KR20030007111A - 황금추출물을 함유하는 신경세포 보호 및 재생용 조성물 - Google Patents
황금추출물을 함유하는 신경세포 보호 및 재생용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 황금추출물을 함유하는 신경세포의 보호, 성장촉진 및 재생용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 신경줄기세포와 분화된 신경세포에서의 세포사멸 방어효과, 신경세포의 분화 유도효과, 신경돌기의 재생효과, 뇌신경 신경재생 효과, 말초신경재생효과, 신경근 접합부 재형성 효과, 치매 및 뇌허혈 동물의 신경 세포사멸 방어와 재생효과가 우수하였다.
따라서 본 발명의 조성물은 다양한 종류의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료제와 학습능력 향상제로 매우 유용하게 사용될수 있다.
Description
본 발명은 황금추출물을 함유하는 신경세포의 보호, 성장촉진 및 재생용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 황금추출물을 함유하는 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 다양한 종류의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료제와 학습능력 향상제로 매우 유용하게 사용될수 있다.
신경세포와 신경세포간의 연결을 시냅스(synapse)라고 하며, 평균적으로 신경세포 1개는 다른 신경 세포와 약 1000-5000개의 시냅스를 이루며 인간의 뇌에는 적어도 1011개 정도의 신경세포가 있을 것으로 추정된다. 따라서 뇌내에는 적어도 1014개 이상의 무수한 시냅스 연결이 있을 것이며 이 수 많은 신경망을 통해서 인간의 모든 복잡하고 다양한 기능, 즉 사고, 인식, 기억, 학습, 행동과정이 수행되고 있는 것이다. 이러한 많은 시냅스의 연결은 신경세포의 생존에 필수적인 요건이며 각 신경세포간의 연결에 따른 특수한 기능이 수행되므로써 다양하고 무한한 고차원의 뇌 기능이 인간에게서 표출되게 되는 것이다. 시냅스의 주체인 신경세포의 특징은 특히 중추신경계의 경우 손상을 받으면 재생하기 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 손상신경 조직 또는 아직 확실하게 규명되어 있지 않은 만성퇴행성 질환을 치료할 방법에 대한 발상과 시도들이 다방면에서 이루어지고 있다. 1940 년대에 Hamburger와 Levi-Montalcini들이 Chick embryo limb의 분화과정에서 운동신경세포 생존에 결정적인 미지의 물질을 발견하고 그 근거로 제기한 신경성장인자가설(neurotrophic factor hypothesis)을 바탕으로 NGF(nerve growth factor)가 발견되었고, 그 후에 뇌로부터 유도된 BDNF(brain-derived neurotrophic factor), NT-3(neurotrophic factor-3) 등의 신경성장인자(neurotrophic factor)들이 발견되었다. 아울러 각 분화신경세포 집단의 생존에 어떤 종류의 신경성장인자들의 공급이 필수적인 지에 대해서도 일부 형질전환 동물실험상에서 밝혀져 있다. 물론 신경세포의 생존에는 각종 뉴로트로핀(neurotrophin)들 만이 관여하는 것은 아니고 여러 종류의 싸이토카인(cytokine)들도 참여하고 있음이 밝혀지고 있다. 신경세포의 생존에는 그 외에 또 다른 많은 요인들이 관여하겠지만 뉴로트로핀이나 싸이토카인의 공급이 중단되거나 이 인자들을 받아들이는 수용체들이 세포에서 발현되지 않을 경우에 세포는 사망하게 되고 이러한 인자들이 공급될 때 세포는 생존 할 수 있는 것이다. 신경세포가 죽음에 이르는 형태는 일반 다른 세포의 경우처럼 세포자멸사(apoptosis)와 괴사(necrosis)로 대별된다. 이들은 서로 다른 형태학적, 분자생물학적 특징을 나타낸다. 축색돌기(axon)가 절단되면(axotomy) 세포체가 붙어있는 부분과 시냅스를 형성하고 있던 말단부분이 두 부분으로 분리된다. 축색돌기의 절단은 표적 세포체로부터 공급받는 여러 고유한 단백질 인자의 단절로 인한 시냅스의 변성 뿐 만 아니라, 축색돌기가 절단된 신경세포에 접촉하고 있는 시냅스들의 대부분이 탈리되는 현상(synaptic detachment)이 일어난다. 즉 재생이 성공적으로 이루어진다면 세포가 생존 할 수 있겠지만 대부분의 신경세포는 이로 인해 결국 세포자멸사의 형태로 사망한다. 사망한 신경세포의 자리는 흔히 말초신경계에서는 신경교세포(glia cell)로, 중추신경계에서는 미세교세포(microglia) 또는 신경별교세포(astrocyte)로 대치되는 과정(synaptic stripping)이 진행된다. 또한 손상의 정도에 따라 여기에 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage)등의 면역계 세포들이 참여할 수 도 있다. 신경세포의 물리적인 손상을 포함하여 급성 신경독성, 급 만성 신경장애, 간질, 치매의 기전은 너무나 많은 방면에서 이론이 제기되고 있지만 이들 질환의 궁극적인 공통무대는 특정 신경 세포들과 그 지지 조직이다. 이 세포들이 수직 및 수평 방향으로 뻗고 있는 수많은 수상돌기들과 축색돌기들의 연결, 이들로 이루어지는 수많은 신경회로의 이상이 신호전달계의 이상을 초래하고 다양한 뇌신경계질환으로 나타나는 것이다. 현재 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트(glutamate)에 반응하는 글루타메이트성 신경회로는 급 만성 뇌신경질환 발병에 가장 주목받고 있는 신경회로이다.
포유동물의 뇌는 신경줄기세포(neuronal stem cell)의 분열과 분화 및 생존과 사멸(apoptosis) 그리고 시냅스 형성 등 일련의 과정을 거쳐 체계적인 신경회로망(neural network)을 발생(development)함으로서 복잡한 기능을 수행할 수 있게 된다. 동물의 성체시기에도 뇌신경세포에서는 신경성장에 필요한 많은 물질을 생산하여 축색돌기(axon)과 수상돌기(dendrite)가 성장하게 되고 새로운 학습과 기억을 할 때마다 시냅스 연결과 신경회로망(neural network)을 끊임없이 재구성(synaptic remodeling)하므로 성체에서도 계속 분화(differentiation)하고 있다고 할 수 있다. 신경세포는 세포분화하고 시냅스를 형성하는 과정에서 신경성장인자와 같은 표적유래 생존인자(target-derived survival factor)를 받지 못하면 세포사멸하며 스트레스와 세포독성물질(cytotoxic agent)에 의한 세포사멸은 퇴행성뇌질환의 주요원인이 된다. 말초신경계는 손상되었을 때는 중추신경계와 달리 축색이 오랜 시간에 걸쳐 재생한다. 신경 상해 부위의 뒤쪽 축색은 월러변성(Wallerian degeneration)으로 알려진 과정에 의해 퇴화되고 신경의 세포체는 축색의 성장(axonal regrowth)을 다시 시작하며 슈반세포는 분열한 후 생존과 사멸에 의해 표적신경을 결정하고 다시 분화하는 등, 발생과정을 다시 거쳐 재생하게 된다.
최근에는 성체에도 신경줄기세포가 있다는 것이 확인되고 있으며 줄기세포가 성체의 뇌에서 발생분화하는 과정은 바로 재생(regeneration)과정이라 할 수 있다(Johansson, C. B., Momma S., Clarke D. L., Risling M., Lendahl U., and Frisen J. (1999) Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system,Cell96, 25-34). 신경줄기세포는 주로 측뇌실(lateral ventricle)과 맞닿는 줄무늬체(striatum)의 부뇌실 구역(subventricular zone)에서 발견되고 또한 해마(hippocampus)의 치상회(dentate gyrus)에 있는 subgranular zone에서 줄기세포들이 분열하여 과립세포(granule cell)로 되며 이 세포들이 분화하여 기능을 가질 수 있다(van Praag et al.,Nature415, 1031-1034 (2002). 따라서 신경줄기세포의 발생과 분화를 증진하면 신경재생을 촉진할 수 있다.
포유동물의 뇌 발생과정에서는 생성된 신경세포의 반 이상이 세포사멸 한다. 또한 신경세포는 신경계 질환에서 뿐 아니라 정상 성인의 뇌에서도 매일 많은 숫자가 죽어가며 노화하는 신경계에서는 말할 나위도 없다(Yuan and Yankner,Nature.407, 802-809 (2000). 따라서, 신경세포의 세포사멸을 극복하는 것은 중추신경계의퇴행성 뇌질환 뿐 아니라 척수손상 및 말초신경계 손상 등 거의 모든 신경계 질환에서 중요한 문제가 된다. 최근 유럽에서는 퇴행성뇌질환 환자 특히 파킨슨씨병 환자의 경우 태아에서 얻은 신경줄기세포를 이식하는 것이 임상적으로 적용되고 있는데 이식 후에 환자는 매우 빨리 회복되어 행동이 좋아지지만 3달 후면 대부분의 이식된 세포가 사멸하여 다시 이식해야 하는 것이 문제이다(Olanow C. W., Kordower J. H., Freeman T. B. (1996) Fetal nigral transplantation as a therapy for Parkinson's disease.Trends Neurosci.19, 102-109.) 신경계에서 장기적 생존을 증진하기 위해서는 결국 이식된 세포가 그 조직에 적합한 종류의 신경세포로 분화하여 표적세포와 시냅스를 만들고 전기적 신호전달에 참여하여 표적세포로부터 계속해서 생존인자를 공급받아야 가능하다.
신경세포 사멸에 대한 연구는 분화된 신경세포에서는 많이 연구되어왔으나 신경줄기세포에서는 연구 보고가 거의 없으며 신경세포 사멸을 극복할 수 있는 물질에 대한 연구도 아직 미비하다.
신경줄기세포는 분열하여 자기 자신과 또는 분화할 세포를 만드는데 이때 세포분열이 잘못되었거나 필요 없는 세포는 세포자연사(cell death)하게 되고 생존(survival)하게 된 세포는 앞으로 어떤 세포로 분화할 것인지 운명을 결정하게 된다. 신경세포로 분화하는 신경전구세포(neuronal precursor 또는 neuroblast)는 그 장소에 적합한 신경전달물질을 분비하는 세포로 분화하게 되고 신경교세포로 분화하는 신경교 전구세포(glial precursor)는 신경별교세포와희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화한다. 이들은 신경세포를 보조하는 세포로 신경별교세포는 기계적 대사적으로 지지하고 성체 뇌의 70-80%를 이루며, 희소돌기아교세포는 신경축색을 둘러싸서 신경전달을 빠르게 하는 지방물질인 미엘린(myelin)을 생산한다. 태아와 성체의 중추신경계 신경줄기세포는 뇌조직 내의 삼차원적 환경과 그들이 전달받는 신호의 종류에 따라 세 가지 종류 뇌세포를 모두 만들 수 있다.
중추신경계 줄기세포로 세 가지 종류가 보고되었는데 이들 모두 설치류 성체 뇌에 존재하고 인간의 성체 뇌에도 존재할 것으로 보인다. 한 종류는 뇌실 구역과 부뇌실 구역으로 알려진 뇌실(ventricle)과 맞닿는 부위의 뇌조직에 존재한다. 뇌실은 뇌척수액(cerebrospinal fluid)이 흐르는 공간이다. 태아 발생과정에서 뇌실 주변 조직은 세포 분열이 매우 활발히 일어나는 부위이고 성체에도 이 부위에 줄기세포가 존재하나 조직이 훨씬 작아져 있다. 줄기세포가 존재하는 두번째 부위는 사람에서는 아직 발견되지 않은 부위로 측뇌실과 후각망울(olfactory bulb)를 연결하는 길다란 틈을 이루는 부위(rostral migratory stream)이고, 세번째 부위는 기억의 형성에 관계하는 뇌 부위인 해마로 성체 쥐와 사람의 뇌에서 존재한다.
해마에서 줄기세포가 있는 부위는 치상회(dentate gyrus)의 subgranular zone이다. 쥐에서 BrdU(bromodeoxyuridine)로 분열하는 세포를 표지했을 때 표지된 세포의 반 정도가 치상회의 과립세포(granule cell)로 분화하고 15%는 신경교세포로 분화하며 나머지는 확실한 표현형을 갖지 않는다.
사람과 쥐의 치상회에서 BrdU표지된 일부 세포들은 신경세포 표지자인 NeuN,neuron-specific enolase, 또는 calbindin 등을 발현하며 이들 신경 유사세포들은 치상회의 과립세포와 형태적으로 유사하였다. 다른 BrdU 표지된 세포들은 신경별교세포(astrocyte)->생략표지자인 GFAP를 발현하였다. 최근 연구에서는 진단 목적으로 BrdU를 주입한 다섯 암 환자(57-72세)의 뇌조직에서 BrdU 표지된 세포를 조사한 결과 가장 나이 많은 환자의 뇌에서 가장 많은 수의 BrdU 표지된 세포가 발견되었으며 이는 해마에서의 신경세포 형성이 생애 마지막까지도 계속된다는 것을 의미한다.
신경성장인자들은 포유동물의 신경발생과정에서 신경줄기세포의 분열·분화와 사멸의 운명결정, 신경과 신경교세포로의 운명결정, 그리고 시냅스 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.
신경성장인자의 수용체는 티로신키나제이며, 그 중 하나인 Fibroblast growth factors(FGF)는 neuroectoderm과 mesoderm-derived cell의 분열을 촉진하는 성장인자로 발견되어 여러 종류가 있으며 특히 isoelectric point에 따라 acidic FGF(aFGF), basic FGF(bFGF)로 나눈다. FGF receptor 중 low-affinity binding site는 membrane-associated proteoglycan이고 FGF가 high-affinity binding site에 결합하는데 필수적이다. High-affinity receptor들은 거의 모두가 receptor-tyrosine kinase이고 FGF가 결합하면 dimer를 이루어 tyrosine을 autophosphorylation시키고 신호를 전달하는 것이 3T3 fibroblast와 platelet에서 알려졌다. FGF 수용체는 4개의 유전자로부터 alternative splicing에 의해 다양한 transcript로 발현되며, 각 type의 수용체는 한가지 이상의 FGF family member와binding할 수 있으며 ligand binding specificity는 receptor type 및 splicing form에 의해서 결정된다. FGF는 mitogen으로써의 활성 뿐 아니라, cell differentiation을 일으키며, pheochromocytoma cell(PC12)에 처리하면 NGF를 처리했을 경우와 같이 neuronal phenotype을 갖는 세포로 분화하게 한다.
FGF 수용체의 신호전달계는 많이 연구되어 있지 않으나 해마의 일차 배양 세포와 PC12세포에 처리하였을 때 tyrosine phosphorylation이 증가하며 mitogen-activated protein kinase(MAP kinase)인 p42 MAP kinase(ERK2)와 p44 MAP kinase(ERK1)가 활성화된다. 또한, bFGF가 c-fos와 같은 transcription factor를 유도하는 것도 알려졌다. FGF는 발생 중인 흰쥐 뇌의 1차 신경세포 배양에서 해마와 대뇌피질신경의 생존과 neurite outgrowth를 증가시키며, glutamate에 의한 excitotoxicity를 감소시키는 것이 발견되었다. 배양된 FGF 수용체의 mRNA는 성체의 뇌에서 많이 발견되며 특히 발생 중인 쥐의 뇌와 해마의 1차 배양된 신경세포에서도 발견되었다. Xenopus의 망막 시신경 세포가 발생하는 중에 FGF는 이들 신경의 생존을 증진시키며 특히 FGF의 발현이 매우 짧은 기간동안 급격히 증가하는 것이 알려져 있다.
해마의 pyramid 신경세포가 발생하기 시작하는 E16에 신경간세포를 1차배양하고 신경성장인자인 FGF를 처리하면 세포의 분열이 증가하고 분화하여 약 30%가 신경세포로, 나머지는 glia 세포로 발달한다. McKay group은 PDGF를 처리하면 약 80%가 신경세포로 분화하도록 운명이 제한되고 신경세포로 분화하여 neuronal marker를 발현하며, 또한 FGF와 EGF를 처리한 후 CNTF를 처리하면 astrocyte로 분화하며thyroid hormone T3는 oligodendrocyte로의 분화를 촉진한다고 발표하였다. 이는 PDGF가 원시신경세포 발생의 매우 초기에 neurotrophic factor로 작용하여 neuronal cell fate를 결정하는 것을 의미한다. 우리는 해마의 원시신경세포주(HiB5)에 PDGF와 FGF를 처리하였을 때 세포사멸이 억제되었고 신경세포 또는 glia로 분화하는 cell fate에 영향을 주는 것을 발견하였다.( Kwon, Y. Kim (1997) Expression of brain-derived neutrophic factor mRNA stimulated by basic fibroblast grwoth factor adn platelet-derived growth factor in rat hippocampal cell line,Mol. Cells7, 320-325.).
신경성장인자들은 신경간세포의 분열개시, 분열한 세포의 수를 사멸과정으로 조절하는 동시에 분화를 시작하도록 하며, 표적유래성장인자로서 정향 이동된 세포의 생존과 잘못된 방향으로 이동된 세포의 사멸을 유도하여 시냅스전 신경세포의 생존을 조절하는 한편 새로운 시냅스 형성과 재구성을 조절한다. 또한 성체의 신경 생존과 시냅스 가소성 및 신경손상 시 재생하는 과정에서도 유사한 기능을 가질 것으로 추측된다. 인간의 경우 중추신경계는 물론 말초신경계도 재생이 어려워 퇴행성 뇌질환 뿐만 아니라 현대사회의 산업재해 및 교통사고, 전쟁불구자 등이 누적되면서 사회문제화 되고 있으므로 신경계의 재생에 관한 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.
한편 황금(黃芩,SCUTELLARIA RADIX)은 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로서 황금은 한방에서 그 뿌리를 해열·이뇨·지사·이담 및 소염제로 이용하여 왔으며, 황금탕(黃芩湯)은 급성위장염으로 설사가 나고, 식욕부진 ·복통 등에 처방되어 왔다.
한국공개특허 제2001-0081188호(US2001/0026813 A1)에는 뇌의 허혈성모델에서 뇌 신경세포손상에 대한 황금알코올추출물의 보호작용과 PC12세포주를 이용한 작용기전 실험에 대한 내용이 공개 되었다.
그러나 본 발명은 상기 선행기술과 달리 황금추출물의 뇌신경 세포의 보호작용 뿐만 아니라 신경세포의 분화, 재생에 대한 효과를 확인 한 것이며, 또한 신경줄기세포 및 말초신경의 보호, 재생, 분화, 재형성에 관한 효과를 처음으로 확인 한 것이다.
본 발명의 목적은 황금추출물을 함유하는 신경세포의 보호, 신경줄기세포를 포함한 신경세포의 분화촉진, 그리고 신경세포 재생용 약학 및 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료에 유용한 황금추출물을 함유하는 약학 및 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 신경세포 보호는 물론, 신경줄기세포를 포함한 신경세포의 분화와 재생을 촉진시킴으로써 다양한 형태의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 사고로 인한 중추 혹은 말초신경손상 등을 치료 및 예방할 수 있고, 더 나아가 학습능력 향상의 효과를 얻을 수 있는 황금추출물 함유 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 HiB5신경세포의 분화를 유도하는 황금추출물의 효과를 공초점 현미경(confocal microscope)으로 촬영한 사진이다. bFGF(basic fibroblast growth factor)를 처리한 상태를 bFGF+로, 처리하지 않은 상태를 bFGF-로 나타내었다.
도 2는 HiB5신경세포의 분화를 유도하는 황금추출물의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 황금추추물(50 ㎍/㎖)을 투여한 후 14일이 경과된 PC12 cell을 200배 확대한 사진으로서, 신경세포돌기가 현저하게 생성됨을 보여주고 있다.
도 4a 내지 4c는 NGF (Nerve Growth Factor. 50ng/ml)를 투여한 후 3일이 경과된 PC12 cell의 신경세포돌기의 생성을 보여주는 사진이다.
도 5는 분화된 신경세포주인 인간 신경아세포종(human neuroblastoma) SH-SY5Y를 사용하여 신경돌기(neurite) 재생에 대한 황금추출물의 효과를 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다. Retinoic acid는 SH-SY5Y의 신경돌기 분화를 일으키는 양성대조군이다.
도 6은 분화된 신경세포주인 인간 신경아세포종(human neuroblastoma) SH-SY5Y를 사용하여 신경돌기(neurite) 재생에 대한 황금추출물의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 황금추추물(50 ㎍/㎖)을 14일 동안 PC12 cell의 배양액에 처리하여 생성되는 신경세포돌기의 길이를 측정하여 막대그래프로 나타낸 것이다[1: 대조군(생리식염수 처치군), 2: NGF (50 ng/ml) 처치군, 3: 황금추추물(50 ㎍/㎖) 처치군].
도 8a는 PC12 cell에서 황금추추물 처치에 의해 나타난 NGF mRNA의 발현을 보여주는 사진으로서 정상군에 비해 황금추추물 처치군에서 현저히 높은 NGF 발현도를 보여주고 있다. 도 8b는 mRNA의 정량에 있어 대조군으로 사용되는 GAPDH mRNA 발현 양상을 보여주고 있다(M: 100 bp DNA marker, 1: 정상군, 2: 50 ng/ml의 NGF를 14일 동안 처치한 군, 3: 50 ㎍/㎖의 황금추추물을 7일 동안 처치한 군, 4: 50 ㎍/㎖의 황금추추물을 14일 동안 처치한 군).
도 9a 및 9b는 생후 7일된 흰쥐의 정상 대뇌 절편의 TUNEL 염색을 보여주고 있다. 도 9b는 도 9a의 네모부분을 확대한 사진(배율: X400)이다.
도 10a 및 10b는 MK-801 (0.5 mg/kg)을 생후 7일된 흰쥐에 복강 주사한 1일 후에, 대뇌절편상에서 볼 수 있는 신경세포의 사망양상을 보여주는 사진이다. 도 10a는 대뇌의 전체 coronal 절편을 보여준다(까맣게 나타나는 세포들은 핵 내의 DNA가 분절된 세포에만 양성으로 염색되는 apoptosis 검색법, 즉 TUNEL법에 양성반응을 보이는 세포들이다). 도 10b는 도 10a의 네모부분을 확대한 사진(배율: X400)으로서 apoptosis로 사망한 세포들을 보여준다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 황금추추물(20 mg/kg)만을 생후 4일된 흰쥐에 3일동안 복강내 주사하여 적출한 대뇌 절편의 TUNEL 염색사진으로 황금추추물 자체는 신경세포사를 유발하지 않음을 보여주고 있다. 도 11b는 도 11a의 네모부분을 확대한 사진(배율: X400)이다.
도 12a 및 12b는 본 발명의 황금추추물(20 mg/kg)을 생후 4일된 흰쥐의 복강에 3일 동안 전처치한 후 MK-801 (0.5 mg/kg)을 복강주사한 실험군의 대표사진으로서, MK-801 (0.5 mg/kg)에 의해 유도된 신경세포자멸사의 정도가 본 발명의 황금추추물에 의해서 현저하게 억제됨을 보여주고 있다. 도 12b는 도 12a의 네모부분을 확대한 사진이다(배율: X400).
도 13a 및 13b는 생후 7일된 흰쥐의 복강에 MK-801 (0.5 mg/kg)을 주사하여 신경세포 자멸사를 유도한 후 본 발명의 황금추추물(20 mg/kg)을 5일 동안 복강 주사하여 적출한 대뇌절편 사진으로서, MK-801 (0.5 mg/kg)에 의해 유도된 신경세포자멸사의 정도가 본 발명의 황금추추물에 의해서 현저하게 억제됨을 보여주고 있다. 도 13b는 도 13a의 네모부분을 확대한 사진이다(배율: X400).
도 14는 어린 흰쥐의 대뇌절편상에서 MK-801 (0.5 mg/kg)에 의해 나타나는 신경세포자멸사의 정도가 황금추추물에 의해서 억제되는 양상을 정량적으로 나타낸 그림이다[1: MK-801 (0.5 mg/kg) 단독 투여군, 2: 황금추추물(20 mg/kg)을 단독으로 6일 동안 투여한 군, 3: MK-801 (0.5 mg/kg)을 투여한 후 황금추추물(20 mg/kg)을 6일간 투여한 군, 4: 황금추추물(20 mg/kg)을 3일 동안 전처치한 후 MK-801 (0.5 mg/kg)을 투여한 군].
도 15a는 본 발명의 황금추추물을 용량별로 생후 4일된 흰쥐에 1일(lane 2, 3, 4) 또는 3일(lane 5, 6, 7) 동안 복강 주사한 후에 대뇌 조직에서 발현되는 항고사 유전자인 bcl-2 mRNA의 발현양상을 RT-PCR 방법으로 조사한 것으로써 정상군에 비하여 그 발현이 증가함을 보여주는 사진이다(M: 100 bp DNA ladder, 1: 정상군, 2와 5: 50 mg/kg의 황금추추물 투여군, 3과 6: 20 mg/kg의 황금추추물 투여군, 4와 7: 12.5 mg/kg의 황금추추물 투여군). 도 15b는 GAPDH mRNA의 발현양상이다.
도 16은 신경근접합부 재형성 과정에서 황금추출물의 신경재생효과를 나타낸 사진이다. 대조군에서 신경말단은 하나의 근섬유에 도달하여 있으나 다른 섬유에 퍼지지 못한 상태이고 황금추출물을 투여한 경우 모든 근섬유에 도달하여 신경근 접합부를 형성한 것으로 보인다.
도 17은 황금추출물을 처리한 신경줄기세포를 쥐 뇌에 주입한 후 6주 후에 뇌조직을 신경표지자 NeuN으로 형광 염색하여 황금추출물의 신경분화 효과를 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
본 발명은 황금추출물의 신경세포 성장촉진 및 신경세포 재생용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 신경계의 물리적 손상 및 퇴행성, 허혈성 뇌신경 손상, 말초신경 손상에 대한 예방 및 치료제로 매우 유용하게 이용 될 수 있다.
본 발명에서는 체외(in vitro) 배양된 신경줄기세포를 포함한 여러 가지 신경세포주들을 통해 황금추출물의 신경세포 분화 및 재생 촉진 효과를 검증하였고 체내(in vivo)실험으로는 신경독성 약물처리를 통한 전체적인 뇌 부위의 화학적 신경세포사멸을 유도한 동물모델을 통해 신경세포에 대한 황금추출물의 세포사멸억제 혹은 신경세포보호효과를 조사함은 물론 말초신경손상 동물모델을 통해 손상된 말초신경에 대한 재생 효과도 확인하였다. 보다 구체적으로 체외실험에서는 인간의 신경아세포종(SH-SY5Y), 흰쥐 해마 기원의 신경줄기세포(HiB5), 그리고 흰쥐에서 유래한 PC12 세포 배양액에 황금추출물을 직접 처리하는 방법으로 황금추출물의 신경세포 분화 및 재생 촉진여부를 조사하였다. 그리고 일반적인 퇴행성질환의 공통점인 신경세포사멸 현상을 구현하기 위해 실험동물에 MK-801을 처리하여 뇌세포사멸을 유도한 뒤, 이러한 세포사멸 스트레스에 대한 황금추출물의 세포사멸억제 및 보호효과를 확인하였다. 또한, 좌골신경 파쇄 동물모델을 통해 황금추출물의 말초신경 재생효능을 조사하였다.
상기 실험들을 통해 신경줄기세포를 포함한 신경세포들에 대한 황금추출물의 뛰어난 분화 및 재생 촉진효과와 체내 신경세포사멸 조건에서의 신경세포사멸 억제효과, 그리고 손상된 말초신경에 대한 재생 효과를 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 황금추출물은 단일 혹은 이를 포함한 복합제제 등의 다양한 형태로 신경계 발달장애나 치매를 포함한 일반적인 퇴행성 뇌질환과 각종 신경계 질환, 그리고 교통사고 등으로 인한 중추 및 말초신경계 손상 등을 치료하고 예방하는데 유용할 것으로 판단된다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 황금추출물의 제조
본 발명의 황금추출물은 통상적인 방법에 따라 제조가 가능하다. 즉, 황금의 뿌리를 물, 저급알코올 등을 이용하여 추출물을 제조 할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 건조된 황금의 뿌리를 10∼20 mesh size의 크기로 균질화 한 다음 환류냉각기가 부착된 둥근플라스크에 넣은 후, 열수추출을 한 것을 사용하였다.
2. 다양한 신경 관련세포들의 분화에 미치는 황금추출물의 재생효과
신경세포가 분화하고 신경돌기(neurite)가 재생하는데 황금추출물의 효과를 신경줄기세포(HiB5)와 분화된 신경세포인 신경아세포종(SH-SY5Y), 그리고 PC12 세포를 통해 조사하였다.
1) 분화 유도 효과
먼저 신경줄기세포에서 황금추출물이 세포분화를 유도하는지 조사하기 위해 HiB5 세포를 분화시작조건에서 1일간 배양한 후, 황금추출물을 처리하고 다시 2일간 배양한 뒤, 신경돌기 성장을 관찰하였다. 양성 대조군으로 같은 조건에서 bFGF를 처리하여 신경세포로의 분화를 유도하였다.
그 결과, 황금추출물을 처리한 경우도 신경성장인자인 bFGF를 처리한 경우와 마찬가지로 신경세포로의 분화가 유도되어 세포체(cell body)가 작아지고 신경축색(axon)과 수상돌기(dendrite)의 전구체인 신경돌기가 신장하여 대부분 그 길이가 세포체의 2배 이상이었다. 따라서 황금추출물은 탁월한 신경줄기세포 분화 촉진효능을 지니고 있다.
2) 신경재생 효과
신경세포의 신경돌기(neurite) 재생에 황금추출물이 효과가 있는지 조사하기 위해 SH-SY5Y와 PC12 세포를 사용하여 위와 동일한 방법으로 조사하였다. 신경돌기 성장을 유도하는 레티노산과 NGF는 각 세포들에서 양성 대조군으로 사용되었다. 그 결과, 두 세포 모두에서 황금추출물은 양성 대조군과 동일한 양상의 신경돌기 재생 효과를 보였다.
3. MK-801 모델에서 뇌신경사멸에 대한 황금추출물의 신경재생 및 방어효과
황금추출물을 단독 투여한 어린 흰쥐의 뇌에서는 MK-801로 상해를 입은 어린 흰쥐 뇌의 신경세포들에 비하여 TUNEL 검색에서 양성반응을 보이는 고사신경세포를 발견할 수 없었으며, 황금추출물은 MK-801에 의해 일어나는 세포사멸을 현저히 억제하였다. 또한 황금추출물 투여에 의하여 주요 항-세포사멸(anti-apoptosis) 유전자인 bcl-2 mRNA가 대뇌조직에서 증가함을 관찰할 수 있었다.
현재까지 세포사에 관하여 알려진 바에 의하면(Helmreich, 2001), 신경세포 성장인자의 작용기전은 크게 1) 세포사 지령유전자(death effector gene) 발현을 저지하던가 2) bcl-2 또는 bcl-xL 등의 세포 생존지지유전자(survival promoting gene)발현을 증가시키는데 있다고 본다. 그러므로 황금추출물은 신경성장인자와 유사한 신경세포 성장기능을 가지고 있으며, 분자적 작용기전으로는 대표적인 항-세포사멸 단백질인 Bcl-2의 생산을 증가시킴으로써 신경세포사멸을 효율적으로 억제할 수 있는 것으로 사료된다.
4. 황금추출물에 의한 말초신경계 좌골신경(sciatic nerve) 재생효과
인간의 경우 중추신경계는 물론 말초신경계도 재생이 어려워 퇴행성 뇌질환 뿐만 아니라 현대사회의 산업재해 및 교통사고, 전쟁불구자 등이 누적되면서 사회문제화 되고 있으므로 신경계의 재생에 관한 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.
말초신경계가 발생하고 재생하는 과정에서 슈반세포는 중요한 역할을 한다. 배아가 발생하는 동안에 신경릉(neural crest)에서 기원하는 슈반세포는 축색이 점유하게 될 곳을 따라 미리 분열하므로 말초 신경계의 축색이 슈반세포에 의존하여 성장하게된다. 특히 슈반세포는 영양인자(trophic factors)를 생산하여 신경의 생존과 신경돌기 성장을 조절한다. 또한 신경은 축색에서 뉴레글린(neuregulin)을 분비하여 슈반세포의 생존을 증진하고 축색과 슈반세포의 비율을 조절하며 이때 축색의 영향을 받지 못한 슈반세포는 사멸한다. 발생후기에 슈반세포는 미엘린 수초를 생산하여 축색을 감싸서 슈반세포의 분화가 완성된다.
신경발생이 끝난 성체에서, 말초신경이 다친 경우에는 그 상해 부위에서 신경말단 쪽의 축색부분(distal stump)은 월러퇴행(Wallerian degeneration)이라고 알려진 과정을 통해 점차 퇴화한다. 이때 상해 부위로부터 세포체 쪽의 축색(proximal stump)은 재성장을 시작한다. 상해 부위의 신경말단 쪽의 축색부분에서는 퇴화한 축색과 수초물질을 제거하고 상해 부위로부터 세포체 쪽의 축색부분은 축색이 새롭게 자랄 수 있도록 환경을 조성한다(Kwon, Y. Kim, Bhattacharyya, W.V., Cheon, K., Stiles, C.D., and Pomeroy, S.L. (1997) Activation of ErbB2 during Wallerian degeneration of sciatic nerve,J. Neurosci.17, 8293-8299; Joung, I., Kim, H.S., Hong, J.S., Kwon, H., and Kwon, Y.K. (2000) Effective gene transfer into regenerating sciatic nerves by adenoviral vectors: potentials for gene therapy of peripheral nerve injury.Mol. Cells10, 540-545).
신경이 다친 후 슈반세포는 즉시 급격히 분열하는데 이것은 축색과의 접촉 상실이나 축색이 분비하는 성장인자에 의해 촉진되는 것으로 생각되어왔다. 축색이 재성장하는 동안에 슈반세포가 축색에 접촉하면 다시 분화하여 수초를 재생한다. 세포 표면에서의 상호작용 이외에도 슈반세포는 멀리서도 재생하는 축색에 영향을 줄 수 있다. 신경이 절단된 후 1cm만큼 떨어져 있어도 축색은 distal stamp를 향해 재생한다. 이 때의 축색의 정향운동은 distal stump에 살아있는 슈반세포가 존재해야 일어난다.
말초신경계의 재생과정에서는 먼저 슈반세포가 절단된 축색으로부터 분리되어 다시 분열능력을 얻게되는 탈분화(dedifferentiation) 과정, 상처부위로 부터 신경세포의 축색이 다시 자라나오는 과정, 그리고 다시 자라나온 축색을 슈반세포가 미에린 수초로 감싸는 재분화(redifferentiation) 과정과 축색이 근육까지 자라서 다시 근육세포에 신경근 접합부(neuromuscular junction)를 만드는 과정으로 크게 나눌 수 있다.
본 발명에서는 말초신경계에서 가장 신경섬유가 많이 지나가는 좌골신경을 사용하여 그 재생과정에서 황금추출물이 축색돌기의 재성장, 미엘린 수초의 재생, 근육세포에 신경근 접합부를 만드는 과정에서 재생을 촉진하는지 조사하였다.
본 발명에서는 흰쥐의 좌골신경에 PBS(phosphate-buffered saline) 또는 황금추출물을 복강주사한 뒤 봉합하여 1주, 2주와 4주 뒤에 신경재생 정도를 관찰하였다.
그 결과, 황금추출물은 말초신경 재생과정에서 축색돌기의 성장과 미엘린 수초의 재생을 촉진함을 알 수 있다.
또한 신경근접합부에서 신경말단의 재생에 영향을 주는지 보기 위해 수술 4주 후에 좌골신경에 연결된 뒤다리 근육을 분리하여 관찰 한 결과 수술 4주 후에 대조군에서는 신경말단이 염색되었으나 근육 한부위에 모여 있고 아직 근섬유 각각에 퍼져 하나씩의 신경근접합부를 형성하지 못했으나 황금추출물을 주사한 경우에는 신경말단이 근섬유에 퍼져 있는 것이 관찰되었다
따라서 황금추출물은 말초신경 재생과정에서 축색돌기의 성장, 미엘린 수초의 재생과 신경근접합부를 형성하기 위한 신경말단 재생을 촉진하는 것으로 판단된다.
5. 신경재생과정에서 신경성장인자와 황금추출물의 역할
신경성장인자들은 신경줄기세포의 분열개시, 분열한 세포의 수를 사멸과정으로 조절하는 동시에 분화를 시작하도록 하며, 표적유래성장인자로서 정향 이동된 세포의 생존과 잘못된 방향으로 이동된 세포의 사멸을 유도하여 시냅스전 신경세포의 생존을 조절하는 한편 새로운 시냅스 형성과 재구성을 조절한다. 또한 성체의 신경 생존과 시냅스 가소성 및 신경손상 시 재생하는 과정에서도 유사한 기능을 가질 것으로 추측된다. 황금추출물은 신경줄기세포의 분화를 유도하고 세포사멸을 방어하며 신경돌기 분화를 촉진하므로 신경성장인자와 유사한 기능을 수행하는 것으로 사료된다.
본 발명에 따른 황금추출물은 흰쥐를 이용한 생체실험에서 일반적인 급성독성 및 간기능에 대한 부작용을 나타내지 않았다. 황금추출물의 투여용량은 통상적으로 1일 100-800mg/60kg(체중) 정도, 1일 2-3회 투여하는 것이 바람직하며 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 건강상태에 따라 증감될 수 있다.
황금추출물은 통상적인 방법에 따라 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용 할 수도 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 황금추출물은 각종 신경계 질환의 예방 및 치료 목적으로 약학제제로 제조되거나 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 또한 본 발명은 치매, 만성 간질, 중풍, 허혈성 뇌질환, 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease)등의 퇴행성 뇌질환의 치료효과를 나타내는 의약품 또는 식품(각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류)으로 제공될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하겠으나, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 본 발명의 일반적인 실험방법
1) 신경세포주 배양
흰쥐 배아의 해마에서 기원하는 HiB5 세포는 bFGF(20ng/ml)를 넣어주면 생존이 증가하고 신경세포로 분화하여 신경세포 표지분자를 발현한다. 세포배양배지는 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, sodium pyruvate(0.11g/L)를 첨가하여 사용하고, 39oC에서 분화시 에는 무혈청 배지(serum-free media)인 N2 (DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, Putreseine, BSA 포함 ;Botten Stein & Sato., 1979)에 피루베이트(pyruvate)를 첨가하여 사용한다.
그외 PC12와 SH-SY5Y 세포의 배양은 10% FBS를 첨가한 DMEM으로 배양하고 분화를 위해서는 무혈청 배지에 NGF나 레티노산을 처리한다.
2) 면역조직화학적 방법(Immunohistochemistry)
해당 조직을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 40 um로 동결박절(cryosection)하여 신경 또는 신경별교세포 표지자 항체와 FITC로 표지된 이차항체로 염색한 후, 공초점 현미경으로 관찰한다. 신경세포표지 항체로 세포를 염색하기 위해 배양된 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정한 후 0.5% NP-40로 5분간 삼투하고, 1% BSA 용액을 사용하여 30분간 차단(blocking)과정을 거친다. 일차항체로 4℃에서 약 12시간 반응한 후, FITC로 표지된 이차항체 또는 rhodamin(TRITC)으로 표지된 이차항체로 1시간 다시 반응하고 고정하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
3) 흰쥐의 좌골신경 파쇄
Sprague-Dawley 흰쥐(male 약 200g)를 pentobarbital(50mg/kg)로 마취시킨 후 왼쪽 좌골(sciatic notch)를 노출시키고, 좌골신경에서 동맥을 제외하고 신경섬유를 자르거나 #9 혈관봉합사로 양쪽을 묶고 가운데를 홍채 절제 가위(iridectomy scissors)로 자른다. 또는 파쇄모델에서는 파쇄용 집게를 사용하여 신경섬유를 두 번 완벽하게 파쇄한다. 신경 손상 후 여러 시간대(6시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일)에서 proximal stump, distal stump를 각각 얻어 손상 및 재생상태를 조사한 후 실험에 적용한다. 오른쪽 좌골신경을 대조군으로 이용하였다.
실시예 2. 황금 추출물의 제조
(1) 열수추출물의 제조
1) 서울 경동약령시에서 5년근 황금을 구입하였다.
2) 황금 뿌리를 증류수로 1차 세정한 후 상온의 그늘에서 혹은 40℃ 이하로 맞추어진 건조기에서 24시간 동안 충분히 건조하여 잡질을 제거한다.
3) 임의의 크기로 약재를 절단한 후, 이산화규소(Silicagel, 흡습제)가 채워진 데시케이터에서 다시 24시간 건조한 후 10-20 mesh size의 크기로 균질화 한다.
4) 균질화된 황금 뿌리 1kg을 취하여 환류냉각기가 부착된 3L 용량의 둥근플라스크에 넣은 후, 열수 추출을 위하여 증류수 1L를 가한다.
5) 황금 뿌리와 증류수를 잘 섞은 후 100℃에서 3시간 동안 가열한다.
6) 열수 추출 과정 후에 추출액을 상온까지 냉각한 후에 100mesh로 여과하여 8 Brix농도의 추출물 7.5L를 얻었다.
7) 이 추출물을 60배 희석하여 0.2Brix(고형분 0.2%)로 하여 사용하였다.
(2) 에탄올추출물의 제조
1) 서울 경동약령시에서 5년근 황금을 구입하였다.
2) 황금 뿌리를 증류수로 1차 세정한 후 상온의 그늘에서 혹은 40℃ 이하로 맞추어진건조기에서 24시간 동안 충분히 건조하여 잡질을 제거한다.
3) 임의의 크기로 약재를 절단한 후, 이산화규소(Silicagel, 흡습제)가 채워진 데시케이터에서 다시 24시간 건조한 후 10-20 mesh size의 크기로 균질화 한다.
4) 균질화된 황금 뿌리 2kg을 취하여 환류냉각기가 부착된 3L 용량의 둥근플라스크에 넣은 후, 추출을 위하여 에탄올 20L를 가한다음 100℃에서 3시간 동안 가열한다.
6) 추출 과정 후 추출액을 상온까지 냉각한 후에 100mesh로 여과하여 4 Brix농도의 추출물 17L를 얻었다.
7) 이를 진공농축하여 에탄올을 제거하고 정제수를 가하여 20 Brix농도의 농축액을 만든다음, 0.2%로 희석하여 실험에 사용하였다.
실시예 3. 다양한 신경 관련세포들의 분화에 미치는 황금추출물의 재생효과
1) 분화 유도 효과
먼저 신경줄기세포에서 황금추출물이 세포분화를 유도하는지 조사하기 위해 HiB5 세포를 분화시작조건에서 1일간 배양한 후, 황금추출물을 50 ug/ml 농도로 처리하고 다시 2일간 배양한 뒤 신경특이적 표지분자로 면역염색(immunostaining)하고 공초점 현미경을 사용하여 신경돌기의 성장을 관찰하였다. 양성 대조군으로 위와 동일한 조건에서 bFGF(20ng/ml)를 처리하여 신경세포로의 분화를 유도하였다. 신경세포의 분화정도는 신경 특이적 표지분자인 항-신경세사(anti-neurofilament) 항체와 FITC로 표지된 이차항체(녹색)를 사용하여 신경돌기를 염색하고 세포핵은 프로피디움 요오드(propidium iodide, 적색)로 이중염색하였다.
도1에서 보는 바와 같이 bFGF를 처리하면 신경세포로의 분화가 유도되어 세포체가 작아지고 축색돌기와 수상돌기의 전구체인 신경돌기가 나와 길이가 길어진다. 황금추출물을 처리한 경우에도 이와 동일한 세포형태 변화를 보이고 아무 것도 처리하지 않은 대조군에 비해 분화가 유도된 신경세포수가 4배까지 증가되었다(표1, 도2 참조).
[표1]
| N2 | 황금추출물 | |
| 분화된 평균세포수/전체 평균세포수 | 3.07/22.38 | 13.42/21.00 |
| 평균(%) | 14.46 | 63.55 |
2) 신경재생 효과
신경세포의 신경돌기 재생에 황금추출물이 효과가 있는지 조사하기 위해 분화된 신경세포주인 SH-SY5Y와 PC12 세포를 사용하여 조사하였다. 양성 대조군으로는 각각의 세포에 레티노산(50uM 농도로 처리)과 NGF(50ng/ml 농도로 처리)를 처리하여 신경돌기의 재생을 보았으며, 황금추출물을 각각 50 ug/ml 농도로 처리했을 때, 두 세포 모두에서 양성 대조군과 마찬가지로 신경돌기가 신장되었다(도3, 도4, 도5 참조). 특히, SH-SY5Y에 황금추출물을 처리한 경우 세포체 길이의 3배 이상되는 신경돌기를 가지는 세포수의 비율이 아무 것도 처리하지 않은 대조군에 비해 약 1.5배 많아졌다(표2, 도6 참조).
[표2]
| N2 | 레티노산 | 황금추출물 | |
| 분화된 평균 세포수/전체 평균세포수 | 22.30/42.33 | 18.91/24.75 | 25.06/35.06 |
| 평균(%) | 44.47 | 81.59 | 69.25 |
실시예 4. PC12 세포주에서의 신경세포돌기 정량 비교
1) PC12 세포주의 배양액에 황금추출물 50 ㎍/㎖처치군, 생리식염수 처치 군, NGF 50 ng/ml 처치군을 2주이상 배양 하면서 생성되는 신경세포돌기의 길이를 측정하였다.
2) 신경세포돌기의 생성을 신경세포 분화지표로 간주하여 분화지수를 다음과 같이 산출하였다. 신경세포돌기발현을 볼 수 없는 세포를 0, 발현된 신경세포돌기 길이가 세포체의 직경 미만이면 1, 발현된 신경세포돌기 길이가 세포체 직경 정도이면 2, 신경세포돌기 길이가 세포체 직경의 1배 이상 2배 이하이면 3, 신경세포돌기 길이가 세포체 직경의 2배 이상 또는 다른 세포의 신경세포돌기와 synapses를 형성하면 4의 점수로 계산하였다. 분화지수는 각 약물 처치군의 microculture well에서 200개의 분화세포를 1단위로 하여 5개의 영상을 통계 처리하였다.
3) 그 결과는 도 7로서 황금추출물 처치군은 생리식염수 처치군에 비하여 신경돌기생성이 현저히 우수하였다.
실시예 5. PC12 세포주에서의 NGF mRNA 및 GAPDH mRNA 발현양상 비교
1) PC12 세포주의 배양액에 황금추출물 50 ㎍/㎖처치군, 생리식염수 처치군, NGF 50 ng/ml 처치군을 2주이상 배양 한 후 NGF mRNA 및 대조군인 GAPDH mRNA 발현 양상을 RT-PCR 방법으로 조사하였다.
* RT-PCR 방법
가) Total RNA 분리
조직 100 mg당 TRI Reagent?(Molecular Research Center Inc., USA) 1 ㎖를 넣고 균질화 시킨 후 상온에 10분간 방치하였다. 균질액 1 ㎖당 0.1 ㎖의 BCP (Sigma, USA)를 넣고 1분간 잘 혼합하고 4℃에 10분간 방치하였다가 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 차가운 isopropanol을 넣고 -20℃에서 16시간 이상 방치하였다. 그 후 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 얻은 RNA 침천물을 DEPC (diethylpyrocarbonate) 처리된 차가운 75% 에탄올로 세척하고 SpeedVac을 이용하여 건조시켰다. 건조시킨 RNA를 DEPC 처리된 증류수를 넣어 녹인 후 260 nm 파장에서 분광광도계로 농도 및 순도를 측정하고 -20℃에 보관하여 사용하였다.
나) cDNA 합성(Reverse Transcription: RT)
Total RNA 2 ㎍에 대하여 4.0 ㎕의 5X RT buffer, 1.0 ㎕의 oligo(dT16) (100 pmoles/㎕), 4 ㎕의 10 mM dNTPs (Promega, USA), 0.5 ㎕의 RNasin (40 Units/㎕, Promega, USA), 1.0 ㎕의 MMLV reverse transcriptase (200 units/㎕, Promega,USA)를 혼합하고 반응액의 전체부피가 30 ㎕되게 DEPC 처리된 증류수를 첨가하였다. 이 반응액을 DNA thermal cycler (Perkin Elmer 2400, USA)에서 42℃에서 1시간동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
다) 중합효소연쇄반응 (Polymerse Chain Reaction: PCR)
RT 산물 1 ㎕ 기준으로 sense 및 antisense primers (각 10 pmoles), 1 ㎕의 10 mM dNTPs, 2 ㎕의 10X buffer (20 mM Tris-Cl, 1.5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.1 ㎎/㎖ gelatin, pH 8.4), 1 unit의TaqDNA polymerase (Promege, USA)를 첨가하여 반응액의 전체부피가 25 ㎕가 되게 증류수를 첨가하여 DNA thermal cycler (Perkin Elmer 2400, USA)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
라) 전기영동 및 분석
증폭된 PCR 산물 10 ㎕를 1.5 % agarose gel에 전기영동하여 gel documentation system (Bio-Rad Lab, USA)을 이용하여 밀도를 측정, 비교하였다.
2) 그 결과는 도 8a 및 도 8b로서 황금추출물 처치군은 생리식염수 처치군에 비하여 현저히 높은 NGF 발현도를 보여주고 있다.
실시예 6. MK-801모델에 의한 황금추출물의 뇌 신경세포재생 및 방어효과 확인
1) MK-801 유발 신경세포자멸(apoptosis) 모델
MK-801은 동물실험에서 주사 후 10∼30분만에 혈청 및 뇌조직에 최고치에 도달하고 흰쥐에서 반감기는 1.9시간으로 추정되고 있다(Vezzani, A., Serafini, R., Stasi,M.A., Caccia, S., Conti, I., Tridico, R.V. and Samanin, R. (1989) Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats.
J Pharmacol Exp Ther249, 278-83). Ikonomidou 등은 어린 흰쥐(생후 7-8일)에 MK-801을 투여하여 NMDA 수용체를 억제하면(2-3시간 정도) 감수성이 높은 NMDA성 신경세포들이 사멸의 경로를 거쳐 사멸하며 부위에 따라 다르지만 사망하는 신경세포의 수는 전체의 12∼26%에 이른다는 것을 발견하였다(Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vockler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L. and Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain.Science283, 70-4).
2) 본 발명에 따른 황금추출물의 신경세포보호기능은 생후 7일된 어린 흰쥐에서 MK-801로 유도된 신경세포 고사모델을 이용하여 검정하였다.
즉 어린 흰쥐를 5개의 군 즉, 가) 생리식염수 단독투여군, 나) MK-801(0.5 mg/kg) 단독투여군, 다) 황금추출물(20 mg/kg) 단독투여군, 라) 황금추출물(20 mg/kg) 전처치 후 MK-801(0.5 mg/kg) 투여군, 마) MK-801(0.5 mg/kg) 전 처치후 황금추출물(20 mg/kg) 투여군으로 나누고 모든 약물은 복강 주사하였다.
뇌신경세포의 관찰방법은 실험동물을 마취 하에서 희생시키고 뇌를 적출하여 포르마린에 고정한 후 조직절편을 제작하고, 그 조직절편에서 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 기법(Gavrieli et al, 1992)을 이용하였으며 광학현미경(Olympus BX 50)으로 1.25배 및 400배로촬영하였다. 실험결과는 하기와 같다.
가) 생리식염수 단독투여군
도9a 및 9b는 생후 7일된 흰쥐의 정상 대뇌 절편의 TUNEL 염색을 보여주고 있다.
나) MK-801 단독투여군
MK-801 (0.5 mg/kg)만을 생후 7일된 흰쥐에 복강 주사한 1일 후에, 대뇌절편의 신경세포의 사망양상을 확인하였다.
도 10a 및 10b는 대뇌 관상절편(coronal)을 보여준다. 까맣게 나타나는 세포들은 핵 내의 DNA가 분절된 세포에만 양성으로 염색되는 사멸검색법, 즉 TUNEL법에 양성반응을 보이는 세포들이다.
다) 황금추출물 단독투여군
본 발명의 황금추출물(20 mg/kg)만을 생후 4일된 흰쥐에 복강내 주사한 후 3일 째 적출하여 대뇌 절편을 TUNEL 염색사진으로 관찰하였다. 황금추출물 자체는 신경세포사를 유발하지 않음을 보여주고 있다(도 11a 및 도 11b)
라) 황금추출물 전처치 후 MK-801 투여군
황금추출물(20 mg/kg)을 생후 4일된 흰쥐의 복강에 3일 동안 전처치한 후 MK-801 (0.5 mg/kg)을 복강주사한 후 상기의 방법으로 대뇌절편을 관찰하였다. 그결과 MK-801에 의해 유도된 신경세포자멸사의 정도가 본 발명의 황금추출물에 의해서 현저하게 억제됨을 확인 할 수 있었다(도 12a 및 12b 참조)
마) MK-801(0.5 mg/kg) 전 처치후 황금추출물(20 mg/kg) 투여군
생후 7일된 흰쥐의 복강에 MK-801 (0.5 mg/kg)을 주사하여 신경세포 자멸사를 유도한 후 본 발명의 황금추출물을(20 mg/kg)을 5일 동안 복강 주사한 후 적출한 대뇌절편을 관찰하였다. 그 결과 MK-801에 의해 유도된 신경세포자멸사의 정도가 본 발명의 황금추출물에 의해서 현저하게 억제됨을 보여주고 있다.(도 13a 및 13b)
실시예 7. 흰쥐 대뇌에서의 신경세포자멸사 정량비교
어린 흰쥐의 대뇌절편상에서 MK-801 (0.5 mg/kg) 단독 투여군, 황금추출물(20 mg/kg) 단독 6일 투여군, 황금추출물(20 mg/kg)을 3일 동안 전처치한 후 MK-801 (0.5 mg/kg)을 투여한 군, MK-801 (0.5 mg/kg)을 투여한 후 황금추출물(20 mg/kg)을 6일간 투여한 군을 대상으로 MK-801에 의해 사망하는 신경세포자멸사의 정도(TUNEL positive cell numbers)가 황금추출물에 의해서 억제되는 양상을 정량적으로 나타내었다.(도14) 정량방법은 TUNEL 양성 고사신경세포 수를 각 군당 12 마리의 대뇌절편의 동일 면적에서 세어서 평균하여 표시하였다.
실시예 8. 흰쥐 대뇌에서의 bcl-2 mRNA 및 GAPDH mRNA 발현양상 비교
생후 4일된 흰쥐에 본 발명의 황금추출물을 각각 12.5 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 복강 주사한 후 대뇌 조직에서 발현되는 항고사 유전자인 bcl-2 mRNA의 발현양상을 RT-PCR 방법으로 조사하였다. 그 결과 대조군과 비교할 때, 황금추출물을 투여받은 흰쥐의 뇌조직에서 bcl-2 mRNA 발현이 황금추출물 처리 농도에 비례하여 증가였다. 대조군으로는 GAPDH mRNA의 발현양상을 RT-PCR 방법으로 조사하였다.(도15a 및15b)
실시예 9. 황금추출물에 의한 말초신경계 좌골신경(sciatic nerve) 재생효과
흰쥐를 깊이 마취하고 좌골신경을 좌골에서 노출하여 파쇄하고 PBS 또는 황금추출물을 쥐몸무게 0.1kg당 2mg되게 복강주사한 뒤 봉합하여 1주, 2주와 4주 뒤에 신경재생 정도를 관찰하였다. 동물을 관류(perfusion)하고 수술 부위 뒤쪽(distal stump)의 좌골신경을 얻어 7-10um로 동결박절하고 축색표지자인 beta-tubulin isotypeIII (cy3, red)와 슈반세포의 분화(미엘린)표지자 MBP(myelin binding protein, cy2, green) 항체로 이중염색한 뒤 공초점 현미경으로 관찰하여 300um보다 긴 축색과 200um보다 긴 미엘린을 관찰하였다.
수술 4주 후에는 300um가 넘는 축색의 수가 2배 이상 증가하였다. 미엘린은 1주 후부터 200um가 넘는 미엘린 수가 2배 이상되고 4주에는 3.5배에 달하였다
따라서, 황금추출물은 말초신경 재생과정에서 축색돌기의 성장과 미엘린 수초의 재생을 촉진함을 알 수 있다.
또한 신경근 접합부에서 신경말단의 재생에 영향을 주는지 보기 위해 수술 4주 후에 좌골신경에 연결된 뒷다리 근육을 분리하여 동결박절하고 신경근접합부를 신경표지자인 beta-tubulin isotypeIII와 신경세사(neurofilament)로 염색하였다. 수술 4주 후에 대조군에서는 신경말단이 염색되었으나 근육 한 부위에 모여 있고 아직 근섬유 각각에 퍼져 하나씩의 신경근접합부를 형성하지 못했으나 황금추출물을 주사한 경우에는 신경말단이 근섬유에 퍼져 있는 것이 관찰되었다(도16).
따라서 황금추출물은 말초신경 재생과정에서 축색돌기의 성장, 미엘린 수초의 재생과 신경근접합부를 형성하기 위한 신경말단 재생을 촉진하는 것으로 보인다.
실시예 10. 황금추출물이 성체 쥐의 해마에 이식된 신경줄기세포의 분화에 미치는 영향
신경세포의 분화에서 약물의 효과를 조사하기 위해 해마에서 유래하는 신경줄기세포주를 사용하였다. 본 실험에 사용한 HiB5 세포주는 temperature sensitive SV40 large T antigen을 흰쥐 배아(embryonic day 16)의 해마에서 일차배양한 세포에 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)로 감염하여 만든 것이므로 허용온도(permissive temperature ; 32℃)에서는 계속 세포분열하지만 쥐의 체온인 nonpermissive temperature(39℃)에서는 세포분열을 멈추고 원래의 세포운명으로 돌아가 분화를 시작한다(분화시작조건). 흰쥐 배아의 해마는 embryonic day 16에 소수의 GABAegic neuron은 분화하고 있는 상태이며 glutamatergic pyramidal cell precursor는 아직 분열하고 있고 이들 일부가 embryonic day 18에 치상이동경로(dentate migration pathway)를 통해 dantate gyrus 부위로 침투하여 glutamatergic granule cell로 분화한다.
황금추출물이 신경줄기세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 HiB5 세포를 분화시작조건에서 배앙하면서 황금추출물을 50ug/ml 농도로 처리한 후 DiI로 표지하였다.
먼저 흰쥐 성체를 깊이 마취하고 머리를 stereotaxic frame을 사용하여 뇌의 위치를 고정한 뒤 황금추출물을 처리하고 DiI로 표지한 HiB5 세포(6.0X104cells/ml)를 등쪽 해마에 2ul주입하였다. 수술 6주 후에 brain slices를 얻어 신경특이적표지자인 NeuN 항체로 형광염색하고 신경세포의 분화를 조사하였다.
그 결과 도 17에서 보는 바와 같이 해마의 CA1 부위에 있는 추상세포층 주변에서 DiI 표지된 HiB5 세포가 발견되나 그 일부만이 신경세포로 분화하여 NeuN 표지자로 염색이 되는 것을 볼 수 있다. HiB5 세포를 주입하기 전에 황금추출물을 처리한 경우에는 대다수의 DiI 표지된 세포들이 신경세포로 분화하여 NeuN 표지자로 염색이 되는 것을 볼 수 있다. 따라서 황금추출물은 세포 배양실험에서와 마찬가지로 신경줄기세포의 분화를 증진하는 것으로 판단된다.
상기 한 바와 같이, 본 발명에 따른 황금추출물을 함유하는 조성물은 신경줄기세포의 분화촉진과 신경세포의 재생을 촉진시켜 신경세포의 축색돌기 및 수상돌기를 형성시킴으로써 신경세포 및 신경조직 손상에 대한 신경보호작용과 신경재생작용이 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 종류의 퇴행성 신경질환 또는 신경손상 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 특히 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 간질, 중풍, 허혈성 뇌질환과 말초신경 손상 등의 경우에서 공통적으로 수반되는 신경세포의 손상 및 사멸에 대해 신경줄기세포 및 신경세포의 분화와 재생을 촉진함으로써 신경계를 보호하고 재생하는 효능이 탁월한 예방, 치료제 및 신경기능 향상제로 매우 유용하다.
Claims (9)
- 황금추출물을 함유하는 신경세포의 보호, 성장촉진, 재생 또는 신경손상, 신경질환의 예방 및 치료용 조성물
- 신경세포의 보호, 성장촉진, 재생 또는 신경손상, 신경질환의 예방 및 치료를 위하여 황금추출물을 신경세포에 전처리하는 것으로 특징으로 하는 조성물
- 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 황금추출물이 황금뿌리의 열수추출물인 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 황금추출물이 황금뿌리의 에탄올추출물인 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 1항에 또는 제2항에 있어서, 상기 신경세포가 신경줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경손상, 신경질환이 뇌손상 또는 뇌질환인 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 6항에 있어서, 상기 뇌손상 또는 뇌질환이 치매, 파킨슨병, 알쯔하이머병, 헌틴톤병, 간질, 중풍, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 퇴행성 뇌질환 또는 기억력 감퇴인 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경손상, 신경질환이 말초신경손상, 근위축성 축색 경화 증 또는 말초신경질환인 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 1항 내지 제 8항에 있어서 상기 조성물이 식품 또는 의약품인 것으로 특징으로 하는 조성물
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