KR20030065523A

KR20030065523A - 관류세척 보존 용액

Info

Publication number: KR20030065523A
Application number: KR10-2003-7006937A
Authority: KR
Inventors: 대비드 포츠; 제레미 피터 알란 로쥐
Original assignee: 유니버시티 오브 리드스
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2003-08-06
Also published as: US7510823B2; US20040053205A1; US8236486B2; DE60131189D1; US20130171613A1; ES2295222T3; NZ525522A; GB0028414D0; ES2647913T3; CA2427325A1; EP1997373A1; WO2002041696A1; KR100855354B1; DE60131189T2; US20090226877A1; ATE376770T1; EP1339280B1; AU1513102A; AU2002215131B2; US9049857B2

Abstract

혈액의 공급없이 세포의 보존을 위한 관류세척 보존 용액으로서,

ⅰ) 주입을 위한 물:

ⅱ) 단당류, 이당류, 삼당류, 혹은 다당류와 같은 적어도 한종류의 당류

ⅲ) pH 완충용액 성질을 갖는 적어도 한종류의 구성성분: 및

ⅳ) 칼슘 이동을 차단하는 성질이나 칼슘의 작용을 억제(anti-calcium action activity)하는 성질을 갖는 적어도 한종류의 구성성분을 포함한다.

그것의 제조방법;심장이 뛰거나 뛰지 않는 기증자로부터 받은 장기를 포함한 이식수술, 온허열과 냉허열의 모든 상황을 포함하는 수술, 심장마비와 심장수술, 사지나 전신의 보존, 생조직에 대한 실험, 유전조작된 세포나 조직 및 장기,사지 또는 전신을 보존하고 배양할때 사용되는 그것의 용도;세포의 관류세척, 보존, 관류세척 보존을 위한 방법; 그리고 그 용액의 구성요소를 포함하는 부분들의 키트에 관한것이다.

Description

관류세척 보존 용액{flush preservation solution}

본 발명은 혈액의 공급없이 세포의 생존을 유지시키는 관류세척 보존 용액, 장기이식과 수술 및 실험적인 실험관 시험에서 세포의 손상을 예방하기 위한 관류세척 보존 용액의 용도 및 보존, 관류, 또는 관류보존을 위한 방법과 처치 방법, 그리고 보존용액을 구성하는 부분들의 키트(kit)에 관한 것이다.

제 1a도는 간의 재관류를 위한 관류장치의 순환을 도시한 도면,

제 1b도는 심장의 재관류를 위한 관류장치의 순환을 도시한 도면,

제 2도는 24시간 냉각 보존뒤에 SOL4,UW 및 SOL20 그룹에서 재관류동안 나타난 담즙의 유출속도[μl.(g liver)^-1. (2h)^-1]를 도시한 도면,

제 3도는 24시간 냉각 보존뒤에 SOL4,UW 및 SOL20 그룹에서 재관류동안 나타난 담즙에서 담즙산의 농도(umol/L)를 도시한 도면,

제 4도는 24시간 냉각 보존뒤에 SOL4,UW 및 SOL20 그룹에서 재관류동안 나타난 담즙산 누출(%) 정도를 도시한 도면,

제 5도는 24시간 냉각 보존뒤에 SOL4,UW 및 SOL20 그룹에서 재관류동안 나타난 산소 소비량[μl.(g liver)^-1. (min)^-1]을 도시한 도면,

제 6도는 24시간 냉각 보존과 2시간 동안의 재관류 후에 UW와 PBSL 그룹에서 나타난 간의 무게 변화(%)를 도시한 도면,

제 7도는 24시간 냉각 보존 후에 UW와 PBSL 그룹에서 15분 간격으로 계속하여 담즙 유출의 정도를 도시한 도면,

제 8도는 24시간 냉각 보존 후에 UW와 PBSL 그룹에서 재관류동안 AST 방출정도를 도시한 도면,

제 9도는 24시간 냉각 보존 후에 UW와 PBSL 그룹에서 재관류동안 ALT 방출 정도를 도시한 도면,

제 10도는 24시간 냉각 보존 후에 UW와 PBSL 그룹에서 재관류동안 LDH 방출 정도를 도시한 도면이다.

장기이식은 현재 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 장관등에서 이루어지고 있다. 회수과정에서 이식된 장기는 그것의 혈관을 통해 보존액으로 관류세척(flush)된다. 이 보존액은 장기의 온도를 떨어뜨리는것을 촉진하고 세포의 부종을 방지하며 유리산소기(oxygen free radical)의 제거, pH 조절, 허열(ischaemic)적 손상의 감소, 장기가 신체로부터 벗어나 보관되는 시간의 연장 및 재관류(reperfusion)후 장기의 회복을 촉진시키기 위해 고안되었다.

중요 관류세척 용액들은 1967년 벨저(Belzer)와 1969년 콜린스(Collins)에의해 소개되었고, 계속하여 유로-콜린스(Euro-Collins)(EU), 마샬(Marshall,1976), 브레츠 네이더(Bretschneider)(Ismert et al 1988 참조) 및 다른 연구진들에 의해 변형되었다. 그중 가장 성공적인 위스콘신 대학 용액(UW)은 벨저(Belzer)와 그 연구진들에 의해 1988년에 소개되었다. 그러나 보다 개선된 관류세척 용액의 필요성은 여전히 남아있다. 최근의 증거들은 우수한 이식수술은 보다 즉각적인 기능과 보다 긴 기능적 이식편의 생존기간을 제공해야한다는 것을 보여주고 있다.

이분야의 문헌은 벨저(Belzer,1993); 벨저와 사우싸드(Belzer & Southard,1988); 본벤트르와 웨인버그(Bonventre & Weinburg, 1992); 체거니 외 (Changani,1999);처치힐과 네트만(Churchill & Kneteman, 1988); 콜린스(Collins,1997); 콜린스와 위콤(Collins & Wicomb, 1992); 달렌산드로 외(D'Allensandro et al, 1994); 멀벡커외(Muhlvacker et al, 1999); 사우싸드와 벨저(Southard & Belzer, 1995) 등에 의해 평론되었다

인산나트륨과 설탕만을 포함한 단순 관류세척 용액은 앤드류와 코피(Andrew & Coffey)에 의해 1982년에 소개되었고, 1983년 허열적 손상으로부터 신장세관들의 형태를 보호한다는 것이 보여졌다. 우리는 기능적 테스트를 수행하였고 미세관류(microperfusion)에 의해 판정되는 신장세관의 보존의 측면에서 기존의 보존용액(EC와 콜린스 C2 용액)과 비교해볼때 유사 용액(PBS140)이 상당히 성공적이라는 사실을 알게 되었다. PBS140은 다른 어떤 용액보다도 기부세관(proximal tubules)의 형태와 기능을 더 잘 보존한다는 것이 밝혀졌다. PBS140은 또한 전체 신장 기능을 보존하는데 있어서도 효과적이라는 것이 1988년과 1989에 퍼와나, 피리에 및 팟츠(Ferwana, pirie & Potts)에 의해 밝혀졌다. 램, 메이버, 팟츠 및 가일즈(Lam, Mavor, Potts & Giles, 1989)에 의한 실험적 장기이식에서, PBS140은 고삼투질농도의 구연산이 UW 용액과 비교할때 보다 효과적인 보존성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다(Lodge, Perry, Skinner, Potts & Giles 1991). PBS140은 리즈(Leeds)에서도 임상적으로 테스트 되었고, 인간 신장 장기이식에서도 잘 기능하는 것으로 나타났다(Ahmad, Kashi, Helmy, Hadingham, Potts & Lodge, 1997)

개선된 면역억제제의 출현과 함께 보다 좋은 성능을 갖는 다양한 기관(multi-organ)의 관류세척 용액에 대한 요구가 대두되고 있다.

많은 연구진들은 개선된 용액들의 개발, 특히 다수의 첨가제를 혼합하는 보다 간단한 용액의 개발을 연구하고 있다. 그런 노력들은 다른 조성공식을 가진 결과물들을 이론적으로 설명하는 것을 가능케하고 있다. 그럼에도 불구하고 명백히 교환이 가능한 첨가제의 유형이 사실상 기대되는 것과 다른 효과를 나타낼 수 있으며, 기능이 일개의 구성성분에 의지한다기보다는 전체적인 조성공식에 의해 결정되기 때문에, 주어진 첨가제와 또한 함께 존재하는 다른 구성성분이라는 두가지 관점에서 조성공식은 굉장히 특이적이 된다. 그것은 또한 서로 다른 기관들은 상당히 다른 요구조건을 가지고 있기 때문에 보편적인 관류세척 용액이라는 것은 그르치기 쉬운 목적이라는 것이 더욱 명백해진다. 그러나 개개인의 연구진들은 특정기관에도 적용될 수 있는 관류세척 용액의 기본을 형성하는 필수 성분에 집중하는 시도를 하고 있다. 이 분야의 다수의 평론들, 특히 "Evaluation of preservation of the intra abdominal organs", F'O Belzer, Transplantation Processings, vol 25, No4(August) 1993, p2527-2530, "Organ preservation", D'Alessnadro et al, Horizons in Organ Transplantation, Vol 74, No.5, 1994 p1083-1093, "A comparison of Flushing solutions for Liver procurement using an isolated perfused porcine model", Bell et al, Aust, N.Z.J Surg. (1994)64,565-568, " new organ preservation solutions", Collins et al, kidney international, Vol.42, Suppl.38(1992) PS197-S202, "Improved preservation solutions for organ storage", Changni et al, Transplantation, vol. 68, 345-355, No.3, 1999, "Investigation of a primary requirement of organ preservation solutions", Churchill et al, Transplantation, vol.65, 551-559, No.4, 1998 등이 연관성이 있다. 부분적으론 도움이 되기는 하지만, 각각의 연구와 평론들은 어떤 의미있는 추론도 도출될 수 없는 많은 변수들을 제시한다. 보존하는 동안 잃어버리거나 파괴되는 필수 세포성분에 관한 조성공식을 디자인하거나, 자연의 세포 기능과 상호반응하는 성분과 그런 기능의 붕괴방지, 유지 또는 구속하는 등의 성분에 관한 조성공식의 대비되는 개념들이 제안되고 있다. 효과적인 관류세척 용액은 분석이나 추론에 의해서라기 보다는 꾸준한 실험에 의해 도출되기 쉽다는 것을 보여준다.

따라서 특정 기관이나 살아있는 조직(유전조작된 것도 포함)의 세포의 연장된 보존을 가능케 하고, 장기이식, 온허열과 냉허열의 모든 상황을 포함하는 수술, 심장마비와 심장수술, 사지나 전신에 관한 수술 또는 실험 등에서 개선된 응용성(versatility)과 유효성 및 재관류를 제공할 수 있는 상업적으로 존속가능하고 효과적인 관류세척 용액에 대한 요구가 여전히 존재한다.

우리는 간이식을 위해 개선된 용액을 개발하고자 하는 실험을 수행하고 있다. 설탕-인산 완충용액이 좋은 기본적 보존을 제공한다는 것이 드러났다. 다수 첨가제들의 혼합은 UW 용액보다 낳은 보존효과를 갖는 용액을 생산했으며, 이는 그레이터 바일 플로(greater bile flow), 담즙산 추출(bile acid extraction),간 무게 증가 및 간 효소의 방출 등에 의해 판정되었다. 이 시도는 신장과 간에 대한 새로운 관류세척 용액을 제공한다.

심장은 다른 요구조건을 가지고 있다. 신장과 간을 위해 개발된 새용액은 심장에는 적합하지 않은것으로 판명되었다. 그러나 약간의 변형이 된 기본적인 설탕-인산 완충용액은 심장 조직을 보존하는데 있어서 효과적이라고 판명되었다. 이런 다른 요구조건들은 심장의 근육구성이 다른것과 확실히 연관되는 것 같다.

따라서, 가장 넓은 발명의 관점에서 볼때, 본 발명은 혈액의 공급없이 세포의 보존을 위한 관류세척 보존 용액을 제공하는데, 이는

ⅰ) 주입을 위한 물:

ⅲ) pH 완충용액 성질을 갖는 적어도 한종류의 구성성분: 및

ⅳ) 칼슘 이동을 차단하는 성질이나 칼슘의 작용을 억제(anti-calciumaction activity)하는 성질을 갖는 적어도 한종류의 구성성분

등을 포함한다.

관류세척 용액은 오직 이런 구성요소만으로 구성될수도 있는데, 이경우 보편적인 세포(universal cell type),특히 단순 세포계(simple cell systems),의 보존과 기능을 위해 적합하다. 한편 장기나 생조직 더욱 특정하게 작거나 큰 동물들, 특히 사람의 장기와 생조직과 같은 복합적 세포계(copmlex cell systems)의 보존에 있어서, 세포의 바람직한 타입의 보존이나 기능에 적합하도록 한개 또는 그 이상의 대체물이 함께 제공될 수도 있다.

본 발명에서 우리는 상당히 효과적이고 보편적인 기본용액이 다른 응용을 위해서 다수의 다른 구성성분을 이용해 동일효과를 내도록 보충될 수도 있다는 놀라운 사실을 발견했다. 이것은 현존하는 용액의 개선이라는 점에서 다수의 장점이 있는데 특정하게 원하는 조성물을 생산할 수 있는 조성 키트(formulation kit)의 준비가 가능하다는 것 외에도 보존기간동안 손상을 감소시키고 보존 기간을 연장시킬수 있는 가능성과 편리성 및 그런 조성물이 상업적으로 가능하도록 가격면에서도 예상되는 효과가 있다.

선행기술은 보편적인 보존용액의 기본을 가르치고자 시도하였으나 그것은 당류와 pH완충용액의 규명에서조차도 보편적으로 받아들여지지 않을 정도로 상당히 분분하였다. 본발명에서는 위에서 서술한바와 같이 밑바탕에 깔려있는 보존 메카니즘을 이론적으로 설명하고자 하는 시도 없이 실험에 의거하여 보편적으로 받아들여질 수 있는 관류세척 보존 용액을 보여준다.

본발명의 관류세척 보존 용액의 모든 구성성분은 순도에 관한 국내 또는 국제적인 약전기준을 만족시킨다. 주입을 위한 물은 정제되고 멸균되기 전에 탈이온화(de-ionized)시켰다.

당류는 설탕, 라피노즈(raffinose), 마니톨(mannitol)중에서 선택하였고, 바람직하게는 설탕이 선택되었다.

pH완충용액은 인산나트륨 완충용액, 인산칼륨 완충용액과 그 유사류, 바람직하게는 Na₂HPO₄, Na₂H₂PO₄,K₂HPO₄,K₂H₂PO₄와 그 유사류 중에서 선택되었다.

칼슘 이동 차단제나 칼슘의 활동을 억제하는 제제는 니카디핀(nicardipine), 딜티아젬(diltiazem), 베라파밀(verapamil), 니솔디핀(nisoldipine), 클로르프로마진(chlorpromazine) 또는 트리 프루오르페라진(trifluorperazine)과 같은 알려진 칼슘 이동 또는 채널 차단체, 바람직하게는 니카디핀(nicardipine), 및/또는 딜티아젬(diltiazem) 에서 선택되었다.

이런 이론에 제한됨이 없이 아래에서는 흔히 인정되고 있는 생리적 작용에 근거하여 기능에 의한 구성요소가 언급된다. 그러나 의심을 피하기 위해 나열된 구성요소들은 추정되는 작용에 부가적 또는 다른 기능을 부여할 수도 있으며 이는 발명을 제한하는 것으로서 간주되서는 안된다. 또한 나열된 구성요소에 대한 기능적 동등물(equivalents)들은 발명의 범위내로서 간주될 수 있다.

바람직하게는 관류세척 보존 용액은

ⅴ) 세포속으로 침투되지 않는, 바람직하게는 불침투성이며 격리성(sequestering)이 있는, 적어도 하나의 음이온;

ⅵ) 뜨롬복산 억제제(thromboxane inhibitor); 및

ⅶ)교질성(colloid)의 삼투성을 갖는 적어도 하나의 구성요소

들로부터 선별된 하나 또는 그이상의 구성요소를 포함한다.

불침투성이며 격리성의 음이온은 바람직하게는 락토비오네이트 (lactobionate) 또는 락토비오닉산(lactobinic acid)를 포함한다.

뜨롬복산 억제제(thromboxane inhibitor)는 혈액응고를 방지하며 바람직하게는 아스피린을 포함한다.

교질성(colloid)의 삼투성을 갖는 구성요소는 바람직하게는 폴리에칠렌 글라이콜(peg), 썩씨닐레이티드 젤라틴(succinylated gelatin, as in Gelofusine), 피콜(ficoll, a polysaccharide) 또는 녹말제품 등을 포함한다.

선별적으로 또는 대신하여 본발명의 관류세척 보존 용액은

ⅷ) 무기 또는 유기 용질;

ⅸ) 칼슘 킬레이팅 성질을 갖는 하나의 구성성분 또는 복수의 구성성분들;

ⅹ)철 킬레이팅 성질을 갖는 하나의 구성성분 또는 복수의 구성성분들

로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 구성성분을 포함할 수도 있다.

바람직하게는 무기 또는 유기 용질은 무기용질이며 양이온 및/또는 음이온을 포함한 전해질을 포함하며, 예로서는 Na⁺, K⁺,Cl^-,OH^-, Ca²⁺, Mg²⁺및 그 유사물이 있다.

칼슘 킬레이터로는 바람직하게는 구연산 혹은 EGTA를 포함하며, 철 킬레이터는 EDTA를 포함한다.

부가적으로 혹은 대신하여 본발명의 관류세척 보존 용액은

xi) 하나 이상의 아미노산;

ⅹii) 유리산소기나 유리산소기의 생산에 대항하여 효과적인 적어도 하나의구성요소;

ⅹiii) 에너지 공급체계 또는 그것에 영향을 미치거나 케톤바디에 영향을 미치는 적어도 하나의 구성요소

들로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 구성요소를 포함할 수도 있다.

아미노산은 바람직하게는 글루타민, 글라이신, 혹은 N-아세틸씨스테인이 바람직하다.

유리산소기 억제제는 바람직하게는 알로퓨리놀(allopurinol), 환원된 글루타싸이온, 더욱 바람직하게는 그들의 조합으로부터 선택된다.

에너지 공급체계 구성요소는 바람직하게는 아데노신을 포함하며 케톤바디는 베타-하이드록시 뷰티레이트(beta-hydroxy butyrate)를 포함한다.

부가적으로 혹은 대신하여 본발명의 관류세척 보존 용액은

xiv) 근육에서 크로스브리쥐(cross bridge) 기능에 가역적으로 작용할 수 있는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 뷰테인-디온-모녹싸임(butane-dione-monoxime);

xv) 세포막안으로 단백질을 삽입하고 세포막으로부터 단백질을 제거하는데영향을 미치는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 탁솔(taxol);

xvi) 세포내 신호전달체계나 이것을 변형시키는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 단백질 카이네이즈 억제제 혹은 칼모듈린(calmodulin) 억제제;

xvii) 세포막 안정작용을 갖는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 레놀라진(renolazine)과 그 유사물

등으로부터 선택된 특별 기능을 위한 부가적인 구성요소를 포함할 수도 있다.

본 발명의 관류세척 용액은 약전학적으로 허용되는 생리적 성질의 바람직한 범위에 의거하여 제조된다. 바람직한 pH의 범위는 6.5-7.8의 범위이고, 더욱 바람직하게는 6.5-7.0, 최상으로는 6.8-7.0이다

본 발명의 또다른 측면으로서 앞서 규정한바와 같이 관류세척 보존 용액의 제조를 위한 방법이 제공된다. 본 용액은 약전학적으로 허용되는 상태에서 당업계에서 알려진 단수한 혼합 방법에 의해서 적절히 만들어진다. 바람직하게는 구성요소들은 몰라 농도로 결정되고 혼합된다.

변화의 정도는 용액의 효과에 특이적이기도 또는 불특이적이기도 할 수 있으며 용액의 효과에 영향을 미치지 않는 변화의 정도는 본 발명의 범위내로 간주된다. 구성요소 종류의 선택, 일상적(routine)인 실험에 의해 양을 결정하는 것들도본 발명의 범위로서 간주된다.

구성요소(ii)는 50-150mmol/l, 예로서 대략적으로 100mmol/l, 의 범위내에서 존재하고; 각각의 구성요소 (iii),(v),(viii)는 15-75mmol/l, 예로서 대략적으로 15-20 또는 40-70mmol/l의 종합적인 양의 범위내서 존재하고; 구성요소 (xi)는 15-30mmol/l,예로서 대략적으로 20mmol/l, 의 범위내서 존재하고; 구성요소 (xii)는 5mmol/l에 달하는 범위,예로서 대략적으로는 3-5mmol/l,내서 존재하고; 구성요소(xiii) 키톤바디는 40mmol/l에 달하는 범위, 예로서 대략적으로는 25mmol/l,내서 존재하고; 구성요소 (vii)는 0.5-3.0mmol/l, 예로서 대략적으로는 0.75-1.33mmol/l, 1.0mmol/l 과 20,000mw, 범위내서 존재하고; 구성요소 (vi)는 0.3-1.0mmol/l, 예로서 0.5mmol/l,의 범위내서 존재하고; 구성요소 (iv)는 0.0005-0.1mmol/l, 예로서 대략적으로는 0.0005-0.5mmol/l, 범위내서 존재한다.

다른 구성요소들은 미량으로서 전형적으로 존재할것이며, 예로서 최고 1mmol/l에 달한다.

둘 또는 그이상의 종류로서 존재하는 특정 구성요소의 경우에 있어 상대적인 양은 결정적(critical)이거나 비결정적(non critical)일 수 있다. 선호되는 (xii)는 대략적으로 3mmol/l의 환원된 글루타싸이온과 0.35에서 0.4, 바람직하게는 0.4mmol/l의 알로퓨리놀이다.

전해질 (viii)의 선호되는 범위는 다음과 같다:

Na⁺50-150mmol/l

K⁺0-25mmol/l

Cl^-0-100mmol/l

OH^-0-75mmol/l

Ca²⁺0-2mmol/l

Mg²⁺0-10mmol/l

본 발명의 용액은 UV광선이 없는 무산소 상태하에서 제조되고 저장되는 것이 바람직하다. 구성요소 (i)-(iv)를 포함하는 용액은 연장된 기간동안 저장될 수 있으며 부가적 구성요소는 사용직전에 첨가되는 것이 좋다.

앞서 규정한 관류세척 보존 용액은 기본 구성요소 (i)-(v)와 함께 특정 기능을 갖는 부가적 구성요소들을 포함한다. 장기를 보존하는데 사용하는 용액은 특히 단순 세포계를 보존하는데 필요한 용액보다 훨씬 복잡하기는 하나, 우리는 그럼에도 불구하고 용액이 상대적으로 간단할 수도 있다는 것을 발견했다.

바람직하게는 신장, 간, 췌장 및 장관류 같은 복부의 장기를 위한 관류세척 보존 용액은 앞서 규정한 바와 같이 구성요소 (i)-(iv)와 함께 (v),(vi) 및 (vii)로부터 선택된 적어도 한종류의 구성성분, 더욱 바람직하게는 부가적으로 (viii),(xi),(xii) 및 (xiii)를 포함한다.

심장과 같은 근육장기를 보존하는데 사용되는 용액은 바람직하게는 앞서 규정한 바와 같이 구성요소 (i)-(iv)와 함께 (viii)로부터 선택된 구성성분, 더욱 바람직하게는 부가적으로 적어도 하나의(xiv) 구성요소를 포함한다.

간, 신장 및 췌장의 보존을 위한 관류세척 보존 용액은 바람직하게는 아래에서 주어진 구성요소의 조합들을 포함하는 것이며, 바람직하게는 목록화된 특정 종류의 조합과 더욱 바람직하게는 목록화된 양으로 조합하는 것이다:

구성요소 종류 양 mmol/L

v) 락토비오닉산(lactobionic acid) 50

viii) 수산화칼륨(KOH) 15

viii) 수산화나트륨(NaOH) 35

xii) 글루타싸이온(Glutathione) 3

iii) Na₂HPO₄26.45

iii) NaH₂PO₄16.66

xi) 글루타민 20

ii) 설탕 100

vi) 아스피린 0.5

xii) 알로퓨리놀(allopurinol) 0.4

iv) 니카디핀(nicardipine) 0.005

vii) Peg(20,000 MW) 1

심장 보존을 위한 관류세척 보존 용액은 바람직하게는 아래에서 주어진 구성요소의 조합들을 포함하는 것이며, 바람직하게는 목록화된 특정 종류의 조합과 더욱 바람직하게는 목록화된 양으로 조합하는 것이다:

구성요소 종류 양 mmol/L

iii) Na₂HPO₄42.3

iii) NaH₂PO_4.2H₂O10.67

iii) KH₂PO_4.16

ii) 설탕 100

viii) MgCl₂5

viii) CaCl₂0.6

viii) NaCl 12

iv) 딜티아젬(diltiazem) 0.5

우리는 또한 본 발명에 따른 관류세척 보존 용액 구성요소의 유효성은 다른 구성요소들의 존재에 의해 달성된다는 놀라운 사실을 발견했다. 이 이론에 제한됨 없이 다른 세포 기능의 유지를 보장하는 구성요소의 존재없이는 특정 구성요소의 효과는 무시되거나 또는 목표가 되는 지점으로 단순히 전송되지 않는 것 같다. 예를들어 불침투성이며 격리성을 갖는 음이온 (v)와 교질성의 삼투성 물질 (vii)의 존재는 다름 대체물보다 조합면에서 효과적이며, 유리산소기 억제제 (xii)로서 알로퓨리놀과 환원된 글루타싸이온이 함께 존재하는 것은 각각의 성분보다 훨씬 효과적이다. 우리는 이런 사실이 특정 세포, 조직 또는 장기 유형을 보존하는 특정 용액을 선택하는데 있어서 특별히 유용하며, 특정조합물은 하나의 유형을 위해서 유용하며, 다른 유형을 위해 적합화된 조합에 의해 단순히 치환될 수도 있다. 앞서 기술한바와 같이, 치환은 정상적인 기능을 하는 세포에서 치환물의 존재와 연관될 수도 있거나 혹은 어떤 방식으로 세포의 기능과 상호작용을 할 수도 있다. 바람직한 본발명의 실시예에서 우리는 교질성의 삼투압성 물질과 함께 불침투성이며 격리성의 음이온 (v)이 내부 복부 장기들의 보존을 위해 적합하다는 것을 발견했으며,심장과 같은 근육장기의 보존을 위한 용액으로 만드는데 있어서 이것은 근육 크로스브리쥐(cross bridge) 기능을 갖는 제제로 대체된다는 사실을 알게되었다.

따라서 어떤 대체물은 모든 세포종류에 필수적인 기본적인 세포의 기능 보존을 위해 필수적이며 그것은 구성요소 (i)-(iv)로 본 발명에서 판명되었다. 이 조성은 단순 조직이나 세포계를 보존하는데 있어서 굉장히 효과적이거나 만족할 만한 수준일 수도 있는 반면, 만일 그것이 장기나 특이하고 보다 복잡한 세포 기능을 제공하거나 요구하는 세포계를 보존하기 위해 고안된다면, 근육, 전해질,특정 세포막 활동, 에너지 공급등과 같은 그런 요구사항이나 기능을 보존할 수 있는 특별화된 대체물을 혼합하는 것이 필요하다.

본 발명의 또다른 측면으로서 관류세척 보존 용액을 제조하는 방법이 제공되는데, 이것은 구성요소 vii)와 불안정한 구성요소를 제외하고는 순차적으로 물에 구성요소를 첨가하고 용해한후, 구성요소 vii)가 있다면 첨가하고, 용액을 원하는 양에 달하도록 거의 만들고, pH를 조절하여 최종적 양으로 만든후, 멸균하여 냉각한다. 사용직전에 불안정한 구성요소의 첨가가 바람직하다면 용액은 저장될 수도 있다.

본 발명의 또다른 측면은 혈액의 공급없이 세포의 보존, 특히 장기와 생조직 및 세포들, 을위해 앞서 관류세척 용액, 보존용액, 또는 관류세척 보존 용액으로규정한 바와 같이 관류세척 보존 용액의 용도를 제공하는 것이다. 용액은 크거나 작은 동물 또는 포유류, 특히 인간의 장기나 생조직, 세포들을 위한 용도에 적합하다.

용액은 심장이 뛰거나 뛰지 않는 기증자로부터 받은 장기를 포함한 이식수술, 온허열과 냉허열의 모든 상황을 포함하는 수술, 심장마비와 심장수술, 사지나 전신의 보존, 생조직에 대한 실험, 유전조작된 세포나 조직 및 장기를 보존하고 배양할때 사용될 수 있다. 바람직하게는 용액은 혈관계를 통해 세포, 생조직, 장기, 사지 또는 전신으로 도입되는 관류세척 용액으로서 사용되며, 부가적으로는 관류된 세포나 조직 및 장기의 보존을 위한 보존 용액으로서 기능한다. 본 발명의 실시예에서 첫번째 용액은 세포, 조직, 장기, 사지 또는 전신을 관류세척 하기위해 사용되었고, 두번째 용액은 그것 또는 그것의 일부를 보존하기 이해 사용되었다. 예로서 관류세척 용액은 구성요소 (i)-(iv)를 앞에서 규정한 바와 같이 포함하며, 보존용액은 세포, 조직 또는 장기 등의 특정 기능의 손상 방지와 계속적인 기능의 수행을 위해 부가적인 구성요소를 포함한다.

발명의 또 다른 측면으로서 관류세척, 보존 또는 관류보존을 위한 방법이 제공되는데, 세포, 조직 및 장기는 앞서 규정한바와 같이 용액과 접촉하도록 한다. 방법은 단순 저체온법적(hypothermic) 저장일 수 있으며, 여기서 세포,조직 또는 장기는 용액으로 관류세척되고, 정상위치로부터 제거된후, 0℃와 4℃ 사이의 범위로 냉각된 후, 저장된다. 우리는 세포,조직 또는 장기등이 현재 실행되는 것보다 초과되어 오래 저장될 수 있다는 사실을 발견했는데, 예를 들어 심장은 6-12시간동안, 신장과 간은 48시간 이상 저장될 수 있다. 부가적으로 또는 대신하여 본 방법은 세포, 특히 조직이나 장기를 보존하는데 사용될 수 있는데, 여기서 세포, 조직 또는 장기는 관류세척되고 저체온성 상태로 유도된후 액침(immersion)이나 관류(perfusion) 방법으로 보존용액과 접촉된다.

바람직하게는 본 발명의 방법은 세포,조직,장기, 또는 환자에게 세포의 기능을 유지하거나 증진시킬 수 있는 효과적인 속도와 농도로서 생물학적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는 방법은 세포,조직 또는 장기의 기능, 예를들어 세포대사, 을 보존하는 방법 및/또는 근육의 활동이나 필수 세포 구성요소의 붕괴나 분비, 및/또는 담즙이나 오줌과 같은 형태의 분비물과 같은 특정 세포의 기능을 일시적으로 중단시키는 방법이다.

허열(ischaemia)은 장기속으로 혈액공급이 중단되며 일어나는 상황이다. 그 효과는 산소와 영양물의 부족과 이산화탄소와 다른 폐기물(waste products)의 축적에서 기인한다. 그것은 차가운 상태보다 체온상태에서 더욱 손상이 크므로 이식된 장기는 관류세척되고 냉각된다. 장기수여자는 빈번히 외상을 입고, 수여된 장기는 외상의 결과로서 온허열의 기간에 놓이게 될 수 있다. 실험적으로 온허열의 기간을 관류세척이전에 더하는 것은 이런 상황을 모방한다. 우리 용액은 이런 온허열 상태로부터 보호를 제공하는 장점이 있다.

바람직하게는 관류세척은 300mmHg에 달하는 압력에서 수행할 수 있고, 더욱 바람직하게는 대기압에서 200mmHg의 범위, 더욱 바람직하게는 160mmHg에 달하는 범위, 더욱 바람직하게는 100mmHg에 달하는 범위, 가장 바람직하게는 50mmHg에 달하는 범위에서 하는 것이 좋다.

본 발명의 또다른 측면으로서 특정 목적과 보편적인 관류세척, 보존 또는 관류세척 보존 용액으로서 기능하는 하나 또는 그 이상의 관류세척 용액의 제조용으로서, 앞서 규정한바와 같이 구성요소 (i)-(iv)와 (v)-(xvii)로부터 선택된 각각의 구성요소를 포함하는 관류세척 보존 용액 부분들의 키트를 제공한다.

이제 본 발명은 실시예에서 언급된것에 제한되지 않는 방식으로 이하에서 예시된다.

실시예1

본 발명에서 사용된 관류세척 보존 용액 & 비교

본 연구에서 이용된 보존 용액은 표 1,2,3에서 제시되었고, 양은 mmol/L로 나타냈다. SOLS는 물이 절반이 채워진 플라스크에 락토비오네이트, 수산화칼륨,인산나트륨, 글루타민, 설탕, 아스피린, 알로퓨리놀과 니카르디핀 중의 어느하나, 또는 모든것이 순차적으로 첨가되고 용해되어 만들어진다. 교질성 물질(PEG)은 그 다음에 첨가되고 용액은 원하는 양에 거의 달하도록 만든다. 수산화나트륨은 pH를 맞추기 위해 첨가되었다. 용액이 최종적 양으로 만들어졌다. 모든 용액은 여과에 의해 멸균되었고 유리병에 넣어 4℃에서 보관되었으며 3일내에 사용되었다. 환원된 글루타싸이온은 제조 또는 사용 직전에 첨가되었다.

비교군(comparative)

UW는 기준이 되는 상업적으로 판매되는 용액이다.(viaSpan/Belzer UW, DUPONT PHARMA). PBS140은 인산과 설탕으로 구성되어있다(140mmol/L).

화학물질

락토비오닉산(Sigma, L-2398), 알로퓨리놀(Sigma, A-8003),글루타민(Sigma, G-7029), 환원된 글루타싸이온(Sigma, G-4251), 아스피린 Sigma, A-5376), 딜티아젬(Sigma, D-2521), 타우로콜릭산(Sigma, T-4009), 폴리에틸렌 글라이콜(Sigma, P-2263), 니카디핀(Sigma, N-7510), 아데노신(Sigma, A-9251), 글라이신(Sigma, G07126), N-아세틸-씨스테인(Sigma, A-8199), 알부민, 보바인(Sigma, A-7906), 알라닌(Sigma, A-5824), 포도당(BDH, 10117 Y), 젤로퓨신(B.Braun Medical Ltd.,Lot:8274D14 F), 수산화칼륨(BDH, 102104V), 수산화나트륨(BDH, 102524X), 인산나트륨(BDH, 102494C), NaH₂PO_4.2H₂O(BDH, 310324Q) ,설탕(BDH, 102745C), MgCl₂6H₂O(BDH, 101494V).

표 1.상업적으로 이용가능한 보존용액의 조성

UW 용액
성분mmol/L
KHPO₄	25
염화칼륨	5
아데노신	5
글루타싸이온	3
MgSO₄	5
라피노즈	30
알로퓨리놀	0.01
K-락토비오네이트	100
펜타스타치	5
삼투아	320mommol/L
pH	7.4

표 2: 연구에서 사용된 본 발명 보존액의 조성

Mmol/L	SOL4	SOL5	SOL6	SOL7	SOL8	SOL12	SOL13
락토비오네이트	50	50	50			50	50
KOH	5	5	5	5	5	5	5
NaOH	40	40	40	5	5	55	40
글루타싸이온	3	3	3	3	3	3	3
Na₂HPO₄	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45
글루타민	20	20	20	20	20	20	20
NaH₂PO₄2H₂O	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66
설탕	100	100	100	100	100	100	100
아스피린	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549
알로퓨리놀	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673
딜티아젬	0.0221	0.0221	0.0221	0.0221	0.0221		0.0221
아데노신							5
젤로퓨신(ml/L)		100	300	100	300
니카디핀						0.005
삼투압	300	320	350	280	300	300	300
pH	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0

표 3 연구에서 사용된 본 발명 보존액의 조성

Mmol	SOL14	SOL15	SOL16*	SOL17#	SOL18#	SOL19#	SOL20#	PBSL	PBSH
락토비오네이트	50	50	50	50	50		50	50
KOH	5	5	5	5	5	5	5	16
NaOH	60	50	50	50	45		45	35
글루타싸이온		3	3	3	3	3	3	3
Na₂HPO₄	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45	26.45	42.3
글루타민	20	20	20	20	20	20	20	20
NaH₂PO₄2H₂O	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66	16.66	10.67
KH₂PO₄									16
설탕	100	100	100	100	100	100	100	100	100
아스피린	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5549	0.5
알로퓨리놀	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.3673	0.4
딜티아젬	0.0221	0.0221	0.0221	0.0221	0.0221	0.0221			0.5
니카디핀							0.005	0.005
아데노신
글라이신	10
n-아세틸씨스테인	10
NaCl									12
MgCl₂6H₂O		5							5
CaCl₂2H₂O									0.6
폴리에칠렌글라이콜			0.133	0.133	1.33	1.33	1.33	1.0
삼투압	300	30	320	340	380	290	380	380
pH	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0

폴리엔칠렌 글라이콜*의 분자량은 8000달톤, #는 20000달톤

SOL 4,SOL 5,SOL 6,SOL 7,SOL 8,SOL 12,SOL 13,SOL 14,SOL 15,SOL 16,SOL 17,SOL 18,SOL 19,SOL 20은 모두 SOL 4에 기초하나 다른 첨가제를 가지고 있다. 각 첨가제의 효과는 연구되어 더 의미가 있는 것들은 아래에서 언급된다. 특정한 결과는 SOL 20의 측면에서 아래에서 주어졌다.

글루타싸이온이 글라이신과 N-아세틸씨스테인으로 교체되었을때 우세점이 냉각된 쥐의간 보존에서 24시간내 관찰되었고, 이는 관류(reperfusion)동안 SOL 4에서 보다 더 큰 담즙생산에 의해 입증되었다. 니카디핀이 SOL 4용액에서 딜티아젬을 대신해 첨가되었을때 24시간 동안 냉각된 쥐 간 보존에 있어서 새로운 용액이 SOL 4보다 효과적이라는 것이 발견되었고, 이는 관류동안 보다 많은 담즙 생성과 적은 효소 방출로서 입증되었다. 서로 다른 PEG의 비교에 있어서, PEG20은 PEG8K보다 다소 효과적인 것으로 보이며, 이는 관류동안 숫자상으로 적은 AST와 LDH를 방출하는 것으로 입증되었다. SOL 17에서 PEG 20K의 농도는 0.133mmol/L에서 1.33 mmmol/L으로 증가시켜 SOL 18을 만들었는데 SOL 18이 SOL 17,SOL 4, 및 UW보다 24시간 동안 쥐의 간 냉각보존 측면에서 더욱 효과적이라는 것이 판명되었으며, 이는 많은 담즙생성과 보다 적어진 효소 방출및 보다 높은 담즙산 추출에 의해 입증되었다. SOL 20은 허열적 손상으로부터 쥐간을 보호하는데 잇점이 있다.

간 보존:재료 및 방법

1. 분리되어 관류된 쥐의 간(IPRL)

고어와 그 연구진들에 의해 기술된 방법(Gores et al.,1986)이 채용되었고, 이실험을 위해 변형되었다. 무게가 230-280그램에 달하는 동종교배된 숫컷 위스타쥐를 리즈대학(Leeds)의 바이오메디칼 서비스로부터 얻었다.

1.1. 공여자 간의 적출

쥐는 사전 금식없이 펜토바비탈(pentobarbital)(60mg/kg)을 복막조직내로 주사하므로서 마취되었다. 복부가 긴 정중선 절개에 의해 열려졌다. 간은 종양이나 염증의 어떤 증거가 있는지 검사되었다. 담즙관의 위치가 정해지고, 복측벽(anterior wall)이 절개되고, 직경 1mm의 폴리에틸렌 카테더(catheter)가 관입되었으며(cannulated), 이것은 견사에 의해 견고히 되었으며, 담즙관은 원위(distally)적으로 나눠진다. 500유닛의 헤파린을 함유한 생리식영수 0.5ml가 음경 정맥을 통해 주입된다. 복부의 대동맥은 분리되어 2mm 직경의 폴리에틸렌 카테터가 관입되었으며 이를 통해 간은 30ml 얼음 냉각된 실험용 보존용액들중의 하나를 이용해 관류세척 (flush)된다. 한편, 흉곽이 열리고, 흉곽 동맥은 클램프되며,인페리어 베나카바(IVC)는 관류액이 방류될 수 있도록 절단 박리되었다. 얼음 냉각된 생리 식염수는 간의 냉각을 위해 간 주변에 놓였다. 또다른 직경 2mm 폴리에틸렌 카테터는 간문맥의 정맥에 삽입되었고, 견사에 의해 결찰되었으며, 15ml의 같은 보존액이 이 카테터를 통해 간 속으로 관류(perfused)되었다. 그리고 나서 공여자의 간은 제거되었고 4℃의 같은 보존액속에서 24-48시간동안 저장되었다.관류세척 전의 온허열 그룹에 있어서 쥐의 심장은 간이 PBS140이나 UW용액으로 관류세척 되기전에 멈췄다. 관류전 온허열 그룹에서, 37℃ 챔버에서 30분간의 온허열이 재관류 직전에 부여되었다.

1.2 저장된 간의 재관류

본 연구에서 분리된 간의 재관류를 위한 기본적 용액은 생리적 식염수이다 (표 4).

표 4: 생리적 식염수의 조성

구성요소 mM/L

염화나트륨 114.0

K₂HPO₄3H₂O 2.5

MgCl₂6H₂O 1.2

Na-Lactate 4.0

NaHCO₃25.0

CaCl₂2H₂O 2.0

L- 알라닌 6.0

삼투압(mOsm/L) 297

pH 7.0

세척된 보바인 적혈구를 산소 수용능력을 증가시키기 위해 첨가하였다. 2%의 보바인 혈청 알부민(fraction 5, Sigma)을 온코틱(oncotic) 압력을 유지하기 위해 첨가되었다. 관류액의 조성은 표 5에서 개관되었다.

표5 관류액의 조성

조성 부피

생리적 식염수 160ml

신선한 보바인 적혈구 80ml

보바인 혈청 알부민 5g(=2% in solution)

타우로콜릭산 60-80mg(약 50um/hr)

신선한 보바인 혈액은 도살장에서 얻었다. 혈액은 10분동안 3000rpm으로 원심분리되었고, 적혈구는 분리되어 식염수로 두차례 세척된 후, 최종적인 관류액으로 데칸트되었다. 관류액의 헤마토크릿은 30-35%이다. pH가 측정되고, 8.4%의 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 대게 4.0ml를 필요로한다, 를 첨가하여 pH7.4로 적정하였다.

1.3 장치

관류(perfusion) 장치는 두개의 팬(fan)에 의해 37℃로 유지되는 퍼스펙스(perspex) 캐비넷(cabinet), 롤러 펌프(Watson-Marlow Co.), 멤브레인 산소발생기(membrane oxygenator, COBE), 두개의 씨린지(syringe) 펌프, 마그네틱 스터러(magnetic stirrer)와 간문맥 정맥에 삽입된 관을 통해 간과 연결되는 관류 회로등으로 구성되어 있다. 모든 구성요소는 펌프를 제외하고는 캐비넷안에 들어있다. 롤러 펌프는 회전을 하도록 하고, 두개의 씨린지 펌프는 타우로콜릭산과 중탄산나트륨의 분리된 주입을 위해서 사용된다.(그림 1a)

1.4 재관류

산소발생기를 포함하는 관류 회로는 앞서 유속 100-200 ml/min로 95%/5% O₂/CO₂혼합물로 산소가 생성되는 관류액으로 채워진다. 차갑게 보관된후, 간은 퍼스펙스 캐비넷에 있는 간 용기에 옮겨지고 간 문맥의 삽입관은 유입튜브에 연결된다. 색전증을 방지하기위해 삽입관에 공기방울이 들어가지 않도록 굉장한 주의가 필요하다. 타우로콜릭산을 위한 순환 펌프와 씨린지 펌프가 동시에 작동된다. 타우로콜레이트(sodium salt, Sigma)는 60-80μmol/hr 속도로 관류용액으로 펌프되어지고, 8.4%의 중탄산나트륨 용액은 관류액 pH를 7.4±0.1으로 유지하기위해 첨가되었는데 혈액 개스 분석기(Ciba-Corning)에 의해 측정되었다. 재관류 유입속도는 15ml/min였다. 담즙양은 계속해서 15분 간격으로 기록되었다. pH, pO_2,pCO₂의 측정을 위해 30분 간격으로 유입(간문맥)과 유출(간정맥)되는 샘플을 채취했다. 간정맥으로 얻은 샘플은 락테이트 디하이드로제네이즈(LDH), 아스파테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(ALT)의 양을 결정하는데에도 사용되었다. 재관류가 끝날 무렵, 담즙산 추출 퍼센티지를 계산하기위한 타우로콜릭산의 측정을 위해 관류액 샘플이 취해졌다. 담즙은 2시간동안의 재관류가 끝날무렵 담즙산의 농도에 대해 수집하고 기록하여 분석되었다. 담즙의 양은 μl.(g liver)^-1. (15 min)^-1또는 μl.(g liver)^-1. (2hr)^-1로서 표현된다. 간의 무게는 순수 간 무게(net weight)와 무게 변화를 산출하기 위해 저장 전과 후에 기록되었다. 간 무게는 또한 무게에서 변화를 계산하기 위해 재관류가 끝난후 또한 기록되었다.

1.5 결과의 보고

통계학적 분석의 보고와 결과의 가시화라는 두점을 용이하게 하기위해 관찰결과는 대부분의 경우 표와 그래픽 형태로서 제시된다.

1.6 통계학적 분석

데이터는 전체를 통해 means± SEM으로 표시된다. 각각의 실험 그룹에서 특별 명기가 없으면 동물의 숫자는 6(n=6)이다. 여기서 사용된 통계 테스트는 스튜던츠(Students) 't' 테스트이거나 하나의 대조군과 다수의 비교를 위한 더넷츠(Dunnets) 테스트를 이용한 분산의 원웨이(one way) 분석, 또는 다수의 비교를 위한 터키(Tukey) 테스트 등이 사용되었다. 검정도는 P〈0.05로 추정된다.

SOL 20은 SOL 4-19의 실험결과로부터 개발되었다. 결과는 24시간 냉각 쥐간 보존할때에 새 용액의 효과를 용액 4, UW 용액과 비교하였다.

1.5.1 담즙 유출

이 세 그룹에서 SOL 20의 담즙 생산이 최고였다. 담즙 유출은 회로에 간이 놓인지 5분안에 시작되었고, 재관류되는 2시간동안 계속되었다. 각 그룹의 담즙 모습은 우수해 보였다: 색깔은 짙은 노랑색이고, 매우 맑았다. 2시간동안 간의 그램당 담즙유출 속도는: SOL 4는 93.4±5.3, UW는 103.4 ±6.7, SOL 20은 198.3 ±18.0이었다. SOL 20은 SOL 4 또는 UW 어떤것과도 현저한 차이를 보이며 최고의결과를 보였다(그림 80). SOL 4,UW 및 SOL 20의 재관류동안 계속하여 15분 간격으로 측정한 담즙 유출 속도의 결과[μl.(g liver)^-1. (15 min)^-1]는 표 6과 그림 2의 누적된 결과로 보여졌다.

표 6: 24시간 냉각 보존뒤, SOL 4,UW 및 SOL 20의 재관류 동안 계속하여 15분 간격으로 측정한 담즙 유출 속도[μl.(g liver)^-1. (15 min)^-1]

시간(분)	0-15	15-30	30-45	45-60	60-75	75-90	90-105	105-120
SOL4	5.72±1.3	10.14±1.6*	10.72±0.98*	14.45±1.3*	13.09±1.0*	14.45±2.1*	11.38±0.87*	11.09±0.62*
UW	4.99±0.99	9.72±1.3*	14.01±2.2*	19.01±1.7*	16.90±1.2*	16.96±1.4*	11.92±0.63*	9.78±1.1*
SOL20	9.94±2.3	19.42±3.4	24.10±4.4	35.15±3.3	28.33±3.8	30.76±1.9	26.84±2.4	23.78±2.3

P〈0.05(vs SOL 20)

1.5.2. 효소 방출

1.5.2.1 ALT 방출: 재관류 기간동안, SOL 20에 24시간 저장된 간이 UW나 SOL 4에 저장된 것보다 현저히 적은 양의 ALT(U/L)을 방출했다(표 7). 한편, UW에 저장되 간으로부터 방출된 ALT는 SOL4에서 방출한 것과 비교해 차이가 없었다.

표 7: 24시간 냉각 보존뒤, SOL 4,UW 및 SOL 20의 재관류 동안 방출된 ALT(U/L)

시간(min) 헹굼 30 60 90 120

SOL 4 64.8±6.8 30.3±4.3* 32.0±2.9* 44.9±3.2 80.7±8.1*

UW 4.5±9.8* 24.8±2.9 37.6±3.7* 50.3±3.5* 73.0±6.7*

SOL 20 38.6±2.9 16.2±1.1 20.6±1.2 28.6±2.2 35.4±1.7

P〈 0.05(vs SOL 20)

1.5.2.2 AST 방출

SOL 20에서 저장된 간으로 부터 방출된 AST(U/L)는 UW 나 SOL4 어느것 에서 보다도 적었으며, UW 그룹과 비교할때 헹굼, 30, 120분 싯점에서 현저한 차가 있었고, SOL 4 그룹과 비료할때는 30, 90,120 분 싯점에서 현저한 차이가 있었다 (표 8). SOL 4 와 UW 그룹간에는 차이가 없었다.

표 8: 24시간 냉각 보존뒤, SOL 4,UW 및 SOL 20의 재관류 동안 방출된 AST(U/L)

시간(min) 헹굼 30 60 90 120

SOL 4 38.7±6.8 25.2±3.0* 32.9±6.2 49.0±8.0* 86.6±14*

UW 55.3±6.4* 23.8±2.0* 33.6±1.8 46.2±2.7 69.2±3.6*

SOL 20 27.9±1.3 13.3±0.92 21.6±1.2 26.6±1.4 30.2±1.5

P〈 0.05(vs SOL 20)

1.5.2.3 LDH 방출: SOL 20에 24시간 저장된 간이 UW나 SOL 4에 저장된 것보다 현저히 적은 양의 LDH(U/L)을 방출했다(표 9). UW 그룹과 비교할때, SOL 4에 저장되 간은 적은 LDH를 방출했으나 차이는 통계적으로 의미있지 않다.

표 9: 24시간 냉각 보존뒤, SOL 4, UW 및 SOL 20의 재관류 동안 방출된 LDH(U/L)

시간(min) 헹굼 30 60 90 120

SOL 4 544±36* 204±20* 241±31* 317±57* 461±52*

UW 565±56* 183±18* 216±18* 295±24* 390±21*

SOL 20 358±12 92±18 106±16 130±16 172±25

P〈 0.05(vs SOL 20)

1.5.3 재관류동안 SOL 4, UW 및 SOL 20 그룹에서 답즙산의 농도는 각각 6700±417, 6725±371,6529±317 μmol/L 였으며, 이 그룹간에는 현저한 차이가 없었다(그림 3). 담즙산 추출(%)은 SOL 20 그룹에서가 SOL 4나 UW 그룹보다 높았다(그림 4). UW 그룹과 비교할때, SOL 4 그룹에서 담즙산 추출은 현저히 다르지 않았다.

1.5.4 SOL 4, UW 또는 SOL 20에서 저장된 모든 간의 무게는 24시간 냉각 보존후 감소되었다. SOL 4, UW 또는 SOL 20 그룹간에 현저한 차이가 있다(표 10). SOL 20그룹에서 간의 무게는 2시간동안의 관류 후에 감소됐으나, 다른 두 그룹에서는 관류후 증가되었다. SOL 20과 SOL 4 또는 UW 사이에 현저한 차이가 있다.

표 10: 24시간 냉각보존후 2시간동안의 관류 뒤에 나타난 SOL 4, UW 및 SOL 20 그룹에서 보이는 간 무게 변화(%)

용액 보존후 관류후

SOL 4 -0.78±0.82 3.97±1.0*

UW -2.39±0.62** 5.27±1.1*

SOL 20 -2.13±0.72** -0.18±1.8

P〈 0.05(vs SOL 20) ; P〈 0.05(vs SOL 4

1.5.5 관류기간동안 SOL 4, UW 및 SOL 20 에 저장된 간의 산소 소비량은 각각 0.360±0.007,0.417±0.016 및 0.646±0.04 μmol.(g liver)^-1. (min)^-1였다. SOL 20 그룹은 SOL 4나 UW 그룹과 비교할때 현저한 차이가 있었으며, SOL 4와 UW 사이에도 현저한 차이가 있었다(그림 5).

완전히 독립적인 일련의 관찰이 PBSH에 대해 이루어졌는데 그림 6-10에서 제시되었다. 이 결과들은 PBSL이 UW보다 간의 팽윤(swelling)을 덜 야기한다는 것을 확인해준다(그림 6). PBSL에서 보존뒤 담즙 유출(bile flow)은 UW에서 보존된것보다 2배에 달한다(그림 7). PBSL에서 AST(그림 8),ALT(그림 9) 및 LDH(그림 10)의 방출은 낮았다. 이런 모든 결과는 UW 보존 용액에 대한 PBSL의 우위를 확인해준다.

2. 심장 보존: 재료와 방법

분리되어 작동하는 쥐 심장 모델이 닐리 쥬니어(Neely Jr)에 의해 기술된 바와 같이 사용되었다. 이 장치는 다음과 같은 부분으로 구성되어 있다:

1) 워터 재킷(jacketed)과 아래 출구에 유리필터를 갖는 란젠도프(Langendorff) 저장소(reservoir).

2) 심장 챔버(chamber)와 캐뉼라 조립. 두개의 스테인레스 스틸 캐뉼라를 지닌 테플론(teflon) 마개(bung)는 결찰사를 조절하기 위해 홈이 파여있다. 하나의 캐뉼라는 대동맥에 맞도록 똑바르며, 란젠도프(Langendorff) 관류, 카디오플레지아(cardioplegia) 관류, 압력과 심장 박동의 측정 및 대동맥 유출 측정 등을 위해 4개의 팔 모양의 연결구에 적합하도록 되어있다. 또다른 캐뉼라는 좌심방으로의 관삽입을 용이하게 하기위해 각을 이루고 있다. 두개의 캐뉼라에 의해 지지되는 관류된 심장은 워터 재킷트된 심장 챔버속으로 끼워진다.

3) 대동맥과 동맥의 버블트랩 및 컴플라이언스(compliance) 챔버.

4) 산소발생을 촉진하기위해 넓은 표면적을 제공하는 테이퍼 연결구를 갖는워터재킷된 세개의 콘덴서 유닛으로 구성된 산소 발생 챔버.

5) 심장 위 60㎝에 위치하며 그것을 통해 보존액이 심장으로 주입될 수 있는 카디오플레지아 저장소.

6) 산소발생 챔버를 통과한 관류액을 재활용하기 위해 사용되는 연동펌프와 필터

7) 심장박동률과 대동맥 압력을 기록할 수 있는 압력계와 펜(pen) 기록기.

심장 재관류 기구의 단순화된 그림이 그림 1b에서 보여진다.

2.2. 재환류 매체(medium)

재환류액은 크렙스-헨쎌릿 완충용액(KHB)을 37℃에서 95% 산소, 5% 이산화탄소로 안정시키는 변형을 가하였다. 이 완충용액의 최종 염의 농도는(mmol/L) NaCl 118, KCl 4.7, MgSO₄1.2, CaCl₂2.5, KH₂PO₄1.2, NaHCO₃25이다.

2.3 연구 계획

숫컷 위스타 쥐(250-320g)는 쏘디움 펜토바비톤(pentobarbitone)을 복강내로 주입하여 마취되었다. 수술직전 헤파린(250IU)이 정맥으로 주사되었다. 복부는 흉곽의 노출을 용이하게 하기위해 개복되었고, 흉부조루술(thoracotomy)이 실행되었으며, 심장은 절제되어 즉시 얼음 냉각된 식염수에 두었다. 대동맥으로 관삽입이 실행되었고, 심장은 관류기구에 연결되었으며 초기 세척과 심장이 박동상태를 회복하는 안정 기간동안 37℃에서 KHB 용액에 의한 관류를 하였다. 이 기간동안 좌심방은 심장이 펌핑 모드로 전환될 수 있도록 관의 삽입이 이루어졌다. 이런 배치에서 KHB는 좌심실로 유출되고, 용액을 다시 대동맥으로 펌프되어 컴플라이언스 챔버를 통과한다. 이 챔버는 부분적으로 공기가 채워져 있어서 다소의 유연성을 제공한다. 이 챔버에서 압력의 발달은 용액이 유출측정기(flow meter)를 통과해 심장 100㎝ 위에 위치한 버블트랩을 통과하도록 하며 용액은 재활용되기 위해 산소발생 챔버를 경유해 되돌아온다.

심장 기능 조절능력의 측정은 15분 동안 매 5분마다의 심장박동(HR), 수축기 압력(SP), 대동맥의흐름(AF), 관상 흐름(CF), 및 카디악 아웃풋(cardiac output)을 포함한다. 45ml/min 이하의 대동맥의 흐름, 16ml/min 이하의 관상 흐름 또는 240비트/min 이하의 심장박동을 보이는 심장은 연구에서 제외되었다. 그리고나서 심장은 심장위에 위치한 카디오플레지아 저장소에 있는 4개의 보존액(25ml)중의 하나를 이용해 관류세척되고, 4℃에서 6시간 동안 저장되었다. 실험된 용액은 세인트 토마스 병원 용액 no 2(STH2), UW용액, 쎄시어 용액(CS), 인산으로 완충된 설탕 용액(PBSH)이다. 각 그룹에 포함된 심장의 최소 숫자는 6이다.

원하는 기간동안 저장후에, 15분 안정기간동안 란젠도프(Langendorff) 모드에서 재관류가 수행되었고, 란젠도프(Langendorff) 관류를 멈추고 좌심방을 통해 관류를 시작하므로서 작동하는 심장 모드로 전환되었다. 작동하는 심장 모드는 30분동안 지속되었고, 이 기간동안 각각의 허열전 대조치와의 비교를 위해 5분간격으로 심장기능이 측정되었다. 심장기능의 회복은 허열전 대조치에 대한 퍼센티지로서표현되었다.

연구 계획을 요약하면 다음과 같다;

란젠도프(Langendorff) 모드(2-3 분)

작동 모드(15분)

카디오플레지아(관류세척액 25ml)

보존(6시간)

란젠도프(Langendorff) 모드(15분)

작동 관류(30분)

통계적 분석

각 그룹의 결과는 mean±SEM으로 나타냈다. 그룹의 평균은 아노바(ANOVA.one way analysis of variance)를 이용해 비교하였다. 통계학적 검정율은 0.05 이하의 P 수치에서 받아들여졌다.

2.4 결과

4개의 실험그룹에 대한 결과( mean±SEM)는 혈액동태적(haemodynamic) 변수들에 대한 허열전 기능의 회복%를 표시한 것으로서 표 11에서 보여진다.

그룹 N HR SP AF CF CO

STH2 8 93±2.2 80.2±0.8 37.5±2.5 71.59±5.9 47.3±2.1

CS 8 89.6±2.4 79±1.2 41.5±3.2 67.8±4.2 47.6±2.0

UW 7 98.7±1.2 80.1±1.8 47.6±5.0 65.3±4.5 51.2±4.4

참고문헌

Andrews PM and Coffee AK(1982). Laboratory Investigation 46, 100-120

Belzer FO, Ashby Bs and Dunphy JE(1967). Lancet 2, 536-539.

Belzer FO and Southard JH(1988). Transplantation 45, 673-676

Coffee AK and Andrews PM (1983).Transplantation 35, 136-143

Collins GM, Bravo-Shugarman M and Terasaki PI(1969).Lancet 2, 1219-1222

Ferwana O, Pirie SC and Potts DJ(1988). Clinical Science 74, 261-268

Ferwana O, Pirie SC and Potts DJ(1989). Clinical Science 77, 77-84

Ismer FE, Ludwig A, Schuck O, Bretschneider HJ and Peiper HJ(1988).Transplantation Proceedings 20, 885-886

Lam FT, Mavor A, Potts DJ, and Giles G(1989) Transplantation 47, 767-771

Ross H, Marshall VC and Esott MO(1976). Transplantation 21, 498-501

Pirie SC and Potts DJ(1989).Clinical Science 70, 443-452

Claims

혈액의 공급 없이 세포의 보존을 위해

ⅰ) 주입을 위한 물;

ⅱ) 적어도 한종류의 당류;

ⅲ) pH 완충용액 성질을 갖는 적어도 한종류의 구성성분; 및

ⅳ) 칼슘 이동을 차단하는 성질이나 칼슘의 작용을 억제(anti-calcium action activity)하는 성질을 갖는 적어도 한종류의 구성성분; 을 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 1 항에 있어서, 당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 또는 다당류로부터 선택된 관류세척 보존 용액.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, pH 완충용액은 인산나트륨 완충용액과 인산칼륨 완충용액으로 부터 선택된 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 칼슘 이동을 차단하거나 칼슘의 작용을 억제(anti-calcium action activity)하는 성분은 니카디핀(nicardipine), 딜티아젬(diltiazem), 베라파밀(verapamil), 니솔디핀(nisoldipine), 클로르프로마진(chlorpromazine) 및트리프루오르페라진(trifluorperazine)으로부터 선택된 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,

ⅴ) 불침투성이며 격리성(sequestering)이 있는 적어도 하나의 음이온;

ⅵ) 뜨롬복산 억제제(thromboxane inhibitor); 및

ⅶ) 교질성(colloid)의 삼투성을 갖는 적어도 하나의 구성요소;

들로부터 선택된 하나 또는 그이상의 첨가적 구성요소를 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 5 항에 있어서, 불침투성이며 격리성이 있는 음이온은 락토비오네이트 또는 락토비오닉산을 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 뜨롬복산 억제제는 아스피린을 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 5항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서, 교질성(colloid)의 삼투성을 갖는 요소는 폴리에칠렌 글라이콜(peg), 썩씨닐레이티드 젤라틴(succinylated gelatin), 피콜(ficoll)과 같은 다당류 또는 녹말제품을 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 5 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,

ⅷ) 무기 또는 유기 용질;

ⅸ) 칼슘 킬레이팅 성질을 갖는 하나의 구성성분 또는 복수의 구성성분들;

ⅹ)철 킬레이팅 성질을 갖는 하나의 구성성분 또는 복수의 구성성분; 들로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 구성성분을 부가적으로 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 9 항에 있어서, 무기 용질이 Na⁺, K⁺,Cl^-,OH^-, Ca²⁺및 Mg²⁺로부터 선택된 양이온 및/또는 음이온을 포함하는 전해질인 관류세척 보존 용액.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 칼슘 킬레이터는 유기산 또는 EGTA를 포함하며 철 킬레이터는 EDTA를 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,

xi) 하나 이상의 아미노산;

ⅹii) 유리산소기나 유리산소기의 생산에 대항하여 효과적인 적어도 하나의 구성요소;

ⅹiii) 에너지 공급체계 또는 그것에 영향을 미치거나 케톤바디에 영향을 미치는 적어도 하나의 구성요소; 들로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 구성요소를부가적으로 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 12 항에 있어서, 아미노산은 글루타민, 글라이신 및 N-아세틸씨스테인으로부터 선택된 관류세척 보존 용액.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 유리산소기 억제제는 알로퓨리놀(allopurinol), 환원된 글루타싸이온과 그들의 조합으로부터 선택된 관류세척 보존 용액.
제 12 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서, 에너지 공급체계는 아데노신이나 베타-하이드록시 뷰티레이트(beta-hydroxy butyrate)또는 베타-하이드록시 뷰티레이트(beta-hydroxy butyrate)를 포함하는 케톤바디를 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,

xiv) 근육에서 크로스브리쥐(cross bridge) 기능에 가역적으로 작용할 수 있는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 뷰테인-디온-모녹싸임(butane-dione-monoxime);

xv) 세포막안으로 단백질을 삽입하고 세포막으로부터 단백질을 제거하는데 영향을 미치는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 탁솔(taxol);

xvi) 적어도 하나의 단백질 카이네이즈 억제제 혹은 칼모듈린(calmodulin) 억제제;

xvii) 세포막 안정작용을 갖는 적어도 하나의 구성요소로서 바람직하게는 레놀라진(renolazine); 등으로부터 선택된 부가적인 구성요소를 포함하는 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서, pH가 6.5-7.8 범위인 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서, 삼투압이 300-450mosmol/l 범위인 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 구성요소(ii)는 50-150mmol/l의 범위내에서 존재하고; 각각의 구성요소 (iii),(v),(viii)는 15-75mmol/l의 종합적인 양의 범위내서 존재하고; 구성요소 (xi)는 15-30mmol/l의 범위내서 존재하고; 구성요소 (xii)는 5mmol/l에 달하는 범위내서 존재하고; 구성요소 (vii)는 0.5-3.0mmol/l 범위내서 존재하고; 구성요소 (vi)는 0.3-1.0mmol/l의 범위내서 존재하고; 구성요소 (iv)는 0.0005-0.1mmol/l 범위내서 존재하고; 다른 구성요소들은 1mmol/l에 달하는 미량으로서 존재하는 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서, 앞서 규정한 바와 같이 구성요소 (i)-(iv)와 함께 (v),(vi) 및 (vii)로부터 선택된 적어도 한종류의 구성성분, 더욱 바람직하게는 부가적으로 (viii),(xi),(xii) 및 (xiii)를 포함하는 신장, 간, 췌장 및 장관류 같은 복부의 장기 보존을 위한 관류세척 보존 용액.
제 1 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서, 앞서 규정한 바와 같이 구성요소 (i)-(iv)와 함께 (viii)로부터 선택된 구성성분, 더욱 바람직하게는 부가적으로 적어도 하나의(xiv) 구성요소를 포함하는 심장과 같은 근육장기를 보존하는데 사용되는 관류세척 보존 용액.
다음과 같은 구성요소 종류와 양을 포함하는 간, 신장 및 췌장 보존을 위한 관류세척 보존 용액.

구성요소 종류 양 mmol/L

v) 락토비오닉산(lactobionic acid) 50

viii) 수산화칼륨(KOH) 15

viii) 수산화나트륨(NaOH) 35

xii) 글루타싸이온(Glutathione) 3

iii) Na₂HPO₄26.45

iii) NaH₂PO₄16.66

xi) 글루타민 20

ii) 설탕 100

vi) 아스피린 0.5

xii) 알로퓨리놀(allopurinol) 0.4

iv) 니카디핀(nicardipine) 0.005

vii) Peg(20,000 MW) 1
다음과 같은 구성요소와 양을 포함하는 심장보존을 위한 관류세척 보존 용액.

구성요소 종류 양 mmol/L

iii) Na₂HPO₄42.3

iii) NaH₂PO_4.2H₂O10.67

iii) KH₂PO_4.16

ii) 설탕 100

viii) MgCl₂5

viii) CaCl₂0.6

viii) NaCl 12

iv) 딜티아젬(diltiazem) 0.5
약전학적으로 허용되는 상태하에서 만일 존재한다면 구성요소 vii)과 불안정한 구성요소를 제외하고 순차적으로 물에 구성요소를 첨가하고 용해한후, 구성요소 vii)과 불안정한 구성요소가 있다면 첨가하고, 용액을 원하는 양에 달하도록 거의 만들고, pH를 조절하여 최종적 양으로 만든후 멸균하여 냉각하는, 제 1 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에서 청구된 관류세척 보존 용액을 제조하는 방법.
혈액의 공급없이 세포의 보존, 특히 장기와 생조직 및 세포들의 손상을 방지하기 위한 관류세척 용액, 보존용액, 또는 관류세척 보존 용액인,제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에서 청구된 관류세척 보존 용액의 용도.
제 25 항에 있어서, 용액은 심장이 뛰거나 뛰지 않는 기증자로부터 받은 장기를 포함한 이식수술, 온허열과 냉허열의 모든 상황을 포함하는 수술, 심장마비와 심장수술, 사지나 전신의 보존, 생조직에 대한 실험, 유전조작된 세포나 조직 및 장기,사지 또는 전신을 보존하고 배양할때 사용되는 보존 용액으로서의 용도.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 보존용액은 혈관계를 통해 세포, 생조직, 장기, 사지 또는 전신으로 도입되며, 부가적으로는 관류된 세포나 조직 및 장기의 저장을 위한 보존 용액으로서 기능하는 보존용액의 용도.
제 25 항 내지 제 27 항 중의 어느 한 항에 있어서, 앞서 규정한 첫번째 용액은 세포, 조직, 장기, 사지 또는 전신을 세척하기 위해 사용되고, 두번째 용액은 그것들이나 그것의 일부를 보존하기 위해 사용되는 관류세척 보존 용액의 용도.
세포, 조직 및 장기는 단순 저체온법적(hypothermic) 저장을 위해 제 1 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 용액과 접촉되도록 하며, 여기서 세포,조직 또는 장기는 용액으로 관류세척되고, 정상위치로부터 제거된후, 0℃와 4℃ 사이의 범위로 냉각된 후 저장되는, 세포의 관류세척, 보존 또는 관류보존을 위한 방법.
제 29 항에 있어서, 세포, 조직 또는 장기가 세척되고 저체온 상태로 도입된 후 액침이나 관류에 의해 보존용액과 접촉되는 세포, 특히 조직이나 장기의 보존을 위한 방법.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 방법은 특정 세포,조직 또는 장기의 기능을 보존, 및/또는 일시적으로 특정 기능을 중단시키는 것으로서 세포,조직,장기, 또는 환자에게 세포의 기능을 유지하거나 증진시킬 수 있는 효과적인 속도와 농도로서 제 1항에서 23항까지의 청구항에서 청구된 용액을 생물학적으로 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 29 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서, 관류세척이 300mmHg에 달하는 압력에서 수행하는 방법.
특정 목적과 보편적인 관류세척, 보존 또는 관류세척 보존 용액으로서 기능하는 하나 또는 그 이상의 관류세척 용액의 제조용으로서, 구성요소 (i)-(iv)와 하나 또는 그 이상의 (v)-(xvii)로부터 선택된 각각의 구성요소를 갖는 제 1항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에서 청구된 관류세척 보존 용액을 포함하는 부분들의 키트.