KR20030019282A

KR20030019282A - βAPP의 C말단 pCT105 원격제어에 의한 치매발병 유도 세포주 개발

Info

Publication number: KR20030019282A
Application number: KR1020020074183A
Authority: KR
Inventors: 김상태; 김정도; 안승희
Original assignee: 김상태
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2003-03-06

Abstract

본 발명은 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 개발에 있어서 절대적으로 요구하는 인체 조직과 대비되는 치매발병 유도능력을 제공하는 예를 들면 Tet-On와 같은 vector의 실험실 치매발병 원격유도 세포주에 관한 것이다.

Description

βAPP의 C말단 pCT105 원격제어에 의한 치매발병 유도 세포주 개발 {Development of alzhemier-inducible cell line by Tet-On with recombinant pCT105 vector in βAPP}

본 발명은 치매를 인간이나 동물에서 각각 유도한 것이나 유도되도록 하여 치료제를 개발 내지 형질전환 동물을 구축하는 단계에서 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료를 하기 위한 약물개발을 시도하고 있으나 실제 임상에서 확실한 치료제가 전무한 이유는 약물개발 시스템의 부족 내지 정확한 약물검색 표적인자의 구축시스템 부재에서 초래한 이유로 본 발명은 치매치료제 개발의 정확하고 원격제어에 의한 약물개발에 탁월한 치매치료제 탐색효과를 가진다. 최근에 베타 아밀로이드 단백질이 Alzheimer병의 발생에 중요한 원인적 인자의 하나가 된다는 것이 밝혀지고 있기 때문에 베타 아밀로이드에 대한 분자생물학적 연구가 이 질병 해결에 가장 큰 공헌을 하리라 예견되고 있다. 이 노인성 치매의 중요한 병변은 39개∼43개의 아미노산으로 구성된 베타 아밀로이드 단백질이 세포내와 외에 침착하여 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle)와 신경반(neuritic plaque)을 형성하는 것이다. 전술한 바, 전뇌 기저부(basal forebrain)의 콜린성 신경핵과 해마구조에 주로 침착이 된다. 이 베타 아밀로이드 단백질은 큰 분자량의 전구단백질(amyloid precursor protein 695, 751, 770: APP 695, 751, 770)에서 잘라져서 형성된다.(Tammer AH, Coia G, Cappai R, Fuller S, Masters CL, Hudson P, Underwood JR.: Clin Exp Immunol 2002 Sep;129(3):453-63 ; Generation of arecombinant Fab antibody reactive with the Alzheimer's disease-related Abeta peptide)( 그러나 현재 아밀로이드 전구 단백질이 어떤 효소에 의해서, 어떤 대사 과정에 의해서 잘라져서 베타 A4단백질을 만들어 내는지는 아직 전혀 모르고 있다. 따라서 베타 아밀로이드 단백질의 형성을 촉진하는 프로테아제(protease)와 이 프로테아제의 유전자를 발현하려는 노력이 현재 연구의 핵심이 되고 있으며, 이 프로테아제 효소 단백질이나 프로테아제 유전자의 발현을 억제하는 약물의 개발이 미래의 약물 개발에 가장 큰 목표가 되고 있다. 또한 정상에서 이 베타 단백질의 대사효소(amyloid degrading enzyme: ADE)를 활성화시키는 방법도 중요한 개발 목표가 될 수 있다. 또한 세포막에 붙어 있는 아밀로이드 전구 단백질들의 세포내 기능과 이 아밀로이드 전구 단백질에서 잘려나가 형성되어 조직에 침착된 베타A4단백질의 기능이 무엇인지에 대해서도 많은 논란이 제기되고 있다. 따라서 이러한 연구 개발을 진행시키기 위하여 필요한 당면 과제는 최신 유전공학적 기법을 이용한 아밀로이드 전구 단백질 및 베타 A4 아밀로이드 단백질의 발현과 대량 생산, 및 순수정제가 될 것이다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 단백질을 이용하여 항체를 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 아밀로이드 전구 단백질들의 생체내 기능과 베타 아밀로이드 단백질이 Alzheimer병 발생 기전에서 차지하는 역할을 정확히 규명할 수 있을 것이며 또한 아밀로이드 전구 단백질에서 어떤 효소에, 어떻게 대사가 이루어지는 가를 연구할 수 있을 것이다. 최근 각종 뇌신경질환과 허혈성 신경손상, 중추신경계 장애 등의 원인이 활성산소종의 생성과 분해기구의 조절과 직접적인 관련이 있다고 보고하고 있으며 이러한 조절기구의 사실로 과잉의 활성산소가 뇌조직의 지질과산화를 유도함과 활성산소종의 발생으로 인한 app치매 유도물질에 의해 뇌세포 세포막이 손상되고 각종 뇌신경계 장애가 발생한다고 사실로 밝혀지고 있다.(Nishimura I, Uetsuki T, Kuwako K, Hara T, Kawakami T, Aimoto S, Yoshikawa K.: Cell Death Differ 2002 Feb;9(2):199-208 ; Cell death induced by a caspase-cleaved transmembrane fragment of the Alzheimer amyloid precursor protein) (도 1). 최근에 신경전달물질 체계에 대한 연구가 진행되고 있어서 치료제 개발에 대한 합리적 접근 방법이 모색되고 있고, 콜린(cholin)성 기능을 향진시키려는 시도들이 이루어지고 있으며 포도당과 산소 대사촉진제들도 시도되고 있다. 그러나 이미 거론된 가능한 약리학적 접근 방법은 잘해야 일시적으로 증세를 경감시키는 효과 밖에 없다. 치매치료제 연구동향으로 현재까지 많이 사용된 코그넥스, 아리셉트 그리고 최근에 독일 메르츠(Merz + Co.)가 개발한 혈관 치매(vascular dementia) 치료제 신약인 메만틴(Memantine)에 대한 제 3임상 연구 결과가 발표되었다. 임상 연구는 무작위, 위약-비교 시험법으로 수행되었으며 연구 결과는 스웨덴의 수도 스톡홀름에서 4월 5일부터 8일에 걸쳐 개최된 제 6차 국제 스톡홀름/스프링필드 알츠하이머병 치료법 개발 심포지엄(International Stockholm/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy)을 통해 발표되었으며 미국 노바티스사가 개발한 엑 셀론를 유럽에서 임상에 적용시키고 있으나 FDA에 인가되지 못했다. 미국 노바티스사가 개발한 '엑셀론'은 유럽에서 널리 사용되고 있으나, 아직 FDA 승인은 받지 못했다. 이 약물은 뇌 속 신경전달물질인 아세틸콜린의 분해효소의 작용을 억제함으로써 기억력과 인지능력을 높힌다. 미국서 초기 또는 중기의 알츠하이머 환자9백41명을 대상으로 이 약을 임상시험한 결 과, 26%에서 현저하게 증상이 개선되는 등 82%에게서 증상이 악화되 지 않거나 좋아지는 효과가 있는 것으로 보고됐는데 기존 치료제 '코그넥스'(성분명 타크린)에 비해 간 독성이 없고, 복용이 간편해 졌다는 점에서 획기적이다. 아세틸콜린 분해효소 억제제로 효과는 비슷하나 간 독성 때문에 환자는 수시로 간 기능검사와 혈액검사를 받아야 했다. 또 하루 네 번 복용하기 때 문에, 환자에게 약을 복용시키기가 무척 어려웠다. 아리셉트는 하루 한번, 엑셀론은 하루 두번 복용한다. 국내의 치매치료제 개발동향은 카르복실기 말단(C단)쪽에 위치한 1백개 안팎의 아미노산 덩어리가 떨어져 나와 신경세포를 직접 파괴할 뿐만 아니라 주위의 교(膠)세포를 자극해 염증을 유발함으로써 치매가 생긴다는 내용으로 서울의대 서 유헌 교수는 (Kim HS, Lee JH, Suh YH.: Neuroreport 1999 Jan 18;10(1):113-6 ; C-terminal fragment of Alzheimer's amyloid precursor protein inhibits sodium/calcium exchanger activity in SK-N-SH cell.) "현재 6∼7종의 독성단백질이 뇌에 작용해 치매를 일으키는 것으로 알려져 있지만 C단 단백질은 보다 근본적인 치매의 원인으로 여겨지고 있다"고 밝혔는데 (Kim SH, Suh YH. :J Neurochem 1996 Sep;67(3):1172-82 ; Neurotoxicity of a carboxyl-terminal fragment of the Alzheimer's amyloid precursor protein.)(Lee JP, Chang KA, Kim HS, Kim SS, Jeong SJ, Suh YH.: J Neurosci Res 2000 May 15;60(4):565-70 ; APP carboxyl-terminal fragment without or with abeta domain equally induces cytotoxicity in differentiated PC12 cells and cortical neurons.) 치매치료제를 오수유에서 추출한 디하이드로에보디아민으로 개발중이라고 말했고 (Park CH, Lee YJ, Lee SH, Choi SH, Kim HS, Jeong SJ, Kim SS, Suh YH.: J Neurochem 2000 Jan;74(1):244-53 ; Dehydroevodiamine.HCl prevents impairment of learning and memory and neuronal loss in rat models of cognitive disturbance.) 작년말 전(前)임상시험이 끝나 금년부터 1상 임상에 착수했지만 그약효에서는 의문시 되고 있다 왜냐하면 A42-44의 절편은 세포산물의 공격대상이 외부에서 진행되기 때문에 정확한 치매 치료제 개발에 부족한 분이다.

이와 같이 치매 유발로 인한 여타의 치료제가 확실하게 규명되어 있지 않는 이유가 결국 정확한 인체실험과 동일한 탐색시스템 구축이 요함으로 일차적으로 치매 치료제로 효과를 가지기 위해 효과를 검정하기 위한 탐색시스템 구축이 요구된다(Qiu Z, Naten DL, Liston JC, Yess J, Rebeck GW: Exp Neurol 2001 Jul;170(1):186-94 ; A novel approach for studying endogenous abeta processing using cultured primary neurons isolated from APP transgenic mice.) 또한 치료제가 되기 위해 뇌기능에 우수하고 독성이 없으면서 항산화기능의 성분을 검색하기 위한 연구방향에 적합한 활성산소종에 의한 app발현 및 pCT105를 원격제어로 치매를 유도하여 약물탐색이나 치료제의 약리 작용점을 탐색하고 그 효능을 규명하는데 본 원격제어용 치매발병유도 시스템을 개발하여 치매진행을 억제하면서 뇌세포의 기능을 증진하고 황산화기능이 탁월한 치매 치료에 유용한 약물 탐색시스템을 개발하게 되었다.

본 발명자들은 치매과 그의 관련 뇌질환에 사용될 수 있는 약물개발에 관하여 오랜 연구를 행하여 왔다. 그 결과 본 발명은 치매치료제를 개발하는데는 약물탐색시스템의 신기술을 개발하여 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료에 탁월한 효과를 가지는 치매치료제 개발을 위한 탐색시스템을 개발하므로 치매치료에 놀라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 치매 CT105를 억제하는 약물은 현재 개발이 진행되고 있다. 그리고 현재의 연구는 본 치매치료제 탐색시스템이 장래의 유용한 치매 치료제의 탐색시스템으로 역할을 할 것이라고 제시한다

도 1은 치매 발병 기전의 원인물질 생성과정을 나타낸 것이다.

도 2은 실험실 수준에서 치매발병 유도 세포주 제작공정을 나타낸 것이다.

도 3은 doxycyclin으로 유도한 치매 세포주의 세포사를 형태학적 양상을 나 타낸 것이다.

도 4은 세포사를 확인하기 위한 Tunel assay의 그림이다.

도 5은 세포사의 DNA fragmentation사진을 나타낸 것이다.

도 6은 치매유도 세포주의 neurite outgrowth의 유형을 나타낸 것이다.

도 7은 치매유도시 신경돌기 신장에 미치는 유전자의 RT-PCR 밴드를 나타 낸 것이다.

도 8은 치매원격 유도시 단백질발현에 관여하는 western blot으로 분석한 것이다.

본 발명은 Tet-On을 적용한 재조합 pCT105 vector개발을 통해 분자생물학적 실험에서 치매 발병 기전을 규명하였고 이에 치매 발병시 관여하는 관련유전자를 파악하여 치매치료제 개발에 적합하고 강력한 치매치료 탐색시스템을 구축하여 놀라운 효과를 보이는 결과를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 Tet-On을 적용한재조합 pCT105 vector개발을 통해 분자생물학적 실험에서 치매 발병 기전을 규명하였고 이에 치매 발병시 관여하는 치매 촉진 내지 억제하는 유전자를 파악하여 치매치료제 개발에 적합한 약물탐색 내지 강력한 치매치료 탐색시스템을 구축하여 놀라운 효과를 보이는 결과를 제공 를 제공하는 것이다. 상기 시스템은 동시에 벡터, 또는 각각 단독으로 세포이입하여 치매발병 유도 세포주를 얻고 이들 일시적 또는 필요한 시점에 영구적으로 치매유전자를 발현하거나 일부만 유도하여도 좋다. 다음에 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 기재하며, 이들이 본발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

1. 본 발병에 사용된 pCT105 플라스미드의 구축은 Harvard Medical School, Brigham and Women's Hospital의 Center for Neurologic Diseases소속 Dennis J. Selkoe 박사로부터 분양받은 치매 유발 유전자 APP695로부터 도 1에서처럼 포유동물세포주인 SK-N-SH 내에서 발현이 되도록 PCR를 수행하여 APP695부분의 CT105 절편만을 분리하여 이를 TA vector인 pT7 vector에 clonning하여 대장균인 JM109에 형질전환시켜 이 플라스미드를 추출하여 BamH1/HindIII의 제한효소를 처리하여 이를 포유동물발현 유도벡터인 Tet-On vector에서 pTRE2의 BamHI/HindIII에 삽입하여 clonning한 다음 대장균인 JM109에 형질전환시켜 pCT105 플라스미드를 분리하여 본 실험에 사용하였다. 본 발명에 사용된 세포주인 SK-N-SH은 서울대학교 암연구소 한국 세포주은행으로부터분양 받아서 계대배양시켜 5% FBS가 함유한 RPMI 배지에 penicillin/streptomycin을 첨가하여 flask내지 cell culture용 dish에 배양하면서 pCT105의 플라스미드를 본 실험에 사용세포주를 구축하기 위해 미리 103 세포를 6-well plate에 분주하고 37 에서 하룻밤 배양하여 80%정도 조밀차게 배양한 다음 반응액 A으로 rTetR인 역Tet억제제가 테트라사이크린계열인 도시사이크린 항생제가 있을 경우에만 TRE의 CT105에 결합하는 원리로 pTet-On 2㎍와 serum free medium (이하 SFM이라 명명) 100㎕을 혼합하고, 반응액 B으로 lipofectin 10㎕와 SFM 100㎕을 혼합하여 45분간 반응시킨 다음 상기 반응액 A와 B를 다시 혼합하여 15분간 반응시킨 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 SFM 배지 1.5 ml와 반응 혼합액을 분주한 다음 6시간정도 37 , 5% CO2 incubator에서 유지하고 5% RPMI배지를 첨가하여 하룻밤 배양한다.이를 새로운 6well plate에 다시 계대배양하면서 G-418 450㎍/ml로 selection을 2주간 실시하고 단일 clone을 선정하여 본 실험에 사용하였고 pCT105를 형질이입하기 위해 상기 방법을 동일하게 실시하였다. (도 2).

2. 치매발병 원격유도 세포주를 분리 계대배양하는 공정에 대한 제공하는 것이다. 본 발명에서는 이러한 분리방법에서 인간 신경세포주에서 형질이입 후 G418로 선택적으로 분리한 후 2주간 한번 더 선택적으로 클론을 분리하여 선정하였고 같은 방법으로 pTRE-CT105 벡터를 형질이입하여 최종적으로 치매유전자 최종 산물인 CT105아미노산 절편을 만들게 하여 이들이 신경세포의 세포사를 유도하는 양상을 초래하는데 발명자가 원하는 시점에 원격적으로 유도 가능하고 치매 치료제 탐색시스템을 제작하는 공장을 제공하는 것은 또 다른 목적으로 한다. 상기와 같은 일련의 제작 과정에 수득되는 벡터 내지 치매발병 원격 유도 세포주는 각각 후술하는 바와 같이 뇌신경질환, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 탐색시스템의 탁월한 효과를 가지고 있기 때문에 본 발명의 세포주 및 벡터으로 사용될 수 있다.

실시예 2

본발명의 실시예 1과 같은 제작방법으로 세포주 및 벡터를 얻는다.실시예 3본발명의 실시예 1과 같은 제작방법으로 다양한 신경세포에서 치매 발병원격제어 형질전환 동물, 세포주 및 벡터를 얻는다.

실시예 3

본발명의 실시예 1과 같은 제작방법으로 다양한 포유동물세포, 신경세포에서 치매 발병 원격제어 형질전환 동물, 세포주 및 벡터를 on-line상, 화상 시뮬레이션상으로 얻는다.

실시예 4

실시예 2와 실시예 3에서처럼 비실험실, 가상현실 및 실험실 그리고 형질전환 동물로부터 치매 유도 원격제어 모델을 얻는다.

실험 예 1

본 발병에 사용된 pCT105 플라스미드의 구축은 Harvard Medical School, Brigham and Women's Hospital의 Center for Neurologic Diseases소속 Dennis J. Selkoe 박사로부터 분양받은 치매 유발 유전자 APP695로부터 도 1에서처럼 포유동물세포주인 SK-N-SH 내에서 발현이 되도록 PCR를 수행하여 APP695부분의 CT105 절편만을 분리하여 이를 TA vector인 pT7 vector에 clonning하여 대장균인 JM109에 형질전환시켜 이 플라스미드를 추출하여 BamH1/HindIII의 제한효소를 처리하여 이를 포유동물발현 유도벡터인 Tet-On vector에서 pTRE2의 BamHI/HindIII에 삽입하여 clonning한 다음 대장균인 JM109에 형질전환시켜 pCT105 플라스미드를 분리하여 본 실험에 사용하였다.

a) 아미노사 서열

MLPYKLARADCRRLALEVLVDGNGGLLAEPQIAMFSVARLNMHM

NVQNGKWETDVSGCIGTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKKGRKQCK

SRTHIVVPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDICETHLHWHTVAKESCSEKSMS

LHEYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPSAEESESFDSADAAEDDCDVWWGGADADYVDR

SDDKAVEAQPDEEEEVVEVEEEETDDDEDDGDEAEEEPEEPYEEATERTTSIATTTTTTT

ESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYYDVTESKCAQFIYGGCGGNRNNFESDDYCM

AVCGSVIPATAASTPDAVDKYLENPNDENEHDRFLKAKERLEGKHREKMSEVMKEWEE

AERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAAKQRQQLVETHMARVEAMLNDRRRIALE ADPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVINE

RMNQSFSLLYKVPAVAEEIQDEVDELFQKEQNYSDDMVSNMVSDHRVSYGNDALMPSL

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IIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTTIHHGVVEVDAAVTPEERHLTKMQQNGYEN

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b) 염기서열CT105 (347 bp)

gctggatccatggag atctctgaag tgaa------------->

1741 tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaagatgga tgcagaattc

1801 cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg

1861 ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg

1921 atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg

1981 gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac

2041 ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaactag

<----------------agcagatgc agaactagaag ctt

본 발명에 사용된 세포주인 SK-N-SH은 서울대학교 암연구소 한국 세포주은행으로부터분양 받아서 계대배양시켜 5% FBS가 함유한 RPMI 배지에 penicillin/streptomycin을 첨가하여 flask내지 cell culture용 dish에 배양하면서 pCT105의 플라스미드를 본 실험에 사용세포주를 구축하기 위해 미리 103 세포를 6-well plate에 분주하고 37 에서 하룻밤 배양하여 80%정도 조밀차게 배양한 다음 반응액 A으로 rTetR인 역Tet억제제가 테트라사이크린계열인 도시사이크린 항생제가 있을 경우에만 TRE의 CT105에 결합하는 원리로 pTet-On 2㎍와 serum free medium (이하 SFM이라 명명) 100㎕을 혼합하고, 반응액 B으로 lipofectin 10㎕와 SFM 100㎕을 혼합하여 45분간 반응시킨 다음 상기 반응액 A와 B를 다시 혼합하여 15분간 반응시킨 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 SFM 배지 1.5 ml와 반응 혼합액을 분주한 다음 6시간정도 37 , 5% CO2 incubator에서 유지하고 5% RPMI배지를 첨가하여 하룻밤 배양한다.이를 새로운 6well plate에 다시 계대배양하면서 G-418 450㎍/ml로 selection을 2주간 실시하고 단일 clone을 선정하여 본 실험에 사용하였고 pCT105를 형질이입하기 위해 상기 방법을 동일하게 실시하였다. (도 2), 마찬가지로 형질전환 치매쥐를 제작하기 위해 배시기에 핵이식을 수행하여 대리모에 착상시켜출산시켜 나온 쥐를 탐지자에 의해 치매유전자인 CT105가 제대로 발현되는 형질전환쥐를 선정하여 본 발명에 적용하였다.

실험예 2

CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 6-well에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 doxycyclin 1μM/ml 농도별로 처리하여 상기 세포주의 세포사를 억제하는지 조사하기 위해 5% FBS가 함유한 RPMI medium, penicilin / streptomycin이 함유한 배지를 37 에서 4일간 배양하여 세포사 양상을 관찰하였다. 세포사 관찰은 현미경의 200배율에서 세포사가 유도된 200개정도 세포수를 촬영하여 조사하였는데 CT105 발현이 확인된 신경세포에서 CT105로 인한 신경세포의 세포사의 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해 형태학적인 변화를 관찰한 결과 도 3에서처럼 도시사이클리인을 무첨가시 세포형태학적으로는 정상적으로 신경돌기가 잘 뻗어 자라고 있는 반면(도 3), 도시사이클리인을 첨가한 경우 CT105가 발현되어 세포가세포사를 유도되면서 신경돌기가 소실되는 양상으로 나타났으며(도 3), CT105 발현이 확인된 신경세포에서 세포사가 CT105 발현과 관련하여 정상군과 달리 대조군에서 녹색의 형광이 강하게 보이는 것으로 CT105에 의해 세포사가 일어남을 의미하는데(도 3), 이 결과로 볼 때 pCT105가 신경세포 증식과 신경돌기의 형태학적인 변화를 유도하여 신경세포의 세포사를 유도하리라 사료되어진다. 이 결과로 볼 때 pCT105에 의해 시간이 경과함에 따라 신경세포 증식 감소와 신경돌기의 형태학적인 변화를 초래하여 신경세포에 영향을 미친다는 것을 관찰하였으며 APP의 C말단 단백질 펩티드인 CT105발현을 확인하기 위해 CT105의 발현을 도시사이클린 항생제를 일정량 투여한 후형광현미경하에서 FITC형광체로 확인한 결과 24시간 이후부터 발현이 진행되어 96시간 시점에 발현정도가 가장 높았다.

실험예 3

CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 slide glass위에 laminin coated 된 slipe round cover glass에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 도시사이클리인을 1μM/ml 농도가 되도록 가한 다음 5시간 후에 세포사를 유도하는지 Tunel assay방법으로 조사하였다. 103세포수를 분주하고 하룻밤 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 세포를 4% p-formaldehyde로 12시간동안 4 에서 고정시킨 다음 0.5% Tween 20, 0.2% BSA (bovine serum albumin)을 첨가하여 실온에서 15분간 침투과정을 실시하고 PBS로 3회 세척을 실시하고 세포내 염색체 DNA nick 말단을 표지하기 위해 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)용액( TdT완충액, biotin-dUTP, TdT=18:1:1) 5㎕를 떨어 뜨려서 37 에서 1시간 유지하고 증류수로 3회 세척한다음 blocking 용액인 0.5% BSA를 50㎕정도 첨가하여 실온에서 10분간 정치하여 놓는 다음 avidine-DAIP용액 50㎕첨가하여 30분간 실온에서 유지하고 PBS로 3회 세척한 다음 slide glass 위에 mounding 용액을 약간 떨어뜨리고 엎어놓고 형광현미경하에서 관찰하였는데 치매는 신경세포가 어떤 원인으로 세포사가 발생하기 때문에 일어나는 신경계의 퇴행화의 일부분으로 보통 신경세포의 세포사는 운동신경 및 감각신경의 장애를 초래하는데 치매에 의한 신경세포의 세포사는 곧 언어장애와 운동장애로 심각한 생활에 장애를 초래한다. 따라서 신경세포사의 최종적인 현상으로 APP의 C말단 단백질 펩티드인 CT105발현을 확인하기 위해 CT105의 발현을 DAIP형광체로 확인한 결과 12시간부터 발현이 진행되어 48시간 시점에 발현정도가 가장 강하였다(도 4).

실험예 4

CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 6-well에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 농도별로 처리하여 DNA fragmentation를 유도하는 정도를 파악하기 위해 세포 용해액인 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2% Triton X-100) 200㎕를 첨가한 후 30분간 얼음에 유지한 다음 proteinase K(100 ㎍/ml)를 첨가하고 50 에서 5시간동안 항온조에 유지한 다음, 이를 phenol/chloroform의 동량을 넣고 잘 혼합한 후, 상기와 같이 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한다. 상등액을 취해 100% EtOH로 침전시켜 침전물을 건조시켜, 이를 RNase(50 ㎍/ml)가 함유한 dH2O 35㎕를 첨가하여 녹인 후, 이 용액을 1.5% agarose gel을 제조하여 전기영동을 실시한 다음 DNA fragmentation의 유무를 조사하였는데 세포사가 일어날 경우 자가효소에 의해 세포내의 염색체가 잘라지게 되면 약 200-400 bp만큼씩 불연속적인 절편이 존재하게 되는데 세포사의 일차적인 과정인 세포핵의 변화를 관찰할 필요가 있기 때문에 6-well에 105 cell수로 분주하여 하룻밤 배양한 APP의 CT105발현 세포에 첨가하여 세포사를 유도되는 정도를 세포 DNA를 분리하여 DNA fragmetation를 조사하여 본 결과 도 5에서처럼 대조군 경우에는 1Kbp이하에서 불연속적인 band가 존재하는 것을 보아 시간이 경과하면 ladder가 강하게 증가하는 경향을 보임으로 해서 APP의 CT105발현에 의한 세포사를 유도한다고 사료되어진다(도 5) .

실험예 5

CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 laminin coated 6-well (BECTON DICKINSON)에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 NGF를 50 ng/ml이 되게 하여 첨가하고 5시간동안 자극을 가한 다음 약물군의 무혈청 내지 100개의 세포에서 neurite outgrowth를 현미경하에서 관찰하여 정상군과 상호 비교하여 neurite outgrowth를 조사한 결과 신경세포의 신경돌기 신장 상해는 세포사에 영향을 주기 때문에 CT105로 신경이 손상을 입은 세포의 신경돌기는 도 6에서처럼 정상군에서의 신경돌기는 잘 발달되어 분지되어 있으나 CT105의 발현 유도에 의해 신경돌기가 손상을 입은 경우 성장이 안되는 상태로 나타내고 있는데 CT105로 인한 신경돌기의 상해는 신경돌기 말단에 함몰되는 양상을 관찰한 결과 CT105로 인한 세포사는 neurite outgrowth의 길이를 감소시키거나 신장을 제한하여 함몰을 유도하고 기능을 상실하게 되는데 아마도 이런 현상을 신경돌기의 신장을 억제시키는 기전에 관여한다고 사료된다( 도 6).

실험예 6

본 CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 laminin coated 6-well (BECTON DICKINSON)에 분주하고 하룻밤 배양한 세포를 1.5ml eppendorf tube에 모아서 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 RNAzol 용액을 200㎕를 첨가한 다음 chloroform 50㎕를 가하고 조심스럽게 pippeting하여 세포를 lysis하고 이를 15,000 rpm에서 4 하에 15분간 원심분리하여 total RNA를 회수한 다음 isopropanol 동량을 넣고 4 에서 15분간 침전시켜 75% EtOH로 한번 세척하여건조시킨 다음 RNase free dH20를 20㎕을 넣고 60 에서 30분간 가하여 녹인 다음 total RNA 5㎕에 10mM dNTP 5㎕, 25mM MgCl2 6㎕, 10x RNA PCR buffer 5㎕, RNase inhibitor 1㎕, AMV-Optimized Taq 1㎕, AMV reverse Transcriptase XL 1㎕, 20pM specific primer (sense/antisense) 1㎕, RNase free dH20 26㎕을 첨가하여 42 에서 60분간 역전사 반응을 실시하고, 92 에서 2분간 반응을 정지시켜서 PCR(polymerase chain reaction)를 실시하였는데 반응조건은 92 2min, 92 60sec, 54 60sec, 72 60sec에서 35 cycles를 진행시켜 72 에서 최종적으로 5분간 elogation 반응을 실시하여 종결한 후 이 PCR 산물을 1% agarose gel에 elute시켜 사이즈 마커를 기준으로 band유무를 확인하였다. 그 결과는 mRNA발현을 확인하여 전사 수준에서 신경 상해정도를 분석하였는데 도 7에서처럼 세포사에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향이 DNA의 유전적인 문제 내지 전사 수준에서 조절하는지 APP의 CT105 cell lines에서 신경돌기에서 중요한 인자인 BDNF, GDNF mRNA발현 경우에서 발현이 감소되고, 이로 인해 세포사가 초래하는 이는 CT105와 calpain은 발현양이 증가하기 때문이라 사료된다. 세포의 전사수준에서 단백질 발현에 표준의 지표인 -actin mRNA 발현 경우 모든 군에서 일정하게 발현되었다. 본 CT105로 인한 신경세포의 세포사가 신경세포의 신장이나 유전자발현을 억제하여 신경세포의 세포사를 조절하는 기전으로 진행한다고 사료된다(도 7).

실험예 7

CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 6-well에 분주하고 상기와 같은 방법으로 실시하고 lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v)Triton X-100, 150 mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl2)로 처리하여 그 추출액 30 g을 10% polyacrylamide SDS gels (SDS-PAGE)에 용출한 후 Immobilon-P membrane (Amersham)에 옮겨서 단백질의 발현을 확인하기 위해 ehanced chemilumenescence (ECL)로 발색시켜 확인하는데 antibody를 일차적으로 (Santa Cruz, 1:1,000 희석) 일차항체인 iNOS, p42/44, MAPK, APP, GSK3 , caspase-3을 표지하고 PBS로 세척한 다음 blotting 용액을 첨가하여 부반응을 제거하고 이차항체인 Horseradish Peroxidase-conjugate anti-goat IgG (HRP) 항체를 표지하고 ECL blotting reagent로 3분간 배양하고 chemiluminescence은 30 sec에서 20분간 X-ray film에 노출시켜 발색정도를 확인하였는데 그 결과 APP의 CT105 발현이 신경아세포암 SK-N-SH neuroblastoma cell lines에서 세포사를 억제하는지 세포사에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포 생존에 관여하는 glycogen syntase kinase (GSK3 ), GDNF 그리고 BDNF는 발현양이 점점 감소되나 CT105와 caspase-3의 발현은 증가하는 경향을 보였다(도 8). 신경세포의 단백질 발현에서처럼 CT105로 인한 신경세포의 세포사가 유도되는 양상을 촉진하여 세포사를 유도하는 단백질의 전사과정이나 단백질 합성과정을 유도함으로 신경세포의 파괴를 초래하고 있음이 시사되어지며 APP의 CT105에 의한 신경 세포의 세포사를 유의성 있게 유도되어 향후 치매치료제 탐색시스템으로 적용될 수 있으리라 사료되어진다. .

이상의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 신규 치매치료제 을 탐색하기 위한 시스템으로 탁월한 결과를 가진다. 따라서, 본 발명의 시스템은 치매치료제 탐색 모듈로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 비실험실, 실험실, 시뮬레이션 그리고 형질전환동물모델등에 의하여 그 사용량이 달라질 수 있으나, 본 발명의 시스템은 치매치료제를 탐색하여 그화합물의 유효성을 확인절차에서 지속적으로 적용할 수 있고 효율성이 극히 우수하여 단기적, 장기적, 동물, 포유세포, 인체에 유용한 치매치료제 개발에 적용할 수 있다.

본 발명의 시스템은 뇌질환에 관련 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 개발효과를 가지고 있기 때문에 본 발명의 시스템에서 유효성분에 효능을 가지는 기존에 이미 약제로 사용되고 있는 코그넥스, 아리셉트, 메만틴(Memantine), 엑 셀론, 디하이드로에보디아민, 레미닐, 타크린, 피라세탐, 이데베논, 토코페롤(비타민 E), 은행잎 추출물, 에스트로겐, 아스피린, 티클로피딘, 와파린, 세레길린, 니세르골린에서 선택된 1종 이상의 약물을 더 함유하고, 여기에 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께등과 같은 약물과 병용하여 사용하여 대조적인 약물검정에도 적용할 수 있다.

본 발명의 시스템과 상기의 약물을 대조군으로 기존 약물의 상용량을 줄일 수 있고, 따라서 기존 약물들이 가지는 문제점들을 경감시킬 수 있는 약물개발에 적용될수 있다.

본 발명의 시스템은 분자생물학적으로 통상으로 사용되는 벡터이외에 아데노바이러스, 아데노 연결 바이러스, 레트로바이러스, 허페러스바이러스 및 기타 시스템으로 통상으로 허용되는 세포 형질이입법을 보조제와 혼합하고 분자생물학적으로 통상으로 허용되는 약물탐색시스템을 활용하여 약학적 제제를 탐색내지 유효성을 검정할 수 있다. 이러한 분자생물학적인 탐색시스템는 주사제, 액제, 정제, 캡슐제, 산제, 시럽제 등으로 제제화 할 수 있다. 다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

제제실시예 1

실시예 2의 벡터 500 ng

멸균증류수 적량

pH 조절제 적량

실시예 1의 500 ng을 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.0로 조절한 다음 전체를 1ml로 한 후 1ml용량의 앰플에 충진하고 여과멸균하여 제조한다.

제제실시예 2

실시예 2의 벡터 500 ng

멸균증류수 적량

pH조절제 적량

실시예 1의 500 ng을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.0로 조절하고 전체를 1ml로 한 다음 1ml용량의 앰플에 충진하여 여과멸균하여 제조한다.

제제실시예 3

실시예 1 의 벡터 500 ng

여타의 벡터 100 ng

상기의 성분을 혼합하고 통상의 분말의 제조방법에 따라서 정제하여 분말를 제조한다.

제제실시예 4

실시예 1의 500 ng

아데노바이러스 50 cpu

알부민 100 mg

상기의 성분을 혼합하고 통상의 용액의 제조방법에 따라서 분말하여 분말화로 제조한다.

제제실시예 5

실시예 1의 500 ng

아데노연결바이러스 50 cpu

알부민 100 mg

제제실시예 6

실시예 1의 500 ng

허페러스바이러스 50 cpu

알부민 100 mg

제제실시예 7

실시예 1의 500 ng

라이포좀 100 ng

알부민 100 mg

상기의 성분을 혼합하고 통상의 분말의 제조방법에 따라서 분말화를 제조한다.

제제실시예 8

실시예 1의 500 ng

라이포펙틴 100 ng

알부민 100 mg

이상에서 상세히 설명한 바와 같이 Tet-On CT105에서 선택된 벡터로 분리한 시스템를 주가 되고, 필요하면 라이보좀, 리폭펙틴, 아데노바이러스, 아데노연결바이러스, 레트로바이러스, 허페르스바이러스에서 선택된 1종 이상의 보조 세포형질이입법 또는 이의 물, 알부민, 보조제, 안정제에서 선택된 용매로 분리한 벡터를함유하는 시스템은 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 개발에 탐색시스템로써 탁월한 검정효과를 가지고 있는 의약 탐색시스템로써 치매치료에 탁월한 개발효과가 있다.

Claims

Tet-On CT105에서 선택된 벡터의 시스템를 주가 되고, 필요하면 라이보좀, 리폭펙틴, 아데노바이러스, 아데노연결바이러스, 레트로바이러스, 허페르스바이러스에서 선택된 1종 이상의 보조 세포형질이입법 또는 이의 물, 알부민, 보조제, 안정제에서 선택된 용매로 분리한 벡터를 함유하는 시스템은 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 개발에 탐색시스템로써 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 탐색시스템로써 탁월한 효과를 가지고 있는 탐색시스템.
Tet-On CT105에서 선택된 벡터의 시스템를 주가 되고, 필요하면 라이보좀, 리폭펙틴, 아데노바이러스, 아데노연결바이러스, 레트로바이러스, 허페르스바이러스에서 선택된 1종 이상의 보조 세포형질이입법 또는 이의 물, 알부민, 보조제, 안정제에서 선택된 용매로 분리한 벡터를 함유하는 시스템은 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 개발에 탐색시스템로써 중풍, 뇌경색, 고혈압 , Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료에 의약 치료제 탐색법으로써 탁월한 효과를 가지고 있는 분자생물학적 탐색시스템.
제 1항 또는 제 2항의 시스템을 분자생물학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께 분자생물학적으로 통상으로 허용되는 보존형태로 제제화한 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 개발에 탐색시스템으로써 탁월한 효과를 가지고 있는 분자생물학적 제제.
제 3항에 있어서, 기존에 이미 시약제로 사용되고 있는 라이보좀, 리폭펙틴, 아데노바이러스, 아데노연결바이러스, 레트로바이러스, 허페르스바이러스에서 선택된 1종 이상의 보조 세포형질이입법 또는 이의 물, 알부민, 보조제, 안정제에서 선택된 용매로 분리한 벡터를 함유하는 시스템을 더 함유하고, 여기에 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제형태로 제제화한 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제 탐색시스템으로 분자생물학적으로 치매치료제 탐색연구에 탁월한 효과를 가지고 있는 분자생물학적으로 가지는 분자생물학적 제제.