KR20030033283A

KR20030033283A - 텍토리게닌과 카이카사포닌 ⅲ의 제조방법 및항돌연변이제로서의 용도

Info

Publication number: KR20030033283A
Application number: KR1020010064861A
Authority: KR
Inventors: 박희준; 최종원; 이경태
Original assignee: (주)허벤텍
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2003-05-01

Abstract

본 발명은 이소플라보노이드와 사포닌 Ⅲ를 다량 함유하는 갈화 분획과 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ를 제조하는 방법과 그 새로운 용도인 항돌연변이 효과에 관한 것이다. 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ는 에임즈 테스트 (Ames test)에서 고도로 현저한 항돌연변이 효과를 나타내었으므로 항발암제 및 항암제로 사용될 수 있다. 이들을 함유하는 분획과 이들 성분은 아플라톡신 B₁과 MNNG에 대하여 고도로 현저한 항돌연변이 효과를 나타내었다.

Description

텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ의 제조방법 및 항돌연변이제로서의 용도 {Preparation of tectorigenin and kaikasaponin Ⅲ and use thereof as antimutagenic agent}

본 발명은 갈화로부터 항돌연변이 효과가 있는 유효성분 및 이를 함유하는 갈화 추출물의 추출방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 갈화로부터 용매추출한 항돌연변이 효과를 지닌 텍토리게닌과 카이카사포닌Ⅲ의 제조방법 및 이들의 용도에 관한 것이다.

암은 현대인의 건강을 위협하는 질병으로서 가장 치명적인 질환의 하나이다. 암은 암 발현 유전인자가 활성화되어 발생하는 것으로 그 첫 단계는 프로토온코진이 온코진으로 전환되면서 돌연변이가 유발된다. 암세포의 생성을 위한 일련의 과정에 대하여 생체내 각종의 항산화 효소계, 간-약물 대사계 (해독계효소들), 유전자수복효소 등 다양하게 관여하고 있으며 또한 이미 생성된 암세포에 대해서는 세포사멸 (apoptosis)에 의해 제거되는데 이에 관계하는 생체의 매개인자로는 종양-괴사 인자(Tumor-Necrosis-Factor)와 같은 것이 있다. 그러나, 발암을 위한 과도한 돌연변이 유발성 물질의 생체내 생성 혹은 외부로부터의 이입으로 생체가 이에 대응하지 못하게 될 때 암세포의 생성이 진행된다. 그러므로, 암의 조기발견시에는 기존의 항암에 관한 화학요법제로서 치료를 할 수 있다. 그러나, 많은 경우에 발암이 상당히 진행되어 악성종양으로 나타났을 때 발암이 확인되는 경우가 있으므로 이에 대한 암세포 전이 억제제 개발에 관한 연구가 진행되고 있다.

이러한 배경하에서 암세포의 조기발견이 어려운 실정이므로 암 화학 예방제 (cancer chemopreventives)의 개발도 상당히 활발히 진행되고 있다. 녹차나 커피가 암을 예방한다는 결과 등 각종의 언론매체를 통해 많은 것들이 알려지고 있다. 많은 생약의 이러한 효과들은 항돌연변이 효과에 기인한다. 그러므로, 와송에서의 항돌연변이물질, 결명자에서의 항돌연변이물질, 한국인진호에서의 항돌연변이물질 등이 알려지고 있다.

갈화 (Puerariae Flos)는 칡 (Pueraria thunbergiana, 콩과 (Leguminosae))의 꽃을 건조한 것으로 한방에서 지칭되는 용어이다. 칡의 뿌리는 갈근(Puerariae Radix)이라 하여 한방에서 해열진통, 소갈의 효과가 있다고 기록되어 있다. 이와 반면에 그 꽃의 부위를 사용하는 갈화는 소갈, 주독 등이 전통약물의 서적에 기록된 바 당뇨병과 알코올 해독효과가 있는것으로 믿어지고 있다. 본 발명자들은 소갈이라 기록되어 있음은 당뇨병의 치료와 관련이 있는 것으로 파악하고 있다. 당뇨병의 병리적 진행도 생체에서의 친전자성 물질 및 활성산소 등에 의해 일어나는 바 소갈약은 돌연변이를 효과적으로 저지할 수 있으리라 생각하기 때문에 갈화로부터 항돌연변이제를 개발하고자 하였다.

본 발명은 항돌연변이 효과가 우수한 갈화 추출물의 에틸아세테이트분획과 이 분획의 유효물질인 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 분획 또는 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ를 돌연변이유발 저해용의 조성물을 제공한다.

본 발명은 항돌연변이 효과를 지닌 유효성분 및 이를 함유한 갈화 추출물의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 항돌연변이 효과를 지닌 유효성분은 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ이다.

갈화의 기원식물인 칡은 한국의 전역에 널리 자생하며 한국 뿐 아니라 중국, 일본에서도 널리 자생하고 있다. 한방에서 갈근은 감기를 치료하기 위하여 해열진통의 목적으로 사용되는 반면 갈화는 당뇨병과 알코올 해독에 사용되고 있다. 근래에는 갈화의 추출물을 이용한 음료로 알코올 해독을 위한 음료로 몇몇 식품회사에서 시판하고 있다. 그러나, 발명자들은 이러한 갈화가 한방 소갈약으로서 당뇨에 작용하리라 판단을 하고 있기 때문에 이 생약이 돌연변이를 저해하는 특성을 나타내리라는 가설을 세우고 실험을 하였다. 발명자들은 이미 갈화에서 분리한 성분이 지질과산화를 저해하는 특성을 보고했기 때문에 이러한 성분들이 돌연변이를 저해하는 특성을 나타내리라는 추측을 하였다.

본 발명의 갈화 추출물은 칡의 꽃을 건조시켜 사용하거나 또는 건조시키지 않은 상태로 사용할 수도 있다. 바람직하게는 갈화의 시료는 건조한 것이 간편하다.

본 발명에 따른 갈화 추출물은 갈화에 추출용매를 첨가하여 가열 추출한다. 추출용매로는 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 사용한다.

에틸아세테이트로 분획한 갈화 분획물에서 5가지의 성분을 분리하였고 융점, IR 스펙트럼,¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼, 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 등의 분석에 의하여 각각 텍토리게닌, 글리시테인, 텍토리딘, 글리시틴, 카이카사포닌 Ⅲ으로 동정하였다.

텍토리게닌은 현재 이 등에 의해 동물실험에서 스트렙토조토신으로 유발한 혈당과 혈청지질의 상승을 크게 억제한다고 보고하였을 분만 아니라 동 연구에서 지질과산화억제 효과와 세포보호효과를 나타낸다고 하였다. 카이카사포닌 Ⅲ도 유사효과가 있으나 in vitro에서 지질과산화억제효과 실험에서 그 결과가 관찰되지 않은 점은 텍토리게닌의 활성과 차이가 있다. 텍토리게닌의 유사물질인 게니스테인은 오랫동안 항암작용을 갖는 이소플라본화합물로 알려져 있으며 이러한 성분은 지질대사에도 관여하여 LDL-콜레스테롤을 감소시킨다는 보고도 함께 알려져 있다. 그러나, Lee 등은 세포분화및 세포사멸유도작용에 대해서도 보고하였다. 게니스테인과 같은 이소플라보노이드는 주로 콩과식물에서 압도적으로 많이 분포하고 특히 콩에 많이 함유되어 있는 것으로 나타나 있다.

갈화에서 이소플라보노이드 성분들이 이미 보고되어 있음에도 불구하고 갈화의 항돌연변이 활성성분의 추적에 관한 연구는 본 발명이 처음으로서 활성성분으로 중요한 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ의 항돌연변이 효과는 이전의 어떤 보고에서도 찾을 수가 없다. 또 이소플라본 배당체들은 그 비당체의 약효에 미치지 못하고 이들은 사람이 갈화 추출물을 복용할 때 장내미생물에 의해 전환하여 활성성분인 비당체로 된다. 그러므로, 이러한 배당체를 가수분해하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하면 다량의 텍토리게닌을 얻을 수 있음을 발명하였다. 또한, 부탄올 분획을 농축하고 메탄올을 가하면 다량의 순수한 텍토리딘을 얻을 수 있다. 여기서 얻어진 텍토리딘을 산가수분해하여 용매분획법으로 텍토리게닌을 얻을 수가 있다. 한편, 부탄올 분획과 에틸아세테이트 분획을 합하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 카이카사포닌 Ⅲ를 보다 많은 양을 얻을 수 있다.

에임즈 테스트에서는 항돌연변이 실험을 수행하기 위해 돌연변이 유발제를 사용하는 살모넬라 티피무리움의 돌연변이 정도와 시료를 전처리한 군의 돌연변이 정도를 관찰함으로써 그 효과를 알 수가 있다. 스폰테이니어스 군은 자연발생의 돌연변이를 나타내는 것이다. 아플라톡신과 같은 크세노바이오틱스(xenobiotics)는 간 호모게네이트(S9 mix)에 의해서 활성화되어 돌연변이를 유발하지만 MNNG는 그러한 과정의 필요가 없이 돌연변이를 나타내기 때문에 후자를 간접 돌연변이원이라고 부르고 있다. 표-1에서 나타내었듯이 갈화의 메탄올 추출물은 농도의 증가에 따라 항돌연변이 효과가 증가되고 있음을 보여 주었다. 1.0 mg/plate에서 78%의 항돌연변이 효과를 나타내었다. 특히, 항돌연변이 효과의 실험에서는 이와 같은 농도의존적 활성이 매우 중요하다. 왜냐하면 저농도에서는 항돌연변이 효과를 나타내지만 고농도에서는 오히려 돌연변이원성 효과를 나타내는 경우도 있기 때문이다. 따라서 이 사실은 갈화 알코올 추출물이 항돌연변이 효과를 나타내고 농도를 증가시켜도돌연변이원성 효과를 나타내지 않는다는 것을 의미한다. 이 알코올 추출물의 분획들이 아플라톡신으로 유발한 돌연변이를 강하게 저해하으며, 특히 에틸아세테이트의 분획이 가장 강한 효과를 나타내었다. 이 분획은 농도의존적 효과를 나타내었을 뿐 아니라 1.0 mg/plate 처리군에서는 95%의 저해율을 나타내었다.

한편 MNNG로 유발한 돌연변이에 대하여 메탄올 추출물은 아플라톡신으로 유발한 돌연변이의 경우보다 낮은 효과를 나타내었다. 그러나, 이 경우에도 에틸아세테이트 분획이 가장 현저한 효과를 나타내었다. 그러므로, S-9 분획의 존재 없이도 직접적인 돌연변이를 차단하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

본 실험의 결과까지는 에틸아세테이트 분획이 가장 돌연변이를 저해하는 효과가 크게 나타났다. 그러므로 에틸아세테이트에서 분리되어진 다섯가지의 성분에 대해서 아플라톡신 B₁과 MNNG의 돌연변이원성을 저해하는 효과를 각각 측정하였다.그 결과 카이카사포닌 Ⅲ가 가장 강한 효과를 나타내었고 다음으로 이소플라본인 텍토리게닌과 글리시테인이 유사한 효과를 나타내었다. MNNG에 대한 항돌연변이 효과가 텍토리게닌 쪽이 글리시테인쪽 보다높은 활성을 보였다. 카이카사포닌 Ⅲ는 아플라톡신 0.5 mg/plate로 처리하였을 때 99%의 저해율을 나타내었으며 MNNG로 같은 용량을 처리하였을 때는 75%의 저해율을 나타내었다.

이상의 실험 결과로 카이카사포닌 Ⅲ는 매우 강한 효과를 나타내는 항돌연변이 성분으로서 그 이용성이 높을 것으로 생각된다. 또한 텍토리게닌도 그에 따르는 아주 우수한 천연화합물이다. 우리는 항돌연변이 연구를 해오는 동안에 다른 약효성분의 경우와 달리 분획이나 추출물 수준에서 아주 높은 효과를 나타내는 경우를 확인해 왔다. 이러한 사실은 각기 다른 성분이 서로 길항하지 않고 상가적이나 상승적인 효과를 나타내는 결과로 보고 있다. 노화방지제로 알려진 각종의 식물유, 천연토코페롤, 간유 등이 단일 물질이 아니고 복합물이다.

따라서, 본 발명은 갈화의 알코올 추출물, 알코올 추출물의 용매 분획물 또는 이들로부터 분리한 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ를 유효성분으로 함유하는 돌연변이 유발 저해용의 조성물을 제공한다. 상기 조성물의 예로는 식품, 음료, 의약품, 차 및 기타 건강 보조식품을 들 수가 있다.

<실시예>

실시예1

갈화 시료의 제조 및 알코올 추출물의 제조

강원도 원주 근교에서 야생하는 칡의 꽃을 9월 중 채집하여 그늘에 말리고 재료로 사용하였다. 실험에 사용된 식물은 강원대학교 생물학과 식물학자인 유 기억 박사에 의뢰하여 분류학적 동정을 거쳤다. 칡꽃을 그늘에서 말린 후 그 건조시료를 잘게 분쇄하여 추출 재료로 사용하였다.

상기 건조하고 분쇄한 갈화 (건조 중량 2 kg)을 둥근 플라스크에 넣고 추출용매인 메탄올을 시료를 충분히 덮을 만큼 가하였다. 환류냉각기를 장착하고 약 5 시간동안 히팅 맨틀(heating mantle)을 이용하여 가열 추출하였다. 상기 메탄올 침출액을 여과지 (와트만 1번, 와트만)를 사용하여 여과한 후 여과액을 40℃의 수조로 가온하면서 진공농축기를 사용하여 강압농축하였다. 그 결과 메탄올 추출물(320 g)을 얻었다.

실시예2

추출물의 분획

실시예 1에서 얻은 메탄올 추출물 150 g을 증류수 800 ml에 현탁시켰다. 상기 용액을 2 L 용기의 분획깔때기에 넣고 클로로포름 약 800 ml을 가한 후 약 5 분간 세차게 흔들어 주고 충분한 시간동안 방치하였다. 하층의 클로로포름 층을 취하고 난 후 같은 방법으로 클로로포름으로 2회 더 분획하였다. 수층(aqueous phase)에는 에틸아세테이트 600 ml을 가하여 상기 클로로포름의 분획과 같은 방법으로 3회 분획하였다. 상층의 에틸아세테이트 층을 모두 모아 따로 용기 보관하였다. 에틸아세테이트 분획의 제조 후 남은 수층에 대하여 같은 방법으로 부탄올로 3회 분획하였다. 상층의 부탄올 분획을 합쳐서 보관하였다. 상기 분획 과정을 통해 얻은 분획들을 각각 따로 농축기로 농축하여 클로로포름 분획(52 g), 에틸아세테이트 분획(40 g), 부탄올 분획 (72 g)을 각각 얻었다.

실시예3

실리카겔 컬럼 크로마토그래피

내경 7 cm의 컬럼을 스탠드에 수직 고정하고 컬럼의 아래 부분을 솜으로 막았다. 미리 준비해 둔 클로로포름-메탄올-물 (7:3:1, 하층) 2.0 L와 실리카 겔 {Kiesel gel 60 (1.007734.1000). Merck} 500 g을 삼각플라스크에서 현탁한 후 컬럼에 신속히 가하고 컬럼 하단의 마개를 열어 전개용매를 빼내었다. 유출된 용매를 이용하여 남은 실리카겔을 모두 씻어 컬럼에 충진하였다. 전개용매가 실리카겔의상단에 올 때까지 용출하고 컬럼의 마개를 잠갔다. 시료를 실리카겔에 흡착시키기 위하여 실시예 2에서 제조한 에틸아세테이트 분획 20 g을 메탄올 200 ml와 잘 혼합한 후 실리카겔 30 g을 첨가하고 진공농축기에서 60℃로 가온하면서 용매를 증발시켰다. 얻어진 분말상의 건조물을 유발에서 미세하게 갈았다. 이를 미리 준비한 컬럼에 조심스럽게 스푼을 사용하여 로딩하였다. 80 ml씩을 계속 분취하면서 40개의 분획을 얻었다. 40개의 분획을 얻은 후 다시 미리 준비 한 클로로포름-메탄올- 물(65:35:10, 하층)의 전개용매로 이동상을 교체하여 가한 후 역시 80 ml씩 분취하였다. 이 때 각 소분획들은 연속하여 41번부터 번호를 부여하였다. 이러한 과정에 의해 모두 70개의 분획이 얻어졌다.

얻어진 모든 분획물에 대하여 박층크로마토그래피 (TLC)로 용출성분을 분석하였다(TLC plate; Silica gel 60F₂₅₄(1.05715), Merck). TLC는 제조자의 매뉴얼에 기재된 방법으로 실험하였으며 자외선 조사, 50%-황산분무 후 가열의 방법으로 반점을 확인하였다. 8번 내지 9번 분획이 서로 같은 반점을 보였으므로 함께 농축하고 메탄올에 녹여 방치할 때 생성하는 백색의 분말을 얻었다. 이 화합물은 분광분석 결과 텍토리게닌으로 확인되었다 (수득량 120 mg). 같은 방법에 의해 11번 분획 내지 15번 분획을 모아 농축시키고 상기와 유사하게 메탄올을 가하여 녹이고 수일 방치하였을때 석출하는 백색의 분말을 얻었다. 이 화합물은 분광분석 결과 글리시테인으로 확인되었다 (수득량 280 mg). 26번 내지 28번 분획을 같은 방법으로 농축시키고 메탄올에 녹이고 방치하였을 때 석출하는 백색의 화합물을 얻었다. 이 화합물은 분광분석 결과 텍토리딘으로 확인되었다 (수득량 320 mg). 계속해서 30번 내지 34번 분획을 농축하여 메탄올에 녹이고 방치하였을 때 석출하는 백색의 화합물을 얻었다. 이 화합물은 분광분석 결과 글리시틴으로 확인되었다. 마지막으로 55번 분획 내지 61번 분획을 농축하고 같은 방법으로 메탄올에 녹이고 수일 방치하였을 때 생성하는 백색의 분말을 얻었으며 이 화합물은 분광분석 결과 카이카사포닌 Ⅲ로 확인되었다 (수득량 120 mg).

실시예4

항돌연변이성을 가지는 텍토리게닌의 수득법

실시예1과 실시예2에서 얻어진 부탄올 분획 (15 g)에 메탄올 100ml를 가하였다. 이 혼합물을 흔들어서 용해를 시도하였을 때 백색의 석출물이 생성되었다. 이를 TLC로 분석한 결과, 텍토리딘과 동일한 R_f치를 나타내었다. 상기 침전된 물질을 여과하고 석출물을 얻었다 (수득량 6.2 g). 이의 일부인 5 g을 5%-HCl 용액 (물-메탄올(2:8))에 넣고 환류냉각기를 장착하여 약 5 시간 가열한 다음 이를 냉각하고 에틸아세테이트로 3회 분획하였다. 분획물들을 모으고 증류수 소량으로 2회 세척한 후 무수망초를 넣어서 탈수시키고 농축한다. 여기에 메탄올을 가하고 방치하였을 때 석출하는 백색의 분말을 얻었다 (수득량 2.8 g). 이 화합물은 실시예3에서 얻은 텍토리게닌과 분광학적 성질이 동일하였다.

실시예5

갈화 총 이소플라본의 제조 및 이의 성분분리

갈화 에틸아세테이트 분획 10 g에 5%-염산 300 ml를 가하고 환류냉각기를 장착하고 5 시간 가열하였다. 반응액을 식힌 후 분획깔때기에 넣고 여기에 다시 헥산을 넣어서 분획화하는 과정을 3회 거쳐서 상층의 헥산분획을 제거한 후 에틸아세테이트로 다시 분획하는 과정을 3회 반복하였다. 상층의 에틸아세테이트 분획을 모으고 증류수 소량을 가하여 세척한 후 하층의 물 층을 제거하였다. 남은 에틸아세테이트층에 무수망초를 가하여 탈수시키고 여과하였다. 여과된 용액을 진공농축기에서 농축하여 고형물 4.2 g을 얻었다. 이를 HPLC로 분리하였을 때 텍토리게닌 31%와 글리시테인65%로 나타나 대부분 텍토리게닌과 글리시테인으로 나타났다. 이를 실시예 3과 같은 방법으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하였을 때 텍노리게닌 560 mg과 글리시테인 2.9 mg이 얻어졌다.

실시예6

분리 화합물의 구조동정

실시예 3에서 분리된 화합물들의 의 구조를 동정하였다. 화합물의 융점은 융점 측정용 기구 (Electrical Digital Melting Point Apparatus, Electrothermal사)를 사용하여 측정하였다. 선광도는 디지털 폴라리미터(JASCO DIP-360 Digital Polarimeter)를 사용하여 제조자의 매뉴얼 방법에 의하여 25℃에서 측정하였다. IR 스펙트럼은 FT-IR 스펙트럼(Bomem MB-100 FT-IR Spectrometer)를 사용하여 KBr 디스크법으로 측정하였으며, 질량 스펙트럼은 피니간 매트 TSQ-700(Finnigan Mat TSQ-700)으로 측정하였다.¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼은 내부표준물질 테트라메틸실란(tetramethylsilane: TMS)을 첨가하여 브루커 AM-500 스펙트로미터 (Bruker AM-500 Spectrometer)로 측정하였다. UV 흡광도는 UV-160A UV-비저블 레코딩 스펙트로포터미터(UV-160A visible Recording Sepctrophotometer, Shmadzu)로 측정하였다. 이때 흡수 극대에서의 파장및 흡광도를 읽고 logε값을 계산하고 기록하였다. 상기 방법에 의하여 텍토리게닌, 글리시테인, 텍토리딘, 글리시틴, 카이카사포닌 Ⅲ를 분석한 결과는 다음과 같다.

텍토리게닌:

Colorless needles (MeOH); mp >300℃; [α]_D-46° {c=0.25, dimethyl -sulfoxide (DMSO)}; UV λ_max(MeOH) (log ε): 209.4 (4.39), 266.2(4.46); IR V_max(KBr)(cm^-1): 3472(OH), 1635(α,β-unsaturated ketone), 1517, 1498, 1469, 1433(aromatic C=C), 1100-1000(glycoside); FAB-MS m/z : 463 [M+H]⁺;¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Table 1;¹³C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d₆): Table 2.

글리시테인

Pale yellowish powder (MeOH); mp 170-180℃; UV λ_max(MeOH)(log ε)211.4 (4.29), 231.6 (4.18), 260.2 (4.30), 319.0 (3.94); IR v_max(KBr)cm^-1: 3472 (OH), 1635 (α,β-unsaturated ketone), 1520, 1419, 1373(aromatic C=C), 1232, 1207,1178; MS (70 eV, rel. int.) m/z: 284.1(100) [C₁₆H₁₂O₅]⁺, 166.0 (30) [C₈H₆O₄]⁺, 118.0 (11) [C₈H₆O]⁺,¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: Table 1;¹³C-NMR(75.5 MHz, DMSO-d₆): Table 2.

텍토리딘

Colorless needles (MeOH); mp >300℃; [α]_D-46.0° (c 0.25, DMSO); UV λ_max(MeOH) (log ε): 209.4 (4.39), 266.2 (4.46); IR v_max(KBr) cm^-1:3472 (OH), 1635 (α,β-unsaturated ketone), 1517, 1498, 1469, 1433(aromatic C=C), 1100-1000 (glycoside); FAB-MS: 463 [M+H]⁺;¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): Table 1;¹³C-NMR (300 MHz, 75.5 MHz): Table 2.

글리시틴

White powder (MeOH); mp 210℃; UV λ_max(MeOH)(log ε) 208.0 (4.32), 262.6 (4.29), 320.2 (3.74); IR v_max(KBr) cm^-1: 3472 (OH), 1635 (α,β-unsaturated ketone), 1516, 1498, 1469, 1433 (aromatic C=C), 1274, 1218 (C-O), 1100-1000 (glycoside); FAB-MS: 447 [M+H]⁺;¹H-NMR(300 MHz, DMSO-d₆): Table 1;¹³C-NMR (300 MHz, 75.5 MHz): Table 2.

카이카사포닌 Ⅲ

Colorless needles; mp 170-172℃; [α]_D-8.1°(c=1.0, pyridine); IR v_max(KBr) cm^-1: 3400 (OH), 1720 (COOH);¹³C-NMR (300 MHz, pyridine-d₅) δ: aglycone, 38.8 (C-1), 26.5 (C-2), 89.9 (C-3), 39.6(C-4), 55.8 (C-5), 18.5 (C-6), 33.2 (C-7), 39.9 (C-8), 47.9 (C-9), 36.8 (C-10), 23.7 (C-11), 122.5 (C-12), 144.7 (C-13), 42.3 (C-14), 26.4 (C-15) 28.6 (C-16), 37.9 (C-17), 45.3 (c-18), 46.7 (C-19), 30.8 (C-20), 42.2 (C-21), 75.5 (C-22), 28.6 (C-23), 15.6 (C-24), 16.7(C-25), 17.1 (C-26), 25.7 (C-27), 28.3 (C-28), 33.2 (C-29), 21.1 (C-30); 3-glucuronic acid, 105.2 (C-1'), 79.0 (C-2'), 76.1 (C-3'), 73.4(C-4'), 77.2 (C-5'), 172.6 (C-6'); 2'-galactose, 101.9 (C-1"), 78.5 (C-2"), 76.0 (C-3"), 70.3 (C-4"), 76.5 (C-5"), 61.8 (C-6"); 2"-rhamnose, 102.6 (C-1"'), 72.2 (C-2"'), 72.5 (C-3"'), 74.2 (C-4"'), 69.3 (C-5"'), 18.5 (C-6"')

실시예 7

항돌연변이 실험

상기 실시예 2에서 획득한 메탄올 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물과 실시예 3에서 에틸아세테이트 분획으로부터 분리한 4개의 이소플라보노이드 (텍토리게닌, 글리시테인, 텍토리딘, 글리시틴) 및 1개의 사포닌 (카이카사포닌Ⅲ)에 대하여 항돌연변이 효과를 에임즈 테스트를 실시함으로써 조사하였다. 에임즈 테스트는 돌연변이 유발제를 사용하는 살모넬라 티피무리움의 돌연변이 정도와 시료를 전처리한 군의 돌연변이 정도를 관찰함으로써 실시하였다.

돌연변이원으로는 아플라톡신 B₁(Sigma Chemical Co.(USA)을 디메틸설페이트 (dimethylsulfate, DMSO)에 녹여 사용했으며 MNNG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine; Aldrich Chemical Co. (USA))는 증류수에 녹여 사용하였다. 항돌연변이 실험에 사용된 균주는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhymurium) TA100으로 미국의 에임즈 박사(University of California, CA, USA)로부터 공급받았다. 효소원인 S9 분획과 S9 혼합물은 다음과 같이 제조하였다. 200 g 내외의 흰쥐에 각각의 마지막 투여로부터 24시간 절식시킨 후 신속하게 복강을 개복하여 간을 적출하였다. 적출한 간을 0.15M KCl 등장액으로 혈액을 제거한 후 간 중량의 3배량 0.25M 수크로스 용액을 가하여 Potter-Elvehjem으로 균질화(homogenation) 하였다. 이 균질물을 9000g으로 10분간 원심분리하여 그 상등액을 획득하였다. 상기 상등액을 가아제로 여과하고 105,000g에서 초원심분리하여 상등액과 침전물을 각각 취한 다음 침전물에 0.1M 인산 완충액 {phosphate buffer (pH 7.4)}로 현탁시켜 미세 현탁액 (microsomal suspension)으로 제조한 후 원심분리하여 효소원으로 하였다.

에임즈 등의 방법에 준하여 건열멸균된 캡 시험관(cap test tube)을 45℃의 항온수조에서 예열한 후 준비된 아가(top agar)를 2 ml씩 나누어 담고 여기에 시료 0.1 ml와 24시간 배양한 균액 0.1 ml 및 각군의 S9 혼합물 0.5 ml를 가하여 잘 섞은 후 미리 준비된 최소 아가 플레이트 위에 거품이 생기지 않도록 고르게 퍼지게 한 다음 2일 동안 배양하였다. 배양 후 복귀돌연변이체(revertant)의 수를 계수하였다.

실험 결과, 아플라톡신에 의해 유발된 돌연변이 실험에서는 갈화의 메탄올 추출물은 농도의 증가에 따라 항돌연변이 효과가 증가되고 있음을 보여 주었다. 1.0 mg/plate에서 78%의 항돌연변이 효과를 나타내었다. 다른 알콜분획물도 돌연변이를 강하게 저해했으나 에틸아세테이트의 분획이 가장 강한 효과를 나타내었다. 에틸아세테이트 분획은 농도 의존적인 효과를 나타내었으며 1.0 mg/plate 처리군에서는 95%의 저해율을 나타내었다(표 1).

[표 1]

갈화 알콜분획의 아플라톡신 B1에 의해 유도된 돌연변이에 대한 효과

1)상기 값들은 저해율(%)을 나타낸 것이다.

a∼e는 던컨 다중 범위 검사에 의해 유의적으로 차이가 있음을 나타내는 것 이다.(p<0.05)

한편 MNNG로 유발한 돌연변이의 경우 메탄올 추출물은 아플라톡신으로 유발한 돌연변이의 경우보다 낮은 효과를 나타내었다. 이 경우에도 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 효과를 나타내었다. 이것은 에틸아세테이트 분획에는 S-9 분획의 존재 없이도 직접적인 돌연변이를 차단하는 효과가 있음을 나타낸 것이다 (표 2).

[표 2]

갈화 알콜분획의 MNNG에 의해 유도된 돌연변이에 대한 효과

1)상기 값들은 저해율(%)을 나타낸 것이다.

a~e는 던컨 다중 범위 검사에 의해 유의적으로 차이가 있음을 나타내는 것이다.(p<0.05)

에틸아세테이트에서 분리되어진 다섯 가지의 성분에 대해서 아플라톡신 B₁과 MNNG의 돌연변이원성을 저해하는 효과를 각각 측정한 결과, 카이카사포닌 Ⅲ가 가장 강한 효과를 나타내었고 다음으로 이소플라본인 텍토리게닌과 글리시테인이 유사한 효과를 나타내었다 (표 3).

[표 3]

갈화 에틸아세트산 분획에서 얻어진 화합물의 아플라톡신 B1에 의해 유도된돌연변이에 대한 효과

1)상기 값들은 저해율(%)을 나타낸 것이다.

MNNG에 대한 항돌연변이 효과가 텍토리게닌 쪽이 글리시테인 쪽보다 높은 활성을 보였다. 카이카사포닌 Ⅲ는 아플라톡신 0.5 mg/plate로 처리하였을 때 99%의 저해율을 나타내었으며 MNNG로 같은 용량을 처리하였을 75%의 저해율을 나타내었다 (표 4).

[표 4]

갈화 에틸아세트산 분획에서 얻어진 화합물의 MNNG에 의해 유도된 돌연변이에 대한 효과

1)상기 값들은 저해율(%)을 나타낸 것이다.

a∼e는 던컨 다중 범위 검사에 의해 유의적으로 차이가 있음을 나타내는 것이다.(p<0.05)

본 발명은 이소플라보노이드와 사포닌 Ⅲ를 다량 함유하는 갈화 분획과 텍토리게닌과 카이카사포닌 Ⅲ를 제조하는 방법 및 그 새로운 용도인 항돌연변이 효과에 관한 것이다. 상기 갈화 분획물 및 성분들은 항돌연변이 효과가 뛰어나며 따라서, 이들을 항발암제 및 항암제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Claims

갈화에 추출용매를 첨가하고 가열 추출한 추출물을 컬럼크로마토 그래피로 분리함으로써 항돌연변이 효과를 지니는 이소플라보노이드와 사포닌을 제조하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 추출용매가 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 중에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 이소플라보노이드가 텍토리게닌, 글리시테인, 텍토리딘, 글리시틴중 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 사포닌이 카이카사포닌Ⅲ인 방법.
제 1항 기재의 방법에 의해 제조된 갈화 추출물.
제 1항 기재의 방법에 의해 제조된 이소플라보노이드 또는 사포닌.
제 6항 기재의 이소플라보노이드 또는 사포닌 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 하는 돌연변이 유발 저해용 조성물.