KR20020097218A

KR20020097218A - 타입 ⅱ 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 및 이를엔코딩하는 폴리누클레오티드

Info

Publication number: KR20020097218A
Application number: KR1020027013776A
Authority: KR
Inventors: 로버트 피터 밀라; 스티븐 로웨; 다렐 콘클린
Original assignee: 메디칼 리서취 카운실
Priority date: 2000-04-15
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2002-12-31
Also published as: CA2404127A1; HUP0301666A2; WO2001078796A9; NO20024937L; PL357684A1; EP1337282A2; WO2001078796A3; NO20024937D0; IL152011A0; WO2001078796A1; JP2003530837A; BR0110098A; AU2001248599A1

Abstract

본 발명은 마모셋 및 인간 타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R)의 전체 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 상응하는 아미노산 서열이 또한 제공된다.

Description

타입 Ⅱ 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 {TYPE II GONADOTROPIN-RELEASING HORMONE RECEPTOR AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEREFOR}

타입 I 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH)은 시상하부로부터 방출된 데카펩티드이며, 수용체를 통해 작용하여 생식 기능에 필요한 고나도트로핀의 분비를 조절한다 (참조: Fink et al., "Gonadotrophin secretion and its control", The Phsiology of Reproduction, E Knobil and I Neill, New York, Raven Press, pages 1349-1377, 1988).

타입 I GnRH에 대한 수용체 (즉, 타입 I GnRH-R)은 거대한 G-단백질 커플링된 수용체 패밀리의 구성원이며, G 단백질의 G_q/G₁₁패밀리를 통해 포스포이노시티다제 C에 우선적으로 커플링된다. 전형적으로 타입 I GnRH-R은 하수체 전엽의 성선자극 세포 (여기서, 타입 I GnRH의 결합은 고나도트로핀 황체형성 호르몬 및 여포자극 호르몬의 방출을 초래함)내에 위치할 뿐만 아니라 중추신경계 및 말초신경계, 성선, 태반, 및 유방 및 전립선과 같은 특정 종양상에 위치한다. 타입 I GnRH 수용체는 상향 조절 및 하향 조절 둘 모두를 디스플레이할 수 있으며, 타입 I GnRH 아고니스트는 전립선암 및 유방암의 처리에서 사용되어 왔을 뿐만 아니라 불임의 치료에서 고나도트로핀 분비를 자극하는 데에 사용되어 왔다.

마우스 및 래트 타입 I GnRH-R의 발현은 적합한 공급원(예를 들어, 하수체)로부터의 폴리(A) + mRNA를 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 주입시킴으로써 최초로 달성되었다 (참조: Eidne et al., J. Mol. Endocr. Vol 1, pages R9-R12, 1988; Yoshida et al., Molecular Endocrinology, Vol 3, pages 1953-1960, 1989; and Sealfon et al., Molecular Endocrinology, Vol 4, pages 119-124, 1990). 이 시스템은 타입 I GnRH-R의 약리학을 어느정도 특징화시켜 주었다.

뮤린 타입 I GnRH-R의 단백질 엔코딩 누클레오티드 서열은 뮤린 타입 I GnRH-R에 대한 추론된 아미노산 서열과 함께 츠츠미(Tsutsumi) 등에 의해 최초로 발표되었다 (Molecular Endocrinology, Vol 6, pages 1163-1169, 1992).

척추동물에서의 11가지 상이한 형태의 GnRH이 지금까지 확인되었다 (참조: King and Millar, "Coordinated evolution of GnRHs and their receptors", in GnRH Neurons: Gene to Behavior, Eds. I.S. Parhar and Y. Sakuma, Brain Shuppan, Tokyo, pages 51-77, 1997; Sealfon et al., Endocr. Rev. 18:180-205, 1997; Millar et al., "Plasticity in the structural and functional evolution of GnRH: A peptide for all seasons", in Proceedings of the XIIIthInternational Conference of Comparative Endocrinology, Eds. S. Kawashima and S. Kikuyama, Moduzzi Editore, Italy, pages 15-27, 1997; and Sherwood et al., General and Comparative Endocrinology, 112, 1998). 이러한 상이한 GnRH 형태 중 다수가 실제로 GnRH 타입 I의 변이체이다. 그러나, 별개의 타입 II 및 타입 III GnRH가 확인되었다.

타입 II GnRH는 닭 뇌로부터 최초로 단리되었고 (참조: Millar and King, News Physiological Science, 3:49-53, 1988), 초기에는 "닭 GnRH II" 또는 "cGnRH II"라 일컬어졌다. 후속 연구는 상기 이소폼이 대부분의 척추동물종에 존재하며, 모든 GnRH 이소폼 중에서 GnRH II가 가장 편재함을 밝혀내었다. GnRH II의 광범위한 분포는 중요한 기능을 암시하며, 이는 중추신경계 및 말초신경계에서 신경조절 역할 및 가능하게는 신경내분비 역할을 하는 것으로 가정된다 (참조: Millar and King, 1988, supra). GnRH II는 교감신경절에서 M 전류 (K⁺채널)를 조절하는 것으로 밝혀졌으며 (Bosma et al., in G proteins and Signal Transduction, The RockeFeller University Press, pages 43-59, 1990), 생식 행동을 자극한다 (참조: King et al., in GnRH Neurones: Gene to Behavior, eds. Parhar (Brain Shuppan), Tokyo, pages 51-77, 1997). GnRH II가 특이적 FSH 방출제로서 작용한다는 것이 또한 가정되었다 (Millar et al. 참고문헌 33).

타입 II GnRH는 신장, 골수 및 전립선 뿐만 아니라 시상하부외(extrahypothalamic) 뇌에서 고도로 발현된다 (White et al. 참고문헌15).

지금까지 단지 부분적인 서열 정보가 타입 II GnRH-R에 대해 이용가능하였다. 상세하게는, 밀라(Millar) 등은 인간 게놈 EST(expressed sequence tag) 데이터베이스를 스크리닝함으로써 수득된 인간 유전자의 1642개 누클레오티드의 연속 누클레오티드 서열을 보고하였다 (Millar et al., in Journal of Endocrinology, 162:117-126, 1999). 상기 EST 서열은 클로닝된 인간 유전자 및 다수의 조직으로부터의 cDNA의 PCR 생성물에서 확증되었다. 검출된 모든 EST 전사체는 본원에 기재된 신규한 GnRH 수용체 서열과 비교하여 안티센스 배향이었고, 광범위한 인간 뇌 및 말초 조직에서 고도로 발현되었다.

밀라 등에 의해 수득된 cDNA 부분 서열의 PCR 분석 결과, 인간 타입 I GnRH-R의 인트론 2와 동등한 인트론 서열이 보유된 것으로 밝혀졌다. 인트론 자체는 전사체에서 스플라이싱되지(spliced out) 않았지만, 이것은 안티센스 전사체에 대해 예상되었는데, 이는 후보 도너 및 억셉터 부위가 GnRH 수용체 동족체를 엔코딩하는 배향으로 전사되는 경우에만 유전자에 존재하였기 때문이다. 광범한 5' RACE 실험에도 불구하고, 밀러 등은 인간 타입 I GnRH-R의 인트론 2에 상응하는 서열의 5'에 대한 임의의 전사체를 수득하지 못하였고, 안티센스 전사체는 안티센스 배향으로 전사되는 경우 추정 인트론 2내의 폴리아데닐화 시그널 서열의 존재로 인해 폴리 A로 종결되었다 (도 1 참조).

어떠한 서열도 작용성 단백질을 번역하는 임의의 연속 오픈 리딩 프레임을 나타내지 못했다. 밀라 등은 추정 수용체가 과잉으로 되는 수용체를 표현하는 슈도진(pseudogene)일 것으로 결론내렸고, 추가의 연구는 전장 안티센스 전사체가 염색체 14에 국재화되는 신규한 리보누클레오단백질(RNP)를 엔코딩함을 밝혀내었다 (참고문헌 26). 후속하여, 상기 유전자는 RNP 및 타입 II GnRH-R 둘 모두에 대한 슈도진인 것으로 밝혀졌다.

RNP의 존재는 관찰된 광범위한 조직 발현을 설명해주며, RNP cDNA의 3' 비번역된 서열만이 엑손 1 및 엑손 2의 등가물을 엔코딩하는 추정 GnRH 타입 II 수용체 서열과 오버랩(overlap)된다는 것이 중요하다.

GnRH-R 타입 II의 효과적인 변형체가 포유류에 존재하지 않음을 제시해주는 밀라 등의 결과에도 불구하고, 본 발명자들은 마모셋으로부터의 타입 II GnRH-R을 엔코딩하는 전체 누클레오티드 서열 및 인간 타입 II GnRH-R을 엔코딩하는 완전한 누클레오티드 서열 (엑손 I을 포함함)을 수득하였다. 본원에 보고된 인간 타입 II GnRH-R은 염색체 1에 국재화되었다 (1q12-21).

본 발명은 타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R), 타입 II GnRH-R을 발현시킬 수 있는 유전공학처리된 숙주 세포, 및 상기 수용체에 대한 리간드 및 항체에 관한 것이다.

도 1은 타입 I GnRH-R 및 타입 II GnRH-R의 인간 유전자 구조를 개략적으로 도시한다. 세포외(EC) 및 세포내(IC) 루프 도메인, 트랜스멤브레인(transmembrane) (어두운 블록) 및 카복시 말단 테일 (C)의 위치가표시되어 있다. 인간 수용체중의 셀레노시스테인 (SeCys) 및 인트론 1'에 대한 "짧은 스플라이스(short splice)"(SS)의 근사 위치가 나타나 있다.

도 2는 양(sheep) 하수체에 대한 타입 II GnRH 수용체 및 황체형성 호르몬 (LH)의 면역국재화(immunolocalisation)를 도시한다:

a) EC3에 대한 항체를 사용한 타입 II GnRH-R의 면역국재화;

b) 하수체 성선자극세포에 대한 LH의 면역국재화;

c) 항체 a) 및 b)를 사용한 코-로컬리제이션(co-localisation) 및 효소 검출;

d) 공초점형 현미경검사에 의한 타입 II GnRH-R (흑색) 및 LH (회색)의 코-로컬리제이션; 일부 세포는 LH만을 함유하지만 타입 II GnRH-R을 발현하는 대부분의 세포는 LH 포지티브이다.

도 3은 스플라이싱 올터너티브 1에 따른 인간 타입 II GnRH-R 및 마모셋 타입 II GnRH-R의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.

사용된 넘버링은 인간 서열의 넘버링이다. 별표(*)는 동일함을 나타내며, 수직 슬래시(｜)는 보존적 치환을 나타낸다. 로돕신 결정 구조와의 상동성 모델링으로부터 나선형인 것으로 추정된 영역이 표시되어 있다. 인간 서열 중의 엑손 경계, 짧은 스플라이스 (인트론 1')의 위치 및 명확한 정지 코돈이 또한 나타나 있다.

도 4는 증가하는 용량의 펩티드 (IC₅₀값은 nM으로 표시됨)의 존재하에서COS-7 세포에서 발현되는 마모셋 타입 II GnRH-R에 의해 매개되는¹²⁵I-[His⁵, D-Tyr⁶]GnRH의 이종성 경쟁물질 결합을 나타낸다: mGnRH (포유류 GnRH, ■, 51.7 ±1.9nM; GnRH II (GnRH 타입 II, ▲, 1.3 ±0.2nM); 및 sGnRH (연어 GnRH, ▼, 9.8 ±1.4nM). 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다 (n = 2).

도 5는 다양한 펩티드의 농도 (EC₅₀값은 nM으로 표시됨)에 반응하여 COS-7 세포에서 발현되는 마모셋 타입 II GnRH-R에 의해 매개되는 전체 이노시톨 포스페이트 생성을 도시한다: mGnRH (포유류 GnRH, ■, 33.2 ±6.3nM; GnRH II (GnRH 타입 II, ▲, 0.46 ±0.12nM); sGnRH (연어 GnRH, ▼, 8.7 ±0.5nM); [D-Arg⁶] GnRH II ([D-Arg⁶]GnRH 타입 II, ◆, 1.1 ±0.23nM); 및 Ant 135-18 (안타고니스트 135-18, ●, 223 ±7nM). 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다 (n = 2).

도 6은 마모셋 타입 II 수용체 (왼쪽 패널) 및 인간 타입 I 수용체 (오른쪽 패널)로 트랜스펙션된 COS-7 세포에서의 포유류 GnRH I ( ○) 및 GnRH II ( ●)의 수용체 결합 (a) 및 이노시톨 포스페이트 생성 (b)을 도시한다. 타입 II 수용체에서의 타입 I 수용체 안타고니스트 135-18에 의한 이노시톨 포스페이트의 자극이 또한 나타나 있다. 오차 막대는 3회 내지 6회의 별도의 실험의 s.e.m을 나타낸다.

도 7은 양에서의 GnRH I 및 II에 대한 황체형성 호르몬 (LH) 및 여포자극 호르몬 (FSH) 반응을 도시한다.

도 8은 COS-7 세포에서의 타입 I (빈 막대) 및 타입 II (흑색 막대) GnRH 수용체에 의한 ERK2 및 p38αMAP 키나제의 활성화를 도시한다. 면역침전된 myc-ERK2의 포유류 GnRH I, GnRH II 및 안타고니스트 135-18을 사용한 타입 I (a) 및 II (b) GnRH 수용체의 자극. 인셋(inset) 패널은 안티-myc COS-7 세포 면역침전물의 안티-포스포-ERK2 면역블롯팅을 도시한다. c (왼쪽 패널)은 타입 II GnRH 수용체의 GnRH II 자극 (100nM)에 의한 p38α의 선택적 및 시간 의존적 활성화를 나타낸다. 타입 I GnRH 수용체 (100nM)의 자극은 p38αMAP 키나제를 활성화시키지 못했다. 오른쪽 패널은 타입 I 및 타입 II GnRH 수용체 둘 모두의 자극이 ERK의 시간 의존적 활성화를 유도시키지만 타입 II 수용체의 GnRH II 자극이 더욱 지속적임을 입증해준다. 데이터는 평균 ±s.e.m., n ≥3 을 나타낸다.

도 9는 마모셋 및 인간 조직에서의 타입 II GnRH 수용체의 발현을 도시한다. (a) RT-PCR은 다양한 조직으로부터 단리된 마모셋 RNA로부터 준비된 cDNA로 특이적 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR 생성물은 아가로스 겔에서 크기 분별되었다. 타입 II GnRH 수용체 수준은 액틴 RNA에 대해 정규화되었고, 하수체와 비교하여 RNA 발현의 log로서 표현되었다. 빗금그어진 막대는 마모셋 뇌 조직을 나타내고, 흑색 막대는 마모셋 생식 조직을 나타내며, 빈 막대는 그 밖의 마모셋 조직을 나타낸다. (b, c) 인간 조직에서의 타입 II GnRH 수용체의 발현은³²P 표지된 인간 엑손 1과의 하이브리드화에 의한 mRNA의 노던 블롯 (Clontech)으로 조사되었다; (b) 인간 소뇌 (1), 대뇌 피질 (2), 수질 (3), 척수 (4), 후두극 (5), 전두엽 (6), 측두엽 (7) 및 피각 (8)으로부터의 mRNA; (c) 심장 (1), 전뇌 (2), 태반 (3), 폐(4), 간 (5), 골격근 (6), 신장 (7) 및 췌장 (8)으로부터의 mRNA. 또 다른 블롯은 아미그달라(amygdala)에서의 보통의 발현, 및 미상핵, 뇌량, 해마, 흑색질, 시상밑핵 및 시상에서의 낮은 발현을 나타내었다 (데이터는 도시되지 않음).

따라서, 본 발명은 작용성 타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R) 펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다.

"펩티드"란 용어는 크기의 내포없이 임의의 펩티드 화합물을 의미하기 위해 본원에 사용되므로, 다른 경우에는 "폴리펩티드" 또는 "단백질"이라고도 명명될 수 있는 거대한 분자도 이러한 정의에 포함된다.

한 가지 구체예에 있어서, 엔코딩된 펩티드는 엑손 I의 적어도 일부를 포함한다. "엑손 I"이란 타입 I GnRH-R의 엑손 I에 상응하며 이와 상당한 상동성을 나타내는 타입 II GnRH-R의 부분을 의미한다. 특히, 본 발명자들은 SEQ ID No 2의 마모셋 타입 II GnRH-R 서열의 아미노산 서열 1 내지 170의 90%를 넘게 포함하는 펩티드 또는 인간 타입 II GnRH-R 서열의 동등한 아미노산을 포함하는 펩티드를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 엑손 I은 SEQ ID No 5에 개시된 스플라이싱 올터너티브(alternative) 1의 아미노산 1 내지 168번을 의미한다 (도 3 참조). 상기 용어는 명확함을 위해 채택되었으며; 하기 언급되는 짧은 스플라이스(short splice)는 이를 인트론 1과 구별하기 위해 본원에서 인트론 1'로 표시된다. 결과적으로, 인간 타입 II GnRH-R 펩티드의 아미노산 1 내지 9번을 포함하는 짧은 엑손 (엑손 1')은 본원에 정의된 엑손 I에 포함된다.

본 발명의 바람직한 구체예는 SEQ ID No 1 (마모셋) 또는 SEQ ID No 3 (인간)에 개시된 누클레오티드 서열을 지닌 폴리누클레오티드, 또는 SEQ ID No 2 (마모셋) 또는 SEQ ID No 4, 6, 8 또는 10 (인간)에 개시된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.

도 3에 도시된 바와 같이, 타입 II GnRH-R의 마모셋 아미노산 서열은 상응하는 인간 서열과 90%가 넘는 상동성을 지닌다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID No 1 또는 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 임의의 폴리펩티드를 포함한다.

인간 누클레오티드 서열이 마모셋의 누클레오티드 서열과 비교되는 경우, 코딩 서열의 위치 30에서 명확한 단일-염기 결실이 존재한다. 앞선 EST 서열 (Genbank BG036291)은 이 서열의 5' 말단과 매칭(matching)하지만, 이러한 매치는 코딩 서열의 누클레오티드 29에서 끝나고 코딩 서열의 누클레오티드 290에서 계속되는데, 이는 이것이 스플라이스 부위임을 나타낸다. 닭 수용체의 경우, 인트론은 또한 유사한 위치에 존재하였다. 이 위치에서의 매우 짧은 인트론 (인트론 1')의 절제는 프레임 쉬프트(frame shift)를 초래하며; 매우 짧은 인트론이 다른 유전자에서 주목되었는데, 예를 들어 마우스 알파-7 인테그린 유전자는 단지 16개 염기의 인트론을 지닌다 (Genbank L23422). 5-염기 결실, 8-염기 결실 또는 38-염기 결실을 포함하는 3가지 올터너티브 스플라이싱 가능성이 존재하며, 이들 각각은 인간 타입 II GnRH-R의 오픈 리딩 프레임을 복원할 것이다.

3가지의 각각의 스플라이싱 올터너티브 후의 인간 타입 II GnRH-R 아미노산 서열의 출발은 하기와 같다:

스플라이싱 올터너티브 1:

(위치 29로부터 5개의 염기 결실)

스플라이싱 올터너티브 2:

(위치 29로부터 8개의 염기 결실)

스플라이싱 올터너티브 3:

(위치 29로부터 38개의 염기 결실)

첫 번째 스플라이싱 올터너티브에 따른 인간 타입 II GnRH-R에 대한 전체 서열은 SEQ ID No 5 및 6에 개시되어 있고, 두 번째 스플라이싱 올터너티브에 따른 전체 서열은 SEQ ID No 7 및 8에 개시되어 있으며, 세 번째 스플라이싱 올터너티브에 따른 서열은 SEQ ID No 9 및 10에 개시되어 있다.

SEQ ID No. 3에 도시된 바와 같이, 인간 누클레오티드 서열은 엑손 2의 첫 번째 부분에서 명확한 정지 코돈을 포함한다. 마모셋의 경우, 동등한 코돈 (SEQ ID No 1의 누클레오티드 449-452에 도시됨)은 아르기닌을 나타낸다. 이로써 정지 코돈이 하나의 아미노산 (예를 들어 아르기닌)을 나타내도록 공학처리된 SEQ ID No 3의 변형된 변형체가 포함된다. 그러나, 본 발명자들은 코돈 TGA가 정지 코돈으로서 기능하지는 않지만 대신에 셀레노시스테인(selenocystein)으로서 번역된다고 믿는다. 진핵생물의 경우, 셀레노시스테인으로서 TGA의 디코딩(decoding)은 mRNA의 3' UTR에서 셀레노시스테인 삽입 엘리먼트 (SECIS)를 필요로 한다 (참조: Copeland et al., EMBO J, 19(2): 306-14, 2000; and Fagegaltier et al., Nucleic Acids Research, 29(14): 2679-80, 1995). 서열의 추정 UTR (SEQ ID No. 3 참조)은 SECIS 패턴 RTGAN{13,15}AARN{23,26}GA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 단백질의 상기 위치(SEQ ID No 6의 경우 아미노산 177번; SEQ ID No 8의 경우 아미노산 176번; SEQ ID No 10의 경우 아미노산 166번)에서의 셀레노시스테인 삽입이 가능하다. SEQ ID No. 3, 5, 7 및 9의 경우, Xaa로 표시된 (그리고 서열에 대한 앞부분에서 TGA로서 정의된) TGA는 PATENTIN 프로그램에서 코딩 서열을 전체적으로 유지할 뿐이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 타입 II GnRH에 특이적으로 결합할 수 있고, 바람직하게는 이에 대한 수용체로서 기능할 수 있는 펩티드를 엔코딩한다.

당업자는 SEQ ID No 1 및 SEQ ID No 3, 5, 7 및 9의 누클레오티드 서열이 각각 마모셋 및 인간 유전자의 하나의 대립유전자에 상응하며, 대립유전자 변이가 일어날 것임을 인식할 것이다. 대립유전자 변이체는 표준 방법에 따라 다양한 개체로부터의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다. 사일런트(silent) 돌연변이를 함유하는 변이체 및 아미노산 서열 변화를 일으키는 돌연변이를 함유하는 변이체를 포함하는 서열 목록에 개시된 DNA 서열의 대립유전자 변이체는 본 발명의 범위에 속하며, 이들은 SEQ ID No 2 및 No 4, 6, 8 및 10의 대립유전자 변이체인 단백질이다.

또한, 본 발명은 다른 종, 바람직하게는 다른 포유동물종으로부터의 상동 타입 II GnRH-R을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 뮤린, 돼지, 양, 소과동물, 개과동물, 고양이과동물, 말 및 영장류 타입 II GnRH-R이 특히 관심을 끈다. 본원에 기재된 기술 및 당 분야에 공지된 통상의 표준 클로닝 기술과 함께 SEQ ID No 1, 3, 5, 7 및 9에 제공된 서열 정보는 이러한 상동 폴리누클레오티드를 수득하기에 충분하다. 예를 들어, 유전공학 분야에 필요한 기술에 관한 상당량의 지식이 존재하며, 문헌[Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982 and "Principles of Genetic Engineering", Old and Primrose, fifth addition, 1994]이 참조된다.

또한, 본 발명은 타입 II GnRH-R 기능 (즉, GnRH 타입 II와 결합할 수 있는 능력)을 보유하고 해당 누클레오티드 서열과 70% 이상의 상동성 (바람직하게는 80% 상동성, 특히 바람직하게는 85 내지 90% 상동성, 가장 바람직하게는 90%가 넘는 상동성)을 지닌 변형된 서열을 포함한다. 이러한 폴리누클레오티드의 작용성 등가물이 또한 본 발명의 일부이다. 특히, 본 발명자들은 발현되는 아미노산에 영향을 미치지 않는 누클레오티드 치환을 포함시킨다. 본원에 사용된 "작용성 등가물(functional equivalent)"이란 용어는 유전자 생성물의 발현 또는 이의 생물학적 기능에 현저한 악영향을 주지 않으면서 누클레오티드(들) 및/또는 아미노산(들)이 첨가되거나, 결실되거나, 치환된 임의의 유도체를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 아미노산 Glu는 코돈 gag 또는 코돈 gaa에 의해 엔코딩될 수 있고, 각각의작제물은 발현된 펩티드의 서열에 영향을 주지 않으면서 이러한 방식으로 달라질 수 있다. 또한, 대부분의 척추동물은 3가지 타입의 GnRH를 지니며, 이는 3가지 동족(cognate) 수용체가 존재하는 것으로 가정된다. 공동연구자들(Troskie, Kwon 및 Wangli)과 함께, 본 발명자들은 제노푸스 및 불프로그(bullfrog)에서 타입 I, II 및 III GnRH 수용체를 확인하였다. 타입 III GnRH-R은 타입 I 보다 타입 II GnRH-R과 더욱 유사하다. 따라서, 본 발명자들은 타입 II와 상동인 타입 III 인간 GnRH-R의 존재를 제안한다. 따라서, 타입 III GnRH-R은 본원에 기재된 타입 II GnRH-R과 상당한 상동성을 지니는 것으로 기대되며, 이는 기술된 서열의 변형된 변형체에 포함될 것이다.

폴리누클레오티드는 임의의 형태 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 이중 가닥 또는 단일 가닥)일 수 있지만, 일반적으로 이중 가닥 DNA가 가장 편리하다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 재조합 유전자 작제물의 일부일 수 있고, 상기 작제물은 그 자체로 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)를 포함할 수 있으며, 진핵생물 벡터 (뿐만 아니라 원핵생물 벡터)가 관심을 끈다. 대안적으로, 작제물은 유전자이식 동물의 게놈내로 통합될 수 있다. 상기 기재된 폴리누클레오티드를 포함하는 임의의 벡터 또는 유전자이식 동물은 본 발명의 또 다른 일면을 형성한다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 기재된 타입 II GnRH-R을 발현시킬 수 있는 재조합 발현 시스템을 제공한다. DNA 작제물 (즉, 관심의 타입 II GnRH-R을 코딩하는 폴리누클레오티드 서열과 재조합된 표준 벡터) 및 이러한 작제물로 형질전환된 세포가 또한 본 발명에 포함된다.

"발현 시스템"이란 용어는 단백질 엔코딩 영역을 포함하며 이 영역의 발현을 달성하는 데에 필요한 모든 유전자 시그널에 작동적으로 결합되어 있는 유전자 서열을 의미하도록 본원에서 사용된다. 임의로, 발현 시스템은 단백질 엔코딩 영역의 전사 및/또는 번역을 증가시키거나 발현을 조절하기 위해 프로모터 또는 인핸서와 같은 조절 엘리먼트를 또한 포함할 수 있다. 조절 엘리먼트는 단백질 엔코딩 영역의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하거나 단백질 엔코딩 영역 그 자체내에 위치할 수 있다.

상기 기재된 타입 II GnRH-R 작제물 이외에, 본 발명은 이러한 작제물로 형질전환되어 생물학적으로 활성인 변형된 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 숙주 세포를 또한 제공한다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 기재된 타입 II GnRH-R, 바람직하게는 인간 타입 II GnRH-R을 발현할 수 있는 안정한 세포주를 제공한다. "안정한"이란 세포주가 다수(예를 들어 10회)의 세대 후에 유용한 양의 타입 II GnRH-R을 발현할 수 있는 능력을 보유하며 타입 II GnRH-R 발현의 수준의 임의의 감소는 세포주의 유용성에 실질적으로 영향을 주지 않을 정도로 충분히 낮음을 의미한다.

바람직하게는, 인간 타입 II GnRH-R을 엔코딩하는 작제물로 형질전환된 숙주 세포는 포유류 기원을 갖지만, 그 밖의 세포 타입이 또한 유용할 수 있다. 예로는 원핵 세포 (예를 들어 이. 콜라이), 비포유류 유래 진핵 세포 (예를 들어, 곤충, 이스트 또는 식물 세포)가 있다. 적합한 숙주 세포는 예를 들어 COS-1 세포, COS-7 세포, COSM6 세포, CHO 세포, BHK 세포, GH₃세포, HEK293 세포 및 293EBNA 세포를 포함한다.

또한, 본 발명은 작용성 타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R) 펩티드를 포함하는 단리된 펩티드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 엑손 I의 적어도 일부를 포함한다.

본 발명에 따른 펩티드의 바람직한 구체예는 SEQ ID No 2의 아미노산 1 내지 170번의 서열에 상응하는 아미노산 서열 (바람직하게는 실질적으로 SEQ ID No 2에 개시된 전체 서열을 포함함) 또는 SEQ ID No 6의 아미노산 1 내지 168번, SEQ ID No 8의 아미노산 1 내지 165번 또는 SEQ ID No 10의 아미노산 1 내지 155번의 서열에 상응하는 아미노산 서열 (바람직하게는 실질적으로 SEQ ID No 4, 6, 8 또는 10의 전체 서열을 또한 포함함)을 지닌 펩티드를 포함한다.

바람직하게는, 펩티드는 타입 II GnRH와 결합할 수 있으며, 바람직하게는 이에 대한 작용성 수용체이다.

또한, 본 발명은 타입 II GnRH-R 펩티드에 대해 특이적인 항체, 바람직하게는 타입 II GnRH-R의 세포외 도메인, 예를 들어 이의 엑손 3 중의 EC3에 대해 특이적인 항체를 제공한다. 본원에 사용된 "항체"란 용어는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편, 3량체 또는 4량체 작제물 및 재조합 또는 단백분해 항체 단편을 포함한다.

EC1, EC2 및 EC3 (특히 EC2)에 대해 유도된 항체가 특히 관심을 끌며, 암치료에 있어서 치료적 가치를 지닐 수 있다. 타입 II GnRH-R이 발현될 수 있으며, 이를 사용하여 잠재적인 치료적 관심의 작용제를 스크리닝할 수 있다.

따라서, 본 발명은 약리학적 활성에 대해 작용제를 스크리닝하는 방법을 추가로 제공하며 (즉, 타입 II GnRH-R에 결합하는 데에 있어서 이의 유용성을 확인하기 위해), 이 방법은,

a) 상기 기재된 타입 II GnRH-R 펩티드를 제공하고, 타입 II GnRH-R 펩티드를 시험하려는 작용제에 노출시키고;

b) 상기 작용제가 타입 II GnRH-R 펩티드와 상호작용하는 지를(예를 들어 펩티드에 특이적으로 결합하는 지를) 확인하는 것을 포함한다.

표지된 (예를 들어, 방사선표지되거나 형광표지됨) 항체를 사용하여 작용제와 타입 II GnRH-R이 서로 상호작용하는 지를 결정할 수 있다. 임의로, 세척 단계를 포함시켜서 작용제 또는 GnRH-R에 결합하지 않은 표지를 제거할 수 있다.

상기 기재된 타입 II GnRH-R을 생성시킬 수 있는 발현 시스템이 이러한 방법에서 사용될 수 있으며; 바람직하게는 발현 시스템은 형질전환된 세포주일 것이고, 숙주 세포는 일반적으로 포유류 기원을 지닌다. 대안적으로, 발현 시스템은 유전자이식 동물일 수 있다.

임의로, 발현되는 수용체는 돌연변이되어 안타고니스트(antagonist) 및 아고니스트(agonist)에 대해 스크리닝하는 데에 사용될 수 있는 구성적으로 활성인 수용체를 생성시킬 수 있다.

상기 기재된 타입 II GnRH-R을 생성시킬 수 있는 발현 시스템을 사용하여 잠재적 치료 용도를 지닌 작용제(예를 들어, 타입 II GnRH 아고니스트 또는 안타고니스트)를 스크리닝할 수 있다. 바람직하게는, 발현 시스템은 타입 II GnRH 유도된 시그널 트랜스덕션의 적어도 특정한 일면을 모사할 것이다. 임의로, 발현 시스템은 안정한 세포주일 수 있고, 숙주 세포는 일반적으로 포유류 기원을 지닌다. 대안적으로, 발현 시스템은 유전자이식 동물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 타입 II GnRH-R 그 자체 또는 이의 세포외 도메인 (예를 들어, EC2 또는 EC3 루프)이 생체내에서 투여될 수 있다. 유리 GnRH-R 또는 세포외 도메인 (합성 펩티드일 수 있음)은 GnRH에 경쟁적으로 결합하여 생체내에서 이것이 천연 수용체와 반응하는 것을 억제할 수 있다.

대안적으로, 타입 II GnRH-R 또는 이의 세포외 도메인은 피임 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 환자는 타입 II GnRH-R의 주사에 의해 면역될 수 있다. 이것은 타입 II GnRH-R에 대한 항체 생성을 유도하며, 이렇게 생성된 항체는 천연 타입 II GnRH-R과 또한 상호작용하여 생식 기능에 영향을 미친다. 대안적으로, 외인성 타입 II GnRhH-R은 내인성 GnRH에 대해 경쟁적으로 결합할 수 있다.

본 발명은 하기 제한적이지 않은 실시예 및 도면을 참조로 하여 추가로 설명되며, 도면에 대한 설명은 다음과 같다:

밀라 등에 의해 보고된 서열 (Journal of Endocrinology (1999), Vol162, pages 117-126)로부터 엑손 I의 위치를 알아내기 위한 수 많은 시도가 수포로 돌아간 후, 후속 실험은 밀라 등의 안티센스 서열이 염색체 14에 국재화되는 RNP의 3' 비번역된 말단임을 입증해내었다.

엑손 2 또는 엑손 3 서열 정보가 PCR에 사용되는 한은 본 발명자들은 항상 RNP의 3' 비번역된 말단을 검출할 것으로 인식되었는데, 이는 이것이 모든 조직에서 고도로 발현되기 때문이다. 또한, 타입 II 수용체의 추정 인트론 2가 항상 보유된다. 이러한 전사체 말단이 추정 타입 II 수용체의 인트론 1의 등가물의 영역에서 폴리아데닐화로 종결하므로 (RNP에 대해 반대 방향으로 판독하여), 본 발명자들은 타입 II 수용체의 엑손 1에 대한 정보를 결코 얻을 수 없었다.

본 발명자들은 3가지 신규한 엘리먼트가 추정 타입 II GnRH 수용체를 찾기 위해 필요한 것으로 결론내렸다.

a) 엑손 1의 부분을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 대해 데이터베이스를 검색하는 것.

b) 인간 타입 I 수용체에 대한 타입 II 수용체의 세포외 루프 3에서 리간드 선택성을 담당하는 고도로 특이적인 도메인에 대한 항체를 생성시켜 (참조:Sealfon et al, Endocr. Review18:180-205 및 Troskie et al., General and Comparative Endocrinology112:296-302 (1998)), 어느 조직에서 이러한 희귀한 수용체가 발현되는 지를 결정하는 것.

c) 코딩 서열이 슈도진 부위에 (RNP와 함께) 존재하는 지 및 다른 곳의 또 다른 "진정한(real)" 유전자 위치에 존재하는 지를 결정하기 위해 염색체 국재화에 착수하는 것.

재료 및 방법

마모셋 타입 II GnRH 수용체의 클로닝.RNA를 RNAsol B (Biogenesis)를 사용하여 마모셋 하수체 및 뇌간으로부터 단리하였다. RNA 2㎍을 1mM dNTP, 2μM 랜덤 헥사폴리누클레오티드 (Promega), 유전자 특이적 프라이머 또는 앵커링(anchoring)된 올리고-dT 프라이머와 80℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 1X RT 완충액 (Sigma), 1U/㎕ RNAsin (Promega) 및 0.5U/㎕ AMV 역전사효소 (Sigma)를 20㎕의 전체 부피로 첨가하고, 55℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 65℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 프라이머는 타입 II 마모셋 GnRH 수용체 엑손 서열에 대해 디자인되었다. 프라이머는 추정 인트론을 스패닝(spanning)하도록 선택되어, 가능한 게놈 DNA 오염 및 RNP 안티센스 전사체의 존재하에서 프로세싱된 RNA를 검출할 수 있었다. 랜덤 헥사-폴리누클레오티드를 사용하여 생성된 정제된 (Qiagen) cDNA 50ng을 이미 공지된 인간 서열 (17) 및 엑손 1을 엔코딩하는 인간 게놈 서열 (Zymogenetics AL 160282, BG 636291, AA 954764)를 사용하여 PCR하였다. 라운드 1 PCR: 프라이머 S1 및 A1을 사용하여 65℃에서 5 사이클, 63℃에서23 사이클 (S1, GATGCCACCTGGAATATCACTG (SEQ ID No 17); A1, AGGCAGCAGAAGG (SEQ ID No 18)). 라운드 2 PCR: 주형으로서의 라운드 1로부터의 생성물 1㎕ 및 프라이머 S2와 A2를 사용하여 63℃에서 5 사이클, 61℃에서 25 사이클 (S2, CAGCCTGGGGACTTAGTTTCCTG (SEQ ID No 19); A2, GGTTATAGGTGGTCTCTTGC (SEQ ID No 20)). 생성물을 크기 정제하고 (Qiagen), pGEM-T (Promega) 내로 클로닝하고, 시퀀싱하였다. 센스 및 안티센스 올리고누클레오티드를 신규한 마모셋 서열로부터 디자인하고, 3' 및 5' RACE에서 사용하였다. 나머지 PCR에 대해, 3단계 프로토콜을 사용하였는데, 여기서 최초 5 사이클의 어닐링 온도는 두 개의 프라이머의 하한 T_m보다 2℃ 높았다. 두 번째 단계에서, 5 사이클의 어닐링 온도는 두 개의 프라이머의 하한 T_m과 동일하였다. 세 번째 단계는 20 사이클이었고, 어닐링 온도는 두 개의 프라이머의 하한 T_m보다 2℃ 낮았다. 5' RACE의 경우, 폴리-A 서열은 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 생성된 마모셋 하수체 cDNA 50ng에 첨가하였다. 생성물을 정제하고 (Qiagen), PCR 하였다. 프라이머 S3 및 A3를 사용한 첫 번째 라운드 PCR의 생성물 2㎕를 프라이머 S4 및 A4를 사용하여 두 번째 PCR 라운드에서 사용하였다 (S3, GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV (SEQ ID No 21) (Boehringer Mannheim으로부터의 앵커링된 RACE 프라이머); A3, GAAGGGACTGGACCAGCTCG (SEQ ID No 22); S4, GACCACGCGTATCGATGTCGAC (SEQ ID No 23); A4, CAAGGCAAGCAGGAAACTAAG (SEQ ID No 24)). 3' RACE의 경우, 앵커링된 올리고-dT 프라이머를 사용하여 생성된 마모셋 하수체 cDNA 50ng을 프라이머 S5 및S3를 사용하여 PCR 하였다 (S5, ACCTCTTCACCTTCTGCTGCCT (SEQ ID No 25)). 이러한 PCR로부터의 생성물 2㎕ 및 프라이머 S6와 S4를 제 2 PCR에서 사용하였다 (S6, CCTCCTCAATGCTCCTTTGGATC (SEQ ID No 26)). 생성물을 크기 정제하고 (Qiagen), pGEM-T (Promega) 내로 클로닝하고, 시퀀싱하였다. 전장 마모셋 타입 II GnRH 수용체를 5' UTR의 올리고 (S7, GAATTCGCTTCATACTCACACTTCATC (SEQ ID No 27); S8, CGGAATTCTCACACTTCATCCTCCTATCTC (SEQ ID No 28)) 및 정지 코돈을 포함하는 3' 서열 (A5, GCTCTAGAGATCAGATTGATGTTATAGGAATG (SEQ ID No 29)) 을 사용하여 PCR에 의해 생성시켰다. 랜덤 헥사-폴리누클레오티드를 사용하여 생성된 마모셋 뇌간 cDNA 50ng을 프라이머 S7 및 A5를 사용하여 PCR 하였다. 생성물 2㎕ 및 프라이머 S8과 A5를 제 2의 PCR 라운드에서 사용하였다. 이러한 PCR의 생성물을 정제하고 (Qiagen), pcDNA3.1+ (Invitrogen) 내로 클로닝하고, 시퀀싱하였다. 생성된 플라스미드를 발현 실험에서 사용하였다.

면역세포화학.인간, 마우스, 양, 붉은털원숭이 및 시노몰구스 원숭이로부터의 조직을 수득하였다. 인간 타입 II GnRH 수용체에 대한 항혈청은 토끼를 Cys 잔기를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌에 컨쥬게이션된 EC3에 상응하는 합성 펩티드 (YSPTMLTEVPPC (SEQ ID No 30))로 면역시킴으로써 생성시켰다. 이 펩티드, 인간 타입 I 수용체의 EC3에 대한 합성 펩티드 (DPEMLNRLSDPC (SEQ ID No 31)) 및 헤모시아닌을 면역국재화 특이성 실험을 위해 사용하였다. 포유류 GnRH I 특이적 항혈청의 검출을 위해, GF6을 사용하였다 (18).

조직 절편 (15㎛)을 공지된 퍼옥시다제/디아미노벤지딘 가시화 기술에 적용하였다 (18, 19). 형광 표지화를 ABC 반응 전의 단계까지 동일한 절차를 사용하여 달성하였고, 이때 플루오레세인 표지 (로다민 600, 아비딘 D 또는 FITC)를 슬라이드에 도포시키고 실온에서 암조건에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이중 표지화의 경우, 슬라이드를 아비딘 D 및 바이오틴 차단 용액과 각각 15분간 순차적으로 인큐베이션시킨 후, 다음번 1차 항체와 리인큐베이션(re-incubation)시키고 나서, 나머지 형광 표지화 (로다민 또는 FITC)를 수행하였다. 1차 항체 및 노출 정도(order of exposure)가 생략된 대조표준은 일관하여 네거티브였다.

면역형광은 공초점형 현미경검사에 의해 두 개의 파장에서 관찰되었다.

세포 배양 및 트랜스펙션.COS-7 세포를 공지된 바와 같이 배양하였다 (20, 21). 인간 타입 I GnRH 수용체 또는 마모셋 타입 II GnRH 수용체에 의한 COS-7 세포의 일시적 트랜스펙션을 myc-태깅(tagging)된 ERK2, JNK 및 p38α작제물과 함께 수퍼펙트(Superfect) (Qiagen)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 기술된 모든 검정을 트랜스펙션한지 48시간 후에 수행하였다.

수용체 결합 및 이노시톨 포스페이트 생성. ¹²⁵I-[His⁵-D-Tyr⁶]GnRH I를 사용한 수용체 결합 및 GnRH 리간드에 의한 이노시톨 포스페이트 생성을 공지된 바와 같이 실험하였다 (20 - 22)

포스포-MAP 키나제 검정.인간 타입 I 또는 마모셋 타입 II GnRH 수용체로 트랜스펙션된 혈청 결핍상태의 (12 내지 16시간) COS-7 세포를 37℃에서 도 9에 대해 명시된 시간 및 용량으로 포유류 GnRH I, GnRH II 또는 안타고니스트 135-18로처리하였다. 리간드 자극 후, COS-7 세포를 면역침전을 위해 준비시켰다 (23). 코-트랜스펙션(co-transfection)된 myc-태깅된 MAP 키나제 작제물을 myc-아가로스 슬러리 (Santa Cruz)와 하룻밤 인큐베이션시킴으로써 세포 용해물로부터 면역침전시키고, 세척하고, 동부피의 2x 래믈리(Laemmli) 샘플 완충액을 첨가하고, SDS-PAGE에 의해 분석하고, PVDF 막 (NEN Life Sciences)으로 전기이동시켰다. 활성화된 MAP 키나제를 안티-포스포-ERK/JNK/p38a-키나제 특이적 항혈청 (New England Biolabs)을 사용하여 검출하고, 효소 결합된 화학형광 (Amersham-Pharmacia)에 의해 가시화시키고, 포스포이매져(phosphoimager)를 사용하여 정량하였다. 인산화된 MAP 키나제의 정도는 특이적 항혈청으로 검출된 인산화되지 않은 MAP 키나제의 양에 대해 정규화시켰다.

마모셋 및 인간 조직에서의 타입 II 수용체 mRNA의 발현.전체 RNA를 TRI 시약 (Sigma)을 사용하여 다양한 마모셋 조직으로부터 추출하고, cDNA를 올리고 dT 프라이머 (Ambion)를 사용하여 생성시켰다. PCR을 엑손 1 내지 3을 스패닝하는 마모셋 타입 II GnRH 수용체 cDNA 특이적 프라이머 (센스: CTTCGGCTGGAGGGAACCTG, 안티센스: GGTGCCCTCTTCGGCAGC), 및 액틴 특이적 프라이머를 사용하여 cDNA에 대해 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스겔에서 전개시키고, HybondN⁺나일론막 (Amersham)상으로 블롯팅하였다. 서던 블롯을 랜덤 프라이밍된 마모셋 타입 II GnRH 수용체 cDNA 또는 액틴 cDNA를 사용하여 프로빙하였다. 서던 블롯을 포스포이매져를 사용하여 정량하였고, 마모셋 타입 II GnRH 수용체 발현을 액틴의 발현에대해 정규화시켰다.

인간 조직에서의 발현을 랜덤 프라이밍된³²P 표지된 인간 타입 II GnRH 수용체 엑손 1을 사용한 mRNA의 노덧 블롯에 의해 조사하였다. 인간 타입 II GnRH 수용체 게놈 서열 (P1 클론)을 인간 서열에 대한 올리누클레오티드에 의한 P1 클론의 PCR 스크린을 사용하여 게놈 시스템즈(Genome Systems) (St Louis, MD)에 의해 수득하였다 (17). 이 서열에 대한 올리고누클레오티드 (안티센스: CTGTCCTGCCCGGTCCTGAG; 센스: TGCCCACCTTCTCGGCAGCA)를 P1 클론과 함께 사용하여 460bp 앰플리콘을 생성시켰다. 표지화를 공급업자가 명시한 조건 (Stratagene)을 사용하여³²P dCTP (6000 Ci/mMole)로 수행하였다. 하이브리드화는 5 x SSC/0.005% SDS/5x 덴하르트/2㎎/㎖ 연어 정자 DNA 중에서 65℃에서 2 x 10⁷cpm을 사용하여 수행하였고, 55℃에서 0.1 x SSC/0.5% SDS로 세척하고, 블롯을 X선 필름에 6일간 노출시켰다.

양에서의 LH 및 FSH의 자극.생체내에서 FSH 및 LH 분비를 유도하는 데에 있어서의 포유류 GnRH I 및 GnRH II의 상대적 효능을 본 발명자들의 거세하지 않은 숫양(ram) 모델 Soay를 사용하여 시험하였다 (24). 이것을 광주기 유도된 생식 사이클의 성적으로 활발한 (짧은 일수, SD) 및 활발하지 못한 (긴 일수, LD) 둘 모두 동안 반복하였다 (24). 동일한 동물 (n = 8)을 두 가지 경우에 사용하였다. GnRH를 교차 설계에서 250ng/ram 및 10㎍/ram의 용량으로 투여하되, 완전한 회복을 위해 처리 사이에 1주일의 간격을 두었다. 펩티드를 0.9% 식염수 1㎖에 용해시키고,정맥내 볼루스(bolus)로서 투여하였다. 혈액 샘플을 처리하기 20분 전에서 처리 후 2시간째까지 10분 마다 채취하고, 특이적 방사선면역검정에 의해 검정하였다 (24). GnRH 아고니스트에 대한 FSH 및 LH 반응을 델타 반응으로서 계산하였다 (처리 후 2시간 평균 호르몬 농도 - 처리 전 20분 평균 호르몬 농도). 이들 값을 사용하여 GnRH II 및 GnRH I에 대한 FSH : LH 반응비를 계산하였고, 이로써 포유류 GnRH I 자극과 비교하여 GnRH II 자극에 대한 전체 비를 계산하였다. 이는 LD 및 SD 둘 모두하에서 각각의 동물에 대해 평가된 후, 그룹에 대해 평가되었다 (평균 ±SEM, n = 8).

결과 및 논의

마모셋 타입 II GnRH 수용체의 클로닝 및 1차 구조.

광범위한 척추동물종으로부터의 게놈 DNA로부터 EC3을 증폭시키는 것은 양서류 및 파충류에서 공지된 타입 I 수용체 및 신규한 타입 II 수용체를 나타내는 두 개의 독특한 서열을 밝혀주었다 (25). 인간 EST 데이터베이스의 검색은 파충류 EC3에 대한 상동 서열을 밝혀내었다 (17). EST 컨티그(contig)로부터, 본 발명자들은 타입 수용체의 이러한 엑손에 상응하는 추정 엑손 2 및 3을 엔코딩하는 부분 수용체를 작제하였다 (17). 모든 EST는 안티센스 배향이었고, 이는 이들이 조사된 모든 조직에서 고도로 발현되는 신규한 인간 리보누클레오단백질 (RBM8)의 3' 비번역된 영역 (UTR)에 존재함을 나타내었다 (26). 엑손 1의 등가물은 RMB8 3' UTR에 없었다. 따라서, 엑손 1에 상동인 서열을 확인하는 것이 타입 II 수용체를 발견하기 위해 필수적임이 분명하였다. 인간 타입 I 수용체의 엑손 1을 조회어로 사용하여 인간 데이터베이스를 검색한 결과 다수의 EST 및 게놈 서열 BG 036291, AA 954764; AL 160282이 밝혀졌다.

수용체는 별개의 조직에서 발현되는 드문 전사체로 여겨졌으므로, 본 발명자들은 인간 타입 II 수용체의 EC3 도메인에 대한 항혈청을 생성시켰고, 면역세포화학에 의해 인간, 붉은털원숭이, 양 및 마우스의 하수체 및 뇌에서의 강력한 반응성을 알아내었다 (도 2). 그 후, 본 발명자들은 인간 엑손 1에 대한 올리고누클레오티드 및 RBM8 3' UTR 서열을 사용하여 PCR 및 5' RACE 절차에 의해 마모셋 하수체 및 뇌로부터의 cDNA를 증폭시켰다. 전장 cDNA는 380 아미노산 단백질을 엔코딩하며 특징적인 G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 구조 SEQ ID No. 1을 지닌다. 이것이 그 밖의 GPCR 보다 GnRH 수용체와 더욱 상동성이라고 하더라도, 이것은 인간 타입 I 수용체와 단지 41% 서열 동일성을 지니는데 이는 초기 진화론적 유전자 복제를 제시해준다. 이는 또한 신속한 탈감작에 대해 중요하고 포유류 타입 I 수용체에는 독특하게 없는 카복시 말단 테일을 지닌다 (27 - 30). 상기 수용체는 또한 수용체 활성화에서 역할을 하는 포유류 타입 I 수용체의 트랜스멤브레인 나선 2 및 7의 독특한 Asn/Asp 마이크로도메인을 지니지 않는다 (21). 대신에, 이것은 최근 클로닝된 비포유류 타입 I GnRH 수용체에서와 같은 Asp/Asp 모티프를 지닌다 (7, 9). 드로소필라 GnRH 수용체 동족체는 대부분의 GPCR의 특징인 흔한 Asp/Asn 모티프를 지니며 (31) 이는 고대 척추동물 GnRH 수용체에서 Asp/Asp로의 최초 돌연변이가 일어난 후 포유동물 타입 I 수용체에서 Asn/Asp로 돌연변이가 일어났음을 나타내준다. 따라서 이러한 마이크로도메인(21)의 활성화 역할은 타입 II 수용체를 사용한 실험에 의해 추가로 밝혀질 수 있다. 포유류 타입 I 수용체의 리간드 선택성에 대해 중요한 EC3의 LSD/EP 서열 (9, 20)은 파충류 (VPPS) 및 양서류 (VPPV) 타입 II GnRH 수용체에 또한 존재하는 VPPS가 대신한다 (25). 따라서, 이러한 서열의 차이는 GnRH II에 대한 타입 II 수용체 선택성의 결정인자인 것으로 여겨지는데, 이는 모든 그 밖의 결합 부위 (9)가 보존되기 때문이다.

마모셋 타입 II GnRH 수용체의 약리학적 특징화.

도 4는 트랜스펙션된 COS-7 세포에서 발현된 마모셋 타입 II GnRH 수용체에 의해 매개된¹²⁵I-[His⁵, D-Tyr⁶]GnRH의 이종성 경쟁 결합을 도시하며, 타입 II GnRH 수용체가 GnRH 타입 II에 대해 높은 선택성을 나타냄을 보여준다.

천연 GnRH 및 두 개의 GnRH 유사체에 대한 타입 II GnRH 수용체의 친화성 및 특이성이 도 5에 도시되어 있다. GnRH 아고니스트 및 안타고니스트의 추가의 특징화는 일상적인 결합 검정으로 결정될 수 있다. 수용체의 시그널링 경로의 확인은 2차 메신저 생성 시스템을 활성화시킬 수 있는 리간드 유도된 수용체의 능력을 시험함으로써 조사되었다.

상기 기술된 발현 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 이노시톨 포스페이트의 생성을 활성화시키지만 (도 5 참조) 사이클릭 AMP 생성은 자극하지 않는다고 결정하였다.

따라서, COS-7 세포에서의 타입 II 수용체의 발현은 이것이 수용체 결합 검정 (도 4) 및 이노시톨 포스페이트 세포내 메신저 생성의 자극 (포유류 GnRH I과비교하여 40배 내지 90배 큰 활성) (도 5)에서 GnRH II에 대해 고도로 선택적임을 나타내었다 (표 1). 이는 타입 I 수용체와 대조적인데, GnRH II는 이들 검정에서 포유류 GnRH I의 10% 및 9% 활성만을 지닌다 (도 6). 전체적으로 GnRH II는 타입 I 수용체 보다 타입 II 수용체에 대해 24배 큰 친화성을 지닌다. 또한, 타입 II 수용체는 연어 GnRH 및 [D-Arg⁶]GnRH II에 대해 더욱 선택적이었다 (표 1).

마모셋 타입 II & 인간 타입 I GnRH 수용체의 리간드 결합 및 이노시톨 포스페이트 생성 특성 비교

펩티드	리간드 결합 (IC₅₀)	InsP 생성 (EC₅₀)
	마모셋 타입 II	인간 타입 I	마모셋 타입 II	인간 타입 I
GnRH II	1.07 ±0.04	26.1 ±4	0.45 ±0.05	7.41 ±1.55
GnRH I	42.6 ±3.19	2.81 ±0.17	40.5 ±4.43	0.63 ±0.08
sGnRH	9.48 ±2.17	244 ±23.6	5.99 ±0.91	9.62 ±3.5
[D-Arg⁶]GnRH II	3.34 ±0.06	11.9 ±0.35	2.39 ±0.64	3.8 ±0.71
안타고니스트135-18	1650 ±478	10.6 ±1.4	276 ±45.5	완전(full) 안타고니스트
데이터는 나노몰로 표현되고, s.e.m.을 나타낸다 (n = 3 내지 6). 포유류 GnRH I (GnRH I) 연어 GnRH (sGnRH:[Trp⁷, Leu⁸]GnRH I), GnRH II ([His⁵, Trp⁷, Tyr⁸]GnRH I)

더욱이, 타입 I 수용체 GnRH 안타고니스트는 타입 II 수용체에서 안타고니스트로서 작용하였다 (도 5). 고나도트로핀 생합성의 조절 및 GnRH에 의해 조절되는 성선자극세포 기능의 조절이 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAP 키나제)의 활성화에 의해 매개될 수 있는 것으로 최근 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 3가지 주요 MAP 키나제 프로토타입, COS-7 세포 중의 ERK, JNK (에이수케 니시다(Eisuke Nishida) (Kyoto University)를 통해 입수할 수 있는 MAP 키나제의 특정한 타입) 및 p38α을 활성화시킬 수 있는 타입 인간 GnRH 수용체 및 마모셋 타입 II GnRH 수용체 둘 모두의 능력을 평가하였다. 타입 I 수용체에서, 포유류 GnRH I은 ERK2를 활성화하는 데에 있어서 GnRH II 보다 현저히 효능적이었다 (도 8a). 대조적으로, 타입 II 수용체에서, 리간드 특이성은 반대였고, 안타고니스트 135-18은 타입 I 수용체에서의 낮은 활성과 비교하여 현저한 아고니스트 활성을 지녔다 (도 8 패널 a 및 b). JNK의 아고니스트 유도된 활성화는 타입 I 또는 타입 II 수용체의 자극에 의해 검출되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, p38α의 활성화는 타입 II 수용체의 자극시에 검출되었지만, 타입 I 수용체의 자극에서는 검출되지 않았다 (도 8c). 또한, p38α활성화의 시간 경과(time course)는 ERK2의 타입 I/II 수용체 활성화에 대한 시간 경과 보다 현저히 길었다. 또한, 본 발명자들은 타입 I GnRH 수용체를 통한 ERK2 자극이 타입 II GnRH 수용체 자극에 의해 매개된 자극 보다 일시적임을 주목하였다 (도 8c). 따라서, 두 개의 수용체에 의한 시그널링에서의 구별되는 차이가 존재하였다.

마모셋 타입 II GnRH 수용체의 조직 분포 및 발현.타입 II 수용체의 잠재적 기능에 관한 견식을 얻기 위해, 인간 및 마모셋 조직에서의 이의 발현이 조사되었다. 마모셋 뇌 조직으로부터의 cDNA의 PCR 증폭은 이것이 하수체, 척수, 뇌교, 소뇌, 피각, 수질, 시상하부, 시각교차 앞구역, 중뇌, 후두극, 전두엽 및 뇌량에서 발현됨을 밝혀내였다 (도 9a). 발현은 고환, 전립선, 유선, 정낭 및 부고환과 같은 생식 조직에서 높았다. 상당한 발현이 부신, 갑상선, 심장 및 골격근에서 검출되었지만, 간, 난소 및 방광과 같은 그 밖의 조직에서는 발현이 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않았다 (도 9a). 노던 블롯은 유사한 발현 패턴을 생성시켰다(데이터는 제시되지 않음). 엑손 1로 프로빙된 인간 조직에 대한 노던 블롯은 대뇌 피질 및 후두극에서 최대 발현을 나타내었고, 전두엽, 측두엽 및 피각에서 중간정도의 발현을 나타내었으며, 소뇌, 수질 및 척수에서 낮은 발현을 나타내었다 (도 9b). 아미그달라에서 상당한 발현이 나타났고, 미상핵, 뇌량, 해마, 흑색질, 시상밑핵 및 시상에서는 낮은 발현이 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). 또한, 심장 및 췌장에서는 현저한 발현이 나타났지만, 태반, 폐, 간, 골격근 및 신장에서는 발현이 거의 나타나지 않거나 전혀 나타나지 않았다 (도 9c).

하수체에서의 타입 II GnRH 수용체 기능.인간 타입 II 수용체의 EC3에 대한 특이적 항혈청을 사용하여 면역세포화학을 수행하였고, 인간 하수체전엽에서의 수용체의 특이적 발현을 입증하였다 (도 2). 신규한 타입 II 수용체가 하수체 기능을 조절할 수 있다는 가능성에 비추어, 본 발명자들은 이것이 다른 포유류의 하수체에서 발현되는 지를 결정하였다. 스테이닝(staining)은 마우스 및 양의 하수체전엽에서, 세포의 약 10%에서 또한 발견되었다 (성선자극세포의 상대적 출현) (도 2). 양의 경우, 타입 II 수용체 및 LH 항혈청에 의한 하수체전엽 이중 스테이닝은 타입 II 수용체 면역반응성이 LH 포지티브 세포의 69%에서 코-로컬리제이션됨을 밝혀내었다 (도 2). 타입 II 수용체 포지티브 세포의 12%만이 LH에 대해 네거티브였다. 포유류 GnRH I 결합 부위가 발정 전기에 래트 하수체의 성선자극세포의 90% 이하에서 LH와 또한 코-로컬리제이션되므로 (32), 대부분의 성선자극세포가 타입 II 및 타입 I 수용체 둘 모두를 발현시키는 것으로 여겨지며, 이는 이들 수용체가 LH 및 FSH 생합성 및 분비를 공동으로 조절할 수 있음을 제시해준다. 대부분의성선자극세포내의 타입 II 수용체의 존재는 최초 고려시에 의외였는데, 이는 단일 GnRH (포유류 GnRH I)이 성선자극세포의 분비를 조절하는 데에 충분하고, 포유류 난소 주기 동안의 LH 및 FSH의 차별적 분비가 성선 스테로이드 (안드로겐, 에스트로겐 및 프로게스테론) 및 펩티드 (액티빈, 인히빈 및 폴리스태틴)의 조절 효과에 의해 적절하게 이루어질 수 있음을 제시해주는 상당한 문헌이 존재하기 때문이다 (14). 그러나, 상당수의 생리학적 실험은 고나도트로핀의 차별적 분비를 설명해주는 FSH-방출 펩티드의 존재를 이끌어낸다 (13 - 16).

GnRH II (닭 GnRH II로도 일컬어졌음)에 대한 초기 실험에서, 이는 닭 GnRH I (닭 타입 I GnRH)와 비교하여 우선적인 FSH-방출 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다 (33). 더욱이, GnRH II는 비포유류 척추동물의 종에서 시상하부 영역 (참조: 참고문헌 (7, 8)) 및 원숭이의 시각로위, 뇌실곁, 활모양 및 하수체 줄기 영역에 국재화되었으며, 여기서 이것은 고나도트로핀 분비에서 어떠한 역할을 하는 것으로 생각된다 (19, 34). 따라서, 본 발명자들은 잘 정립된 양 모델을 사용한 실험을 수행하여 LH 및 FSH 분비에 대한 포유류 GnRH I 및 GnRH II의 상대적 효과를 결정하였다. GnRH의 250ng 볼루스에 대한 반응은 상대적 LH 및 FSH 분비와 비교하여 너무 낮았다. 10㎍ 용량에서, 모든 램(ram)은 강한 반응을 나타내었고, 각각의 개체는 포유류 GnRH I와 비교하여 GnRH II로 처리된 경우 높은 비의 FSH 대 LH 분비를 나타내었다 (도 7). GnRH II에 의해 유도된 FSH 대 LH의 평균 비는 성적으로 활발한 램 및 성적으로 활발하지 않은 램 각각에 대해 포유류 GnRH I에 의해 유도된 비 보다 2.14 ±0.29 및 2.02 ±0.34 (평균 ±SD) 배 높았다. GnRH II 처리시의 성적으로 활발한 및 활발하지 않은 램 둘 모두에서 생성된 FSH/LH 비는 포유류 GnRH I 처리의 경우 보다 둘 모두 현저히 높았다 (각각 p = 0.03, p = 0.002, paired two-tailed t-test).

GnRH II가 타입 I 수용체에서 포유류 GnRH I의 20% 이하의 친화성 및 효능을 지니는 것으로 간주되고 두 개의 펩티드의 생체내 분비가 농도 및 박동성 방출의 페이싱(phasing) 둘 모두에서 미세 조정되는 것으로 여겨지는 경우, 본 발명의 펩티드의 외인성 볼루스 투여는 비교적 천연적인 방법이다. 따라서, 내인적으로 분비된 GnRH II에 의한 FSH의 상대적 차별 자극은 생체내에서 훨씬 클 수 있다.

시상하부에서의 GnRH II의 발견, 성선자극세포 중의 타입 II 수용체 면역반응성의 존재 및 고나도트로핀의 차별적 방출은, 현존하는 정설과는 반대로, 고나도트로핀이 두 개의 별도의 동족 성선자극세포 수용체를 통해 작용하는 두 가지 상이한 형태의 GnRH에 의해 조절됨을 제시해준다. 상대적 LH 및 FSH 분비에서의 차이를 이끌어내기 위해, 포유류 GnRH I 및 GnRH II는 상이한 패턴의 방출 기간, 농도 및 분비 및/또는 차별적 세포내 시그널링 경로의 펄스 빈도를 지녀야 할 것이다. 본원에 나타난 타입 I 및 타입 II 수용체 사이의 차별적, 일시적 또는 정성적 다운스트림 시그널링은 우선적 FSH 분비를 위한 수단을 제공할 수 있다.

불프로그 교감신경절에서의 타입 II 수용체의 GnRH II 활성화는 M-타입 K⁺채널을 효능적으로 억제시킨다 (11). 성선자극세포에서의 유사한 작용은 이들을 부분적으로 탈분극화시킴으로써 세포에 대한 외부 자극 투입 또는 L 타입 채널을통한 세포외 Ca²⁺의 진입을 용이하게 해주며, 이는 포유류 GnRH I에 의한 타입 I 수용체의 자극시에 일어난다 (1 - 3). 이들 두 가지 GnRH 및 GnRH 수용체 시스템은 시그널링 경로에서의 차이와 함께 차별적 FSH 및 LH 분비를 위한 수단을 제공하며, 생식계의 질병의 치료를 위한 신규한 GnRH II 유사체 뿐만 아니라 스테로이드 성 호르몬 생성에 영향을 미침이 없이 FSH 및 생식발생을 선택적으로 억제하는 피임약을 개발할 수 있는 가능성을 열어준다.

신경 발생 및 성적 흥분에서 역할을 할 수 있는 타입 II GnRH 수용체.중추 및 말초 신경계에서의 이의 광범한 분포로 인해, GnRH II는 불프로그 교감신경절에서 K⁺채널 억제에 의해 입증된 바와 같이 (11) 신경조절작용을 지니는 것으로 제안되었다 (7, 8). 본 발명자들의 다수의 뇌 영역에서의 GnRH II-선택적 수용체 발현의 입증은 이를 뒷받침해준다. 타입 II GnRH 수용체 항혈청 면역반응성 세포는, 배아 일수 E58, E70 및 E78에서 붉은털원숭이 중에서 뿐만 아니라 성체 시노몰구스 원숭이 중에서, 내측 격벽(medial septum), 분계섬유줄의 베드 핵 (bed nucleus), 내측 시각교차앞구역, 무명질, 메이너트(Meynert)의 기저핵, 클로스트럼(claustrum), 아미그달라 및 피각과 같은 시상하부외 영역, 및 시각교차위핵, 뇌실주위 영역, 복내측핵 및 배내측핵과 같은 시상하부 영역에서 광범위하게 관찰되었다. 이들 영역 중의 일부에서 (예를 들어, 중뇌 및 시각교차위핵), GnRH II 리간드가 또한 발현된다 (19, 34). 시상하부외 영역에서의 타입 II GnRH 수용체 포지티브 세포의 분포 패턴은 본 발명자들이 기술한 초기 발생중인 포유류 GnRHI 세포의 분포 패턴과 오버랩되었다 (18). 배아 발생의 후기에, GnRH I 세포는 타입 II GnRH 수용체 항혈청과 일관하여 면역포지티브하지 않았다. 이는 포유류 GnRH I 뉴런의 발생에서의 수용체에 대한 잠재적인 역할을 제시해준다. 흥미로운 관찰은 시상하부의 시각교차앞구역 및 뇌실주위 영역에서 포유류 GnRH I 유전자를 발현하는 뉴런이 (참고문헌 34) 붉은털원숭이에서 타입 II GnRH 수용체 항혈청으로 스테이닝된다는 것이었으며, 이는 GnRH II가 포유류 GnRH I 뉴런을 조절할 수 있음을 제시해준다. 포유류 GnRH I은 이 자체의 분비에 대해 초단기 피드백을 지니는 것으로 알려져 있지만 (8, 35), 시상하부 영역에서의 포유류 GnRH I 뉴런상의 타입 II 수용체의 코-로컬리제이션은 포유류 GnRH I 분비에 대한 약간의 효과가 GnRH II를 통해 매개될 수 있음을 제시해준다.

GnRH는 성호르몬 생성의 자극과 무관하게 설치류에서 생식 행동 및 성적 흥분에 대한 직접적인 효과를 지니는 것으로 밝혀졌다 (8, 36). 성적 행동의 시각적, 후각적 및 그 밖의 자극제에 반응하여 뇌 영역의 GnRH 함량, 세포수 및 세포 크기의 빠른 변화가 어류, 양서류, 파충류 및 포유류의 종에서 관찰되었다 (참조: 참고문헌 7, 8, 10, 36, 37). 더욱이, GnRH II는 산비둘기 (7) 및 멧종다리 (12)에서 구애행동 및 노래를 자극하는 데에 있어서 포유류 GnRH I 보다 훨씬 더 효과적이고, GnRH II 분포는 영원(newt) (37)에서 구애의 개시 후에 중뇌 세포체로부터 말단 영역으로 이동한다. 인간 또는 원숭이 뇌의 측두엽, 피각, 아미그달라, 내측 시각교차앞구역, 복내측핵, 배내측핵 및 뇌실주위핵에서의 타입 II GnRH 수용체의 분포와, 래트, 개, 고양이, 원숭이 및 인간에서의 성적 관심, 발기, 삽입, 트러스팅(thrusting) 및 사정과 같은 생식 행동에 대한 이들 영역의 병변 및/또는 전기적 자극의 효과의 주목할만한 일치가 존재한다 (36 - 38). GnRH II는 붉은털원숭이에서 이들 영역에 또한 국재화되었다 (19, 34).

포유류의 신경계에서의 GnRH II의 작용 메카니즘은 알려져 있지 않지만 이 펩티드는 양서류의 교감신경절에서 확인되었으며, 여기서 이것은 선택적인 고친화성 수용체에 결합하고 (22) M-타입 K⁺채널을 효능적으로 억제한다 (11). GnRH II에 의한 이들 K⁺채널의 억제는 통상의 신경전달물질에 의해, 시냅스후 뉴런의 투입 저항을 증가시킴에 의해 및 부분 탈분극에 의해 빠른 흥분 전달을 촉진시킨다 (11). 따라서, 이는 신경전달물질에 의한 시그널링을 촉진시킴으로써 신경계에서의 GnRH II 효과, 특히 생식 행동에 대한 일반적 신경조절 메카니즘을 제공할 수 있다.

생식 조직에서의 타입 II GnRH 수용체.유선, 전립선, 성선 및 부신 세포와 같은 비신경성 생식 관련 조직에서의 마모셋 타입 II GnRH 수용체 발현 및 GnRH II 리간드 발현 (7, 8, 11)은 이들 조직 및 다양한 종양 (예를 들어, 전립선, 난소 및 유선 (1 - 3))에서의 수용체의 결합 약리학과 이들 조직에서 수용체인 것으로 믿어지는 공지된 하수체 타입 I 수용체의 결합 약리학의 불일치의 오랜 수수께끼를 풀어줄 수 있다. 예를 들어, 이들 종양 세포주의 증식에 대한 GnRH 아고니스트와 안타고니스트 둘 모두의 유사한 효과의 모순은 타입 II 수용체가 이들 효과를 매개하는 경우 이론적으로 설명될 수 있으며, 이는 본 발명자들이 특정한 포유류 GnRH I안타고니스트 (예를 들어, 135-18)가 타입 II 수용체에 대해 아고니스트로서 작용함을 밝혀내었기 때문이다 (도 8b). 더욱이, 이들 종양의 세포주에 대한 GnRH 유사체의 증식억제 효과는 타입 II 수용체에 의한 p38α의 활성화와 일치하는 데, 이는 이러한 MAP 키나제가 증식억제제로 공지되어 있기 때문이다 (39).

Claims

작용성 타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R) 펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드.
제 1항에 있어서, 타입 II GnRH-R의 엑손 I의 일부 또는 전부를 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 포유류 타입 II GnRH-R을 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 3항에 있어서, 영장류 타입 II GnRH-R을 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 4항에 있어서, 마모셋 타입 II GnRH-R을 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 5항에 있어서, SEQ ID No. 1에 개시된 누클레오티드 서열을 지니거나 이와 90%가 넘는 상동성을 지닌 누클레오티드 서열을 지님을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 4항에 있어서, 인간 타입 II GnRH-R을 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 7항에 있어서, SEQ ID No. 3, 5, 7 또는 9 중 어느 하나에 개시된 누클레오티드 서열 또는 이와 90%가 넘는 상동성을 지닌 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 8항에 있어서, SEQ ID No. 4, 6, 8 또는 10 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열 또는 이와 90%가 넘는 상동성을 지닌 아미노산 서열을 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 타입 II GnRH에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 10항에 있어서, 타입 II GnRH-R에 대한 수용체로서 작용할 수 있는 펩티드를 엔코딩함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 재조합 유전자 작제물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하며 작용성 타입 II GnRH-R 펩티드를 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
제 13항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제 14항에 있어서, 작용성 타입 II GnRH-R을 발현시킬 수 있음을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 12항에 따른 작제물이 게놈내로 안정하게 삽입된 유전자이식 동물.
타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R)의 엑손 I의 일부 또는 전부를 포함하는 펩티드.
단리된 작용성 타입 II 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 (타입 II GnRH-R).
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 포유류 타입 II GnRH-R의 엑손 I의 일부를 포함함을 특징으로 하는 펩티드.
제 19항에 있어서, 영장류 타입 II GnRH-R의 엑손 I의 일부를 포함함을 특징으로 하는 펩티드.
제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No. 2에 개시된 아미노산 서열 또는 이와 90%가 넘는 상동성을 지닌 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 펩티드.
제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No. 4, 6, 8 또는 10 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열 또는 이와 90%가 넘는 상동성을 지닌 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 펩티드.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 타입 II GnRH와 특이적으로 결합할 수 있음을 특징으로 하는 펩티드.
제 23항에 있어서, 타입 II GnRH에 대한 작용성 수용체임을 특징으로 하는 펩티드.
타입 II GnRH-R과 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
제 25항에 있어서, 타입 II GnRH-R의 세포외 도메인 EC1, EC2 또는 EC3에 대해 특이적임을 특징으로 하는 항체.
a) 작용성 타입 II GnRH-R 펩티드를 제공하고 이 펩티드를 작용제(agent)에 노출시키고;

b) 상기 작용제가 타입 II GnRH-R 펩티드와 상호작용하는 지를 확인하는 것을 포함하여, 작용제를 약리학적 활성에 대해 스크리닝하는 방법.
제 27항에 있어서, 타입 II GnRH-R이 제 15항에 따른 숙주 세포에 의해 발현됨을 특징으로 하는 방법.
제 27항에 있어서, 타입 II GnRH-R이 제 11항에 따른 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포에 의해 발현되고, 상기 숙주 세포는 타입 II GnRH-R 시그널 트랜스덕션을 적어도 부분적으로 모사하며, 작용제가 타입 II GnRH-R 펩티드에 성공적으로 결합하는 경우 작용제에 상기 숙주 세포가 노출되면 타입 II GnRH-R 시그널 트랜스덕션을 일으킴을 특징으로 하는 방법.
타입 II GnRH-R 또는 이의 세포외 도메인을 투여하는 것을 포함하여, 생체내에서 GnRH가 이의 천연 수용체에 결합하는 것을 억제하는 방법.
제 30항에 있어서, 타입 II GnRH-R의 EC2 루프가 투여됨을 특징으로 하는 방법.
내인성 타입 II GnRH가 내인성 타입 II GnRH-R에 결합하는 것을 실질적으로 감소시키기에 충분한 양으로 외인성 타입 II GnRH-R 또는 이의 세포외 도메인을 투여하는 것을 포함하는 피임법.
생체내에서 내인성 타입 II GnRH가 이의 천연 수용체에 결합하는 것을 억제하기 위한 타입 II GnRH-R 또는 이의 외인성 도메인의 용도.
피임약으로서의 타입 II GnRH-R의 용도.
제 33항 또는 제 34항에 있어서, 타입 II GnRH-R이 재조합 유전자 작제물로부터 발현됨을 특징으로 하는 용도.