of pepper blight, the incidence rate of the red pepper seed coated with the cell suspension and the culture filtrate was sown in contaminated soil. The method of irrigation on soil is effective in preventing diseases, but it requires a large amount of material and there is a problem of soil contamination after disease control. Therefore, the seed coating method is used to maximize the effect of preventing diseases and does not cause soil pollution. Looking at the results of the experiment by the above process it can be seen that the treatment of pepper seeds in the culture filtrate for 2 hours the most excellent effect of inhibiting the development of pepper blight.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것을 아니다.Hereinafter, the specific configuration of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to the following Examples.
실시예 1 : 본 발명 신규한 길항 미생물의 분리 및 동정Example 1 Isolation and Identification of the Novel Antagonist Microorganisms of the Invention
1999년 6월에서 12월까지 경북 영천근교의 저 병해 포장에서 토양샘플을 채집하여 10 g을 살균수 190 mL를 첨가하고 30분간 진탕하여 10-7배로 희석하였다. 그 희석액의 0.2 mL를 다양한 평판배지인 PDA, TSA, King's B media 등에 도말하여 28℃에서 48~74 시간 배양하여 싱글 콜로니를 획득 후 분리 배양하였다. 순수 분리를 위해 평판 배지에서 얻은 콜로니들을 다시 배지에 스트릭킹하여 각각의 싱글 콜로니를 얻었으며 이 과정을 3~4회 반복함으로써 순수 분리된 균주를 항균 활성 시험에 사용하였다.From June to December 1999, soil samples were collected from low blight in the Yeongcheon suburbs of Gyeongbuk, and 10 g was diluted 10 -7 times by adding 190 mL of sterilized water and shaking for 30 minutes. 0.2 mL of the dilution was spread on various plate media such as PDA, TSA, King's B media, and cultured at 28 ° C. for 48-74 hours to obtain single colonies and then cultured separately. Each single colony was obtained by streaking the colonies from the flat medium again for pure separation, and this process was repeated three to four times to use purely isolated strains for the antibacterial activity test.
상기 분리균주는 표1에 나타낸 것과 같이 내생포자를 형성하고 그램(+)의 간균으로써 크기는 0.6-0.8 x 2-5 μm 이고 배지상의 콜로니 형태는 가장자리가 둥글고 점질성의 유백색이었다(표2). 또한 분리균주의 세포막의 지방산 매틸 에스터 분석을 위해 셔록 시스템 버전 3.00(Sherlock system Version 3.00 (Microbial Id Inc.))을 사용한 결과, 바실러스(Bacillus) sp.의 특성인 불포화지방산이 63 %으로 특이적으로 높았으며, Api 50 CHB kit는 생명공학(주) 마이크로 아이디에 의뢰하였고, 바실러스 써큐란스와 84.7%의 유사성을 보여 바실러스 써큐란스(B. circulans)KLP1(KCCM 10368)으로 동정되었으며, 2002년 4월 2일 국제기탁기관인 한국종균협회에 기탁번호 KCCM 10368로 기탁하였다.The isolated strain formed endogenous spores as shown in Table 1, and the size was 0.6-0.8 x 2-5 μm as a gram (+) bacterium. In addition, as a result of using Sherlock system Version 3.00 (Microbial Id Inc.) for fatty acid methyl ester analysis of cell membranes of isolated strains, 63% of unsaturated fatty acids, characteristic of Bacillus sp. Api 50 CHB kit was commissioned by Micro ID of Biotechnology Co., Ltd., and was identified as B. circulans KLP1 (KCCM 10368) with 84.7% similarity to Bacillus Circulans. On the 2nd, it was deposited with KCCM 10368.
또한, 본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans)KLP1(KCCM 10368)의 감자 액체 배지에서의 최적 pH를 알기위해 250mL의 PD 브로스(broth)가 담긴 500mL 삼각플라스크에 균주를 접종하고, 진탕배양기(100rpm)를 사용하여 30℃의 온도에서 24시간 동안 배양한 후 배양액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표2에 나타내었고, pH 6에서 세포성장이 가장 활발함을 알 수 있었다.In addition, in order to know the optimal pH in the potato liquid medium of B. circulans KLP1 (KCCM 10368) of the present invention, the strain was inoculated with a 500 mL Erlenmeyer flask containing 250 mL of PD broth, followed by shaking incubator (100 rpm). ) Was incubated for 24 hours at a temperature of 30 ℃ and the absorbance of the culture was measured. The results are shown in Table 2, and it was found that cell growth was most active at pH 6.
실시예 2 : 본 발명 신규한 바실러스 써큐란스(Example 2 Inventive New Bacillus Circulus B. circulansB. circulans ) KLP1(KCCM 10368)의 파이토프소라 캡사이시() Phytopusora capsaishi of KLP1 (KCCM 10368) Phytophthora capsiciPhytophthora capsici )에 대한 항균 효과Antimicrobial effect on
본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 대한 항균효과를 확인하기 위한 실험은 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368) 현탁액(1×106cfu/cm3), 배양여액, 열처리된 배양여액에 대하여 48시간동안 병원균 발육 억제거리 측정법, 아가 홀 디퓨전(Agar hole diffusion)법, 페이퍼 디스크(Paper disc) 침지법을 이용하여 항균 활성도를 조사하였다. 그 결과 바실러스 써큐란스 KLP1(KCCM 10368) 현탁액 무처리구 1.1 균사건물중(g)에 대해 처리구 1.05 균사건물중(g)으로 95%의 항균활성도를 보였고, 배양여액 무처리구 1.1 균사건물중(g)에 대해 배양여액 처리구 0.67 균사건물중(g)으로 61%의 항균활성도를 보였으며, 열처리된 배양여액 무처리구 1.1 균사건물중(g)에 대해 배양여액 처리구 0.61 균사건물중(g)으로 56%의 항균활성도를 보였다(표3). 따라서 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368) 현탁액의 항균활성도가 가장 뛰어나며, 배양여액과 열처리된 배양여액도 50% 이상의 항균활성도를 보였다.The present invention Bacillus sseokyu lance (B. circulans) experiments to determine the antibacterial effect of the KLP1 upon between the pie Saratov seashell cap (KCCM 10368) (Phytophthora capsici) is Bacillus sseokyu lance (B. circulans) KLP1 (KCCM 10368 ) suspension (1 × 10 6 cfu / cm 3 ), culture filtrate, heat treated culture filtrate for 48 hours by measuring the pathogen inhibition inhibition distance, Agar hole diffusion method, paper disc immersion method Antimicrobial activity was investigated. As a result, Bacillus Circus KLP1 (KCCM 10368) suspension showed no antibacterial activity (1.1 g) in 1.1 mycelium (95 g), and treated in 1.05 mycelial (g). The antimicrobial activity of the culture filtrate treated with 0.67 mycelium was 61%. The antimicrobial activity was 0.6% with the culture filtrate treated with 0.61 mycelial culture (g). (Table 3). Therefore, the antimicrobial activity of B. circulans KLP1 (KCCM 10368) suspension was the highest, and the filtrate and the heat treated culture filtrate showed more than 50% antimicrobial activity.
또한, 본 발명 분리균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368) 배양여액의 고추 역병균인 파이토프소라 캡시사이에 대한 항균활성도와 배양시간과의 상관관계를 알기 위해서 분리된 균주를 진탕배양기(100rpm)로 pH 6, 30℃에서 배양하여 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간의 각 시간마다 배양여액을 확보하여 항균 활성도를 측정하는 실험을 하였다. 그 결과 표4에서 보는 바와 같이, 배양액 내의 세포농도는 60hr 배양시 가장 높으나, 항균 활성도는 48시간 배양시 가장 높은 것 을 알 수 있었다.In addition, the isolated strain of the present invention Bacillus Circus (B. circulans) In order to know the correlation between the antimicrobial activity and culture time of the phytophthora capsisai, a pepper bacterium bacterium in KLP1 (KCCM 10368) culture filtrate, the isolated strains were cultured at a pH of 6, 30 ℃ with a shaker (100 rpm). Experiments were carried out to measure the antimicrobial activity by securing the filtrate at each time of 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, 60 hours, 72 hours, and 84 hours. As a result, as shown in Table 4, the cell concentration in the culture medium was the highest at 60hr culture, the antimicrobial activity was found to be the highest at 48 hours incubation.
실시예 3 : 본 발명 신규한 바실러스 써큐란스(Example 3 Inventive Novel Bacillus Circus ( B. circulansB. circulans ) KLP1(KCCM 10368)의 항생제와 농약에 대한 저항성Resistance to antibiotics and pesticides of KLP1 (KCCM 10368)
본 발명 균주 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 항생제, 제초제, 살충제, 살균제에 대한 저항성을 분석하기 위해 NA배지에 앰피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 카나마이신(kanamycin), 페니실린(penicillin), 글라이포세이트(glyphosate), 프로파닐(propanil), 카브퓨란(carbfuran), 클로로탈로닐(chlorothalonil)을 각각 처리하여 30℃에서 48시간 배양하여 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 생장억제도(%)를 관찰하였다. 항생제는 페이퍼 디스크에 침지시켜 균사억제거리를 측정하였으며, 제초제, 살충제, 그리고 살균제는 10 μg/mL 처리 후 72 시간만에 660 nm에서 흡광도를 측정하여 균주 생장억제 정도를 대조구와 비교·산정하였다.B. circulans strain of the present invention Ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, penicillin, glyphosate in NA medium to analyze the resistance of KLP1 (KCCM 10368) to antibiotics, herbicides, pesticides, and fungicides , Propanil, carbfuran, chlorothalonil, respectively, treated with 30 hours of incubation at 30 ℃ for Bacillus Circulse (B. circulans) Growth inhibition (%) of KLP1 (KCCM 10368) was observed. The antibiotic was immersed in the paper disk to measure the mycelial inhibition distance, herbicides, insecticides, and fungicides were measured and absorbed at 660 nm 72 hours after 10 μg / mL treatment to determine the extent of strain growth inhibition and control.
그 결과를 살펴보면 항생제는 약 20%의 균주 생장억제도를, 제초제는 약 4~7%의 균주 생장억제도를, 살충제는 0%의 생장억제도를, 살균제는 97%의 생장억제도를 나타내었다. 따라서 본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)은 살균제를 제외한 항생제와 제초제, 살충제에 대하여 높은 저항성을 가지고 있음을 알 수 있었다.As a result, antibiotics showed about 20% strain growth inhibitory, herbicides about 4 ~ 7% strain growth inhibition, insecticides 0% growth inhibition, and fungicides showed 97% growth inhibition. It was. Therefore, the present invention Bacillus Circulan (B. circulans) KLP1 (KCCM 10368) was found to have high resistance to antibiotics, herbicides, and insecticides except fungicides.
실시예 4 : 본 발명 신규한 바실러스 써큐란스(Example 4 Inventive Novel Bacillus Circulus ( B. circulansB. circulans ) KLP1(KCCM 10368)의 고추 역병 발생 억제 효과 검정) KLP1 (KCCM 10368) Inhibition Effect of Pepper Blight
본 발명 신규한 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)의 고추역병 발생 억제 효과를 측정하기 위해 다음과 같은 방법으로 처리하여 고추역병 발병률을 조사하였다. 고추 재배지 토양을 지름 2mm 채로 친 후 수크로즈 5g, 감자 100 g 을 잘게 썰어 넣고 고압 살균 후 고추 역병균을 7mm 디스크(disc) 30개를 토양에 접종하여 28℃ 에서 15 일간 배양하였다. 고추종자를 균체 현탁액 또는 그 배양 여액에 침지하거나 흡착시킨 후 오염 토양에 파종하고, 한달 동안 발병률을 검정하였다.In order to determine the inhibitory effect of B. circulans KLP1 (KCCM 10368) on the development of pepper blight, the incidence of pepper blight was investigated. Chilli planting soil was beaten with a diameter of 2mm, finely chopped sucrose 5g, potato 100g, and autoclaved, inoculated 30 pepper 7 bacterium (disc) in the soil and incubated at 28 ℃ for 15 days. Pepper seeds were soaked in a cell suspension or culture filtrate or adsorbed, and then sown in contaminated soil, and the incidence was assayed for one month.
바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368) 균체 현탁액(2.6 x 106cfu/cm3)은 1%의 CMC(carboxylmethyl cellulose)와 혼합하고 이 혼합액에 고추종자를 침지 또는 흡착시킨 후 10분 건조하여 파종하였고, 배양여액은 상기 균체 현탁액을 30분간 원심분리(120,000 rpm) 후 실린더 필터(0.24μm)로 여과하고 제조하여 이 배양여액에 고추종자를 침지 또는 흡착시킨 후 10분 건조하여 파종하였다. B. circulans KLP1 (KCCM 10368) cell suspension (2.6 x 10 6 cfu / cm 3 ) was mixed with 1% CMC (carboxylmethyl cellulose) and immersed or adsorbed red pepper seeds in the mixture for 10 minutes. The culture filtrate was prepared by centrifugation (120,000 rpm) for 30 minutes, filtered through a cylinder filter (0.24 μm) and soaked with red pepper seeds in the culture filtrate, followed by drying for 10 minutes. .
그 결과 표 6에서 보는 바와 같이 고추종자를 배양여액에서 2시간 처리했을 때 고추역병발생의 억제효과가 가장 뛰어남을 알 수 있었다.As a result, as shown in Table 6, the treatment of pepper seeds in culture filtrate for 2 hours showed the most excellent inhibitory effect of the development of pepper blight.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans) KLP1(KCCM 10368)은 고추역병균 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici)에 대해 항균활성을 가지고, 본 발명 바실러스 써큐란스(B. circulans) KPL1(KCCM 10368)을 유효성분으로 함유하는 균체 현탁액 또는 배양여액으로 처리한 경우에 고추역병에 대한 현저한 항균력이 있으므로, 고추역병 방제에 사용할 수 있는 환경 친화적인 무공해 살균제로서 농업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention Bacillus sseokyu lance (B. circulans) KLP1 (KCCM 10368 ) have antimicrobial activity against bacteria between pepper station pie Saratov seashell kaepsi (Phytophthora capsici), the invention Bacillus sseokyu lance (B. circulans ) It is a very useful invention in agriculture as an environmentally friendly pollution-free bactericide that can be used to control pepper blight when treated with cell suspension or culture filtrate containing KPL1 (KCCM 10368) as an active ingredient. .
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