KR20030073833A

KR20030073833A - Ｐｅｐ-27 펩타이드의 친수성 부위를 다른 아미노산으로치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 및 그를포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20030073833A
Application number: KR1020020013580A
Authority: KR
Inventors: 최철희; 이동건; 함경수
Original assignee: 학교법인조선대학교
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2002-03-13
Publication date: 2003-09-19
Also published as: KR100517055B1

Abstract

본 발명은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)에서 세포사망 프로그램(apoptosis)과 관련이 있는 것으로 알려진 펩타이드인 Pep²⁷의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환시켜 제조한서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드 및 그를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 합성 펩타이드는 세포독성이 없고 탁월한 항암 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｐｅｐ-27 펩타이드의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 및 그를 포함하는 약학적 조성물{Peptides with increased hydrophobicity by substituting one or more amino acids of Ｐｅｐ-27 peptide and pharmaceutical compositions containing thereof}

본 발명은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)에서 세포사망 프로그램(apoptosis)과 관련이 있는 것으로 알려진 펩타이드인 Pep²⁷의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환시켜 제조한서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드 및 그를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 성공적인 암치료에 대한 장해 요인 중 하나로 종양세포의 다약물내성(multi-drug resistance, MDR)기전의 획득을 들 수 있다. 이러한 다약물내성은 P-당단백(P-glycoprotein)과 다약물내성 관련 단백질(MRP)을 코드하는 각각의 유전자인 인간MDR1이나MRP유전자의 과발현(overexpression)에 의해 매개된다. 상기 P-당단백이나 MRP 단백질이 과발현되면 세포내의 약물축적을 감소시켜 암세포로 하여금 다약물내성의 표현형을 갖게하는 것이다. 현재까지 많은 소수성 펩타이드(hydrophobic peptide)들이 P-당단백의 기질(substrate)이라고 알려져 있다. 따라서 소수성 펩타이드를 이용하여 화학요법감작제의 개발이 가능하다(Sharom, F. J., et al.,Biochem. J.,1998, 333, 621-630).

한편, 연체동물의 일종인 돌라벨라 아우리쿨라리아(Dolabella auricularia)에서 분리한 돌라스타틴 10(dolastatin 10) 펩타이드는 항암활성을 가지고 있으며, 쥐와 인간의 백혈병세포에서 상기 펩타이드에 대한 내성에 P-당단백이 관여한다고 알려져 있다(Toppmeyer, D. L.,Biochem. Pharmacol.,1994, 48, 609-612). 뿐만 아니라 최근에는 두 개의 소수성 펩타이드인 리버신 121 및 205(reversin 121 및 205)가 P-당단백과 반응하여 내성세포에서 약물의 축적을 약물 감수성 세포수준으로 증가시킨다고 보고된 바 있다(Sharom, F. J., et al.,Biochem. Pharmacol.,1999, 58(4):571-586).

이에, 본 발명자들은 일반적이거나 약물내성이 있는 암세포에 효과적인 항암활성을 나타내는 새로운 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 신규한 펩타이드를 합성하였으며, 이와 같이 합성된 합성 펩타이드의 항생, 항암활성 및 세포 독성(용혈활성)을 확인하여 상기 합성 펩타이드가 항생제 및 항암제로 유용하게 이용될 수 있는 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가되고 세포독성이 없으며 우수한 항암 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 Pep²⁷펩타이드 유래의 유사체 펩타이드의 모식도이고,

도 2는 본 발명의 합성 펩타이드를 인간 백혈병 세포주(Jurkat)에 처리한 후, 동초점의 레이저 스캐닝 현미경(좌) 및 위상차 현미경(우)으로 시간 경과에 따른 펩타이드의 분포양상을 관찰한 결과를 나타내는 사진이고,

A : 펩타이드 30분 처리군,

B : 펩타이드 60분 처리군,

C : 펩타이드 120분 처리군

도 3은 본 발명의 합성 펩타이드가 세포사멸(apoptosis) 및 막 보전상태에 미치는 영향을 유세포 분석으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이고,

왼쪽: 이중염색(Annexin V-FITC[FL1-H] 및 PI[FL2-H]),

중앙: 아넥신 V-FITC 염색,

오른쪽: PI 염색,

A: 대조군, B: 에토포사이드(etoposide) 처리군,

C: 멜리틴(melittin) 처리군, D:서열번호 2로 기재되는 펩타이드 처리군

도 4는 본 발명의 펩타이드를 인간 백혈병 세포주(Jurkat)에 처리한 후 시간과 농도에 따른 인산효소 활성의 변화 양상을 나타내는 그래프이다.

A: 펩타이드를 5분에서 60분 처리,

B: 펩타이드를 12.5 μM에서 62.5 μM로 처리

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 폐렴구균에서 성분 시스템 VncR/S를 거쳐 신호전달을 통해 세포사망 프로그램(apoptosis)을 시작하는 것으로 알려진 펩타이드인서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역을 증가시킴으로써 양친화성 구조를 갖는 합성 펩타이드이다.

본 발명의 펩타이드는 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법 등을 사용하여 제조될 수 있다(Merrifield, R. B.,J. Am. Chem. Soc.,1963, 85, 2149). 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 모든 합성 펩타이드가 될 수 있으며,서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위에 존재하는 11번째 아미노산인 세린과 13번째 아미노산인 글루타민을 트립토판, 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 구성된 군으로부터 선택된 소수성의 아미노산으로 치환하여 제조하는 것이 바람직하며, 각각 트립토판으로 치환하여 제조된서열번호 2로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체인것이 더욱 바람직하다(도 1참조).

본 발명자들은 본 발명의 펩타이드를 분리·정제한 후 그 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로서열번호 2로 기재되는 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 어떤 종류의 암세포에도 효과적으로 사용될 수 있으며, 특히 유방암, 위암 및 림프종에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체가 항암제로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 펩타이드의 항암 활성을 측정하였다. 항암 활성은 50% 생육 저해농도(50% inhibitory concentration, 이하 "IC₅₀"라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다.

본 발명의 합성 펩타이드가 암세포에 대한 항암 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 인간의 급성 골수 백혈병 세포주, 전골수성 백혈병 세포주, 유방암 세포주, 위선암 세포주 및 T-세포 백혈병 세포주를 대상으로 항암 활성을 측정한 결과,서열번호 2로 기재되는 본 발명의 합성 펩타이드는 비교군으로 사용한 Pep²⁷펩타이드에 비해 강한 항암 활성을 나타냄을 확인하였다(표 1참조).

아울러, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 약물 내성을 가진 암세포에 대해서도 항암 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 약물에 민감한 인간의 급성 골수 백혈병 세포주, P-당단백을 과발현하는 세포주 및 다약물내성 관련 단백질을 과발현하는 세포주를 대상으로 항암 활성을 측정한 결과,서열번호 2로 기재되는 본 발명의 합성 펩타이드는 비교군으로 사용한 Pep²⁷펩타이드에 비해 탁월한 항암 활성을 나타냄을 확인하였다(표 2참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 합성 펩타이드를 인간 백혈병 세포주인에 처리한 후, 시간경과에 따른 펩타이드의 세포내 분포 및 작용부위를 관찰한 결과, 시간이 지남에 따라 본 발명의 펩타이드가 세포내로 확산되는 것을 확인하였다(도 2참조).

아울러, 본 발명의 펩타이드를 인간 백혈병 세포주에 처리한 후 세포사멸과 막보전상태를 유세포 분석을 통하여 관찰한 결과, 세포막의 큰 손상 없이 세포사멸을 초래함을 확인하였다(도 3참조).

또한, 본 발명의 펩타이드를 인간 백혈병 세포주에 처리한 후 펩타이드의 처리 시간과 처리 농도에 따른 인상효소 활성의 변화 양상을 관찰한 결과, 처리 시간과 농도가 증가함에 따라 인산효소의 활성도 증가하는 것을 확인하였다(도 4참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드는 탁월한 항암 효과를 나타내므로 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체의 유효용량은 0.1∼2 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1~3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드 및 그의 유도체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명자들은 소수성 영역이 증가되어 양친화성 구조를 갖는 항암 펩타이드를 합성하기 위하여,서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켰다. 구체적으로,서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 11번째 아미노산인 세린과 13번째 아미노산인 글루타민을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 펩타이드를 제조하였다(도 1). 펩타이드의 합성에는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였다(Merrifield, R. B.,J. Am. Chem. Soc.,1963, 85, 2149). 본 발명에서는 카르복실말단이 -NH₂형태인 펩타이드는 링크 아미드(Rink Amide) MBHA-레진(Resin)을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin(SynPep Corporation)을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장은 N-hydroxybenzo triazole(HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide (DCC)법에 의하였다. 먼저, 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘(piperidine)/NMP(N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-페놀(phenol)-티오아니솔(thioanisole)- H₂O-트리이소프로필실란(triisopropylsilane) (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol/vol) 용액을 가하고 2 내지 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile) 농도구배(gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 칼럼(Delta Pak, C₁₈300Å, 15, 19.0mm ×30 cm, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성된 펩타이드를 6 N-HCl로 110℃에서 가수분해시켜 잔사를 감압농축한 후, 0.02 N-HCl에 용해시켜 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 이렇게 조성된 펩타이드의 순도를 확인한 결과 95%의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법(Hill, et al .,Rapid Commun. Mass Spectrometry,1991, 5, 395)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로서열번호 2로 기재되는 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

<실험예 1> 합성 펩타이드의 항암 활성 측정

<1-1> 생육 최소저해농도(IC ₅₀ ) 측정

상기실시예 1에서 제조된 본 발명의 합성 펩타이드의 항암 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인간의 폐암 세포주인 Calu-6와 위암 세포주인 SNU 601, 및 T 세포 림프종인 Jurkat 세포주를 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 우선 2×10⁵세포/㎖ 농도의 각 세포주 90 ㎕씩을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이때, 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 잘 흔든 후 3일 동안 CO₂배양기에서 배양하였고, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔을 0.04 N HCl-이소프로판올 용액 100 ㎕로 잘 용해시켜 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성 펩타이드를 70 μM을 최대농도로 2배씩 희석하여 처리한 웰의 흡광도 값을 합성 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 본 발명의 펩타이드의 항암 활성도를 나타내었다(표 1).

펩타이드	50% 생육저해농도(IC₅₀)
펩타이드	AML-2	HL-60	Jurkat	SNU-601	MCF-7
Pep²⁷	70<	70<	70<	70<	70<
서열번호 2의 합성펩타이드	29	20	23	25	10

그 결과,표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 합성 펩타이드는 실험한 모든 세포주에 대해서 비교군으로 사용한 Pep²⁷보다 각 세포주에 따라 3배에서 7배까지 더 강하게 항암 활성이 나타남을 확인하였다.

<1-2> 약물내성을 가진 암세포에 대한 세포독성 측정

본 발명의 합성 펩타이드가 약물내성을 가진 암세포에 대해서도 항암 활성 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 인간의 급성 골수 백혈병 세포주인 AML-2, 약물에 민감한 AML-2 세포주, P-당단백 과발현 내성 AML-2 아세포주인 AML-2/D100 및 다약물내성관련 단백 과발현 내성 AML-2 아세포주인 AML-2/DX100 등을 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 우선 2×10⁵세포/㎖ 농도의 AML-2/WT, AML-2/D100, AML-2/DX100 세포주 90 ㎕씩을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 잘 흔든 후 하룻밤 동안 CO₂배양기에서 배양한 후 본 발명의 합성 펩타이드를 각각 20 ㎕씩 처리(17.5 μM, 35 μM 및 70 μM)하고 37℃에서 3일간 배양하였다. 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT(3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5- diphenyl-2H-tetrazolium bromide)-포르마잔을 0.04 N HCl-이소프로판올 용액 100 ㎕로 잘 녹여서 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 합성 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 본 발명의 합성 펩타이드의 항암 활성도를 나타내었다 (표 2).

펩타이드	70 μM	35 μM	17.5 μM
펩타이드	AML-2/WT	AML-2/D100	AML-2/DX100	AML-2/WT	AML-2/D100	AML-2/DX100	AML-2/WT	AML-2/D100	AML-2/DX100
Pep²⁷	89.7	68.95	100	93	84.35	100	93.4	98.3	98.7
서열번호 2의 합성펩타이드	0	0	0	30.4	49.9	100	83.2	91.95	100

그 결과,표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 합성 펩타이드는 실험한 모든 세포주에 대해서 Pep²⁷펩타이드보다 더 강하게 항암 활성이 나타남을 확인하였다. 본 발명의 합성 펩타이드는 17.5 μM 농도에서는 항암 활성을 나타내지 않았으나 농도가 증가할수록 급격한 항암 활성을 나타내어 70 μM 농도에서는 암세포의 성장을 완전히 억제하는 강한 항암 활성을 나타내었다.

<1-3> 시간경과에 따른 펩타이드의 세포내 분포 및 작용부위 확인

본 발명자들은 인간 T-세포 백혈병 세포주인 Jurkat 세포주에 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드를 처리한 후 시간 경과에 따른 세포주의 막 보전상태를 확인하기 위하여 동초점의 레이저 스캔닝 현미경 (confocal laser scanning microscopy)을 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, Jurkat 세포주를 커버 글래스 상에서 키운 후 하룻밤동안 FITC(fluoresceinisothio cyanate)를 붙인 본 발명의 펩타이드를 처리하였다. 30분, 60분, 120분 동안 각각 처리한 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)를 사용하여 15분 동안 고정시켜 글래스 슬라이드에 봉입(mount)을 하였다. 표지된 펩타이드의 분포는 Leica DAS uplight microscope에 연결된 Leica TCS 4D (Leica Lastertech. GmbH, Heidelberg, Germany)를 사용하여 가시화하였다.

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드가 세포내 원형질막 전체에서 시간이 흐름에 따라 내부로 확산 분포되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 본 발명의 펩타이드가 세포막을 투과하여 항암 활성을 나타낸다는 것을 의미한다(도 2).

<1-4> 아포프토시스(apoptosis) 세포사멸과 막 보전 측정

본 발명자들은 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드가 인간 백혈병 세포주인 Jurkat 세포의 세포사멸과 막 보전 상태에 미치는 영향을 확인하기 위하여 유세포 분석(flow cytometry) 실험을 수행하였다. 구체적으로, 1×10⁵세포/㎖ 농도의 Jurkat 세포에 12.5 μM 과 62.5 μM의 본 발명의 합성 펩타이드를 처리하여 혼합한 후 4시간 동안 반응시켰다. 대조군으로는 항암요법제인 에토포사이드(etopside)와 강한 항암 활성을 가진 멜리틴(mellitin)을 사용하였다. 상기 혼합액을 인산염 완충용액으로 3번 세척한 다음 결합 완충액(binding buffer, 10 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂) 400 ㎕에 재현탁 시키고 10 ㎕의 아넥신(Annexin) V-FITC(MedSystems Diagnostics GmbH, Australia)를 넣어 10분 동안 상온에서 배양한 후, 1 μM의 PI(propidium iodide)에 노출시켰다. 유세포 분석은 FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행하였다.

그 결과, 양성대조군인 에토포사이드 100 μM 에서는 아포프토시스 세포사멸은 초래하였으나 세포막 손상은 적었다. 반면 멜리틴 12.5 μM에서 아포프토시스 세포사멸은 적었으나 세포막손상이 심하였다. 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드 12.5 μM를 Jurkat 세포에 처리한 경우 에토포사이드 100 μM과 비슷한 정도로 세포막의 큰 손상 없이 아포프토시스 세포사멸을 초래하였고, 62.5 μM의 높은 농도에서도 세포막의 큰 손상 없이 아포프토시스 세포사멸을 현저하게 초래하였다(도 3). 이상의 결과로부터 본 발명의서열번호 2의 항암작용은 메리틴과는 달리 세포막의 손상보다는 아포프토시스 세포사멸 기전을 통해서 나타남을 알 수 있었으며, 에토포사이드의 아포프토시스 세포사멸 초래 효능은 약 9배정도 강함을 알 수 있었다.

<1-5> 시간 및 농도에 따른 인산효소활성의 확인

본 발명자들은 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드를 인간 백혈병 세포주인 Jurkat 세포주에 처리한 후, 펩타이드의 처리 시간과 처리 농도에 따른 인산효소 활성의 변화 양상을 관찰하였다. 구체적으로, 펩타이드가 처리된 Jurkat 세포를 원심분리한 후 트리스염 함유 완충용액(tris-bufferd saline, pH 7.4)으로 세척하였다. 상기 세포를 보관 완충용액(25 mM Tris-Hcl, pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol, 2 mM EDTA, 0.1 mM phenylmethylsufonyl fluoride)에서 초음파 분쇄한 후 Sephadex G-25 컬럼에 로딩하였다. 여기서 받은 시료를 세린/트레오닌 인산효소 분석 키트(Ser/Thr Phosphatase Assay kit, Promega, USA)로 분석을 한 후 파장 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드의 처리 시간과 농도가 증가함에 따라 세린/트레오닌 인산효소(Ser/Thr Phosphatase)의 활성도 증가하는 것을 확인하였다(도 4).

<실험예 2> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의서열번호 2로 기재되는 펩타이드를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 항생 펩타이드는 랫트에서 5 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드는 일반 암세포뿐만 아니라 약물에 민감하거나 약물에 대한 내성이 있는 암세포에 대해서도 탁월한 항암 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항암용 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

서열번호 1로 기재되는 Pep²⁷펩타이드의 친수성 부위를 소수성의 다른 아미노산으로 치환하여 소수성 영역이 증가된 펩타이드 또는 그의 유도체.
제 1항에 있어서, 소수성 아미노산은 트립토판, 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 그의 유도체.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는서열번호 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 그의 유도체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 암은 유방암, 위암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.