KR20030040536A - 알로스테릭 조절 부위를 함유하는 α/β 단백질의 리간드결합 활성/효소 활성을 조절하는 물질 및 방법 - Google Patents

알로스테릭 조절 부위를 함유하는 α/β 단백질의 리간드결합 활성/효소 활성을 조절하는 물질 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 α/β 단백질과 결합 파트너간의 결합을 조절하는 방법, 조절자를 동정하는 방법 및 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

알로스테릭 조절 부위를 함유하는 α/β 단백질의 리간드 결합 활성/효소 활성을 조절하는 물질 및 방법{MATERIALS AND METHODS TO MODULATE LAGAND BINDING/ENZYMATIC ACTIVITY OF α/β PROTEINS CONTAINING AN ALLOSTERIC REGULATORY SITE}
단백질의 알파/베타(α/β) 도메인 상과는 특이적인 폴드 구조에 의해 동정되는 대략 97개의 군을 포함한다. 상과중의 단백질은 일반적으로 TIM 배럴(barrel), 홀스헤드(horsehead) 폴드 또는 중앙의 베타 시트가 알파 헬릭스에 의해 둘러싸이며 평행, 역평행 또는 혼합 배향으로 배열된 다수의 베타 쇄 도메인으로부터 형성되는 베타-알파-베타 구조와 같은 구별되는 폴드 구조를 보유한다.
인테그린 I 도메인을 포함하는 단백질, A 도메인 구조를 포함하는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 및 다양한 효소를 포함한 상과의 많은 구성원들이, 단백질의 삼차 구조에서 폴드를 야기하는 개방된 비틀린 베타 시트를 갖는다. 이러한 폴드는 흔히 로스만 폴드(Rossmann fold), 로스만-유사 폴드, 또는 디뉴클레오티드 결합 폴드로 불린다. 기능적으로 다양한 많은 단백질들이 로스만 폴드를 함유하며, 이들 단백질은 SCOP, SMART, 및 CATH 데이타베이스를 이용하여 확인될 수 있다. 원형(prototypic) 로스만 폴드는 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 NADP 결합 부위에서 발견된다.
많은 로스만 도메인들이 중앙 베타 시트의 "상부면" 상에 기능적 부위를 포함한다. 예를 들어 인테그린 I 도메인, Rho/Rac GTPase 및 이종삼합체 GTPase의 이 부위는 조화된 금속 이온 결합을 허용한다. 적어도 일부의 인테그린 I 도메인에서, 결합된 금속 이온은 결합된 리간드와 중요한 직접 접촉을 형성하며, 금속 이온 결합의 이 부위는 금속 이온 의존성 부착 부위(MIDAS)로 나타내어져 왔다. 다른 단백질들에서 금속 이온 결합 부위는 또한 예를 들어 GTPase에 대한 GTP/GDP 결합, 및 박테리아 단백질 ENR에 대한 보조 인자(즉, NAD 및 FAD)의 결합을 포함하는 리간드 결합에 근접해있다. 이전의 연구는 GTPase, LFA-1[참조: 허쓰 등, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 97:5231-5236 (2000)], Mac-1[참조: 옥스빅 등, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 96:2215-20 (1999)] 및 알파2[참조: 엠슬리 등, Cell 101:47-56 (2000)]를 포함한 적어도 일부 단백질의 경우, MIDAS 영역내의 리간드 결합이 그 단백질의 활성 상태와 비활성 상태 사이의 형태 변화를 요구함을 보여주었다.
인테그린 I 도메인 구조는 상세히 규명되었다. I 도메인 구조가 확인된 인테그린중에, 일차 아미노산 서열 비교는 전체적인 상동성이 다른 인테그린 군 구성원간에 크게 상이할 수 있음을 나타낸다. 이러한 상동성의 다양성에도 불구하고, 일부 잔기는 많은 인테그린에서 높게 보존된다. 더욱이, 아미노산 서열 상동성에서의 관찰된 다양성이 개개의 서브유닛내의 I 도메인의 삼차 구조 또는 이종이합체내의 사차 구조에서의 실질적인 차이를 야기하는지 여부는 여전히 명확하지 않다.
αM[참조: 리 등, Cell 80:31-638 (1995)], αL[참조: 큐 등, Structure 4:931-942 (1996)], α1[참조: 리치, J.Biol.Chem., 274:24906-24913 (1999)], 및 α2[참조: 엠슬리 등, J.Biol.Chem., 272:28512-28517 (1997)]를 위한 I 도메인이 결정화되어 그전에 추측된 기능적 영역의 상세한 분석을 가능하게 하였다. αM결정 구조는 중앙의 소수성 베타 시트의 상부를 따라 형성된 리간드 결합 틈을 포함한 로스만 폴드를 명확히 확인하였으며, 이때 베타 시트는 다수의 양친성 α헬릭스에 의해 둘러싸인다[참조: 디킨슨 등, Cell. Mol. Life. Sci. 54:556-566 (1998)]. 이전의 관찰과 일치되게, αM과 αL둘다 결정형 I 도메인이 또한 MIDAS 영역을 포함하는 것으로 나타났다.
결정형 αMI 도메인으로부터의 일반적인 구조 관찰은 αL의 결정형 구조에 관련된 것으로 보인다. 이들 관찰은 αL이 리간드 결합이 일어날 수 있기 전에 비활성 상태에서 활성 상태로의 전환을 일으킴을 명백히 나타낸다. 이 관찰은 NMR 연구에서 확인되었는바, 여기서 αLI 도메인에의 ICAM-1의 결합이 αLMIDAS 영역 및 I 도메인내이지만 MIDAS 영역에서 떨어진 제 2 영역에서의 아미노산 잔기의 위치적교란을 요구함을 보여주었다[참조:허쓰 등, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 97:5231-5236 (2000)].
제 2 영역에서의 부위 지시된 돌연변이유발은 이곳의 잔기가 ICAM-1 결합 부위의 일부가 아니지만, 즉, 이들 잔기가 리간드와 직접 접촉하지 않지만, 이들 잔기가 적어도 부분적으로 ICAM-1 결합을 조절하는 데 있어서 역할을 함을 보여주었다. 이 영역을 구성하는 아미노산 잔기는 I 도메인 알로스테릭 부위(IDAS)[Id.]로 표시되었으며, 이 영역은 소분자에 의해 조절될 수도 있는 기능적으로 관련된 형태 이동을 진행하고/하거나 유도하는 것으로 추측된다. 만일 전체적인 삼차 구조가 다른 단백질의 I 또는 A 도메인에서 보존되면, 그러한 부위는 이들 단백질을 위한 리간드 결합을 조절하기 위한 매력적인 표적을 제공할 수 있다.
또한, 알파V베타3, 인테그린의 전체 세포외 영역의 결정 구조가 최근에 보고되었다 [참조: 커진, Science, 293:1743-1746 (2001.9)]. 결정 구조는 모든 인테그린의 베타 서브유닛이 I 도메인을 함유한다는 예측을 확인한다. 이러한 I 도메인은 인테그린 기능을 조절하는 것으로 생각되어져 왔기 때문에, 이것은 이들 단백질을 위한 리간드 결합을 조절하기 위한 부가의 가능한 부위이다. 그러한 조절 영역의 확인은 리간드 결합의 조절인자, 즉 작동물질 및 길항물질이 동정될 수 있는 수단을 제공한다. 그러한 조절인자의 동정은 α/β단백질의 비정상 활성과 관련된 무수한 병리학적 상태에 대한 보호, 및 그로부터의 구제를 제공할 수 있는 후보 화합물을 제공한다.
따라서, 다양한 기능과 일차 구조를 갖는 α/β단백질을 그들의 생물학적활성에 영향을 주는 방식으로 조절하는 양상을 확인할 필요가 당업계에 존재한다.
본 출원은 2000년 10월 12일에 출원된 미국 가출원 제 60/239,750호의 이익을 갖는다.
본 발명은 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β단백질의 결합 활성을 조절하는 물질 및 방법을 제공한다.
한 가지 양상으로, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인을 함유하는 단편이 아닌 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공하며, 이때 상기 제1 분자는 α/β도메인 구조를 포함하며, 상기 α/β구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 분자를 알로스테릭 효과기 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이때 알로스테릭 효과기 분자는 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하며 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자 사이의 결합을 조절하는 상기 α/β구조의 리간드 결합 도메인에서의 배열을 촉진시킨다. 본원에서 사용될 때, 분자에 대한 "α/β구조"는, 예를 들어 α와 β 서브유닛으로 나타내지는 서브유닛을 다수 갖는 분자를 반드시 나타내는 것은 아닌 특징적인 구조를 포함하는 분자의 일반적인 부류를 말한다. 하지만, 이러한 일반적인 부류의 분자는 α와 β서브유닛으로 나타내지는 다수의 서브유닛을 갖는 분자를 포함할 수 있다. 본 발명은 추가로 LFA-1 또는 이의 I 도메인을 함유하는 단편이 아닌 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공하며, 이때 상기 제1 분자는 α/β도메인 구조를 포함하며, 상기 α/β구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 분자를 알로스테릭 효과기 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 알로스테릭 효과기 분자는 디아릴 화합물을 포함하며, 상기 디아릴 화합물은 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하고 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자 사이의 결합을 조절하는 상기 α/β구조의 리간드 결합 도메인에서의 정합을 촉진시킨다. 다른 양상에서, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인을 함유하는 그의 단편이 아닌 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공하며, 이때 상기 제1 분자는 α/β도메인 구조를 포함하며, 상기 α/β구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 분자를, 디아릴 설파이드 화합물과 디아릴아미드 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되며 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하고 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자 사이의 결합을 조절하는 상기 α/β구조의 리간드 결합 도메인에서의 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 로스만 폴드 구조를 포함하는 제1 분자를 이용하며, 상기 로스만 폴드 구조는 상기 알로스테릭 조절 부위를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 로스만 폴드 구조는 당업계에 알려진 바와 같이 로스만-유사 폴드 구조와 디뉴클레오티드 폴드 구조를 포함한다. 본 발명 방법에서, 제1 분자내의 로스만 폴드 구조는 321456 또는 231456 배향으로 위치한 β시트 쇄를 갖는 β시트를 포함한다. 다르게는, 제1 분자내의 로스만 폴드 구조는 3214567 배향으로 위치된 β시트 쇄를 갖는 β시트를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 제1 분자내의 로스만 폴드 구조는 32145 배향으로 위치한 β시트 쇄를 갖는 β시트를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 배향이란 β시트의 개개의 쇄의 평행, 역평행 또는 혼합 배열로의 위치를 말한다. 바람직하게는, 본 발명 방법은 I 도메인 구조 또는 A 도메인 구조를 포함하는 제1 분자를 이용한다.
본 발명은 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합 상호작용을 조절하는방법을 제공하며, 상기 제1 분자는 도 1에 개시된 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대해 약 90% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지며, 상기 제1 분자는 α/β구조를 포함하며, 상기 α/β도메인 구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 분자를 알로스테릭 효과기 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 데 이때 알로스테릭 효과기 분자는 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하며 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자사이의 결합을 조절하는 상기 α/β구조의 리간드 결합 도메인의 정합을 촉진시킨다.
본 발명의 알로스테릭 조절 부위는 IDAS 도메인뿐만 아니라 "I-유사 도메인" 또는 "IDAS-유사 도메인"을 포함한다. 본원에서 사용될 때, I-유사 도메인과 IDAS-유사 도메인은 MIDAS 영역(MIDAS-함유 분자내)과 구별되고, 리간드, 기질 또는 보조 인자 결합 부위와 구별되는(즉, 구별될 수 있는)조절 부위를 말하며, 반드시 완전한 I 도메인 자체를 포함할 필요는 없지만 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합을 증가시키거나 감소시키기 위해 소분자에 의해 조절될 수 있는, 기능적으로 관련된 형태 이동을 진행하고/하거나 유도한다. 다른 양상에서, 본 발명은 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 제1 분자는 도 1에 개시된 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 약 90% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지며, α/β구조를 포함하고, 상기 α/β도메인 구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 분자를 알로스테릭 효과기 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 알로스테릭 효과기 분자는 디아릴 화합물을 포함하며, 상기 디아릴 화합물은 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하며 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자 사이의 결합을 조절하는 α/β구조의 리간드 결합 도메인에서의 정합을 촉진시킨다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 제1 분자와 결합 파트너 분자 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 제1 분자는 도 1에 개시된 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 약 90% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지며, α/β도메인 구조를 포함하고, 상기 α/β구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 분자를 알로스테릭 효과기 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 알로스테릭 효과기 분자는 디아릴 설파이드 화합물과 디아릴아미드 화합물로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 알로스테릭 효과기 분자는 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하고 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자 사이의 결합을 조절하는 α/β구조의 리간드 결합 도메인에서의 정합을 촉진시킨다. 바람직한 구체예에서는, 각 방법에서 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 제1 분자는 로스만 폴드 구조를 포함하며, 상기 로스만 폴드 구조는 알로스테릭 조절 부위를 포함하며 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 제1 분자를 이용하며 이때 상기 제1 분자내의 로스만 폴드 구조는 321456 또는 231456 배향으로 위치한 β시트쇄를 갖는 β시트를 포함하며 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 본 발명 방법은 상기 제1 분자내의 로스만 폴드 구조가 3214567 배향으로 위치한 β시트 쇄를 갖는 β시트를 포함하며 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용한다. 다른 양상에서, 본 발명 방법은 32145 배향으로 위치한 β시트 쇄를 갖는 β시트를 포함하는 로스만 폴드 구조를 갖는 제1 분자를 이용하며, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 제1 분자는 I 도메인 구조를 포함하며 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 제1 분자는 A 도메인 구조를 포함하고 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대하여 약 40% , 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 미만의 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명 방법에서, 조절 인자는 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 증가시키는, 상기 제1 분자의 리간드 결합 도메인내의 정합을 촉진시키며,한 가지 양상에서, 제1 분자와 제 2 분자간의 결합의 증가는 제1 분자의 효소 활성의 증가로 나타난다. 다른 구체예에서, 조절 인자는 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 감소시키는, 상기 제1 분자의 리간드 결합 도메인내의 정합을 촉진시키며 제1 분자와 제 2 분자간의 결합의 감소는 제1 분자의 효소 활성의 감소를 야기한다.
본 발명 방법은 I 또는 A 도메인, G 단백질, 이종삼합체 G 단백질, 및 튜불린 GTPase를 포함하는 기타 단백질뿐만 아니라 표 1에 개시된 단백질들로 구성된 군으로부터 선택되는 제1 분자의 사용을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명 방법은 표 1에 개시된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 제1 분자를 이용한다. 한 가지 양상에서, 제1 분자는 진핵 분자이다. 바람직하게는, 제1 분자는 인간 분자이다. 다른 양상에서, 제1 분자는 원핵 분자이다. 한 가지 구체예에서, 제1 분자는 박테리아 분자이다.
더욱 바람직하게는, 제1 분자는 αMβ2, 보체 단백질 C2, 보체 단백질 인자 B, αEβ7, α4β7, αVβ3, α4β1, αdβ2, 폰 빌레브란트 인자, Rac-1, HPPK, ftsZ 및 ENR로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명 방법에서, 제1 분자가 αMβ2이고 결합 파트너 단백질이 피브리노겐; 제1 분자는 αMβ2이고 결합 파트너 단백질은 iC3b; 제1 분자는 αEβ7이고 결합 파트너 단백질은 E-카드헤린;제1 분자는 α4β7이고 결합 파트너 단백질은 MadCAM-1;제1 분자는 αVβ3이고 결합 파트너 단백질은비트로넥틴;제1 분자는 α4β1이고 결합 파트너 단백질은 VCAM;제1 분자는 αdβ2이고 결합 파트너 단백질은 VCAM;제1 분자는 폰 빌레브란트 인자이고 결합 파트너 단백질은 gpIb;제1 분자는 보체 단백질 C2이고 결합 파트너 단백질은 보체 단백질 C4b;제1 분자는 보체 단백질 인자 B이고 결합 파트너 단백질은 보체 단백질 C3b;제1 분자는 Rac-1이고 결합 파트너는 GTP;제1 분자는 HPPK이고 결합 파트너는 ATP 또는 HMDP;제1 분자는 ftsZ이고 결합 파트너는 GTP;그리고 제1 분자는 ENR이고 결합 파트너는 NADH이다.
발명의 상세한 설명
한 실시 양태에서, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는 유사체가 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β 구조를 포함하는 제1 분자 와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용한 용어 "결합 파트너 분자"는 리간드, 기질 및 보조인자를 포함하는 것인데, 상기에서 결합은 제1 분자의 1종 이상의 생물학적 활성을 작용시키는데 요구되는 것이다. LFA-1의 I 도메인 단편은 LFA-1의 폴리펩티드 부분 또는 단편(즉, 도 2에 나타낸 바와 같은 전장 LFA-1 보다 짧은 폴리펩티드)으로서, (ⅰ) LFA-1의 I 도메인, 또는 (ⅱ) LFA-1 I 도메인의 생물학적 활성 특징이 유지되는 LFA-1 I 도메인의 부분을 포함하는 것이다. LFA-1 I 도메인의 1종 이상의 생물학적 활성을 복제 또는 작용시키는 펩티도유사체를 비롯한 LFA-1 I 도메인의 합성 유사체도 상기 정의에 포함된다. 단백질의 α/β 상과는 베타-알파-베타 구조를 갖는 단백질을 포함하는데, 여기에서, 중앙 베타 시트 도메인은 하나 이상의 알파 헬릭스 도메인이 그 베타 시트의 양 옆에 위치한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는 유사체가 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 단백질의 로스만 폴드 구조는 베타 시트 구조를 포함하는데, 여기에서, 그 단백질의 개개의 베타 시트 도메인은 평행, 역평행 또는 혼합 배향으로 위치한다. 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 상기 제1 분자의 베타 시트는 개개의 베타 시트 스트랜드를 포함한다. 개개의 베타 시트 스트랜드에 대한 숫자 표기는 제1 단백질의 1차 아미노산 서열에서의 그들의 위치에 따라 할당되고, 제1 베타 시트 스트랜드는 단백질 서열의 아미노 말단에 가장 가까운 것이다. 또한, 로스만 폴드 구조는 베타 시트 구조의 "상부(top)"에 일반적으로 위치하는 베타 시트의 3차원 구조에 리간드 결합 폴드, 포켓, 또는 부위가 존재한다는 것에 특징이 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는유사체가 아니며 알로스테릭 조절 부위 및 321456 또는 231456 배향으로 위치한 β 스트랜드를 갖는 β 시트를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는 유사체가 아니며 알로스테릭 조절 부위 및 3214567 배향으로 위치한 β 스트랜드를 갖는 β 시트를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는 유사체이 아니며 알로스테릭 조절 부위 및 32145 배향으로 위치한 β 스트랜드를 갖는 β 시트를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 제1 분자에 있어서의 개개의 베타 시트에 대한 숫자 표기는 전술한 바와같다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는 유사체가 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 I 도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 I 도메인 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. I 도메인 구조는 다수의 인테그린에서 동정된 도메인에 의하여 예증되는 바와 같이 약 200 개의 아미노산을 포함하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 문헌[Dickeson, 등, Cell. Mol. Life Sci. 54:556-566(1998)]을 참조하라.
또한, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인-함유 단편 또는 유사체가 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 A 도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 A 도메인 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. A 도메인 모티프는 폰 빌레브란트 인자에서 발견된 도메인에 의해 예증되며, I 도메인과 상동성을 공유하는 것으로 당업계에 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같은 동일성은 디폴트 파라미터를 사용하는 베이직 블라스트(BLAST) 분석을 이용하여 계산할 수 있다. 동일성 퍼센트 값은 제1 분자의 길이와 동일하거나 유사한 아미노산 잔기들의 영역과 도 1에 나타낸 바와 같은 전체 LFA-1 서열 I 도메인을 가로지르는 아미노산 잔기들 간의 일-대-일 대응을 반영한다. 상기 방법의 다른 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의대안적인 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위 및 321456 또는 231456 배향으로 위치한 β 시트 스트랜드를 갖는 로스만 폴드 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 대안적인 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위 및 3214567 배향으로 위치한 β 시트 스트랜드를 갖는 로스만 폴드 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 대안적인 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위 및 32145 배향으로 위치한 β 시트 스트랜드를 갖는 로스만 폴드 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 로스만 폴드 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 대안적인 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 I 도메인 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 I 도메인 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 대안적인 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 A 도메인 구조를 포함하며 도 1에 나타낸 바와 같은 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 A 도메인 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시키는 알로스테릭 효과기 분자와 상기 제1 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 대안적인 실시 태양에서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열에 대한 동일성 퍼센트가 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약90 % 미만인 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 각 방법에 있어서, 조절자는 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 증대시키는 상기 제1 분자의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시킨다. 대안적으로, 조절자는 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 감소시키는 제1 분자의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진시킨다. 상기 방법은 표 1에 열거된 분자 또는 기타 본 명세서에 기술된 분자로 구성된 군으로부터 선택된 제1 분자를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 방법은 αMβ2, 보체 단백질 C2, 보체 단백질 인자 B, αEβ7, α4β7, αVβ3, α4β1, αdβ2폰 빌레브란트 인자, Rac-1, HPPK, ftsZ 및 ENR로 구성된 군으로부터 선택되는 제1 분자를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 디아릴 화합물인 조절자를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 디아릴 설파이드 화합물 및 디아릴아미드 화합물로부터 선택되는 조절자를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 디아릴 설파이드 화합물인 조절자를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
제1 분자가 αMβ2인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 피브리노겐이고, 바람직한 조절자는 표 2에 언급되어 있는 바와 같은 화합물 S, 화합물 R, 화합물 N, 화합물 O, 화합물 P, 화합물 Q, 화합물 L, 화합물 V, 화합물 F, 화합물 AA 및 화합물 AC로 구성된 군으로부터 선택된다. 제1 분자가 αMβ2인 방법에 있어서, 대안적인 바람직한 결합 파트너 단백질은 iC3b이고, 바람직한 조절자는 화합물 H, 화합물 I 및 화합물 C로 구성된 군으로부터 선택된다. 제1 분자가 αEβ7인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 E-카드헤린(cadherin)이고, 바람직한 조절자는 본 명세서의 표 2에 언급된 화합물 중에서 선택된다. 제1 분자가 α4β7인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 MAdCAM-1이다. 제1 분자가 αVβ3인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 비트로넥틴이다. 제1 분자가 α4β1인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 VCAM이다. 제1 분자가 αdβ2인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 VCAM이다. 제1 분자가 폰 빌레브란트 인자인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 gpIb이다. 제1 분자가 보체 단백질 C2인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 보체 단백질 C4b이다. 제1 분자가 보체 단백질 인자 B인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너 단백질은 보체 단백질 C3b이다. 제1 분자가 α1β1, α2β1, α11β1인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 콜라겐이다. 제1 분자가 α2β1인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 콜라겐이고, 바람직한 조절자는 본 명세서의 표 2에 언급된 화합물의 군으로부터 선택된다. 제1 분자가 Rac-1인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 GDP/GTP이고, 바람직한 조절자는 GTP이다. 제1 분자가 HPPK인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 ATP 또는 HMDP이다. 제1 분자가 ftsZ인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 GTP이다. 제1 분자가 ENR인 방법에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 NADH이다.
본 발명의 방법은 제1 분자, 결합 파트너 분자 또는 양자 모두가 그 분자를 이종성 단백질로 발현시키도록 개질된 세포로부터 또는 천연 공급원으로부터 얻어진 분리된 단백질 또는 그의 결합 단편인 것인 제1 분자 및 결합 파트너 분자의 사용을 포함한다. 또한, 상기 방법은 제1 분자 또는 이의 결합 단편, 결합 파트너 분자 또는 이의 결합 단편, 양자 모두가 이종성 단백질을 발현시키도록 개질된 세포의 표면 상에서 또는 그 분자를 이종성 단백질로 발현시키는 세포의 표면 상에서 발현되는 것인 제1 분자 또는 이의 결합 단편 및 결합 파트너 분자 또는 이의 결합 단편의 사용을 포함한다. 생체내 및 생체외 방법이 고려된다.
생체내 방법은 제1 분자 및 결합 파트너 분자간의 이상 결합 활성으로부터 발생하는 병리학적 증상을 완화 및/또는 예방할 것으로 예상된다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 완화 또는 예방할 것으로 예상되는 부적절한 보체 활성과 관련된 징후로는 (ⅰ) 전신 홍반 루푸스(SLE), 굳파스튜어병(Goodpasture's disease), 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 혈소판감소 자색반 및 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis)을 비롯한 항체/보체 침적 관련 질병; (ⅱ) 발작, 심근경색증, 심폐 우회로, 급성 혈량저하증, 신부전증 및 타가이식을 비롯한 허혈성-재관류 손상 관련 질병; (ⅲ) 알츠하이머병 및 다발경화증과 같은 중추 신경계 병리 증상; 및 (ⅳ) 외상, 화학적 또는 열적 손상 및 동물장기이식과 같은 다양한 징후 등이 있다.
유사하게, 알파 1, 알파 2 및 알파 11의 억제제 역시 암 치료에 유용할 것으로 기대된다. 전이가 진행되는 동안 종양 세포는 혈관내이물질 침입 전과 혈관외유출 후에 세포외 기질을 통과해야 한다. 이들 영역을 통한 이동은 인테그린 활성에 의존한다. 또한, 모노클로날 항체를 사용하여 α1 또는 α2 활성을 차단하는 것[Locher 등, Mol. Biol. Cell. 10:271-282(1999)] 또는 넉아웃 마우스에서 α1 활성을 제거하는 것[Pozzi 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 97:2202-2207(2000)]은 기질 메탈로프로테인아제(MMP) 농도를 변화시키는 것으로 나타났다. MMP는 다양한 유형의 암에서 일정 역할을 하는 것으로 알려진 세포외 기질 분해 효소이다(이의 개요에 대해서는 Nelson 등의 문헌[J. Clin. Oncol. 18:1135-1149(2000)] 참조). MMP의 억제제는 현재 여러 유형의 암 치료에 있어서의 임상적 용도에 대해 테스트가 진행되고 있다. 현재까지 MMP 억제제는 인간을 대상으로 한 임상 시험에서는 동물 모델에서와 같은 유효성은 없는 것으로 나타났다. 인테그린 활성 억제에 의한 MMP 발현 조절은 상이한 MMP 농도를 차별적으로 조절하고 이러한 MMP 조절을 α1, α2, 또는 α11발현 세포에 대해 특이적으로 표적화하면 더 효과적으로 된다는 것을 입증할 수 있다.
보다 구체적으로, 알파 11은 아테롬성경화증 플라크 내의 거품 대식세포 및 류마티스 관절염 환자의 활막 내의 대식세포의 아군에서 발현되는 것으로 나타났다. 비활성화된 단핵구 유래의 대식세포에서는 발현이 관찰되지 않았다. 그러므로, 알파 11/리간드 결합 상호작용의 억제제는 여러 종류의 염증 진행과 관련된 대식세포의 이동 및/또는 신호전달 과정을 감소시키는 데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 알파 11 억제제는 아테롬성경화증 및 류마티스 관절염을 비롯한 염증성 질환의치료에 유용한 치료제가 될 수 있다.
이와 유사하게, 알파 1 및 알파 2 인테그린은 자극 후에 특정 세포(T 세포 및 단핵구 등) 상에서 상향조절되는 것으로 확인되었다. 또한, 알파 1 또는 알파 2 와 이들의 리간드간의 상호작용을 모노클로날 항체를 사용하여 차단하면 지연형 과민증, 접촉 과민증 및 관절염의 마우스 모델에서 염증 반응을 억제하는 것으로 확인되었다[참조: deFougerolles 등, J. Clin. Invest. 105:721-729 (2000)]. 알파 1 및 알파 2의 길항물질은 세포 이동, 세포 증식, 및 기질 메탈로프로테인아제 3, 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨-1과 같은 염증 조절자의 생산을 비롯한 다양한 메카니즘을 통해 염증을 억제할 수 있다. 따라서, 알파 1 및 알파 2 회합(리간드 결합)의 소분자 억제제 또는 길항물질, 즉 알로스테릭 효과기 분자는 관절염, 섬유증 및 암 등의 염증성 질환의 치료에 유용할 수 있다.
섬유증은 부적절하게 활성화된 일부 세포 유형에 의해 섬유성 세포외 기질이 과다 생산된 것을 특징으로 한다. 섬유성 세포외 기질 형성의 메카니즘은 적어도 부분적으로는 α/β단백질 활성과 관련이 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 α/β단백질을 억제함으로써, 경피증(반상 경피증, 전신성 반상경피증, 선형 경피증), 켈로이드, 비대성 상처, 소결절 근막염, 호산성 근막염, 뒤퓌트랑 구축, 신섬유증, 폐섬유증, 화학요법/방사선 요법에 의한 폐섬유증, 아테롬성경화증 플라크, 염증성 장 질환, 크론병, 관절염 관절, 침입성 유방암종 결합조직형성, 피부섬유종, 내피세포 발현, 혈관지방종, 혈관지방평활근종, 유육종, 간경변, 특발성 간질성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증(4가지 병리 유형), 콜라겐 혈관 질환 관련 폐 증후군, 원인 불명의 구조성 결핵, 굳파스튜어 증후군, 베그너 육아종증, 호산성 육아종, 의원성 폐 질환, 진폐증(아스베스토증, 규폐증), 과민성 폐렴(농부의 폐, 새장수의 폐 등), 간질성 폐 섬유증, 화학적 폐렴, 과민성 폐렴 등을 비롯한 각종 섬유증 질환의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
박테리아 단백질에 대해서는, ENR은 이미 항결핵 약물의 표적 및 광범위한 살생물제인 트리클로산의 표적이 되고 있다. 그러므로 소분자는 약물 내성 결핵에 유용할 것이다. 게다가, ENR 및 DapB 억제제의 활성 범위는 그람 음성 억제제로서 유용하다. 뿐만 아니라, ERA-GPTase는 박테리아에서 보존 정도가 높기 때문에, 침투성에 따라서 광범위한 박테리아에 대한 억제제로서 유용할 것이다. 또한, 다양한 박테리아 단백질의 억제제는 그람 음성 박테리아를 비롯한 박테리아성 질환 및 정의되지 않은 박테리아성 병원균 감염의 치료에 유용할 것이다.
설폰아미드와 같은 다른 화학요법제는 신규 엽산 생합성 경로에 길항작용을 하여 박테리아 성장을 억제한다[참조: Mandell 및 Petri, Sulfonamides, Trimethoprim-sulfamethoxazole, Quinolones, and Agents for Urinary Tract Infctions, in The Pharmacological Basis of Therapeutics(Goodman 및 Gilman 편저, 1996)]. 항엽산 요법의 1차 목표는 세포내의 감소된 엽산 풀을 고갈시켜서 티미딘 농도의 부족에 의해 DNA 복제를 억제하는 것이다[참조: Hitchings 및 Baccanari, Design and Synthesis of Folate Antagonists as Antimicrobial Agents, in Folate Antagonists as Therapeutic Agents (1984)].
효소 6-히드록시메틸-7,8-디히드로프테린 파이로포스포키나제(HPPK)는 신규엽산 생합성 경로에서 ATP로부터 파이로포스페이트의 6-히드록시-7,8-디히드로프테린(HMDP)으로의 전달을 촉매한다[참조: Richey 및 Brown, J. Biol. Chem., 244:1582-1592 (1969)]. HPPK는 그램 양성 및 그람 음성 박테리아 둘다와 진균류 및 원생동물에서 발현되지만, 고등 진핵생물에서는 발현되지 않으며, 항엽산 활성을 이용한 항생제의 개발을 위한 중요한 표적이 된다. 본 발명은 HPPK의 억제에 의해 각종 박테리아 및 진균 감염을 치료 및 예방하는 방법 및 조성물을 제공할 수 있다.
FtsZ는 세포 분열에 관여하는 필수적인 박테리아 유전자의 생성물이다. FtsZ는 GTP에 결합하여 이를 가수분해시키며, GTP에 결합될 경우 이는 긴 선형의 중합체를 형성한다. ftsZ의 GTP-의존적 중합 과정은 박테리아 세포 분열에서의 이의 기능과 관련이 있다. 격막 형성 중에 ftsZ는 세포 분열 판을 한정하는 고리를 형성한다. ftsZ가 결여된 세포는 격막 형성이 진행될 수 없으므로 세포 분열이 일어나지 않고 사멸한다. FtsZ는 박테리아계 전반에 걸쳐서 고도로 보존되어 있다(약 60%). 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 ftsZ의 억제에 의해 광범위한 항생제를 제공한다. ftsZ의 원자 구조에 의하면 이는 알파/베타 단백질 구조로 되어 있다[ 참조: Nogales 등, Nature Structural Biology 5:451-458 (1998)].
vWF 결합의 조절자는 심근경색(MI) 및 혈전성 뇌졸중과 같은 혈전성 혈관 질환의 치료에 유용하다. vWF A1-도메인 결합 길항물질의 급성 투여는 불안정 협심증 환자 또는 PTCA 또는 스텐트 설치 후의 환자와 같이 고위험군의 환자에서 관상 동맥 혈관 폐색의 위험률을 감소시킬 수 있다. 최근 몇종의 gpIIb/IIIa 길항물질이이러한 병증에서의 임상적 용도에 대해 승인을 받았다[레오프로(등록상표명), 이트라피반, 시브라피반]. 이러한 제제는 유효하긴 하지만, 이 제제의 사용에는 출혈이 수반되기 때문에 유효량이 제한되고 있다. A1-도메인 억제제의 출혈 부작용을 제한할 수 있다면 혈관 폐색 위험이 있는 개체에서 장기적으로 사용될 수 있다. 이러한 개체에는 협심증 환자, 파행 환자 및 MI 또는 뇌졸중의 병력이 있는 환자가 포함된다. 비정상적인 vWF 대사는 혈전성 혈소판감소성 자반병에서의 폐색성 혈전의 원인이며, 이는 A1 도메인 억제제가 상기 병증에서도 유용할 것임을 암시하는 것이다.
Rac1, Rac2 및 Rac3는 분자량이 작은(약 22∼25 kDa) GTPase의 Ras 상과[이들 중 다수는 α/β 단백질임]의 일원이다[참조: Edwards 및 Perkins, FEBS Lett 358:283 (1995); De Vos 등, Science 239:888 (1988); Worthylake 등, Nature 408:482 (2000)]. 1차 아미노산 서열 비교 결과는 Rac 단백질의 총 상동성이 약 88∼약 92%임을 나타낸다. Rac1 및 Rac2 단백질은 세포의 생존, 증식, 전이 및 활성 산소종(ROS) 생성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[참조: Symons, Curr. Opin. in Biotech., 6:668 (1995); 및 Scita, EMBO J., 19(11):2393 (2000)]. 세포 증식의 조절에 있어서의 Rac 단백질의 중요성으로 인해, Tac 구아닌 뉴클레오타이드 치환 반응의 길항물질, 특히 Tiam1의 존재 하에 Rac1의 GDP에서 GTP로의 치환을 방해하는 소분자가 본 발명의 방법 및 조성물에 있어서 매우 중요하다.
전술한 사항들을 고려하여, 본 발명은 LFA-1 또는 이의 I 도메인 단편이 아닌 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 이상 결합으로 인한 질병을 완화 또는 예방하는 방법을 추가로 제공하는데, 이때 상기 제1 분자는 하기 표 1에 기재된 단백질 군에서 선택되는 α/β단백질이고, 상기 방법은 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합 조절자의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 유효량이란 용어는 의도하는 목적을 달성하기에 충분한 양의 조절자를 투여하는 것을 칭한다. 보다 구체적으로, "치료적 유효량"은 치료 대상 피험체를 치료 또는 예방하거나, 또는 기존 증상을 완화시키는 데 유효한 양을 칭한다. 유효량은, 특히 본원의 상세한 설명에 의하면 당업자가 충분히 결정할 수 있는 사항이다.
본 발명은 한 양태로서 α/β단백질이 로스만 폴드를 포함하는 것인 치료 방법을 제공한다. 또 다른 양태로서, 표적 단백질 내의 로스만 폴드가 중앙의 β시트 구조를 구성하는 5개, 6개 또는 7개의 β스트랜드를 포함하는 것인 치료 방법을 제공한다. 로스만 폴드가 5개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 32145인 것이 바람직하다. 로스만 폴드가 6개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 321456 또는 231456인 것이 바람직하다. 로스만 폴드가 7개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 3214567인 것이 바람직하다. 본 발명의 치료 방법은 제1 분자가 도 1에 도시된 LFA-1의 I 도메인 아미노산 서열과 약 90% 미만의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 것인 방법들을 포함한다. 바람직하게는, 제1 분자는 LFA-1의 I 도메인과의 서열 동일성이 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75%미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 또는 약 90% 미만이다. 본 발명의 이러한 양태를 목적으로 한 서열 동일성은, 예컨대 디폴트 매개변수를 이용한 기본형 BLAST 검색 분석을 이용하여 계산한다.
본 발명은 또한 LFA-1 또는 이의 I 도메인 단편이 아닌 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합의 조절자를 동정하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 제1 분자는 하기 표 1에 기재된 단백질 군에서 선택된 α/β단백질이며, 상기 방법은 테스트 화합물의 존재 및 부재 하에 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합을 측정하는 단계, 및 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합의 변화가 테스트 화합물 부재 하의 결합과 비교하여 테스트 화합물의 존재 하에 검출되는 경우 결합의 조절자로서의 테스트 화합물을 동정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 한 양태로서, α/β단백질이 로스만 폴드를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 본 발명은 또 다른 양태로서, 표적 단백질 내의 로스만 폴드가 중앙의 β시트 구조를 구성하는 5개, 6개 또는 7개의 β스트랜드를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 로스만 폴드가 5개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 32145인 것이 바람직하다. 로스만 폴드가 6개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 321456 또는 231456인 것이 바람직하다. 로스만 폴드가 7개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 3214567인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은 제1 분자가 도 1에 도시된 LFA-1의 I 도메인 아미노산 서열과 약 90% 미만의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 것인 방법들을 포함한다. 바람직하게는, 제1 분자는 LFA-1의 I 도메인과의 아미노산 서열 동일성이 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 또는 약 90% 미만이다. 본 발명의 이러한 양태를 목적으로 한 서열 동일성은, 예컨대 디폴트 매개변수를 이용한 기본형 BLAST 검색 분석을 이용하여 계산한다.
본 발명은 또한 LFA-1 또는 이의 I 도메인이 아닌 제1 분자와 결합 파트너 분자간 결합의 조절자를 제공하는데, 이때 상기 제1 분자는 하기 표 1에 기재된 단백질 군에서 선택된 α/β단백질이다. 한 양태에서, 조절자는 로스만 폴드를 포함하는 α/β단백질의 결합에 영향을 주는 것들이다. 다른 양태로서, 표적 단백질 내의 로스만 폴드가 중앙의 β시트 구조를 구성하는 5개, 6개 또는 7개의 스트랜드를 포함할 경우 결합에 영향을 주는 조절자를 제공한다. 로스만 폴드가 5개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 32145인 것이 바람직하다. 로스만 폴드가 6개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 321456 또는 231456인 것이 바람직하다. 로스만 폴드가 7개의 β스트랜드를 포함하는 경우, 개개의 스트랜드의 배열은 앞서 정의한 바와 같이 3214567인 것이 바람직하다. 본 발명은 도 1에 도시된 LFA-1의 I 도메인 아미노산 서열과의 서열 동일성이 약 90% 미만인 제1 분자에 대한 조절자를 제공한다. 바람직하게는, 제1 분자는 LFA-1의 I 도메인과의 아미노산 서열 동일성이 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 또는 약 90% 미만이다. 본 발명의 이러한 양태를 목적으로 한 서열 동일성은, 예컨대 디폴트 매개변수를이용한 기본형 BLAST 검색 분석을 이용하여 계산한다.
본 발명은 또한 조절자를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 조성물은 약학 조성물이다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 1종 이상의 조절자를 포함하며, 바람직하게는 약학적 허용 담체 또는 희석제를 더 포함한다. 본원에서 사용된 "약학적 허용 담체"란 용어는 수용 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간과 접촉시켜 사용하기에 적합한 화합물로서, 독성, 자극 또는 알러지 반응이 적당한 이익/위험 비율로 균형을 이루며, 목적 용도에 유효한 화합물을 칭한다.
본 발명은 또한 전구약물 형태로 존재하는 조절자를 제공한다. 본원에서 사용된 "전구약물"이란 용어는, 생체내에서, 예컨대 가수분해에 의해 모화합물, 즉 활성 조절자 화합물로 재빨리 전환되는 화합물을 칭한다. 이에 대한 자세한 고찰은 Higuchi 등의 문헌[Prodrugs as Novel Delivery Systems, vol. 14 of the A.C.S.D Symposium Series, and in Roche(ed), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 기술되어 있으며, 상기 두 문헌은 본원에서 참고로 인용하는 문헌이다. 전구약물 디자인에 대해서는 Hardma 등의 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9판, New York, New York, pp. 1-16 (1996)]에 개괄적으로 기술되어 있다. 요약하면, 약물을 투여하면, 이 약물은 체내에서 제거되거나, 또는 일부는 생체내전환이 진행됨으로써 약물의 생물학적 활성이 감소 또는 제거된다. 또는, 생체내전환 과정은 그 자체가 처음에 투여된 약물과 비교하여 활성이 같거나 더 큰 대사 부산물을 산출할 수 있다. 이러한 생체내전환 과정에 대한 이해가 증가함에따라 생체내전환 후에 변형된 상태에서 생리학적으로 활성이 더 커지는 이른바 "전구약물"의 디자인이 가능하다. 그러므로, 전구약물은 생물학적 활성 대사산물로 전환되는 약리적 불활성 화합물이다. 몇몇 형태의 전구약물은, 종종 전구약물 상에 작용기를 도입하거나 또는 노출시키는, 예컨대 에스테르 또는 아미드 결합의 가수분해를 통해 약리적 활성 상태가 된다. 이렇게 변형된 약물은 내생 화합물과 반응하여, 예컨대 순환 반감기가 증가된 결과로서 화합물의 약리적 특성을 추가로 증가시키는 수용성 접합체를 형성할 수도 있다.
또 다른 대안으로서, 전구약물은, 예컨대 글루쿠론산 황산염, 글루타티온, 아미노산 또는 아세테이트를 사용하여 작용기 상에 공유적 변형이 일어나도록 디자인할 수 있다. 형성된 접합체는 불활성화되어 뇨로 분비되거나, 또는 모화합물보다 더 강력하게 된다. 고분자량 접합체는 또한 담즙으로 분비되고 효소에 의해 분해되어 순환계로 다시 방출됨으로써 처음에 투여된 화합물의 생물학적 반감기를 효과적으로 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심이 존재하는 입체이성체로서 존재할 수 있다. 입체이성체는 키랄 탄소 원자 주변의 치환기의 배열에 따라서 "S" 또는 "R"로 나타낸다. 입체이성체의 혼합물 역시 본 발명에 고려된다. 입체이성체로는 거울상이성체, 부분입체이성체 및 이들의 혼합물이 포함된다. 본 발명의 화합물의 개별 입체이성체는 비대칭 또는 키랄 중심을 함유하는 시판되는 출발 물질로부터 합성에 의해 제조하거나, 또는 라세미 혼합물을 제조한 후 당업계에 잘 알려져 있는 분리 또는 분해 기법을 실시하여 제조할 수 있다. 분해 방법으로는 (1) 키랄보조물에 거울상이성체의 혼합물을 부착시키고, 형성된 혼합물을 재결정화 또는 크로마토그래피에 의해 분리한 후, 보조물로부터 광학적으로 순수한 생성물을 유리시키는 방법; (2) 광학적 활성 분해제를 사용하여 염을 형성하는 방법, 및 (3) 키랄 크로마토그래피 컬럼 상에서 광학적 거울상이성체를 직접 분리하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 임의의 적절한 경로를 통해 인간 및 동물에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 이 조성물은 경구, 직장, 비경구, 조내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 또는 점적약의 형태로), 협측, 또는 비강 경로로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구" 투여란 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 포막내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 칭한다.
본 발명의 비경구 주사용 약학 조성물은 약학적 허용 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 뿐만 아니라, 사용직전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 적당한 수성 또는 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적당한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유) 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 있다. 적절한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우에 소정의 입경을 유지함으로써, 그리고 계면 활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
또한, 이들 조성물은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 각종 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함함으로써 달성될 수 있다. 또한, 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 약제 형태 흡수의 연장은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제를 함유시킴으로써 달성될 수 있다.
어떤 경우에는, 약물의 효과를 연장시키기 위하여, 피하 또는 근육내 주사에서 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이러한 결과는 수용성이 적은 무정형 물질 또는 결정의 액체 현탁액을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 약물의 흡수 속도는 그것의 용해 속도에 따라 다르며, 이 용해 속도는 결정 크기 및 결정 형태에 따라 다를 수 있다. 별법으로, 비경구 투여된 약물 형태 흡수의 지연은 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.
주사가능한 데포우(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체 중에 약물의 미세캡슐 메트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 기타의 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 있다. 또한, 데포트 주사가능한 제제는 약물을 체조직과 상용성이 있는 리포좀 또는 마이크로에멀젼 내에 포획시킴으로써 제제된다.
주사가능한 제제는 예컨대 박테리아 또는 바이러스 보유 필터를 통한 여과에 의하여, 또는 사용 직전에 멸균수 또는 기타의 멸균 주사가능한 매질에 용해시키거나 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태 중에 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균시킬 수 있다.
경구용 고체 제형으로서는 캡슐제, 정제, 환제, 산제 및 과립제가 있다. 이들 고체 제형에 있어서, 활성 화합물을 적어도 하나의 불활성 약학적 허용 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토즈, 수크로즈, 글루코즈, 만니톨 및 실릭산, (b) 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로즈, 검(예컨대, 알기네이트, 아카시아) 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 및 수크로즈, (c) 보습제, 예컨대 글리세롤, (d) 붕해제, 예컨대 아가-아가(agar-agar), 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카(tapioca) 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨, (e) 용액 지연제, 예컨대 파라핀, (f) 흡수 가속화제, 예컨대 4차 암모늄 화합물, (g) 습윤화제, 예컨대 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 (i) 활택제, 예컨대 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합한다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 제형은 완충제를 포함할 수도 있다.
유사한 종류의 고체 조성물도 역시 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 뿐만 아니라 락토즈 또는 유당과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로 이용될 수 있다.
정제, 당의정제, 캡슐제, 환제 및 과립제의 고체 제형은 코팅 및 쉘(shell), 예컨대 장용 코팅 및 약학 제제 분야에 잘 알려져 있는 기타의 코팅으로 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 함유할 수 있고, 이들이 장관의 부분에서, 임의로 지연된 방식으로, 활성 성분만을 또는 활성 성분을 선택적으로 방출하는 조성물이 될 수도 있다. 대표적인 물질로는 유드라짓(Eudragit, 등록 상표)과 같은 시판 물질을 비롯한 pH 민감성 용해도를 갖는 중합체가 있다. 사용할 수 있는 매립 조성물의 예로는 중합체성 물질 및 왁스가 있다.
활성 화합물은 또한 적절한 경우 하나 이상의 전술한 부형제와 함께, 마이크로인캡슐화 형태로도 될 수 있다.
경구용 액체 제형은 약학적 허용 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르가 있다. 활성 화합물 이외에, 상기 액체 제형은 당 기술분야에서 통상 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 기타의 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 탄산에틸, 아세트산에틸, 벤질 알콜, 벤조산벤질, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 조미료 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물 이외에 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로즈, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸스 및 이들의 혼합물와 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서는 고형화되지만 체온에서는 액체화되는 적절한 비염증성 첨가물 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌제용 왁스와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌제인 것이 바람직하다. 따라서, 이들 담체는 직장 또는 질 공동에서 용융되어 활성 화합물을 방출한다.
본 발명의 화합물은 리포좀의 형태로도 투여할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 리포좀은 통상 인지질 또는 기타의 지질 물질로부터 유래된다. 리포좀은 수성 매질에 분산된 단일 또는 다중 라멜라 수화 액정에 의하여 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 생리학적으로 허용가능하고 대사가능한 임의의 비독성의 지질을 사용할 수 있다. 리포좀 형태의 본 조성물은 본 발명의 화합물 이외에 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 천연 및 합성의 인지질 및 포스파티딜 콜린(렉시틴)이다. 리포좀 형성 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[참조: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y., p.33 (1976)]을 참고하라.
본 발명의 화합물은 무기산 또는 유기산에서 유래한 약학적 허용 염의 형태로 사용될 수 있다. "약학적 허용 염"에는 안전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적절한 염들이 있으며, 적당한 이익/위험 비율이 알맞다. 약학적 허용 염은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, 전체가 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[참조: S. M. Berge 등, J. Pharmaceutical Sciences, 66:1 (1977)]에는 약학적 허용 염이 상세하게 기재되어 있다. 이들 염은 본 발명 화합물의 최종 분리 및 정제 도중 계내에서 또는 자유 염기 기능을 적절한 염과 반응시킴으로써 별도로 제조할 수 있다. 대표적인 산부가염의 비한정적인 예로는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포롤설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오드, 2-히드록시에탄설포네이트(이소티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보테이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트가 있다. 약학적 허용 산 부가염을 형성하기 위하여 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및, 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산이 있다.
염기성 질소 함유기는 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오드를 비롯한 저급 알킬 할로겐화물; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오드와 같은 장쇄 할로겐화물; 벤질 및 페네틸 브로마이드 등과 같은 아릴알킬 할로겐화물과 같은 제제로 4차화될 수 있다. 이에 의하여 수용성이나 유용성(oil-soluble) 또는 분산성 제품을 얻는다.
염기 부가염은 카복실산 함유부를 약학적 허용 금속 양이온의 히드록시드, 카보네이트 또는 바이카보네이트와 같은 적절한 염기와, 또는 암모니아와, 또는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 반응시킴으로써 본 발명 화합물의 최종 분리 및 정제 도중 계내에서 제조될 수 있다. 약학적 허용 염기 부가염의 비한정적인 예로서는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속계 양이온 및 비독성 4차 암모니아 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민 등을 비롯한 아민 양이온이 있다. 염기 부가염의 형성에 유용한 기타의 대표적인 유기 아민으로서는 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등이 있다.
본 발명 화합물의 국소 투여용 제형으로서는 산제, 스프레이, 연고 및 흡입제가 있다. 활성 화합물을 멸균 조건하에서 약학적 허용 담체 및 임의의 필요한 방부제, 완충제 또는 필요할 수도 있는 추진체와 함께 혼합한다. 안과용 제제, 눈 연고, 산제 및 용액도 역시 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 생각된다.
본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실질적인 투여 수준은 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대하여 소정의 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 화합물의 양을 얻기 위하여 다양하게 할 수 있다. 선택된 투여 수준은 특정 화합물, 투여 경로, 치료할 상태의 중증도, 치료할 환자의 상태와 과거 병력에 따라 다르다. 그러나, 소정의 치료 효과를 달성하기 위하여 요구되는 것보다 낮은 수준으로 화합물의 투여를 시작하고, 소정의 효과가 달성될 때까지 상기 투여량을 점차 증가시키는것은 당 기술의 범위 내이다.
통상 포유 동물 환자에게 경구 또는 정맥내로 1일 체중 1 kg 당 활성 화합물을 약 0.1 내지 1000 mg로, 약 0.5 내지 약 500 mg로, 약 1 내지 약 250 mg로, 약 1.5 내지 약 100 mg 및 바람직하게는 약 5 에서 약 20 mg의 투여 수준으로 투여한다. 필요에 따라, 1일 유효 투여량은 투여를 위하여 다수의 투여량으로, 예컨대 1일 2회 내지 4회 분할 투여로 나누어질 수 있다.
본 발명 화합물의 효능을 조사하였고, 예컨대 EC50및 LC50과 같은 매개변수에 의하여 설명할 수 있다. 여기서, 용어 EC50은 세포계 분석에서 50%까지 활성을 억제하는데 필요한 유효 능도를 말한다. 여기서, 용어 IC50은 생화학 분석에서 단백질 활성을 50%까지 억제하는데 요구되는 농도를 말한다. 여기서, 용어 LD50은 독성 분석에서 소정의 시간 간격에 걸쳐 세포의 50%를 사멸시키는데 필요한 화합물 농도를 말한다.
[표 1]
I 또는 A 도메인, G 단백질, 이종 삼량체 G 단백질, 및 튜블린 GTPase를 함유하는 단백질.
1. TIM 베타/알파-배럴(23)
평행한 베타 시트의 배럴을 함유하며, 닫혀있고; n=8, S=8; 스트랜드 순서 12345678, 여기서 처음 여섯 개의 상과는 유사한 포스페이트 결합 부위를 지닌다.
1. 트리오세포스페이트 아이소머라제(TIM)(1)
1. 트리오세포스페이트 아이소머라제(TIM)(12)
2. 리불로스-포스페이트 결합 배럴(4)
1. 히스티딘 생합성 효소(2)
배럴 폴드내의 유전자 중복의 구조적 증거.
2. D-리불로스-5-포스페이트-3-에피머라제(1)
3. 오로티딘 5'-모노포스페이트 디카르복실라제
(OMP 디카르복실라제)(4)
4. 트립토판 생합성 효소(6)
3. 티아민 포스페이트 신타제(1)
1. 티아민 포스페이트 신타제(1)
4. FMN-결합 옥시도리덕타제(1)
1. FMN-결합 옥시도리덕타제(9)
5. 이노신 모노포스페이트 디히드로게나제(IMPDH)(1)
기질의 포스페이트 부분은 '공통의' 포스페이트 결합 부위에서 결합한다.
1. 이노신 모노포스페이트 디히드로게나제(IMPDH)(4)
6. PLP-결합 배럴(2)
표준 폴드의 순환성 치환: 알파 헬릭스로 시작하고 베타 스트랜드로 종결한다.
1. 알라닌 라세마제류, N-말단 도메인(4)
2. "가상의" 단백질 yb1036c(1)
7. NAD(P)-결합 옥시도리덕타제(1)
1. 알도-케토 리덕타제(NADP)(7)
공통의 폴드는 전체 단백질 구조를 카버한다.
8. (트랜스)글리코시다제(7)
1. 알파-아밀라제, N-말단 도메인(22)
공통의 폴드 도메인에는 작은 칼슘-결합 서브도메인이
개입되어 있다. 이 도메인 다음에는 그 과에 공통되는 모든-베타 도메인이 온다.
2. 베타-아밀라제(4)
3. 베타-글리카나제(21)
다수의 서열 과들로 구성된다.
4. 글리코실 히드롤라제 과 1(8)
5. 타입 II 키티나제(9)
글리코실라제 과 18
6. 세균성 키토비아제(베타-N-아세틸헥소사미니다제),
촉매 도메인(1)
글리코실 히드롤라제 과 20
7. 베타-D-글루칸 엑소히드롤라제, N-말단 도메인(1)
9. 메탈로-의존성 히드롤라제(3)
트 배럴은 유사하게 비틀려져있고 C-말단이 캐핑되어있다.
헬릭스는 배럴내에 결합된 전이 금속 이온을 지닌다.
1. 아데노신 디아미나제(ADA)(1)
2. 우레아제의 알파 서브유닛, 촉매 도메인(2)
3. 포스포트리에스테라제 류(2)
10. 알도라제(4)
공통의 폴드는 전체 단백질 구조를 카버한다.
1. 클래스 I 알도라제(14)
촉매 리신은 기질과 함께 쉬프 염기 중간체를 형성한다.
2. 클래스 II 알도라제(1)
금속-의존성
3. 5-아미노라에부리네이트 디히드라타제, ALAD(포르포빌리노겐 신타제)(3)
클래스 I 및 II 알도라제의 하이브리드
4. 클래스 I DAHP 신타제(2)
11. 에놀라제 C-말단 도메인 류(2)
배럴내에 보존된 부위에서 금속 이온(마그네슘 또는 망간)과 결합한다.
N-말단 알파+베타 도메인은 이 과에서 공통되는 구조이다.
1. 에놀라제(2)
2. D-글루카레이트 디히드라타제 류(6)
12. 포스포에놀피루베이트/피루베이트 도메인(6)
1. 피루베이트 키나제(5)
2. 피루베이트 포스페이트 디키나제, C-말단 도메인(1)
3. 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(1)
4. 포스포에놀피루베이트 뮤타제(1)
교환된 이량체를 형성한다.
5. 2-디히드로-3-디옥시-갈락타레이트 알도라제(1)
교환된 이량체를 형성하며; PK-타입 금속 결합 부위를 함유한다.
6. 이소시트레이트 리아제(2)
교환된 이량체를 형성하며; 부가의 서브도메인이 추가된다.13. 말레이트 신타제 G(1)
1. 말레이트 신타제 G(1)
14. 루비스코, C-말단 도메인(1)
1. 루비스코, 커다란 서브 유닛, C-말단 도메인(6)
N-말단 도메인은 알파+베타 이다.
15. 자일로스 아이소머라제 류(3)
다른 과들은 유사하나 동일하지 않은 금속 결합 부위를 공유한다.
1. 엔도뉴클레아제 IV(1)
2. L-람노즈 아이소머라제(1)
3. 자일로즈 아이소머라제(12)
16. 세균성 루시페라제 류(3)
어느 정도 다른 폴드를 가졌으나 확실히 관련성 있는 과들로 구성된
다.
1. 세균성 루시페라제(알카날 모노옥시게나제)(1)
전형적인(베타/알파)8-배럴 폴드
2. 비형광성 플라보단백질(luxF, FP390)(2)
7 스트랜드의 베타 시트와 혼합된 불완전한 베타/알파 배럴
3. 조효소 F420 의존성 테트라히드로메타노프테린 리덕타제(1)
17. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라제, C-말단 도메인(1)
7스트랜드의 평행한 베타 시트를 지닌 불완전한 베타/알파 배럴
1. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라제, C-말단 도메인(2)
18. 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI-PLC)(2)
1. 포유동물 PLC(1)
2. 세균성 PLC(2)
19. 코발라민(비타민 B12)-의존성 효소(3)
1. 메틸말로닐-CoA 뮤타제, N-말단(CoA-결합)도메인(1)
2. 글루타메이트 뮤타제, 커다란 서브유닛(1)
3. 디올 디히드라타제, 알파 서브유닛(2)
20. tRNA-구아닌 트랜스글리코실라제(1)
1. tRNA-구아닌 트랜스글리코실라제(1)
21. 디히드로프테로에이트 신타제 류(1)
1.디히드로프레로에이트 신타제(3)
2. 메틸테트라히드로폴레이트:코리노이드/철-황 단백질 메틸트랜스퍼라제 MetR(1)
22. 유로포르피리노겐 디카르복실라제, UROD(1)
1.유로포르피리노겐 디카르복실라제, UROD(1)
23. 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제(1)
1. 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제(1)
2. NAD(P)-결합성 로스만-폴드 도메인(1)
코어: 3층, a/b/a; 평행한 6 스트랜드의 베타 시트, 순서 321456
이것과 다음 두개의 폴드/상과의 뉴클레오티드 결합 모드는 유사하다.
1. NAD(P)-결합성 로스만-폴드 도메인(8)
1. 알콜/글루코스 디히드로게나제, C-말단 도메인(9)
N-말단의 모든-베타 도메인이 과의 특징이다.
2. 티로신-의존성 옥시도리덕타제(27)
이는 단쇄 디히드로게나제 및 SDR 과로도 공지되어 있으며, 평행한
베타 시트는 7번째 스트랜드로 연장되어 있으며 순서는 3214567이고;
좌선형이고, 스트랜드 6과 7사이에 교차 연결이 이루어져 있다.
3. 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 류, N-말단 도메인(20) 과의 구성원들은 C-말단 도메인중에서 공통의 알파+베타 폴드를 공유한다.
4. 포르메이트/글리세레이트 디히드로게나제, NAD-도메인(9)
이 도메인은 과의 특징이 되는 다른 도메인에 개입되어 있다.
5. 락테이트 및 말레이트 디히드로게나제, N-말단 도메인(16)
6. 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제 류, N-말단 도메인(8)
베타 시트는 8 스트랜드로 연장되며, 순서는 32145678이고; 스트랜드 7 및 8은 나머지 부분과 평행하지 않으며, C-말단 도메인은
또한 어느 정도 유사성을 나타낸다.
7. 아미노산 디히드로게나제 류, C-말단 도메인(11)
8. 숙시닐-CoA 신타제, 알파-사슬, N-말단(CoA-결합)도메인(2)
3. FAD/NAD(P)-결합 도메인(1)
코어는 3층, b/b/a; 5 스트랜드의 중앙의 평행한 베타 시트, 순서 32145;
3 스트랜드의 상부 역평행성 베타 시트, 굴곡짐.
1. FAD/NAD(P)-결합 도메인(5)
1. 아드레노독신 리덕타제 류의 C-말단 도메인(3)
2. FAD-결합 리덕타제, N-말단 도메인(10)
C-말단 도메인은 알파+베타로서 이는 과에 공통된 것이다.
3. 구아닌 뉴클레오티드 분리 억제제, GDI(1)
두개의 도메인이 FAD-결합 리덕타제와 유사하지만 FAD에
결합하지는 않는다.
4. 숙시네이트 디히드로게나제/푸마레이트 리덕타제 N-말단 도메인(5)
5. FAD/NAD-결합 리덕타제, N-말단 및 중앙의 도메인(17)
중복; 두개의 도메인은 유사한 폴드와 기능을 지니며,
과의 대부분의 구성원은 공통의 C-말단 알파+베타
도메인을 함유한다.
4. 뉴클레오티드-결합 도메인(1)
3층: a/b/a; 5스트랜드의 평행한 베타 시트, 순서 32145; 로스만 류
1. 뉴클레오티드 결합 도메인(2)
이 상과는 공통의 뉴클레오티드-결합 부위를 공유하며, 로스만-폴드 NAD(P)-결합 및 FAD/NAD(P)-결합 도메인 사이를 연결한다.
1. 아드레노독신 리덕타제 류의 N-말단 도메인(3)
2. D-아미노산 옥시다제, N-말단 도메인(2)
이 과는 FAD 결합된 리덕타제와 아마도 관련이 있으며, 이들과 C-말단 도메인 폴드를 공유한다.
5. MurD(UDP-N-아세틸뮤라모일-L-알라닌; D-글루타메이트 리가제)의 N-말단 도메인(1)
3층: a/b/a; 5스트랜드의 평행한 베타 시트, 순서 32145; 불완전한 로스만류 폴드; UDP 기에 결합한다.
1. Mur△(UDP-N-아세틸뮤라모일-L-알나닌:D-글루타메이트 리가제)의
N-말단 도메인(1)
1. Mur△(UDP-N-아세틸뮤라모일-L-알나닌:D-글루타메이트 리가제)의 N-말단 도메인(1)
6. 셀룰라제(1)
베타/알파 배럴의 변형; 평행한 베타 시트 배럴, 닫혀있고, n=7, S=8; 스트랜드 순서 1234567
1. 셀룰라제(1)
1. 셀룰라제(4)
7. PFL 류 글리실 라디칼 효소(1)
배럴을 함유하며, 닫혀있고; n=10, S=10; 배럴내에서 헤어핀 루프를 수용한
다.
1. PFL 류 글리실 라디칼 효소(3)
중복: - 및 C-말단 반쪽은 유사한 위상을 갖는다.
1. 피루베이트 포르메이트-리아제, PFL(1)
2. 리보뉴클레오티드 리덕타제의 R1 서브유닛, C-말단 도메인(1)
3. 클래스 III의 혐기성 리보뉴클레오티드 트리포스페이트
리덕타제 NRDD 서브유닛(1)
8. "회전고리" 베타/베타/알파 도메인(5)
3층: b/b/a; 중앙의 시트는 평행하며, 다른 한 시트는 비평행성이고,
위상이 약간 다르다. 이 도메인은 이것을 함유하는 것으로 알려진 모든 단백질 중에서 이동성을 갖는 것으로 추정된다.
1. 포스포히스티딘 도메인(2)
배럴을 함유하며 닫혀있고, n=7, S=10이다.
1. 피루베이트 포스페이트 디키나제, 중앙의 도메인(1)
2. PEP의 효소 I의 N-말단 도메인: 당 포스포트랜스퍼라제계(1)
2. 아코니타제, C-말단 도메인(1)
이는 혼합된 베타 시트 배럴을 함유하며, 닫혀있고, n=7, S=10이다.
1. 아코니타제, C-말단 도메인(2)
3. 카르바모일 포스페이트 신테타제, 작은 서브유닛 N-말단 도메인(1)
1. 카르바모일 포스페이트 신테타제, 작은 서브유닛 N-말단
도메인(1)
4. 트랜스페린 수용체 엑토도메인, 정점 도메인(1)
1. 트랜스페린 수용체 엑토도메인, 정점 도메인(1)
5. GroEL 류 샤폐론, 정점 도메인(2)
1. GroEL(2)
2. 그룹 II 샤페로닌(CCT, TRIC)(1)
9. 바스타 류(2)
2 층, a/b; 3스트랜드의 평행한 베타 시트, 순서 123
1. 바스타(바르나제 억제제)(1)
1. 바스타(바르나제 억제제)(1)
2. 리보좀 단백질 L32e(1)
1. 리보좀 단백질 L32e(1)
이는 공통 폴드에 불규칙적인 N-말단 연장부가 부가되어있다.
10. 루이신-풍부 반복부, LRR(우선회형 베타-알파 수퍼헬릭스)(2)
2개의 굴곡이 있는 층, a/b;평행한 베타 시트; 순서 1234...N
1. RNI 류(3)
규칙적인 구조는 유사한 반복부로 구성된다.
1. 리보뉴클레아제 억제제(2)
2. Rnalp(1)
3. 사이클린 A/CDK2-관련 p19, SKp2(1)
2. L 도메인류(5)
덜 규칙적인 구조는 가변성의 반복부로 구성된다.
1. 인터나린 B LRR 도메인(1)
2. Rab 게라닐게라닐트랜스퍼라제 알파-서브유닛, C-말단
도메인(1)
3. mRNA 수송 인자 tap(1)
4. U2A'류(1)
중복: 5-6개의 부분적으로 불규칙적인 반복부로 구성된다.
5. 타입 I의 인슐린 형 성장인자 수용체의 L1 및 L2 도메인(1)
11. 외부 아암 디네인 경쇄 1(1)
(베타-베타-알파)n 수퍼헬릭스
1. 외부 아암 디네인 경쇄 1(1)
1. 외부 아암 디네인 경쇄 1(1)
12. 리보좀 단백질 L15p 및 L18e(1)
코어: 불규칙적인 (베타-베타-알파)n 수퍼헬릭스의 3 회전
1. 리보좀 단백질 L15p 및 L18e(1)
1. 리보좀 단백질 L15p 및 L18e(2)
13. SpoIIaa류(2)
코어: (베타-알파)n 수퍼헬릭스의 4 회전
1. 포스파티딜이노시톨 트랜스퍼 단백질 sec14p의 C-말단
도메인(1)
1. 포스파티딜이노시톨 트랜스퍼 단백질 secl4p의 C-말단
도메인(1)
2. SpoIIaa (1)
1. SpoIIaa (1)
14. ClpP/크로토나제 (1)
코어: (β-β-α)n 수퍼헬릭스의 4 회전
1. ClpP/크로토나제 (3)
1. Clp 프로테아제, ClpP 서브유닛 (1)
2. 광계 II D1 C-말단 처리 프로테아제, 촉매 도메인 (1)
3. 크로토나제-유사 (4)
15. BRCT 도메인 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. BRCT 도메인 (2)
1. DNA-수복 단백질 XRCC1 (1)
2. NAD+-의존성 DNA 리가제, 도메인 4 (1)
16. 루마진 신타제/리보플라빈 신타제 복합체의 β-서브유닛 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 루마진 신타제/리보플라빈 신타제 복합체의 β-서브유닛 (1)
1. 루마진 신타제/리보플라빈 신타제 복합체의 β-서브유닛 (4)
17. 카스파제-유사 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 카스파제-유사 (2)
단일 도메인에 폴드된 이종이량체성 단백질
1. 카스파제 (3)
2. 긴기파인 R (RgpB), N-말단 도메인 (1)
18. DNA 글리코실라제 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. DNA 글리코실라제 (2)
1. 우라실-DNA 글리코실라제 (3)
2. G:T/U 부정합-특이성 DNA 글리코실라제 (1)
19. 말로닐-CoA ACP 트랜스아실라제의 촉매 도메인 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 말로닐-CoA ACP 트랜스아실라제의 촉매 도메인 (1)
1. 말로닐-CoA ACP 트랜스아실라제의 촉매 도메인 (1)
20. 개시 인자 IF2/eIF5b, 도메인 3 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 개시 인자 IF2/eIF5b, 도메인 3 (1)
1. 개시 인자 IF2/eIF5b, 도메인 3 (1)
21. 리보솜 단백질 L13 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 3214
1. 리보솜 단백질 L13 (1)
1. 리보솜 단백질 L13 (1)
22. 리보솜 단백질 L4 (1)
3 층, a/b/a; 코어: 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 1423
1. 리보솜 단백질 L4 (1)
1. 리보솜 단백질 L4 (2)
23. 플라보독신-유사 (16)
3 층, a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 21345
1. CheY-유사 (3)
1. CheY-관련 (11)
2. 에틸렌 수용체의 수용기 도메인 (1)
3. 아미다제 오페론 AmiR의 음성 조절인자 (1)
2. Toll/인터류킨 수용체 TIR 도메인 (1)
1. Toll/인터류킨 수용체 TIR 도메인 (2)
3. 가설 단백질 MTH538 (1)
1. 가설 단백질 MTH538 (1)
4. 숙시닐-CoA 신테타제 도메인 (1)
1. 숙시닐-CoA 신테타제 도메인 (4)
추가의 N-말단 스트랜드 "0" 포함, 스트랜드 2에 대한 역평행임
5. 플라보단백질 (3)
1. 플라보독신-관련 (8)
FMN를 결합시킴
2. NADPH-시토크롬 p450 리덕타제, N-말단 도메인 (2)
3. 퀴논 리덕타제 (4)
FAD를 결합시킴
6. 코발라민 (비타민 B12)-결합 도메인 (1)
1. 코발라민 (비타민 B12)-결합 도메인 (4)
7. 오르니틴 데카르복실라제 N-말단 "윙" 도메인 (1)
1. 오르니틴 데카르복실라제 N-말단 "윙" 도메인 (1)
8. N5-카르복시아미노이미다졸 리보뉴클레오티드 (N5-CAIR) 뮤타제 PurE (1)
1. N5-카르복시아미노이미다졸 리보뉴클레오티드 (N5-CAIR) 뮤타제 PurE (1)
9. 큐티나제-유사 (1)
1. 큐티나제-유사 (3)
이 과는 α/β 히드롤라제 상과로 분류될 수 있다.
10. 에스테라제/아세틸히드롤라제 (4)
1. 에스테라제 (1)
2. 적혈구응집소-에스테라제-융합 당단백질 HEF1의 에스테라제 도메인 (1)
3. 아세틸히드롤라제 (1)
4. 람노갈락투로난 아세틸에스테라제 (1)
11. β-D-글루칸 엑소히드롤라제, C-말단 도메인 (1)
1. β-D-글루칸 엑소히드롤라제, C-말단 도메인 (1)
12. 포르메이트/글리세레이트 데히드로게나제 촉매 도메인-유사 (3)
1. 포르메이트/글리세레이트 데히드로게나제, 기질 결합된 도메인 (6)
이 도메인은 로스만-폴드 도메인에 의하여 개입됨
2. L-알라닌 데히드로게나제 (1)
3. S-아데노실호모시스테인 히드롤라제 (2)
13. 타입 II 3-데히드로퀴네이트 데히드라타제 (1)
1. 타입 II 3-데히드로퀴네이트 데히드라타제 (2)
14. 뉴클레오시드 2-데옥시리보실트랜스퍼라제 (1)
1. 뉴클레오시드 2-데옥시리보실트랜스퍼라제 (1)
15. 리보솜 단백질 S2 (1)
추가의 구조로 작성된 폴드
1. 리보솜 단백질 S2 (1)
16. 클래스 I 글루타민 아미도트랜스퍼라제-유사 (4)
옥시음이온 홀 및 촉매 친핵체의 보존된 위치;
상이한 구성 과는 상이한 추가의 구조를 포함함
1. 클래스 I 글루타민 아미도트랜스퍼라제 (GAT) (3)
촉매 Cys-His-Glu 트리아드를 포함함
2. 세포내 프로테아제 (1)
클래스 I GAT 트리아드와 상이한 촉매 Cys-His-Glu 트리아드를 포함함
3. 카탈라제, C-말단 도메인 (1)
4. 아스파틸 디펩티다제 PepE (1)
공통의 코어에서의 가능한 원형 변경; 촉매 Ser-His-Glu 트리아드를 포함함
24. 메틸글리옥살 신타제-유사 (1)
3 층, a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145
1. 메틸글리옥살 신타제-유사 (2)
공통의 포스페이트 결합 부위를 포함함.
1. 카르바모일 포스페이트 신테타제, 커다란 서브유닛 알로스테릭, C-말단 도메인 (1)
2. 메틸글리옥살 신타제, MgsA (1)
25. 페레독신 리덕타제-유사, C-말단 NADP-결합된 도메인 (1)
3 층, a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145
1. 페레독신 리덕타제-유사, C-말단 NADP-결합된 도메인 (5)
통상의 로스만 폴드보다 상이하게 NADP를 결합시킴
N-말단 FAD-결합된 도메인은 (6,10) 배럴을 포함함
1. 리덕타제 (10)
2. 프탈레이트 디옥시게나제 리덕타제 (1)
추가의 2Fe-2S 페레독신 도메인을 포함함
3. 디히드로오로테이트 데히드로게나제 B, PyrK 서브유닛 (1)
C-말단 연장체에서 2Fe-2S 클러스터를 포함함
4. NADPH-시토크롬 p450 리덕타제-유사 (2)
5. 플라보헤모글로빈, C-말단 도메인 (1)
추가의 글로빈 도메인을 포함함.
26. 아데닌 뉴클레오티드 α 히드롤라제-유사 (3)
코어: 3 층, a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145
1. 뉴클레오티딜릴 트랜스퍼라제 (3)
1. 클래스 I 아미노아실-tRNA 신테타제 (RS), 촉매 도메인 (10)
C-말단 연장체에서 보존된 모든 α 서브도메인을 포함함
2. 시티딜릴트랜스퍼라제 (1)
3. 아데닐릴트랜스퍼라제 (2)
2. 아데닌 뉴클레오티드 α 히드롤라제 (2)
1. N-타입 ATP 피로포스파타제 (3)
2. 포스포아데닐릴 설페이트 (PAPS) 리덕타제 (1)
3. UDP-글루코즈 데히드로게나제 (UDPGDH), C-말단 (UDP-결합) 도메인 (1)
1. UDP-글루코즈 데히드로게나제 (UDPGDH), C-말단 (UDP-결합) 도메인 (1)
27. 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라제 중앙 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145; 로스만-유사
1. 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라제 중앙 도메인 (1)
1. 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라제 중앙 도메인 (2)
28. DNA 포토리아제의 N-말단 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145; 로스만-유사
1. DNA 포토리아제의 N-말단 도메인 (1)
1. DNA 포토리아제의 N-말단 도메인 (2)
29. ETFP 아데닌 뉴클레오티드-결합 도메인-유사 (1)
3 층: a/b/a, 코어: 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145
1. ETFP 아데닌 뉴클레오티드-결합 도메인-유사 (2)
1. 전자 전달 플라보단백질, ETFP (2)
코어 시트의 양 모서리에서 추가의 스트랜드를 포함함
2. "가설" 단백질 MJ0577 (1)
30. 비오틴 카르복실라제 N-말단 도메인-유사 (1)
3 층: a/b/a; 4 내지 6 스트랜드의 평행 또는 혼합형 β시트
로스만-폴드 도메인의 가능한 흔적 형태
1. 비오틴 카르복실라제 N-말단 도메인-유사 (5)
이것 이후의 공통의 ATP-결합 도메인에 의하여 정의된 상과
1. 비오틴 카르복실라제/카르바모일 포스페이트 신테타제 (5)
2. D-알라닌 리가제 N-말단 도메인 (2)
3. 원핵성 글루타티온 신테타제, N-말단 도메인 (1)
4. 진핵성 글루타티온 신테타제 (1)
원핵성 효소의 환형 변경된 버젼
5. 시냅신 Ia 도메인 (1)
31. DHS-유사 NAD/FAD-결합 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 321456; 로스만-유사
1. DHS-유사 NAD/FAD-결합 도메인 (4)
통상의 로스만 폴드보다 반대 방향으로 보조인자 분자를 결합시킴
1. 데옥시히푸신 신타제, DHS (1)
2. 전자 전달 플라보단백질 α 서브유닛의 C-말단 도메인 (2)
스트랜드 3의 결여; 피루베이트 옥시다제 도메인과 FAD-결합 모드를 공유함
3. 피루베이트 옥시다제 및 데카르복실라제, 중간 도메인 (5)
N-말단 도메인은 Pyr 모듈이고, C-말단 도메인은 티아민 디포스페이트-결합 폴드의 PP 모듈임
4. 트랜스히드로게나제 도메인 III (dIII) (3)
NADP를 결합시키고, 피루베이트 옥시다제 FAD-결합 도메인과 함께 공통의 ADP-결합 모드를 공유함
32. 튜불린, GTPase 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 321456
1. 튜불린, GTPase 도메인 (1)
1. 튜불린, GTPase 도메인 (3)
33. 시스테인 히드롤라제 (1)
3 층 a/b/a; 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 321456
1. 시스테인 히드롤라제 (2)
1. N-카르바모일사르코신 아미도히드롤라제 (1)
2. YcaC (1)
34. 할로내성 단백질 Hal3 (1)
3 층: a/b/a; 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 321456
1. 할로내성 단백질 Hal3 (1)
1. 할로내성 단백질 Hal3 (1)
35. 글루코사민 6-포스페이트 데아미나제/이소머라제 (1)
3 층: a/b/a; 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 324561
1. 글루코사민 6-포스페이트 데아미나제/이소머라제 (1)
1. 글루코사민 6-포스페이트 데아미나제/이소머라제 (2)
36. 티아민 디포스페이트 결합 폴드 (THDP-결합) (1)
3 층: a/b/a; 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 213465
1. 티아민 디포스페이트 결합 폴드 (THDP-결합) (4)
피리딘 (Pyr)- 및 피로포스페이트 (PP)-결합 모듈 모두는 이 폴드를 지님
보존된 코어는 2 개의 Pyr 및 2 개의 PP-모듈로 이루어지고, 2 개의조효소 분자를 결합시킴
1. 피루베이트 옥시다제 및 데카르복실라제 (5)
Pyr 모듈은 N-말단 도메인이고, PP 모듈은 C-말단 도메인임
로스만-유사 도메인은 이들 사이에 존재함
2. 트랜스케톨라제, TK (1)
3. 분지쇄 α-케토산 데히드로게나제 (2)
TK 및 PFOR에 대한 어버이 과
TK와 관련된 이종이량체성 단백질; α-서브유닛는 PP 모듈이고, β-서브유닛의 N-말단 도메인은 Pyr 모듈임
4. 피루베이트-페레독신 옥시도리덕타제, PFOR, 도메인 I 및 VI (1)
도메인 VI, I 및 II는 TK N, M 및 C 도메인과 동일한 방식으로 배열됨
37. 뉴클레오티드 트리포스페이트 히드롤라제를 포함하는 P-루프 (1)
3 층: a/b/a, 가변 크기의 평행 또는 혼합형 β시트
1. 뉴클레오티드 트리포스페이트 히드롤라제를 포함하는 P-루프 (14)
β시트 토폴로지에 기초한 과로 분열
1. 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 키나제 (16)
5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 23145
2. 시키메이트 키나제 (1)
뉴클레오티드/뉴클레오시드 키나제와 유사하나, 상이한 기질에 작용함
3. 클로람페니콜 포스포트랜스퍼라제 (1)
뉴클레오티드/뉴클레오시드 키나제와 유사하나, 상이한 기질에 작용함
4. 아데노신-5' 포스포설페이트 키나제 (APS 키나제) (1)
5. PAPS 설포트랜스퍼라제 (4)
뉴클레오티드/뉴클레오시드 키나제와 유사하나, 설페이트기를 전달함
6. 포스포리불로키나제/판토테네이트 키나제 (2)
7. 6-포스포프룩토-2-키나제/프룩토스-2,6-비스포스파타제, 키나제 도메인 (1)
8. G 단백질 (28)
코어: 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 2312456; 스트랜드 2는 나머지에 대하여 역평행임
9. 모터 단백질 (7)
10. 니트로게나제 철 단백질-유사 (10)
코어: 7 스트랜드의 평행 β시트, 순서 3241567
11. RecA 단백질-유사 (ATPase-도메인) (9)
코어: 8 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 32451678; 스트랜드 7은 나머지에 대하여 역평행임
12. ABC 트랜스포터 ATPase 도메인-유사 (7)
RecA-유사 토폴로지를 갖는 중앙 코어에 삽입된 2 개의 추가의 서브도메인이 존재함
13. 연장된 AAA-ATPase 도메인 (13)
폴드는 RecA와 유사하나, 이는 마지막 2 개의 스트랜드가 결여되어 있으며, 그후 과-특이성 모든 -α Arg-핑거 도메인이 있음
14. RNA 헬리카제 (1)
복제: 2 개의 유사한 도메인으로 이루어지나, 하나는 NTP를 결합시키고, 다른 하나는 RNA를 결합시킴; 또한, C-말단 연장체에 모든 α서브도메인을 포함함
38. 프룩토스 퍼미아제, 서브유닛 IIb (1)
3 층: a/b/a, 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 324156
1. 프룩토스 퍼미아제, 서브유닛 IIb (1)
1. 프룩토스 퍼미아제, 서브유닛 IIb (1)
39. 니코티네이트 모노뉴클레오티드: 5,6-디메틸벤즈이미다졸 포스포리보실트랜스퍼라제 (CobT) (1)
3 층: a/b/a, 7 스트랜드의 평행 β시트, 순서 3214567
1. 니코티네이트 모노뉴클레오티드: 5,6-디메틸벤즈이미다졸 포스포리보실트랜스퍼라제 (CobT) (1)
1. 니코티네이트 모노뉴클레오티드: 5,6-디메틸벤즈이미다졸 포스포리보실트랜스퍼라제 (CobT) (1)
40. 메틸에스테라제 CheB, C-말단 도메인 (1)
3 층: a/b/a, 7 스트랜드의 평행 β시트, 순서 3421567
1. 메틸에스테라제 CheB, C-말단 도메인 (1)
1. 메틸에스테라제 CheB, C-말단 도메인 (1)
41. 서브틸리신-유사 (1)
3 층: a/b/a, 7 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2314567;
스트랜드 2와 3간의 좌선형 교차 연결
1. 서브틸리신-유사 (2)
1. 서브틸라제 (12).
2. 세린-카르복실 프로테이나제 PSCP (1)
추가의 구조를 사용하여 작성됨
42. 아르기나제/데아세틸라제 (1)
3 층: a/b/a, 8 스트랜드의 평행 β시트, 순서 21387456
1. 아르기나제/데아세틸라제 (2)
1. 아르기나제 (2)
2. 히스톤 데아세틸라제, HDAC (1)
43. CoA-의존성 아실트랜스퍼라제 (1)
코어: 2 층, a/b; 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 324561; 스트랜드 3 및6은 나머지에 대하여 역평행임
1. CoA-의존성 아실트랜스퍼라제 (1)
1. CoA-의존성 아실트랜스퍼라제 (5)
44. 포스포티로신 단백질 포스파타제 I-유사 (2)
3 층: a/b/a; 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 포스포티로신 단백질 포스파타제 I (1)
II과와 함께 공통의 활성 부위 구조를 공유함
1. 저분자량 포스포티로신 단백질 포스파타제 (3)
2. 효소 IIB-셀로비오스 (1)
1. 효소 IIB-셀로비오스 (1)
45. (포스포티로신 단백질) 포스파타제 II (1)
코어: 3 층, a/b/a; 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 1432
1. (포스포티로신 단백질) 포스파타제 II (3)
환형 변경된 토폴로지와 I과 공통의 활성 부위 구조를 공유함
1. 이중-특이성 포스파타제 (2)
2. 고분자량 포스포티로신 단백질 포스파타제(8)
스트랜드 4 이전에 3 개의 역평행 스트랜드의 β시트로의 연장체를 지님
3. 포스포이노시티드 포스파타제 Pten (Pten 종양 억제제), N-말단 도메인 (1)
46. 로다네즈/세포 주기 조절 포스파타제 (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32451
1. 로다네즈/세포 주기 조절 포스파타제 (2)
활성 부위 구조는 I과 및 II과 단백질 포스파타제의 구조와 유사함; 토폴로지는 I과 토폴로지의 상이한 환형 변경에 의하여 관련될 수 있음
1. 세포 주기 조절 포스파타제, 촉매 도메인 (2)
2. 설퍼트랜스퍼라제 (로다네즈) (2)
복제, 이 폴드의 2 개의 도메인으로 이루어짐
47. 티오레독신 폴드 (3)
코어: 3 층, a/b/a; 4 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 4312; 스트랜드 3은 나머지에 대하여 역평행임
1. 티오레독신-유사 (10)
1. 티올트랜스퍼라제 (12)
2. PDI-유사 (3)
복제: 이 폴드의 2 개의 탠뎀 반복부를 포함함
3. 칼세퀘스트린 (1)
복제: 이 폴드의 3 개의 탠덤 반복부를 포함함
4. 디설피드-결합 형성 촉진인자 (DSBA) (2)
5. 글루타티온 S-트랜스퍼라제, N-말단 도메인 (23)
6. 포스두신 (2)
7. 세포질세망 단백질 ERP29, N-도메인 (1)
8. 스플리세오소말 단백질 U5-15Kd (1)
9. 디설피드 결합 이소머라제, DsbC, C-말단 도메인 (1)
공통의 폴드로 작성함
10. 글루타티온 퍼옥시다제-유사 (6)
2. RNA 3'-말단 포스페이트 시클라제, RPTC, 삽입 도메인 (1)
1. RNA 3'-말단 포스페이트 시클라제, RPTC, 삽입 도메인 (1)
3. 티오레독신-유사 2Fe-2S 페레독신 (1)
1. 티오레독신-유사 2Fe-2S 페레독신 (1)
48. 트랜스케톨라제 C-말단 도메인-유사 (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 13245, 스트랜드 1은 나머지에 대하여 역평행임
1. 트랜스케톨라제 C-말단 도메인-유사 (3)
1. 트랜스케톨라제 (1)
2. 분지쇄 α-케토산 데히드로게나제 β-서브유닛, C-도메인 (2)
3. 피루베이트-페레독신 옥시도리덕타제, PFOR, 도메인 II (1)
49. 피루베이트 키나제 C-말단 도메인-유사 (2)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 32145, 스트랜드 5는나머지에 대하여 역평행임
1. 피루베이트 키나제, C-말단 도메인 (1)
1. 피루베이트 키나제, C-말단 도메인 (5)
2. ATP 신타제 (F1-ATPase), 감마 서브유닛 (1)
공통의 폴드로의 -anb C-말단 연장체에 의하여 확인되는 역평행의 꼬인 코일을 포함함
1. ATP 신타제 (F1-ATPase), 감마 서브유닛 (2)
50. 류신 아미노펩티다제, N-말단 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 23145; 스트랜드 2는 나머지에 대하여 역평행임
1. 류신 아미노펩티다제, N-말단 도메인 (1)
1. 류신 아미노펩티다제, N-말단 도메인 (1)
51. 안티코돈-결합 도메인-유사 (4)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 21345; 스트랜드 4는 나머지에 대하여 역평행임
1. 클래스 II aaRS의 안티코돈-결합 도메인 (1)
1. 클래스 II aaRS의 안티코돈-결합 도메인 (5)
2. TolB, N-말단 도메인 (1)
1. TolB, N-말단 도메인 (1)
3. 디올 데히드라타제, β 서브유닛 (1)
1. 디올 데히드라타제, β 서브유닛 (1)
C-말단 연장체에 추가의 구조를 포함함
4. Maf/Ham1 (2)
공통의 폴드에 삽입된 추가의 구조로 작성됨
1. Haml (1)
2. Maf 단백질 (1)
52. 제한 엔도뉴클레아제-유사 (3)
코어: 3 층, a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 12345; 스트랜드 2, 몇몇의 과에서 5는 나머지에 대하여 역평행임
1. 제한 엔도뉴클레아제-유사 (17)
1. 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI (1)
2. 제한 엔도뉴클레아제 EcoRV (1)
3. 제한 엔도뉴클레아제 BamHI (1)
4. 제한 엔도뉴클레아제 BglI (1)
5. 제한 엔도뉴클레아제 BglII (1)
6. 제한 엔도뉴클레아제 PvuII (1)
7. 제한 엔도뉴클레아제 Cfr10I (1)
8. 제한 엔도뉴클레아제 MunI (1)
9. 제한 엔도뉴클레아제 NaeI (1)
10. 제한 엔도뉴클레아제 NgoIV (1)
11. 제한 엔도뉴클레아제 BsobI (1)
12. 제한 엔도뉴클레아제 FokI, C-말단 (촉매) 도메인 (1)
13. 람다 엑소뉴클레아제 (1)
14. (1)로부터의 DNA 부정합 수복 단백질 MutH
15. 매우 짧은 패취 수복 (VSR) 엔도뉴클레아제 (1)
16. TnsA 엔도뉴클레아제, N-말단 도메인 (1)
17. 홀리데이 연결 레졸바제 (엔도뉴클레아제 I) (1)
2. tRNA 스플라이싱 엔도뉴클레아제, C-말단 도메인 (1)
1. tRNA 스플라이싱 엔도뉴클레아제, C-말단 도메인 (1)
3. 진핵성 RPB5 N-말단 도메인 (1)
1. 진핵성 RPB5 N-말단 도메인 (1)
53. 레졸바제-유사 (2)
코어: 3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 21345; 스트랜드 5는 나머지에 대하여 역평행임
1. 레졸바제-유사 (2)
1. 감마, 델타 레졸바제, 커다란 단편 (1)
2. 5' →3' 엑소뉴클레아제 (5)
추가의 스트랜드 및 α-나선형 아치를 포함함; 스트랜드 순서 321456; 스트랜드 6은 나머지에 대하여 역평행임
2. β-카보닉 안하이드라제 (1)
1. β-카보닉 안하이드라제 (2)
54. 만노스 트랜스포터의 IIA 도메인, IIA-Man (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 21345; 스트랜드 5는 나머지에 대하여 역평행임
1. 만노스 트랜스포터의 IIA 도메인, IIA-Man (1)
활성 이량체는 스트랜드 5 교환에 의하여 형성됨
1. 만노스 트랜스포터의 IIA 도메인, IIA-Man (1)
55. 리보뉴클레아제 H-유사 모티프 (7)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 32145; 스트랜드 2는 나머지에 대하여 역평행임
1. 액틴-유사 ATPase 도메인 (4)
복제는 이 폴드의 2 개의 도메인을 포함함
1. 액틴/HSP70 (8)
2. 아세테이트 키나제 (1)
3. 헥소키나제 (3)
4. 글리세롤 키나제 (1)
2. 크레아티나제/피롤리다제 N-말단 도메인 (1)
1. 크레아티나제/피롤리다제 N-말단 도메인 (2)
3. 리보뉴클레아제 H-유사 (6)
이 폴드의 하나의 도메인으로 이루어짐
1. 리보뉴클레아제 H (4)
2. 레트로바이러스 인테그라제, 촉매 도메인 (3)
3. mu 트랜스포사제, 코어 도메인 (1)
4. 트랜스포사제 억제제 (Tn5 트랜스포사제) (1)
5. DnaQ-유사 3'-5' 엑소뉴클레아제 (11)
6. RuvC 레졸바제 (1)
4. 해독기 성분 (2)
1. 리보솜 단백질 L18 및 S11 (2)
2. 진핵성 펩티드쇄 방출 인자 서브유닛 1의 중간 도메인, ERF1 (1)
5. 가설 단백질 MTH1175 (1)
1. 가설 단백질 MTH 1175 (1)
6. DNA 수복 단백질 MutS, 도메인 II (1)
1. DNA 수복 단백질 MutS, 도메인 II (2)
7. 메틸화된 DNA-단백질 시스테인 메틸트랜스퍼라제 도메인 (1)
1. 메틸화된 DNA-단백질 시스테인 메틸트랜스퍼라제 도메인 (3)
56. 포스포릴라제/히드롤라제 유사 (6)
코어: 3층, a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 시트;
순서 21354; 스트랜드 4는 나머지에 대하여 역평행임;
교차 루프를 포함함
1. 히드로게나제 성숙화 엔도펩티다제 HybD (1)
폴드는 공통 코어 구조와 일치함
1. 히드로게나제 성숙화 엔도펩티다제 HybD (1)
2. 푸린 및 우리딘 포스포릴라제 (1)
복합 구조; 8 스트랜드의 혼합형 β시트를 포함함,
순서 23415867, 스트랜드 3, 6 및 7은 나머지에 대해 역평행임;
배럴, 폐쇄형임; n=5, S=8
1. 푸린 및 우리딘 포스포릴라제 (6)
3. 펩티딜-tRNA 히드롤라제 (1)
1. 펩티딜-tRNA 히드롤라제 (1)
4. 피롤리돈 카르복실 펩티다제(피로글루타메이트 아미노펩티다제)(1)
1. 피롤리돈 카르복실 펩티다제
(피로글루타메이트 아미노펩티다제) (2)
5. Zn-의존성 엑소펩티다제 (5)
코어: 8 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 12435867;
스트랜드 2, 6 및 7은 나머지에 대해 역평행임
1. 췌장 카르복시펩티다제 (6)
2. 카르복시펩티다제 T (1)
3. 류신 아미노펩티다제, C-말단 도메인 (1)
4. 박테리아 엑소펩티다제 (3)
5. 트랜스페린 수용체 엑토도메인, 프로테아제 유사 도메인 (1)
6. 방향족 개환 디옥시게나제 LigAB의 LigB 서브유닛 (1)
PNP 폴드에 가장 유사한, 공통 폴드의 환형 변경
1. 방향족 개환 디옥시게나제 LigAB의 LigB 서브유닛 (1)
57. 몰리브덴 보조인자 생합성 단백질 MogA (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트; 순서: 21354,
스트랜드 5는 나머지에 대해 역평행임;
포스포릴라제/히드롤라제 유사 폴드의 변경
1. 몰리브덴 보조인자 생합성 단백질 MogA (1)
1. 몰리브덴 보조인자 생합성 단백질 MogA (1)
58. 아미노산 데히드로게나제 유사, N-말단 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트; 순서 12435,
스트랜드 2는 나머지에 대하여 역평행임
1. 아미노산 데히드로게나제 유사, N-말단 도메인 (3)
1. 아미노산 데히드로게나제 (7)
이량체화 도메인
2. 테트라히드로폴레이트 데히드로게나제/시클로히드롤라제 (3)
3. 미토콘드리아 NAD(P)-의존성 말산 효소 (1)
이 도메인은 추가의 구조로 장식되어 있고;
N-말단의 추가 서브도메인을 포함함
59. 글루타메이트 리가제 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 126345;
스트랜드 1은 나머지에 대하여 역평행임
1. 글루타메이트 리가제 도메인 (2)
1. MurD/MurF C-말단 도메인 (2)
2. 폴릴폴리글루타메이트 신테타제, C-말단 도메인 (1)
60. 포스포글리세레이트 뮤타제 유사 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 324156;
스트랜드 5는 나머지에 대해 역평행임
1. 포스포글리세레이트 뮤타제 유사 (4)
1. 포스포글리세레이트 뮤타제 (1)
2. 산 포스파타제 (2)
3. 피타제 (마이오-이노시톨-헥사키스포스페이트-3-
포스포히드롤라제) (3)
4. 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토즈-2,6-비스포스파타제,
포스파타제 도메인 (1)
61. PRTase 유사 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 321456;
스트랜드 3은 나머지에 대하여 역평행임
1. PRTase 유사 (2)
1. 포스포리보실트랜스퍼라제 (PRTases) (14)
2. 포스포리보실피로포스페이트 신테타제 (1)
복제: 이 폴드의 2개의 도메인으로 구성됨
62. 인테그린 A (또는 I) 도메인 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 321456;
스트랜드 3은 나머지에 대하여 역평행임
1. 인테그린 A (또는 I) 도메인 (1)
1. 인테그린 A (또는 I) 도메인 (7)
63. 글루타코네이트-CoA 트랜스퍼라제 서브유닛 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 6 스트랜드의 평행 또는 혼합형 β시트,
순서 432156; 시트의 일부는 그 자체 상에 폴딩되어
배럴 유사 구조를 형성함
1. 글루타코네이트-CoA 트랜스퍼라제 서브유닛 (1)
1. 글루타코네이트-CoA 트랜스퍼라제 서브유닛 (2)
64. 피루베이트-페레독신 옥시도리덕타제, PFOR, 도메인 III (1)
3 층 : a/b/a; 6 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 231456;
스트랜드 3은 나머지에 대하여 역평행임
1. 피루베이트-페레독신 옥시도리덕타제, PFOR, 도메인 III (1)
1. 피루베이트-페레독신 옥시도리덕타제, PFOR, 도메인 III (1)
65. 포르밀트랜스퍼라제 (1)
3 층: a/b/a; 7 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 3214567;
스트랜드 6은 나머지에 대하여 역평행임
1. 포르밀트랜스퍼라제 (1)
1. 포르밀트랜스퍼라제 (2)
66. S-아데노실-L-메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 7 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 3214576;
스트랜드 7은 나머지에 대하여 역평행임
1. S-아데노실-L-메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 (11)
1. 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제, COMT (1)
2. RNA 메틸트랜스퍼라제 FtsJ (1)
3. 피브릴라린 상동체 (1)
4. 가설 단백질 MJ0882 (1)
5. 글리신 N-메틸트랜스퍼라제 (1)
6. 아르기닌 메틸트랜스퍼라제, HMT1 (1)
β-샌드위치 올리고머화 서브도메인으로 교체된 공통
폴드의 마지막 2개 스트랜드가 결여되어 있음
7. 단백질-L-이소아스파르테이트 O-메틸트랜스퍼라제 (1)
추가의 α+ β서브도메인을 갖는 공통 폴드의
또 다른 C-말단 변형
8. 주화성 수용체 메틸트랜스퍼라제 CheR, C-말단 도메인 (1)
추가의 N-말단의 모든 α도메인, res.11-91을 포함함
9. RNA 메틸라제 (3)
10. DNA 메틸라제 (5)
11. II형 DNA 메틸라제 (2)
공통 폴드의 환형 변경 형태
67. PLP-의존성 트랜스퍼라제 (1)
주요 도메인: 3 층: a/b/a, 7 스트랜드의 혼합형 β시트,
순서 3245671; 스트랜드 7은 나머지에 대하여 역평행임
1. PLP-의존성 트랜스퍼라제 (5)
1. AAT 유사 (9)
2. β-제거용 리아제 (2)
3. 시스타티오닌 신타제 유사 (8)
4. 오메가-아미노산: 피루베이트 아미노트랜스퍼라제 유사 (15)
5. 오르니틴 데카르복실라제 주 도메인 (1)
68. 뉴클레오티드-디포스포-당 트랜스퍼라제 (1)
3 층: a/b/a; 7 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 3214657;
스트랜드 6은 나머지에 대하여 역평행임
1. 뉴클레오티드-디포스포-당 트랜스퍼라제 (8)
1. 포자각 다당류 생합성 단백질 SpsA (1)
2. β 1,4 갈락토실트랜스퍼라제 (b4GalT1) (1)
3. CMP 아실뉴라미네이트 신테타제 (1)
4. 갈락토실트랜스퍼라제 LgtC (1)
5. N-아세틸글루코사민 1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 GlmU,
N-말단 도메인 (1)
6. 글루코스-1-포스페이트 티미딜일트랜스퍼라제 RmlA (1)
7. 1,3-글루쿠로닐 트랜스퍼라제 I (glcAT-1) (1)
8. 몰리브덴 보조인자 생합성 단백질 MobA (1)
69. α/β-히드롤라제 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 8 스트랜드의 혼합형 β시트,
순서 12435678, 스트랜드 2는 나머지에 대하여 역평행임
1. α/β-히드롤라제 (20)
많은 구성원이 스트랜드 8과 부가의 스트랜드 9 사이에
좌선형의 교차 연결을 갖음
1. 아세틸콜린에스테라제 유사 (8)
2. 카르복실에스테라제 (2)
3. 마이코박테리아 항원 (2)
4. 프롤릴 올리고펩티다제, C-말단 도메인 (1)
5. 세린 카르복시펩티다제 (4)
6. 위장 리파제 (1)
7. 프롤린 이미노펩티다제 (2)
8. 할로알칸 데할로게나제 (3)
9. 디엔락톤 히드롤라제 (2)
10. 탄소-탄소 결합 히드롤라제 (1)
11. 에폭시드 히드롤라제 (3)
12. 할로퍼옥시다제 (5)
13. 티오에스테라제 (2)
14. 카르복실에스테라제/티오에스테라제1 (2)
15. 신규한 박테리아 에스테라제 (1)
16. 리파제 (1)
17. 진균류 리파제 (9)
18. 박테리아 리파제 (5)
19. 췌장 리파제, N-말단 도메인 (6)
20. 히드록시니트릴 리아제 (2)
70. 뉴클레오시드 히드롤라제 (1)
코어: 3 층, a/b/a; 8 스트랜드의 혼합형 β시트,
순서 32145687; 스트랜드 7은 나머지에 대하여 역평행임
1. 뉴클레오시드 히드롤라제 (1)
1. 뉴클레오시드 히드롤라제 (2)
71. 디히드로폴레이트 리덕타제 (1)
3 층: a/b/a; 8 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 34251687;
스트랜드 8은 나머지에 대하여 역평행임
1. 디히드로폴레이트 리덕타제 (1)
1. 디히드로폴레이트 리덕타제 (10)
72. 리보키나제 유사 (2)
코어: 3 층: a/b/a; 8 스트랜드의 혼합형 β시트,
순서 21345678, 스트랜드 7은 나머지에 대하여 역평행임
가능한 상과: 이 폴드의 구성원은 유사한 기능을 갖지만
ATP 결합 부위가 다름
1. 리보키나제 유사 (2)
스트랜드 2와 3 사이에 별도의 스트랜드가 배치되어 있음
1. 리보키나제 유사 (3)
2. 히드록시에틸티아졸 키나제 (thz 키나제) (1)
2. MurD 유사 펩티드 리가제, 촉매 도메인 (2)
스트랜드 1과 2 사이에 별도의 스트랜드가 배치되어 있음
1. MurD/MurF (2)
2. 폴릴폴리글루타메이트 신테타제 (1)
73. 카르바메이트 키나제 유사 (1)
3 층: a/b/a; 8 스트랜드의 혼합형 (주로 평행) β시트,
순서 34215786; 스트랜드 8은 나머지에 대하여 역평행임
1. 카르바메이트 키나제 유사 (1)
포스포글리세레이트 키나제의 N-말단 도메인과 토폴로지가
유사함
1. 카르바메이트 키나제 유사 (2)
74. 클래스 II 알돌라제 (1)
3 층: a/b/a; 9 스트랜드의 혼합형 (주로 역평행) β시트,
순서 432159876; 스트랜드 4와 5 사이에서 좌선형의 교차
1. 클래스 II 알돌라제 (1)
1. 클래스 II 알돌라제 (1)
금속 (아연) 이온 의존성임
75. 시토졸 포스포리파제 A2 촉매 도메인 (1)
3 층: a/b/a; 9 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 654321789;
스트랜드 4, 6 및 8은 나머지에 대해 역평행임
1. 시토졸 포스포리파제 A2 촉매 도메인 (1)
1. 시토졸 포스포리파제 A2 촉매 도메인 (1)
76. 포스파타제/설파타제 (1)
3 층: a/b/a; 10 스트랜드의 혼합형 β시트,
순서 564371892A, (A=10); 스트랜드 9는 나머지에 대하여 역평행임
1. 포스파타제/설파타제 (2)
1. 알칼리성 포스파타제 (1)
2. 아릴설파타제 (2)
77. 이소시트레이트 및 이소프로필말레이트 데히드로게나제 (1)
가성다이애드(pseudodyad)와 관련된 2개의 서로 얽힌 (서브)도메인으
로 구성됨; 복제
3 층: a/b/a; 10 스트랜드의 단일 혼합형 β시트,
순서 213A945867 (A=10); 5∼9의 스트랜드는 나머지에 대해 역평행임
1. 이소시트레이트 & 이소프로필말레이트 데히드로게나제 (1)
1. 이소시트레이트 & 이소프로필말레이트 데히드로게나제 (7)
78. ATC 유사 (2)
가성다이애드와 관련된 2개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
코어: 3 층, a/b/a 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 아스파르테이트/오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (1)
1. 아스파르테이트/오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (6)
2. 글루타메이트 라세마제 (1)
1. 글루타메이트 라세마제 (1)
C-말단 연장체를 N-말단 도메인에 가함
79. 트립토판 신타제 β서브유닛 유사 PLP-의존성 효소 (1)
가성다이애드와 관련된 2개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
코어: 3 층, a/b/a; 4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 3214
1. 트립토판 신타제 β서브유닛 유사 PLP-의존성 효소 (1)
1. 트립토판 신타제 β서브유닛 유사 PLP-의존성 효소 (4)
80. SIS 도메인 (1)
가성다이애드와 관련된 2개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 21345
1. SIS 도메인 (2)
1. 글루코사민 6-포스페이트 신타제(GLMS)의 "이소머라제 도메인" (1)
2. 포스포글루코스 이소머라제, PGI (2)
초과 폴드의 변경
81. 포르메이트 데히드로게나제/DMSO 리덕타제, 도메인 1-3 (1)
가성다이애드와 관련된 2개의 유사한 서로 얽힌 도메인으로 구성됨;
복제
코어: 3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32451
1. 포르메이트 데히드로게나제/DMSO 리덕타제, 도메인 1-3 (1)
몰리브돕테린 효소
1. 포르메이트 데히드로게나제/DMSO 리덕타제, 도메인 1-3 (6)
도메인 1 (잔기 1-55)은 FDH에서의 Fe4S4 클러스터에는
결합하나 DMSO 리덕타제와는 결합하지 않음
82. 알데히드 리덕타제 (데히드로게나제), ALDH (1)
각각 3층 (a/b/a)을 갖는 2개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
코어: 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145
1. 알데히드 리덕타제 (데히드로게나제), ALDH (1)
다른 NAD(P)-의존성 옥시도리덕타제와 달리 NAD에 결합함
1. 알데히드 리덕타제 (데히드로게나제), ALDH (8)
83. 아코니타제, 처음 3개 도메인 (1)
각각 3층 (a/b/a)을 갖는 3개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
코어: 5 스트랜드의 평행 β시트, 순서 32145
1. 아코니타제, 처음 3개 도메인 (1)
1. 아코니타제, 처음 3개 도메인 (2)
Fe(4)-S(4) 클러스터를 포함함
84. 포스포글루코뮤타제, 처음 3개 도메인 (1)
각각 3층 (a/b/a)을 갖는 3개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
코어: 4 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 2134,
스트랜드 4는 나머지에 대하여 역평행임
1. 포스포글루코뮤타제, 처음 3개 도메인 (1)
1. 포스포글루코뮤타제, 처음 3개 도메인 (1)
85. L-푸코즈 이소머라제, N-말단 및 제2 도메인 (1)
각각 3층(a/b/a)의 유사한 토폴로지를 갖는 2개의 도메인으로 구성됨;
도메인 1 (1-173)은 5 스트랜드의 평행 β시트를 가짐,
순서 21345
도메인 2 (174-355)는 4 스트랜드의 평행 β시트를 가짐,
순서 2134
1. L-푸코즈 이소머라제, N-말단 및 제2 도메인 (1)
1. L-푸코즈 이소머라제, N-말단 및 제2 도메인 (1)
86. 포스포글리세레이트 키나제 (1)
각각 3층(a/b/a)의 유사하지 않은 2개의 도메인으로 구성됨;
도메인 1은 6 스트랜드의 평행 β시트를 가짐, 순서 342156
도메인 2는 6 스트랜드의 평행 β시트를 가짐, 순서 321456
1. 포스포글리세레이트 키나제 (1)
1. 포스포글리세레이트 키나제 (4)
도메인 2는 ATP에 결합함
87. UDP-글리코실트랜스퍼라제/글리코겐 포스포릴라제 (1)
각각 3층(a/b/a)의 유사하지 않은 2개의 도메인으로 구성됨;
도메인 1: 7 스트랜드의 평행 β시트, 순서 3214567
도메인 2: 6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 321456
1. UDP-글리코실트랜스퍼라제/글리코겐 포스포릴라제 (4)
1. β-글루코실트랜스퍼라제 (DNA-변형) (1)
2. 펩티도글리칸 생합성 글리코실트랜스퍼라제 MurG (1)
3. UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라제 (1)
4. 올리고당류 포스포릴라제 (4)
88. 글루타미나제/아스파라기나제 (1)
각각 3층(a/b/a)의 유사하지 않은 2개의 도메인으로 구성됨;
도메인 1은 6 스트랜드의 혼합형 β시트를 가짐, 순서 213456,
스트랜드 6은 나머지에 대하여 역평행임;
스트랜드 4 및 5 사이에 좌선형의 교차 연결
도메인 2는 4 스트랜드의 평행 β시트를 가짐, 순서 1234
1. 글루타미나제/아스파라기나제 (1)
1. 글루타미나제/아스파라기나제 (5)
89. 포스포프럭토키나제 (1)
각각 3층(a/b/a)의 유사하지 않은 2개의 도메인으로 구성됨;
도메인 1은 7 스트랜드의 혼합형 시트를 가짐, 순서 3214567;
스트랜드 3 및 7은 나머지에 대해 역평행임
도메인 2는 4 스트랜드의 평행 시트를 가짐, 순서 2314
1. 포스포프럭토키나제 (1)
1. 포스포프럭토키나제 (2)
도메인 1은 ATP에 결합함
90. 코발트 프레코린-4 메틸트랜스퍼라제 CbiF (1)
2개의 비유사 도메인으로 구성됨
도메인 1은 5 스트랜드의 역평행 시트, 순서 32415
도메인 2는 5 스트랜드의 혼합형 시트, 순서 12534;
스트랜드 4 및 5는 나머지에 대해 역평행임
1. 코발트 프레코린-4 메틸트랜스퍼라제 CbiF (1)
1. 코발트 프레코린-4 메틸트랜스퍼라제 CbiF (1)
91. 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (ATP-옥살로아세테이트 카르복시-리아제) (1)
2개의 α/β 도메인으로 구성됨
복제: 도메인은 2 나선 및 6 스트랜드 혼합형 시트의
비정상적인 폴드를 공유함; β(2)-α-β(4)-α; 순서 312465,
스트랜드 1 및 5는 나머지에 대해 역평행임
1. 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제
(ATP-옥살로아세테이트 카르복시-리아제) (1)
도메인 2는 P-루프 ATP-결합 모티프를 포함함
1. 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제
(ATP-옥살로아세테이트 카르복시-리아제) (1)
92. 킬레이타제 유사 (2)
복제: 2개 도메인의 탠덤 반복부; 3 층 (a/b/a);
4 스트랜드의 평행 β시트, 순서 2134
1. 킬레이타제 (2)
도메인간 링커는 짧음; 2개 도메인 사이의 C-말단 나선 교환
1. 페로킬레이타제 (1)
2. 코발트 킬레이타제 CbiK (1)
2. "나선형 골격" 금속 수용체 (3)
도메인간 링커 내에 긴 알파 나선형 삽입체를 포함함
1. 세포질 철(II) 담철세포(siderophore) 결합 단백질 FhuD (1)
2. TroA 유사 (2)
3. 니트로게나제 철-몰리브덴 단백질 (3)
이 폴드의 3개 도메인을 포함함;
"나선형 골격"은 도메인 2 및 3을 보유함
93. 세포질 결합 단백질 유사 I (1)
각각 3층(a/b/a)을 갖는 2개의 유사한 얽혀 있는 도메인으로 구성됨:
복제
6 스트랜드의 평행 β시트, 순서 213456
1. 세포질 결합 단백질 유사 I (1)
구조가 상과 II와 유사하지만 토폴로지는 부분적으로 상이함
1. L-아라비노즈 결합 단백질 유사 (13)
94. 세포질 결합 단백질 유사 II (1)
각각 3층(a/b/a)을 갖는 2개의 유사한 얽혀 있는 도메인으로 구성됨:
복제
5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 21354;
스트랜드 5는 나머지에 대해 역평행임
1. 세포질 결합 단백질 유사 II (2)
구조가 상과 I과 유사하지만 토폴로지는 부분적으로 상이함
1. 포스페이트 결합 단백질 유사 (20)
2. 트랜스페린 (8)
추가의 복제: 2개의 도메인 돌출부로 구성됨
95. 티올라제 유사 (1)
가성다이애드와 관련된 2개의 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
3 층: a/b/a; 5 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 32451;
스트랜드 1 및 5는 나머지에 대해 역평행임
1. 티올라제 유사 (2)
1. 티올라제 관련 (6)
2. 칼콘 신타제 (2)
96. Fe-단독 히드로게나제 (1)
2개의 얽힌 도메인으로 구성됨; 부분 복제를 포함함
1. Fe-단독 히드로게나제 (1)
1. Fe-단독 히드로게나제 (2)
97. 시티딘 데아미나제 (1)
각각 3 층(a/b/a)을 갖는 2개의 매우 유사한 도메인으로 구성됨; 복제
4 스트랜드의 혼합형 β시트, 순서 2134;
스트랜드 2는 나머지에 대하여 역평행임
1. 시티딘 데아미나제 (1)
1. 시티딘 데아미나제 (1)
[표 2]
하기 실시예에 의해 본 발명을 예시한다.
실시예 1
알파/베타 단백질 및 알로스테릭 조절 부위의 동정
또한, 본 발명은 LFA-1, 또는 I 도메인을 함유하는 그 단편이 아닌 분자로서, 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β도메인 구조를 포함하는 분자를 동정하는 방법을 제공한다. 상기 분자가 알로스테릭 효과기 분자와 접촉할 때, 알로스테릭 조절 부위(예컨대, I 도메인 알로스테릭 부위)는 상기 알로스테릭 효과기 분자와 상호작용하여, 제1 분자와 이의 결합 파트너 분자 간의 결합을 조절하는 상기 α/β구조의 리간드 결합 도메인 내의 정합을 촉진한다.
예를 들어, 공지된 알로스테릭 조절 부위를 갖는 단백질과 후보 단백질을 비교함으로써, 알로스테릭 조절 부위를 동정할 수 있다. 예를 들어, 예정된 3차원 구조와 유사한 단백질을 동정할 수 있는 검색 도구[예컨대, NCBI 벡터 정렬 검색 도구(또는 "VAST" 검색)]를 사용함으로써, 알로스테릭 조절 부위를 갖는 α/β단백질을 동정할 수 있다(그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Gibrat 등의 문헌[Curr. Opin. Struct. Biol. 6:377-385 (1996)]; 및 그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Madej 등의 문헌[Proteins 23:356-369 (1995)]을 참조하라). 상기 방법의 경우, 대비(camparison) 또는 질의(query) 단백질로서 LFA-1을 사용할 수 있는데, 이는 LFA-1이 I 도메인 알로스테릭 부위를 포함하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 마찬가지로, 알로스테릭 부위를 포함하는 것으로 공지된 다른 α/β단백질을 참조(reference) 단백질로 사용하여, I 도메인 알로스테릭 부위를 포함하는 다른 α/β단백질을 동정할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 7 이상의 VAST 점수 또는 0.005 이하의 P값을 갖는 단백질은 대조 단백질과 충분히 관련되어 추가의 조사를 보장하는 것으로 정의할 수 있다.
또한, 정합 상극성(conformational ambivalence)을 예측하는 알고리즘을 사용하여 알로스테릭 조절 부위를 동정할 수 있다(그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Young 등의 문헌[Protein Science 8:1752-1764 (1999)]; 및 그 내용 전부가 본 명세서 참고로 인용되는 Kirshenbaum 등의 문헌[Protein Science 8(9):1806-1815(1999)]를 참조하라). 상극성 구조 예측기(Ambivalent Structure Predictor("ASP")라 칭하는 이 알고리즘은 아미노산 서열 정보로부터 3차원 형태재배열의 영역을 예측한다. 상기 알고리즘은 2차 구조 예측 알고리즘, 즉 프로필 네트워크 프리딕션 하이델베르크(Profile Network Prediction Heidelberg("PHD")(그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Rost의 문헌[Meth. Enzymol. 266:525-539 (1996)]을 참조하라)로부터 환산된 확률(scaled probability)을 사용하여, 구조적으로 상극인 서열 요소(element)를 확인한다. α/β도메인 내에 평균 잔기 상극성 점수(mean residue ambivalence score)의 -1.75 표준 편차 미만의 z 점수를 보유하는 잔기는 본 발명에 따라 유용한 타입의 알로스테릭 조절 부위와 일치하는 것으로 이해된다.
예를 들어, 표 3은 인테그린 α/β 도메인 및 이와 밀접하게 관련된 도메인은 2가지 대표적인 도메인인 LFA-1 및 Mac-1 도메인에 비하여 대략 10 이상의 VAST 점수 및 대략 0.0009 이하의 P값을 보유한다는 것을 나타낸다. 또한, 표 3은 구조적으로 상극인 서열 요소(SASE)의 위치가 상기 도메인에 대하여 공지되거나 예측된 c-말단 강체(rigid body) 운동과 일치한다는 것을 나타낸다. 따라서, 이와 같은 타입의 상기 도메인 및 상기 도메인과 밀접하게 관련된 도메인은 전형적인 IDAS를 보유하는 것으로 예측된다. 더욱이, 표 3에 나타나 있는 계산에 의해 증명되듯이, 일부 Ras 상과 일원(superfamily member)(예컨대, RhoA) 및 효소(예컨대, ENR)도 또한 전형적인 IDAS를 보유하는 것으로 예측된다.
또한, VAST 분석에 의해 증명되듯이, 보다 관련성이 적은 일부 비(非)인테그린 α/β도메인은 전형적인 인테그린 IDAS와 구별되는 것처럼 보이는 부위에서 SASE를 보유한다. 상기 α/β도메인은 소분자(예컨대, 디아릴 화합물)로도 조절될수 있는 IDAS-유사 부위를 보유할 수 있다.
다수의 α/β도메인은 35% 미만의 아미노산 동일성을 공유한다. 따라서, 질의 서열을 도메인 서열의 데이타베이스와 대비하는 웹기반의(web-based) 간단한 모듈 구조의 연구 도구(simple modular architecture research tool; SMART)(그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Schultz 등의 문헌[Nuc. Acids Res., 28:231-234 (2000)]; 그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Copley 등의 문헌[Curr. Opin. Struct. Biol. 9:408-415 (1999)]; 그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Ponting 등의 문헌[Nuc. Acids Res. 27:229-232 (1999)]; 및 그 내용 전부가 본 명세서에 참고로 인용되는 Schultz 등의 문헌[PNAS USA 95:5857-5864 (1998)]을 참조하라)를 사용하여, 추가의 분기(divergent) 과 성분을 동정하였다. SMART는 대표적인 패밀리 성분의 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 사용한다. 수동으로 상기 정렬을 최적화하고, 하기 숨겨진 마르코프(Markov) 모델의 생성을 사용하여, 서열 데이타베이스를 검색하였다. 상기 정렬에 유의적으로 유사한 서열을 부가함으로써, 연이은 검색에 사용되는 상기 모델을 정제하였다. 따라서, 추가의 중요 α/β도메인을 동정하는 원천(source)으로서 SMART 데이타베이스를 사용하여, 알로스테릭 조절 부위의 존재에 대하여 분석할 수 있다.
[표 3]
α/β도메인 VAST 구조 인접물(neighbor) ASPSASE*위치(C-말단으로부터 유래한 잔기)
LFA-1 Mac-1
점수 P값 점수 P값
αL(LFA-1, 1Z00) 14.7 10e-11.7 27
αM(Mac-1, 1IDN) 13.2 10e-4.8 28
α1(1QC5) 13.8 10e-11.6 17.6 10e-15.9 23
α2(1DZ1A) 12.5 10e-9.0 17.2 10e-15.3 16
ENR(IDFIA) 12.2 0.0009 10.8 0.0001 11
Gα1(1GFI) 12.4 0.0016 70‡
Rac1(1MH1) 11.6 0.029 †
RhoA(1DPFA) 12.1 0.0045 23
cdc42(1AM4D) 11.6 0.253 20
H-Ras(1Q21) 10.4 0.0406 12.2 0.0027 †
Sir2(1ICIA) 8.0 0.0088 56‡
ftsZ(1FSZ) 11.7 0.0277 14.4 0.0048 92‡
HPPK(1DY3A) 37‡
Era(1EGA) 9.8 0.0474 13.3 0.001 81‡
SASE*: 구조적으로 상극인 서열 요소.
†: ASP 기본 설정값(default setting)에 의해 검출되지 않은 C-말단 SASE.
‡: SASE의 제2 부위는 IDAS-유사 부위를 나타낼 수 있다.
실시예 2
CD11b I 도메인 돌연변이체
A. CD11b I 도메인 내에서의 돌연변이의 생성
I 도메인 내에서의 돌연변이를 가진 CD11a 변이체를 사용하는 이전 결과(Huth 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97:5231-5236(2000)]을 참조하라)의 관점에서, 결합 파트너 ICAM-1 및 iC3b에 대한 증가된 친화성을 갖는 CD11b 변이체를 동정하는 의도로 CD11b에 돌연변이를 도입하였다.
QuickChange 부위 지향 돌연변이 유발 키트(Stratagene)을 사용하여 6개의 돌연변이를 생성시켰다. 상기 돌연변이체는 Asp156(D156A), Val254(V254A), Gln327(Q327A), Ile332(I332A), Phe333(F333A) 및 Glu333(E336A)의 Ala으로의 단일 변화를 포함하였다. 간단히 말해서, 주형으로서의 전장 CD11b와의 PCR에 사용되는 2가지 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드(센스 스트랜드에 대한 것 및 안티센스 스트랜드에 대한 것)를 합성하였다. 돌연변이체 D156A, V254A, Q327A 및 I332A에 대한 PCR 조건은 30초 동안 95 ℃에서의 1 사이클 수행 후에, 30초 동안 95 ℃, 1분 동안 50 ℃, 및 18분 동안 60 ℃에서의 16 사이클 수행하는 것을 포함하였다. 돌연변이체 F333A 및 E336A에 대한 PCR 조건은 16 사이클에서 최종 신장(elongation) 단계를 20분 동안 68 ℃에서 수행한다는 것을 제외하고는 동일하였다. PCR 완료 후, 메틸화되고 돌연변이화되지 않은 주형 DNA를 1시간 동안 37 ℃에서 DpnI로 분해하고, 돌연변이화된 CD11b DNA를 사용하여, 제조업체에서 제시한 프로토콜에 따라 Supercompetent XL1 Blue 세포(Stratagene)을 형질전환시켰다. 카르보마이신 내성 콜로니를 수집하여 액체 배양 내에서 성장시킨 후, 플라스미드 DNA를 분리하고, 삽입물의 서열을 결정하였다. 전장 돌연변이체를 보유하는 콜로니로부터, 유전자의 5' 부분을 함유하는 1.3 kb의 SacI/EcoRV 단편을 모 벡터 내에 다시 서브클로닝하였다. 상기 서브클론으로부터 유래한 삽입물의 서열을 결정하여, 접합부(junction)의 완결성(integrity) 및 돌연변이의 존재를 입증하였다.
D156A(센스): CATTGCCTTCTTGATTGCGGGCTCTGGTAGCATC(서열 번호 1)
V254A(센스): GCCTTTAAGATCCTAGCGGTCATCACGGATGGAG(서열 번호 2)
Q327A(센스): GAAGACCATTCAGAACGCGCTTCGGGAGAAGATC(서열 번호 3)
I332A(센스): CAGCTTCGGGAGAAGGCGTTTGCGATCGAGGG(서열 번호 4)
F333A(센스): CTTCGGGAGAAGATCGCGGCGATCGAGGGTAC(서열 번호 5)
E336A(센스): GAAGATCTTTGCGATCGCGGGTACTCAGACAGG( 서열 번호 6)
B. COS-7 형질감염
CD18/pDC1 및 야생형 CD11b 또는 CD11b의 돌연변이체 형태로 COS 세포를 동시 형질감염시켰다. 형질감염은 본질적으로 전술한 Huth 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97:5231-5236 (2000)]에 기재되어 있는 것과 같이 수행하였다.
C. FACS 분석
항-CD11b 모노클로날 항체 TMG6-5(Diamond 등의 문헌[J. Cell Biology 120:1031-1043 (1993)] 참조)를 사용하여 CD11b 발현을 확인하였다는 것을 제외하고는 전술한 Huth 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97:5231-5236 (2000)]에 기재되어 있는 것과 같이 FACS 분석을 수행하였다.
D. COS 형질감염된 세포 및 고정화된 ICAM-1 또는 iC3b를 사용한 부착성 분석
개량된 방법(Sadhu 등의 문헌{Cell Adhes. Commun. 2:429-4440 (1990)] 참조)을 사용하여 96-웰 이지 워시 플레이트(미국 뉴욕주 코닝에 소재하는 Corning Glass에서 제조함) 내에서 부착성 분석을 수행하였다. 글리코포린(Calbiochem)(10 ㎍/㎖), ICAM-1/Fc(5 ㎍/㎖) 및 iC3b(3 ㎍/㎖) 50 ㎕를 사용하거나; 또는 50 mM의탄산수소산염 완충액(pH 9.6) 중의 항-CD18 모노클로날 항체(TS1/18, 5㎍/㎖) 및 항-CD11b 모노클로날 항체(44AACB [ATCC], 5 ㎍/㎖), 또는 완충액만을 사용하여, 4 ℃에서 하룻밤동안도록 각 웰을 코팅하였다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 D-PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 D-PBS 중의 1% HSA(100 ㎕/웰)로 차단처리하였다. 웰들을 100 ㎕의 부착성 완충액(RPMI 및 5.0 %의 불활성화된 FBS를 함유함)으로 1회 헹구고, 각 웰에 100 ㎕의 부착성 완충액을 첨가하였다. 60 ㎍/㎖의 대조군 항체(IgG(5a)7.2, 60 ㎍/㎖), 차단 항체(44AACB, 60 ㎍/㎖) 또는 활성화 항체 240Q를 보유하거나 보유하지 않은 또 다른 100 ㎕의 부착성 완충액(Huth 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97:5231-5236 (2000)] 참조)을 각 웰에 첨가한 후, 부착성 완충액 중의 COS-7 형질감염체(100 ㎕의 0.75 ×106세포/㎖)를 각 웰에 첨가하였다. ICAM-1 결합의 경우에는 30분 동안, iC3b 결합의 경우에는 15분 동안 37 ℃에서 플레이트를 항온처리하였다. D-PBS 중의 14% 글루타르알데히드 50 ㎕/웰의 첨가에 의해 부착성 세포를 고정시키고, 실온에서 1.5시간 동안 항온처리를 계속하였다. 플레이트를 dH2O로 세척하고, 실온에서 5분 동안 10% 에탄올 중의 0.5% 크리스탈 바이올렛 100 ㎕/웰로 염색하고, dH2O(수차례 변화됨)로 수회 세척하였다. 세척 후, 70% 에탄올을 첨가하고, SPECTRmax 250 마이크로플레이트 분광 광도계 시스템(미국 캘리포니아주 써니베일에 소재하는 Molecular Devices에서 제조함)을 사용하여 570 nm 및 410 nm에서 흡광도를 측정함으로써 부착성 세포를 정량하였다. 하기 식을 사용하여 세포 결합의 백분율을 측정하였다:
세포 결합률(%) = [A570-A410(ICAM-1 또는 iC3b에 결합함)/A570-A410(CD18 + CD11b 모노클로날 항체에 결합함)] ×100
결과는 ICAM-1과 iC3b에 결합하는 야생형 CD11b가 각각 3.1% 및 26.4%라는 것을 나타내었다. 돌연변이체 V254A, Q327A 및 I332A는 ICAM-1에 대한 결합 백분율(각각 114.7%, 105.1% 및 123.1%) 및 iC3b에 대한 결합 백분율(각각 147.1%, 140.5% 및 205.2%)이 각각 유의적으로 더 높은 반면에; 돌연변이체 F332A 및 E336A는 ICAM-1에 대한 결합 백분율(각각 1.1%, 및 0.7%) 및 iC3b에 대한 결합 백분율(각각 4.9% 및 4.3%)이 모두 더 낮다는 것을 나타내었다. 따라서, 보다 높은 레벨의 ICAM-1 결합을 나타내는 돌연변이체는 증가된 레벨의 ICAM-1 결합의 결과로서 보다 높은 신호 대 잡음(signal-to-noise) 비율을 제공하는 면에서 ICAM-1에 대한 CD18/CD11b(Mac-1) 결합을 억제하는 화합물을 확인하는데 유용하다.
실시예 3
CD11b 작동물질의 동정
이전의 연구는 다양한 디아릴 화합물이 ICAM-1에 대한 LFA-1의 결합을 억제할 수 있음을 증명하였다. 상기 실시예 1에서의 이러한 관찰과 결과로부터, 아마도 CD11b의 알로스테릭 조절 부위와의 상호작용을 통해 디아릴 화합물이 천연 결합 파트너에 대한 CD11b의 결합에 영향을 줄 수 있는지를 결정하기 위한 실험들을 설계하였다.
A. 고정화된 ICAM-1에 대한 α M 을 발현하는 HL60의 부착 분석
테스트 화합물의 CD11b(αM) 결합 조절 능력을 평가하기 위해, HL60 세포 및 고정화된 ICAM-1을 사용하여 부착 분석을 수행하였다.
분석은, 각각의 웰이 (i) ICAM-1/Fc(5 ㎍/ml) 50 ㎕, (ii) 50 mM 중탄산염 완충액(pH 9.6) 중 항-CD18 모노클로날 항체(22F12C, 5 ㎍/ml) 및 항-알파 4 모노클로날 항체(A4.1, 5 ㎍/ml), 또는 (iii) 완충액만으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅되었다는 점을 제외하고는, 전술한 방법을 사용하여 96-웰 이지 워시 플레이트(뉴욕 코닝에 소재하는 코닝 글래스에서 제조함) 내에서 부착 완충액 중 HL60 세포(1 x 106세포수/ml) 100 ㎕를 사용하여 차단성 항-CD18 모노클로날 항체(TS1/22, 10 ㎕/ml)의 존재하에 분석을 수행하였다. 세포 결합률(%)은 하기 식을 사용하여 결정하였다.
이어서, 다음 식을 사용하여 데이타를 표준화하였다.
추가의 연구에서 약 30종의 화합물이 동정되었다. 전술한 HL-60 분석 또는 후술하는 피브리노겐을 사용한 호중구 결합 분석(실시예 15)에서 IC50값을 측정하였다.
B. 고정화 iC3b에 대한 JY/CD11b 세포의 부착 분석
간략하게, 96웰-플레이트의 각각의 웰을, 중탄산염 완충액(pH 9.6) 중에서글리코포린(10 ㎕/ml) 50 ㎕, iC3b(5 ㎍/ml)를 사용해서, 또는 항-CD18 모노클로날 항체(22F12C, 5 ㎍/ml)와 항-CD11b 모노클로날 항체(44AACB, 5 ㎍/ml)를 사용해서 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 플레이트는 D-PBS 중 인간 혈청 알부민을 사용하여 실온에서 1시간동안 차단처리하였다. 부착 완충액중 CD11b(JY/CD11b 세포)(1 x 106세포수/ml로 100 ㎕)로 형질감염시킨 JY 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분간 항온처리하였다. 플레이트를 고정하고, 실시예 1에 기재한 바와 같이 분석하였다. 하기 식을 사용하여 세포 결합의 비율(%)을 결정하였다.
다음 식을 사용하여 데이타를 표준화하였다.
스크린에서 억제를 나타내었던 45종 화합물에 대한 IC50값을 측정하였고, 이들 화합물 중 6종은 10 μM 이하의 IC50을 나타내었다. 이어서, 이들 45종 화합물 중 12종을, 피브리노겐에 대한 호중구 부착을 이용하는 부착 분석에 사용하였다(실시예 15에 기재되어 있음).
또, 이 스크린에 의해 iC3b에 대한 결합을 자극하는 능력을 가진 17종의 화합물을 동정하였다. 이들 17종의 화합물을 재적정한 결과로부터, 화합물 H, 화합물 I 및 화합물 C는 DMSO 처리한 대조군에 대해 관찰된 2배 수준으로 iC3b에 대한 CD11b/CD18 결합을 용량 의존적으로 자극할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
실시예 4
보체 단백질 C2 및 인자 B의 억제제 스크리닝
보체 단백질 C2 및 인자 B는 단백질의 세린 프로테아제 활성 및 그 각각의 컨버타제를 조절하는 것으로 여겨지는 A 도메인 영역을 포함하는 것으로 나타났다. 이들 단백질의 A 도메인은 또한 하나 이상의 조절 도메인을 포함하며 리간드 결합 부위로서 작용하는 것으로 여겨진다. C2는 전형적인 보체 경로에서 보체 단백질 C4b와 결합하여 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제 일부를 형성하고, 인자 B는 C3b와 결합하여 다른 보체 경로 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제의 일부를 형성한다. C2 또는 인자 B 결합에 대한 조절자가 동정된다면, C3 및/또는 C5 컨버타제 활성을 조절할 수 있는 메커니즘을 제공할 수 있을 것이다.
전형적인 경로 보체 단백질 C2 및 다른 경로 보체 단백질 인자 B의 억제제에 대한 스크린은 후술하는 바와 같은 미량역가 플레이트 포맷에서 표준 용혈성 CH50 및 AH50 분석의 변법을 사용하는 1차 스크리닝을 포함한다[참조: Current Protocols in Immunology, Chapter 13, Unit 13.1, John Wiley & Sons, Inc., (2000)]. CH50 분석은 C2 및 전형적인 경로의 활성에 의존하는 데 반해, AH50 분석은 인자 B 및 다른 경로의 활성에 의존하였다.
CH50 분석은 항-양 RBC 혈청에 의해 옵소닌화된 양의 적혈구 세포(RBC)의 보체 의존성 용해를 분석하는 것으로 이루어지며, 이는 Mg++및 Ca++모두에 의존적이었다. CH50은 37℃에서 1시간내에 옵소닌화된 양 RBC의 50%를 용해시키는 데 필요한 인간 혈청의 농도이다. C2 억제제에 대한 1차 스크린은 CH50 수준의 일정한 혈청 농도의 사용을 포함하고, 분석은 테스트 화합물 10 μM 의 존재 및 부재하에서 수행한다. 이러한 1차 분석을 억제하는 화합물을 적정하고, 2차 용혈성 분석에서 특이성을 재시험하였다. 2차 분석에서는, 각각의 정제된 보체 단백질을 테스트 화합물의 존재 또는 부재하에서 순차적으로 첨가하여 어떤 성분이 억제되는가를 결정한다.
AH50 분석은 토끼 적혈구 세포의 직접 보체 의존적 용해 분석으로 이루어지며, 이는 Ca++가 아닌 Mg++에 대하여 의존적이므로, EGTA의 존재하에서 수행한다. CH50과 유사하게, AH50은 37℃에서 1시간내에 토끼 RBC의 50%를 용해시키는 데 필요한 인간 혈청 농도이다. 인자 B 억제제에 대한 1차 스크린은 AH50 수준의 혈청 농도를 사용하는 것을 포함하고, 이 분석은 10 μM 테스트 화합물의 존재 또는 부재하에서 수행된다. 이 1차 분석을 억제하는 화합물을 적정하고, 2차 용혈성 분석에서 특이성을 재시험한다. 이 2차 분석에서는, 각각의 개별적인 정제된 보체 단백질을 화합물의 존재 또는 부재하에 순차적으로 첨가하여 어떤 성분이 억제되는가를 결정한다.
콜로라도 세럼 컴퍼니(콜로라도 덴버에 소재함)에서 알세버스(Alsevers) 용액 중 양의 전혈 및 항-양 헤몰리신을 입수하였다. 적혈구-항체 복합체(EA)는, 항-양 헤몰리신의 최적 농도(적정에 의해 1:800 희석액인 것으로 측정됨)를 사용하여 제조하였다. 정상 인간 혈청(NHS)은 10명의 무작위적인 건강한 인간 공여자로부터신선한 혈청을 수집하고, 이것을 풀링(pooling)하고, 이 풀링한 혈청을 분할하고, 이것을 액체 질소중에서 급속 동결시키고, 이것을 -70℃에서 저장함으로써 제조하였다. 새로운 분취량은 각각의 사용 직전에 해동시켰다.
콘스타 96-웰 둥근 바닥 또는 V자 바닥 미량역가 플레이트 내에서 표준 분석을 확립하였다. 모든 샘플을 이중 분석하였고, 평균을 내었다. 첫째, NHS를 적정하여 EA(CH50 희석액)의 용해에 있어서 그 선형 활성의 중점을 측정하였다. Mg++및 Ca++를 함유한 젤라틴 베로날 완충액(0.142 M NaCl, 4.9 mM 5,5'-디에틸바르비투르산 나트륨 및 1.0 g/l 젤라틴, HCl로 pH를 7.35로 조정한 다음, CaCl2및 MgCl2를 첨가하여 최종 농도를 각각 60 μM 및 400 μM 로 만듦), 또는 dH2O(총 용해를 측정하기 위하여 사용함) 중 새로이 해동시킨 NHS의 일련의 2배 희석액을 2개의 웰에 배치하고(80 ㎕/웰), 37℃로 5분간 가온하였다. GVB++로 2회 세척하고 2 x 108복합체수/ml로 재현탁시킨 EA를 첨가하고(80 ㎕/웰), 이 플레이트를 37℃에서 60분간 항온처리하였다. 0.15 M NaCl 80 ㎕/웰을 첨가하고, 이 플레이트를 2500 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상청액 100 ㎕/웰을 분석 플레이트로부터 이뮤론4 96-웰 평평한 바닥 ELISA 플레이트로 옮기고, 420 nm에서의 흡광도를 측정하였다. NHS를 함유하는 모든 웰에 대한 판독치로부터 NHS를 함유하지 않는 웰에서 백그라운드 흡광도 판독치를 빼서 얻어진 특이적인 흡광도를, dH2O를 함유하는 웰로부터 얻어진 비율(총 용해 %)로서 표시하였다.
37℃에서 60분내에 50% 총 용해를 나타내는 데 필요한 NHS 희석율(CH50)은 1:150으로 측정되었다. 이 희석액은 NHS 용해 활성의 선형 범위의 중점을 구성하였고, 보체 경로의 억제제에 대하여 테스트 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용되었다. 이 테스트 화합물을 먼저 GVB++/5% DMSO에 40 μM 로 희석하였고, 코스타 96-웰 둥근 바닥 또는 V-자 바닥 플레이트내로 40 μM /웰로 2개의 웰에 분할하였다. GVB++(백그라운드), dH2O(총 용해), DMSO 단독, 항-C2 다클론 항혈청(40 ㎍/ml; 칼바이오켐), 정상 염소 IgG(40 ㎍/ml; 시그마) 및 EGTA(4 mM)를 함유하는 대조군 웰을 또한 포함시켰다. 플레이트를 37℃에서 5분간 항온처리하였다. GVB++에 1:75로 희석한 NHS 40 ㎕/웰을 첨가하였고(이것은 화합물을 함유하는 1:150 최종 희석액을 생성하였음), 단 백그라운드 또는 총 용해 웰에는 GVB++또는 dH2O를 각각 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 10분간 항온처리하였다. EA를 2종 세척하고, GVB++중에 2 x 108/ml로 재현탁하여, 각각의 플레이트에 80 ㎕/웰로 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 60-70분간 항온처리한 후, 0.15 M NaCl 80 ㎕/웰을 첨가하고, 이 플레이트를 2500 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 각각의 웰로부터 얻은 상청액 100 ㎕를 분석 플레이트로부터 이뮤론4 96-웰 평평한 바닥 ELISA 플레이트 상의 각각의 웰로 옮기고, 420 nm에서의 흡광도를 분석하였다. 각각의 웰의 흡광도로부터 NHS를 함유하지 않는 웰에서의 백그라운드의 흡광도 판독치를 감산하여 얻어진 특이적인 흡광도를, DMSO 만을 함유하는 웰로부터 얻어진 것의 비율(% DMSO 용해)로서 표시하였다. DMSO 용해를 35% 이상만큼 억제한 모든 화합물을 다시 테스트하고, 동일한 분석법으로 적정하였다. 39종의 화합물이 20 μM 이하의 IC50값을 가진 것으로 동정되었다. 2종의 가장 강력한 화합물은 5 μM 이하의 IC50값을 가졌으며, 이들은 20 μM 이상의 농도에서의 표준 세포계 부착 분석에서 (i) LFA-1에 의해 매개되는 ICAM-1에의 부착, (ii) Mac-1에 의해 매개되는 ICAM-1에의 부착, (iii) a2β1에 의해 매개되는 콜라겐에의 부착, (iv) a4β7에 의해 매개되는 MAdCAM-1에의 부착, 또는 (v) gp1b의 vWf 결합을 유의성있는 정도로 억제하지 않았기 때문에, 보체 억제에 대하여 선택적임을 알 수 있었다.
전형적인 보체 경로(CCP) 스크린에서 혈청 활성의 약 30%는 C3 및 C5 컨버타제를 포함하는 다른 보체 경로 (ACP) 인자 B에 의한 증폭에 기인한다. 그러므로, 이 분석은 전형적인 보체 경로 컨버타제, 렉틴 보체 경로(LCP)(여기서, C3도 중간체 성분임), 및 다른 보체 경로의 억제제 중 어느 하나를 분리할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 또한, C2 및 인자 B 사이에 고도의 1차 구조 상동성이 있는 경우에, 모든 3가지 경로에서 컨버타제 모두를 억제하는 화합물이 분리될 가능성이 있다.
원래 스크린의 특성이 주어지는 경우, 억제는 보체 경로의 어떤 단계에서도 일어날 수 있었다. 테스트 화합물이 보체 활성화의 어느 단계에서 활성을 억제하는지를 결정하기 위해, 정제된 보체 단백질를 입수하고(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 어드밴스드 리써취 테크놀로지즈에서 제조함), 보체 활성화를 단계적으로 재구성하였다. 각각의 단계에서, 선도 화합물 또는 DMSO 만을 첨가하고, 최종 용혈 활성을 상기와 같이 측정하였다. 처음에는, 보체 활성화의 4가지 임의의 다른 단계에서 이 선도 화합물의 억제능을 테스트하였다: 1) EA의 표면상에서 응집된 항체에 대한 C1의 결합; 2) C1에 대한 C4의 결합 및 C1에 의한 C4 분열; 3) C4b에 대한 C2의 결합, C1-매개 분열에 의한 C2의 활성화 및 C4bC2a-매개 C3 분열(즉, C3 컨버타제의 형성과 활성); 및 4) C5 컨버타제의 형성과 활성 및 이어지는 보체 단백질 C6 내지 C9의 침착. 이들 단백질은 막 공격 복합체(MAC)를 형성하여 세포 용해를 일으킨다.
분석에서는, 1 x 107EA/웰을 코스타 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 2개의 웰에서 분석하였다. 단계 1(전술한 바와 같음)을 테스트하기 위해, 세포를 C1 단백질 7.5 ㎍/ml를 함유하는 GVB++중에 재현탁시키고, 30℃에서 15분간 항온처리하였다. 단계 2를 테스트하기 위해, 세포를 C4 단백질 7.5 ㎍/ml를 함유하는 GVB++중에 재현탁시키고, 30℃에서 15분간 항온처리하였다. 단계 3을 테스트하기 위해, 세포를 C2 단백질 0.4 ㎍/ml 및 C3 단백질 25 ㎍/ml를 함유하는 GVB++중에 재현탁시키고, 30℃에서 30분간 항온처리하였다. 단계 4를 테스트하기 위해, 세포를 4 mM EGTA 함유 GVB++및 NHS의 1:50 희석액 중에 재현탁시키고, 37℃에서 60분간 항온처리하였다. 각각의 단계에서, 선도 화합물을 적정하였다. 여기서, 화합물과 DMSO, 염소 항-C2 pIgG, 및 염소 정상 pIgG와의 희석액에 있어서 억제를 테스트하였다. 각 쌍의 웰은 오직 하나의 단계에서의 억제제를 보유하였다. 각 단계의 항온처리 후, 플레이트를 2400 RPM으로 3분간 원심분리하고, 세포 펠릿을 100 ㎕/웰 GVB++로 2종 세척하여 억제제와 미결합 단백질을 제거하였다. 단계 4에서는 혈청으로부터 C1의 새로운 첨가를 차단하기 위해 EGTA를 사용하였고, 이로써 최종 단계가 이전의 C3b 침착에 의존하도록 만들었다. 이 성분 분석에서, 항-C2 pIgG(정상 pIgG는 아님)는 예상한 바와 같이 단계 3에서 보체 활성화를 차단하였다.
선도 화합물은 용량 의존적인 방식으로 단계 4를 억제하였지만, 단계 1, 2 또는 3에 대해서는 그렇치 아니하였다. 그 결과는, 이 화합물이 CCP/LCP C3 컨버타제의 형성 또는 활성을 억제하지는 않지만, C5 컨버타제 또는 이후 MAC(보체 시스템의 최종 성분)의 형성을 억제한다는 것을 나타내었다.
선도 화합물이 C5 컨버타제 활성 또는 이후 MAC 형성을 억제하였는가를 결정하기 위해, 단순화된 성분 분석을 수행하였다. C2가 결실된 NHS를 입수하였다(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 어드밴스드 리써취 테크놀로지즈에서 제조함). EA를 GVB++로 2종 세척하고, GVB++중에 2 x 109세포수/ml로 재현탁시켰다. C2가 결실된 NHS의 1:50 희석액을 함유하는 동용적의 GVB++을 첨가하고, 세포를 30℃에서 7.5분간 항온처리하여 C1을 침착 및 활성화시킨 후, C4를 분열시켰다. 세포 현탁액을 GVB++로 20배 희석시켜 반응을 중단시키고, 2400 RPM에서 3분간 원심분리하였다. 이 세포 펠릿을 GVB++로 3종 세척하고, GVB++중에서 2 x 108세포수/ml로 재현탁시켰다. 이 처리된 EA 50 ㎕/웰을, 1 ㎍/ml C2, 50 ㎍/ml C3 및 1 ㎍/ml C5를 함유하는 GVB++50 ㎕/웰과 함께, 항-C2(80 ㎍/ml) 정상 염소 IgG(80 ㎍/ml)의 존재 또는 부재하에, 코스타 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 2개의 웰에 첨가하였다. 선도 화합물(80 μM ) 및 DMSO를 첨가하고, 플레이트를 30℃에서 20분간 항온처리하였다: GVB++200 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 2400 RPM으로 3분간 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 펠릿을 200 ㎕/웰 GVB++로 1종 세척하였다. 세포 펠릿을 100 ㎕/웰 GVB 중에서 재현탁시키고, 40 mM EDTA 및 1:50 NHS를 함유하는 100 ㎕/웰 GVB를 첨가한 후, 이 플레이트를 37℃에서 60분간 항온처리하였다. 플레이트를 다시 원심분리하고, 100 ㎕/웰을 이뮤론4 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겨, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
항-C2 pIgG 및 선도 화합물 모두는 용혈을 특이적으로 억제하였는데, 이는 화합물이 CCP/LCP C5 컨버타제 활성을 직접 억제함을 의미하는 것이었다. 이 결과는, 테스트 화합물은 C2 또는 인자 B와 결합하고 세린 프로테아제 도메인이 C5 기질에 접근하는 데 필수적인 구조적 변화를 억제한다는 보체 억제의 가능성있는 메커니즘과 일치하는 것이었다. 인자 B 세린 프로테아제 도메인의 결정 구조 데이타 및 A 도메인과의 상호작용 모델링은 이 가설과 일치하는 것이었다[Hua Jing, 등, EMBO J. 19:164-173 (2000)].
보체 단백질 C2 및 인자 B에 대한 상위 5종의 억제제를 표 4에서 제시한다.
[표 4]
실시예 5
알파 E, E-카드헤린 및 MAdCAM-1에 대한 cDNA의 분리
다른 α/β단백질의 결합 활성을 조절할 수 있는가의 여부를 평가하기 위해, 알파 E, E-카드헤린 및 MAdCAM-1를 암호화하는 DNA를 다음과 같이 제조하였다.
A. 알파 E
1. 인간 알파-E cDNA의 분리
정상적인 인간의 장 cDNA 라이브러리(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래보러토리즈 인크에서 제조함)로부터, 프로브로서 알파 E I 도메인 cDNA를 사용하여 인간 알파-E를 암호화하는 DNA를 분리하였다. 주형으로서 인간 대장 cDNA 라이브러리 및 알파 E I 도메인의 5' 및 3' 말단을 포함하는 프라이머를 사용해서, 알파 E 1 도메인 프로브를 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 클로닝을 촉진하기 위해,BamHI 및XhoI 제한 부위(서열에서 밑줄 부분)를 5'(서열 번호 7) 및 3'(서열 번호 8) 프라이머내에 설계하였다.
ATTGGA TCCGCT GGC ACC GAG ATT GCC ATC서열 번호 7
AAT TTC TC GAGGTC TCC AAC CGT GCC TTC C서열 번호 8
607 bp I 도메인 단편을 증폭하고,BamHI 및XhoI로 분해하고, 플라스미드 pBluescript(등록상표) SK(캘리포니아 라 욜라에 소재하는 스트라타젠에서 제조함)내로 삽입하였다. 이 플라스미드를 박테리아내로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA는 공지의 방법에 따라 제조하였으며,BamHI/XhoI 삽입체를 정제하였다. 알파 E I 도메인을 암호화하는 단편을, 하이브리드화 프로브로서 사용하기 위한 무작위 프라임처리된 DNA 표지 키트(인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 로슈 다이아그노스틱스 코포레이션에서 제조함)를 사용해서32P-dCTP 및32P-dTPP로 방사능표지하였다.
전장 알파 E를 암호화하는 DNA를 다음과 같이 동정하였다. 파지 람다 GT11(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래보러토리즈에서 제조함)내 인간 장 cDNA 라이브러리를 평판배양하고, 표준 방법을 사용하여 I 도메인 프로브와 하이브리드화시켰다. 2종의 스크리닝으로부터, 6종의 파지 클론을 분리하였다. cDNA 삽입체를EcoRI 분해에 의해 파지로부터 분리하고, pBluescript(등록상표) SK(캘리포니아 라 욜라에 소재하는 스트라타젠에서 제조함)에로 서브클로닝하고, 서열결정하였다. 3개의 다른 클론[5' 말단을 포함하는 클론 A (3), cDNA의 중반부 서열을 포함한 클론 B (22), 및 알파 E cDNA의 3' 말단을 포함하는 클론 C (22)]로부터 완전한 3.4 kb 서열을 재구성하였다. 서열 분석 결과, 공지의 뉴클레오티드 서열과 비교할 때, 클론 A (3)이 2개의 시티딘 삽입부와 357 및 464 위치에서 각각 구아니딘의 또다른 삽입부를 보유한다는 것이 나타났다. 이들 삽입부는 오픈 리딩 프레임에서 75 염기 프레임쉬프트를 일으키는데, 이로써 이전에 보고된 서열에서는 발견된 바 없었던 다음과 같은 25개의 추가 아미노산 잔기가 첨가되게 되었다.
PKGRHRGVTVVRSHHGVLICIQVLVRR서열 번호 9
이 25개의 아미노산 삽입부의 하류에 존재하는 서열은 분자의 나머지에 대한 공지의 알파 E 서열과 동일하였다.
알파 E cDNA를 pcDNA3(등록상표)(캘리포니아 칼스바드에 소재하는 인비트로젠 코포레이션에서 제조함)내로 서브클로닝하기 위해, 다음과 같은 5' 프라이머 Eo26-H3(서열 번호 10) 및 3' 프라이머 Eo-24(서열 번호 11)를 사용한 PCR 증폭에 의해 5' 말단에HindIII 부위를 생성시켰다.
GAG GGG AAG CTT AGT GGG CC서열 번호 10
GAA GTT GGC CTG AGC CTG G서열 번호 11
PCR 생성물을HindIII 및NsiI로 분해한 후, 벡터의 대응하는 부위에 연결시켰다.
발현 벡터 pMHneo[참조: Hahn 등, Gene 127:267-268 (1993)] 및 pcDNA3(등록상표)/aE를 박테리아 균주 NEB316, XbaI 제한 부위를 메틸화시키지 않는 dam 균주, 및 표준 방법에 따라 분리한 플라스미드 DNA내로 형질전환시켰다. pMHneo 및 pcDNA3(등록상표)/aE 양자를HindIII 및XbaI로 분해하고, 아가로즈 겔 전기영동을 사용하여 pcDNA3(등록상표)/aE로부터 3.4 kb 알파 E cDNA 단편을 분리하였다. 이 단편을 겔로부터 잘라내어, 정제하고,HindIII/XbaI로 분해한 벡터 pMHneo에 연결시켰다. 연결 혼합물 분취량을 사용하여 XL-1 블루 박테리아(캘리포니아 라 욜라에 소재하는 스트라타젠에서 제조함)를 제조자의 프로토콜에 따라 형질전환시키고, 암피실린을 함유하는 LBM 아가 플레이트 상에서 성장시켜 pMHneo를 포함하는 박테리아 콜로니를 선택하였다. 박테리아 콜로니를 100 ㎍/ml 암피실린 함유 LBM 배지내에서 하룻밤동안 성장시키고, 위저드 플러스 미니프렙 키트(위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션에서 제조함)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 이 플라스미드 DNA는 진단 제한 분해를 특징으로 하였으며, 알파 E cDNA를 함유하는 플라스미드(pMHneo/aE라 부름)를 사용하여 후술하는 바와 같이 JY 세포주를 안정하게 형질감염시켰다.
B. E-카드헤린
1. E-카드헤린 cDNA의 분리
다음의 E-cad 5'#1(서열 번호 12) 및 E-cad 3'#1(서열 번호 13) 프라이머를 사용하여 마라톤-레디(상표명) 인간 대장 cDNA 라이브러리(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래보러토리즈에서 제조함)를 PCR 증폭시켜, 인간 E-카드헤린에 대한 cDNA를 분리하였다.
5'-CTGCCTCGCTCGGGCTCCCCGGCCA-3'서열 번호 12
5'-CTGCACATGGTCTGGGCCGCCTCTCTC-3'서열 번호 13
라이브러리 cDNA 5 ㎕, 어드밴티지(상표명)-GC cDNA PCR 키트(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래버러토리즈에서 제조함)로부터의 5X PCR 완충액 10 ㎕, 50X dNTP 믹스 1 ㎕, 10 μM 프라이머 E-cad 5'#1 1 ㎕, 10 μM 프라이머 E-cad 3'#1 1 ㎕, 어드밴티지(상표명) KlenTaq 폴리머라제 믹스 1 ㎕, 및 H2O 31 ㎕를 함유하는 반응 혼합물 중에서 퍼킨 엘머 세투스(캘리포니아 포스터 씨티에 소재하는 PE 어플라이드 바이오시스템즈에서 제조함) DNA 열 사이클러에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 증폭 조건은 94℃에서 1분간 최초 항온처리한 후, 94℃에서 30초간 그리고 72℃에서 4분간 5사이클; 94℃에서 30초간 그리고 70℃에서 4분간 5사이클; 94℃에서 30초간 그리고 68℃에서 4분간 25사이클; 그리고 마지막으로 72℃에서 5분간 항온처리하는 것을 포함하였다. PCR 생성물의 대략적인 크기를 측정하기 위해 아가로즈 겔 전기영동을 이용해서 반응의 분취량을 분리하고, 예상한 바와 같은 2.7 kb 이하의 단일 밴드를 검출하였다. 2.7 kb PCR 생성물을, TA 클로닝 키트(캘리포니아 칼스바드에 소재하는 인비트로젠 코포레이션에서 제조함)를 사용해서 제조자의 프로토콜에 따라 플라스미드 pCR(등록상표)2.1내에 연결시켰다. 이. 콜리 균주 INVaF'(캘리포니아 칼스바드에 소재하는 인비트로젠 코포레이션에서 제조함)는 제조자의 권장 사항에 따라 연결 반응 분취량으로 형질전환시키고, 단일 박테리아 콜로니를 분리하고, 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LBM 배지에서 하룻밤동안 성장시켰다. 위저드 플러스 미니프렙 키트(위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션에서 제조함)를 사용해서 이들 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다.
2. E-카드헤린/Ig 융합 단백질을 암호화하는 DNA의 생성
E-카드헤린의 세포외 영역은 각각 대략 110개의 아미노산으로 된 5개의 탠덤 반복부위(도메인)로 이루어진다. E-카드헤린-인간/인간 IgG1 융합 단백질을 발현하기 위해, 프라이머 Ecad5'Kozak(서열 번호 14) 및 Ecad3'(Xho)(서열 번호 15)를 사용해서 E-카드헤린 cDNA(전술한 바와 같은 pCR(등록상표)2.1/E-카드헤린 #3)를 PCR 증폭시킴으로써 E-카드헤린 도메인 1 내지 5를 함유하는 DNA 단편을 생성하였다. 5' 프라이머 Ecad5'Kozak을 사용하여 5'HindIII 부위를 첨가하여, 이후 발현 벡터 pDEF2내로 5-도메인 단편의 서브클로닝을 촉진하고(미국 특허 제5,888,809호 참조), 최초 E-카드헤린 cDNA 클론에 결핍된 전사 개시 코돈의 상류 Kozak 서열을재구성하였다. 3' 프라이머 Ecad3'(Xho)는 E-카드헤린의 도메인 1 내지 5를 포함하는 단편의 신규 3' 말단을 생성하였고, 단편의 3' 말단에XhoI 제한 부위를 첨가하여 이후 pDEF2내로 5-도메인 단편의 서브클로닝을 촉진하였다.
5'-GCGTTAAAGCTTCACAGCTCATCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCA-3'서열 번호 14
5'-AGGCGCTCGAGAATCCCCAGAATGGCAGGAATT-3'서열 번호 15
pCR2.1/E-cad#3내에 함유된 E-카드헤린 cDNA 단편을, pCR2.1/E-cad#3 0.5 ㎕, 5X PCR 반응 완충액 10 ㎕, 10 μM 프라이머 Ecad5'Kozak 1 ㎕, 10 μM 프라이머 E-cad 3'(Xho) 1 ㎕, 어드밴티지(상표명) KlenTaq 폴리머라제 믹스 1 ㎕, 및 H2O 35.5 ㎕를 함유하는 반응에서 PCR 증폭시켰다. 증폭 조건은 94℃에서 1분간 최초 항온처리; 94℃에서 30초간 그리고 72℃에서 4분간 5사이클; 94℃에서 30초간 그리고 70℃에서 4분간 5사이클; 94℃에서 30초간 그리고 68℃에서 4분간 25사이클; 그리고 마지막으로 72℃에서 5분간 항온처리하는 것을 포함하였다. PCR 반응의 분취량을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하였고, 예상한 바와 같이 2.1 kb의 단일 밴드가 관찰되었다. 위저드 플러스 미니프렙 키트(위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션에서 제조함)를 사용해서 이들 단편을 정제하였고, 표준 조건하에서XhoI 및HindIII로 분해하였다. 얻어진 단편을 5'-HindIII-Kozak-E-카드헤린-XhoI-3'라고 불렀다.
플라스미드 pDC1/ICAM3.IgG1을XbaI 및SalI로 분해하고, 5' 말단SalI 부위 및 3' 말단XbaI 부위를 가진 908 bp의 단편(5'-SalI-IgG1-XbaI-3'라고 부름)을 저융점 아가로즈 겔(메인 록랜드에 소재하는 FMC 바이오프로덕츠에서 제조함)로부터 정제하였다. 이 단편은 인간 IgG1의 CH2-CH3 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. 발현 벡터 pDEF2를HindIII 및XbaI를 가진 다중 클로닝 부위에서 선형화하여, 5'-SalI-IgG1-XbaI-3' 단편, 선형화된 pDEF2, 및 5'-HindIII-Kozak-E-카드헤린-XhoI-3' 단편을 포함하는 쓰리-웨이 연결 반응을 수행하였다. 이 반응에서, 5'-HindIII-Kozak-E-카드헤린-XhoI-3'에서 3'XhoI 부위는 5'-SalI-IgG1-XbaI-3'에 인-프레임으로 결합되고;XhoI 및SalI 둘다는 함께 연결될 수는 있으나XhoI 또는SalI 어느 하나에 의해 다시 분해될 수 없는 적합성 5' 돌출부를 가진다. 연결 혼합물 분취량을 사용하여 박테리아 균주 XL-1 블루(캘리포니아 라 욜라에 소재하는 스트라타젠에서 제조함)를 형질전환시켰다. 각각의 박테리아 콜로니를 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LBM내에서 하룻밤동안 성장시키고, 위저드 플러스 미니프렙 키트(위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션에서 제조함)를 사용해서 플라스미드 DNA를 분리하였다.HindIII 및XbaI를 사용해서 pDEF2/E-cadIgG1 플라스미드 DNA를 분해하고, 분해 생성물을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 2.1 kb 단편을 함유하는 클론을 서열결정하여 E-카드헤린-IgG1 키메라가 E-카드헤린/IgG1 접합부를 가로지르는 오픈 리딩 프레임을 보유하고 있음을 확인하였다.
pDEF2/E-cadIgG1 클론 #3은 E-카드헤린/IgG1 접합부를 가로지르는 연속 오픈 리딩 프레임을 보유하는 것으로 밝혀졌으며, 후술하는 CHO 세포 발현 연구에서 사용되었다. E-카드헤린/IgG1 융합의 오픈 리딩 프레임은 완전히 서열결정되지 않았는데, 그 이유는 이 키메라에 기여하는 DNA 단편이 이미 서열결정되어 PCR 증폭되지 않았기 때문이다.
C. MAdCAM-1-1
1. 인간 MAdCAM-1-1의 부분 cDNA의 분리
MAdCAM-1의 부분 cDNA를 함유하는 단편을 Advantage(상표명)-GC cDNA PCR Kit(미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 CLONTECH Laboratories, Inc.에서 제조함)를 사용하여 Marathon-Ready(상표명) 인체 비장 cDNA 라이브러리를 PCR 증폭시켜서 분리하였다. Marathon(상표명) 인체 비장 cDNA 5 ㎕, 10 μM 프라이머 MAdCAM-1 5'#1(서열 번호 16) 1 ㎕, 10 μM 프라이머 MAdCAM-1 3'#5(서열 번호 17) 1 ㎕, 5.0 M GC-Melt(상표명) 10 ㎕, 50X dNTP 믹스 1 ㎕, Advantage(상표명) Klen Taq 폴리머라제 믹스 1 ㎕, 5X 반응 완충액 10 ㎕, 및 H2O 21 ㎕를 함유하는 반응물 중에서 Perkin Elmer Cetus(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 PE Applied Biosystems에서 제조함) DNA 열 사이클러를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다.
5'-ATGGATTTCGGACTGGCCCTCCTGCT-3'서열 번호 16
5'-CTCCAAGCCAGGCAGCCTCATCGT-3'서열 번호 17
증폭 조건은 94℃에서 1분간의 초기 항온처리; 94℃에서 30초간 및 72℃에서 3분간의 처리 5 사이클; 94℃에서 30초간 및 70℃에서 3분간의 처리 5 사이클; 94℃에서 30초간 및 68℃에서 3분간의 처리 25 사이클; 그리고 68℃에서 5분간의 최종 항온처리로 구성되었다. 반응물 일정 분획을 아가로즈 겔 전기영동으로 분해하여 640 bp의 단일 단편을 검출하였다. 단편을 pCR(등록상표)2.1로 서브클로닝하고 TA Cloning(등록상표) Kit(미국 캘리포니아 칼스바드에 소재하는 Invitrogen Corp.에서 제조함)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 박테리아 중에서 증폭시켰다. 암피실린 100 ㎍/㎖를 함유하는 LBM 중에서 하루밤동안 단일 박테리아 콜로니를 성장시켰다. Wizard Plus Miniprep Kit(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 Promega Corp.에서 제조함)를 사용하여 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 서브클로닝된 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 분석을 이용하여 결정하였다. 이 MAdCAM-1의 부분 cDNA는 개시 코돈에 의해 시작하여 도메인 2의 잔기 640의 3' 말단에서 종결한다. 이 부분 MAdCAM-1 cDNA의 서열은 이미 보고된 것[참조: Shyjan 등, J. Immunol. 156:2851-2857 (1996)]과 동일하다.
2. MAdCAM-1 도메인 1 및 2를 암호화하는 추가의 PCR 증폭 DNA
분비된 면역글로불린 융합 단백질로서 MAdCAM-1의 도메인 1 및 2를 발현시키기 위해서, 하기 (i) 내지 (iv)가 필수적이었다: (i) 유효한 단백질 번역이 가능하도록 개시 코돈 상류의 Kozak 서열을 복원하고, (ii) 5'HindIII 부위를 첨가하여 단편의 pDEF2로의 서브클로닝을 촉진시키며, (iii) 기존의 부분 MAdCAM-1 cDNA의 오픈 리딩 프레임을 연장시켜 완전 제2 도메인을 암호화하는 데 필요한 추가의 아미노산 잔기를 포위하게 하고, (iv) 단편의 3' 말단에SalI 부위를 도입하여 pDEF2로의 서브클로닝을 촉진한다. 이러한 변경을 하기와 같은 Mad5'Kozak(서열 번호 18) 및 Mad 3'#6 Sal(서열 번호 19)를 사용하는 PCR 증폭에 의해 전술한 MAdCAM-1 단편에 도입한다.
5'-GCGTTAAAGCTTCACAGCTCATCACCATGGATTTCGGACTGGCCCTCCT-3' 서열 번호 18
GCTAGTCGACGGGGATGGCCTGGCGGTGGCTGAGCTCCAAGCAGGCAGCCTCATCGT 서열 번호 19
PCR 반응물은 pCR(등록상표)2.1/MAd#4-1 주형 DNA 0.5 ㎕, 5X PCR 완충액 10 ㎕, 5.0 M GC Melt(상표명) 10 ㎕, 50X dNTP 믹스 1 ㎕, 10 μM 1 ㎕, 10 μM 1 ㎕, 50X Advantage(상표명) Klen Taq 폴리머라제 믹스 1 ㎕, 및 H2O 25.5 ㎕를 포함하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 1분간의 처리; 94℃에서 30초간 및 72℃에서 2분간의 처리 5 사이클; 94℃에서 30초간 및 70℃에서 2분간의 처리 5 사이클; 94℃에서 30초간 및 68℃에서 2분간의 처리 20 사이클; 및 68℃에서 5분간의 처리를 포함한다. 반응물 일정 분획을 아가로즈 겔 전기영동으로 분해하여, 기대했던대로 ∼0.7 kb의 단일 단편을 검출하였다. 위자드 PCR 정제 키트(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 Promega Corp.에서 제조함)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고 표준 조건 하에서HindIII 및SalI로 분해하였다. 표준 조건 하에서 단편을HindIII/SalI 소화 pBluescript(등록상표) SK 플라스미드 DNA(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 Stratagene에서 제조함)에 연결시키고, pBS-SK/Mad#7 중의 MAdCAM-1 단편의 서열을 결정하였다.
3. MAdCAM-1/Ig 융합 단백질의 생성
키메라성 도메인 1/도메인 2 MAdCAM-1-IgGl 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 생성시키기 위해서, pBS/Mad#7로부터의 702 bpHindIII-SalI 단편, pDC1/ICAM3.IgG로부터의 908 bpSalI-XbaI 단편 및HindIII 및XbaI에 의한 소화에의해 선형화된 pDEF2를 연결 반응물에 혼합하였다. 연결 반응물의 일정 분획을 사용하여 XL-1 블루 박테리아(미국 캘리포니아 라졸라에 소재하는 Stratagene에서 제조함)을 형질전환시키고 단일 콜로니에서 분리된 플라스미드 DNA를HindIII,XbaI 및SalI에 의해 제한 소화시켜서 스크리닝하였다. 하나의 클론, pDEF2/MadIg#1이 세개의 단편을 모두 함유하는 것으로 확인되었고, 후술하는 바와 같이 안정하게 형질감염된 CHO 세포주를 생성하는 데 사용하였다.
실시예 6
MAdCAM-1/Ig 및 E-카드헤린/Ig의 발현
A. MAdCAM-1/Ig 및 E-카드헤린/Ig를 발현하는 안정한 CHO 세포주의 생성
숙주 CHO DG44 세포를 pDEF2/MAdIg 또는 pDEF2/EcadIg로 형질감염시키기 위해, 플라스미드 50 내지 100 ㎍을 제한 효소PvuI에 의해 소화시켜서 선형화시켰다. DG44 세포를 하이포크산틴(최종 농도 0.01 mM)과 티미딘(최종 농도 0.0016 mM)이 보충된 DMEM/F-12 배지 중에서 배양하고, 이것을 "HT"로 표시하였다. 처리된 150 ㎠ 조직 배양 폴리스티렌 플라스크(미국 뉴욕 코닝에 소재하는 Corning Inc.에서 제조함)에서 컨플루언스 약 50% 미만까지 배양물을 성장시켜서 형질감염을 위한 DG44 세포를 제조하였다. 세포를 수집하고, 목적하는 플라스미드 DNA와 함께 HeBS 완충액(20 mM Hepes, pH 7.0, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 및 6 mM 덱스트로즈)를 함유하는 용액 0.8 ㎖에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 290 V 및 960 μF(9 내지 11.5 msec 펄스)의 커패시터 방전에 의해 실온에서 전기충격 처리하였다. 세포를 5% 투석 FBS 및 HT로 보충된 DMEM/F-12 10 ㎖에 첨가하고, 원심분리에 의해 펠릿화한 후, 5% 투석 EBS 및 HT가 보충된 DMEM/F-12("비선택성 배지") 2 ㎖에 재현탁시키고, 75 ㎠ 폴리스티렌 조직 배양 플라스크에 접종하였다. 2일 후, 세포 성장물을 수집하고, 5% 투석 FBS가 보충되고 HT는 함유하지 않는 DMEM/F-12("선택성 배지")에 다양한 희석률로 접종하였다.
선택이 완료되고 단일 세포 클론이 동정될 수 있게 되면, 타입신화(typsinization)에 의해 풀링된 CHO 형질감염체의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 개개의 클론을 분리하기 위해, CHO/MAdCAM-1/Ig 및 CHO/E-카드헤린Ig 형질감염체를 선택된 조건 하에서 이뮤론-4 96-웰 플레이트(미국 버지니아 챈틸리에 소재하는 Dynex Technologies, Inc.에서 제조함)에서 약 1 세포수/웰의 밀도로 평판배양하였다. 96-웰 플레이트에서 단일 콜로니가 검출되면, 각 웰의 상청액에 대해 MAdCAM-1/Ig 또는 E-카드헤린/Ig 융합 단백질의 존재를 스크리닝하였다. 인간 IgG1 단백질 성분을 생산하는 단일 세포 CHO 클론을 팽창시키고, 대규모의 단백질 생산을 위해 최대 농도의 MAdCAM-1/Ig 또는 E-카드헤린/Ig 융합 단백질을 생산하는 클론을 선택하였다.
대규모 단백질 생산에 있어서, CHO/MadIg 및 CHO/E-cadIg 클론은 5% CO2분위기 하에 37℃로 유지되는 스피너 플라스크 내의 무혈청 5.2(HT-) 중에서 팽창시켰다. 세포 밀도가 106세포수/㎖를 초과하면, 배지를 수거하고 스피너 플라스크에 새로운 5.2(HT-) 배지를 공급하였다. 소모된 배지는 우선 원심분리하여 세포 파편을 제거한 다음, 1 리터 필터 유닛(미국 뉴욕 코닝에 소재하는 Corning Inc.에서 제조함) 0.22 ㎛를 통해 여과하고, 4℃에서 보관하였다.
B. MAdCAM-1/Ig 정제
CMF-PBS로 평형화된 단백질 A-Sepharose(등록상표) 4 고속 유동 수지 컬럼(미국 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Amersham Pharmacia Biotech, Inc.에서 제조함)을 사용하여 친화도 크라마토그래피에 의해 MAdCAM-1/Ig를 정제하였다. 세포 상청액을 4 ㎖/분의 유속으로 컬럼을 통해 순환시켰다. 로딩후, 용출액 중에 검출가능한 단백질이 존재하지 않을 때까지 컬럼을 CMF-PBS로 세정하였다. MAdCAM-1/Ig를 0.1M 아세트산(pH 3.0)으로 용출하여 pH 9.0의 1 M Tris를 함유하는 튜브에 넣고, 샘플을 CMF-PBS에 대해 4℃에서 투석하였다.
C. E-카드헤린/Ig의 정제
D-PBS로 평형화된 A-Sepharose(등록상표) 4 고속 유동 수지 컬럼(미국 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Amersham Pharmacia Biotech, Inc.에서 제조함)을 사용하여 친화성 크라마토그래피에 의해 E-카드헤린/Ig를 정제하였다. 상청액을 약 4 ㎖/분의 유속으로 컬럼을 통해 순환시켰다. 부하 후, 용출액 중에 검출가능한 단백질이 존재하지 않을 때까지 컬럼을 1 mM CaCl2를 함유하는 pH 8.0의 Tris-완충 염수로 세정하였다. E-카드헤린/Ig를 1 mM CaCl2를 함유하는 0.1 M 아세트산(pH 3.0)으로 용출하여 pH 9.0의 1 M Tris를 함유하는 튜브에 넣었다. 칼슘 농도를 1 mM로 조절하고 샘플을 1 mM CaCl2를 함유하는 Tris-완충 염수(pH 6.8)에 대해 4℃에서 투석하였다.
실시예 7
JY/알파-E 형질감염체의 생성
인체 B 임파모구양 세포주, JY를 전술한 바와 같이 플라스미드 pMHneo/aE로 형질감염시켰다. 형질감염된 집단을 "선택 배지"(5% FBS, 100U/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 및 1.0 ㎎/㎖ G418로 보충된 RPMI 1640 배지를 함유) 중에서 성장시키고, 14일 후, 108G418-내성 JY 세포를 항-aE 모노클로날 항체 Ber-ACT8(미국 캘리포니아 카르핀테리아에 소재하는 DAKO Corp.에서 제조함) 5 ㎍/㎖를 함유하는 선택 배지 5 ㎖에 재현탁시킨 다음, 얼음에서 1시간동안 항온처리하였다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 배지를 흡인하였다. JY/aE 형질감염체를 양의 항-마우스 Ig-FITC(미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 Sigma Corp.에서 제조함)의 1:200 희석액을 함유하는 선택 배지로 얼음에서 1시간동안 염색하였다. 원심분리에 의해 미결합 항체를 제거하고 상청액을 흡인하였다. 알파 E-발현 세포를 유동 세포측정법으로 분리한 다음, 선택 배지 중에서 시험관내 배양물에 의해 팽창시켰다.
Ber-ACT8에 의한 유동 세포측정법에 의해 분류 JY/aE+집단을 재분석한 결과, 알파 E-발현 세포 및 알파 E-비발현 세포 둘다를 함유하는 2모드형 세포 집단을 확인하였다. 2모드형 집단을 전술한 바와 같이 Ber-ACT8로 2회 염색하고, 개개의 JY/aE 세포를 분류하여 선택 배지를 함유하는 96-웰 이뮤론-4 플레이트에 넣었다. 높은 수준으로 알파 E를 발현하는 단일 세포 JY/aE+클론을 시험관내 팽창시키고, 추가의 특성 분석을 위해 JY/aE 클론 #47을 선택하였다. 이 클론(JY 모세포가 아님)은 재조합 E-카드헤린/Ig 에 대해 강력한 부착성을 나타내었는데, 결합은 세포의 포르볼 에스테르 처리에 의해 유도하였다. E-카드헤린/Ig에 대한 JY/aE 클론 #47의 결합은 항-β7인테그린 항체 FIB504(미국 미들랜드 록빌에 소재하는 ATCC에서 입수가능)와, E-카드헤린(미국 캘리포니아 샌프란시스코에 소재하는 Zymed Corp.에서 제조함)에 의해서 차단처리하였다.
실시예 8
JY/알파 D + 클론의 분리
αdβ2인테그린을 안정하게 발현하는 JY 세포주를 얻기 위해서, JY 세포를 전술한 바와 같이 pMHneo/aD로 전기충격 처리하고, 선택 배지 중에서 성장시켜서 안정한 형질감염체를 선택하였다. 세포의 G418-내성 집단을 선택한 후, JY/aD+세포를 항-αd모노클로날 항체 212D 및 양의 항-마우스-FITC(미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 Sigma Corp.에서 제조함)로 염색하였다. 단일 세포 JY/aE+클론의 분리에 대해 전술한 바와 같이 유동 세포측정계를 사용해 세포 분류하여 단일의 세포 JY/aD+클론을 분리하였다.
실시예 9
JY/aE + 부착 분석
A. 화합물 희석물
부착 배지(350 ㎕)(페니실린 및 스트렙토마이신, L-글루타민, NaPy, 및 5% FBS를 함유하는 RPMI 1640)를 2.0 ㎖ 용량의 딥웰 96-웰 역가 플레이트(미국 캘리포니아 풀러톤에 소재하는 Beckman Instruments, Inc.에서 제작함)의 컬럼 1-11의 A, C, E 및 G 열에 있는 각 웰에 분취하여 넣었다. 스크리닝하고자 하는 모든 화합물을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM로 하였다. 화합물을 -20℃에 보관하고, 사용하는 날 37℃ 항온처리조에서 해동시켰다. 딥웰 역가 플레이트의 컬럼 3-11의 A, C, E 및 G 열에 있는 각 웰에 각 화합물(2.1 ㎕)을 피펫으로 주입하였다. 화합물을 함유하지 않는 웰(A1 & A2, C1 & C2, E1 & E2, G1 & G2)에, DMSO 2.1 ㎕를 첨가하였다. αEβ7결합 활성을 차단하는 항-β7모노클로날 항체, FIB504(미국 미들랜드 록빌에 소재하는 ATCC에서 입수 가능)를 7.5 ㎍/㎖의 농도로 웰 C2 및 G2에 첨가하였다. 각 딥웰 역가 플레이트를 덮어 건조를 막고, 사용을 위해 준비하기 전까지 37℃ 항온처리조에 보관하였다.
B. 부착 분석
96-웰 이뮤론 4 플레이트(미국 버지니아 챈틸리에 소재하는 Dynex Technologies, Inc.에서 제조함)에서 다음과 같이 부착 분석을 수행하였다. 각 웰을 D-PBS 중의 E-카드헤린/Ig(3.0 ㎍/㎖) 50 ㎕로 코팅하였다. 대조용 웰은 100%유입 세포 결합을 정성분석하기 위해 포획 항체 FIB504로 코팅하거나, 또는 백그라운드 결합을 결정하기 위해 코팅 완충액만으로 코팅하였다. 4℃에서 하룻밤동안 항온처리한 후, 플레이트를 200 ㎕/웰 D-PBS로 3회 세정하고 D-PBS 중의 1% BSA로 1시간 이상 차단처리하였다. BSA 용액을 제거하고 컬럼 1 내지 11의 B 내지 G 열에 부착 배지(페니실린 및 스트렙토마이신, L-글루타민, 피루브산나트륨, 0.1% BSA 및 60 ng/㎖ PMA를 함유하는 RPMI 1640)을 첨가하였다.
이 시점에서, 60 μM 농도의 테스트 화합물을 함유하는 부착 배지 100 ㎕를 딥웰 96-웰 역가 플레이트로부터 E-카드헤린/Ig 코팅 부착 플레이트로 3회분 옮겼다. 바깥쪽 열을 D-PBS 300 ㎕로 충전하였다. 이 플레이트를 5% CO2분위기 하에 습도조절된 37℃ 항온처리조로 옮겼다.
E-카르헤린 코팅 플레이트의 각 웰에 JY/aE+세포 현탁액 100 ㎕를 첨가하여 부착 분석을 개시하였다. 각 웰의 최종 부피는 105세포, PMA(최종 농도 20 ng/㎖) 및 테스트 화합물(최종 농도 20 μM)을 함유하는 부착 배지 300 ㎕이었다. 플레이트를 37℃에서 30분간 항온처리하였다. 각 화합물에 대해 3회씩 테스트하였다.
D-PBS 중의 14% 글루타르알데히드 용액 50 ㎕를 첨가하여 부착성 세포를 고정시켰다. 플레이트를 물로 세정하고, 100 ㎕/웰의 0.5% 크리스탈 바이올렛(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma Corp.에서 제조함)으로 5분간 염색하였다. 300 ㎕/웰의 70% 에탄올을 첨가하고, 570 nm에서의 흡광도를 결정하여 부착성 세포를 정량분석하였다. 소정 분석에 있어서 3회 테스트 결과의 평균값을 사용하여 하기 식에 따라 세포 결합률(%)을 결정하였다.
C. IC 50 결정
테스트 화합물의 초기 스크리닝 과정에서, 20 μM의 고정 농도에서의 세포에 기초한 부착 분석으로 각 화합물의 실체를 테스트하였다. 이어서, E-카드헤린/Ig에 대한 JY/αEβ7-의존성 부착을 50% 이상 차단한 화합물은 다양한 농도에서 다시 테스트하여 세포 결합이 50% 감소되는 억제 농도, 즉 IC50값을 결정하였다.
스크리닝한 화합물 중 40종, 즉 총 라이브러리의 1.4%는 αEβ7-E-카드헤린 부착을 40% 이상 억제하였다. 화합물 중 약 18종은 디아릴아미드 라이브러리에서 동정되었고, 22종의 화합물은 디아릴 설파이드 라이브러리에서 동정되었다. 이 1차의 IC50결정 결과를 재분석한 결과, 40종의 화합물 중 4종이 10 μM 이하의 IC50값으로 E-카드헤린에 대한 JY/aE+결합을 억제하는 것으로 나타났다. 초기 억제 활성이 재현성이 없거나, 화합물이 인테그린-의존성 부착 반응을 억제하거나, IC50값이 10 μM을 초과하거나, 임의의 세포 변성 효과 또는 세포 독성 효과를 나타내는 경우에는 추가의 특성 분석시 초기 결과 대다수를 배제시켰다. 표 2에 제시된 화합물 K, 화합물 W, 화합물 Z, 화합물 D는 화합물 농도 10 μM 이하에서 재현성있는 억제 활성을 나타내었다. 초기 스크리닝 과정에서는 주목할만한 억제 활성을 나타내었지만 재분석 시에 JY/aE+/E-카드헤린 결합을 억제하지 못한 화합물이 다수 존재하였다. 일부 디아릴 화합물은 반복된 동결 및 해동 과정에서 활성을 상실할 가능성이 있다.
각 화합물의 선택성을 분석하기 위해서, 추가의 결합 파트너 화합물들, JY/αvβ3및 비트로넥틴, JY/α4β1및 VCAM/Ig, JY/αdβ2및 VCAM, JY/αLβ2및 ICAM-1, JY/αMβ2및 iC3b, 그리고 JY/α4β7및 MAdCAM-1의 IC50값을 결정하였다.
각 IC50분석에서, 50 mM 중탄산염 완충액(pH 9.6) 중에 희석된 리간드 50 ㎕를 이뮤론-4 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 2개의 다른 리간드를 각각 3번씩 테스트하는 데 하나의 단일 플레이트를 사용하였다. 다양한 리간드의 코팅 농도는 다음과 같이 하였다: VCAM-1/Ig 2.0 ㎍/㎖, ICAM-1/Ig 5.0 ㎍/㎖, 비트로넥틴 0.5 ㎍/㎖, MAdCAM-1/Ig 3.0 ㎍/㎖ 및 iC3b 5.0 ㎍/㎖. 포획 항체, 예를 들면 항-CD18 모노클로날 항체 TS1/22를 10 ㎕/㎖의 농도로 웰당 50㎕ 첨가하였다. 리간드 코팅 플레이트를 덮어 4℃에서 하룻밤동안 보관하였다. 그 다음날, 각 웰의 내용물을 경사분리하고, 각 플레이트를 200 ㎕/웰 D-PBS로 3회 세정하였다. 이어서 1% BSA/D-PBS 용액을 웰당 300 ㎕ 첨가하여 플레이트를 차단처리하였다. 각 플레이트를 다시 덮어 실온에서 1시간 이상 항온처리하였다.
각 IC50결정 시, 최종 농도 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5.0 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.63 μM, 0.32 μM 및 0.16 μM에서 테스트할 수 있도록 테스트 화합물을 DMSO 중에 연속적으로 희석하였다. 부착 플레이트로 옮기기 전에, 0.1% BSA 및 3 ng/㎖ PMA(미국 미주리 센트루이스에 소재하는 Sigma Corp.에서 제조함)를 함유하는 RPMI 1640을 웰당 0.7 ㎖ 함유하고 37℃로 미리 가온된 96-웰 딥웰 역가 플레이트에 희석 화합물 4.2 ㎕를 옮겨서 화합물들을 초기 희석하였다. 1% BSA/D-PBS 차단처리 용액을 96-웰 이뮤론-4 플레이트에서 경사분리하고 희석 화합물 0.2 ㎖로 대체하였다. 스크리닝하고자 하는 각 96-웰에 대해, 원심분리에 의해 약 8×106세포를 수집하고 최종 농도 106/㎖로 부착 배지(0.1% BSA를 함유하는 RPMI 1640)에 재현탁하였다. 부착 분석 시 PMA-의존성 상동기관의 집합을 방지하기 위해서, 세포 현탁액에 최종 농도 10 ㎍/㎖로 항-CD18 항체 22F12C(미국 워싱턴 보텔에 소재하는 ICOS Corp.에서 제조함)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 15분간 항온처리하였다. 이 항체는 JY/αLβ2, JY/αdβ2또는 JY/αMβ2및 그들의 대응 리간드 ICAM-1, VCAM-1 또는 iC3b를 포함하는 CD18-의존성 부착 분석에는 첨가하지 않았다.
이뮤론-4 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 ㎕를 첨가하여 부착 분석을 개시하였다. 플레이트를 37℃에서 30분간 항온처리하고 D-PBS 중의 14% 글루타르알데히드 용액 50 ㎕를 첨가하여 부착성 세포를 1시간 이상 고정시켰다. 플레이트를 물로 세정하고 웰당 100 ㎕의 0.5% 크리스탈 바이올렛(미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 Sigma Corp.에서 제조함)으로 5분간 염색하였다. 플레이트를 물로 2회 세정하여 과량의 크리스탈 바이올렛 염료를 제거하고, 70% 에탄올 300 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트 분광광도계로 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 부착성 세포를 정량분석하였다. 소정 분석에 있어서, 3회 테스트 결과의 평균값을 사용하여 하기 식에 따라 세포 결합률(%)을 결정하였다:
1차 스크리닝 과정에서 동정된 4종의 화합물 K, 화합물 W, 화합물 Z 및 화합물 D를 추가의 특이성 분석을 위해 선택하고, 추가의 인테그린-의존성 부착 반응에서 그들의 IC50값을 결정하였다. 모든 경우에, 결합 분석에 사용된 인디케이터 세포주는 분석 과정 중에 2 ng/㎖ PMA로 처리하여 인테그린-의존성 부착을 자극하였다. 이 4종의 화합물의 IC50값을 부착 분석에서 결정하였는 바, 하기 표에 나타낸 바와 같다.
[표 5]
화합물 E-카드헤린 αEβ7 MAdCAM-1 α4β7 iC3bαMβ2 VNαVβ3 ICAM-1αLβ2 VCAMα4β1 VACMαdβ2
K 3 μM 4 μM 4 μM 6 μM 11 μM ＞40 μM ＞40 μM
D 3 μM 4 μM 7 μM 4 μM 28 μM ＞40 μM ＞40 μM
W 5 μM 5 μM 4 μM 8 μM 30 μM ＞40 μM ＞40 μM
Z 3 μM 11 μM ND ND 20 μM ＞40 μM ＞40 μM
시예 10
알파 1, 알파 2 및 알파 11 I 도메인의 클로닝, 발현 및 정제
콜라겐-결합 인테그린 알파 1, 알파 2 및 알파 11은 류코인테그린 알파 L, 알파 M, 알파 X 및 알파 d에 함유된 I 도메인 서열과 상동성인 I 도메인 서열을 함유한다. 이러한 분자들이 알로스테릭 조절 부위를 통해 조절될 수 있는 가능성을조사하기 위해서, 테스트 화합물의 라이브러리에 대해 그 인테그린과 그들의 리간드 콜라겐 및 라미닌 간의 상호작용을 억제하는 능력을 분석하였다.
알파 1 및 알파 2 I 도메인 서열과 알파 11을 박테리아성 발현 벡터 pET15b(Novagen 제조)에 클로닝시켰다. 이. 콜리 중에서의 상기 작제물들의 발현 결과, 아미노산 말단 히스티딘 태그를 가진 단백질 및 "태그된(tagged)" 단백질이 생성되는데, 이들은 니켈 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. 알파 11의 클로닝은 전술한 바와 같이 수행하였다[참고: Velling 등, J. Biol. Chem. 274:25735-25742(1999)].
알파 1 및 알파 2 I 도메인 서열 둘다를 PCR 증폭에 따라 pET15b에 클로닝하여 I 도메인을 벡터 내의 히스티딘 태그에 의해 프레임 내에 클로닝할 수 있는 제한 부위를 첨가하였다. 알파 1 I 도메인 PCR 반응의 주형은 전술한 바와 같이 벡터 pcDNA-1 Amp 내의 비장 cDNA 라이브러리로부터의 하이브리드화에 의해 클로닝된 전길이 알파 1 cDNA이었다. 이 스크리닝에 사용된 하이브리드화 프로브는 각각 다음과 같은 Alpha1.5(서열 번호 20) 및 Alpha1.3(서열 번호 21) 프라이머를 사용하는 PCR 반응의 생성물이었다:
5'-GACTTTCAGCGGCCCGGTGGAAGACATG-3'서열 번호 20
5'-CCAGTTGAGTGCTGCATTCTTGTACAGG-3'서열 번호 21
샘플은 94℃에서 30초간 초기 항온처리하고, 이어서 94℃에서 5초간 및 72℃에서 2분간의 처리 5 사이클, 94℃에서 5초간 및 70℃에서 2분간의 처리 5 사이클, 94℃에서 5초간 및 68℃에서 2분간의 처리 25 사이클을 수행한 다음, 72℃에서 7분간의 최종 항온처리를 수행하였다. PCR 생성물을 TOPO TA 벡터 pCRII(Invitrogen 제조)에 클로닝하고 서열결정하였다. 생성된 클론을 상기한 바와 동일한 조건을 사용하는 PCR의 주형으로서 사용하고, 증폭 반응물을 겔 정제하여 무작위 프라임처리된 표지 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여32P로 표지한 다음, 하이브리드화 프로브로 사용하였다. 하이브리드화는 전길이 알파 11 cDNA의 스크리닝에 사용된 것과 동일한 조건 하에서 ExpressHyb 하이브리드화 용액(Clontech 제조)을 사용하여 수행하였다. 생성된 클론, 알파 1/pcDNA/111을 알파 1 I 도메인을 서브클로닝하는 데 주형으로 사용하였다.
알파 1 I 도메인은 각각 다음과 같은 A1.5Nde(서열 번호 22) 및 A1.3Bam(서열 번호 23) 프라이머에 의해 증폭시켰다:
5'-ATATCATATGGACATAGTCATAGTGCTGG-3'서열 번호 22
5'-ATATGGATCCCTAAGACATTTCCATTTCAAATG-3'서열 번호 23
알파2 I 도메인은 주형으로서 벡터 pcDNA-1 Amp 내 HUVEC cDNA 라이브러리와 각기 아래에 나타낸 A2.5Nde(서열 번호 24) 프라이머 및 A2.3Bam(서열 번호 25) 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다:
5'-ATATCATATGGATGTTGTGGTTGTGTGTG-3'서열 번호 24
5'-ATATGGATCCCTATGACATTTCCATCTGAAAG-3'서열 번호 25
양쪽 I 도메인의 증폭에 대한 PCR 조건은 2 분 동안 94℃에서의 초기 항온처리, 이어서 20 초 동안 94℃; 30 초 동안 55℃ 및 45 초 동안 72℃의 30 사이클;및 7 분 동안 72℃에서의 최종 항온처리를 포함하였다. PCR 생성물은 겔 정제하고, NdeI 및 BamHI로 분해하였으며, 다시 겔 정제하고, 동일 효소로 미리 분해시킨 pET15b에 클로닝하였다. 생성된 클론 알파1/pet/2 및 알파2/pet/27을 서열 결정하였다.
알파1, 알파2 및 알파11 pET15b 클론은 발현을 위한 박테리아 균주 BL21(DE3)pLysS(Stratagene)로 형질전환하였다. 히스티딘 태깅된 단백질을 Ni-NTA 아가로즈 칼럼(QIAGEN)과 이미다졸 구배 용출을 사용하여 이. 콜리 용해물의 가용성 분획으로부터 분리하였다. 용출된 단백질을 CMF-PBS에 대해 투석하고, EZ-연결 설포-NHS-LC-비오틴(Pierce)을 사용하여 제조자의 권장 프로토콜에 따라서 비오틴일화하였다.
96-웰 플레이트 포맷에서 콜라겐에 결합하는 알파1 또는 알파2 I 도메인의 측정 분석은 콜라겐을 96-웰 플레이트의 웰에 결합하는 단계, 비오틴일화된 알파1 또는 알파2 단백질을 웰에 첨가하는 단계 및 유로퓸 커플링된 스트렙타비딘과 경시적 분해 형광(time resolved fluorescene)을 사용하여 콜라겐 결합 I 도메인의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 이뮤론4 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 CMF-PBS 중의 래트 I형 콜라겐(Sigma) 20 ㎕/㎖로 코팅하였다. 웰을 CMF-PBS 250 ㎕로 2회 세척하고, 30℃에서 1 시간 동안 CMF-PBS 중의 2.5% BSA로 차단처리하였다. 웰을 CMF-PBS 200 ㎕로 세척하고, 비오틴일화된 단백질을 2 mM MgCl2및 1% BSA을 함유하는 CMF-PBS 또는 2 mM MnCl2및 1% BSA를 함유하는 TBS 중의 1 ㎍/㎖로 웰에 첨가하였으며, 37℃에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 웰을 동일 항온처리 완충액(I 도메인 없음) 200 ㎕로 2회 세척하고, 콜라겐 결합된 비오틴일화 단백질은 SA-Eu 희석 완충액(Wallac) 중의 스트렙타비딘 유로퓸(SA-Eu; Wallac)의 1:1000 희석액 100 ㎕를 첨가하여 검출하였다. 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 웰을 항온처리 완충액 200 ㎕로 6회 세척하고, 증강(Enhancement) 용액(Wallac; 물로 1:1 희석함)을 5 분 동안 실온에서 각각의 웰에 가하였다. 유진(Eugen) 프로그램을 사용하여 형광을 측정하였다.
실시예 11
콜라겐 결합의 알파2 길항물질의 동정
FACS 분석으로, 주르카트 세포가 알파1 및 알파2 인테그린을 모두 발현하는 것으로 나타났다. 각각의 이러한 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 결합 연구로, 래트 I형 콜라겐에 대한 주르카트 세포 부착이 알파2와의 상호 작용을 통하여 우세하게 매개되는 것으로 나타났다. 예를 들면, 모노클로날 항체를 차단하는 알파2는 I형 콜라겐에 대한 주르카트 세포 결합을 완전히 억제하는 것으로 나타났다. 이 결과를 고려하여, 주르카트 세포를 후술되는 바와 같은 부착 분석에서 사용하여 알파2 결합의 억제제를 동정하였다. 상기 분석은 전술한 절차[Sadhu 등, 상기 참조]의 변형을 이용하여 수행하였다.
이뮤론4 플레이트(미국 버지니아 챈틸리에 소재하는 Dynex Technologies에서 제조함)를 (i) 50 ㎕ 래트 I형 콜라겐(Sigma)(CMF-PBS 중의 20 ㎍/㎖), (ii) 중탄산염 완충액, pH 9.6 중의 항-베타1 모노클로날 항체 3S3(5 ㎍/㎖), 또는 (iii) 중탄산염 완충액 단독으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 200 ㎕/웰 D-PBS로 1회 세척하고, D-PBS 중의 1% BSA(100 ㎕/웰)로 1 시간 동안 실온에서 차단처리하였다. 웰을 RPMI 및 1% 불활성화 FBS를 함유하는 100 ㎕ 부착 완충액으로 1회 세정하고, PMA(10 ng/㎖ 최종 농도)를 함유하는 100 ㎕ 부착 완충액을 각각의 웰에 첨가하였다. 후보 억제제(최종 농도 20 μM에서)를 함유하거나 함유하지 않은 부착 완충액을 첨가한 후, 부착 완충액 중의 100 ㎕ 주르카트 세포(1 x 106세포/㎖)를 첨가하였으며, 항온처리를 37℃에서 30 분 동안 행하였다. 부착성 세포는 D-PBS 중의 50 ㎕/웰 14% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 항온처리함으로써 고정시켰다. 플레이트를 dH2O로 세척하고, 10% 에탄올 중의 50 ㎕/웰 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 5 분 동안 실온에서 염색하였다. 플레이트를 몇 가지 변화의 dH2O 중에서 세척한 후, 70% 에탄올을 가하였다. 부착성 세포는 SPECTRmax 250 마이크로플레이트 분광광도계 시스템(미국 캘리포니아 서니베일에 소재하는 Molecular Device에서 제조함)을 사용하여 570 nm 및 410 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 세포 결합률(%)은 하기 수학식을 사용하여 측정하였다:
데이타는 하기 수학식을 사용하여 정규화하였다:
121 종의 화합물이 대조군보다 50% 이상 더 큰 수치로 래트 I형 콜라겐에 대한 주르카트 세포 부착을 억제하였다. 이러한 억제제에 대한 IC50결정은 억제제를 0.15 내지 40 μM의 농도 범위를 통하여 2 배 희석액으로 테스트한 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 주르카트 부착 분석에서 평가하였다. 121 종의 화합물 중 113 종의 IC50값을 결정하고, 이들 121 종 중 21 종은 상기 분석에서 2 내지 17 μM의 IC50범위의 효능을 기준으로, 그리고 α4β7결합 분석(본 명세서에 기재됨) 및 폰 빌레브란트 인자 결합 분석(본 명세서에 기재됨)에서 저 수치의 억제율을 나타내는 특이성에 대해 선택하였다. 이러한 21 종의 화합물은 특이성과 독성에 대해 더 분석하였다. 특이성 결정에서, 화합물들은 고정화된 VCAM-1/Ig에 대한 주르카트 세포 결합을 억제하는 능력에 대하여 0.15 μM 내지 20 μM의 농도 범위에서 테스트하였다. 이 분석은 세포를 콜라겐 대신에 VCAM-1/Ig로 코팅한 것을 제외하고는 전술한 콜라겐 부착 분석과 유사한 방식으로 수행하였다. VCAM-1에 대한 결합은 α4β1의 표면 발현에 의존하였다. 이러한 결과는 표 6에 나타낸다.
21 종의 화합물에 대하여, 주르카트 세포의 독성은 4 시간 항온처리 후 또는 24 시간 항온처리 후에 평가하였다. LD50농도는 CellTiter 96(등록상표) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay System(Promega)을 사용하여 제조자의 권장 프로토콜에 따라서 결정하였다. 각각의 화합물의 일련의 2 배 연속 희석물 시리즈를 40 μM 내지 0.15 μM의 농도 범위에서 테스트하였다. 독성 분석으로부터의결과는 표 6에 나타낸다.
[표 6]
화합물 α2β1/콜라겐EC50(μM) α7β1/VCAMEC50(μM) 독성LD50(μM)
화합물 AD 2 >20 3
화합물 T 4 15 25
화합물 AF 6 >20 35
화합물 AI 6 >20 33
화합물 AG 7 >20 35
화합물 AE 7 >20 30
화합물 Y 7 >20 25
화합물 J 8 >20 >40
화합물 X 8 >20 30
화합물 M 8 >20 25
화합물 AL 8 >20 20
화합물 AJ 8 >20 38
화합물 AK 9 >20 35
화합물 AH 9 >20 38
화합물 AB 13 >20 >40
화합물 A 14 17 >40
화합물 U 15 >20 >40
화합물 G 16 >20 >40
화합물 E 16 >20 >40
화합물 B 17 >20 >40
화합물 AN 17 >20 >40
시예 12
콜라겐 결합의 알파1 길항물질의 동정
중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 내인성 콜라겐 수용체를 발현하지 않는다. 따라서, CHO 세포를 전장 알파1 발현 구성물, 알파1/pDC-1/1로 형질감염시켰다. 전장 알파1 삽입물을 벡터 pLEN[Briesewitz 등, JBC 268: 2989-2996 (1993)] 내 클론에서 제거하고, pDC-1에 서브클로닝하여 클론 알파1/pDC-1/1을 생성하였다. 형질감염체는 선택성 배지(12% FBS를 함유하는 DMEM/F12) 내에서 성장시키고, 제한 희석에 의해 클로닝하였다. 알파1 발현 클론은 차단처리 알파1 모노클로날 항체(항체5E8D9; Upstate Biotech)로 세포를 염색하고, FACS 분석에 의해 발현 수치를 결정함으로써 동정하였다. 상기 세포는 이러한 부착을 억제시키는 것으로 나타난 차단처리 알파/모노클로날 항체(UPstate Biotech; Clone 5E8D9)를 사용하여 알파-의존적 방식으로 IV형 콜라겐에 부착하는 것으로 입증되었다. 이 결과를 고려하여, 알파1 형질감염된 CHO 세포를 후술되는 바와 같은 부착 분석에 사용하여 알파1 결합의 억제제를 동정하였다. 이 분석은 전술한 알파2 길항물질을 동정하는 데 사용된 절차의 변형이다.
이뮤론4 플레이트를 (i)웰당 50 ㎕의 인간 IV형 콜라겐(Sigma)(CMF-PBS 중의 0.5 ㎍/ml), (ii) 중탄산염 완충액, pH 9.6 중의 항-알파1 모노클로날 항체 5E8D9 또는 (iii) 중탄산염 완충액 단독으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 D-PBS로 2회 세척하고, D-PBS 중의 1% BSA(100 ㎕/웰)로 1 시간 동안 실온에서 차단처리하였다. 웰을 100 ㎕/웰 부착 완충액(혈청을 함유하지 않는 DMEM/F12 배지)으로 1회 세정하였다. 후보 억제제를 함유하거나 함유하지 않는 부착 완충액(200 ㎕)을 각각의 웰에 가한 후, 부착 완충액 중의 알파1 형질감염된 CHO 세포 100 ㎕를 첨가하였다. CHO 세포는 베르센을 사용하여 미리 회수하였으며, 10% FBS를 함유하는 DMEM/12 배지에서 3회 세정하였다. 세포를 0.75 x 106세포수/㎖의 밀도로 부착 완충액에 재현탁하였다. IV형 콜라겐 상의 알파1-형질감염된 CHO 세포의 항온처리는 37℃에서 30 분 동안 수행하였다. 부착성 세포는 D-PBS 중의 14% 글루타르알데히드 50 ㎕/웰를 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 항온처리함으로써 고정시켰다. 플레이트를 dH2O로 세척하고, 10% 에탄올 중의 0.5% 크리스탈 바이올렛 50 ㎕/웰으로 5 분 동안 실온에서 염색하였다. 플레이트를 몇 가지 변화의 dH2O 중에서 세척한 후, 70% 에탄올을 가하였다. 부착성 세포는 SPECTRmax 250 마이크로플레이트 분광광도계 시스템(미국 캘리포니아 서니베일에 소재하는 Molecular Device에서 제조함)을 사용하여 570 nm 및 410 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 세포 결합률(%)은 하기 수학식을 사용하여 측정하였다:
데이타는 하기 수학식을 사용하여 정규화하였다:
64 종의 화합물이 DMSO 대조군보다 50% 이상 더 큰 수치로 IV형 콜라겐에 대한 알파1 형질감염된 CHO 세포 부착을 억제하였다. 이러한 화합물에 대한 EC50결정은 억제제를 0.15 μM 내지 20 μM(즉, 0.15 μM, 0.3125 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 2.50 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM)의 농도 범위를 통하여 2 배 희석액으로 테스트한 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 알파1 형질감염된 CHO 세포 부착 분석에서 평가하였다. 이들 화합물에 대한 EC50값은 0.5 μM 내지 18 μM이었다. 이들 화합물은 특이성과 독성에 대해 더 분석하였다.
초기 특이성 테스트를 위하여, 이 화합물들을 I형 콜라겐에 대한 알파2 형질감염된 CHO 세포 부착을 억제하는 능력에 대하여 0.15 μM 내지 20 μM의 농도 범위에서 테스트하였다. 이 분석을 위하여 CHO 세포를 알파2 발현 구성물 알파2/pDC-1/8로 형질감염시켰다. 원래의 알파2 구성물은 발현 벡터 pcDNA-3 내에서 구성하였으며, Genestorm 클론은 인비트로겐에서 구입하였다. 알파2 서열은 클론 알파2/pDC-1/8로부터 생성된 pDC-1에 서브클로닝하였다. 알파2 발현 세포를 클로닝하고, 알파2 모노클로날 항체, A2-IIE10(Upstate Biotech)을 사용하여 FACS에 의해 분석하였다. 중간 정도의 알파2를 발현하는 CHO 세포주를 동정하고, 알파1에 대해 전술한 바와 같이 부착 분석에 사용하였다. 알파2 부착 분석에서의 유일한 차이점으로는 (i) IV형 콜라겐 대신에 고정화 래트 I형 콜라겐(Sigma)을 사용하고, (ii) 알파1 모노클로날 항체 대신에 알파2 모노클로날 항체, A2-IIE10을 사용한 것이다. 대부분의 화합물들은 알파2와 비교하였을 때 알파1에 대한 특이성의 범위가 좁았다. 이들 화합물은 알파1 의존성 부착의 억제가 알파2 의존성 부착의 억제보다 약 1 내지 3 배 효과적이었다.
화합물의 독성은 알파1 형질감염된 CHO 세포를 사용하는 4 시간 분석에서 평가하였다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 LD50농도(또는 "치사 투여량 50")는 규정된 시간 간격에 걸쳐서 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 화합물 농도이다. LD50농도는 CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay System(Promega)을 사용하여 제조자의 권장 프로토콜에 따라서 결정하였다. 각각의 화합물의 2 배 연속 희석물 시리즈를 40 μM 내지 0.15 μM의 농도 범위에서 테스트하였다. 이들 화합물에 대한 독성은 2.5 μM 내지 40 μM 범위였다.
그 효능, 선택성 및 독성 프로필을 기초로 선택된 32 종의 화합물을 특이성에 대하여 더 분석하였다. 화합물들은 보다 관련이 먼 I 도메인 함유 인테그린 알파L(LFA-1) 및 알파M(Mac-1)의 부착 억제에 대하여 테스트하였다. 알파L에 대하여, 이 화합물들은 ICAM-1에 대한 JY8 세포 부착의 억제에 대하여 테스트하였다.
ICAM-1/JY-8 세포 부착 분석
본 발명에서 화합물의 생물학적 관련 활성은 다음과 같이, 고정화 ICAM-1에 대한 JY-8 세포(그 표면 상에서 LFA-1을 발현하는 인간 EBV 형질전환된 B 세포주)의 부착을 차단하는 화합물의 능력을 측정하는 세포계 부착 분석을 사용하여 확인하였다. 화합물들은 약간의 변형을 가하여 알파1 분석에 대해 기재된 바와 같이 LFA-1 의존성 부착의 억제에 대하여 스크리닝하였다. 플레이트를 IV형 콜라겐 대신에 ICAM-1 Ig 단백질(중탄산나트륨 완충 용액 중의 5 ㎍/㎖)로 코팅하였다. K562[α1] 세포 대신에 JY 세포를 사용하였다. 알파1 모노클로날 항체 대신에 사용된 포착 모노클로날 항체는 22F12C(중탄산나트륨 완충 용액 중의 5 ㎍/㎖)였다.
알파M의 경우, 이 화합물들은 iC3b에 대한 Mac-1 형질감염된 JY 세포 부착의 억제에 대하여 테스트하였다(실시예 2에 기재된 분석). 양 분석의 경우, 화합물들은 20 μM 내지 0.15 μM의 농도 범위에서 2 배 희석액 시리즈로 테스트하였다. 대부분의 화합물들은 LFA-1 및 MAC-1 의존성 부착을 억제하는 것보다 알파1 의존성 부착을 억제하는 것이 1 내지 10 배 더 효과적이었다. 또한, 이들 화합물들은 CHO세포에 대해 전술한 바와 같이 JY 세포로 4 시간 분석에서 독성에 대해 분석하였다.
제2 알파1 의존성 세포 부착 분석은 동정된 알파1 길항물질을 더 평가하기 위하여 개발되었다. 골수양 백혈병 세포주인 K562 세포를 전장 알파1 발현 구성물 알파1/pMHneo/40으로 형질감염시켰다. 알파1/pMHneo/40 구성물은 전장 알파1 서열을 발현 벡터 pMH-neo에 서브클로닝함으로써 생성되었다[Hahn 등, Gene 127: 267-268 (1993)]. 형질감염체를 0.5 mg/㎖ G418로 선택하였다. 알파1 발현 세포를 더 선택하기 위하여, 형질감염체는 IV형 콜라겐에 대한 부착을 위해 패닝처리하였다. 패닝처리의 경우, 조직 배양 플레이트는 1 시간 동안 37℃에서 CMF-PBS 중의 인간 IV형 콜라겐(Sigma) 20 mg/㎖로 코팅하였다. 플레이트를 결합 완충액(10% FBS를 함유하는 RPMI)으로 세척하고, 알파1 형질감염된 K562 세포를 20 mg/㎖ PMA를 함유하는 결합 완충액 중에 첨가하였다. 37℃에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 세척하여 미결합 세포를 제거하였다. 부착성 세포를 베르센으로 제거하고, 결합 완충액으로 희석시켰다. 패닝 처리후, 알파1을 발현하는 K562 세포주를 얻었으며, 후술되는 추가 스크리닝에 사용하였다.
CHO 세포 부착 분석에서 동정된 21 종의 알파1 길항물질을 알파1 형질감염된 K562 세포 부착 분석에서 더 분석하였다. 세포 부착 분석은 부착 완충제로서 RPMI를 사용한 것을 제외하고는 CHO 세포 분석에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 알파1 길항물질의 효능은 K562 및 CHO 세포 부착 분석에서와 유사하였는데, 대부분의 화합물들의 대부분의 EC50값은 두 분석 간의 1 내지 3 배 범위 내에 있었다. 또한, 이 화합물들은 전술한 CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay System을 사용하는 4 시간 분석에서 K562 세포와의 독성에 대해 분석하였다. 대부분의 화합물의 독성(LD50)은 K562 및 CHO 분석에서와 유사하였다. 두 분석 간의 LD50값은 대다수 화합물에 대하여 2 배 미만으로 변하였다.
5 종의 알파1 길항물질의 구조는 표 7에 나타낸다. 이들 화합물들의 EC50값은 0.5 내지 1.5 μM 범위였다. 이들 화합물들은 알파2에 대한 알파1의 특이성이 좁고(1 내지 4 배), 보다 관련이 먼 인테그린, 예컨대 LFA-1 및 Mac-1에 비하여 선택성이 더 컸다(3 내지 10 배). 효능(EC50)과 독성(LD50) 간의 윈도우는 6 내지 20 배 범위였다.
[표 7]
실시예 13
알파1 I 도메인의 발현 및 정제, 그리고 생화학 분석에서의 용법
알파1 I 도메인 구성물은 이. 콜리 내 히스티딘 태깅된 단백질로서 알파1 I도메인을 발현하기 위해 생성하였다. 히스티딘 태깅된 단백질은 공결정화 실험에서 억제제와 복합체화된 알파1 I 도메인의 삼차원 구조를 결정하는 데 사용하였다. 또한, 히스티딘 태깅된 단백질은 고정화 콜라겐에 대한 알파1 I 도메인의 결합을 측정함으로써 생화학 분석에서 알파1 길항물질을 평가하는 데에도 사용하였다.
알파1 I 도메인을 하기와 같이 클로닝하였다. 알파1 I 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기 A1.I.Bam(서열 번호 26) 프라이머 및 A1.I.Pst(서열 번호 27) 프라이머와, 주형으로서 벡터 알파1/pDC-1/1을 사용하여 PCR 증폭시켰다:
A1.I.Bam: CGGATCCCCCACATTTCAAGTCGTGAAT서열 번호 26
A1.I.Pst: GCTGCAGTCATATTCTTTCTCCCAGAGTTTT서열 번호 27
PCR 조건은 2 분 동안 94℃에서의 초기 항온처리, 이어서 30 초 동안 94℃; 30 초 동안 55℃; 및 30 초 동안 72℃의 30 사이클; 및 7 분 동안 72℃에서의 최종 항온처리를 포함하였다. 생성된 PCR 생성물은 겔 정제하고, BamHI 및 PstI로 분해하였으며, 다시 겔 정제하고, BamHI 및 PstI로 미리 분해시킨 백터 pQE30(Qiagen)에 클로닝하였다. 생성된 클론 알파1/pQE30/2를 서열 결정에 의해 검증하였다.
알파1/pQE30/2 구성물은 단백질 발현을 위하여 이. 콜리 균주 M15(pREP4)(Qiagen)으로 형질전환시켰다. 히스티딘 태깅된 알파1 I 도메인을 6 M 구아니딘을 사용하여 정제된 봉입체로부터 가용화시킨 다음, 구아니딘을 함유하지 않는 완충액 중의 희석에 의해 급속 리폴딩하였다. 가용화된 알파1 I 도메인을 Ni-NTA 아가로즈 칼럼(Qiagen)과 이미다졸 구배의 용출을 이용하여 정제하였다.
정제된 알파1 I 도메인을 다음과 같이 고정화 IV형 콜라겐으로 직접 결합 분석에 사용하였다. 코스트라 이뮤론4 플레이트(96 웰)를 (i) CMF-PBS 중의 40 ㎍/㎖의 인간 콜라겐 IV 단백질(Sigma) 50 ㎕/웰, (ii) CMF-PBS 중의 10 ㎍/㎖의 항-알파1 I 도메인 모노클로날 항체(Immune Diagnostics)(양성 대조군) 또는 (iii) CMF-PBS 단독(음성 대조군)으로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 그 다음 날, 배지를 제거하고, 플레이트를 건식 블로팅 처리한 후, 0.05% Tween-20을 함유하는 CMF-PBS 중의 2% BSA 150 ㎕/웰을 가하여 플레이트를 차단처리하고, 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 더 항온처리하였다. 배지를 건식 블로팅 처리한 플레이트로부터 다시 제거한 다음, 0.05% Tween-20 및 5 mM MgCl2(PBS/T/Mg)를 함유하는 CMF-PBS 150 ㎕/웰로 2회 세척하였다. 2X 화합물, DMSO, 항-알파1 I 도메인 모노클로날 항체, 동형 정합 대조 모노클로날 항체를 함유하거나, 또는 억제제를 함유하지 않는 PBS/T/Mg 대략 50 ㎕/웰을 플레이트에 가한 후, 정제된 알파1 I 도메인 20 ㎍/㎖를 함유하는 PBS/T/Mg 50 ㎕/웰을 가하고, 플레이트를 30 분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 배지를 제거하고, 플레이트를 건식 블로팅 처리한 다음, 100 ㎕/웰 PBS/T/Mg로 2회 세척한 후, 1 ㎍/㎖ 항-펜타-His 모노클로날 항체(Qiagen)를 함유하는 100 ㎕/웰 PBS/T/Mg를 가하였다. 그 다음, 플레이트를 30 분 동안 37℃에서 항온처리하고, 배지를 제거하였으며, 플레이트를 건식 블로팅 처리하였다. 그 다음, 플레이트를 100 ㎕/웰 PBS/T/Mg로 2회 세척하고, GAM-HRP(Sigma)의 1:20,000 희석물을 함유하는 100 ㎕/웰 PBS/T/Mg를 가하고, 플레이트를 30 분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 배지를 제거하고, 플레이트를 건식 블로팅 처리하였다. 플레이트를 100 ㎕/웰 PBS/T/Mg로 2회 세척하고, H2O2150 ㎕/ℓ및 TMB 기질 스톡의 1:100 희석물을 함유하는 기질 완충액 100 ㎕/웰을 각각의 웰에 가하였으며, 플레이트를 암실에서 30 분 동안 실온에서 현상하였다. 그 다음, 15% H2SO450 ㎕/웰을 가하여 반응을 중지시키고, 플레이트를 분광광도계 상의 A450-A670에 의해 분석하였다. 특정 시그널을 "음성 대조군" 웰에 결합하는 백그라운드를 공제하여 결정하였다.
추가의 분석은 유로퓸 표지된 알파1 I 도메인을 사용하여 전개하였으며, 경시적 분해 형광(TRF)을 사용하여 세척한 후 결합된 I 도메인을 직접 검출하였다. 이 분석에서, 정제된 알파1 I 도메인은 DELFIA 유로퓸 표지 키트를 사용하여 제조자의 권장 프로토콜(Wallac)에 따라서 유로퓸으로 표지하였다. 코스타 이뮤론4 플레이트(96 웰)를 CMF-PBS/1 μM MgCl2중의 25 ㎍/㎖의 인간 콜라겐 IV 단백질(Sigma) 100 ㎕로 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 TBS/T(20 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.02% Tween-20) 및 1 mM MgCl2(TBS/T/Mg) 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 그 다음, 플레이트를 CMF-PBS/1 mM MgCl2/2% BSA 100 ㎕/웰로 1 시간 동안 37℃에서 차단처리하였다. 플레이트를 다시 세척한 다음, RPMI/5% TBS/1 mM MgCl2100 ㎕/웰 중의 5 g/㎖ 유로퓸 I 도메인으로 탐침하고, 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 다시 세척하고, 100 ㎕/웰 증강제(Wallac)를 첨가함으로써 현상하고, 경시적 분해 형광에 의해 Victor 플레이트 판독기 상에서 분석하였다.
실시예 14
α1β1 루신 지퍼 단백질의 발현 및 정제와 생화학 분석에서의 그 용법
물리화학적으로 보다 정밀한 생화학 분석법을 개발하기 위해서, α1β1 루신 지퍼 단백질을 생성시켰다. 경막 및 세포질 꼬리 폴리펩티드 서열 없이 α1 및 β1의 전장 세포외 도메인을 각각 암호화하는 발현 구성물을 제조하였다. 경막 영역의 제거는 용이한 정제를 제공하면서 형질감염된 세포로부터 그러한 단백질을 분리할 수 있다. 경막 서열은 산성 및 염기성 루신 지퍼 서열로 각각 대체하였다. 일반적으로, 문헌[창 등, PNAS 91:11408-11412 (1994)]을 참조할 수 있다.
α1의 세포외 도메인은 pLEN 중의 최초 α1 클론으로부터 서브클로닝하였다[참조: 브리즈위츠 등, JBC 268:2989-2996 (1993)]. β1의 세포외 도메인은 전장 β1 클론 He6.1.2/pcDNA-1 Amp로부터 서브클로닝하였다. 이 클론은 하이브리드화에 의해 Hela cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻었다. 루신 지퍼 서열은 α1β1 이종이량체의 형성을 촉진한다. 이들 구성물은 루신 지퍼 단백질을 구성하는 방법에 관한 설명에 대하여 본 명세서에 참고 인용되어 있는 미국 특허 제6,251,395호(2001년 6월 26일 특허 허여됨)의 실시예 14에 설명되어 있는 동일한 루신 지퍼 서열 및 벡터를 사용하여 생성시켰다. α1 및 β1 루신 지퍼 구성물은 CHO 세포 내로 동시 형질감염시킨 후, 10% 투석된 FBS를 함유한 DMEM/F12 배지 중에 유지하였다. 상청액은 수집하고, 분비된 α1β1 이종이량체는 루신 지퍼의 2개 사슬 모두를 인지하는 항-루신 지퍼 모노클로날 항체와 커플링된 CNBr-활성화된 세파로즈 4B(Pharmacia) 상에서 작동되는 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 생화학 분석에 사용하기 위해서, 정제된 α1β1 루신 지퍼 단백질은 제조사에 의해 제안된 프로토콜에 따라 DELFIA 유로퓸-표지 키트를 사용하여 유로퓸 표지하였다. 부동화된 콜라겐에 대한 표지된 α1β1 루신 지퍼 단백질의 결합은 경시적 분해 형광에 의해 측정하였다. 이종이량체 분석은 기본적으로 유로퓸 표지된 I 도메인 분석과 동일하게 장치하였는데, 단 예외로 CMF-PBS/1 mM MgCl2/2% BSA 중의 유로퓸 표지된 이종이량체는 유로퓸 표지된 I 도메인 대신 프로브로서 대체하였다.
실시예 15
폰 벨레브란트 인자/gpIb-CHO 정지 세포 부착 분석
폰 벨레브란트 인자(vWf) 중의 A11 도메인은 다른 단백질 중에 발견된 I 도메인에 대하여 상동성을 갖는다. 이들 분자가 상기 설명한 바와 같이 유사한 조절에 민감할 수 있는지의 가능성을 연구하기 위해서, 테스트 화합물의 라이브러리는 gpIb에 대한 vWf 결합을 조절할 수 있는 성능에 대하여 테스트하였다.
둥근-바닥(RB) 유리 플레이트는 CMF-PBS 중의 1 ㎍/㎖ 소 vWf(bvWf)의 50 ㎕로 40℃에서 밤새 코팅하였다. 대조 웰은 vWf 5 ㎍/㎖를 사용하여 50 ㎕/웰로 코팅하거나, 또는 10 ㎍/㎖의 피브리노오겐을 사용하여 코팅한 웰을 포함하였다. 다음날, 플레이트는 CMF-PBS 200 ㎕로 1회 세척하고, 2.5% 겔라틴 200 ㎕를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 차단처리하며, CMF-PBS 200 ㎕로 3회 세척하였다.
당단백질(GP) Ib-LX[참조: 크래머, J. Biol. Chem. 274:6097-6106 (1999)]를암호화하는 DNA에 의해 형질감염된 CHO 세포는 10% FCS, 항생물질, 글루타민 및 5-히드록시트립토판을 함유하고 400 ㎍/㎖ G418 및 200 및 200 ㎍/㎖ 제오신으로 보충된 DMEM/F12(Invitrogen) 중에서 성장시켰다. 융합성 세포는 CMF-PBS로 1회 세척하고, 항온처리기에서 5 분 동안 가온한 베르센(Versene)으로 항온처리하였다. 세포는 수집하고, 4 mM EDTA를 함유한 티로드 용액(Tyrode's solution) 중에 2 ×106세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다.
테스트 화합물의 라이브러리는 티로드/EDTA 중에 희석하여 20 μM으로 만들고, 이 희석된 화합물 50 ㎕는 각각의 웰에 첨가하여 최종 농도 10 μM로 만들었다. 대조군의 경우, 1 ㎕ 100% DMSO는 300 ㎕ 세포에 첨가하여 DMSO의 최종 농도가 0.3%가 되도록 하였다. 공지된 vWf 억제제를 함유한 대조군에서는, 오린-트리카르복실산(ATA, Sigma)을 100% DMSO 중에 용해시켜 20 mM으로 만들고, 티로드/EDTA로 희석시켜 20 μM으로 만들어, 최종 농도 10 μM로서 50 ㎕/웰로 첨가하였다.
세포는 각각의 웰에 50 ㎕ 중의 105세포/웰의 밀도로 첨가하고, 플레이트는 실온에서 40 분 동안 진동시켰다. 비부착성 세포는 흡인에 의해 제거하고, 200 ㎕ CMF-PBS는 첨가하며, 플레이트는 와동시키며, 완충액은 제거하였다. 칼세인(calcein)을 첨가하고(2 μM 스톡의 50 ㎕/웰), 플레이트는 실온에서 1 시간 동안 항온처리하여 부착성 세포를 표지화하였다. 형광성은 부착성 세포를 정량화하기 위해서 밀리포어 사이토플루오르(Millipore CytoFluor) 2350 플루오리미터 상에서 측정하였다. IC50값이 20 μM 미만인 다수의 화합물이 동정되었다.
실시예 16
피브리노겐에 대한 CD11b-매개된 호중구 부착
ICAM-1에 대한 HL-60 세포의 CD18/CD11b-(Mac-1)-매개된 부착에 대하여 상기 설명한 부착 분석은 다음과 같은 변형을 이용하여 수행하였다. 각각의 웰은 4℃에서 글리코포린(10 ㎍/㎖), 피브리노겐(5 ㎍/㎖) 50 ㎕ 또는 50 mM 중탄산염 완충액(pH 9.6) 중의 항-CD18 모노클로날 항체(22F12C, 5 ㎍/㎖) 및 항-CD11b 모노클로날 항체(44AACB, 5 ㎍/㎖)를 사용하여 하룻밤동안 코팅하였다. 플레이트는 1% 인간 혈청 알부민을 사용하여 차단처리하였고, 차단 항체는 이용하지 않았다. 호중구는 밀도 구배 원심분리에 의해 새로운 헤파린 인간 전혈로부터 분리하였고, 각각의 웰에는 부착 완충액 중의 세포(4 ×106세포/㎖) 100 ㎕를 첨가하였다. 플레이트는 37℃에서 10 분 동안 항온처리하였다.
1000개 이상의 화합물이 스크리닝이 되었는데, 몇개의 화합물은 IC50값이 1 μM 내지 40 μM였다. 9개의 화합물[화합물 S, 화합물 R, 화합물 N, 화합물 O, 화합물 P, 화합물 Q, 화합물 L, 화합물 V, 및 화합물 F]은 표 2에 기재되어 있는 바와 같이 10 μM 이하의 IC50값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 화합물 S(이것은 초기에 1 μM의 IC50을 나타내었음)를 기준으로 한 SAR 시험 후, 화합물에 있어서 억제 효능은 200 nM 미만으로 개선되었고(화합물 AA 및 화합물 AC의 경우), 몇 개의 화합물은 20 μM에서 완전한 억제를 나타내었다(화합물 Z에서 화합물 AM에 이르는 화합물의 경우). 화합물 Z를 제외하면, αEβ7/E-카드헤린을 억제시킬 수 있는 성능에 대하여 선택된 모든 화합물은 또한 다른 β7인테그린, α4β7에 대해 길항작용하였다. 이들 화합물은 또한 αLβ2, αdβ2및 α4β1에 대한 최소 억제 활성을 나타내었다. 또한, αEβ7/E-카드헤린과 비교하여, 이들 화합물은 αMβ2및 αVβ3에 대하여 (2배 미만의) 제한된 선택성을 나타내었다.
실시예 17
Rac1 구아닌 뉴클레오티드 교환 반응의 억제제 개발
Rac 단백질은 GDP에 결합되었을 때 비활성이지만, GDP의 GTP로의 교환에 의해 활성화된다. Rac 단백질에서 GDP의 GTP로의 교환은 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF), 예컨대 Vav1 및 Tiam1에 의해 촉매 활성화된다[참조: 아그해즈데흐 등, Cell 102:625(2000); 워씨레이크 등, Nature 408:682 (2000)]. 세포 증식의 제어에서 Rac 단백질의 중요성 때문에, Rac 구아닌 뉴클레오티드 교환 반응의 길항물질과, 특히 Tiam1의 존재 하에 Rac1의 GDP의 GTP로의 교환을 방해하는 소분자는 본 발명의 방법 및 조성물에 상당히 중요한 것이다.
A. Rac1 및 Tiam1의 클로닝 및 발현:
Rac1 및 Tiam1의 DH-PH는 표준 재조합 DNA 절차를 이용하여 클로닝하였다[참조: 디스버리 등, J. Biol. Chem. 264: 16378 (1989)]. Rac1은 앞에서 설명한 방법에 따라 벡터 pGEX2T를 사용하여 GST 융합 단백질로서 이. 콜리 중에서 발현시켰다[참조: 셀프 및 홀, Meth. Enzymol. 256:3 (1995)]. 정제된 트롬빈-절단된 Rac 단백질을 상기 분석에 사용하였다.
Tiam1 DH-PH 도메인은 문헌[참조:로스만 및 캠펠, Meth. Enzymol. 325:25 (2000)]에 설명된 플라스미드 pET28a를 사용하여 카르복시 말단 6 × His 태그를 함유하는 융합 단백질로서 발현시켰다.
B. 구아닌 뉴클레오티드 교환 분석:
Rac1의 GDP의 GTP로의 Tiam1-촉매 활성화된 교환은 기본적으로 문헌[참조: 크롬프톤 등, J. Biol. Chem. 275(33): 25751 (2000)]에 설명된 절차에 따라 수행하였다. GDP-결합된 Rac1은 Tiam1의 존재 하에 [α32P]-표지된 GTP로 항온처리하였고, 뉴클레오티드 교환은 Rac1에 결합된 방사능의 증가를 추적함으로써 모니터링하였다. 유리 방사능은 96-웰 플레이트의 웰 내에 반응 혼합물을 배치하고, Rac1에 결합되지 않은 [α32P]GTP의 분획을 여과함으로써 제거하였다. 뉴클레오티드 교환 길항물질에 대한 스크리닝 동안에는 화합물을 10 μM 농도로 사용하였다. 이하, 스크리닝 방법을 기술한다.
C. 세포 증식 분석:
래트 배아 섬유아세포(REF) 및 주르카트(Jurkat) 세포는 세포 증식에 미치는 Rac1 구아닌 뉴클레오티드 교환 억제제의 효과를 테스트하기 위해서 섬유아세포 및 T 세포의 대표로서 각각 선택하였다. 배지 RPMI("REF-R 세포 배양물") 중에 배양된 REF는 문헌[참조: 노베스, Meth. Enzymol. 325:441 (2000)]에 설명된 바와 같이 얻었다. 완전 RPMI 및 10% 태아 소 혈청(FBS) 중의 REF-R 또는 주르카트 세포는 96웰 플레이트에서 10 ×103세포/웰로 이중 평판배양하였다. 1 시간 후(주르카트의 경우), 그리고 45 시간 후(REF-R의 경우), Aalama Blue(Serotec)를 첨가하고, 세포를 항온처리기(37℃, 5% CO2)에 복귀시켜 3 시간 동안 추가로 항온처리하였다. 결과는 SpectraMaxGEMINI(Molecular Devices)를 사용하여 얻었다.
Rac1 구아닌 뉴클레오티드 교환 반응을 대조예의 50% 이상으로 억제시키는 화합물을 얻었다. 몇개의 화합물의 IC50값은 Tiam1의 존재 하에 Rac1의 구아니딘 뉴클레오티드 교환 반응에 대하여 결정하였다. 표 8에 도시된 5가지 구조는 가장 강력한 억제제를 나타내며, 이들 화합물의 경우 구아닌 뉴클레오티드 교환 반응에 대한 IC50값도 상기 표에 포함되어 있다.
[표 8]
화합물 IC50(μM)
AY 1.9
AZ 3.1
AAA 3.5
AAB 4.7
AAC 5
시예 18
박테리아 단백질의 억제
로스만 폴드 구조를 함유하는 3가지 미생물 효소는 테스트 화합물의 라이브러리를 사용하여 스크리닝하기 위한 후보로서 동정하였다. 선택은 (i) 로스만 구조의 존재, (ii) 원핵 세포 및 진핵 세포에서의 발현 패턴, (iii) 임상적 중요성 및 (iv) 박테리아 성장 및 생존에 대한 기능적 중요성을 근거로 하였다. 선택된 단백질 중 2가지, 즉 디히드로디피콜리네이트 리덕타제(DHPR 또는 DapB) 및 엔오일-acp 리덕타제(ENR)는 NADH의 기질로의 전자 전달을 촉매 활성화하고, 각각 라이신 합성 및 지방산 합성을 위한 생합성 경로에 필수적이다. 제3 단백질 및 제4 단백질, 즉 이. 콜리 ras-유사 GTPase(ERA-GTAse) 및 yihA(또는 GTPase)는 해독 및 세포 주기 조절과 관련이 있다.
DapB 활성의 조절은 아스파테이트 세미알데히드로부터 디히드로디피콜레이트의 합성을 포함하는 광학 분석을 이용하여 평가한다. 상기 분석은 디히드로피콜레이트 신타제(DapA)를 사용하여 우선 디히드로피콜네이트를 합성하고, 이어서 NADH 및 DapB를 첨가한다. 디히드로피콜레이트는 불안정한 화합물이므로 반드시 커플링 반응이 필요하다. NADH에서 NAD+로의 전환을 발생시키는 테스트 화합물의 존재 또는 부재 하에서의 흡광도 변화는 340 nm에서 모니터링한다.
ENR의 조절자의 동정은 유사한 방식이지만, 단일 단계 반응으로 수행한다. 개략적으로, NADH 및 ENR을 우선 항온처리하고, 이어서 기질(크로토닐-CoA 또는 크로토닐-ACP)을 첨가한다. 마찬가지로, NADH의 NAD+로의 전환을 발생시키는 테스트 화합물의 존재 유무 하에서의 흡광도 변화는 340 nm에서 모니터링한다.
광학 분석이 다량의 기질, 즉 크로토닐 CoA를 필요로 한다는 점, 및 몇개의 테스트 화합물이 NADH와 동일한 파장에서 흡수된다는 점에 비추어 볼 때, 대안적인 박막 크로마토그래피(TLC) 및 플레이트계 분석은 방사능 표지된 NADH를 사용하여 ENR의 조절자를 동정하기 위해 설계하였다.
TCL 방법은 5 분 내지 10 분의 운전 시간 후 PEI 막 상에서 2가지 상태를 분리시키는 염화리튬의 존재 하에 P32-NADH의 NAD+로의 전환을 측정한다. 방사능 표지된 스폿(spot)은 스톰 포스포이미저(Storm Phosphoimager) 상에서 측정하고, NAD+대 NADH의 비율을 계산한다. 테스트 화합물의 존재 하에 NADH 대 NAD+의 비율은 전환 억제율을 나타낸다. 제어 반응은 선형 범위의 전환율을 측정하기 위해서 최적화된다. 이러한 분석의 실제 적용은 시판되는 효소 억제제를 사용하여 입증하였다. TLC 방법은 소규모 스크리닝에 특히 유용하다.
대규모 스크리닝의 경우, 플레이트계 분석은 동일한 시약을 사용하도록 설계한다. 이 분석은 분리를 허용할 수 있는 NADH와 NAD+간의 전하 차를 이용한다. 양전하를 띠는 DEAE-셀룰로즈 막은 NAD+보다 더 큰 순 음전하를 갖는 P32-NADH를 선택적으로 포획하는 데 사용한다. 이 포획된 NADH는 섬광 계수법을 이용하여 검출하고, 테스트 화합물의 존재 하에 증가된 신호는 효소 억제를 나타낸다.
ERA-GTPase의 경우에는 1 단계 분석을 수행하여 조절자를 확인한다. GTP에서 GDP로의 전환에 있어서 표지된 인의 전달은 테스트 화합물의 존재 또는 부재 하에 측정하고, 표지는 해당 기술 분야에서 일상적으로 실시되는 분석을 이용하여 섬광 계수기에서 검출한다. 또한, ERA GTPase 분석은 yihA 조절자에 대한 스크리닝에서 이용될 수 있다.
실시예 19
HPPK 길항물질의 동정
효소 6-히드록시메틸-7,8-디히드로프테린 피로포스포키나제(HPPK)는 드 노보 엽산염 생합성 캐스케이드의 일부이고, ATP로부터 6-히드록시-7,8-디히드로프테린(HMDP)으로의 피로포스페이트의 전달을 촉매 활성화한다[참조: 리치니 등, J. Biol. Chem. 244: 1582-1592 (1969)]. HPPK는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 곰팡이 및 원생동물에서 발현되지만, 고등 진핵생물에서는 발현되지 않는다.
1. 이. 콜리 HPPK 유전자의 분리:
이.콜리 HPPK 유전자는 이.콜리 게놈 DNA를 HPPK 유전자의 5'(서열 번호 28) 말단과 3'(서열 번호 29) 말단에 특이적인 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머로 PCR 증폭시킴으로써 분리하였다:
5'EcHPPK 5'-GTAGATGACAGTGGCGTATATT-3' 서열 번호 28
3'EcHPPK 3'-GCCTTACCATTTGTTTAATTTGT-3' 서열 번호 29
PCR은 퍼킨 엘머 시터스(Perkin Elmer Cetus)(캘리포니아주 포스터 시티 소재 PE Applied Biosystems) DNA 열 사이클러에서 표준 조건 하에 수행하였다. 일반적으로, 문헌[오스우벨 등, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, p.15.1.1-p.15.1.15(1999)]을 참조할 수 있다. 이어서, 증폭 생성물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하여 PCR 생성물의 대략적인 크기를 결정하였는데, 예상한 바와 같이 대략 487 bp의 단일 DNA 단편이 검출되었다.
HPPK PCR 생성물은 제조사의 프로토콜에 따라 벡터 pCRII-TOPO(캘리포니아주 칼스베드 소재 Invitrogen Corp.)에 연결하였다. 이. 콜리 균주 TOP10(캘리포니아주 칼스베드 소재 Invitrogen Corp.)는 제조사에 의해 권장되는 바와 같이 연결 반응의 분취물로 형질전환시키고, 단일 박테리아 콜로니는 분리하여 100 ㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 LBM 배지에서 하룻밤동안 성장시켰다.
플라스미드 DNA는 위자드 플러스 미니프레 키트(Wizard Plus Miniprep Kit)(위스콘신주 매디슨 소재 Promega Corp.)를 사용하여 단일 콜로니의 2 ㎖ 배양물으로부터 분리하였다. 플라스미드 pCRII-TOPO/EcHPPK에서 이.콜리 HPPK 생성물의 DNA 서열은 서열 번호 30으로 제시된 아미노산 서열을 갖는 것으로 정확하게 결정되었다.
2. His(6)-HPPK 발현 구성물의 생성:
이.콜리 HPPK의 정제 및 검출을 용이하게 하기 위해서, 후속적인 PCR 증폭 동안 이.콜리 HPPK 암호 서열에 다음과 같은 변화를 부여하였다: 1.) HPPK의 아미노 말단을 변경하여 추가 6 히스티딘 잔기를 혼입시키고, 2.) 독특한 제한 부위를암호 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 첨가하여 PCR 단편을 발현 벡터 pBAR5 내로 서브클로닝하는 것을 용이하게 하였다. 유사한 PCR 단편을 발현 백터 내로 서브클로닝하기 위한 방법은 본 명세서에 참고 인용하고 있는 미국 특허 제5,847,088호(1998년 12월 8일에 특허 허여됨)의 실시예 8에 이미 기술되어 있다. 5' PCR 프라이머는 하기 도시되는 바와 같이NcoI 제한 부위와 이에 따른 추가 아미노산 잔기 "MGHHHHHHGG"(서열 번호 31)를 암호화하는 서열을 포함하였다:
5'EcHisHPPK 서열 번호 32
5'-CGCCATGGGCCACCACCACCACCACCACGGCGGCGGCATGACAGTGGCGTATATT-3'
3'PCR 프라이머는 XhoI 제한 부위를 포함하였고, 하기 도시한 바와 같다:
3'EcXhoHPPK 서열 번호 33
5'-CGGCTCGAGTTACCATTTGTTTAATTTGT-3'
이들 프라이머를 사용하여, 487 bp HPPK PCR 생성물은 표준 PCR 증폭 반응으로 증폭시켰고, 반응의 분취물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 예상된 크기에 상응하는 대략 519 bp의 단일 밴드가 검출되었다. PCR 증폭 생성물은 QIAquick PCR Purification Kit(캘리포니아주 발렌시아 소재 QLAGEN Inc.)를 사용하여 정제하였고, 제한 효소 NcoI 및 XhoI로 분해하였다. 이 분해된 PCR 생성물은 NcoI-분해 및 XhoI-분해 플라스미드 pBAR5 내로 연결하였고, 연결 반응의 분취물은 제조사의 프로토콜(캘리포니아주 칼스배드 소재 Invitrogen Corp.)에 따라 TOP10 박테리아를 형절전환시키는 데 사용하였다. 단일 콜로니는 카르베니실린을 함유하는 LBM 아가 플레이트 상에 평판배양한 후 분리하였다. 몇개의 단일 콜로니는 카르베니실린을 함유하는 LBM의 2 ㎖ 배양물 중에서 하룻밤동안 성장시켰고, 플라스미드 DNA는 앞에서 설명한 바와 같이 DNA 서열결정을 위해 분리하였다. 플라스미드 pBAR5/HisHPPK는 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 His(6)-HPPK 유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한 것으로 나타났다.
3. HisHPPK 발현:
플라스미드 pBAR5/HisHPPK는 표준 방법을 이용하여 이.콜리 균주 BL21(DE3)pLysS(위스콘신주 매디슨 소재 Novagen Inc.)를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환체는 플라스미드 pLysS 및 pBAR5/HisHPPK에 대하여 각각 선택하도록 클로람페니콜 및 카르베니실린을 모두 함유하는 LBM 플레이트 상에 평판배양한 후 선택하였다. 플라스미드 pLys는 T7 리소좀을 암호화하는 플라스미드이다. 리소좀의 존재는 동결-해동 주기를 수행하는 세포 용해에 도움을 준다.
HisHPPK의 대규모 발현을 개시하기 위해서, pBAR5/HisHPPK를 함유하는 BL21(DE3)pLysS의 배양물 50 ㎖는 카르베니실린 및 클로람페니콜을 함유하는 LBM 중에서 진탕시키면서 30℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 다음날, 하룻밤동안 성장시킨 배양물 10 ㎖는 카르베니실린 및 클로람페니콜에 의해 보충된 LBM 500 ㎖를 함유하는 2 ℓ들이 플라스크를 접종하는 데 사용하였다. 이 플라스크는 박테리아 배양물이 대략 0.6의 OD600에 도달할 때까지 진탕시키면서 37℃에서 항온처리하였다.
플라스미드 pBAR5/HisHPPK는 HisHPPK 유전자의 아라비노즈-유도성 프로모터 상류를 함유한다. 일단 배양물이 적당한 밀도에 도달하면, 아라비노즈는 HisHPPK발현을 유도하기 위해서 배양물에 첨가하여 0.1%의 최종 농도로 만들고, 플라스크는 2.5 시간 더 진탕시키면서 37℃에서 항온처리하였다. 이어서, 박테리아는 원심분리에 의해 수집하고, 박테리아 배양물 1 ℓ로부터 얻은 세포 펠릿은 용해 완충액[50 mM Na2HPO4, pH 8, 50 mM 이미다졸, 10 mM β-머캅토에탄올, 0.5 M NaCl, 및 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제(인디애나주 인디아나폴리스 소재 Roche Molecular Biochemicals)] 중에 재현탁시켜 최종 부피 35 ㎖로 만들었다. 각각의 박테리아 현탁액 35 ㎖는 50 ㎖ 들이 폴리프로필렌 튜브에 옮기고, 드라이 아이스 상에서 급속 동결시킨 후, -20℃에서 저장하였다.
4. HisHPPK의 정제:
각각의 35 ㎖ 분취물은 얼음 상에서 해동시키고, 프렌취(French) 프레스 내에서 용해시켰다. 가용성 단백질 분획을 나타내는 처리한(cleared) 용해물을 얻기 위해서, 용해물은 4℃에서 20,000 ×g으로 30 분 동안 원심분리하였다. HisHPPK는 2단계 절차를 이용하여 정제하였다.
먼저, 비특이적으로 Ni-NTA 아가로즈(캘리포니아주 발렌시아 소재 QIAGEN Inc.)를 결합하고 있는 박테리아 단백질은 EDTA로 미리 처리하여 결합된 Ni2+양이온을 제거해 놓은 NTA 아가로즈와 함께 처리한 용해물을 항온처리함으로써 제거하였다. NTA 수지를 원심분리에 의해 제거한 후, 처리한 용해물의 35 ㎖는 4℃에서 대략 1 시간 동안 NTA 아가로즈 1 ㎖와 함께 회분식으로 항온처리하였다. HisHPPK는 제조사의 프로토콜(캘리포니아주 발렌시아 소재 QLAGEN Inc.)에 따라 Ni-NTA 아가로즈 상에서 정제하였다. 이 분리된 HisHPPK 단백질은 12% Novex 겔(캘리포니아주 칼스배드 소재 Invitrogen Corp.) 상에 재용해시키고, 겔은 고정시키며, 표준 조건 하에 선명한 쿠마지 블루로 염색하였는데, HisHPPK 제제 내에 확인된 유일한 단백질은 질량이 약 19 kD인 단일 종이었으며, 상기 질량이 HisHPPK의 예상된 크기와 일치하였다. 단백질은 20 mM Tris, pH 8에 대하여 투석하고, 분취하며, -70℃에 저장하였다.
5. HPPK 활성에 대한 스크리닝 분석:
HPPK의 소분자 억제제를 동정하기 위해서, HPPK에 대해 6-히드록시메틸-7,8-디히드로프로테인(HMDP)의 피로포스포릴화의 부산물로서 ATP의 AMP로의 HPPK 의존성 전환을 측정하기 위한 분석을 이용하였다[참조: 쉬 등, J. Med. Chem. 44: 1364-1371 (2001)]. 양쪽 기질(HMDP 및 ATP)의 상승된 농도는 기질 경쟁자를 동정하는 가능성을 감소시키기 위해 분석에 사용하였다. 이 반응은 다음과 같이 96-웰 V-바닥 폴리프로필렌 플레이트에서 사용하기 위해 변형하였다.
다음과 같은 조성, 즉 50 mM Hepes, pH 8.5, 100 μM HMDP(스위스 조나 소재 Schircks Laboratories), 10 mM MgCl2, 35 μM 아데노신 트리포스페이트, 및 γ-표지된32P-ATP(일리노이주 알링톤 하이츠 소재 Amersham Pharmacia Biotech)를 함유하는 매스터 혼합물을 제조하였다. 매스터 혼합물의 분취물은 96웰 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 또한, 분석 플레이트에 후보 억제제 화합물 5 ㎕/웰을 최종 스크리닝 농도 20 μM로 첨가하였다. 각각의 후보 화합물은 분석 플레이트에 참가하기 전에 DMSO 중에 희석시키고, 최종 분석 혼합물 중의 DMSO의 최종 농도는 5%이었다. 반응은 정제된 HisHPPK의 100 ng을 첨가하여 항온처리하는데, 37℃에서 15 분 동안 진행시켰다. 반응은 동일한 부피의 120 mM EDTA를 각각의 웰에 첨가함으로써 정지시켰다. AMP로부터 방사능 표지된 ATP를 해상하기 위해서, 반응 부피 2 ㎕를 PEI 셀룰로즈 플레이트 상에 스폿팅하였고, 플레이트를 0.3M KH2PO4로 현상하였다. 플레이트의 방사능은 시스템, 즉 Molecular Dynamics Storm 860 Phospor 이미저 시스템(캘리포니아주 써니베일 소재 Molecular Dynamics Storm)을 사용하여 측정하였다. 화합물의 존재 하에 HPPK 효소 활성은 DMSO-단독 대조 반응에 비하여 이중 테스트 샘플에서 표지된 ATP에서 AMP로의 전환율으로부터 추측하였다. 기질이 부족한 샘플의 비특이성 백그라운드가 1% 미만이었기 때문에, 보정은 하지 않았다. 대략 2,520개의 화합물을 스크리닝되었고, 대략 58개의 화합물이 55% 이상으로 HPPK 활성을 억제하였으므로 적중률은 2.3%이었다. 이들 화합물은 IC50결정 값으로 시험관내 효능에 대한 순위를 정하였다.
6. 이.콜리 TolC의 박테리아 성장에 미치는 HPPK 길항물질의 효과:
미량역가 브로스 분석을 이용하여 이.콜리의 성장을 억제시키는 데 요구되는 최소 억제 농도(MIC)는 HPPK 적중의 생체내 활성을 결정하기 위해 측정하였다. MIC는 DMSO-단독 대조군과 비교하여 성장을 80% 감소시키는데 요구되는 최소 농도로서 정의한다. 보다 구체적으로, 이들 화합물의 효능은 TolC 유전자 내의 돌연변이를 함유하는 이.콜리 균주에 대하여 측정하였다. TolC 유전자는 박테리아 시토졸로부터 단백질 독소 및 항생물질과 같은 소분자의 배출을 용이하게 하는 경세포질 유출 펌프(transperiplasmatic efflux pump)를 암호화한다[참조: 앤더슨 등, Curr. Opin. Cell. Biol. 13:412-416 (2001)]. 이 돌연변이가 박테리아 내로 화합물이 진입하는 데 아무런 영향을 미치지 않지만, 유출 펌프를 통해 제거되는 경향이 있는 일부 화합물은 TolC 돌연변이체 내의 세포내 농도를 달성할 수 있다. 모든 미량역가 브로스 분석은 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)[Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; approved standard-5th Edition. Vol. No. 2. NCCLS Guidelines. Wayne, Pennsylvania (2000)]에 의해 확립된 프로토콜에 의해 수행하였다.
미량역가 브로스 분석은 저농도의 티미딘을 함유하는 Mueller-Hinton 브로스에서 수행하였다. 박테리아 배지 중의 티미딘의 존재는 항엽산염, 즉 트리메토프림 및 설파메톡사졸의 활성에 길항작용하고, 마찬가지로 또한 HPPK 억제제에 길항작용한다.
화합물은 미량희석(microdilution) 플레이트에 첨가하기 전에 DMSO 중에 2배로 연속 희석하였다. 각각의 플레이트는 2개의 대조군을 함유하였다: 트리메토프림의 연속 희석액은 각각의 플레이트에 양성 대조예를 제공하였고, 미접종된 Mueller-Hindon 브로스를 함유하는 제2 열은 웰들 간의 교차오염을 모니터링하는 데 멸균성 대조군으로서 작용하였다. 접종 밀도는 최종 부피 100 ㎕ 중에 대략 105박테리아/㎖였다. 플레이트는 OD600를 측정하기 전에 16 시간 동안 항온처리하였다.
MIC 분석에서 가장 큰 활성을 갖는 4개의 화합물은 표 9에 기재하였다. 이.콜리 TolC에서 이들 화합물의 최소 억제 농도는 0.1-12.5 μM이었다. 그러나, MIC 분석은 작용의 정균성 모드와 살균성 모드 간을 구별하지 않을 뿐만아니라, 이들 화합물이 생체내에서 HPPK를 선택적으로 억제하는지의 여부를 결정하지 못한다. 실험은 이들 화합물이 항엽산염 활성을 갖고 있는지의 여부 및 생체내에서 HPPK를 억제하는지의 여부를 결정하기 위해 현재 진행중에 있다. 통상적인 항엽산염, 예컨대 트리메토프림 및 설파메톡사졸의 활성이 박테리아 배지 중의 티미딘의 존재로 인하여 길항작용된다는 점은 잘 확립되어 있다[참조: 아미에스 및 스미스, J. Med. Microbiol. 7(2):143-153 (1973)]. Mueller-Hinton 배지 단독 또는 티미딘을 함유한 배지로 보충 처리한 상기 배지 중에서 각 화합물에 대한 MIC를 결정하는 실험은 앞으로 수행할 것이다. 디아릴설파이드 화합물이 생체내에서 HPPK를 억제시킨다면, 이들 화합물의 활성은 엽산염 최종 생성물 티미딘의 존재 하에 경감되어야 한다. 대안으로, 이들 화합물은 트리메토프림과 쌍을 이룰 때 박테리아 성장을 상승적으로 억제시킬 수 있는 능력에 대하여 분석할 수 있다. 상승효과는 단지 디아릴설파이드 화합물과 트리메토프림이 모두 동일한 생화학적 경로에 작용하는 경우에만 발생한다. 트리메토프림과 테스트 화합물의 조합 분석은 이들 화합물이 앞에서 설명한 바와 같이 미량역가 브로스 분석에서 박테리아 성장에 미치는 효과에 대하여 교차 적정되어 분석되는 경우 표준 "격자(checkerboard)" 연구에서 수행되고 있다[참조: 엘리오포울로스 및 모엘러링 쥬니어, Antimicrobial Combination, pp. 330-393, in Antibiotics in Laboratory Medicine, 4th Edition(V. Lorian ed., 1996)].
[표 9]
실시예 20
ftsZ 억제제의 확인을 위한 분석
ftsZ은 세포 분열에 관련된 필수 박테리아 유전자의 생성물이다. ftsZ은 GTP를 결합하여 가수분해하며, GTP에 결합하는 경우, 선형의 긴 중합체를 형성한다. ftsZ의 GTP-의존성 중합은 박테리아 세포 분열에서 그의 기능과 관련되어 있다. 격막 형성중 ftsZ는 세포 분열 평면을 한정하는 고리를 형성한다. ftsZ가 결여된 세포는 격막을 형성할 수 없으며, 분열하지 못해 사멸된다. ftsZ는 박테리아계 전체에 고도로 보존되어 있다(약 60%). 따라서, ftsZ 억제제는 새로운 작용 메카니즘을 가진 넓은 범위의 항생제를 의미할 수 있다. X-선 회절을 통해 결정된 바와 같이, ftsZ의 원자 구조는 ftsZ가 알파/베타 단백질임을 나타내고 있다[참조: Nogales 등, Nature Structural Biology 5: 451-458 (1998)]. ftsZ에 대해 가장 유사한 구조는 진핵생물 단백질인 튜불린인데, 이는 세포 분열중 기관과 염색체의 분리에 필수적인 역할을 수행하는 마이크로튜불린을 형성하기 위해 중합되는 GTP-결합 및 가수분해 단백질이다.
미량역가 웰에서 수행할 수 있는 ftsZ 억제제의 확인을 위한 중합 분석법이 개발되어 왔다. 상기 중합 분석법은 튜불린 중합 분석에 적용되며[참조: Bollag 등, Cancer Research 55: 2325-2333 (1995)], GTP에 의존하는 방식으로 ftsZ의 가역적인 중합을 포함한다.
GTP 및 10 mM CaCl2의 존재하에서, 5 nm ftsZ 선형 중합체는 0.2 ㎛ 필터에의해 포획되기에 충분히 큰 대형 중합체[참조: Yu 등, EMBO 16: 5455-5463 (1997)]내로 조립된다. 상기 필터 상에 유지되는 단백질은 염색할 수 있으며, 비색 분석으로 검출할 수 있다. 100 μM GTP에 의해 중합된 ftsZ 300 ㎍/ml로 이루어진 반응물을 10 μM에서 후보 ftsZ 억제제에 대해 스크리닝하였다.
또한, 감도가 더 좋을 수 있는 대안적인 분석법이 개발되었다. 이 분석법에서, ftsZ 100 ㎍/ml는 0.5 μM32P-γ-GTP와 함께 항온처리하였다. ftsZ의 GTPase 활성은32PO4를 방출하였다. 100 mM NaH2PO4내의 활성탄 25 mg/ml를 이용하여 반응을 종료시키고, 생성물을 원심분리함으로써, 잔류32P-γ-GTP는 챠콜에 의해 포획되었다. 따라서, 상청액내에 잔류하는32PO4를 측정하여 GTPase 억제를 측정할 수 있다. 이 스크리닝 분석은 ftsZ 억제제를 더 양호하게 확인할 수 있는데, 그 이유는 상기한 중합 스크리닝 보다 GDP에 의한 억제에 대한 감도가 상당히 좋기 때문이다(IC50이 8 μM 대 250 μM임).
실시예 21
ENR 억제제에 대한 스크리닝 분석
고순도의 비방사능 NADH를 이용하여 ENR 억제제에 대해 스크리닝하기 위한 분석법이 개발되었다. ENR의 분리는 문헌[참조: Baldock 등, Science 274: 2107 (1996)]에 기술되어 있다. 개략적으로 설명하면, ENR은 NAD+ 및 지방 아실-CoA를형성하기 위한 NADH 및 크로토닐-CoA의 전환 반응을 촉매하며, 상기 분석법은 제2 반응에서 생성된 NAD+의 양을 측정하는데, 이때 루시페라제는 NAD+를 NADH로 전환시킨다. 루시페라제 반응으로 인한 발광은 초기 반응에서 생성된 NAD+의 양에 비례한다. 후보 억제제 화합물은 ENR 반응에 첨가하고, 후보 억제제 화합물이 ENR 활성을 억제하는 경우, 루시페라제 반응에서 검출된 빛의 양은 감소된다.
상기 분석은 다음과 같이 수행하였다. 6 ng/㎕ ENR 또는 1웰당 총 120 ng을 함유하는 20 mM Hepes 내의 30 μM NADH(뵈링거 만하임) 20 ㎕ 및 DMSO내의 10 μM 후보 억제제 화합물 20 ㎕를 96웰 평 바닥 광학 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 300 μM 크로토닐-CoA(시그마, C6146) 20 ㎕를 첨가하여 상기 반응을 개시시켰다. 트리클로산은 양성 대조군으로 사용하였으며, 각각의 플레이트에 포함시켜 억제를 확인하였다. 스크리닝 분석에서, 트리클로산은 약 1 μM의 IC50으로 억제하였다.
상기 반응은 약 10분 동안 진행시켰는데, 이는 완료될때 까지 시간의 약 30%에 상응하는 것이다. 따라서, NAD+의 농도는 10분후에 약 3 μM이어야만 한다.
상기 시스템에 160 mM HCl 30 ㎕를 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 2 이하로 만들고, 잔류 NADH 기질을 제거하였다. 산 첨가후 반응 혼합물은 1분 동안 항온처리하고 잔류 NADH는 ADP-리보즈 및 니코틴아미드로 분해하였다. NAD+는 강산의 첨가에 실질적으로 영향받지 않았다.
바로 직전에 설명한 1분의 시간이 경과한 후, 상기 반응 혼합물에 알콜 데히드로게나제, 에탄올, FMN, FMN 옥시도리덕타제, 데카날 및 박테리아 루시페라제를함유하는 NADH 재생/루시페라제 용액 110 ㎕를 첨가하였다.
더 구체적으로, 300 mM 트리스(1 M, pH 7.5의 스톡 용액을 이용함), 비스(트리메틸실릴)아세트아미드("BMA") 0.26 중량%, 0.65 mM EDTA 및 18 mM KCl을 함유하는 완충 용액 110 ㎕내의 NADH 재생/루시페라제 용액을 제조하였다. 상기 용액 10 ml 마다 데카날(시그마, D7384, 순도 98%) 0.67 ㎕를 첨가하여 데카날 농도가 약 200 μM인 최종 용액을 생성하였다. 충분한 FMN(시그마 F8399)을 첨가하여 FMN 농도가 약 2 μM인 최종 용액을 제조하였다. 유사하게, 충분한 알콜(200 프루프)을 첨가하여 에탄올 농도가 약 100 μM인 최종 용액을 제조하였다. 상기 용액에 이들 시약 모두를 첨가한 후, 강하게 교반하였다.
상기 용액에 NADH:FMN 옥시도리덕타제(로슈, 476 480) 1.08 ㎕를 각각의 용액 10 ml에 첨가하여 효소 농도가 1.25 U/l인 최종 용액을 제조하였다. 박테리아 루시페라제(로슈, 476 498)를 첨가하여 약 4.5 ㎍/ml의 용액을 제조하였다. 유사하게, 알콜 데히드로게나제를 첨가하여 최종 농도가 0.7 U/ml인 용액을 제조하였다. 이들 시약을 첨가한 후, 혼합물은 거꾸로 들어 부드럽게 혼합하였다.
상기 분석을 통해 ENR 활성을 억제하는 약 100개의 화합물을 확인하였다. 이들 화합물중 약 50개의 화합물은 레디오미메틱 ENR 분석에서 상당한 억제 활성을 나타냈다. 상기 분석에서, 20 mM Hepes내의 30 μM32P-NADH 20 ㎕는 DMSO중의 10 μM 후보 억제제 화합물 20 ㎕ 및 1웰당 ENR 120 ng과 함께 항온처리하였다. 이어서, 300 μM 크로토닐-CoA(시그마, C6146) 20 ㎕를 첨가하여 반응을 개시시켰다.상기 반응의 생성물은32P-NAD를 포함하였다. 반응물32P-NADH 및 생성물32P-NAD는 서로 1 M LiCl내의 PEI-셀룰로즈 상에서 박층 크로파토그래피를 수행하여 분리하였으며, 방사능사진법으로 시각화하였다. 상기 반응의 정도는 NADH의 NAD로의 전환에 의해 측정하였다. 또한, 이들 화합물은 이. 콜리 성장의 억제에 대해 테스트하였다.
투과성 박테리아 균주(AB734 TN10::tolC)를 상기 스크리닝 분석에 사용하여 그람 음성 세포 벽을 가로지를 수 있는 화합물의 능력을 극대화시켰다. 분석은 본원에 참고 인용한 NCCLS 프로토콜에 따라 수행하였다.
또한, 항미생물 활성을 가진 이들 화합물이 ENR에 의존하는 방식으로 작용하는 지 여부를 결정하는 것도 관심의 대상이었다. 투과성 tolC 균주중 2개의 균주를 구성하였다. 첫번째 균주에서, ENR 단백질은 중간 정도의 사본수를 가진 플라스미드 상에서 그 자신의 프로모터의 조절하에 위치시켜 과발현시켰으며, 두번째 균주는 단지 플라스미드만을 포함하는 대조군으로 사용하였다. ENR을 표적화하는 후보 화합물은 상기한 첫번째 균주에 대한 활성은 매우 미약해야만 하는데, 그 이유는 상기 표적이 실질적으로 과발현되기 때문이다. 예를 들어, 상기 첫번째 균주에 대해 테스트하는 경우, 트리클로산에 대한 MIC는 31에서 1000 ng/ml로 이동하였다. 유사하게, 화합물 325084의 경우 MIC는 25 μM에서 100 μM 이상으로 이동하였는데, 이는 상기 화합물이 박테리아 성장중 ENR을 억제함으로써 그의 항미생물 작용을 나타내는 것을 의미한다. 그러나, 다른 화합물은 MIC에서 유사한 이동을 나타내지 않기 때문에, 이들 다른 화합물들은 아마도 상이한 메카니즘을 통해 박테리아 성장을 억제하는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 화합물 325085 및 325086은 화합물 325084와 유사한 구조를 보유하며, 또한 ENR에 대한 활성이 일부 입증되었다.
화합물 325084 및 트리클로산이 동일하거나 상이한 ENR 부위에서 작용하는 지 여부를 결정하기 위해, (i) 93번 잔기가 글리신에서 발린으로 치환되고, (ii) 효소 활성을 보유하며, (iii) 트리클로산에 민감하지 않은 재조합 ENR을 제조하였다. 이어서, ENR 억제제로서 확인된 화합물은 야생형 ENR 및 돌연변이 ENR을 이용하여 분석하고, 돌연변이 ENR 형에 대해 거의 또는 전혀 억제 활성을 나타내지 않는 화합물들은 아마도 ENR의 활성 부위에서 작용하며, 무시할 수 있다. 대안으로, 돌연변이 효소 및 야생형 효소를 억제하는 화합물들은 알로스테릭 부위에서 작용할 수 있으며, 추가로 연구될 것이다.
지금까지 특정 구체예를 기술했지만, 여러가지 변형 실시가 가능함을 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본원에 개시한 화합물에 있어서, 하나의 할로겐 치환체가 다른 상이한 할로겐 치환체로 치환될 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 이는 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부하는 특허청구의 범위에 의해 정해진다.

Claims (49)

  1. LFA-1 또는 이의 I 도메인 함유 단편이 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β 도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서,
    상기 제1 분자와, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 알로스테릭 효과기 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. LFA-1 또는 이의 I 도메인 함유 단편이 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β 도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서,
    상기 제1 분자와, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 디아릴 화합물을 포함하는 알로스테릭 효과기 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. LFA-1 또는 이의 I 도메인 함유 단편이 아니며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β 도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서,
    제1 분자와, 디아릴 설파이드 화합물 및 디아릴아미드 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되고 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 알로스테릭 효과기 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 분자내의 상기 로스만 폴드 구조는 321456 또는 231456 배향으로 위치된 β시트 스트랜드를 보유하는 β시트를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제1 분자내의 상기 로스만 폴드 구조는 3214567 배향으로 위치된 β시트 스트랜드를 보유하는 β시트를 포함하는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 제1 분자내의 상기 로스만 폴드 구조는 32145 배향으로 위치된 β시트 스트랜드를 보유하는 β시트를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 I 도메인 구조를포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내제 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 A 도메인 구조를 포함하는 것인 방법.
  10. 도 1에 도시한 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서,
    상기 제1 분자와, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 알로스테릭 효과기 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  11. 도 1에 도시한 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서,
    상기 제1 분자와, 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 디아릴 화합물을 포함하는 알로스테릭 효과기 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  12. 도 1에 도시한 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 90% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하며 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 α/β도메인 구조를 포함하는 제1 분자와 결합 파트너 분자간의 결합 상호작용을 조절하는 방법으로서,
    제1 분자와, 디아릴 설파이드 화합물 및 디아릴아미드 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되고 상기 알로스테릭 조절 부위와 상호작용하여 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 조절하는 상기 α/β 구조의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 알로스테릭 효과기 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 알로스테릭 조절 부위를 포함하는 로스만 폴드 구조를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제1 분자내의 상기 로스만 폴드 구조는 321456 또는 231456 배향으로 위치된 β시트 스트랜드를 보유하는 β시트를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 제1 분자내의 상기 로스만 폴드 구조는 3214567 배향으로 위치된 β시트 스트랜드를 보유하는 β시트를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 제1 분자내의 상기 로스만 폴드 구조는 32145 배향으로 위치된 β시트 스트랜드를 보유하는 β시트를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  22. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 I 도메인 구조를 포함하는 것인 방법.
  23. 제23항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  24. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 A 도메인 구조를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 분자는 LFA-1 I 도메인 아미노산 서열과 약 40 % 미만, 약 45 % 미만, 약 50 % 미만, 약 55 % 미만, 약 60 % 미만, 약 65 % 미만, 약 70 % 미만, 약 75 % 미만, 약 80 % 미만, 약 85 % 미만 또는 약 90 % 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 보유하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제10항 내지 제12항, 제15항 내지 제21항, 제23항 또는 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절자는 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 증가시키는 상기 제1 분자의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제1 분자와 상기 제2 분자간 결합의 증가가 상기 제1 분자의 증가된 효소 활성을 초래하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제10항 내지 제12항, 제15항 내지 제21항, 제23항 또는 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절자는 상기 제1 분자와 상기 결합 파트너 분자간의 결합을 감소시키는 상기 제1 분자의 리간드 결합 도메인내 정합을 촉진하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 분자와 상기 제2 분자간 결합의 감소가 상기 제1분자의 감소된 효소 활성을 초래하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제10항 내지 제12항, 제15항 내지 제21항, 제23항 또는 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 표 1에 적시한 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 분자는 진핵생물 분자인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제1 분자는 인간 분자인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 제1 분자는 원핵생물 분자인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 제1 분자는 박테리아 분자인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 제1 분자는 αMβ2, 보체 단백질 C2, 보체 단백질 인자 B, αEβ7, α4β7, αVβ3, α4β1, αdβ2, 폰 빌레브란트 인자, Rac-1, HPPK, ftsZ 및 ENR로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 αMβ2이고, 상기 결합 파트너 단백질은피브리노겐인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 αMβ2이고, 상기 결합 파트너 단백질은 iC3b인 방법
  38. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 αEβ7이고, 상기 결합 파트너 단백질은 E-카드헤린인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 α4β7이고, 상기 결합 파트너 단백질은 MAdCAM-1인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 αVβ3이고, 상기 결합 파트너 단백질은 비트로넥틴인 방법.
  41. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 α4β1이고, 상기 결합 파트너 단백질은 VCAM인 방법.
  42. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 αdβ2이고, 상기 결합 파트너 단백질은VCAM인 방법.
  43. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 폰 빌레브란트 인자이고, 상기 결합 파트너 단백질은 gpIb인 방법.
  44. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 보체 단백질 C2이고, 상기 결합 파트너 단백질은 보체 단백질 C4b인 방법.
  45. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 보체 단백질 인자 B이고, 상기 결합 파트너 단백질은 보체 단백질 C3b인 방법.
  46. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 Rac-1이고, 상기 결합 파트너는 GTP인 방법.
  47. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 HPPK이고, 상기 결합 파트너는 ATP 또는 HMDP인 방법.
  48. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 ftsZ이고, 상기 결합 파트너는 GTP인 방법.
  49. 제35항에 있어서, 상기 제1 분자는 ENR이고, 상기 결합 파트너는 NADH인 방법.
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