KR20030067757A

KR20030067757A - 돼지 산자수 관련 ｄｎａ 표지인자

Info

Publication number: KR20030067757A
Application number: KR1020020000582A
Authority: KR
Inventors: 홍기창; 박성수
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2002-01-05
Filing date: 2002-01-05
Publication date: 2003-08-19
Also published as: KR100444160B1

Abstract

본 발명은 돼지 산자수(pig litter size) 관련 DNA 표지인자에 관한 것으로, 돼지의 에스토로겐 수용체 유전자(pig estrogen receptor gene)내에 돼지 품종간의 산자수를 결정하는 표지유전자 및 이를 이용하여 돼지 산자수를 결정하고 선별하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 큰 산자수를 가지는 돼지를 조기에 선발할 수 있어서 돼지를 경제적이고 효율적으로 육종할 수 있게 되는 뛰어난 효과가 있다.

Description

돼지 산자수 관련 ＤＮＡ 표지인자{Genetic marker for increased pig litter size}

본 발명은 돼지 산자수 관련 DNA 표지인자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지의 에스토로겐 수용체 유전자(pig estrogen receptor gene)내 돼지 품종간의 산자수를 결정하는 표지유전자 및 이를 이용한 돼지 산자수를 결정하고 선별하는 방법에 관한 것이다.

가축 육종의 목표는 산자수, 우유나 고기의 생산성, 육질 등의 경제형질을 개선하는 데에 있다. 가축의 개체마다 이러한 경제형질의 차이는 유전적 소양에 기인하는데 이와 연관된 유전자의 염기서열 다양성 분석이 가축육종의 새로운 장을 열고 있다.

최근에 경제 형질과 연관된 유전자 다양성(RFLP)과 연관성 (linkage disequilibrium)이 조사됨에 따라 산자수로 대표되는 번식형질의 개량을 가능케 해주고 있다(Georges et al., Genome Res. 6(10):907-921(1996)., Rohrer et al., J. Anim. Sci. 77:1318-1391(1999)). 면양에서는 FecB라는 유전자의 변이와 산자수 간의 연관성이 보고된 바 있고(Montgomery et al., J. Reprod. Fertil. 95: 895-901(1992), 돼지에서는 estrogen receptor (ER) 유전자를 이용하여 돼지의 산자수 증진에 관한 연구가 진행되고 있다(Rothschild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:201-205(1996)).

ER(estrogen receptor)은 동물세포의 핵 내에서 수용체 및 전사인자로서 기능을 수행하는데 estrogen과 결합하여 활성화되어 전사인자로서 대상유전자들의 발현을 조절함으로서 estrogen에 의한 번식생리 및 광범위한 생리현상을 매개한다. 잘 알려진 바와 같이 estrogen hormone은 배란, 수정 및 임신 등에 관여하기 때문에 이 기능을 매개하는 수용체 역시 이러한 기능들에 대해 동등한 역할을 할 것으로 생각된다. 그러나 현재까지 ER의 생리적 작용이 직접적으로 산자수에 영향을 준다는 연구결과는 알려진 바 없지만, ER 유전자의 돌연변이가 사람에서 자연유산과 관련성이 있다는 결과(Lehrer et al., Lancet 335(8690):622-624(1990)., Berkowitz et al., J. Obstet. Gynecol. 171(6):1579-1584(1994)), 형질전환 생쥐를 이용한 실험에서 ER 유전자가 불활성화된 수컷의 경우 정상적인 정자 형성과정이 이루어지지 못하였고, 암컷에 있어서도 자궁과 난소에서 형태적 이상이 발견되어 암수 모두에서 불임의 원인이 되었다(Korach et al., Science 266(5190):1524-1527(1994)., Eddy et al., Mol. Endocrinol. 7(3):441-452(1996))

이러한 결과들을 기초로 ER 유전자가 돼지의 산자수 증진에 영향을 줄 수 있는 후보 유전자로서 연구가 진행되고 있다. ER 유전자를 probe로 하여 다산종인 중국의 Meshian 종과 Yorkshire 종간의 교잡종 그리고 Meshain 종과 교배를 하지 않은 Yorkshire 종의 개체와 가계에서 ER 좌위의 유전자 다형현상이 분석되어졌다. 그 결과 ER 유전자 다형성은 AA, AB 그리고 BB 의 세 유전자형이 나타났으며, Meshian 종에서 나타나는 B 유전자가 Yorkshire 종의 다산인 개체와 그 가계에서 일관되게 출현하였다(Rothschild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:201-205(1996)).

본 발명은 상기와 같은 점에 착안하여 ER 유전자 내에 존재하는 산자수와 연관된 새로운 좌위를 찾기 위하여 수행되어졌으며, 그 결과 다산종에서 나타나는 B 형의 유전자형과 연관된 새로운 RFLP 좌위를 ER 유전자 내에서 발견하고 이를 손쉽게 검색할 수 있는 kit를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 에스트로겐 수용체 유전자내에 존재하는 돼지 산자수 관련 DNA 표지인자 및 이를 이용한 돼지 산자수 측정용 킷트를 제공하는 것이다.

도 1은 산자수와 관련된 ER유전자에 대한 다형 현상을 밝히기 위해 클로닝한 돼지 ER cDNA를 표지유전자로 하여 Southern-RFLP 분석을 수행한 결과이다.

도 2은 돼지의 유전자형이 AA type과 BB type의 에스트로겐 유전자를 증폭하여MspA1 I 처리한 결과를 비교한 것이다.

도 3는MspA1 I의 제한효소 사이트가 존재하는 돼지 에스트로겐 유전자 염기서열을 분석한 결과이다.

[BB type genome에서MspA1 I 제한효소 인식부위 CCGCGG (진하게, 밑줄 친 부분), AA type에서는 염기서열이 CAACGG로 존재함. 고능력돈 선발용 kit 개발을 위해 제작된 5′primer (gaaaatcatggacatggagattagtac) 와 3′primer (gcattcttctattgcataatagga)는 각각 진하게 표시. 대문자는 엑손(exon)이고 소문자는 인트론(intron) 염기서열.]

도 4는 본 발명 프라이머를 이용하여 PCR-RFLP를 실시한 결과이다.

(레인 2∼5: AA type, 레인 6∼9 : AB type, 레인 10∼13 : BB type)

본 발명은 돼지의 산자수를 측정하는데 유용한 DNA 표지를 제공한다.

본 발명에서 의미하는 '돼지의 산자수를 측정하는데 유용한 DNA 표지' 란 구체적으로 돼지의 에스트로겐 유전자내에 존재하는MspA1 I의 제한효소 사이트를 말한다.

본 발명은 돼지 산자수를 측정하는 측정용 킷트 및 이를 사용하여 돼지 산자수를 측정하는 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 돼지 산자수 측정용 킷트는 돼지 에스트로겐 수용체 유전자내에MspA1 I의 제한효소 사이트 존재여부를 확인하기 위한 프라이머 및 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mixture)로 구성되어 있다.

상기 "프라이머"는 돼지 에스트로겐 유전자에 위치한MspA1 I의 제한효소 사이트를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 의미한다. 즉,돼지 에스트로겐 수용체 유전자내에MspA1 I이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함된다. 본 발명 프라이머의 일 예는 하기 서열번호 8과 서열번호 9로 표시된 올리고뉴클레오티드이다. 상기 "PCR 반응 혼합물"은 DNA 폴리머라제 및 완충용액을 포함하여 PCR을 수행하기 위해 사용되는 분자생물학적 시약(molecular biological reagent)를 의미한다.

본 발명 킷트를 사용한 돼지 산자수의 측정방법은 돼지로부터 genomic DNA를 분리하고, 상기 분리한 DNA를 본 발명의 킷트를 사용하여 증폭한 다음MspA1 I 처리하여 전기영동 하거나 염기서열을 분석하는 것이다.

본 발명에서 돼지의 에스트로겐 수용체 유전자 다형성은 AA, AB 그리고 BB의 세가지 유전자형(genotype)으로 나타나는데, A는 Yorkshire 종 유래의 유전자, B는 Meshian 종 유래의 유전자를 의미한다(Rothschild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:201-205(1996)).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1: 돼지 에스트로겐 수용체 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

제1단계 : 돼지의 자궁조직으로부터 RNA분리

후보 표지유전자 cloning을 위한 RNA를 분리하기 위하여 서울시 동대문구 마장동 소재 (주) 우성농역의 도축장과 경기도 퇴계원 소재 (주)남양식품의 도축장에서 후보 RNA가 존재하는 배란 후 시기의 난소와 그러한 난소들이 존재하는 자궁조직을 채취하였다. RNA의 변성을 방지하기 위하여 바로 도축된 돼지의 조직을 채취하여 DEPC-H₂O에 처리한 후 -192^oC 액체질소에 보관하여 운반하였으며, 상기 조직으로부터 Total RNA는 guanidinium isothiocyanate method (Chomczynski et al. 1987. Anal. Biochem. 162:156-159)에 따라 분리하였다.

제2단계 : RT-PCR

종래 알려진 돼지 ER cDNA의 염기서열 (Boekenkamp. 1994. Mol. Cell. Endocrinol. 104:163-172)을 근거로 하여 다음과 같은 primer를 제작하였다. up stream primer는 5'-gaa gaa cag ccc ggt ctt gtc-3'(서열1)이고, 에스트로겐 수용체 cDNA상의 838bp에서 858bp에 위치하며, down stream primer는 5'-tca gat tgt ggt ggg gaa gtt c-3'(서열2)이고, 1700bp에서 1719bp에 해당하는 antisense primer 이다.

난소로부터 분리한 5㎍ 의 SUPERSCIPT II reverse transcritase (BRL)와 0.4 uM antisense primer를 이용하여 42℃에서 1시간동안 역전사 반응 하였다. PCR은 Gene Amp 2400 (Perkin Elmer, USA) 을 이용해서 pre-denaturation step으로 94℃에서 15 분간 1회 반응 후 변성(denaturation) 94℃ 1분, 결합(annealing) 52℃1분, 신장(extention) 72℃ 2분으로 구성된 반응 주기를 총 30 회 반복하였다.

상기 증폭된 PCR 산물은 T7 Blue vector (Novagen)에 클로닝하여 ABI 310 automated DNA sequencer(Perkin-Elmer, Co. USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.

제3단계 : 5'RACE 방법에 의한 에스트로겐 유전자의 5'말달 유전자의 클로닝

상기 제2단계의 실험을 통하여 3' 말단의 유전자만 획득이 가능하였으므로 5' 말단의 유전자는 5'-RACE 실험방법을 통하여 클로닝하였다. 5'RACE는 Frohman 방법대로 수행하였다(Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(23):8998-9002(1998)).

5'RACE에 사용된 primer의 염기서열은 하기와 같다.

역전사를 위한 primer: 5'-gca ctg atc atc tgg tcg gct-3'(서열3),1차 PCR을 위한 primer:5'-tcg gct gtc agg gac aag-3'(서열4),2차 PCR을 위한 primer:5'-gac aag acc ggg ctg ttc-3'(서열5)을 사용하였고, 나머지 QO, QT, QI 프라이머는 Frohman 방법(Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(23):8998-9002(1998))에 기재된 것과 동일한 프라이머를 사용하였다.

Total RNA는 난소로부터 분리한 것 중 5㎍ 을 사용하였으며, 여기에 50 ng의 역전사 primer, 10 mM dNTP, 0.1 M DTT, RNasin, DEPC, 그리고 역전사 반응 buffer(5X buffer)를 넣어 전체 반응부피를 19 ul로 조절한 다음 1 ul(200 unit)의역전사 효소를 첨가하여 최종 부피가 20 ul가 되도록 하였다. 42^oC에서 1시간 반응시키고 50^oC에서 10분, 70^oC에서 15분간 가열하여 반응을 정지시킨 후 5분간 원심분리하고 RNase H를 넣어 RNA template를 제거한 다음 생성된 cDNA를 spun column을 이용하여 분리하여 dATP로 3' tailing을 수행하였다. tailing은 terminal deoxytransferse를 이용하여 37^oC에서 10 분간 수행하였고 65^oC로 5 분간 가열하여 반응을 정지시킨 후 TE buffer로 20 ul를 500 ul로 맞춘 다음 그중 1 ul를 취하여 PCR 반응을 실시하였다. 1차 PCR 반응에서는 GSP-1 (상기 언급한 1차 PCR primer), QO, 그리고 QT primer들이 각각 최종 농도가 27 pmole, 25 pmole 그리고 2 pmole이 되도록 조절하였고 Taq DNA polymerase 2.5 unit을 넣어준 다음 94^oC 1 분 , 52^oC 1 분, 72^oC 3 분으로 총 30 회를 반응시켰다. 72^oC에서 15 분간 반응시킨 후 1 차 PCR 반응산물을 20 배로 희석하여 그중 1 ul를 2차 PCR에 사용하였다. 2차 PCR 반응은 GSP-2 (2차 PCR primer), QI primer를 각각 25 pmole이 되도록 첨가하였고 그 외의 모든 조건은 1차 PCR과 동일하였다. 생성된 5'-RACE 산물은 T7 Blue vector (Novagen)에 클로닝하여 ABI 310 automated DNA sequencer(Perkin-Elmer, Co. USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.

상기 제2단계 및 제3단계에서 결정된 에스트로겐 수용체 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 서열6, 서열7에 나타내었다.

실험예 2: 번식능력과 연관된 표지유전자의 탐색

제 1단계 : 돼지의 혈액에서 genomic DNA분리

산자수 관련 표지 유전자 (ER)의 검색 및 cloning 분석을 위해 실험 축군(resource population)으로 선정된 경기도 포천군 소재 (주)세왕농장의 Yorkshire종의 경산돈을 대상으로 실시하였다. 유전자 다형성 분석을 위한 기초실험으로 번식능력을 분석하여 5산차 이상의 Yorkshire종 61두를 표본 추출하여, 경정맥으로부터 혈액을 채취하여 DNA 추출에 이용하였다.

상기 유전자 다형성 분석을 위한 genomic DNA의 분리는 Sambrook 등 (1989)의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지의 경정맥에서 10 ml의 혈액을 채취한 후, 응고를 방지하기 위해서 ACD 용액 (citric acid 0.48 g, sodium citrate 1.32 g, glucose 1.47 g to H₂O 100 ml) 2 ml을 첨가하여 4℃ 유지하여 실험실까지 운반하였다. 50 ml 원심 분리용 튜브에 옮긴 후 1,300 g에서 15분간 원심분리하여 buffy coat를 모아 15 ml의 DNA extraction buffer (10mM Tris-Cl, pH 8.0; 0.1M EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS; 20%㎍/ml)를 넣고 잘 섞은 후 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 배양한다. 배양 후 Proteinase K (200 ㎍/ml, BRL)를 혼합하여 37℃ 항온수조에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 동량의 0.5M Tris-Cl (pH 8.0)으로 준비된 Phenol에 넣고 30분 동안 섞어 추출한 후 실온에서 15 분간 5,000 g로 원심 분리하여 층이 생기도록 하였다. 이 과정을 3번 반복한 후, 직경이 0.3 cm되는 pippet으로 상징액을 취하여 50 ml Tris-Cl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0) 4 L에서 18시간 동안 4℃에서 투석하여 chromosomal DNA를 분리하였다. 분리된 DNA 순도는 spectrophotometer (Beckman, USA)를 이용하여 흡광도 A₂₆₀과 A₂₈₀의 비율로 측정하였으며, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동을 시행하여 DNA의 분자량을 확인하였다.

제 2단계: Southern-RFLP(restriction fragment length polymorphism)분석

산자수와 관련된 ER유전자에 대한 다형 현상을 밝히기 위해 클로닝한 돼지 ER cDNA를 표지유전자로 하여 Southern-RFLP 분석을 수행하였다. 산자수 생산능력에 있어 차이를 보이는 대상군의 genomic DNA를 분리하여MspA1 I 제한효소로 절단한 후, 5'말단의 751 bp DNA를 probe하여 Southern blot을 수행하였다.

먼저, 50 ㎍의 genomic DNA를 제한효소MspA1 I로 절단하고, 절단한 DNA를 0.7% 아가로즈 젤 상에서 0.5×TBE 완충액으로 전기영동 하였다. 전기영동 후 젤을 연속적으로 탈퓨린화와 변성과정을 걸쳐 중화하였다. 처리가 끝난 젤은 20×SSC [3 M NaCl, 300 mM Trisodium acetate (pH 7.0)] 용액을 이용하여 젤 상에 존재하는 DNA를 양전하 처리된 나일론 막 (Boehringer Mannheim, Germany)에 전이시키고, UV cross-linking (UVP, USA) 하였다. 이 나일론 막에 68℃로 준비한 혼성화 완충용액 [5×SSC; 1% blocking reagent (Boeringer Mannheim, Germany), 0.02% SDS, 0.1% N-lauroylsarcosine]을 가하여 68℃에서 2 시간 동안 예비 혼성화시켜서 DIG-11-dUTP로 표지된 probe를 첨가하여 68^oC에서 12 시간 동안 혼성화 하였다. 혼성화된 나일론 막은 세척과정을 거친 후, chemiluminescent 검출을 하였다. 검출반응은Anti-DIG-AP, Fab fragment (Boehrigerm Mannheim, Germany)와 이것에 대한 발색 기질인 CDP-Star (Boehrigerm Mannheim, Germany)를 이용하여 수행되었다 (Southern, 1975; Sambrook 등, 1989).

Southern blot을 수행한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 3.6kb 와 3.0kb 부근에서 산자수 증가에 따른 다형현상을 나타내었다. 즉, 산자수가 높은 개체에서는 3.0 kb의 단일 band가 나타난 반면에 산자수가 낮은 개체에서는 3.6 kb의 단일 band가 보였다.

제3단계: 돼지의 번식능력을 분석할 수 있는 primer 개발

상기 Southern-RFLP결과를 토대로 하여 산자수를 결정할 수 있는 primer를 개발하기 위해, 산자수에 따라 다형현상을 나타내는 5' 751 bp ERcDNA부분의 범위를 계속적인 Southern-RFLP를 통해 축소하였다. 충분히 작게 얻은 cDNA 범위를 기초로 하여 primer를 제작하고, 돼지 genomic DNA를 주형(template)으로 하여 ER 유전자의 2kbp의 인트론(intron)을 얻었다. 이것을MspA1 I제한효소로 처리하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 돼지 AA, BB type의 genomic DNA를 primer F (5'-ggg aga aga act cta tag gtt-3': cDNA상 178-195; 서열11)와 primer R (5'-agc gcc aga caa gac caa tca-3':326-347; 서열12)을 이용하여 PCR을 수행하여 돼지 ER Exon-intron 2kbp DNA을 얻고, 상기 산물을MspA1I 처리한 결과, AA type에는MspA1I 부위가 존재하지 않았으나, BB type에는 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

제4단계 : 에스트로겐 수용체 유전자의 intron에 MSPA1 I 제한 효소부위 확인

실험예1에서 염기서열 분석결과, clone된 cDNA 염기서열상(AA type)에는MspA1I 제한효소 인식부위가 존재하지 아니하므로, BB type에서 분리한 돼지의 genomic DNA를 template로 하여 각각 PCR을 수행한 후 염기서열을 분석하여MspA1I 제한효소 인식부위가 존재하는 것을 확인하였다(서열 8 및 도 3)

실시예: 본 발명 kit를 이용한 고능력돈 선발(PCR-RFLP분석)

MspA1I 제한효소에 의해 인지되는 것으로서 PCR 산물이 300 bp가 되도록 primer를 제작하였다. 이것을 이용하여 PCR-RFLP를 수행하였다.

돼지 genomic DNA 150 ng을 RFLP-1 primer (5'-gaa aat cat gga cat gga gat atg tac-3'; 서열9)와 RFLP-2 primer (5'-gat tcc tat tat gca ata gaa gaa tgc-3';서열10)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94^oC 5분, 1회, 94^oC 1분, 56^oC 1분, 72^oC 1분, 40회이다. PCR mixture 9㎕ ul를 총 volume 12㎕ ul에서MspA1I 제한효소로 12시간 반응시킨후 1.5 % gel에서 분석하였다.

실험결과 도 4에 나타난 바와 같이, PCR 증폭산물의 크기는 300 bp로서 제한효소인MspA1I로 처리할 경우, AA형에서는 절단되지 않아 300 bp의 증폭산물이 나타났으며, 이형접합체인 AB에서는 A유전자형과 B유전자형을 절반씩 가지므로 300bp, 200bp, 100bp의 세 종류 절편이 관찰되었다. BB형의 경우,MspA1I 에 의해 절단되어 200bp 와 100bp 절편이 형성되었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 명백한 바와 같은, 본 발명 에스트로겐 수용체 유전자내에MspA1I site는 돼지의 산자수를 결정하는 생물학적 표지자(marker)로 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 돼지의 산자수를 측정 및 예측할 수 있으므로, 돼지 육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

돼지 에스트로겐 수용체 유전자내에 존재하는 산자수(pig litter size) 결정 표지유전자를 이용한 돼지 산자수 측정방법에 있어서,

(a) 돼지로부터 genomic DNA를 분리하는 단계

(b) 상기 (a)단계의 DNA를 주형으로 하여 에스트로겐 수용체 유전자를 증폭시키는 단계

(c) 상기 (a)단계에서 분리한 genomic DNA 및 상기 (b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소MspA1I을 처리하는 단계

(d) 상기 (c)단계에서 얻어진 유전자 단편들의 다형성(restriction fragment length polymorphism)을 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 산자수 측정방법.
돼지의 에스트로겐 수용체 유전자내에 제한효소MspA1I 부위의 존재유무를 V판단하기 위한 프라이머.
제2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9과 서열번호 10로 표시된 올리고뉴클레오타이드로 구성됨을 특징으로 하는 프라이머.
제 2항의 프라이머와 PCR 반응혼합물로 구성됨을 특징으로 하는 돼지 산자수 측정 킷트.