KR20030073161A - 웰 또는 핀타입의 체외 대량, 고속의 단백질 상호작용검색 시스템 - Google Patents

Abstract

본 연구는 단백질의 신규 기능 연구에서 단백질 간의 상호작용 여부를 웰타입 또는 핀타입의 방식을 이용하여 고속, 대량으로 측정할 수 있는 신기술을 확립하여 특정 단백질과 상호 작용하는 단백질 결합 파트너(Binding partner)들을 고속으로 찾아내는 방법 (Well or Pin typein vitroHighthroughput Protein Interaction detection system) 에 관한 것이다.

Description

웰 또는 핀타입의 체외 대량, 고속의 단백질 상호작용 검색 시스템 {Well or Pin type In vitro Highthroughput Protein Interaction detection system}

기능유전체학 (Functional Genomics) 연구에 있어서 단백질 간의 결합 여부를 측정하고자 하는 연구는 이전부터 상당량 진행되어 많은 방법들이 개발되어 왔는데, 대표적인 방법이 효모 2 하이브리드 (yeast Two hybrid) 방법이다. 이 방법은 본 발명과 유사하게 체외(In vitr o)가 아닌 효모 세포안에서 택이 붙어 있는 두 단백질간의 상호 작용을 보고자 하는 것으로 효모내에서 유전적으로 조작된 단백질간의 상호작용 여부를 분석하는데, 짧은 시간에 대량의 시료를 분석할 수 있다는 장점이 있으나, 여러 세포 기능 관련 단백질들이 정상적으로 세포질에서 핵으로 이동하기 어렵고, 일반적으로 위양성 (false positive)이 많다는 단점을 가지고 있다.(Rain et al., 2001 Nature 409 p211~215; Uetz et al., 2000 Nature 403 p623~627; Fields et al., 2000 Nature Biotech. 18 p1257~1261) 이외에도 항체를 이용하는 면역 침전법( IP ;Immuno-Precipitation), 단백질을 항체로서 사용하는 파 웨스턴 (Far Western)방법, 바이아코어(Biacore)를 활용하는 방법 등이 있는데 면역침전법은 정확성이 높으나 특정 단백질에 대한 항체를 일일이 제작해야 하고, 파웨스턴 (Far Western) 방법은 항원과 항체간 결합 정도인 K_D=10^-5이하의 단백질간 결합력이 매우 큰 것만 검색할 수 있으며, 바이아코어 (Biacore)방법은 정제된 단백질만을 사용해야 하며 한번에 두가지 단백질만을 검색할 수있고 비용이 많이 든다는 단점이 있다.

현재까지의 단백질 상호작용 검색기술과 본 특허의 기술의 장단점을 비교하면 다음과 같다.

표 1. 고속, 효율(Highthroughput), 비용, 소요 기간 측면에서 본 단백질 상호 작용 측정 기술의 장단점 비교

단백질 상호작용 측정 기술	처리 속도	동시 처리 용량	정확도	측정 비용 효율 (적을 수록 높은 효율)	세팅 정도(샘플 준비 기간 등)
1. Yeast Two hybrid	○○○○○○○	○○○○○○○	○○	○○	○○○
2. Biacore	○	○	○○○○○○	○○○○○	○○○○○○
3. Far Western	○○○○	○○○○○	○	○	○○
4. FRET/BRET	○	○	○○○○	○○○○○○	○○○○
5. 면역 침전법	○	○	○○○	○○	○○
6. 고속, 대량 면역 ELISA	○○○○○○	○○○○	○○○○	○○	○○○

위 표에서 보이는 바와 같이 현재 하루마다 새로 업데이트되는 유전자 정보 속에서 대량, 고속으로 단백질간의 상호 작용 여부를 검색해야 하는데 대량 측정이 가능한 시스템은 정확도에서 큰 문제점을 안고 있고 또 정확성이 높은 시스템은 대량, 고속 측정이 어려운 난점이 있다. 이에 본 특허는 기존 기술의 처리 속도, 용량, 정확도, 비용 측면에서 각 기술이 가지는 한계성을 극복하자는 것이며, 정확성과 속도의 장점을 갖는 시스템에 관한 것이다

본 발명은 여러 단백질간의 결합 여부를 웰타입 또는 핀타입을 이용하여 간편하며 고속으로 측정하는 시스템을 개발하고자 하는 것이다.

도 1은 체외에서 웰 타입으로 단백질 상호작용을 검색할 수 있는 시스템을 도식적으로 나타낸 모식도

도 2와 도 3은 위의 검색 시스템을 핀타입에 적용하는 경우를 나타내는 모형을 나타내는 모식도

도 3은 웰 타입으로 단백질 결합을 측정한 실질적인 발색 결과 (100ng GST-CDK4코팅된 웰에 His-p16과 His-Akt세포 파쇄액을 각각 0, 50, 100, 200, 300ul씩 넣은 뒤 ELISA방법으로 OD값 측정--> 네모 박스 안의 값이 측정값)

본 발명은 웰 타입과 핀타입의 두가지로 개발되었는데, 먼저 웰 타입에 대해 설명하면 다음과 같다.

1. 융합 단백질 (Fusion protein) 제조.

상호작용 여부를 검색하고자 하는 두 단백질을 각각 다른 택을 붙인 유전자 재조합 단백질을 만든다. 이때 웰에 최초에 코팅하는 단백질은 택이 없이도 코팅할 수 있으므로 반드시 택을 가질 필요는 없다. 하지만 첫번째 단백질과의 결합여부를 판단하고자 하는 두번째 단백질은 향후 항체를 이용하여 진단하거나 형광등을 이용해야 하므로 택(His tag, GST tag, Flag tag과 GFP 형광단백질 등)이 있어야 대량으로 검색할 수 있다.

2. 단백질 코팅

첫번째 단백질을 웰에 직접 코팅하는 것으로 폴리스타이렌 재질의 플레이트에 염기용액 상태에서 첫번째 단백질 용액을 넣고 4도에서 15시간정도 인큐베이션한다. 이때 정제된 단백질을 사용할 수도 있지만 택이 없는 단백질 샘플을 정제되지 않은 상태에서 세포 파쇄액 형태로 코팅을 한다. 이 경우 해당 단백질에 택을 붙이는 조작이 필요하지 않으나, 더 정확한 결과를 얻기 위해서는 택을 통한 정제가 필요하다. 해당 단백질에 택이 붙어 있는 경우 96웰 플레이트에 GST나 항체 등이 미리 부착된 것을 사용하여 정제를 할 수 있다.

3. 블로킹 (Blocking)

첫번째 단백질을 코팅한 뒤에 이후 과정에서 96웰 플레이트에 단백질들이 비특이적 결합 (Non-specific binding)을 할 수 있으므로 이를 방지하기 위하여 PBS 완충용액에 5% 탈지분유나 1% 소 혈장 알부민 (BSA ;Bovine serum albumin)을 용해시킨 녹인 블로킹 (Blocking) 완충용액을 사용하여 웰에 있는 기타 비 특이적인 단백질 결합 부위를 봉쇄한다.

4. 단백질 간 결합 유도

완충용액으로 5분씩 5회 이상 충분히 씻어 준뒤 2번째 단백질이 포함된 세포 파쇄액을 넣고 2시간 정도 상온에서 반응시켜 단백질 간 결합을 유도한다.

5. 단백질 간 결합 측정

만일 2번째 단백질에 His 또는 GST 택이 붙어있다면 각각 발색반응 효소가 컨쥬게이션 되어있는 His, GST 항체(HRP conjugated His tag 항체)로 발색반응을 통해 측정하며, 녹색 형광 단백질(GFP, Green fluorescence protein)등은 직접 형광을 측정한다.

6. 정확도 측정

하나의 96웰 안에 대조군(Control)과 이중 검증 방법 (double checking system)을 이용하여 결과의 신뢰도를 평가한다.

다음으로 핀 타입에 대해 설명하면 다음과 같다.

핀타입 방법은 웰 타입보다 속도와 간편성을 증진시킨 방법으로, 핀에 GST또는 Ni등 택(tag)을 붙여 제작한 뒤 GST 또는 Ni 이 융합된 단백질이 들어있는 세포 파쇄액에 담궈 첫번째 융합 단백질 만을 선택적으로 결합시킨다. 여러번의 세척을거친 다음, 결합 여부를 보고자 하는 두 번째 단백질이 들어있는 세포 파쇄액에 핀을 일정 시간 담구고 두 단백질간의 결합을 유도한다. 이때 두번째 단백질은 발색반응을 위한 효소를 결합시킨 융합 단백질 형태로 재조합 되어 있어야 한다. 이후에 핀을 꺼내 여러번 세척한 후 반응용액에 담구면 두번째 단백질이 첫번째 단백질과 결합되어 있는 웰에서만 발색 반응이 일어나게 되며, 발색 정도를 측정함으로써 결합 여부를 판단한다.

본 발명은 단백질 간의 상호 작용 여부를 웰타입이나 핀타입을 이용하여 고속으로 검색할 수있는 시스템에 관한 것이다. 실상 생명체에서 대부분의 기능을 수행하고 있는 것(Major playmaker)은 바로 단백질이며 따라서 단백질의 신규 기능 연구가 그 중요성을 갖게 되는데 단백질은 생체내에서 홀로 기능하는 것이 아니라 여러 다른 단백질과의 상호 작용을 통해 기능을 수행하는 것이 일반적이다.

따라서 단백질 상호 작용 측정은 단백질 신규기능 연구에 중요한 의미를 갖게되며 이는 단백질간의 결합을 통해 이루어 지게 된다.

이에 유전체 수준의 단백질간 결합을 측정할 수 있는 시스템들이 많이 개발되고 있으며, 본 발명도 이 범주에 들어간다고 할수있다.

본 발명은 세포 전체 단백질체(Proteome) 수준에서 단백질 간의 상호 작용 여부를 검색하기 위한 대량, 고속의 면역 측정법(Massive, parellel ELISA)에 관한 것이며 세포 전체 단백질체(Proteome) 수준에서 단백질 간의 상호 작용 여부를 검색하기 위한 시스템으로의 응용에 본 발명의 효과가 있다 하겠다.

Claims (4)

1. 두 단백질(혹은 한 단백질)을 유전자 재조합으로 His-택(tag), GST-택 혹은 GFP등과 융합된 형태(Fusion protein)로 제조하여 기존의 방법인 엘리사(ELISA)를 이용하여 웰 타입 형태로 고속으로 단백질간 결합 여부를 확인하는 방법.
2. 청구항 1에서의 웰 타입의 단백질간 결합 여부 확인 시스템.
3. Ni또는 GST등을 핀에 부착시켜 Ni또는 GST로 표지된 (택이 붙어 있는) 해당 단백질만을 선택적으로 정제하고 다음 단백질과의 결합을 유도한 뒤 효소 반응을 통해 두 단백질간 결합 여부를 측정할 수 있는 핀타입의 검색 방법.
4. 청구항 3에서의 핀 타입의 단백질간 결합 여부 확인 시스템.