KR20030079255A - 항산화 활성이 높은 옻나무 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성이 높은 옻나무 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 반응성 산소종에 대한 포착활성 및 세포자살 방지효과를 가지는 옻나무 추출물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로부터 제조된 옻나무 추출물에 관한 것이다.

Description

항산화 활성이 높은 옻나무 추출물의 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF EXTRACT OF RHUS VERNICIFLUA STOKES HAVING HIGH ANTIOXIDANT ACTIVITY}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 항산화 활성이 높은 옻나무 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응성 산소종에 대한 포착활성 및 세포자살 방지효과를 가지는 옻나무 추출물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로부터 제조된 옻나무 추출물에 관한 것이다.

[종래기술]

반응성 산소종(Reactive oxygen species; ROS)이란 쌍을 이루지 못한 전자를 가진 불안정한 산소로서 세포 지질막, 세포내 단백질 및 DNA 등을 손상시켜 세포사멸을 초래하며, 나아가 노화 및 각종 질병을 야기시키는 물질이다. 반응성 산소종에는 수퍼옥사이드 라디칼 (superoxide anion, O₂ ^ㆍ-), 하이드로겐 퍼옥사이드 (hydrogen peroxide, H₂O₂), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical,^ㆍOH), 일중합산소, 유기 자유기(organic free radical, R) 및 페록실 자유기(peroxyl free radical; ROOH) 등이 있으며, 이들은 생체내 대사과정에서 자연적으로 생성되는 부산물이다(J.M. Mates, F.M. Sanchez-Jimenez, IJBCB 32 (2000) 157-170).

반응성 산소종에 대한 항산화 방어체계로서 생체내에는 슈퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase; SOD), 카탈라제(catalase; CAT), 글루타티온 퍼록시다제(glutathione peroxidase; GPX) 및 글루타티온 리덕타아제(glutathione reductase; GR) 등과 같은 효소가 있다(B.N. Ames, M.K. Shigenaga, in: B. Halliwell, O.I. Aruoma (Eds.), Fllis Horwood Limited, Chichester, West Sussex, England, 1993, pp. 1-15). 예를들어 슈퍼옥사이드 라디칼은 먼저 SOD에 의해 과산화수소로 전환되며, 과산화수소는 CAT와 GPX에 의해 물과 산소로 분해되어 인체에 무해하게 처리된다. 따라서 생체내 항산화 효소들은 첫째 과다한 활성산소 생성을 예방하고, 둘째 생성된 유리기를 포착, 제거하며, 셋째 철 및 구리와 같은 금속이온을 포착하여 세포내 지질 과산화의 발생을 억제하는 작용을 한다.

그러나 세포내 항산화 방어기작과 반응성 산소종 생성간에 불균형이 일어나 과도한 활성산소가 발생될 경우 세포는 산화적 스트레스를 받게되며, 그 현상이 지속될 경우 세포내 중요한 기관에 손상을 주어 신호 전달계, 유전자 발현계 등의 생물학적 기작을 변형시킴으로써 돌연변이 또는 세포고사을 야기하게 된다. 결과적으로 과도한 산화적 스트레스는 여러형태의 세포손상 및 사멸을 초래하며, 나아가 신경퇴행성 질병, 면역 기능장애 및 종양 발병의 직-간접적 원인이 된다(A.F.G. Slater, S. Orrenius, in: R.G. Cutler, L. Packer, J. Bertram, A. Mori, (Eds.) Birkhauser Verlag Basel, Switzerland, 1995, pp. 21-26; H. Wiseman, B. Halliwell, Biochem. J. 313 (1996) 17-29).

세포내 산화-항산화 불균형을 초래하는 세포내외적 원인은 다양한 것으로 보고되었으나 그 중에서도 자외선 조사, 에탄올, 도옥소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin) 및 에테르가 연결된 지질(ether-linked lipid), 그리고 만성적질병 상태로부터 세포내 산소자유기 발생이 촉진되는 것으로 알려져 있으며, 항산화물질은 그러한 활성산소기를 불활성화시키고 나아가 세포고사를 억제한다는 최근의 연구결과로부터 활성산소자유기는 세포독성 및 여러 퇴행성 질병의 원인물질이라는 것이 크게 대두되었다(R. von Harsdorf, P.F. Li, R. Dietz, Circulation 99 (1999) 2934-2941; B. Halliwell, J.M. Gutteridge, Methods Enzymol. 186 (1990) 1-85; M.N. Benchekroun, P. Pourquier, B. Schott, J. Robert, Eur. J. Biochem. 211 (1993) 141-146; B.A. Wagner, G.R. Buettner, C.P. Burns, Cancer Res. 53 (1993) 711-713).

따라서 산화적 스트레스로 야기되는 질병에 대한 예방 및 치료방법으로서 천연 항산화제의 이용가능성이 높게 평가되고 있으며, 오늘날에는 항산화제 치료(antioxidant therapy)라는 새로운 생화적 및 의학적 접근이 다양하게 이루어지고 있다. 특히, 예전의 항산화제는 주로 식품의 저장 또는 보존 목적으로 합성항산화제가 많이 이용되었으나, 최근에 합성항산화제의 과다한 섭취는 생체내 돌연변이 유발, 독성작용 및 발암 등의 문제를 가져올 수 있다는 가능성이 제기되어 오늘날에는 보다 안전하면서도 강한 항산화제를 천연물 또는 미생물 대사산물로부터 탐색하는 연구가 활발히 수행되고 있다. 특히 생체에 무해한 천연물 유래 항산화제인 토코페롤, 비타민 A 및 비타민 C와 같은 비타민류는 가장 잘 알려진 천연항산화제들이며, 최근에는 저분자 물질이면서도 천연항산화제인 플라보노이드계 화합물이 피부보호, 노화억제, 발암억제 등과 같은 항산화치료에 다양하게 이용되고 있다(C.K. Sen, L. Packer, FASEB J. 10 (1996) 709-720; E. Jr. Middleton, C. Kandaswami, Biochem. Pharmacol. 43 (1992)).

최근 우리나라에서도 천연물로부터 강력한 항산화제를 얻으려는 연구가 다양하게 진행되고 있으며, 항산화치료 뿐만 아니라 기능성식품으로도 그 이용성을 연구하는 추세이다. 특히 옻나무(Rhus vernicifluaStokes; RVS)는 주로 우리나라에 자생한 식물로서 오래전부터 옻칠로서 뿐만 아니라 민간에선 약리학적으로 이용되어 왔으며, 최근에는 약리학적 효과에 대한 과학적 연구가 이루어지고 있다. 그 결과 옻나무 에탄올 추출물은 강력한 항산화력 및 항암활성이 있는 것으로 보고되었으나 우루시올(urushiol)이라는 독성물질 때문에 옻나무 에탄올 추출물의 항산화효과에 대한 근본 기작 및 그 원인 물질 그리고 우루시올이 없는 활성분획을 얻기 위한 분리 정제과정에 많은 어려움이 있었다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 반응성 산소종에 대하여 포착활성을 가지는 천연식물 유래 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 옻나무로부터 강력한 항산화활성을 가지는 저독성 추출물을 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 실용적이며 안전한 항산화활성을 가지는 분획을 포함하는 항산화 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 RVS 시료의 하이드록실 라디칼(^ㆍOH) 유도성 데옥시리보오스 손상 억제효과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 RVS 시료의^ㆍOH 유도성 지방산산화 억제효과를 암모늄 시오시아네이트 방법을 통해 실험한 결과이고,

도 3은 RVS 시료의^ㆍOH 유도성 DNA 손상 억제효과를 나타낸 전기영동사진이고,

도 4는 RVS 시료의 라디칼 유도성 지질과산화에 대한 억제효과를 나타낸 것이고,

도 5는 RVS 시료의 슈퍼옥사이드 라디칼(O₂ ^ㆍ-) 포착활성을 확인한 그래프이고,

도 6은 RVS 시료의 반응성 산소종 유도성 흉선세포사멸에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이고,

도 7은 RVS 시료의 흉선세포내 DNA 합성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

도 8은 RVS 시료의 세포독성 유무를 측정한 그래프이고,

도 9는 RVS 시료중에서 가장 항산화활성이 강한 F1(RVS-F1) 및 F2(RVS-F2)의 라디칼 유도성 흉선세포의 자살에 대한 억제효과를 게놈 DNA을 이용하여 알아본 전기영동사진이고,

도 10은 RVS-F2의 라디칼 유도성 흉선세포의 자살에 대한 억제효과를 TUNEL 방법을 이용해 나타낸 사진이고,

도 11은 RVS-F2의 HPLC 크로마토그램이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 옻나무를 분쇄하는 단계, (b) 분쇄물을 에탄올에 침지하여 추출하는 단계, (c) 에탄올 추출물을 여과하여 여과물을 수득하는 단계, (d) 여과물을 저온에서 정치하여 노란색을 띄는 층을 회수하는 단계, (e) 상기 회수물을 동결건조하여 에탄올 조 추출물을 수득하는 단계, (f) 옻나무 에탄올 조추출물을 에탄올에 녹인 다음 실리카겔 컬럼에 주입하고, 증류수 및 유기용매를 순차적으로 주입하여 분획물을 수득하는 단계 및 (g) 상기 분획물을 동결건조하는 단계를 포함하는 옻나무 추출물 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 옻나무 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 옻나무 추출물을 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 옻나무 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 옻나무에서 우수한 항산화 활성을 가지는 추출물을 분리하였다.

본 발명의 옻나무 추출물 분리방법 (a) 옻나무를 분쇄하는 단계, (b) 분쇄물을 에탄올에 침지하여 추출하는 단계, (c) 에탄올 추출물을 여과하여 여과물을 수득하는 단계, (d) 여과물을 저온에서 정치하여 노란색을 띄는 층만 회수하는 단계, (e) 상기 회수물을 동결건조하여 에탄올 조 추출물을 수득하는 단계, (f) 옻나무 에탄올 조추출물을 에탄올에 혼합한 다음 실리카겔 컬럼에 주입하고, 증류수 및 유기용매를 순차적으로 주입하여 분획물을 수득하는 단계, (g) 상기 분획물을 동결건조하는 단계를 포함한다.

또한 옻나무 추출물 분리방법은 상기 (g) 단계 이후에 건조된 분획물을 에탄올에 용해시켜 실리카겔 컬럼에 주입하고, 증류수를 주입하여 분획물을 수득하는 단계 및 상기 분획물을 동결건조하는 단계를 더욱 포함한다.

상기 (a) 단계에서, 옻나무는 옻나무(Rhus verniciflua stokes; RVS), 개옻나무(R. trichocarpa), 검양옻나무(R. succedanea), 산검양옻나무(R.sylvertris) 및 붉나무(R. javanica Linne)로 이루어진 군으로부터 선택되어진 것으로, 바람직하게는 옻나무의 가지 또는 줄기를 분쇄하는 것이다.

상기 (b) 단계에서는 분쇄물을 에탄올에 침지하여 30 내지 60도 내외에서 5일 내지 20일 실시하는 것이 좋다.

상기 (c) 단계에서는 통상적인 여과지에 여과하고, (d) 단계의 4 내지 -20도의 저온 정치를 실시하여 노란색을 띄는 층을 회수하여 다수의 중합 우루시올(urushiol)을 제거한다.

상기 (e)단계에서는 동결건조를 실시하여 에탄올 조추출물을 얻으며, 이후 단계에서 대부분의 우루시올을 제거한다.

상기 (f)단계에서, 옻나무 에탄올 조추출물을 에탄올(99%)에 용해(1 g 추출물/1 mL 에탄올)하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하고, 용출액으로 증류수 및 유기용매를 순차적으로 사용한다. 상기 유기용매는 알콜 또는 아세트산으로, 더욱 바람직하게는 에탄올 및 아세트산을 순차적으로 사용하는 것이 좋고, 가장 바람직하게는 증류수 이후에, 30 % 에탄올, 무수 에탄올 및 5 % 아세트산을 컬럼에 주입하여 용출되는 유기용매 추출물을 수득하는 것이다. (f) 단계에서 수득한 용매 추출물은 E1(증류수 추출물), E2(30% 에탄올 추출물), E3(99% 에탄올 추출물) 및 E4(5% 아세트산 추출물)이다.

상기 (g) 단계이후에, 옻나무 추출물 E1을 무수 에탄올에 용해시켜 실리카겔 컬럼에 주입하여 증류수로 용출시킨다. 이때 4 내지 5개정도의 큰 피크를 나타내는 분획물을 수득하고, 용출 중간 부분에 나오는 가장 큰 분획(선명한 노란색)을 F2으로, F2 이전의 분획물을 F1, 이 후의 분획물을 F3로 수득한다. 상기 F1, F2 및 F3은 옻나무 수 추출물이다.

본 발명의 옻나무 에탄올 조추출물로부터 얻어진 용매 추출물 E1, E2, E3 및 E4, 그리고 E1으로부터 분리한 옻나무 수 추출물 F1, F2 및 F3 각각에 대한 항산화활성 및 산화적 스트레스 유도성 세포자살에 대한 억제효과를 확인하였다.

항산화활성은 크게 금속이온 또는 효소에 의해 발생되는^ㆍOH, H₂O₂및 O₂ ^ㆍ-라디컬에 대한 포착활성을 확인하였다. 금속이온으로는 Fe³⁺및 Fe²⁺, 효소로는 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 및 글루코스 옥시데이즈(glucose oxidase)를 사용하였다.

Fe³⁺에 의해 발생되는 하이드록실 라디컬에 대한 포착실험은 디옥시리보스(도 1), 암모늄 티오시아네이트(도 2), DNA 닉킹(Nicking, 도 3) 방법으로 확인하였고, 그 결과 옻나무 수추출물이 옻나무 유기용매 추출물에 비하여 우수한 포착효과를 나타내었으며, 특히 옻나무 수 추출물 F2의 항산화활성이 가장 높게 나타났다.

Fe²⁺에 의해 발생되는 하이드록실 라디컬에 대한 포착실험은 지질 과산화물 생성 억제율로 실시하였고, 그 결과 옻나무 수 추출물이 유기용매 추출물에 비하여 전체적으로 우수한 포착효과를 나타내었으며, 특히 옻나무 수 추출물 F1, F2, F3 및 유기용매 추출물 E3의 항산화 활성이 매우 높았다(도 4). 따라서, 본 발명의 옻나무 수 추출물 및 유기용매 추출물은 Fe²⁺가 관여하는 지질 과산화를 억제한다.

잔틴/잔틴 옥시데이즈 시스템으로부터 생성된 O₂ ^ㆍ-포착활성 역시 옻나무 수 추출물이 유기용매 추출물에 비하여 높게 나타났다(도 5).

따라서, 본 발명의 옻나무 수 추출물은 반응성 산소종에 대한 항산화효과를 가지며, 위와같은 항산화 효과는 옻나무 추출물의 활성이 단순히 활성산소자유기를소거하는 것에 한정되는 것이 아니라, 라디칼 생성반응을 유도 및 촉진작용을 하는 금속이온, 특히 철 이온에 대한 직접적 포착능력으로 인한 활성산소자유기 생성반응 자체를 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

따라서 이러한 옻나무 추출물의 항산화효과에 대한 보다 정확한 결과를 세포를 이용한 시스템을 통해 알아보고자 생쥐로부터 얻어진 흉선세포를 배양하여 글루코스 옥시데이즈를 처리한 후 하이드로겐 퍼옥사이드 생성에 따른 세포손상을 유도시킨 다음 여기에 옻나무 추출물을 첨가하여 라디칼 소거 및 세포손상 억제능력을 알아보았다. 그 결과 옻나무 수 추출물 및 유기용매 추출물은 흉선세포의 라디칼 유도성 사멸을 유의적으로 억제한다는 결과를 얻을 수 있었다. 이는 옻나무 추출물이 글루코스 옥시데이즈에 의해 생성되는 하이드로겐 퍼옥사이드 뿐만 아니라 하이드로겐 퍼옥사이드로부터 유리되는 하이드록실 라디칼에 대한 직접적 소거 및 라디컬에 의해 매개되는 세포손상을 보호한다는 것을 의미한다(도 6).

한편 옻나무 수 추출물 및 유기용매 추출물이 세포의 유사분열에 미치는 영향을 보기 위해 방사선 동위원소를 이용하여 DNA 합성정도를 실험하였다. 그 결과 모든 추출물은 저농도에서도 유사분열원질 유도성 흉선세포의 분열을 억제하였고, 특히 옻나무 유기용매 추출물 E3은 다른 추출물에 비해 매우 저농도에서도 그 효과가 크게 나타났다(도 7). 이러한 결과는 본 발명의 옻나무 수 추출물 및 유기용매 추출물을 항암제로 이용할 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서 유사분열원질 유도성 DNA 합성에 대한 억제효과가 세포내 신호전달의 조절로 인한 것인지 아니면 세포를 직접적으로 죽이는 효과 때문이지를 알기 위해 MTT를 이용하여 옻나무 추출물그 자체에 대한 세포독성 여부를 흉선세포를 이용하여 확인하였다. 그 결과 옻나무 수 추출물은 세포독성작용이 낮거나 없는 것으로 나타났으나 유기용매 추출물, 특히 E3는 흉선세포에 대한 세포독성이 큰 것으로 나타났다(도 8). 이는 옻나무 수 추출물은 세포에 직접적 독성을 주지 않으면서 세포분열을 조절한다는 것을 의미하는데 이는 옻나무 수 추출물의 강력한 항산화효과에서 기인된 것으로 보여지며, 아울러 그러한 특성은 항암제로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 그러나 E3는 항산화 효과 및 유사분열원질 유도성 DNA 합성에 대한 억제효과가 크나 세포에 대한 직접적 독성작용이 있는 것으로 보아 항암제나 항산화제로서 생체에 직접적으로 적용하기에는 어렵다는 것을 알 수 있었다. 따라서 E3의 경우엔 보다 다양한 실험이 요구된다.

이상의 결과를 종합한 결과 옻나무 수 추출물이 항산화 효과 뿐만아니라 항암가능성도 매우 큰 것으로 나타나 F1과 F2에 대한 라디칼 유도성 세포자살에 미치는 영향을 알아보았다. 그 결과 F1 및 F2 모두 라디칼 유도성 흉선세포의 자살을 유의적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다. 일반적으로 라디칼에 의한 과도한 세포자살은 파킨슨 및 알츠하이머 같은 신경계 질병과 동맥경화, 쇼크와 같은 심장 질환은 물론 각종 암질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있어 옻나무 수 추출물의 세포자살억제효과는 의학적 적용측면에서 큰 의미를 가진다(도 9, 10).

따라서 본 발명의 옻나무 수 추출물, 특히 F2분획은 우수한 항산화효과 및 세포자살 방지효과를 보였기 때문에 그의 주된 성분을 동정하고자 HPLC 크로마토그램, NMR, MS 등을 실시하였다. 그 결과 도 11에 나타낸 바와 같이 옻나수 수 추출물 F2는 10.7 내지 17.7%의 화합물 1, 8.9 내지 12.9%의 화합물 2, 30.8 내지 51.6%의 화합물 3, 7.8 내지 14.2%의 화합물 4 및 5.5 내지 8.06 %의 화합물 5를 포함하고 있다. 화합물 1의 성분은 FT-IR, NMR 및 MS 등의 분석방법에 의해서는 동정되지 않았으며, 화합물 2는 푸스틴(fustin), 화합물 3은 퀘르세틴(quercetin), 화합물 4는 부테인(butein), 화합물 5는 설푸레틴(sulfuretin)으로 확인되었다.

또한 본 발명은 옻나무 수 추출물 또는 유기용매 추출물을 포함하는 항산화 조성물을 제공한다. 본 발명의 항산화 조성물은 반응성 산소종에 의해 유발되는 질병을 예방 및 치료하기 위한 용도나 식품등의 산화를 방지하기 위한 첨가제로 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 옻나무 수 추출물을 포함하는 항산화 조성물은 의학적인 용도로 사용할 수 있으며, 옻나무 유기용매 추출물을 포함하는 항산화 조성물은 인체이외의 산화를 방지하기 위한 용도로 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 옻나무 수 추출물 또는 유기용매 추출물을 포함하는 항암제 조성물을 제공한다. 상기 옻나무 수 추출물 또는 유기용매 추출물은 세포분열을 억제하는 활성을 가지므로, 빠른 세포분열을 나타내는 종양에 투여하여 종양의 증식을 억제할 수 있다. 더욱 바람직하게는 항암제 조성물은 옻나무 수 추출물 F2를 의미한다.

또한 본 발명은 세포자살 방지용 조성물을 제공한다. 상기 세포자살 방지용 조성물은 옻나무 수 추출물 또는 옻나무 유기용매 추출물을 포함하는 것으로, 더욱 바람직하게는 옻나무 수 추출물을 포함한다.

상기에서 언급한 항산화 조성물, 항암제 조성물 및 세포자살 방지용 조성물은 사용용도나 방법에 따라 적절한 제형으로 제조하는 것이 바람직하며, 제형으로는 액제, 분말제, 유제, 고형제, 유동제 등이 있다. 항산화 조성물은 약제, 식품 첨가제, 화장료 등으로 사용할 수 있으며, 항암제 조성물 및 세포자살 방지용 조성물은 약제로 사용할 수 있다. 각 조성물의 사용함량은 사용용도나 질병의 정도에 따라 조절하여 사용하는 것이 좋으며, 사용방법 역시 사용용도에 따라 바람직한 방법으로 사용하는 것이 좋다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 옻나무 추출물 제조

실험에 사용한 시료는 시그마사에서 구입하였고, 마우스는 4주 내지 5주령 BALB/c를 다물회사(Damul Science, 대전유성)에서 구입하여 사용하였다.

옻나무로부터 에탄올 조추출물을 추출하고, 그 추출물을 더욱 정제하였다. 옻나무 에탄올 조추출물의 실리카겔 칼럼 및 크로마토그래피 조건은 다음과 같다.

칼럼 크기 : 지름 4 cm, 길이 28 cm, 칼럼 충진물 : 실리카겔

실리카겔 특성 : 22Å, 28 - 200 mesh

방법 : 실리카겔을 증류수에 침지하여 충분한 반응 시간(2 시간정도)을 준 다음 위와 같은 크기의 칼럼에 조심스럼게 충진한다. 충진시 공기가 들어가지 않고, 다양한 크기의 gel이 고르게 충진되도록 한다. 추출물을 넣을 부분만 남기고 완전 충진시킨다음 하루정도 물로 용출시킨다. 그 후 옻나무 에탄올 조추출물 5 g을 5 내지 7 ml의 99% 에탄올에 용해시킨 후 조심스럽게 겔에 얻고, 증류수, 30%에탄올, 99% 에탄올 및 5% 아세트산 용액으로 순차적으로 용출시킨다. 이 때 사용된 용출액의 양은 각각 300 ml이다. 여기에서 얻어진 용출순서에 따라 얻어진 옻나무(이하 "RVS"라 함) 유기용매 추출물을 E1, E2, E3, E4로 명명하여 실험에 사용하였다. 각 RVS 유기용매 수출물들은 동결건조하여 2.2, 0.5, 0.8 및 0.4 g를 수득하였다.

또한, RVS E1은 다시 무수 에탄올에 용해시켜 실리카겔 컬럼에 주입하고, 용출액으로 증류수를 이용하여 용출한 후 분획순서에 따라 3 부분으로 나누어 수득하여 동결건조를 통해 각각 F1, F2 및 F3로 분획한 후 실험에 이용하였다.

E1으로부터 F1, F2, F3 분획물을 얻는 조건은 다음과 같다.

칼럼 크기 : 지름 2.5 cm, 길이 60 cm, 칼럼 충진물 : 실리카겔

실리카겔 특성 : 22Å, 28 - 200 mesh

방법 : 상기와 동일한 방법으로 칼럼에 실리카겔을 충진하고, E1 1 g을 1 내지 2 ml의 99% 에탄올에 용해시킨 후 주입하여 증류수로 용출시킨다. 이 때 칼럼은 UV 검출기 및 수집기에 연결시켜 용출물의 분획을 용이하게 한다. 결과적으로 4-5개정도의 큰 피크를 얻을 수 있으며, 용출 중간 부분에 나오는 가장 큰 분획(선명한 노란색)을 수득하여 동결건조한 것을 F2라고 명명하였으며, F2 이전의 분획물을 F1, 이 후의 분획물을 F3로 명명하여 실험에 사용하였다. 수득한 RVS 수추출물 F1, F2 및 F3은 각각 동결건조하여 0.7, 0.5 및 0.4 g을 수득하였다.

실시예 2: 자유라디컬 포착활성 측정

Fe³⁺, Fe²⁺및 효소로부터 생성되는 라디컬에 대한 포착활성(scavenging activity)을 측정하였다. 시료로는 실시예 1에서 분리한 옻RVS 유기용매 추출물 및 옻나무 수 추출물을 사용하였다.

Fe³⁺에 의하여 생성되는 라디컬에 대한 포착활성은 디옥시리보스, 암모니움 티오시아네이트 및 DNA 닉킹 분석(DNA nicking assay) 등 세가지 방법으로 측정하였다.

디옥시리보스 및 암모니움 티오시아네이트 분석법은 공지된 방법에 따라 실시하였고(B. Halliwell, J.M. Gutteridge, O.I. Aruoma, Anal. Biochem. 165 (1987) 215-219 ; T. Takao, F. Kitatani, N. Watanabe, A. Yagi, K. Sakata, Biosci. Biotech. Biochem. 58 (1994) 1780-1783), DNA 닉킹법은 pBR322 플라스미드를 이용하여 실시하였다.

(1) 디옥시리보스 분석법

Fe³⁺에 의하여 생성되는 하이드록실 라디칼(^ㆍOH) 대한 포착활성을 디옥시리보스 변성으로 측정하였으며, 디옥시리보스의 변성정도는 티오바르티추릭산-말론알데하이드 부가물(이하 "TBA-MDA"라 함)의 생성율로 측정하였다.

도 1은 RVS 시료의 Fe³⁺-의존적으로 발생되는^ㆍOH 포착활성을 나타낸 것으로, 디옥시리보스의 변성정도를 TBA-MDA 생성율로 확인한 것이다. 그래프에서 ●은 RVS F1이고, ■는 RVS F2, ◆는 RVS F3이고, ○는 RVS E2이고, □는 RVS E3이고,◇는 RVS E4이다.

RVS 시료는 농도에 비례하여^ㆍOH의 생성을 억제하였으며, 특히 RVS F1, RVS F2 및 RVS E3가 다른 추출물들에 비하여 우수한 포착활성을 나타내었다. 반면에 RVS E2 및 RVS E4는 TBA-MDA 부가물 생성억제율이 다른 추출물에 비해 현저히 낮았다. 시료농도-활성 그래프로부터 TBA-MDA 부가물 생성을 50% 억제하는데 필요한 RVS 시료의 농도(concentration of each RVS sample required to inhibit 50% of formation; IC₅₀)를 측정하였다. 그 결과 RVS F1, RVS F2 및 RVS E3 각각의 IC₅₀은 1.11, 0.72 및 1.31 mg/ml로 나타났다.

(2) 암모니움 티오시아네이트 분석법

Fe³⁺에 의하여 생성되는^ㆍOH에 대한 포착활성을 암모니움 티오시아네이트 분석법으로 실험하여 리노레익산(linoleic acid) 산화를 측정하였다.

도 2는 암모니움 티오시아네이트 분석법으로 측정한 것으로^ㆍOH 유도성 지방산산화물의 생성 억제율을 나타낸 것으로, ●은 RVS F1이고, ■는 RVS F2, ◆는 RVS F3이고, ○는 RVS E2이고, □는 RVS E3이고, ◇는 RVS E4이다.

도 2에서 RVS 시료들은 농도에 비례하여 Fe³⁺-의존적 린올레익산 산화를 저해하였으며, 특히 RVS F1, RVS F2, RVS F3 및 RVS E3의 포착활성이 우수하였다.

(3) DNA 닉킹 분석법

위저드 플러스 SV 미니프렙(Wizard Plus SV Minipreps, Promega, Madison,WI)으로 DH5α에서 pBR322 플라스미드 DNA를 추출하였고, 상기 DNA 0.5 ug와 옻나무 시료를 각 농도별로 펜톤스 시약(Fentons reagents: 30 mM H₂O₂, 50 mM ascorbic acid 및 80 mM FeCl₃)에 첨가하여 최종부피 20 uL로 조절하였다. 37도에서 30분간 둔 다음 1% 아가로즈젤에 전기영동하여 DNA의 닉킹정도를 확인하였다.

도 3은 본 발명의 RVS 시료에 의한 라디컬 포착활성을 DNA 닉킹법으로 확인한 전기영동사진이다. 도 3a는 펜톤 반응액에 0.5 ug의 pBR322 플라스미드 DNA를 넣고 반응시킨 후 전기영동한 사진으로, 레인 1, 2, 3, 4는 각각 반응시간 0, 30, 20 및 10분에 따른 반응액을 전기영동한 것이고, 레인 M은 γ/HindIII DNA 마커이다. 도 3b는 RVS F1, RVS F2 및 RVS F3을 각각 DNA 닉킹 용액에 넣고 DNA 닉킹에 대한 억제효과를 확인한 것으로, 레인 1은 플라스미드 DNA이고, 레인 2는 RVS F1, 레인 3은 RVS F2, 레인 4는 F3을 처리한 결과이며, 레인 M은 γ/HindIII DNA 마커이다. 도 3c는 RVS E2, RVS E3 및 RVS E4 분획들을 각각 플라스미드 DNA nicking 용액에 처리하여 30분 후 DNA 닉킹정도를 확인한 것으로, 레인 1은 플라스미드 DNA이고, 레인 2는 RVS E2, 레인 3은 RVS E3, 레인 4는 E4를 처리한 것이며, 레인 M은 γ/HindIII DNA 마커이다.

pBR322 플라스미드 DNA를 닉킹-반응액에 넣고 시간별 닉킹정도를 확인한 결과 반응시간에 따라 슈퍼코일형태(Form I)의 DNA가 반응 10분후에 한가닥이 닉킹된 형태(FormII)를 나타내었고, 30분에 두가닥 모두 닉킹되어 리니어 DNA형(Form III)을 나타내었다(도 3a).

그러나 도 3b의 RVS 수추출물인 RVS F1, F2 및 F3을 처리한 경우 pBR322 플라스미드 DNA가 거의 슈퍼코일 형태를 유지하고 있었고, 극히 일부가 FormII 형태를 나타내어 DNA 닉킹이 억제되었음을 확인할 수 있었다.

옻나무 유기용매 추출물인 RVS E2, E3, 및 E4의 경우 DNA 닉킹현상이 일부 나타났으나, 대조구(도 3a)에 비하여 닉킹정도가 낮았으며, 그중 RVS E3의 DNA 닉킹 억제활성이 E2 및 E4에 비하여 우수하였다.

따라서, Fe³⁺에 의해 발생되는^ㆍOH의 포착활성을 측정한 결과 본 발명의 RVS 시료가 우수한 라디컬 포착효과를 나타내었으며, 이러한 포착효과는 RVS 시료별로 다양하게 나타나 F2 > F1 > E3 > F3 >> E2 = E4 순의 포착활성을 확인하였다.

실시예 3: 자유라디컬 포착활성 측정

Fe²⁺로부터 생성되는 라디컬에 대한 포착활성(scavenging activity)을 측정하였다. 시료로는 실시예 1에서 분리한 RVS 유기용매 추출물 및 RVS 수 추출물을 사용하였다.

Fe²⁺에 의하여 생성되는 라디컬에 대한 포착활성은 쥐 대뇌피질의 마이토콘드리아를 이용하여, Fe²⁺-의존적 티오바르비튜릭산 반응성을 가지는 기질 (thiobarbituric acid-reactive substances; 이하 "TBARS'라 함)의 생성을 억제하는 정도를 측정하였다.

쥐 대뇌 피질을 12%의 퍼콜(Percoll)을 함유한 4 mL 완충액(0.25 M sucrose,0.5 mM EDTA, and 10 mM Tris-Cl, pH 7.4)상에서 균질하고, 3.5 ml의 26% 페르콜과 3.5 ml의 40% 페르콜로 농도구배가 형성된 용액에 혼합하여 5분간 30,000 x g에서 원심분리하였다. 마이토콘드리아가 다량 존재하는 분획을 수득한 다음 PBS 용액에 현탁하고, 현탁액의 단백질 양을 로우리 방법(O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randalr, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275)으로 정량하였다. 20 ug/ml의 시료를 100 ul 미토콘드리아 현탁액(3 mg protein/ml)에 혼합하고, PBS용액을 넣어 400 ul로 조절하였다. 이후 37도에서 10분간 반응시키고, 반응액(10 ul 2 mM ascorbic acid 및 10 ul 25 uM FeSO₄)에 첨가하여 지질 과산화반응을 유도하였다. 37도에서 30분간 반응 후 530 nm에서 흡광도를 측정하여 TBARS 과산화물의 생성량을 확인하였고(Q. Guo, B. Zhao, M. Li, S. Shen, W. Xin, Biochim. Biophys. Acta 1304 (1996) 210-222), 옻나무 추출물의 TBARS 과산화물의 생성 억제율을 환산하였다.

도 4는 RVS 시료의 포착활성을 나타낸 것으로, 지질 과산화반응 억제율로 나타내었다. 각 결과는 3회 반복 실시하여 확인한 것이며, **는 p < 0.01을 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, RVS를 처리하지 않은 A/Fe(II)는 다량의 TBARS 과산화물을 생성한 반면, RVS F1, F2, F3 및 E3는 다른 분획들에 비하여 TBARS 과산화물의 생성을 억제하였다. 특히 RVS F2의 TBARS 과산화물 생성억제활성이 우수하였다.

실시예 4: 자유라디컬 포착활성 측정

효소를 이용한 방법으로 RVS 추출물들의 포착활성을 측정하였다.

하이포잔틴/잔틴 옥시데이즈(hypoxanthine/xanthine oxidase; X/XO) 방법은 다음과 같다(N. Gotoh, E. Niki, Biochim. Biophys. Acta 1115 (1992) 201-207).

각 농도별 시료를 반응액(100 ul 30 mM EDTA (pH 7.4), 10 ul 30 mM hypoxanthine in 50 mM NaOH, and 200 ul 1.42 mM nitroblue tetrazolium)에 첨가하고, 5분 후 100 ul(0.5 U/ml) 크산틴 옥시데이즈를 첨가한 다음 50 mM 인산완충액(pH 7.4)을 총 반응량이 3 ml가 되도록 넣어주었다. 상온에서 20분간 반응시킨 다음 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5는 RVS 시료의 라디칼 포착활성을 효소를 이용한 방법으로 확인한 그래프로, 슈퍼옥사이드 음이온의 생성 억제율을 나타낸 것이다. 그래프에서 ●은 RVS F1이고, ■는 RVS F2, ◆는 RVS F3이고, ○는 RVS E2이고, □는 RVS E3이고, ◇는 RVS E4이다.

도 5에서 RVS 시료들은 슈퍼옥사이드 음이온에 대하여 포착활성을 나타내었으며, 특히 RVS F1 및 F2는 대조구에 대하여 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 78.2 ±5.4% 및 81.8 ± 5.3%로 각각 억제하였다.

실시예 5: 글루코스 옥시데이즈에 의해 매개된 라디칼로부터 세포방어 효과 측정

실시예 1의 RVS 시료를 반응성 산소종에 노출된 세포에 첨가하여 산화적 세포손상으로부터의 방어효과를 확인하였다.

먼저 단일 흉선세포를 10% FBS(HyClone, Logan, UT) 및 항생제가 함유된 RPMI 1640 배지에서 부유시켜 ml당 10⁶개의 세포가 포함되도록 조정한 후 35-mm 배양용기 및 96웰 배양용기에 각각 2 ml 및 100 ul씩 분주하였다. 옻나무 시료를 처리하기 직전 배지를 0.5% FBS가 함유된 RPMI1640으로 교체하고, 글루코스/글루코스 옥시데이즈(G/GO)를 처리하여 배지내에^ㆍOH가 생성되도록 유도하였다(M. Michikawa, K.T. Lim, J.G. McLarnon, S.U. Kim, J. Neurosci. Res. 37 (1994) 62-70). 최종적으로 하이드록실 라디칼에 의한 세포손상과 그에 대한 시료의 억제효과를 MTT 방법을 통하여 알아보았다(T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63)

상기 실험에서의^ㆍOH는 27.75 mM D-glucose 및 20 mU/ml glucose oxidase(G/GO 시스템)으로부터 생성되었다. 먼저 96웰 배양용기에 분주된 흉선세포를 본 시스템에 다양한 시간동안 노출시킨 다음 PBS에 ml당 5 mg으로 용해된 MTT 10 ul를 각 웰에 첨가하고, 37도에서 4시간 동안 더 반응시켰다. 최종 단계로 70 ul의 이소프로판올을 각 웰에 첨가한 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6은 RVS 시료의 라디칼 소거활성에 의한 흉선세포 생존율의 증가를 나타낸 것이다. 결과에서 나타낸봐와 같이 흉선세포를 G/GO 시스템에 4시간 노출하였을 경우 생존율이 약 51.6%로 떨어졌으나, RVS 시료 처리구에서는 생존율이 크게 증가됨을 알 수 있었다. 특히 RVS F1, F2 및 E3을 처리한 경우 흉선세포의 생존율이 51.6%에서 79.4 ±4.6, 84.3 ± 5.7 및 75.6 ±6.2%으로 각각 증가되었다.

상기 실험들에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 RVS 추출물은 라디칼특히^ㆍOH 및 슈퍼옥사이드 음이온에 대하여 우수한 포착활성을 가지며, RVS 추출물 중 수추출물인 F2의 활성이 가장 우수하였다.

실시예 6: 세포독성 측정

RVS 시료를 세포에 처리하였을 때 DNA 합성 및 세포생존율에 미치는 영향을 실험하였다.

배양 흉선세포에 T 림프구 유사분열원질인 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 ml당 5 ug되게 처리한 다음 RVS 시료를 여러 농도로 첨가하였다. 배양 24시간째에 ml당 1 uCi의 [methyl-³H]티미딘(Amersham Pharmacia Biotech)을 첨가하여 8시간 후 흉선세포내 tritium 흡수 함량을 LSC(liquid scintillation counter; Packard Instrument Co.)를 이용하여 측정하였다.

또한 여러농도의 RVS 시료를 흉선세포에 처리한 후 MTT를 이용하여 RVS 시료에 대한 흉선세포의 직접적 세포독성을 측정하였다. 세포독성은 하기 계산식으로 환산하였다.

세포독성% = [(A대조군 - A시료처리군)/A대조군] x 100

도 7은 RVS 시료의 DNA 합성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며, 도 8은 RVS 시료의 세포독성을 측정한 것으로서 각 그래프에서 ●은 RVS F1이고, ■는 RVS F2, ◆는 RVS F3이고, ○는 RVS E2이고, □는 RVS E3이고, ◇는 RVS E4 처리구이다.

대부분의 RVS 시료에서 흉선세포의 콘카나발린 A 유도성 DNA 합성에 대한 억제효과를 관찰할 수 있었으나, 특히 RVS E3의 억제효과가 가장 높게 나타났다.

또한 RVS 시료 수 추출물인 F1, F2 및 F3은 세포에 처리하였을 때 강력한 항산화 및 유사분열원질 유도성 DNA 합성에 대한 억제효과를 보여준 100 ug의 농도에서는 어떠한 세포독성도 유발되지 않는 것으로 나타났다. 그러나 유기용매 추출물의 경우에는 흉선세포에 대한 세포독성이 75 ug 수준까지는 나타나지 않았으나 100 ug에서는 나타났으며, 그 중에서도 E3의 경우 높은 세포독성이 관찰되었다. 이러한 결과는 RVS 수 추출물은 강한 항산화 활성을 가지면서도 세포독성은 나타내지 않으며, 유사분열원질 유도성 세포분열 또한 억제시키는 것을 의미한다. 반면 RVS 유기용매 추출물은 낮은 항산화 활성과 높은 세포분열 억제효과가 있지만 거기에는 흉선세포에 대한 직접적 세포독성작용이 있는 것으로 사료된다.

실시예 7: 세포자살 억제효과 측정

RVS 시료의 세포자살 억제효과를 측정하였다.

(1) DNA 단편화 측정

생쥐로부터 분리된 단일 흉선세포를 RVS 시료, 0.5 % FBS, 5 mU/ml 글루코스 옥시데이즈 및 27.75 mM 글루코스가 처리된 RPMI 1640 배양액에 분주한 후 35 mm 배양용기에서 배양하였다. 그 후 2 x10⁶흉선세포를 500 ul의 1% NP-40, 1% SDS 및 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 조성된 세포분해용액에 넣고 1시간동안 65도에서 반응시켜 DNA를 추출한 후 2% 아가로스 젤상에서 전기영동으로 DNA 단편화를 관찰하였다.

도 9는 RVS F1 및 RVS F2를 각각 처리한 흉선세포의 게놈 DNA 전기영동사진이다. 레인 1은 대조구이고, 레인 2는 글루코스/글루코스 옥시데이즈 처리구이고, 레인 3은 글루코스/글루코스 옥시데이즈 및 ml당 100 ug의 RVS F1 처리구이고, 레인 4는 글루코스/글루코스 옥시데이즈 및 ml당 100 ug의 RVS F2 처리구이다. 도 9에서 글루코스/글루코스 옥시데이즈만을 처리한 경우 현저한 DNA 단편화가 관찰되었으나(레인 2), 여기에 RVS 수추출물 F1 (레인 3) 또는 F2 (레인 4)를 처리했을 경우 세포자살에 의해 나타나는 DNA 단편화가 크게 억제되는 것을 볼 수 있었다.일반적으로 DNA 단편화는 세포자살의 전형적인 특징으로서 본 발명의 RVS F1 및 F2에 의해 라디칼 유도성 DNA 단편화가 억제된다는 것은 산화적 스트레스에 의한 정상세포의 과다한 세포자살을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

(2) TUNEL법

TUNEL법은 공지의 방법(W. Gorozyca, J. Gong, B. Ardelt, F. Traganos, Z. Darzynkiewicz, Cancer Res. 53 (1993) 3186-3192)을 따라 수행하였다.

상기와 같이 라디칼 및 옻나무 시료에 처리된 흉선세포에 0.3%의 포름알데히드(pH 7.5)를 1시간동안 처리하여 세포를 고정시킨 다음 PBS용액으로 세척하고, 70 %의 에탄올로 현탁한 후 -20도에 정치시켰다. 1시간 후 세포를 PBS용액으로 세척한 다음 30 mM Tris-HCl(pH 7.2), 140 mM sodium cacodylate, 1 mM CoCl₂, 0.05 mg/ml BSA, 0.1 mM DTT, 7.5 U TdT 및 0.4 nM FITC-표지된 dUTP이 들어있는 TdT 완충액으로 37도에서 반응시켰다. 반응 30분 후 세포를 다시 PBS용액으로 세척하고 500 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포관찰용 슬라이드에 고정시킨 후 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 세포내 FITC 염색정도를 관찰하였다.

도 10은 TUNEL 방법에 의한 흉선세포의 FITC 형광염색 정도를 나타낸 것으로, 사진 a는 대조구이고, b는 글루코스/글루코스 옥시데이즈 처리구이고, c는 글루코스/글루코스 옥시데이즈 및 RVS F2 처리구이다. 사진에서 화살표는 FITC-dUTP로 염색된 즉, 라디칼에 의한 자살된 상태의 세포를 나타낸다. 아무것도 처리하지 않은 처리구의 세포는 대부분 FITC에 대한 염색이 나타나지 않았으나, 글루코스/글루코스 옥시데이즈 처리구에서는 많은 세포가 염색됨으로서 라디칼에 의한 세포자살이 일어났음을 알 수 있었다. 반면 글루코스/글루코스 옥시데이즈에 노출된 세포에 RVS F2를 처리한 경우 극히 일부의 세포만이 FITC 염색을 보임으로서 옻나무 수추출물 F2의 라디칼 유도성 세포자살에 대한 현저한 억제효과를 확인할 수 있었다.

실시예 8: RVS F2의 분광분석

가장 우수한 항산화 활성을 나타낸 RVS F2에 대한 분광분석을 실시하여 주된 화합물을 동정하였다.

RVS F2를 역상 HPLC(model 2690, 996-photodiode array detector(Waters Co.), Bondapak C18: 125Å 10 mm, 3.9 x 300-mm column)에 주입하고, 아세토나이트릴 농도구배로 크로마토그래피를 실시하였다. 각 분획내 화합물은¹H-NMR 및¹³C-NMR 스펙트럼(Varian Unity Plus NMR: 300/75 MHz, 400/100 MHz) 및 LC-MS로 분석되었다.

크로마토그래피 결과 도 11에 나타난 바와 같이 5개의 화합물이 검출되었다. 이를 분광분석기로 분석한 결과 화합물 1은 동정되지 않았으며, 화합물 2는 푸스틴(fustin)으로, 화합물 3은 퀘르세틴(quercetin)으로, 화합물 4는 부테인(butein)으로, 화합물 5는 설푸레틴(sulfuretin)으로 동정되었다.

상기에 언급한바와 같이, 본 발명의 옻나무 추출물은 무독한 천연추출물로 반응성 산소종을 포착한다. 특히 옻나무 수 추출물은 우수한 항산화효과 및 세포자살 방지효과를 나타내어 반응성 산소종에 의해 매개되는 질병을 예방 및 치료하기 위한 용도로 사용할 수 있다.

Claims (5)

1. (a) 옻나무를 분쇄하는 단계;

   (b) 분쇄물을 에탄올에 침지하여 추출하는 단계;

   (c) 에탄올 추출물을 여과하여 여과물을 수득하는 단계;

   (d) 여과물을 저온에서 정치하여 노란색을 띄는 층을 회수하는 단계;

   (e) 상기 회수물을 동결건조하여 에탄올 조 추출물을 수득하는 단계;

   (f) 옻나무 에탄올 조추출물을 에탄올에 녹인 혼합한 다음 실리카겔 컬럼에 주입하고, 증류수 및 유기용매를 순차적으로 주입하여 분획물을 수득하는 단계; 및

   (g) 상기 분획물을 동결건조하는 단계를 포함하는 옻나무 추출물 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 (g) 단계 이후에 건조된 분획물을 다시 에탄올에 용해시켜 실리카겔 컬럼에 주입하고, 증류수를 주입하여 분획물을 수득하는 단계 및 상기 분획물을 동결건조하는 단계를 더욱 포함하는 옻나무 추출물 제조방법.
3. 제 1항 또는 2항의 방법으로 제조된 옻나무 추출물.
4. 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된 옻나무 추출물을 포함하는 항산화 조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된 옻나무 추출물을 포함하는 항암 조성물.