KR20030067686A - 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 및 이를 위한 시약 - Google Patents

혈소판/백혈구 상호 작용 분석 및 이를 위한 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신속하고 신뢰성있는 혈소판/백혈구 상호 작용의 관리점 평가를 제공하기 위하여 혈소판, 백혈구 또는 둘 다와 직접 상호 작용하는 1 이상의 리간드가 그 표면에 결합되어 있는 고상 자극 물질, 예컨대 자성 입자 또는 비자성 입자, 이들의 혼합물을 사용하는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 방법 및 이를 위한 시약을 제공한다.

Description

혈소판/백혈구 상호 작용 분석 및 이를 위한 시약{PLATELET/LEUKOCYTE INTERACTION ASSAY AND REAGENT THEREFOR}
혈소판은 정상 혈류 동안 접촉의 결과로서(Stone and Nash,British Journal of Haematology,105: 514-22, 1999; Lorenz et al,Blood Coagulation and Fibrinolysis,9: S49-59, 1998), 그리고 다양한 병리학적 과정의 결과로서(Rinder et al,Journal of Cardiovascular Surgery,118: 460-6, 1999; Peyton et al,Journal of Vascular Surgery,27: 1109-15, 1998; Stuard et al,International Journal of Artificial Organs,21: 75-82, 1998; Gawaz et al.,European Journal of Clinical Investigation,25: 843-51, 1995) 백혈구와 상호 작용하는 것으로 알려져 있다.
불안정성 안지나, 관상 동맥 질환(CAD) 및 졸중과 같은 병리학적 상태는 고 수치의 혈소판 및 백혈구 활성을 특징으로 한다. 혈소판/백혈구 상호 작용을 측정하면, 특히 다른 진단 인자와 조합하여 이러한 병리학적 상태를 예측할 수 있다. 또한, 혈소판/백혈구 상호 작용의 측정은 혈소판 및/또는 백혈구 기능의 변형에 관한 요법을 모니터링하는 수단으로서 사용될 수 있다.
유동하는 혈액을 인공 표면에 노출시키는 것이 혈소판/백혈구 상호 작용을 향상시키는 것으로 나타났다. 개입되는 세포 유형과 상호 작용의 정도는 혈액과 접촉하는 인공 표면의 조성에 따라 다르다(Gawaz et al,Artificial Organs,23: 29-36, 1999).
혈소판/백혈구 상호 작용은 다양한 기술을 사용하여 정량할 수 있지만(Hendricks et al, 미국 특허 제5,503,982호; Rinder et al,Blood,78: 1760, 1991), 상호 작용의 평가는 순환하는 혈소판/백혈구 복합체의 측정에 의존하였다. 현재, 측정은 혈액 샘플 내 기존의 혈소판/백혈구 상호 작용을 평가하는 형식을 취하고 있다.
몇몇 병리학적 상태(예컨대, 급성 심근 경색, AMI; 후혈관성형 PTCA, 등)에서, 혈소판/백혈구 복합체 형성은 직접적이든(플라크 형성) 또는 간접적이든(ICAM-1과 같은 생화학적 마커의 방출, Hendricks et al, 미국 특허 제5,503,982호 참조) 손상된 부내피와의 상호 작용과 관련있다.
혈소판/백혈구 상호 작용을 평가하는 데 사용되는 현재의 분석 시스템, 예컨대 미국 특허 제5,503,982호(Hendricks et al)는 기존의(순환하는) 혈소판/백혈구 복합체를 평가하며, 혈관 부내피(즉, 세포외 기질)를 대표하는 성분 또는 다른 고상 자극 물질을 이용하지 않는다. 더욱이, 개별적인 혈소판과 백혈구가 상호 작용하는 역치는 테스트 기간 중에 이러한 세포의 활성화 상태에 따라 달라질 수 있다. 혈소판 및/또는 백혈구 활성화가 혈소판/백혈구 결합의 필수 조건인 것으로 당업계에 알려져 있다. 또한, 특정한 병리학적 상태가 혈소판 및/또는 백혈구 활성의 상향 조절과 관련있는 것으로 당업계에 알려져 있다. 그러나, 병리학적 과정과 관련된 세포 활성의 상향 조절은 추가의 자극없이는 혈소판/백혈구 복합체 형성을 지지하기에 불충분할 수 있으며, 또한 혈소판/백혈구 복합체를 유지시킬 수 있는 안정화 고상 지지체가 부족한 통상의 시스템을 사용해서는 검출 가능하지 않을 수 있다[고상 자극 물질은 기존의 혈소판/백혈구 착체의 국소화 및/또는 그렇게 되는 데 소인이 되는 세포 내 복합체 형성 및 국소화 유발의 수단으로서 사용될 수 있다].
고정화 부내피/세포외 기질과 같은 고상 성분의 사용을 포함하도록 설계된 분석 시스템이 임상 세팅에서 혈소판/백혈구 상호 작용을 검출하는 데 유용하도록 용이하고, 신속하며, 합당한 비용이 될 것이 요망되고 있다.
본 발명은 혈소판/백혈구 결합의 신속한 평가를 촉진하기 위하여 혈장 단백질 및/또는 세포외 기질 단백질 단독 또는 이들의 조합으로 코팅된 다양한 조성물의 마이크로입자를 사용함으로써 기존의 방법 및 기술의 단점을 다루고자 한다.
혈소판은 다양한 메카니즘, 예컨대 정상 혈류 동안의 접촉을 통하여(Lorenz et al,Blood Coagulation and Fibrinolysis,9: S49-S59, 1998), 또는 혈소판 활동 항진과 관련된 병리학적 과정의 결과로서(Spangenberg,Thrombosis Research,74: S35-S44, 1994; Rinder et al,Journal of Cardiovascular Surgery,118: 460-6, 1999) 또는 염증성 과정으로 인하여(Gawaz et al,European Journal of Clinical Investigation,25: 843-51, 1995) 백혈구와 상호 작용할 수 있다. 혈소판 표면에서 발견되는 수용체는 직접 다리 결합 또는 매개 분자를 수반하는 간접 연결을 통하여 다양한 백혈구 상에서 발견되는 수용체와 상호 작용한다(Weber and Springer,Journal of Clinical Investigation,100: 2085-93, 1997). 혈소판 및/또는 백혈구 활성의 상향 조절은 향상된 혈소판/백혈구 상호 작용을 촉진시켰다(Rinder et al, 1999; Stone and Nash,British Journal of Haematology,105: 514-22, 1999; Konstantopoulos et at, 1998; Gawaz et al, 1995; Spanenberg, 1994).
관상 동맥 질환(CAD), 당뇨병 또는 뇌혈관 허혈을 가진 개체는 혈소판 활동 항진과 진행중인 염증성 과정을 나타낸다(Michelson and Furman,Current Opinion in Hematology,6: 342-8, 1999). CAD 환자의 치료는 항혈소판제와 항염증성 약물의 사용을 수반한다(Vorchheimer et al,JAMA 281: 1407-14, 1999; Mannaioni et al,Inflammation Research,46: 4-18, 1997).
혈소판/단핵구(Hendricks et al, 미국 특허 제5,503,982호) 및 혈소판/호중구(Gawaz et al,European Journal of Clinical Investigation,25: 843-51, 1995) 상호 작용은 각각 급성 심근 경색(AMI) 및 염증의 전조가 되는 것으로 제시되었다. 다양한 병리학적 상태의 혈소판/백혈구 상호 작용에 대한 결과는 예컨대 플라크 형성이든, 또는 국소화된 염증성 반응이든, 혈관 벽의 개입이다.
고정화된 세포외 기질 단백질을 사용하는 혈소판 기능 평가는 미국 특허 제5,427,913호(Shaw and Stewart)에 기재되어 있다. 상기 발명자들은 폴리스티렌 비드 상에 고정화된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 혈소판 활성화에 사용함으로써 혈소판 기능 결함 환자로부터의 혈소판의 기능 상태를 결정할 수 있다고 설명하였다. 또한, 상기 발명자들은 혈소판 기능을 변경하도록 설계된 제제의 효과는 자극 물질로서 비드 고정화된 VWF를 사용하여 모니터할 수 있다고 설명하였다. 이러한 연구의 결과는 정상 혈액학적 상호 작용 또는 혈관 벽의 성분을 모사하는 제제의 존재 하에서의 병리학적 상태의 혈액학적 결과를 평가하는 중요성을 강조한다.
상기 발명자들(Shaw and Stewart)은 혈소판 기능을 결정하는 방법 및 조성물을 기술하였지만, 혈소판/백혈구 상호 작용을 평가하는 방법의 사용을 기술하거나 시사한 바는 없다.
CVDI의 TASTM분석기는 환자의 혈액 샘플 중의 응고 경로의 활성화 후 피브린 중합의 동력학을 측정한다. TASTM분석기 및 일회용품은 관리점 세팅에서 전혈을 사용하도록 설계되어 있다. 상자성 산화철 입자(PIOP)는 TASTM분석기에 대해 개발된 각각의 테스트를 위한 검출 시스템의 필수 구성요소이다. 특정 테스트를 위한 PIOP 및 다른 동결 건조된 성분은 일회용 TAS 테스트 카드의 얕은 반응 챔버 내에 위치된다. PIOP 이외에, 테스트 시약은 완충제, 안정화제, 충전제 및 특이적인 응고 경로 활성화제 또는 제제를 함유할 수 있다. 테스트는 TASTM분석기의 슬롯으로 건식 화학 테스트 카드를 삽입함으로써 개시되며, 상기 분석기는 테스트 카드 반응 챔버를 전자석 위에 자동적으로 위치시킨다. 또한, 이 챔버는 발광 다이오드로부터의 적외선광으로 조사한다. 상기 장치는 솔리드 상태 포토다이오드 검출기에 의해 테스트 카드의 표면으로부터 반사된 적외선광을 측정한다. 테스트는 혈액 또는 혈장이 테스트 카드의 샘플 웰에 첨가되고, 모세관 작용에 의하여 반응 챔버로 흡인될 때 분석기 포토다이오드가 반사광 강도 변화를 측정할 때 자동적으로 개시된다. 반응 챔버 내에 존재하는 활성화제는 환자의 샘플 내에서 응고 다단계를 자극하여 트롬빈을 생성하고, 순차적으로 피브린 응고물의 형성을 촉매 작용한다.
응고 테스트 중에, TASTM분석기 전자석은 매초 온 오프를 반복한다. 자석 입자는 전자석이 온 상태일 때 기립하여 더 많은 광이 검출기에서 반사되도록 하고, 이것이 오프 상태일 때 강하하여, 적은 광이 반사되도록 한다. PIOP의 이러한 동작은 광검출기로부터 교류(AC) 시그널을 생성한다. 테스트가 진행됨에 따라서, 피브린 중합이 더 일어나고, PIOP 동작은 적어진다. 소정의 알고리듬을 따른 분석기는 PIOP의 관련 동작에 의해 생성된 시그널을 해석하고, 각각의 테스트에 적당한 종점(응고 시간)을 보고한다.
PIOP가 TSATM검출 시스템의 필수 구성요소이지만, 응고 다단계 또는 피브린 중합의 활성화에 직접적으로 참여하는 것은 아니다. 테스트 카드의 반응 챔버 내에서 PIOP와 활성화제 간의 바람직하지 않은 상호 작용을 방지하기 위하여, PIOP는 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅 또는 차단된다. BSA는 테스트의 표면 구성요소와 그 활성 성분 간의 원치않는 상호 작용을 방지하기 위하여 분석 개발에서 당업자가 통상적으로 사용하는 단백질이다. TASTM시스템은 피브린 중합을 모니터하도록 설계된 것이며, 혈소판과 백혈구 간의 상호 작용을 모니터하도록 설계된 것은 아니다.
본 발명은 혈소판과 백혈구의 상호 작용의 관리 평가 시점을 고려하는 혈소판/백혈구 상호 작용 및 이를 위한 시약에 관한 것이다.
본 발명의 보다 완전한 이해와 이들 대부분의 부수적인 이점들은 첨부 도면에 관하여 고찰하였을 때, 하기 상세한 설명을 참고로 더 잘 이해되는 바와 같이 용이하게 얻어질 것이다.
도 1a는 회전 자기장을 사용하여 본 발명의 분석 중에 형성된 PIOP 고리의 도면이다.
도 1b는 고리의 중심점을 향하여 붕괴되기 시작할 때의 분석 중에 형성된 PIOP 고리의 도면이다.
도 1c는 회전 자기장의 존재 하에 PIOP 고리의 완전 붕괴로부터 형성된 원판 또는 도트의 도면이다.
도 2는 혈소판/백혈구/마이크로입자 복합체의 형성을 보여주는 현미경 사진이다.
도 3은 하기 실시예에서 얻어진 계수 데이타의 표이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 및 이 분석에 사용하기 위한 시약에 관한 것이다. 본 발명의 분석은 혈액 또는 혈액 유도 샘플 내 혈소판과 백혈구 간의 상호 작용을 모니터한다. 본 발명의 분석은 습식 화학 포맷 또는 건식 화학포맷으로 수행될 수 있다.
본 발명의 문맥 중에서, 용어 "백혈구" 및 그것의 표현 형식은 통상의 의학적 의미로 제공되는 것이다. 백혈구는 과립구, 림프구 및 단핵구를 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 과립구 소군 내에는 호중구, 호염기구 및 호산구가 있다. 본 발명은 과립구 및 단핵구와의 혈소판의 상호 작용을 검출하는 데 사용되는 것이 가장 바람직하다. 그러나, 모든 유형의 혈소판/백혈구 상호 작용도 본 발명의 분석의 범주 내에 있다.
본 발명은 현탁액 중에서 고상 자극 물질의 존재 하에 혈소판/백혈구 상호 작용을 평가하고 정량하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 고상 자극 물질은 마이크로입자 상에 고정된 혈장 단백질 및/또는 세포외 기질 단백질, 또는 그것의 단편을 단독으로 또는 조합하여 이루어진다. 이러한 단백질은 부동태로, 또는 공유 결합을 통하여 및/또는 다리 결합 분자를 통하여 마이크로입자에 부착될 수 있다. 마이크로입자는 단일 유형일 수 있거나, 특정 구체예에서 2 이상의 상이한 유형의 마이크로입자를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 고상 지지체를 코팅하는 데 사용되는 단백질은 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 라미닌, 오스테오폰틴, 응고 인자(활성 또는 불활성 형태), 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트 또는 헤파린 술페이트로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다. 이러한 단백질 또는 그것의 단편은 단독으로 또는 조합하여, 부동태로 또는 공유 결합을 통하여 고상 지지체 상에 고정화된다. 또한, 고상 미립자 지지체에 대한 단백질의 부착은 당업자에게 용이하게 명백한 바와 같은 스페이서 분자를 사용하여 달성될 수 있다.
고상 자극 물질은 소정 시간 동안 규정된 힘 조건 하에서 혈소판과 백혈구의 공급원과 현탁 혼합된다. 힘 조건은 복합체의 결합을 수행하기 위한 혈소판/백혈구 복합체와 고상 자극 물질의 단순 접촉 내지 현탁된 고상 자극 물질 상에 혈소판/백혈구 복합체 형성을 유발하도록 고 힘 조건(예컨대, 고 전단 및 난류) 하의 혈소판 및/또는 백혈구 복합체의 활성화에 이르기까지 반응성의 범위가 가능하도록 한다. 혼합 조건은 교반, 진탕, 흡입, 전자기장 및/또는 빔, 초음파의 인가 또는 원추판 점도계와 같은 장치의 사용에 의한 전단의 인가 또는 소정 치수의 도관을 통한 현탁액의 유동의 형태를 취할 수 있다. 도관은 유리 또는 플라스틱 관; 마이크로칩에 형성된 채널 또는 포유류로부터 유도된 혈관 또는 반응 테스트 카드 상의 도관, 예컨대 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,110,727호(Oberhardt)에 기재된 것의 형태를 취할 수 있다. 전형적으로, 분석 샘플은 혈소판 및 백혈구를 함유하는 현탁액이며, 혈액 또는 혈액 유도 샘플이다. 샘플은 손가락 끝으로부터의 전혈, 희석 전혈, 항응고 전혈, 세척 세포, 버피 코트 또는 혈소판이 풍부한 혈장인 것이 바람직할 수 있다. 혈소판/백혈구 현탁액은 테스트하고자 하는 환자에게서 직접, 또는 초기에 환자에게서 채혈한 연구 또는 수혈 목적을 위해 저장된 혈액 산물로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 환자는 포유류, 가장 바람직하게는 사람이다.
혈소판과 백혈구 간의 상호 작용의 평가는 상호 작용의 정성 및/또는 정량 분석이 달성될 수 있도록 힘 조건의 예비 규정 세트의 적용을 통하여 고상 지지체에 세포를 부착하는 것을 포함한다.
정성 분석은 분석 중에 형성된 혈소판/백혈구/고상 지지체 복합체를 검출할 수 있는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법의 적당한 예로는 거시적 실험(육안), 현미경, 광 현미경, 전자 현미경(투과 또는 주사), 공초점 현미경 또는 비디오 현미경이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 대안으로(또는 부수적으로) 정성 분석은 조직화학적 분석, 면역-조직화학적 분석, 유전자 분석(PCR, FISH, 서던 블로팅) 또는 웨스턴 블로팅의 형식을 취할 수 있다.
또한, 본 발명의 분석은 혈소판-백혈구 상호 작용의 정량 또는 반정량 결정에 사용될 수 있다. 그러한 분석은 분석된 샘플에 존재하는 혈소판/백혈구 고상 지지체 복합체의 수를 검출하고 계수할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 적당한 정량 또는 반정량 분석 방법으로는 세포 계수, 유동 세포계, 정적 세포계, 레이저 주사 세포계, 탁도 측정, 흡광도 측정, 색도 측정, 효소 결합 면역 흡광 분석(ELISA), 방사선 면역 분석, 면역방사계 분석, 겔 배제 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 세포내 또는 세포외 이온 플럭스 측정, 세포 방출물의 측정, 고상/혈소판/백혈구 응고물 크기의 측정 또는 라텍스 응집 분석이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 그러한 정량 측정에 바람직한 방법은 세포 계수 및 세포계(유동 및 정적)이다. 적당한 세포계로는 컴퓨사이트(CompuCyte) 제품인 ONCYTE(등록 상표) 및 LSC(등록 상표) 정적 세포계, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) 제품인FACSCalibur(등록 상표) 유동 세포계 및 콜터(Coulter) 제품인 EXCEL(등록 상표) 유동 세포계가 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.
혈소판/백혈구 상호 작용의 정성 또는 정량 평가는 병리학적 상태를 보다 명확히 확인할 수 있는 정보 및/또는 적당한 치료 섭생을 사용자에게 제공하는 다른 분석과 조합하여 수행할 수 있다. 예컨대, 혈소판 기능(본원에서 참고 인용하는 미국 특허 가출원 60/202,638호(Mahan et al)에 기재된 바와 같은 테스트, 또는 통상의 혈소판 기능 테스트), 및 AMI의 출현을 보다 명백히 규정하기 위하여 혈소판/백혈구 상호 작용의 평가와 함께 심장 마커 효소를 측정하기를 원할 수 있다. 그러한 분석 조합은 단일 장치 상에서 공동으로 또는 동시에 실행하도록 구축될 수 있다. 규정된 병리학적 상태에 대한 바람직한 분석의 다른 조합은 당업자에게 용이하게 명백한 것이며, 본 명세서에 언급된 것들로 제한해서는 안된다.
본 발명의 고상 자극 물질은 혈소판/백혈구 상호 작용 정도를 신속히 평가할 수 있는 혈소판/백혈구 콘쥬게이트를 국소화시키는 수단을 제공한다. 또한, 고상 자극 물질은 고상 자극 물질 상에 혈소판/백혈구 복합체 형성을 촉진하는 혈소판 및/또는 백혈구 활성화를 유발할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 입자는 혈장 단백질(들)원 또는 이들의 단편으로 코팅된다. 예시적인 혈장 단백질로는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴 또는 혈액 응고 인자(활성 또는 불활성, 즉 효소원 형태), 예컨대 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 조합이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 입자는 세포외 기질 단백질(들) 또는 이들의 단편 단독 또는 조합으로 코팅된다. 예시적인 세포외 기질 단백질로는 폰 빌레브란트 인자, 피브로넥틴, 콜라겐, 오스테오폰틴, 라미닌, 트롬보스폰딘, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트 또는 헤파린 술페이트 또는 이들의 조합이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.
또한, 입자의 일부를 백혈구 결합 리간드, 예컨대 백혈구 선택성 항체, 또는 백혈구 막 성분에 결합하는 단백질 또는 그것의 단편으로 코팅할 수 있다. 그러한 단백질의 예로는 VCAM-1, 피브로넥틴, 라미닌, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, 콜라겐, 오스테오폰틴, vWf, 비트로넥틴, 트롬모스폰딘, 점막 아드레신 세포 부착 분자 1(MadCAM-1), P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴이 있다.
단백질이 코팅되어 고상 자극 물질을 형성하는 마이크로입자는 임의의 형상일 수 있다. 특히, 이들은 미소구 또는 요철형 마이크로입자의 형태를 취할 수 있다. 미소구 또는 요철형 마이크로입자는 1 종 이상의 상기 단백질 또는 그것의 단편에 직간접적으로 결합할 수 있는 임의의 물질로 이루어질 수 있다. 이러한 미소구 또는 요철형 마이크로입자는 임의의 소정 입자 크기, 바람직하게는 후술되는 PIOP와 동일한 정도의 크기, 보다 바람직하게는 1 내지 20 미크론의 입자 크기를 가질 수 있다. 미소구 또는 요철형 마이크로입자를 포함하는 물질의 바람직한 예로는 폴리스티렌 및/또는 라텍스, 폴리카르보네이트, 아크릴로니트릴, 카르복실레이트, 테플론, 유리, 나일론, 덱스트란, 아가로스, 아크릴아미드, 실리카, 화분, 미생물(생존 가능 또는 생존 불가능함), 산화철, 상자성 산화철, 상자성 입자, 비자성 금속 비드, 금, 백금 또는 팔라듐이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 문헌(Stewart et al,British J. Haematology,97, 321-329(1997) 및 Shaw et al, 미국 특허 제5,952,184호, 각기 본 명세서에서 참고 인용함)에 기재된 바와 같은 폴리스티렌 비드가 가장 바람직하다. 또한, 미소구 또는 요철형 미소구는 본래 상자성이거나 및/또는 적당한 기질 및/또는 화학 물질의 존재 하에 광 또는 색 반응을 유도하기에 적당한 효소로 태그 및/또는 형광 태그될 수 있다.
본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에서, 마이크로입자는 폴리스티렌을 포함하고, 본래 구형이며, 사람 기원의 폰 빌레브란트 인자로 코팅된다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구는 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구 상에 혈소판/백혈구 복합체를 포획하거나, 또는 혈소판/백혈구 복합체 형성을 유발하기에 충분한 소정의 힘 조건 하에서 소정의 시간 동안 전혈(항응고 처리되지 않거나 항응고 처리됨)과 혼합한 후, 그러한 복합체 형성의 존재 및/또는 양을 측정한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분석은 2 개의 중심 시약 요소를 포함하는 시약을 사용하여 실행한다. 첫번째의 것은 자성 입자, 바람직하게는 상자성 산화철 입자(PIOP), 예컨대 (1) 백혈구와 직접 상호 작용하거나, 또는 (2) 혈소판과 상호 작용할 수 있는 표면에 리간드를 결합함으로써 변형된 TASTM분석기에 현재 사용되고 있는 것(각기 본 명세서에서 참고 인용되는 미국 특허 제4,849,340호,제5,110,727호, 제5,350,676호, 제5,601,991호, 제5,670,329호 및 제5,677,233호에 기재됨)이다. 다양한 자성 입자를 사용할 수 있지만, 미국 특허 제5,110,727호에 기재된 바와 같이, 바람직한 자성 입자는 PIOP이다. 따라서, 하기 상세한 설명은 편의를 위하여 PIOP에 관할 것이지만, 달리 지적하지 않는 한, 용어 PIOP는 임의의 자성 입자 유형에 관할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 통상의 TAS 분야에서와 같이, PIOP도 분석 모니터링 및 검출 시스템에서 중추 역할을 담당하는데, 이동 자기장에 따라서 변형된 PIOP의 이동을 모니터링하여 분석의 종점을 결정한다.
이 바람직한 구체예에서 제2 중심 시약 소자는 혈소판과 직접 상호 작용할 수 있는 리간드로 코팅된 비자성 비드 또는 미소구이다. 이들 비자성 비드 또는 미소구는 임의의 소정의 입자 크기, 바람직하게는 PIOP와 동일한 정도의 크기, 보다 바람직하게는 1 내지 20 미크론의 입자 크기를 갖는다. 비자성 비드는 그 표면에 리간드가 결합될 수 있는 임의의 비자성 물질로 이루어질 수 있다. 비자성 비드의 제조에 바람직한 물질로는 미소구 또는 요철형 입자에 대하여 상기 열거된 것들, 예컨대 폴리스티렌 비드, 폴리올레핀 비드, 유리 비드 및 심지어 비자성 금속 비드가 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 문헌(Stewart et al,British J. Haematology,97, 321-329(1997) 및 Shaw et al, 미국 특허 제5,952,184호, 각기 본 명세서에서 참고 인용함)에 기재된 바와 같은 폴리스티렌 비드가 가장 바람직하다. 샘플 첨가시 기능적 안정성, 시약 건조 및 물질 재수화를 향상시키는 것으로 당업자에게 알려진 다른 시약, 예컨대 항응고제, 완충제, 등 및 본 명세서에 기재된 특허(Oberhardt 및 Shaw)에 기재된 바와 같은 것도 테스트 조제물에 첨가될 수있다.
리간드는 리간드의 활성이 손상되지 않는 한, 직접적으로 또는 스페이서를 통하여 간접적으로 입자에 결합될 수 있다. 직접 결합은 공유 또는 비공유적으로 일어날 수 있다. 간접 결합은 한정하는 것은 아니지만, 펩티드 스페이서, 항체 스페이서 또는 탄수화물 스페이서를 비롯한 스페이서를 통하여 일어날 수 있다. 대체로, 이러한 스페이서는 입자와 리간드 간의 다리 결합으로서 작용할 뿐만 아니라, 리간드/수용체 상호 작용의 효율을 변경시키기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 7 아미노산 펩티드 다리 결합을 통하여 vWf를 입자에 커플링하면, vWf와 혈소판 수용체의 상호 작용이 감소될 수 있다. 그러나, 동일한 7 아미노산 펩티드 다리 결합을 통하여 입자에 커플링된 vWf의 활성 세그먼트를 사용하면, vWf 단편/수용체 상호 작용을 상향 조절할 수 있다. 다른 유형의 유사한 향상 방법은 문헌(Beer et al,Blood,79, 117-128(1992))에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 분석의 한 가지 구체예에서, 시약은 진동 자기장이 사용된 경우 자성 입자만을 함유할 수 있다. 그러나, 후술되는 바와 같이, 회전 장이 사용된 경우, 바람직한 시약은 두 가지 유형의 입자에 결합하는 리간드를 가진 자성 및 비자성 입자를 함유한다.
이 구체예의 비자성 입자 상에서 혈소판과 상호 작용하는 리간드는 혈소판의 활성화를 초래하는 기능을 수행할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 적당한 리간드로는 폰 빌레브란트 인자(vWf), 콜라겐 및 트롬빈, 뿐만 아니라 그것의 단편(또한, 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,877,155호(Miller)에 기재된 것과같이, 미메토프로 알려짐)이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 리간드로서 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 단편을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
비자성 입자 및 자성 입자 상에 사용되는 리간드는 동일한 리간드 또는 상이한 리간드일 수 있다. 리간드가 두 유형의 입자에 대하여 동일한 경우, 시약 내에 백혈구 마커를 제공하는 것이 더 필요하다. 백혈구 마커는 백혈구의 존재를 식별하는 것으로 알려진 임의의 통상의 마커, 예컨대 형광 마커일 수 있다. 적당한 백혈구 마커의 예로는 CD45, CD18, CD11a/CD18(LFA-1), CD11b/CD18(Mac-1), CD11c/CD18, P-셀렉틴 리간드(PSGL-1) 및 CD34가 있다. 리간드가 두 유형의 입자에 대하여 동일한 경우, 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 단편인 것이 가장 바람직하다. 리간드는 충분한 수의 혈소판이 활성화되어 1 내지 20 분, 바람직하게는 2 내지 4 분의 시간 이내에 분석 종점을 초래하도록 혈소판에 대한 결합 및 혈소판의 활성화를 제공하기에 충분한 양으로 자성 및 비자성 입자의 표면에 존재하여야 한다. 예를 들면, 후술되는 바와 같은 회전 자기장의 경우, 종점은 초기에 형성된 회전 PIOP 고리가 고형 원판 또는 도트로 붕괴될 때 도달한다.
대안으로, 두 유형의 입자에 결합되는 리간드는 상이할 수 있다. 리간드는 둘 다 혈소판과 직접 상호 작용하는 리간드일 수 있지만, 서로 상이하다. 그러한 경우, 동일 유형의 백혈구 마커가 전술한 바와 같이 필요할 것이다. 그러나, 또 다른 구체예에서, 한 리간드는 혈소판과 직접(그리고, 선택적으로) 상호 작용하는 리간드인 반면에, 다른 리간드는 백혈구와 직접(그리고, 선택적으로) 상호 작용하는 리간드일 수 있다. 그러한 선택성 리간드의 예로는 백혈구 선택성 항체, VCAM-1,피브로넥틴, 라미닌, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, 콜라겐, 오스테오폰틴, vWf, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 점막 아드레신 세포 부착 분자 1(MadCAM-1), P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴(모두 FITC 또는 피코에리트린과 같은 형광 태그로 표지되거나 표지되지 않을 수 있음)이 있다. 그러한 경우, 오로지 혈소판/백혈구/입자 복합체의 형성을 통하여 회전 PIOP 고리의 붕괴가 일어나므로, 혈소판과 백혈구의 상호 작용을 시그널링할 것이다. 이는 혈소판/백혈구 상호 작용의 정성 측정을 제공하는 한편, 이 구체예는 전술한 바와 같은 백혈구 마커를 사용함으로써, 또는 PIOP 고리의 붕괴 시간을 공지된 혈소판/백혈구 상호 작용 활성을 가진 1 이상의 표준과 비교 및 보정함으로써 상호 작용의 정량 측정을 제공할 수도 있다.
본 발명의 분석에서, 혈소판/백혈구 상호 작용은 혈소판 활동 항진 또는 백혈구 활동 항진이 있는 경우에 관찰될 것이다. 그러나, 양 활성이 정상이거나 낮은 경우에는, 상호 작용은 정상적으로 관찰되지 않을 것이다. 그러나, 이는 전술한 바와 같이, 혈소판 및/또는 백혈구를 활성화시키기 위하여 고 힘 조건을 인가함으로써 강제적으로 일어날 수 있다. 고 힘 조건은 혈소판/백혈구 상호 작용에 대한 환자의 감수성을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 전술한 바와 같이, 특히 특정 질환 상태에 대한 다른 진단 도구와 조합한 경우, 그러한 상호 작용을 수반하는 다양한 질환 상태에 대한 성향 또는 소질을 결정하기 위한 진단 도구를 제공할 수 있다.
본 발명의 분석은 습식 화학 또는 건식 화학 포맷일 수 있다. 양 포맷에서, 테스트는 비교적 편평한 반응 표면 상에서, 바람직하게는 전술한 미국특허(Oberhardt)에 기재된 것과 같은 반응 슬라이드 내에서 수행될 수 있다. 분석은 그 개시 내용이 본 명세서에 참고 인용되는 미국 특허 제5,110,727호에 기재된 것과 같은 반응 슬라이드 또는 카드를 사용하는 건식 화학 포맷으로 수행되는 것이 가장 바람직하다. 또한, 본 발명의 분석은 임의의 소정 크기와 형상의 시약 챔버를 갖춘 일회용품 용도로 채택될 수 있다.
본 발명의 혈소판/백혈구 상호 작용 분석의 바람직한 구체예를 수행하기 위하여, 진동 자기장, 예컨대 미국 특허 제5,110,727호(이미 참고 인용함)에 기재된 것으로, 또는 회전 자기장, 예컨대 미국 특허 제5,670,329호(본 명세서에서 참고 인용함)에 기재된 것으로 반응 챔버를 배치하는 것이 필요하다. 분석은 회전 자기장의 존재 하에 수행하는 것이 가장 바람직하다. 자석(진동 장 형 또는 회전 장 형)은 장이 반응 챔버에 존재하는 거의 모든 PIOP에 영향을 줄 수 있도록 설계해야 한다. 회전 자기장의 바람직한 예에서, 반응 챔버가 TAS 테스트 카드에 존재하는 것인 경우, 자기 극 간의 분리는 0.5 내지 2.5 cm 범위일 수 있다. 자석은 자기장이 회전할 때 PIOP의 이동을 유발하기 위하여 반응 챔버에 충분히 근접하도록 위치시켜야 한다. 회전 자기장은 시스템의 자성 입자의 회전 운동을 지연시킬 수 있는 임의의 진동수에서 회전할 수 있으며, 회전 진동수는 2,000 내지 2,500 rpm이 바람직하다. 회전 자기장은 미국 특허 제5,670,329호에 기재된 바와 같이 중심축에 대하여 영구 자석의 회전에 의해 제공되거나, 또한 미국 특허 제5,670,329호에 기재된 바와 같이, 원형 배치된 일련의 전자석의 연속 활성화에 의해 발생될 수 있다.
본 발명의 분석에서 회전 자기장을 제공하기 위한 자석에 대한 한 가지 디자인은 대략 3.4 cm 직경의 금속 원판 상에 장착된 2 세트의 버튼 자석을 포함한다. 금속 원판 베이스는 그 중심이 DC 전기 모터의 샤프트에 부착되어 있다. 각각의 버튼 자석 조립체는 대략 1 cm 직경의 3 개의 즉시 입수 가능한 버튼 자석을 포함한다. 버튼 자석은 금속 베이스 상에서 서로 직접 대향하도록 배치되어 있다. 두께가 대략 3 mm이고, 반경이 9 mm인 제2 금속 원판의 절반(반원, 원의 절반)이 각각의 자석 조립체의 상부 상에 배치되어 있다. 두 원판의 직선 단부는 서로 대면하고, 대략 1.5 cm 분리되어 있다. 전체 조립체는 테스트 카드의 반응 챔버 아래에 대략 2 내지 4 mm 위치되어 있다.
본 발명의 분석은 전혈 또는 혈소판이 풍부한 혈장 샘플을, 바람직하게는 회전 자기장을, 가장 바람직하게는 2500 rpm의 회전 진동수에서 생성하는 자석 위에 위치된, 전술한 시약을 함유하는 반응 챔버에 첨가함으로써 개시된다. 건식 화학 포맷을 사용하는 가장 바람직한 구체예에서, 시약은 자성 입자를 유리시켜서 이들이 회전 자기장에 따라 이동하기 시작하는 샘플에 의해 재수화된다. 회전 장의 존재 하에서, 자성 입자는 반응 영역의 외단부를 따라 이동하는 어두운 물질의 고리 또는 대역을 구성한다. 초기에 고리의 중심은 투명하거나 약간 회색이다(즉, PIOP가 거의 조금 함유됨). 비자성 입자는 검출 시스템에서 보이지 않도록 선택하는 것이 바람직하다.
정상적인 비저해된 샘플에서, PIOP의 대역은 수 분의 시간에 걸쳐서 더 작아지고, 고리의 중심은 PIOP로 충전되어 반응 영역의 중심에 중실 도트를 형성한다. 비자성 비드 자체는 시스템에서 용이하게 볼 수 없고, 분석에 대한 종점을 결정하는 데 참여하지 않는 것이 바람직하다. 테스트의 종점은 시약 조제물에 존재하는 PIOP의 위치 및 이동성에 의해 설정된다. 회전 자기장에 의해 부여되는 반응 영역 내 PIOP의 동작은 PIOP와 비자성 비드 상에 존재하는 고상 길항 물질(즉, 리간드)과의 접촉을 통하여 혈소판을 활성화시키는 데 요구된다. 두 고상의 응고는, 특히 두 종류의 입자 상의 혈소판 리간드를 사용하는 경우, 고상에 대한 혈소판 부착, 이어서 혈소판 활성화를 통하여 혈소판/혈소판 결합(혈소판 응고)을 초래함으로써 일어날 수 있다. 그러한 경우, 혈소판/백혈구 상호 작용의 검출은 시약 혼합물 중에 백혈구 마커, 예컨대 형광 마커를 포함시킴으로써 수행될 수 있다. 혈소판/백혈구 상호 작용이 분석으로부터 결과하는 경우, 마커는 주변 매질보다 응고된 입자 내에서 더 우세할 것이다. 혈소판/백혈구 상호 작용이 일어나지 않는 경우, 마커는 주변 매질과 비교하였을 때 유의적인 정도로 응고된 입자 내에 존재하지 않을 것이다. 혈소판과 백혈구의 상호 작용의 수준은 응고된 입자 내 마커의 존재의 정량 측정에 의해 결정할 수 있다. 응고는 혈소판의 부재시, 또는 저해제의 존재시 일어나지 않는다.
대안으로, 한 유형의 입자가 혈소판 리간드를 보유하고, 다른 유형의 입자가 백혈구 리간드를 보유하는 경우, 혈소판/백혈구 상호 작용의 존재는 직간접적으로 관찰될 수 있다. 백혈구 리간드가 자성 또는 PIOP 입자에 결합되는 경우, 혈소판과 백혈구의 상호 작용의 존재는 직접 관찰될 수 있는데, 그 이유는 PIOP 고리의 붕괴가 그러한 상호 작용없이는 일어나지 않기 때문이다. 반면에, 백혈구 리간드가 비자성 입자에 결합되는 경우, PIOP 고리의 도트로의 붕괴는 훨씬 더 느리기는 하지만 혈소판 리간드 코팅된 PIOP의 혈소판/혈소판 상호 작용을 통하여 여전히 일어날 수 있다. 혈소판/백혈구 상호 작용의 한정적인 측정은 이 구체예에서 전술한 형광 마커와 같은 마커의 사용을 통하여 최상으로 수행될 것이다.
본 발명의 이 구체예의 분석에서, 일단 결합된 리간드가 혈소판 및/또는 백혈구와 상호 작용하면, 샘플 내에 본래 있는 유리 피브리노겐은 활성화된 혈소판과 상호 작용하여 혈소판/혈소판 응고를 유발한다. 혈소판 및/또는 백혈구가 심근 경색 또는 졸중 희생자의 경우에서와 같이 과활성화되면, 혈소판/백혈구 상호 작용도 일어난다. 혈소판(백혈구의 존재 또는 부재시)이 응고함에 따라, 이는 PIOP 주변의 응고물의 유효 질량을 증가시켜서 더 무거운 응고물이 입자의 외부 고리 안쪽으로부터 회전 자기장의 중심을 향하여 이동하게 된다. 분석이 진행됨에 따라, 고리는 원형 도트로 결국 붕괴되는데, 이는 회전 장의 중심에 대하여 계속 회전한다.
분석의 종점은 TAS 분석기와 유사한 반사된 적외선광을 사용함으로써 모니터할 수 있다. 이것은 어두운 고리에 의해 커버된 반응 챔버의 영역이 중실 도트보다 훨씬 더 크기 때문에 가능하다. 시그널은 전술한 바와 같이 정성적 예/아니오 반응과 정량적 반응을 제공할 수 있다.
고리 대 도트에 의해 생성된 시그널의 차이는 반사 물질의 작은 점이 반응 영역의 그 중심을 커버하는 경우에 향상될 수 있다. 이 상황에서, PIOP의 어두운 고리는 반사 물질 뒤로 소실되고, 이로써 시그널을 증가시킨다. 대안으로, 분석의 종점은 비디오 또는 적외선 카메라에 의해 모니터할 수 있다. 카메라의 출력은 디지탈화될 수 있으며, 그 후 이미지를 분석하여 고리 및 도트 구조의 형성을 결정할수 있다.
도 1a는 미국 특허 제5,110,727호에 기재된 것과 같은 분석 테스트 카드로 회전 자기장을 사용하여 작동하는 본 발명의 분석의 도면을 제공한다. 이 도면에서, PIOP는 혈액 샘플을 첨가함으로써 유리되어, 반응 챔버(20) 내에서 PIOP의 회전 고리(10)를 형성시킨다.
도 1b는 PIOP의 회전 고리(10)가 회전 장의 축을 나타내는 중심점(30)을 향하여 붕괴하기 시작하는 것을 보여준다. 도 1c는 PIOP가 도트 구조(40)로 완전히 붕괴된 분석의 종점을 보여준다. 이 종점은 기기 및 육안에 의해서 극적이고 용이하게 검출 가능하다. 육안 검출은 상기 논의된 정성 정보를 얻는 신속하고 용이한 방법을 제공하는 반면에, TAS 분석기와 같은 시스템을 사용하는 기기 검출은 얻어진 시그널을 분석하는 능력을 제공하고, 바람직하게는 공지된 혈소판/백혈구 상호 작용 수치를 가진 샘플을 사용하여 발생된 표준 곡선과 비교함으로써 수용체 차단의 정량 측정을 제공한다.
진동 자기장을 사용한 경우, 생성된 시그널은 입자의 진동을 모니터링함으로써 생성된 붕괴 곡선의 분석에 의하여 미국 특허 제5,110,727호 및 미국 특허 제4,849,340호(Oberhardt)와 동일한 방식으로 분석한다.
본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 단지 예시 목적으로 제공되는 특정 실시예를 참고로 더 이해될 수 있으며, 달리 설명하지 않는 한, 제한하려는 의도는 없다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 한 가지 목적은 샘플로서 전혈을 비롯한 다양한 혈액 산물을 사용할 수 있으며, 검출이 용이한 혈소판/백혈구 상호 작용에 대한 분석을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈소판/백혈구 상호 작용의 신속한 측정을 위하여 TASTM시스템 상에서 사용할 수 있는 혈소판/백혈구 상호 작용에 대한 분석을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바람직하게는 본 발명의 분석에 사용될 수 있는 건식 화학 테스트 카드 포맷으로 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 분석을 사용하여 혈소판/백혈구 상호 작용을 초래하는 상태의 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 분석을 사용하여 혈소판 및/또는 백혈구 활동 항진의 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적은 혈소판/백혈구 상호 작용의 평가 방법의 발견에 의해 충족되었으며, 상기 방법은:
전혈 또는 혈액 유도 샘플을, 혈소판 또는 백혈구 결합에 선택성인 리간드가 표면에 결합된 고상 자극 물질과 접촉시키는 단계; 및
1 이상의 혈소판/백혈구/고상 자극 물질 복합체의 형성을 검출하는 단계
를 포함하며, 또한 본 발명은 상기 방법을 실행하기 위한 시약, 뿐만 아니라 다양한 질환 상태에 의해 유발되는 혈소판/백혈구 상호 작용의 출현 및 이러한 상태에 대한 환자의 소질을 검출하는 방법의 용도에 관한 것이다.
vWf 코팅된 PIOP의 제조
ISK 마그네틱스(인도 발파라이소 소재)에서 구입한 자철광 10 g을 밀봉 플라스크 내 50 mM Tris pH 7.4 90 ㎖에 가하고, 질소로 5 분 동안 퍼지하였다. 그 다음, PIOP 현탁액을, 7 mm 직경 회전 고정자를 사용하는 6의 세팅에서 5 분 동안 모델 700 PowerGen 균질기(피셔 사이언티픽)에 의해 균질화하였다. 균질화된 PIOP의 0.7 ㎖ 분액을 대략 10 ㎍/㎖ vWf 0.3 ㎖에 가하고, 30 분 동안 실온에서 항온 처리하였다.
vWf 코팅된 폴리스티렌 비드의 제조
폴리사이언시즈 코포레이션(미국 펜실베이니아주 와링턴 소재)에서 구입한 폴리스티렌 비드(4 ㎛)를 사용 전에 0.2 mol/ℓ탄산염 완충액(pH 9.35)으로 3회 세척하였다. vWf를 0.2 mol/ℓ탄산염 완충액(pH 9.35) 중에서 2 U/㎖(vWf의 단위는 풀링된 정상 혈장 1 ㎖ 중에서 발견되는 양으로 정의함)로 희석하고, 탄산염 완충액 중에서 예비 평형화된 폴리스티렌 비드와 혼합한 후, 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다.
실시예 1
항응고제로서 시트르산염으로 채혈한 건강한 지원자로부터의 전혈을 사람 폰 빌레브란트 인자로 코팅된 폴리스티렌 미소구와 혼합하였다. 전혈 100 ㎕를 마이크로웰 중의 미소구 5 ㎕(대략 5 x 105, 4.5 ㎛ 직경)에 가하고, 1 내지 10 분 동안 500 rpm의 회전 진탕기 상에서 진탕하였다. 분액을 마이크로웰에서 제거하고, 현미경으로 조사하였다. 반응은 비디오 현미경, 상 콘트라스트 현미경을 사용하여 고정 도말 표본 상의 차등 염색에 의해 평가하였다. 복합체 중의 백혈구와 혈소판은 혈소판이 활동 항진을 나타내는 경우, 또는 혈소판 및/또는 백혈구가 테스트 전에 21 게이지 바늘을 통하여 혈액을 수 회 가압함으로써 반복된 원심 분리(800 x g, 10 분)와 같은 기계 응력 또는 전단을 받는 경우에만 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구와 회합된 것으로 관찰되었다. 도 2는 혈소판/백혈구/vWf 코팅된 폴리스티렌 비드 복합체의 예를 도시하며, vWf 코팅된 비드에 결합된 혈소판에 대한 다형핵성 백혈구 결합을 보여준다.
실시예 2
차등 세포 계수는 자동화 세포 계수를 사용하여 건강한 지원자로부터의 헤파린화 또는 시트르산 첨가 전혈에 대하여 수행하였다. 전혈 100 ㎕를 마이크로웰 중의 폰 빌렌브란트 인자 코팅된 미소구 5 ㎕(대략 5 x 105, 4.5 ㎛ 직경)에 가하고, 1 내지 10 분 동안 500 rpm의 회전 진탕기 상에서 진탕하였다. 그 다음, 제2 계수는 반응 현탁액에 대하여 수행하였다. 비드 시약의 희석 효과를 고려하여, 백혈구 수 감소는 백혈구 계수 감소율(%)을 얻기 위하여 반응 후 계수와 반응 전 계수 간의 비율을 산출하고, 그 결과에 100을 곱함으로써 결정하였다. 부수적으로, 코팅되지 않은 초기의 미소구는 항응고 처리된 전혈로 유사한 방식으로 혼합하고, 전술한 바와 같이 평가하였다. 계수 데이타는 도 3의 표에 나타낸다.
백혈구 계수는 혈소판이 활동 항진을 나타내는 경우, 또는 혈소판 및/또는 백혈구가 테스트 전에 21 게이지 바늘을 통하여 혈액을 수 회 가압함으로써 반복된원심 분리(800 x g, 10 분)와 같은 기계 응력 또는 전단을 받는 경우에만 항응고 처리된 전혈을 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구와 혼합한 후에 감소하는 것으로 나타났다. 이와는 대조적으로, 미코팅 미소구로 행한 테스트는 백혈구 계수의 감소가 나타나지 않았다. 상 콘트라스트 현미경으로 응고물에서의 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구와의 백혈구/혈소판 복합체 회합을 확인하였으며, 미코팅 미소구와의 회합은 없는 것을 확인되었다. 백혈구, 혈소판 및 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구에 의해 형성된 응고물은 차등 세포 계수에 의해 백혈구로서 계수하기에 너무 큰 것으로 나타났다.
실시예 3
관상 동맥 회로조성술(CABG)을 지정받은 연구 환자(n = 3)는 수술 절차 전에, 그리고 수술 절차에 걸쳐서 본 발명의 방법을 사용하여 테스트하였다. 차등 세포 계수는 수술 절차에 걸쳐서 각각의 시점(수술 전, 회로 중, 프로타민 후, 집중 관리 단위, 수술 24 시간 후)에서 시트르산 첨가된 전혈에 대하여 수행하였다. 또한, 각각의 시점으로부터 시트르산 첨가된 전혈 100 ㎕를, 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구(대략 5 x 105, 4.5 ㎛ 직경)를 함유하는 마이크로웰에 가하였다. 마이크로웰은 1 내지 10 분 동안 500 rpm의 회전 진탕기 상에서 진탕하였다. 제2 차등 세포 계수는 마이크로웰로부터의 혈액에 대하여 수행하였다. 비드 시약의 희석 효과를 고려하여, 백혈구 수 감소는 백혈구 계수 감소율(%)을 얻기 위하여 반응 후 계수와 반응 전 계수 간의 비율을 산출하고, 그 결과에 100을 곱함으로써 결정하였다. 모든 연구 환자는 차등 세포 계수 기술에 의해 결정하였을 때 수술 전 샘플 중에서 백혈구 손실이 나타났다. 현미경으로 VWF 코팅된 미소구의 표면 상의 혈소판/백혈구 복합체 형성을 확인하였다. VWF 코팅된 미소구의 존재 하에서 혈소판/백혈구 복합체 형성은 환자가 회로 중일 때 채혈한 혈액 샘플에서 나타났지만, VWF 코팅된 미소구의 존재 하에서 혈소판/백혈구 복합체 형성은 어떠한 연구 환자에게서도 수술 24 시간 후에 채혈한 혈액 샘플에서는 나타나지 않았다.
실시예 4
건강한 지원자로부터의 전혈을 시트르산 진공 용기 튜브, EDTA 진공 용기 튜브 및 헤파린 진공 용기 튜브로 인출하였다. 각 튜브로부터의 혈액의 액적을 VWF 코팅된 폴리스티렌 비드 및 VWF 코팅된 상자성 산화철 입자(VWF-PIOP)의 혼합물을 함유하는 3 개의 개별 반응 카드의 반응 웰에 첨가하고, 현탁액을 5 분 동안 격렬하게 혼합하였다. 전혈의 분액(5 ㎕)을 현미경 습식 마운트 관찰(상 콘트라스트) 및 염색된 도말 표본(Hema-3 염색, 피셔 사이언티픽) 평가를 위하여 각 카드에서 제거하였다. VWF에 대한 약한 혈소판 부착이 EDTA 혈액에서 나타났으며, 대부분의 혈소판이 미결합 상태로 남아있었다. 혈소판은 EDTA 혈액에서 VWF-PIOP와 회합되지 않았다. 시트르산 혈액 샘플과 헤파린 혈액 샘플 모두 VWF 비드에 대한 혈소판의 광범한 결합, 이어서 VWF-PIOP의 결합에 의해 큰 복합체를 형성한 것으로 나타났다. 소수의 혈소판이 미결합 상태로 남아있었다. 이러한 대형 VWF 비드/혈소판/VWF-PIOP 복합체에 대한(또는 그 안에) 백혈구의 결합은 습식 마운트 또는 염색된 도말 표본에 의해 관찰되지 않았다. 복합체 중의 백혈구 및 혈소판은 혈소판이 활동 항진을 나타내는 경우, 또는 혈소판 및/또는 백혈구가 반복된 원심분리(800 x g, 10 분)와 같은 기계 응력을 받는 경우에만 시트르산 샘플과 헤파린 샘플에서 폰 빌레브란트 인자 코팅된 미소구 및 VWF-PIOP와 회합되는 것으로 관찰되었다. 기계 응력은 VWF 비드 또는 VWF-PIOP와의 혈소판 회합을 증대시키거나, EDTA 혈액 샘플 중의 백혈구/혈소판 복합체 형성을 촉진시키지 않았다.
테스트 카드의 제조
대략 30 ㎕의 반응 챔버를 가진 미국 특허 제5,110,727호(Oberhardt)와 같은 테스트 카드에 vWf로 코팅된 전술한 자성 및 비자성 입자를 함유하는 시약 조성물을, 시약 조성물이 ㎖ 당 코팅된 PIOP 1 내지 2 mg 및 ㎖ 당 2 x 106내지 8 x 106폴리스티렌 입자를 포함하도록 하는 양으로 넣었다. 또한, 반응 챔버에 검출 가능한 시그널을 제공하기에 충분한 양의 백혈구 마커, 예컨대 FITC 표지된 항CD45를 넣었다. 반응 챔버가 충전되면, 전술한 특허(Oberhardt)에서 테스트 카드의 제조에 대해 기재된 바와 같이 샘플을 냉동하고, 동결 건조시켰다.
그러나, 코팅된 자성 입자 대 코팅된 비자성 입자의 비는 제한이 없으며, 회전 고리를 형성하고, 원판 또는 도트로 붕괴되기에 충분한 자성 입자가 있는 한, 어떠한 비율일 수도 있다.
혈소판/백혈구 상호 작용 테스트
전술한 시약을 함유하는 일회용품 또는 테스트 카드를 회전 자석 위의 플래트폼 상에 놓았다. 전혈(또는 다른 혈액 유도) 샘플을 웰에 가하여, 모세관 작용에 의해 반응 챔버로 흡인되었다. 그 시점에서, 자성 입자 및 비자성 입자가 유리되었는데, 자성 입자는 반응 챔버의 중심부 주변에서 회전 고리를 형성하였다. 반응이진행됨에 따라, 회전 고리의 내단부는 중심으로 이동하였는데, 최종 종점은 내단부의 중심점으로의 완전 붕괴를 제공하여 원판 또는 도트를 형성하였다. 총 경과 시간은 대략 1 내지 20 분, 통상적으로는 2 내지 4 분 범위였다.
전술한 vWf 코팅된 PIOP 및 vWf 코팅된 폴리스티렌 입자를 사용하는 경우, 혈소판/백혈구 상호 작용의 존재는 본래의 시약 조제물에 존재하는 백혈구 마커의 검출에 의해 결정하였다. 대안으로, PIOP가 백혈구 리간드(vWf 대신에)로 코팅된 경우, 혈소판/백혈구 상호 작용의 출현은 PIOP 고리 자체의 붕괴에 의해 검출하였다.
명백히, 본 발명의 다수의 수정예와 변형예가 상기 교시에 비추어 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범주 내에서, 본 발명은 본 명세서에 상세하게 기재된 것과 다르게 실행될 수도 있다.
본 출원은 1999년 11월 15일 출원된 미국 특허 가출원 제60/165,462호에 기초한 것이며, 본 명세서에서 그 전체를 참고 인용한다.

Claims (119)

  1. 전혈 또는 전혈 유도 샘플을, 혈소판 또는 백혈구 결합에 선택적인 리간드를 그 표면에 결합시킨 고상 자극 물질과 접촉시키는 단계; 및
    1 이상의 혈소판/백혈구/고상 자극 물질 복합체의 형성을 검출하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용의 평가 방법.
  2. 전혈 또는 전혈 유도 샘플을, 혈소판 또는 백혈구 결합에 선택적인 리간드를 그 표면에 결합시킨 마이크로입자를 포함하는 고상 자극 물질과 접촉시키는 단계; 및
    1 이상의 혈소판/백혈구/고상 자극 물질 복합체의 형성을 검출하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용의 평가 방법.
  3. 제2항에 있어서, 혈소판 또는 백혈구 결합에 선택적인 상기 리간드는 혈장 단백질, 혈장 단백질 단편, 세포외 기질 단백질, 세포외 기질 단백질 단편 및 이들의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 마이크로입자는 불규칙 또는 규칙적인 형상 또는 구형인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 포유류로부터 얻어지는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유류는 사람인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 마이크로입자는 폴리스티렌, 라텍스, 폴리카르보네이트, 아크릴로니트릴, 카르복실레이트, 테플론, 유리, 나일론, 덱스트란, 아가로스, 아크릴아미드, 실리카, 화분, 미생물, 산화철, 비자성 금속, 상자성 산화철, 금, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군 중에서 선택되는 1 이상의 물질로 이루어진 입자를 포함하는 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 접촉 단계는 교반, 진탕, 흡인, 전자기장, 초음파, 전단의 인가 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 과정에 의해 수행되는 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 혈소판 또는 백혈구 결합에 선택적인 상기 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트, 상기 단백질들의 단편, 백혈구 선택성 항체 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 혈소판 또는 백혈구를 선택 결합하는 리간드는 마이크로입자에 공유적으로, 부동태 흡착을 통하여, 또는 다리 결합 분자에 대한 결합을 통하여 부착되는 것인 방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 혈장 단백질 단편 또는 세포외 단백질 단편은 재조합 기술 또는 효소 절단을 통하거나, 또는 비효소적 화학적 수단에 의한 아미노산의 연결에 의하여 펩티드의 형성, 펩티드 유사체의 형성 또는 펩티드 미메토프의 형성에 의해 제조되는 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 비항응고 처리된 전혈인 방법.
  13. 제2항에 있어서, 상기 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 항응고 처리된 전혈인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 상기 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 버피 코트 내에 함유된 세포인 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 수혈 목적을 위해 채혈된 혈액 산물인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 수혈 목적을 위해 채혈된 상기 혈액 산물은 무작위 공여 혈소판, 분리 반출 혈소판, 버피 코트 및 패킹된 적혈구로 구성된 군 중에서 선택되는 특이적인 혈액 성분을 분리하도록 설계된 1 이상의 절차로 더 처리되는 것인 방법.
  17. 제2항에 있어서, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 비항응고 처리된 전혈, 항응고 처리된 전혈 및 버피 코트로 구성된 군 중에서 선택되는 일원이고, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 방법에 사용하기 전에 생체내에서 인공 표면에 접촉시켜 놓은 것인 방법.
  18. 제2항에 있어서, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 비항응고 처리된 전혈, 항응고 처리된 전혈 및 버피 코트로 구성된 군 중에서 선택되는 일원이고, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 방법에 사용하기 전에 생체외에서 인공 표면에 접촉시켜 놓은 것인 방법.
  19. 제2항에 있어서, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 비항응고 처리된 전혈, 항응고처리된 전혈 및 버피 코트로 구성된 군 중에서 선택되는 일원이고, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 방법에 사용하기 전에 시험관내에서 인공 표면에 접촉시켜 놓은 것인 방법.
  20. 제2항에 있어서, 상기 검출 단계는 유동 세포계, 세포 계수, 현미경, 광현미경, 투과 전자 현미경, 주사 전자 현미경, 공초점 현미경, 비디오 현미경, 효소 결합 면역 흡광 분석(ELISA), 방사선 면역 분석(RIA), 면역방사계 분석(IRMA), 겔 배제 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 조직화학 분석, 면역화학 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 형광 계내 하이브리드화, 서던 블로팅, 웨스턴 블로팅, 레이저 주사 세포계, 탁도 측정, 응고검출계, 세포내 이온 플럭스 측정, 세포외 이온 플럭스 측정, 세포 방출물의 측정, 고상 자극 물질/혈소판/백혈구 응고물 크기의 측정, 고상 자극 물질/혈소판/백혈구 복합체의 형성 속도 측정 또는 라텍스 비드 응집으로 구성된 군 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
  21. 제2항에 있어서, 전혈 또는 전혈 유도 샘플은 혈소판/백혈구 상호 작용에 영향을 주는 치료제로 치료 과정을 수행하고 있거나 또는 수행하려고 하는 포유류로부터 얻어지고, 상기 방법은 치료 중에 혈소판/백혈구 상호 작용을 평가하기 위하여 치료 과정 전 또는 도중에 예비 설정된 시간 간격으로 포유류로부터 얻은 샘플을 각기 포함하는 다수의 조합된 현탁액의 혈소판/백혈구 상호 작용의 정도를 결정하고, 이로써 치료 효능을 모니터하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  22. 제2항에 있어서, 상기 접촉 단계 중에 상기 전혈 또는 전혈 유도 샘플 및 고상 자극 물질을 선택된 시간 동안 혈소판/백혈구 상호 작용에 영향을 주는 1 이상의 제제와 배합하는 단계, 및 상기 1 이상의 제제의 첨가 전후에 혈소판/백혈구 상호 작용의 정도를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  23. 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합된 자성 입자와, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합된 비자성 입자의 혼합물(상기 제1 리간드 및 제2 리간드는 동일하거나 상이할 수 있다); 및
    백혈구 마커 화합물
    을 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  26. 제23항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  28. 제23항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 동일한 것인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 각기 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  30. 제23항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 서로 상이한 것인혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 리간드 또는 상기 제2 리간드 중 하나는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  32. 자성 입자와 비자성 입자의 혼합물을 포함하며, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 하나는 그 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합되어 있고, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 다른 것은 그 외부 표면에 백혈구와의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합되어 있는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  34. 제32항에 있어서, 상기 제1 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 자성 입자에 결합되는 것인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  35. 제32항에 있어서, 상기 제1 리간드는 상기 자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되는 것인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  36. 제35항에 있어서, 상기 시약은 백혈구 마커 화합물을 더 포함하는 것인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  37. 제36항에 있어서, 상기 백혈구 마커 화합물은 형광 화합물인 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약.
  38. 전혈 또는 전혈 유도 샘플을 진동 또는 회전 자기장의 존재 하에서, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합된 자성 입자와, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합된 비자성 입자의 혼합물(상기 제1 리간드 및 제2 리간드는 동일하거나 상이할 수 있다); 및 백혈구 마커 화합물을 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용 시약과 접촉시키는 단계; 및
    전혈 또는 전혈 유도 샘플 내 혈소판/백혈구 상호 작용 기능의 유무, 혈소판/백혈구 상호 작용의 수준 또는 둘 다를 결정하기 위하여 진동 또는 회전 자기장에 따른 자성 입자의 이동을 모니터링하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 샘플은 전혈인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 동일한 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 각기 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  46. 제38항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 서로 상이한 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제1 리간드 또는 상기 제2 리간드 중 하나는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 상기 접촉은 회전 자기장의 존재 하에서 일어나는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 회전 자기장은 2000 내지 2500 rpm의 진동수로 회전하는 것인 방법.
  50. 전혈 또는 전혈 유도 샘플을 진동 또는 회전 자기장의 존재 하에서, 자성 입자와 비자성 입자의 혼합물을 포함하며, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 하나는 그 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합되어 있고, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 다른 것은 그 외부 표면에 백혈구와의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합되어 있는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약과 접촉시키는 단계; 및
    전혈 또는 전혈 유도 샘플 내 혈소판/백혈구 상호 작용 기능의 유무, 혈소판/백혈구 상호 작용의 수준 또는 둘 다를 검출하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 샘플은 전혈인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  54. 제50항에 있어서, 상기 제2 리간드는 백혈구 선택성 항체, VCAM-1, 피브로넥틴, 라미닌, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, 콜라겐, 오스테오폰틴, vWf, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 점막 아드레신 세포 부착 분자 1(MadCAM-1), P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  55. 제50항에 있어서, 제1 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 자성 입자에 결합되는 것인 방법.
  56. 제50항에 있어서, 상기 제1 리간드는 상기 자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 혈소판/백혈구 상호 작용 시약은 백혈구 마커 화합물을 더 포함하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 백혈구 마커 화합물은 형광 마커 화합물인 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 검출은 상기 진동 또는 회전 자기장에 따른 상기 자성 입자의 이동을 모니터링함으로써 수행하는 것인 방법.
  60. 제56항에 있어서, 상기 검출은 상기 진동 또는 회전 자기장에 따른 상기 자성 입자의 이동을 모니터링함으로써 수행하는 것인 방법.
  61. 제57항에 있어서, 상기 검출은 상기 샘플의 응고 후 상기 샘플 내 상기 백혈구 마커 화합물의 농도차의 검출 또는 정량, 또는 둘 다에 의해 수행하는 것인 방법.
  62. 제50항에 있어서, 상기 접촉은 회전 자기장의 존재 하에 일어나는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 회전 자기장은 2000 내지 2500 rpm의 진동수로 회전하는 것인 방법.
  64. 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태를 가진 것으로 추정되는 환자로부터 얻은 전혈 또는 전혈 유도 샘플을 진동 또는 회전 자기장의 존재 하에서, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합된 자성 입자와, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합된 비자성 입자의 혼합물(상기 제1 리간드 및 제2리간드는 동일하거나 상이할 수 있다); 및 백혈구 마커 화합물을 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용 시약과 접촉시키는 단계; 및
    전혈 또는 전혈 샘플 내 혈소판/백혈구 상호 작용 기능의 유무, 혈소판/백혈구 상호 작용의 수준 또는 둘 다를 결정하기 위하여 진동 또는 회전 자기장에 따른 자성 입자의 이동을 모니터링하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태의 존재의 검출 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 샘플은 전혈인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  68. 제64항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  70. 제64항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 동일한 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 각기 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  72. 제64항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 서로 상이한 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 제1 리간드 또는 상기 제2 리간드 중 하나는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  74. 제64항에 있어서, 상기 접촉은 회전 자기장의 존재 하에서 일어나는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 회전 자기장은 2000 내지 2500 rpm의 진동수로 회전하는 것인 방법.
  76. 제64항에 있어서, 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상기 상태는 뇌혈관 발작(CVA), 일과성 허혈성 발작(TIA), 불안정성 안지나, 관상 동맥 질환(CAD), 급성 심근 경색(AMI) 및 염증으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  77. 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태를 가진 것으로 추정되는 환자로부터 얻은 전혈 또는 전혈 유도 샘플을 진동 또는 회전 자기장의 존재 하에서, 자성 입자와 비자성 입자의 혼합물을 포함하며, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 하나는 그 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합되어 있고, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 다른 것은 그 외부 표면에 백혈구와의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합되어 있는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약과 접촉시키는 단계; 및
    전혈 또는 전혈 샘플 내 혈소판/백혈구 상호 작용 기능의 유무, 혈소판/백혈구 상호 작용의 수준 또는 둘 다를 검출하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태의 존재의 검출 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 샘플은 전혈인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 제2 리간드는 백혈구 선택성 항체, VCAM-1, 피브로넥틴, 라미닌, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, 콜라겐, 오스테오폰틴, vWf, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 점막 아드레신 세포 부착 분자 1(MadCAM-1), P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  82. 제77항에 있어서, 제1 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 자성 입자에 결합되는 것인 방법.
  83. 제77항에 있어서, 상기 제1 리간드는 상기 자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 혈소판/백혈구 상호 작용 시약은 백혈구 마커 화합물을 더 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 백혈구 마커 화합물은 형광 마커 화합물인 방법.
  86. 제82항에 있어서, 상기 검출은 상기 진동 또는 회전 자기장에 따른 상기 자성 입자의 이동을 모니터링함으로써 수행하는 것인 방법.
  87. 제83항에 있어서, 상기 검출은 상기 진동 또는 회전 자기장에 따른 상기 자성 입자의 이동을 모니터링함으로써 수행하는 것인 방법.
  88. 제84항에 있어서, 상기 검출은 상기 샘플의 응고 후 상기 샘플 내 상기 백혈구 마커 화합물의 농도차의 검출 또는 정량, 또는 둘 다에 의해 수행하는 것인 방법.
  89. 제77항에 있어서, 상기 접촉은 회전 자기장의 존재 하에 일어나는 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 회전 자기장은 2000 내지 2500 rpm의 진동수로 회전하는 것인 방법.
  91. 제77항에 있어서, 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상기 상태는 뇌혈관 발작(CVA), 일과성 허혈성 발작(TIA), 불안정성 안지나, 관상 동맥 질환(CAD), 급성 심근 경색(AMI) 및 염증으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  92. 환자로부터 얻은 전혈 또는 전혈 유도 샘플을 진동 또는 회전 자기장의 존재 하에서, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합된 자성 입자와, 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합된 비자성 입자의 혼합물(상기 제1 리간드 및 제2 리간드는 동일하거나 상이할 수 있다); 및 백혈구 마커 화합물을 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용 시약과 접촉시키는 단계; 및
    전혈 또는 전혈 샘플 내 혈소판/백혈구 상호 작용 기능의 유무, 혈소판/백혈구 상호 작용의 수준 또는 둘 다를 결정하기 위하여 진동 또는 회전 자기장에 따른 자성 입자의 이동을 모니터링하는 단계
    를 포함하는, 환자가 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태에 대한 소인을 가졌는 지 여부의 결정 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 샘플은 전혈인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  96. 제92항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 제2 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  98. 제92항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 동일한 것인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 각기 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  100. 제92항에 있어서, 상기 제1 리간드 및 상기 제2 리간드는 서로 상이한 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 제1 리간드 또는 상기 제2 리간드 중 하나는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  102. 제92항에 있어서, 상기 접촉은 회전 자기장의 존재 하에서 일어나는 것인 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 회전 자기장은 2000 내지 2500 rpm의 진동수로 회전하는 것인 방법.
  104. 제92항에 있어서, 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상기 상태는 뇌혈관 발작(CVA), 일과성 허혈성 발작(TIA), 불안정성 안지나, 관상 동맥 질환(CAD), 급성 심근 경색(AMI) 및 염증으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  105. 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태를 가진 것으로 추정되는 환자로부터 얻은 전혈 또는 전혈 유도 샘플을 진동 또는 회전 자기장의 존재 하에서, 자성 입자와 비자성 입자의 혼합물을 포함하며, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 하나는 그 외부 표면에 혈소판과의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제1 리간드가 결합되어 있고, 상기 자성 입자 또는 상기 비자성 입자 중 다른 것은 그 외부 표면에 백혈구와의 직접 상호 작용에 대한 친화성을 가진 소정량의 제2 리간드가 결합되어 있는 혈소판/백혈구 상호 작용 분석 시약과 접촉시키는 단계; 및
    전혈 또는 전혈 샘플 내 혈소판/백혈구 상호 작용 기능의 유무, 혈소판/백혈구 상호 작용의 수준 또는 둘 다를 검출하는 단계
    를 포함하는 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상태의 존재의 검출 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 샘플은 전혈인 방법.
  107. 제105항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 II, 인자 IIa, 인자 V, 인자 Va, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 오스테오폰틴, 피브릴린, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린 술페이트 및 이들의 활성 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 제1 리간드는 폰 빌레브란트 인자 또는 그것의 활성 단편인 방법.
  109. 제105항에 있어서, 상기 제2 리간드는 백혈구 선택성 항체, VCAM-1, 피브로넥틴, 라미닌, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, 콜라겐, 오스테오폰틴, vWf, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 점막 아드레신 세포 부착 분자 1(MadCAM-1), P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
  110. 제105항에 있어서, 제1 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 자성 입자에 결합되는 것인 방법.
  111. 제105항에 있어서, 상기 제1 리간드는 상기 자성 입자에 결합되고, 상기 제2 리간드는 상기 비자성 입자에 결합되는 것인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 혈소판/백혈구 상호 작용 시약은 백혈구 마커 화합물을 더 포함하는 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 백혈구 마커 화합물은 형광 마커 화합물인 방법.
  114. 제110항에 있어서, 상기 검출은 상기 진동 또는 회전 자기장에 따른 상기 자성 입자의 이동을 모니터링함으로써 수행하는 것인 방법.
  115. 제111항에 있어서, 상기 검출은 상기 진동 또는 회전 자기장에 따른 상기 자성 입자의 이동을 모니터링함으로써 수행하는 것인 방법.
  116. 제112항에 있어서, 상기 검출은 상기 샘플의 응고 후 상기 샘플 내 상기 백혈구 마커 화합물의 농도차의 검출 또는 정량, 또는 둘 다에 의해 수행하는 것인 방법.
  117. 제105항에 있어서, 상기 접촉은 회전 자기장의 존재 하에 일어나는 것인 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 회전 자기장은 2000 내지 2500 rpm의 진동수로 회전하는 것인 방법.
  119. 제105항에 있어서, 혈소판/백혈구 상호 작용을 유발하는 상기 상태는 뇌혈관 발작(CVA), 일과성 허혈성 발작(TIA), 불안정성 안지나, 관상 동맥 질환(CAD), 급성 심근 경색(AMI) 및 염증으로 구성된 군 중에서 선택되는 일원인 방법.
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