KR20030018483A

KR20030018483A - 제 1형 인간면역결핍바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에결합하는 ｒｎａ

Info

Publication number: KR20030018483A
Application number: KR1020010052594A
Authority: KR
Inventors: 유지창; 정선주; 남혁준; 김세진
Original assignee: (주) 에빅스젠; 유지창; 정선주
Priority date: 2001-08-29
Filing date: 2001-08-29
Publication date: 2003-03-06
Also published as: KR100435634B1

Abstract

본 발명은 HIV-1의 뉴클레오캡시드 단백질과 결합하여, HIV-1의 증식을 억제하는 RNA에 관한 것이다. 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질과 결합하는 RNA는 HIV의 증식에 중요한 역할을 하는 뉴클레오캡시드 단백질의 기능을 억제하여 HIV의 증식을 저해할 수 있으므로, HIV의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

제 1형 인간면역결핍바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 결합하는 ＲＮＡ{RNA Which Binds to HIV-1 Nucleocapsid}

본 발명은 제 1형 인간면역결핍바이러스(HIV-1)의 뉴클레오캡시드 (nuclocapsid, NC) 단백질에 결합하는 RNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 HIV-1의 NC 단백질과 결합하여, HIV-1의 증식을 억제하는 RNA에 관한 것이다.

일반적으로, RNA는 단백질을 제조하는 정보를 단순히 코딩하는 차원을 넘어서 중요한 생물학적인 기능을 하는 것으로 알려져 있는데, RNA의 헤어핀구조(hairpin loop) 및 헤어핀 유사구조(internal loop, bulge)에 의하여 분자 내부의 상호결합에 따른 안정된 구조를 형성함으로써, 여러 생체분자들과 결합, 그들의 기능에 특이적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. CD4+ T세포에 감염하여 후천성면역결핍증(AIDS)을 유발시키는 인간 면역결핍바이러스(HIV)는 한 쌍의 RNA를 게놈으로 가지고 있으며, 전기 게놈은 HIV의 증식에 중요한 역할을 하는 단백질을 암호화하는 gag, pol 및 env 유전자를 포함하는데, 이 중 gag 유전자에 의해 형성되는 gag 중합단백질은 바이러스 단백질분해효소에 의하여 매트릭스(matrix), 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질로 분해되며, 분해된 각각의 단백질은 성숙된 감염성 바이러스의 형성에 직접적으로 작용하는 것으로 알려져 있다(참조: Mervis, R. J., et al., J. Virol., 62:3993-4002, 1988).

특히, 뉴클레오캡시드(NC) 단백질은 거의 모든 레트로바이러스에서 공통적으로 발견되고, 2개의 징크핑거(zinc finger) 모티브를 포함하며, 바이러스의 RNA 게놈을 선별적으로 패키징(packaging)하고, RNA 게놈의 역전사를 보조하여 바이러스 DNA 합성을 유도할 뿐만 아니라, 바이러스 복제, 게놈 RNA 인식과 캡시드화, 감염 초기 및 성숙 단계에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(참조: Berg, J., Science., 232:485-486, 1986; Dexter T. K., et al., J. Virol., 72:1983-1993, 1998). 이러한 NC 단백질의 작용 중에서 바이러스의 RNA 게놈을 선별적으로 패키징하는 작용이 중요하게 연구되고 있는데, NC 단백질은 바이러스 게놈 RNA의 LTR 부위에 존재하는 Psi(Φ)염기서열에 특이적으로 작용하고, 4개의 헤어핀(SL1, Sl2, SL3, SL4) 구조를 포함하는 Psi(Φ)염기서열은 패키징 신호로 알려져 있다.지금까지 연구결과를 통하여, 4개의 헤어핀으로 형성된 스템-루프(stem-loop) 구조가 NC 단백질과의 결합에 중요함이 밝혀져 있다(참조: Clever J. et al., J. Virol., 69:2101-2109, 1995).

한편, 바이러스의 증식에 중요한 단백질과 결합할 수 있는 RNA를 선별하기 위하여 여러가지 방법이 고안되고 있으며, 높은 효율로 다양한 바이러스 단백질과 결합하는 RNA를 선별하는 방법으로서, SELEX(Systematic Evolution of Ligans by Exponential Enrichment)라는 방법이 개발되었다. SELEX는 생체내 물질과 핵산사이의 상호작용에 관한 정보를 제공할 뿐만 아니라, 촉매활성을 갖는 리보자임(ribozyme)을 선별해내고 그 구조와 기능을 연구할 수 있는 방법을 제공한다(참조: Jun I., et al., Nature Medicine., 2:1386-1389, 1996).

HIV를 치료하기 위하여, 여러가지 방법이 고안되고 종래의 치료제들은 단백질들의 상호작용에 의한 효과에 촛점을 맞추었으나, 표적단백질과 특이적으로 반응하기 위해서는 담체의 연구가 필요하였고, 단백질들의 분해시간 등의 문제점이 있었다. 이런 문제점들을 극복하기 위하여, 최근에는 단백질합성을 지시하는 분자인 세포내 RNA와의 상호작용에 의하여 그러한 단백질의 실제생산을 경감시키려는 연구가 시도되었는데, RNA 유사체를 특이적인 표적 메신저 RNA인 mRNA 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 만들어 서로 특이적인 결합, 즉 RNA 경우 헤어핀과 같은 2차 구조의 형성을 억제함으로써, 특정 유전자의 발현을 막아 바이러스의 삶과 증식에 커다란 악영향을 미치게 하는 것이다. 그러나, RNA의 기능은 주로 구조에 기인한 것이므로, 특별한 작용을 하는 RNA를 선별하고, 2차 또는 3차 구조를 정확히 예측해야 하며, 생체내에서 다른 효소들의 작용을 방어하도록 특별한 치환잔기 등을 이용해 유도체를 구성해야만 한다. 그러나, RNA를 이용할 경우, 단백질 수준에서의 치료로는 수행할 수 없는 근본적인 HIV의 치료가 가능하고, DNA 수준에서의 치료 보다는 폭넓은 치료방법을 수행할 수 있으므로, RNA를 이용하려는 노력이 계속되고 있는 실정이다.

따라서, RNA를 이용하여 HIV를 치료하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 RNA를 이용하여 HIV를 치료하는 방법을 개발하하고자 예의 연구한 결과, 셀렉스 방법을 이용하여 HIV-1 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하여, 전기 뉴클레오캡시드 단백질의 작용을 억제시킬 수 있는 RNA를 선별하고, 이처럼 선별된 RNA를 이용할 경우, HIV-1의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 HIV-1 바이러스의 NC 단백질과 결합할 수 있는 RNA를 제공하는 것이다.

도 1은 RNA의 BLAcore 분석결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 젤 이동분석법에 의하여 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 ＃SE8-6 RNA와 RNA 라이브러리의 결합친화도를 분석한 그래프이다.

도 3은 RNA ＃SE8-6의 경쟁적 억제반응을 나타내는 그래프이다.

본 발명자들은 수십만개의 RNA를 저농도의 완충용액에서 고농도의 목적 단백질로 분리하고, 점차 고농도의 완충용액에서 저농도의 목적 단백질로 선별력을 높이는 단계를 거치면서 목적 단백질인 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 RNA를 선별하여 재조합 플라스미드를 구축한 후, DH5α숙주세포에 열충격 방법으로 삽입하여 형질전환시키고, 자동 염기 서열 분석기로 DNA의 염기서열을 알아내었다. 상보적인 염기서열을 131mer DNA 라이브러리를 PCR로 증폭한 후, 시험관내 전사를 통하여 약 1,013개의 RNA를 포함하는 라이브러리를 제작하였다.

한편, 뉴클레오캡시드 단백질은 GST와 결합한 상태로 준비되었기 때문에, 전기 라이브러리에 포함된 RNA 중에서 GST와 비특이적으로 결합할 수 있는 RNA를 제거하기 위하여, 전기 라이브러리를 GST와 반응시켜 결합시킨 후, 글루타티온 세파로즈(Glutathione Sepharose) 4B(50% slurry)와 섞고, 원심분리하여 GST에 결합하는 RNA가 제거된 상등액을 수득하였다. 전기 수득한 상등액과 뉴클레오캡시드 단백질을 혼합하고 반응시킨 다음, 글루타티온 세파로즈 4B에 결합시키고, 이로부터 뉴클레오캡시드 단백질에 결합하는 RNA를 회수하였다. 이때, 처음에는 저농도의 RNA 라이브러리를 포함하는 완충용액에 고농도의 뉴클레오캡시드 단백질을 첨가하고, 점차적으로 고농도의 라이브러리를 저농도의 뉴클레오캡시드 단백질과 결합시켜 선별함으로써, 특이적으로 뉴클레오캡시드 단백질에 결합하는 RNA만을 선별하였다.

전기 선별된 각각의 RNA로부터 cDNA를 수득하고, 전기 cDNA를 포함하는 재조합 벡터를 작제한 다음, 이를 사용하여 형질전환체를 제조한 후, 이들에 포함된 cDNA의 염기서열을 판독함으로써, 각 RNA의 서열을 분석할 수 있다. 이와 같은 방법으로 RNA #SE8-4, RNA #SE10-3, RNA #SE10-12, RNA #SE10-7, RNA #SE8-6, RNA #SE10-1, RNA #SE10-8, RNA #SE8-11, RNA #SE8-10, RNA #SE10-2, RNA #SE10-11, RNA #SE8-7, RNA #SE8-13, RNA #SE10-9 및 RNA #SE10-4의 15개 RNA를 얻을 수 있었으며, 이들은 하기의 염기서열을 갖는다:

RNA #SE8-4: 5'-AGGGAACUCCGAACCGAGUCCUGGACCAUUGCUGACAGAUACCGGCGGUACCUCA GAGGCCCCUCAAGU-3'(서열번호 1), RNA #SE10-3: 5'-GGCGAACUUGCCAACCUGAUGGUGUGCCC UCGCAGACAAAUACCCGCGGUACCUCAGAGGCCCCUCAAGU-3'(서열번호 2), RNA #SE10-12: 5'-U GCGAACUUGCCAACCUGAUGGUGUGCCCUCGCAGACAAAAACCCGCGGUACCUCAAAGGCCCCUCAAGU-3'(서열번호 3), RNA #SE10-7: 5'-GGCGAACCUGCCAACCUGAUGGUGUGCCCUCGCAGACAAAAACCCGCGUUC CUCAUAGGGCCUCAAGU-3'(서열번호 4), RNA #SE8-6: 5'-ACGGAUAUCGGGAAGCGAGGCCCGGAC UACUCCUACCGGCUACCGGAAACGUACCCAGUGGGACUCCGC-3'(서열번호 5), RNA #SE10-1: 5'-ACGGAUAUCGGGAAGCGAGGCCCGGACUACUCCUACCGGCUACCGGAACGUACCCAGUGGGACUCCGC-3'(서열번호 6), RNA #SE10-8: 5'-AGGGAAAUCGCGAACCGAGGCCCGGACCAUUCCUACCGGACACCGGCACGU CACCCAGUGGCCCUCCGC-3'(서열번호 7), RNA #SE8-11: 5'-AGGGAUAUCGGGAAGCGAUGCCCGGC CCACUCGUACCUGAAACC GGCAGGUACCCUUGGCCCUCCGC-3'(서열번호 8), RNA #SE8-10: 5'-GGGGGAUUGAGAGCUAAGUCGCCCACCCCCACGCAUUCUAACCCGCCGAUGGGGUCGGCCCCGCCGC-3'(서열번호 9), RNA #SE10-2: 5'-CGGGGACUGAGAGCUAAGUCGCCCACCCCCACGCAUUCUAACCCGCCGUUGGA GUCGGGCCACGCCGC-3'(서열번호 10), RNA #SE10-11: 5'-CGGGGAUUGAGAGAUAAGUCGCCCAC CCCCACGCAUUCUAACCCGCCGUUG GAGUCGGGCCAGCCGC-3'(서열번호 11), RNA #SE8-7: 5'-C UCGUACAACGGACAAAAGUACACCCUUAAUCCAGCUCAAUUUAAGCGUGGACACAUAUA-3'(서열번호 12),RNA #SE8-13: 5'-CUCGUACAACGGACAAAAGUACACCCUUAAUCCAGCUCAAUCUAAGCGUUGGACCCACUA UA-3'(서열번호 13), RNA #SE10-9: 5'-CUCGUACAACGGACAAAAGUACACCCUUAAUCAAACUCAA UUUAAGCGUGGGACCCCACUAUA-3'(서열번호 14) 및 RNA #SE10-4: 5'-GCACCAAUGGGCGCCUUCU GCAAAAAGAGACUAGUCCCUAAGGCGCCCCACCAAU-3'(서열번호 15).

전기 RNA의 NC에 대한 친화도를 측정한 결과 ＃SE8-6 RNA와 ＃SE8-13 RNA의 친화도가 가장 높은 것으로 나타났다.

NC 단백질은 HIV가 증식할 때, HIV의 RNA와 결합하여 이의 패키징을 수행하므로, NC 단백질이 HIV의 RNA가 아닌 다른 RNA와 결합할 경우, HIV의 증식을 저해하게 된다. 따라서, NC 단백질과 결합친화력이 높은 전기 RNA를 이용할 경우, NC 단백질의 기능을 저해하여, HIV의 증식을 억제할 수 있으므로, HIV의 발병억제 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 첨부된 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: RNA 라이브러리의 제조

5' 말단도메인: 5'-CGGAATTCCGTAATACGACTCACTATAGGGGAGCTCGGTACC-3'(서열번호 16), 3' 말단도메인: 5'-AAGCTTTGCAGAGGATCCTT-3'(서열번호 17) 및 70개의 무작위염기서열을 갖는 중앙도메인을 포함하는 다수의 DNA 절편을 작제하고, 이를 PCR방법으로 증폭시켜서, 약 26 ×10¹³개의 DNA를 갖는 DNA 풀(pool)을 제조하였다. 제조된 라이브러리를 다음과 같은 시험관내에서 전사시켜서 RNA 라이브러리를 제조하였다: 전사시료(DNA 라이브러리, 전사완충용액(200mM Tris-HCl pH 7.9), 30mM MgCl₂, 10mM spermidine, 50mM NaCl), RNase 억제제 40U, 10mM DTT, 400 μM rNTP mix, T7 RNA 융합효소 2㎕에 dHO-DEPC(0.1% diethylpyrocabonate, Sigma ＃D 5758)로 100㎕ 부피를 맞춘 후, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이어, RQ1 DNase 1U을 첨가하여 37℃에서 15시간 반응시켜 전사 주형으로 사용된 DNA를 제거하고, 이로부터 RNA를 추출한 다음, 6% 폴리아크릴아마이드와 7M 유레아를 포함한 젤에서 전기영동하였다. 전기영동된 젤의 110mer RNA 위치를 잘라서 500㎕ 추출완충용액(0.5M CH₃COONH, 1mM EDTA, 0.2% SDS)에 넣은 후, 37℃에서 3시간 동안 추출하여 RNA 라이브러리를 제조하였다.

실시예 2: 뉴클레오캡시드 단백질과 결합하는 RNA의 선별

뉴클레오캡시드 단백질과 순수하게 결합하는 RNA를 얻기 위하여 10㎍의 RNA 라이브러리를 65℃에서 5분간 변성시킨 후, 안정된 구조를 형성시키기 위해 상온에서 서서히 냉각시켰다. 뉴클레오캡시드 단백질은 GST가 결합된 상태로써 GST에 비특이적으로 결합하는 RNA를 제거하기 위해, 5㎍ GST, 10㎍ RNA 및 400U RNAse 억제제를 반응용액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 250mM NaCl, 30μM ZnCl₂, 1mM MgCl₂, 10mM DTT, 10mg/ml BSA, 250㎍/ml RNA) 200㎕에 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다. 이어, 40㎕ 글루타티온 세파로즈 4B(50% slurry)를 첨가하여 상온에서 GST와 결합시킨 후, 원심분리하여 상층액을 수득하여, GST와 비특이적으로 결합하는 RNA가 제거된 시료를 수득하였다.

전기 GST와 비특이적으로 결합하는 RNA가 제거된 시료와 뉴클레오캡시드 단백질을 대상으로 하여 셀렉스(SELEX) 방법을 수행함으로써, 뉴클레오캡시드 단백질과 친화력이 높은 RNA를 선별하였다: 즉, GST에 결합하지 않은 RNA를 1㎍ 뉴클레오캡시드 단백질과 결합시키고, 뉴클레오캡시드 단백질과 비특적으로 결합하는 RNA를 제거하기위해 결합완충용액 500㎕를 넣어 1분간 교반하였다. 이어, 50mM EDTA 100㎕를 첨가하고, 물 200㎕와 동일 부피의 페놀:클로로포름을 첨가하여 뉴클레오캡시드 단백질에 결합한 RNA를 추출하였다. 과다한 EDTA를 제거하기 위하여, 세파덱스(Sephadex) G-50 컬럼에 RNA 시료를 넣고 반응시킨 후, 1,100 ×g에서 1분 30초간 원심분리하고 에탄올 침전시켰다. 상술한 방법을 총 10회 반복하였는데, 그 중 1-2회 반복은 1차 결합완충용액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 30μM ZnCl₂, 1mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mg/ml BSA, 100㎍/ml tRNA)에서 수행하고, 3-10회 반복은 단계는 2차 결합완충용액(10mg/ml, BSA, 250㎍/ml tRNA)에서 수행하였다. 또한, 7회 반복과정부터는 뉴클레오캡시드 단백질의 양을 감소시켜서, 좀더 친화성이 높은 RNA를 선별하였다(참조: 표 1)

SELEX 조건

반복단계	RNA(㎍)	GST(㎍)	NC(㎍)	RNA:NC(몰비)
1	10	5	1	10 : 1
2	10	5	1	10 : 1
3	10	5	1	10 : 1
4	10	5	1	10 : 1
5	10	5	1	10 : 1
6	10	5	1	10 : 1
7	10	5	0.5	20 : 1
8	10	5	0.1	100 : 1
9	10	5	0.01	1000 : 1
10	10	5	0.01	1000 : 1

실시예 3: RNA의 시험관내에서의 역전사 및 전사

정제된 각 RNA에 5 ×역전사 효소 완충용액 10 ㎕와 0.5 μM 3'-프라이머를 넣고 65℃에서 5분간 변성시키고, 상온에서 10분간 방치하였으며, 10mM dNTP Mix 5㎕와 10U M-MulV 역전사 효소를 불활성화시키기 위해 37℃에서 30분간 방치한 다음, 95℃에서 5분간 가열하고, 얼음에 넣어 역전사 반응을 종결하였다. 역전사 반응으로 합성한 cDNA에 10×Taq DNA 폴리머라제 완충용액 10㎕, 0.25μM 5'-말단도메인, 0.25μM 3'-말단도메인, 각 400μM dNTP mix, 3mM MgCl₂및 1U Taq DNA 폴리머라제를 첨가하여 100㎕ 부피를 맞춘 후, PCR을 수행하여 증폭하였다. 증폭된 다량의 cDNA는 실시예 1의 시험관내 전사방법을 이용하여 RNA로 전환되었고, 실시예 2의 SELEX 방법의 제 8회 내지 제 10회 방법을 수행하여 RNA를 선별하였다.

상술한 방법으로 RNA #SE8-4, RNA #SE10-3, RNA #SE10-12, RNA #SE10-7, RNA #SE8-6, RNA #SE10-1, RNA #SE10-8, RNA #SE8-11, RNA #SE8-10, RNA #SE10-2, RNA #SE10-11, RNA #SE8-7, RNA #SE8-13, RNA #SE10-9 및 RNA #SE10-4라 명명된 15개의 RNA를 선별할 수 있었으며, 각 RNA의 염기서열을 분석한 결과는 다음과 같다:

RNA #SE8-4: 5'-AGGGAACUCCGAACCGAGUCCUGGACCAUUGCUGACAGAUACCGGCGGUACCUCA GAGGCCCCUCAAGU-3'(서열번호 1), RNA #SE10-3: 5'-GGCGAACUUGCCAACCUGAUGGUGUGCCC UCGCAGACAAAUACCCGCGGUACCUCAGAGGCCCCUCAAGU-3'(서열번호 2), RNA #SE10-12: 5'-U GCGAACUUGCCAACCUGAUGGUGUGCCCUCGCAGACAAAAACCCGCGGUACCUCAAAGGCCCCUCAAGU-3'(서열번호 3), RNA #SE10-7: 5'-GGCGAACCUGCCAACCUGAUGGUGUGCCCUCGCAGACAAAAACCCGCGUUC CUCAUAGGGCCUCAAGU-3'(서열번호 4), RNA #SE8-6: 5'-ACGGAUAUCGGGAAGCGAGGCCCGGAC UACUCCUACCGGCUACCGGAAACGUACCCAGUGGGACUCCGC-3'(서열번호 5), RNA #SE10-1: 5'-ACGGAUAUCGGGAAGCGAGGCCCGGACUACUCCUACCGGCUACCGGAACGUACCCAGUGGGACUCCGC-3'(서열번호 6), RNA #SE10-8: 5'-AGGGAAAUCGCGAACCGAGGCCCGGACCAUUCCUACCGGACACCGGCACGU CACCCAGUGGCCCUCCGC-3'(서열번호 7), RNA #SE8-11: 5'-AGGGAUAUCGGGAAGCGAUGCCCGGC CCACUCGUACCUGAAACC GGCAGGUACCCUUGGCCCUCCGC-3'(서열번호 8), RNA #SE8-10: 5'-GGGGGAUUGAGAGCUAAGUCGCCCACCCCCACGCAUUCUAACCCGCCGAUGGGGUCGGCCCCGCCGC-3'(서열번호 9), RNA #SE10-2: 5'-CGGGGACUGAGAGCUAAGUCGCCCACCCCCACGCAUUCUAACCCGCCGUUGGA GUCGGGCCACGCCGC-3'(서열번호 10), RNA #SE10-11: 5'-CGGGGAUUGAGAGAUAAGUCGCCCACCCCCACGCAUUCUAACCCGCCGUUG GAGUCGGGCCAGCCGC-3'(서열번호 11), RNA #SE8-7: 5'-C UCGUACAACGGACAAAAGUACACCCUUAAUCCAGCUCAAUUUAAGCGUGGACACAUAUA-3'(서열번호 12), RNA #SE8-13: 5'-CUCGUACAACGGACAAAAGUACACCCUUAAUCCAGCUCAAUCUAAGCGUUGGACCCACUA UA-3'(서열번호 13), RNA #SE10-9: 5'-CUCGUACAACGGACAAAAGUACACCCUUAAUCAAACUCAA UUUAAGCGUGGGACCCCACUAUA-3'(서열번호 14) 및 RNA #SE10-4: 5'-GCACCAAUGGGCGCCUUCU GCAAAAAGAGACUAGUCCCUAAGGCGCCCCACCAAU-3'(서열번호 15).

실시예 4: RNA의 결합친화도 측정

선택한 RNA중 뉴클레오캡시드 단백질과 가장 높은 친화도를 나타내는 RNA를 선별하기 위하여, 고정화된 뉴클레오캡시드 단백질에 여러 종류의 RNA를 주입하여 각각의 친화도를 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용하여 측정하는 BLAcore 분석방법(BLAcore assay)을 수행하였다.

CM₅감지기(senser chip)에 뉴클레오캡시드 단백질과 백그라운드(background) 단백질인 GST를 아민 결합반응을 이용하여 고정화하고, 덱스트란이 돌출되어 있는 감지기 표면에, NHS/EDC(amine coupling kit, Pharmacia biosensor AB, ＃BR -1000-50) 100㎕를 처리하여 활성화시킨 후, 각각 10mM NaOAc-DEPC(pH 4.5)와 HBS용액에 희석시켰다. 이어, 전기 실시예 3에서 선별한 RNA #SE8-6, RNA #SE8-13, RNA라이브러리 및 RNA #10 혼합물(#SE10-3, #SE10-12, #SE10-7,#SE10-1, #SE10-8, #SE10-2, #SE10-11, #SE10-9 및 #SE10-4의 혼합 RNA)을 첨가하고, 각각의 친화도를 표면 플라스몬 공명을 이용하여 250nM에서 시간의 변화에 따라 측정하였다(참조: 도 1). 도 1은 RNA의 BLAcore 분석방법 결과를 나타내는 그래프로서, 위에서 부터 첫번째 라인은 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 RNA #SE8-6의 결합친화도를 나타내고, 두번째 라인은 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 RNA #SE8-13의 결합친화도를 나타내며, 세번째 라인은 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 RNA #10 혼합물의 결합친화도를 나타내고, 네번째 라인은 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 RNA라이브러리의 결합친화도를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, ＃SE8-6 RNA와 ＃SE8-13 RNA의 친화도가 가장 높은 것으로 나타났다,

실시예 5: 젤 이동분석법에 의한 결합친화도 분석

전기 실시예 4에서 가장 높은 친화도를 나타내는 것으로 밝혀진 ＃SE8-6 RNA의 결합친화도를 젤 이동분석법으로 RNA 라이브러리의 결합친화도와 비교하였다. 0, 0.1, 0.5, 1,2, 4,6, 8, 10, 25, 50, 100, 250 또는 500nM의 뉴클레오캡시드 단백질과 100pM의 표지된 ＃SE8-6 RNA, 40U RNase 저해제를 1차 결합완충용액에 넣고, 최종 부피를 20㎕ 맞추어 상온에서 30분간 반응하였다. 반응 후, 반응산물을 5%(w/v) 네이티브(native) 젤에서 130V 전압으로 4시간 30분간 전기영동하고, 이를 건조시킨 후, 분석하였다(참조: 도 2). 도 2는 젤 이동분석법에 의하여 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 ＃SE8-6 RNA와 RNA 라이브러리의 결합친화도를 분석한 그래프로서, (●)는 ＃SE8-6 RNA를 나타내고, (■)는 RNA 라이브러리를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 소량의 뉴클레오캡시드 단백질에 대하여 ＃SE8-6 RNA가 RNA 라이브러리에 비하여 약 50배 정도의 결합친화도를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 6: 경쟁적 억제반응을 통한 RNA의 특이적 결합반응분석

경쟁적 억제반응을 통하여, 실시예 4로 부터 선택된 RNA ＃SE8-6가 특이적으로 뉴클레오티드캡시드 단백질에 결합하는지를 알아보기 위하여, 100nM의 뉴클레오캡시드 단백질, 100pM의 표지된 ＃SE8-6 RNA 및 40U RNase 저해제를 1차 결합완충용액에 넣고, 최종 부피를 20㎕로 맞추어 상온에서 30분간 반응하였다. 대조군으로서, 100pM의 표지된 RNA 라이브러리를 이용하였다. 경쟁자(competitor)로는 표지되지 않은 RNA 라이브러리를 이용하였는데, 경쟁적 억제반응을 수행하기 위하여, 표지된 RNA와 표지되지 않은 RNA를 1:0, 1:500, 1:1,000, 1:5,000 및 1:10,000으로 혼합하여 반응시키고, 그 결과는 실시예 5의 젤 이동분석법으로 측정하였다(참조: 도 3). 도 3은 RNA ＃SE8-6의 경쟁적 억제반응을 나타내는 그래프로서, X축은 표지된 RNA에 대한 표지되지 않은 RNA의 비율을 나타내고, Y축은 결합정도를 나타내며, (■)는 RNA ＃SE8-6를 나타내고, (●)는 RNA 라이브러리를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, RNA 라이브러리를 경쟁자로 사용하였을 때는 양의 증가에 상관없이 경쟁적 억제반응일 일어나지 않았으나, #SE8-6 RNA를 사용하였을 때는 1000배의 경쟁자를 넣을 때부터 특이적으로 경쟁적 억제반응이 일어났으므로, RNA ＃SE8-6가 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 HIV-1의 뉴클레오캡시드 단백질과 결합하여, HIV-1의 증식을 억제하는 RNA를 제공한다. 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질과 결합하는 RNA는 HIV의 증식에 중요한 역할을 하는 뉴클레오캡시드 단백질의 기능을 억제하여 HIV의 증식을 저해할 수 있으므로, HIV의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

제 1형 인간면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus-1, HIV-1)의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질과 특이적으로 결합하는 다음과 같은 RNA: RNA #SE8-4(서열번호 1), RNA #SE10-3(서열번호 2), RNA #SE10-12(서열번호 3), RNA #SE10-7(서열번호 4), RNA #SE8-6(서열번호 5), RNA #SE10-1(서열번호 6), RNA #SE10-8(서열번호 7), RNA #SE8-11(서열번호 8), RNA #SE8-10(서열번호 9), RNA #SE10-2(서열번호 10), RNA #SE10-11(서열번호 11), RNA #SE8-7(서열번호 12), RNA #SE8-13(서열번호 13), RNA #SE10-9(서열번호 14), RNA #SE10-4(서열번호 15).