KR20020097180A - 약물 표적 발견을 위한 유전자 분열 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유기체의 게놈중의 각각의 유전자에 대하여 임의의 유전자들이 필수적인지, 또한 병인성 유기체의 경우 이들이 독성 또는 병인성에 요구되는 지를 실험적으로 결정할 수 있는 효과적이고 능률적인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 특정 유전자의 하나의 대립유전자가 불활성화되는 한편, 다른 대립유전자가 조건 발현하엣 위치하는 유전적 돌연변이체의 구성과 관련된다. 필수 유전자 및 독성 감염의 전개에 중요한 유전자의 동정은, 이러한 병인성 유기체에 대한 신규한 약물을 위한 선별의 개발의 기초를 제공한다. 본 발명은 또한 약물 선별을 위한 필수적이고 강력한 표적인 것으로 입증되어 있는 칸디다 알비칸스를 제공한다. 표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 다양한 약제 발견, 예컨대 재조합 단백질, 하이브리드화 분석 및 핵산 배열의 구조의 발견을 위해 사용될 수 있다. 다양한 선별 방법에서 필수 유전자에 의해 암호화된 단백질, 및 필수 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하는 유전적으로 가공된 세포의 사용 또한 본 발명에 속한다.
Description
약물 선별용 세포성 표적의 확인은, 유전자 산물을 불활성화시키면 세포가 생육할 수 없게 되는지를 입증하는 실험을 일반적으로 포함한다. 따라서, 예컨대 병인성 진균류에 의해 발현된 동일한 필수 유전자 산물에 대해 활성인 약물은 효과적인 치료제로서 예견될 것이다. 유사하게, 진균류의 병인성 및 독성에 필요한 유전자 산물은 약물 선별 프로그램을 위해 적합한 표적을 제공하는 것으로 또한 기대된다. 이 경우에 표적 확인은, 독성 인자를 암호화하는 유전자의 불활성화에 의해동물 모델 연구에서 덜 병인성이거나 이상적으로는 무독성인 것으로 보여지는 진균류 균주가 생성됨을 입증하는 것에 기초한다. 약물 표적의 동정 및 확인은, 이들 표적이 약학 산업에서 높은 처리량 선별(high throughput screen)에 대한 기초를 마련하므로, 신규한 약물의 검출 및 발견에 있어서 중요한 쟁점이다.
전통적으로 표적 발견법은, 신규하게 동정된 유전자 및 유전자 산물을 잠재적으로-적절한 약물 표적으로서 개별적으로 분석해야 하는 고가의 시간 소모성 방법이었다. 전체 게놈의 DNA 서열 분석은 유전자 발견 방법을 현저히 가속화시켰다. 결과적으로, 이러한 정보를 분석하기 위한, 즉 우선 유기체의 모든 유전자를 동정한 후 이중 어느 유전자가 효과적이고 무독성인 약물을 발견하는데 적합한 표적인지를 구별하기 위한 새로운 방법 및 수단이 요구된다. 서열 분석만을 통한 유전자 발견은 공지되거나 신규한 유전자중 어느 것도 약물 표적으로서 확인하지 못한다. 이러한 기초적인 사항 및 해당 유전자가 필수적인지 아닌지의 여부 결정으로부터 유전자의 기능을 해명하는 것은 적절한 약물 표적의 동정에 대하여 상당한 장애를 여전히 제공한다. 이러한 장애는 2배체 유기체의 경우 특히 뚜렷하다.
칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 인간에 대한 주요 진균류 병원균이다. 이러한 유기체에서 특이적이고 감수성이며 특유한 약물 표적이 동정되지 않았기 때문에 임상적 용도를 위한 효과적이고 무독성인 화합물의 개발이 제한되어 왔다. 최근에 칸디다 알비칸스의 전체 게놈에 대한 DNA 서열 분석이 완료됨에 따라 신규한 항진균성 약물 표적을 동정하기 위한 노력이 다시 활성화되었다. 그럼에도 불구하고, 유용한 약물 표적을 개발하기 위해 이러한 정보를 이용하는 데에는 두가지주요 장애가 남아있다: 즉, 칸디다 알비칸스에서 유전자 조작을 위한 적절한 마커가 부족하며, 2배체 유기체에서 특정 유전자가 필수 산물을 암호화하는지의 여부를 확립하는 것은 근본적으로 어렵다. 2000년 2월 18일자로 출원된 동시계류중인 가특허원은 칸디다 알비칸스에서 형질전환 및 유전자 분열에 적합한 마커를 암호화하는 두가지 유전자의 작성 및 우성의 선택가능한 마커의 동정에 대해 개시하고 있다.
칸디다 알비칸스에서 유전자를 분열시키기 위해 현행되는 방법(도 1)은 게놈내로 재조합되는 "URA 블래스터(blaster)" 유전자 카세트를 사용하고, 흥미로운 표적 유전자를 대체하는 다단계 과정을 통상적으로 포함한다. URA 블래스터 카세트는 상응하는 영양요구성(auxotrophic) 숙주에서 선택가능하고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) HisG 유전자의 직접적인 반복에 의해 플랭크(flank)화될 수 있는CaURA3마커를 포함한다. URA 블래스터 카세트는 교체될 유전자에 상응하는 플랭킹 서열(flanking sequence)을 또한 갖는데, 이는 동족성 재조합에 의한 유전자의 정밀한 교체를 용이하게 한다. 결실될 표적 유전자의 하나의 대립유전자를 갖는 것으로 추정되는 이형접합성 형질전환체는 우라실 원영양체로서 선택되고, 이들의 실체 및 염색체 구조는 서던 블롯(Southern Blot) 및 PCR 분석에 의해 확인된다. 염색체내 재조합이 HisG 반복물 사이에서 발생(이는CaURA3유전자의 절제 및 삽입된 카세트의 소실을 일으킨다)되는 단리물은 5-플루오로오로트산(5-FOA) 함유 배지상에서 선택된다. 이는, 표적 유전자의 제 2 대립유전자의 분열을 위해 URA-블래스터 카세트의 재사용을 비롯하여 전체 과정의 반복을 가능하게 한다. 이러한 경우에, 표적 유전자가 필수적이지 않으면, 동형접합성 유전자 분열이 제 2 라운드(round) 유전자 교체시에 이루어지고 서던 블롯 및 PCR 분석에 의해 동정된다.
그러나, 필수 유전자의 대립유전자 둘다가 소실된 동형접합성 결실 균주는 생육하지 않을 것이다. 따라서, 생육가능한 돌연변이체 균주의 불량한 성장을 비롯한 다른 설명들은 수득된 부정적인 결과와 같을 것이므로, URA 블래스터 방법은 표적 유전자의 필수적 특성을 확립하는 확실한 결과를 제공하지 않을 것이다. 윌슨(Wilson, R.B), 데이비스(Davis, D.) 및 미첼(Mitchell, A.P.)의해 개시된 방법[문헌 "J. Bacteriol.181, 1868-74(1999)" 참조]을 비롯하여 필수 유전자의 동정을 위해 보다 최근에 시도된 방법들은 다수의 영양요구성 마커 및 PCR에 기초한 유전자 분열 전략을 사용한다. 이러한 방법들은 URA 블래스터 카세트를 사용할 필요성을 효과적으로 제거하지만, 주어진 유전자가 필수적인지를 결정하는 것, 따라서 잠재적으로 유용한 표적을 결정하는 것은 여전히 노동 집약적이며, 게놈의 광범위한 분석에 적합하지 않다. 칸디다 알비칸스에서 유전자를 분열시키 위해 URA 블래스터 카세트를 사용하거나 다수의 영양요구성 마커에 기초한 방법을 사용할 경우, 주어진 유전자가 필수적이라는 통계적으로 유효한 결론을 뒷받침하기 위해서는 상당한 노력이 요구된다. 전형적으로, 유전자가 필수적이라는 주장이 통계적으로 지지되기 이전에, 30 내지 40 라운드 사이에 형질전환체는 모두 분열 단편 및 이전에 작성된 분열 대립유전자 사이의 동족성 재조합으로부터 생성된 재작성된 이형접합성 균주로서 확인되어야만 한다(PCR 또는 서던 블롯 분석을 사용하여). 더욱이,제 2 돌연변이는 형질전환 단계 또는 5-FOA 계수기 선택(URA 블래스터 카세트가 재사용된 경우)에서 선택될 수 있으므로, 두가지의 독립적으로 작성된 이형접합성 균주는 바람직하게는 제 2 대립유전자의 분열을 시도하는 동안에 검사된다. 또한, 특정 표현형이 표적 유전자의 동형접합성 돌연변이(그러나, 제 2 돌연변이는 아님)와 연결됨을 나타내는 것은 유전자의 야생형 복제물을 분열 균주로 다시 형질전환시킴으로써 결손을 보충할 것을 요구한다.
최종적으로, URA 블래스터 방법은 유전자의 필수성의 직접적인 입증을 불가능하게 한다. 따라서, 필수적인 표적 유전자의 최종 표현형 특징을 엄밀하게 평가할 수 없다. 결과적으로, 확인된 약물 표적 유전자의 불활성화가 세포 사멸(즉, 사멸 최종 표현형)을 초래할 것인지 성장 억제(즉, 정지 최종 표현형)를 초래할 것인지의 여부를 확립하는 것은, 이러한 정보들이 약물 개발에 적합한 약물 표적을 우선화할 지라도, 현행 방법들로는 불가능하다.
분명히, 현행 유전자 분열 방법들은 노동 집약적이며 표적 확인을 위한 높은 처리량 전략에 대해 매우 위축적이므로, 2배체 병인성 진균류, 특히 칸디다 알비칸스에서 필수 유전자를 확실하고 신속하며 정확히 동정하기 위해 효과적인 방법 및 수단이 요구된다. 본 발명은 약물 표적의 신속한 동정, 확인 및 우선화를 제공하여, 결과적으로 약물 선별을 가속화시키는 높은 처리량 전략을 가능하게 함으로써 현행 약물 발견 방법에 있어서의 상기 단점들을 해결한다.
발명의 요약
본 발명은 유기체의 게놈중의 각각의 유전자에 대하여 이러한 유전자들이 필수적인지, 또한 병인성 유기체의 경우 이들이 독성 또는 병인성에 요구되는 지를 실험적으로 결정할 수 있는 효과적이고 능률적인 방법을 제공한다. 필수 유전자의 동정 및 확인과 독성 감염의 진행에 중요한 이들 유전자는 병인성 유기체에 대한 신규한 약물을 위한 높은 처리량 선별법을 개발하는데 기초를 마련한다.
본 발명은 염색체의 배수성(ploidy)과는 무관한 임의의 유기체, 특히 병인성 진균류에 의해 실행될 수 있다. 바람직하게는, 병인성 진균류는 2배체 병인성 진균류이며, 칸디다 알비칸스, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 양태에서, 본 발명은 유전자의 하나의 대립유전자가 발현가능한 우성의 선택가능한 마커를 포함하는 카세트의 삽입 또는 이에 의한 교체에 의해 변형된 2배체 진균류 균주를 작성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 카세트는 재조합에 의해 염색체내로 도입됨으로써 유전자의 제 1 대립유전자가 불활성화된 이형접합성 균주를 제공한다.
이러한 유전자의 나머지 대립유전자는, 유전자의 제 2 대립유전자의 발현이 이형성 프로모터에 의해 조절되도록, 이형성 프로모터를 포함하는 프로모터 교체 단편의 도입 또는 이의 재조합에 의해 변형된다. 이형성 프로모터로부터의 발현은 DNA-결합 도메인 및 전사-활성화 도메인을 포함하는 트랜스액티베이터 단백질(transactivator protein)의 존재에 의해 조절될 수 있다. 이러한 트랜스액티베이터 단백질의 DNA-결합 도메인은 이형성 프로모터중의 서열을 인식하여 이에 결합하고, 이러한 프로모터의 전사를 증진시킨다. 트랜스액티베이터 단백질은 이 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써 세포에서 형성될 수 있다.
유전자의 대립유전자 둘다가 변형된 2배체 진균류를 작성하는 상기 방법은 유기체의 각각 모든 유전자에 대해서 유사하게 수행되며, 이로써 유전자의 변형된 대립유전자를 각각 포함하는 2배체 진균류 세포의 집합체를 조립할 수 있다. 따라서, 이러한 집합체는 2배체 유기체의 실질적으로 모든 유전자의 변형된 대립유전자를 포함한다. 본원에서, "실질적으로 모든"이란 용어는 전체의 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상을 포함한다. 바람직하게는, 2배체 유기체의 게놈중의 모든 유전자가 집합체내에 나타난다.
본 발명은, 유전자의 변형된 대립유전자(여기서, 유전자의 제 1 대립유전자는 발현가능한 우성의 선택가능한 마커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 삽입되거나 이 서열로 교체됨으로써 불활성화되고 유전자의 제 2 대립유전자는 또한 이의 발현이 이형성 프로모터에 의해 조절되도록 변형된다)를 포함하는 2배체 병인성 진균류와 같은 2배체 유기체를 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 돌연변이체 2배체 병인성 진균류 균주에서 변형된 대립유전자는 균주의 성장, 생육 및 생존에 필요한 필수 유전자에 상응한다. 본 발명의 또다른 관점에서, 변형된 대립유전자는 숙주 유기체에 대한 2배체 병인성 진균류 균주의 독성 및 병인성에 필요한 유전자에 상응한다. 두가지 경우 모두에서, 필수 유전자 및 독성/병인성 유전자는 잠재적인 약물 표적이다.
따라서, 본 발명은 각각의 집합체가 다수의 균주(이러한 균주 각각은 상이한 유전자의 변형된 대립유전자를 함유한다)를 포함하는 돌연변이체 2배체 진균류 균주의 집합체를 포함한다. 본 발명의 균주의 집합체는 진균류의 게놈에 존재하는 실질적으로 모든 상이한 필수 유전자에 대한 변형된 대립유전자 또는 병인성 진균류의 게놈에 존재하는 실질적으로 모든 상이한 독성 유전자에 대한 변형된 대립유전자를 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 또한 식별가능한 위치에 배치된 다수의 한정된 뉴클레오타이드 서열을 기질상에서 일정한 배열로 포함하는 핵산 마이크로배열(microarray)에 관한 것이다. 상기 한정된 뉴클레오타이드 서열은, 2배체 병인성 유기체의 성장 및 생존에 요구되는 2배체 병인성 유기체의 필수 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 유기체의 병인성 또는 독성에 기여하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및/또는 돌연변이체 균주 각각을 표시하기 위해 사용된 특유의 분자 태그(tag)에 상보적이며 이와 하이브리드화될 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 2배체 유기체의 생존에 필수적인 유전자 및 2배체 병인성 유기체의 독성 및/또는 병인성에 기여하는 유전자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 첫번째로, 본 발명은 유전자의 하나의 대립유전자가 분열 카세트의 삽입 또는 이에 의한 교체에 의해 불활성화되고 나머지 대립유전자가 이의 발현이 이형성 프로모터의 조절하에 있도록 이형성 조절 프로모터를 포함하는 핵산 분자에 의해 변형된 2배체 유기체의 돌연변이체(예: 돌연변이체 진균류 세포)를 제공한다. 두번째로, 이러한 돌연변이체 세포를 변형된 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 발현되지 않는 조건하에서 배양시킨다. 그런 다음, 세포의 생육성 또는 병인성을 측정한다. 결과로 나타난 생육성의 감소 또는 심각한 성장 억제로부터, 돌연변이체 세포에서 변형된 유전자가 병인성 진균류의 생존에 필수적임을 알 수 있다. 유사하게, 결과로 나타난 돌연변이체 세포의 독성 및/또는 병인성의 감소로부터, 변형된 유전자가 병인성 진균류의 독성 및/또는 병인성에 기여함을 알 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 개시된 방법에 따라 작성된 돌연변이체 병인성 진균류 균주를 병인성 진균류에 대해 효과적인 항진균제의 검출에 사용한다. 본 발명의 돌연변이체 세포를 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 상이한 성장 조건에서 배양한다. 그런 다음, 성장 속도를 비교하여 화합물이 표적 유전자 산물에 대해 활성인지의 여부를 나타낸다. 표적 유전자의 제 2 대립유전자는 실질적으로 적게 발현되어 변형된 대립유전자에 의해 발현된 유전자 산물에 대하여 활성인 화합물에 대한 증진된 감수성을 갖는 세포를 제공할 수 있다. 다르게는, 제 2 대립유전자는 실질적으로 과발현되어 표적 유전자의 변형된 대립유전자에 의해 발현된 유전자 산물에 대하여 활성인 화합물에 대한 증진된 내성을 갖는 세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 개시된 방법에 따라 작성된 균주는 식물 또는 동물, 예컨대 인간에서 비감염성 질환의 치료에 효과적인 치료제를 선별하기 위해 사용된다. 표적의 아미노산 서열과 식물 또는 동물의 아미노산 서열이 유사하다는결과 또는 서열의 유사성이 없다는 결과에 근거하여 동정된 활성 화합물은 식물 또는 동물의 질병, 특히 인간의 질병(예: 암 및 면역질환)을 치료하기 위한 치료제일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 공지 약물의 존재를 비롯한 다양한 조건하에서 필수 유전자 및/또는 독성 유전자의 발현을 분석하는 전사 프로파일링(transcriptional profiling) 및 프로테오믹(proteomic) 기법의 용도를 추가로 포함한다. 이러한 연구로부터 수득된 정보는 공지 약물의 표적 및 기작을 밝혀내고, 공지 약물과 유사한 방식으로 작용하는 신규 약물을 발견하며, 유기체의 성장 및 생존에 필수적이며 유기체의 독성 및 병인성에 기여하는 유전자 산물간의 상호작용을 설명하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 병인성 유기체의 유전자 1조를 약물 선별을 위해 잠재적인 표적으로서 동정한다. 이러한 유전자는 본원에 개시된 방법 및 기준을 사용하여 병인성 진균류의 생존 및/또는 병인성 진균류의 독성 및/또는 병인성에 필수적인 것으로 결정된 유전자를 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 병인성 유기체의 필수 유전자 또는 독성 유전자(즉, 표적 유전자)의 폴리뉴클레오타이드는 다양한 약물 발견을 위해 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 폴리뉴클레오타이드는 특성화, 선별 또는 치료 용도를 위한 재조합 단백질을 발현시키기 위해; 병인성 유기체가 침해하거나 (영구적으로 또는 진행의 특정한 단계로 또는 질병 상태로) 존재하는 숙주 조직에 대한 마커로서; 잠재적인 오르토로그(ortholog) 필수 유전자 또는 독성 유전자를 동정하기 위하여 다른 관련되거나 관계가 먼 병인성 유기체의 DNA 서열과 비교하기 위해; 발현 패턴을 조사하기 위해 핵산 배열에 부착시키기 위한 올리고머를 선택하거나 제조하기 위해; DNA 면역 기법을 사용하여 항단백질 항체를 생성하기 위해; 항-DNA 항체를 생성하거나 또다른 면역 반응을 유도하기 위한 항원으로서; 및 치료제(예: 안티센스)로서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 또다른 단백질에 (예를 들면 수용체-리간드 상호작용으로) 결합되거나 결합될 수 있는 단백질을 암호화하는 경우, 이 폴리뉴클레오타이드는 결합되는 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 동정하거나 결합 작용의 억제제를 동정하기 위한 분석에 또한 사용된다.
또한, 본 발명에 의해 제공된 필수 유전자 및 독성 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또는 단백질(즉, 표적 유전자 산물)은 높은 처리량 선별을 위한 다수의 단백질들의 패널 또는 배열중의 일원으로서의 이의 용도를 비롯한 생물 활성을 결정하기 위한 분석에 사용될 수 있고; 항체를 생성하거나 면역 반응을 유도하기 위해; 생물학적 유체중의 단백질(또는 이의 수용체)의 농도를 정량적으로 측정하기 위해 고안된 분석에서 시약으로서(표지된 시약 포함); 병인성 유기체가 침해하거나 (영구적으로 또는 진행의 특정한 단계로 또는 질병 상태로) 존재하는 숙주 조직에 대한 마커로서; 및, 물론, 특히 독성 인자의 경우에 관련 수용체 또는 리간드(또한, 결합 파트너로서 지칭됨)를 동정하기 위해 사용된다. 단백질이 또다른 단백질에 (예를 들면 수용체-리간드 상호작용으로) 결합되거나 결합될 수 있는 경우, 이 단백질은 결합되는 다른 단백질을 동정하거나 결합 작용의 억제제를 동정하기 위한 분석에 또한 사용될 수 있다. 이러한 결합 작용에 관여하는 단백질은 펩타이드 또는 결합 작용에 대한 저분자량의 억제제 또는 작용제, 병인성 유기체의 침해 및 병인성에 관여하는 물질들을 선별하기 위해 사용될 수도 있다.
임의의 또는 모든 이러한 약물 발견 용도는 조사 산물로서 상업화하기 위해 키트로 개발될 수 있다. 키트는 본 발명의 다수의 필수 유전자 및 독성 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드, 항체 및/또는 기타 시약을 포함한다.
본원은 2000년 2월 18일자로 출원된 미국 가특허원 일련 번호 제60/183,534호(본원에 이의 전체가 참고로 인용되어 있음)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 (1) 치료 개입에 효과적인 표적으로서 유전자 산물을 동정 및 확인하는데 유용한 균주를 작성하는 방법, (2) 치료 개입에 효과적인 표적으로서 유전자 산물을 동정 및 확인하는 방법, (3) 동정된 필수 유전자들의 집합체, 및 (4) 신규한 약물을 발견하기 위한 선별 방법 및 분석 절차에 관한 것이다.
도 1은 칸디다 알비칸스에서 유전자를 분열시키기 위한 URA 블래스터 방법을 도시한다.
도 2는 유전자(CaKRE9)의 하나의 대립유전자의 유전자 분열 및 표적 유전자의 제 2 대립유전자의 프로모터 교체을 작성하고, 제 2 대립유전자를 이형성 프로모터에 의한 조건부의 조절된 제어하에 두는 GRACE 방법을 도시한다.
도 3은 GRACE 기법을 사용한,KRE1, KRE5, KRE6및KRE9에 의한 조건부의 유전자 발현을 나타낸다.
도 4는 GRACE 기법을 사용한,CaKRE1, CaTUB1, CaALG7, CaAUR1, CaFKS1및CaSAT2에 의한 조건부의 유전자 발현을 나타낸다.
도 5는 비발현 조건하에 상승된 발현을 나타내는 GRACE 균주로부터 단리된CaHIS3, CaALR1, CaCDC24및CaKREE9mRAN에 대한 노던 블롯(Northern Blot) 분석을 나타낸다.
도 6은 3-아미노트리아졸(3-AT)의 존재 및 부재하에, 야생형 2배체CaHIS3균주의 성장과CaHIS3이형접합체 균주 및 테트라사이클린 프로모터-조절된CaHIS3GRACE 균주의 성장을 비교하여 나타낸다.
도 6A는 억제 농도의 3-아미노트리아졸의 존재하에, 테트라사이클린 프로모터-조절된 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라테이즈를 상당량으로(constitutively) 발현하는CaHIS3GRACE 균주의 성장과 야생형 균주 및CaHIS3이형접합체 균주의 성장을 비교하여 도시한다.
도 6B는 중간 농도의 3-아미노트리아졸의 존재하에, 야생형 균주, 반수(haploinsufficient)CaHIS3이형접합체 균주 및 테트라사이클린 프로모터-조절된 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라테이즈를 상당량으로 발현하는CaHIS3GRACE 균주의 성장을 도시한다.
도 6C는 중간 농도의 3-아미노트리아졸의 존재하에, 야생형 균주, 반수CaHIS3이형접합체 균주 및 테트라사이클린 프로모터-조절된 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라테이즈를 극소량으로 발현하는CaHIS3GRACE 균주의 성장을 도시한다.
도 6D는 중간 농도의 3-아미노트리아졸의 존재하에 테트라사이클린 프로모터-조절된 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라테이즈를 극소량으로 발현하는CaHIS3GRACE 균주의 과민성을 나타낸다.
5.1 유전자 분열 및 약물 표적 발견
본 발명은 약물 표적 동정 및 타당성 검사에 대한 체계적이고 유효한 방법을 제공한다. 접근 방법은 유전체 정보뿐만 아니라 각각의 유전자의 생물학적 작용에 바탕을 두고 있다.
본 발명의 방법은 특정 유전자의 조제를 조절할 수 있으므로 성장, 생존 및/또는 병인성에서 이들의 작용이 조사될 수 있는 유전자 돌연 변이체의 집합을 필요로 한다. 이러한 조사로부터 발생한 정보는 잠재적 약물 표적으로서 각각의 유전자 산물의 동정을 허용한다. 본 발명은 약물 선별시 및 약물 작용의 메카니즘을 조사하기 위해 개별적으로 또는 집합적으로서 유전자 돌연 변이체를 사용하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 유전자 분열 실험에 있어서, 동형접합성 결손이 2배체 유기체에서 유전자의 양쪽 대립유전자에 대하여 발생할 수 없다는 소견은 이러한 유전자가 필수 유전자라는 결론을 그 자체로 지지할 수 없다. 오히려, 상기 유전자를 갖는 세포의 생존 능력과 관련된 본 유전자의 발현에 대한 직접적인 입증은 본 유전자가 필수적이라는 명백한 확증을 위해 필요하다.
상기 유전자가 세포의 생존을 위해 필수적이라는 직접적인 입증은 반수체 상태를 갖는 2배체 유기체에서 그의 발현을 중단시킴으로써 성립될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 이는 2배체 세포 유형에서 유전자 분열 방법을 통해 유전자 산물을 완전히 제거한 후 단일 돌연변이 차이점을 갖는 반수체 효모 균주를 직접적으로 비교할 수 있게 하는감수분열 결과의 포자 형성 및 4분 염색체 분열에 의해 달성된다. 그러나, 이러한 접근 방법은 대부분의 반수체 병인성 세포 유형을 포함하는 무성 효모 균주에 적용될 수 없고 다른 방법이 추정 필수 유전자의 발현을 제거하는데 필요하다.
하나의 양태로, 본 발명은 특정 유전자의 조제를 조절할 수 있는 유기체의 2배체 돌연변이 세포를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 방법에 의해, 유기체의 2배체 세포에서 표적 유전자의 하나의 대립유전자가 분열되는 동안 제 2 대립유전자는 이형 기원의 조절된 프로모터에 의해 대체된 프로모터를 가짐으로써 변형된다. 이러한 방법으로 구성된 균주는 변형된 대립유전자 쌍, 즉 양쪽 대립유전자가 상기 기재된 바와 같이 변형된 유전자를 포함하는 것으로 알려져 있다. 유기체의 게놈 DNA 서열을 이용할 수 있기 때문에, 유기체의 각각 및 모든 유전자로 상기 방법을 반복함으로써 분열된 대립유전자 및 조건 발현할 수 있는 대립유전자를 각각 보호하는 돌연변이 유기체의 집합을 구성할 수 있다. 그러므로, 상기 유전자 분열 계획은 상기 유기체에 대한 잠재적인 약물 표적 유전자의 실질적으로 완전한 세트를 제공한다. 변형된 대립유전자 쌍의 실질적으로 완전한 세트를 포함하는 돌연변이 유기체의 상기 집합은 높은 처리량의 약물 선별 분석을 개발하기 위한 기초를 형성한다. 이러한 돌연변이 유기체의 집합은 유기체의 게놈 서열이 완전하게 배열되지 않을 때에도 심지어 이루어 질 수 있다. 돌연변이 유기체의 집합이 더욱 작아질 수 있기 때문에, 각각의 돌연변이 유기체에서 유전자의 목적하는 하위 집합의 하나의 대립유전자가 분열되고 이러한 하위 집합에서 유전자의 다른 대립유전자가 조건 발현하에 배치된다. 상기 균주의 구성에 적용된 본 발명의방법은 본원에서 GRACE 방법이라고 언급하고, 그의 약어는 유전자 배치 및 조건 발현(GRACE; Gene Replacement And Conditional Expression)의 어구로부터 유래한다.
다른 대립유전자의 조건 발현과 관련된 하나의 대립유전자의 분열을 포함하는 GRACE 방법은 URA 발파기 카세트로 분열의 주기를 반복한 후 그 손실에 대한 대응 선택에 의존하는 한계를 극복한다. GRACE 방법은 병인성 진균류와 같은 2배체 병인성 미생물에서 큰 규모의 표적 타당성 검사를 허용한다.
2배체 세포에 적용될 경우에 본 발명의 GRACE 방법은 (i) 유전자 대체가 삽입, 절단 및/또는 결손에 의해 하나의 야생형 대립유전자의 암호화 및/또는 비-암호화 영역을 분열시키는 단계; 및 (ii) 프로모터 대체 또는 조건적인 단백질 불안정성(도 2 참조)을 통해 잔존하는 야생형 대립유전자를 조건 발현하는 단계를 포함한다. 본 방법의 상세한 설명은 이후 단락에서 제공된다.
GRACE 방법의 적용에 기인한 단리된 돌연변이 유기체는 본원에서 유기체의 GRACE 균주로 언급된다. 본 발명은 유기체의 이러한 돌연변이 균주를 포함한다. 구체적인 양태로, 유기체의 게놈에서 실질적으로 모든 상이한 유전자를 GRACE 방법에 의해 변형시킴으로써 생산된 GRACE 균주의 집합을 제공한다. 이러한 집합에서, 각각의 균주는 상이한 유전자의 변형된 대립유전자를 포함하고, 실질적으로 유기체의 모든 유전자는 집합에서 나타난다. GRACE 균주는 관심 유기체의 모든 유전자에 대하여 발생한다. 다른 방법으로, 유기체의 유전자의 목적하는 하부 집합이 GRACE 방법에 의해 변형되는 유기체의 GRACE 균주의 집합은 더욱 작아질 수 있다.
유기체의 생존 능력 및/또는 정상적인 성장이 유전자의 발현과 실질적으로관련되거나 이에 좌우될 경우에 유전자가 필수적으로 고려되는 것이 일반적이다. 세포에 대한 필수 작용은 세포의 유전자형 및 세포의 환경에 대하여 부분적으로 의존한다. 다수의 유전자는 약간의 필수 작용, 예를 들어 에너지 대사, 세포 구조의 새합성, 유전자 물질의 복제 및 복구 등을 필요로 한다. 따라서, 유기체에서 수많은 유전자의 발현은 성장 및/또는 생존을 위해 필수적이다. 따라서, 정의된 조건의 세트하에 GRACE 균주의 생존 능력 또는 정상적인 성장이 변형된 대립유전자 쌍의 잔존하는 작용성 대립유전자의 조건 발현과 관련되거나 이에 의존할 경우, GRACE 방법에 의해 상기 균주에서 변형된 유전자는 유기체의 "필수 유전자"로서 언급된다.
유기체의 병인성이 유전자의 발현에 부분 이상으로 연관된 유기체의 병독성/병인성에 유전자가 기여하는 것으로 간주되는 것이 일반적이다. 유기체의 수많은 유전자가 유기체의 병독성 및/또는 병인성에 기여하는 것으로 예상된다. 따라서, 정의된 숙주 또는 숙주로부터 유래한 세포의 정의된 세트에 대한 GRACE 균주의 병독성 및/또는 병인성이 변형된 대립유전자 쌍의 잔류하는 작용성 대립유전자의 조건 발현과 관련되므로, GRACE 방법에 의해 상기 균주에서 변형된 유전자는 유기체의 "병독성 유전자"로서 언급된다.
본 발명은 병인성 유기체의 필수 유전자를 동정하고 약물 발견 프로그램에서 그의 유용성을 타당성 검사하는데 편리하고 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 병인성 유기체의 병독성 유전자를 동정하는데 유사하게 사용될 수 있다. GRACE 방법에 의해 동정된 유기체의 이러한 필수 유전자 및 병독성 유전자의 동정은 본 발명에 포함된다. 유기체의 실질적으로 모든 필수 유전자 및 병독성 유전자는 본 발명의 GRACE 방법에 의해 동정되고 타당성 검사할 수 있다.
이렇게 동정된 각각의 필수 유전자 및 병독성 유전자는 유기체에 대하여 잠재적인 약물 표적을 나타내고 약물 선별의 다양한 방법에서 개별적으로 사용되거나 집합으로 사용될 수 있다. 약물 선별 프로그램 및 표적 질환의 목적에 따라서, 본 발명의 필수 유전자 및 병독성 유전자는 유전자 산물의 구조적인 특징, 작용 특성 및 발현 프로파일(profile)에 기초한 하부 집합으로 분류되고 나누어진다. 각각의 하부 집합내의 필수 유전자 및 병독성 유전자에 의해 암호화된 유전자 산물은 유사한 생물학적 활성, 유사한 세포내 정위, 구조적인 상동성 및/또는 서열 상동성을 공유할 수 있다. 또한, 하부 집합은 유사하거나 생물 분류학 군, 예를 들어 사카로마이세스 세페비지애의 다른 유기체, 또는 인간 유전자와 서열 상동성 또는 유사성에 기초하거나, 또는 사카로마이세스 세레비시아에와 같은 유기체 또는 인간의 유전자와 서열 유사성 또는 상동성의 완전한 결여에 기초하여 생성될 수 있다. 또한, 하부 집합은 변형된 유전자를 갖는 유기체에 의해 살균성 말단 표현형 또는 정적 말단 표현형의 표시에 기초하여 생성될 수 있다. 약물 선별 프로그램에서 군으로서 편리하게 조사될 수 있고 필수 유전자 세트 또는 병독성 유전자 세트로 언급되는 상기 하부 집합은 본 발명에 의해 제공된다. 따라서, 본 발명은 세포의 성장 및/또는 생존에 각각 필수적인 상이한 유전자의 변형된 대립유전자를 각각 포함하는 GRACE 균주의 집합과 같은 다수의 돌연변이 유기체를 제공한다.
특정 양태로, 병인성 진균류의 게놈에서 실질적으로 모든 필수 유전자는GRACE 방법에 의해 동정되고, 필수 유전자의 변형된 대립유전자 쌍을 포함하는 GRACE 균주는 GRACE 균주의 집합에 포함된다. 다른 특정 양태로, 병인성 진균류의 게놈에서 실질적으로 모든 병독성 유전자는 GRACE 방법에 의해 동정되고, 병독성 유전자의 변형된 대립유전자 쌍을 포함하는 GRACE 균주는 GRACE 균주의 집합에 포함된다.
칸디다 알비칸스에 있어서, 완전한 게놈에 대한 GRACE 균주 집합은 칸디다 알비칸스 게놈 서열의 분석에 기초하여 유전자의 약 7,000개의 변형된 대립유전자 쌍을 포함할 수 있다. 칸디다 알비칸스의 필수 유전자에 대한 완전한 세트는 약 1,000개의 유전자를 포함하는 것으로 추정된다. 본 발명은 칸디디 알비칸스에서 상기 유전자의 일부의 동정, 이러한 유전자의 다양한 용도 및 약물 표적으로서 그의 산물을 제공한다. 또한, 이러한 병원균의 병독성에 관여하는 유전자의 수에 대한 추정치는 100 내지 400개의 유전자 범위이다. 필수 유전자의 동정이 공지되어 있을 경우, GRACE 방법에 비해서 다른 방법에 의해 생산된 하나 이상의 돌연변이 필수 유전자의 복사본을 포함하는 다양한 유형의 돌연변이체가 본 발명에 의해 예상되고 포함된다.
또한, 본 발명은 생물학적 및 컴퓨터 방법, 및 칸디다 알비칸스의 동정된 필수 유전자 및 병독성 유전자에 대하여 상동인 유전자의 단리 및 동정을 허용하는 시약을 제공한다. 2배체 유기체의 GRACE 균주로부터 수득된 정보는 반수체 유기체에서 상동 서열을 동정하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 상동 유전자의 동정 및 용도는 본 발명에 의해 포함된다.
명쾌하게 논의하자면, 본 발명은 병인성 진균류에 대한 예, 칸디다 알비칸스로서 하기 소단락에 기재된다. 그러나, 원리는 다른 병원균, 기생충, 식물 및 인간을 포함한 동물의 필수 및 병독성 유전자에 유사하게 적용될 수 있다. GRACE 방법은 생활 주기에서 2배체 상태를 갖는 임의의 병인성 유기체에 적용될 수 있다. 따라서, 2배체 병인성 유기체란 용어는 2배체 형태로 독점적으로 존재하는 유기체에 제한되지 않고, 또한 생활 주기에서 반수체 및 2배체 상태를 모두 갖는 유기체를 포함한다.
예를 들어, 약물 표적 동정 및 타당성 검사는 기타 병인성 진균류에 직접 적용될 수 있다. 데우테로마이세터스(Deuteromycetous) 진균류, 즉 성주기 및 고전적인 유전자가 결여된 진균류(칸디다 알비칸스가 포함됨)는 대다수의 인간 진균성 병원균을 나타낸다. 아스페르길루스 푸미가투스는, 엄밀히 말하자면, 아스코마이코타(Ascomycota) 및 바시디오마이코타(Basidiomycota)의 일원들을 포함하는 또 다른 의학적으로 중요한 문(phylum)의 일원이다. 아스페르길루스 푸미가투스 자낭균은 면역 손상 환자에서 호흡기 감염 또는 침입성 아스페르질루스증(IA; invasive aspergillosis)의 원인이 되는 우세한 풍매성(air borne) 감염 진균제이다. 20년전에는 비교적 알려져 있지 않았지만, 오늘날 IA 경우의 수는 매년 수천 건으로 추정된다. 또한, IA는 50%를 넘는 사망률을 나타내고, 암포테리신 B 및 플루코나졸 모두 큰 효과가 없다. 이러한 문제들을 종합해보면, 신규 약물 표적의 동정이 상기 유기체에서 현 상태의 표적 타당성 검사에 의해 제한된다는 것이다.
칸디다 알비칸스에 대하여 입증된 GRACE 방법은 다음 이유 때문에 아스페르길루스 푸미가투스에 사용하기 위해 용이하게 변경된다. 아스페르길루스 푸미가투스가 반수체 게놈을 갖고 있지만, GRACE 방법은 야생형 프로모터의 1 단계-조건적인 프로모터 대체에 단순화될 수 있다. 아스페르길루스 푸미가투스는 칸디다 알비칸스와는 대조적으로 보편적인 유전자 암호에 부착하기 때문에, 칸디다 알비칸스에 대한 GRACE 방법을 설계하는데 필요한 것과 같은 광범위한 부위-유도된 돌연변이는 필요하지 않다. 또한, 상동 재조합을 통해 형질전환 및 유전자 분열과 같은 필수 분자 생물학 기술이 아스페르길루스 푸미가투스용으로 개발되었다. 선택성 표지는 아스페르길루스 푸미가투스에서 상기 기술에 이용되고 하이그로마이신 B 및 플레오마이신에 대한 항생물질 저항성 균주는 유전자 및 영양 요구성 표지,ura3을 포함한다. 또한, 공개 및 비공개 아스페르길루스 푸미가투스 게놈 서열화 프로젝트가 존재한다. 따라서, 서열 정보는 추정 필수 유전자의 동정은 물론 GRACE 방법을 사용한 약물 표적의 실험적 타당성 검사에 모두 유용하다. GRACE 방법을 적용할 수 있는 추가의 병인성 데우테로마이세터스 진균류로는 아스페르길루스 (Aspergillus flavus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 및 콕시디오데스 이미티스(Coccidioides immitis)가 포함된다.
본 발명의 다른 양태로, 약물 표적 동정 및 타당성 검사에 대한 GRACE 방법은 담자균성 병인성 진균류에 적용된다. 하나의 구체적인 약학적으로 중요한 문의 일원으로는 크립토코쿠스 네오포르만스가 있다. 이러한 풍매성 병원균은 AIDS 환자에서 생명-위협성 감염의 4번째(7 내지 8%)로 가장 널리 알려진 원인을 나타낸다. 형질도입 및 유전자 분열 계획은 크립토코쿠스 네오로프만스에 대하여 존재하고, 이러한 유기체에 대한 공적 자금의 게놈 서열화 프로젝트는 적절하다. 크립토코쿠스 네오로프만스는 성주기를 가지므로 반수체 및 2배체 균주에 적용되는 GRACE 방법을 적용할 수 있다. 다른 의학적으로 중요한 담자균으로는 트리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii) 및 시조필럼 코무네(Schizophylum commune)가 포함된다.
동일 방법으로, 의학적으로 관련된 진균성 병원균은 GRACE 방법을 사용한 합리적인 약물 표적 발견을 위해 적합하므로, 수많은 식물 진균성 병원균 및 동물 병원균이 농업 및 수의학 목적을 위해 신규한 약물 표적을 화인하기 위해 검사될 수 있다. 과일, 견과, 야채, 쌀, 대두, 귀리, 보리 및 밀을 포함하는 수많은 농작물의 품질 및 수율은 식물 진균성 병원균에 의해 상당히 감소된다. 그 예로는 줄무늬 병(셉토리아 트리티시(Septoria triticii)), 이삭 반점(셉투리아 노도룸(Septoria nodorum)), 다양한 밀 녹병균(푸시니아 레콘디타(Puccinia recondita), 푸시니아 그라미니스(Puccinia graminis)); 흰가루 병(각종 균종); 및 대/줄기 부패(푸사리움 종(Fusarium spp.))를 일으키는 밀 진균성 병원균이 포함된다. 다른 분열성 식물 병원균의 구체적인 예로는 아일랜드 감자 부족의 원인제인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 네덜란드 느릅나무 질환의 원인인 자낭균성 진균류, 옥수수 깜부기병의 원인 병원균인 오필로스토마 울미(Ophiostoma ulmi), 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis) 및 쌀-동고병의 원인 병원균인 마그나푸르틀라 그리세아(Magnapurtla grisea)가 포함된다. 진균 살균제 저항성 식물 병원균의 신흥 출현 및 단일 재배 실시에 대한 신뢰 증가는 신규하고 개선된 진균 살균제 화합물에 대한 요구가 증가함을 명백히 의미한다. 따라서, 본 발명은 병원균, 및 식물 및 가축의 기생충에서 약물 표적을 동정하고 타당성 검사하는 GRACE 방법의 적용을 포함한다. 하기 표 I은 의학적으로, 농업적으로 또는 상업적으로 가치 있는 반수체 및 2배체 진균류의 예시적인 군을 제시한다:
칸디다 글라브라타(Candida glabrata)를 제외한 모든 칸디다 종은 생활 주기에서 반수체 상태가 결여된 편성 2배체 종이므로 GRACE 방법의 적용을 따른다.
5.2 GRACE 균주의 구성
본 발명에 따라, 2배체 유기체의 GRACE 균주에 있어서, 유전자의 하나의 대립유전자만이 제거되는 동안, 제 2 대립유전자는 활성이 조절가능한 이형 프로모터(promoter)의 제어하에 배열된다. 상기 유전자를 필수적이므로, 양쪽 대립유전자의 제거는 성장에 치명적이거나 심각하게 타격을 줄 것이다. 그러므로, 본 발명에 있어서, 이형 프로모터는 제 2 대립유전자의 발현 수준의 범위를 제공하기 위해 사용된다. 조건에 따라서, 제 2 대립유전자는 대립유전자가 원시 프로모터에 결합된 것과 비교하여 발현되지 않거나, 불충분하게 발현되거나, 과도하게 발현되거나, 또는 정상적인 수준으로 발현될 수 있다. 이형 프로모터는 동일 병인성 유기체로부터 다른 유전자 유래의 프로모터이거나, 또는 다른 종 유래의 프로모터일 수 있다.
표적 유전자의 정확한 대체는 관심 균주에서 발현할 수 있는 선택성 표지, 바람직하게는 우성의 선택성 표지를 포함하는 유전자 분열 카세트를 사용함으로써 촉진된다. 2개의 다른 우성의 선택성 표지의 가용성은 기존 방법의 고유한 대응 선택 단계를 필요로 하지 않고 표적 유전자의 양쪽 대립유전자에서 설계되는 유전자 대체법을 허용한다.
구체적으로, 본 발명은 유전자의 양쪽 대립유전자를 변형한 2배체 병인성 진균성 세포의 균주를 구성하기 위한 방법을 포함하며, 이러한 방법은 (a) 2배체 병인성 진균성 세포에서 발현할 수 있는 선택성 표지를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 분열 카세트를 사용하여 재조합하여 상기 세포에서 유전자의 제 1 대립유전자를 변형함으로써, 유전자의 제 1 대립유전자를 불활성화하는 이형접합 병인성 진균성 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 이형 프로모터를 포함하는 프로모터 대체 단편으로 재조합하여 이형 접합 2배체 병인성 진균성 세포에서의 제 2 대립유전자를 변형함으로써, 유전자의 제 2 대립유전자의 발현을 이형 프로모터에 의해 조절하는 단계를 포함한다.
각각의 균주가 다른 유전자의 변형된 대립유전자 쌍을 포함하는 GRACE 균주의 집합을 생산하도록 목적하는 유전자의 하위 집합에 대해 상기 방법을 반복할 수 있다. 병인성 진균류의 모든 유전자에 대하여 상기 방법을 반복함으로써, 병인성 진균류의 완전한 게놈을 나타내는 GRACE 균주의 완전한 세트를 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 유전자의 변형된 대립유전자를 각각 포함하는 2배체 병인성 진균성 세포의 집합을 정리하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다른 유전자의 대립유전자 쌍을 각각 반복적으로 변형함으로써 다른 유전자의 변형된 대립유전자를 각각 포함하는 2배체 병인성 진균성 세포의 집합을 제공하는, 대립유전자 쌍을 변형하는 단계를 여러 번 반복함을 포함한다.
GRACE 균주의 구성에 대한 바람직한 양태는 하기 2 단계 방법을 사용한다. 칸디다 알비칸스는 예로서 사용된다.
5.2.1 유전자 분열에 의한 이형접합체 구성
이형접합체 돌연변이체를 제조하기 위해서 몇가지 당해 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 덜 바람직한 실시양태에서, 경우에 따라,CaURA3, CaHIS3, CaLEU2또는CaTRP1을 포함하나 이에 제한되지 않는 영양요구성 표지를 유전자 분열에 사용할 수 있다. 그러나, 2배체 진균류에서 이형접합체를 구성하는 바람직한 방법은 유전자변형된 우성 선별 표지를 사용하는 것이다. 칸디다 알비칸스는 200㎍/㎖의 농도에서 뉴클레오시드형 항생물질인 스트렙토트리신에 민감하다. 칸디다 알비칸스내에 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)SAT1유전자가 존재하면 스트렙토트리신을 아세틸화시켜 무독성으로 만들어 200㎍/㎖의 농도의 스트렙토트리신의 존재하에서도 균주가 생육할 수 있게 한다. 칸디다 알비칸스에서SAT1유전자를 발현시키는 것은 이 유전자를 조작하여 그의 DNA 서열이 상기 유기체의 유전자 암호에 순응하도록 변화시키고CaACT1프로모터(모르쉬하우저(Morschhauser) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet.,257:412-420, 1998] 참조) 및CaPCK1종결유전자 서열(류커(Leuker) 등의 문헌[Gene,192:235-40, 1997] 참조)을 제공함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 유전자변형된 표지는CaSAT1으로 지칭되며, 이는 2001년 2월 16일자로 출원된 동시계속중인 미국 비가출원의 주제이다.
칸디다 알비칸스는 또한 제 2 살진균성 화합물인 블라스티시딘에 민감하며, 그의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 유래한 동류 저항성 유전자(BSR)는 칸디다 알비칸스에서 발현되도록 유사하게 유전공학적으로 조작되었고(CaBSR1), 우성 약물 저항성 표현형을 부여하는 것으로 알려져 있다. 분열될 칸디다 알비칸스 유전자의 5' 및 3' 서열과 동일한 약 65pb의 측위 서열을 포함하도록 우성 선별성 표지를 PCR로 증폭시킴으로써, 특정 칸디다 알비칸스 유전자에 대한 유전자 분열 카세트를 구성할 수 있다.
보이딘(Baudin) 등의 문헌[Nucleic Acids Research,21:3329-30, 1993]의 방법을 사용하여, 칸디다 알비칸스 균주를 PCR-증폭된 유전자 분열 카세트로 형질전환시키고, 야생형 유전자가 우성 선별성 표지로 정확하게 대체된 약물 저항성 형질전환체에 대해 선별함으로써 유전자 분열 사건을 수행할 수 있다. 이러한 돌연변이 균주는 스트렙토트리신을 포함하지만 이에 제한되지 않는 약물의 존재하에 생육시킴으로서 선별될 수 있다. 생성된 유전자 분열물은 일반적으로 하나의 동종 염색체상의 대립유전자 쌍의 한 복사본은 분열되고, 다른 하나의 동종 염색체상의 다른 하나의 대립유전자는 초기 모 균주에서 발견되는 바와 같이 야생형 대립유전자로서 남아있는 2배체 칸디다 알비칸스의 이형접합체이다. 분열된 대립유전자는 작용성이 없으며, 이 대립유전자는 발현되지 않는다. 유기체의 게놈내 모든 유전자들에 대해 이러한 방법을 반복함으로써, 유기체내의 모든 유전자에 대해서 한 세트(set)의 유전자 분열물이 수득될 수 있다. 이러한 방법은 또한 원하는 유전자들의 서브세트(subset)에도 적용될 수 있다.
5.2.2 테트라사이클린-조절성 프로모터에 의한 조건적 발현
본 발명의 이 실시양태에서 사용된 조건적 발현 시스템은 조절성 프로모터와 프로모터 활성을 조절하는 수단을 포함한다. 섹션 5.1.1에 개시된 바와 같이 구성된 이형접합체에서 남아있는 야생형 대립유전자를 조건적 발현시키는 것은 그의 프로모터를 사카로마이세스 세레비지에에서 처음 발견되고 칸디다 알비칸스에서 사용하기 위해 변형된 테트라사이클린-조절성 프로모터 시스템으로 대체시킴으로써 달성된다. 개리(Gari) 등의 문헌[Yeast,13:837-848, 1997] 및 나가하시(Nagahashi) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet,255:372-375, 1997]을 참조한다.
간략하게, 조건적 발현은 먼저 사카로마이세스 세레비지에GAL4(아미노산 785-881) 또는HAP4(아미노산 424-554)의 전사 활성화 도메인에 융합된 이 콜라이(E. coli)TetR테트라사이클린 억제 유전자 도메인 또는 DNA 결합 도메인(아미노산 1-207)을 포함하는 전사활성화(transactivation) 융합 단백질을 구성함으로써 이루어진다. 다중 CTG 코돈 교정체는 칸디다 알비칸스의 유전자 암호와 일치시키기 위해 도입되었다. 이 콜라이TetR(아미노산 1-207) + 사카로마이세스 세레비시아에GAL4(아미노산 785-881)의 전사활성화 융합 단백질, 및 이 콜라이TetR(아미노산 1-207) + 사카로마이세스 세레비시아에HAP4(아미노산 424-554)의 전사활성화 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이들 두 서열은 칸디다 알비칸스에서 발현되기 위해 적절하게 변형되었다)이 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명은 세포에서 발현가능한, DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 포함하는 전사활성화 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는 일배체 또는 2배체 세포를 제공한다.
칸디다 알비칸스에서 전사활성화 융합 단백질의 항구적 발현은CaACT1프로모터와CaACT1종결유전자 서열을 제공함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 칸디다 알비칸스에서 작용성인 임의의 조절 영역, 프로모터 및 종결유전자를 사용하여 융합 단백질을 발현시킬 수 있음은 이해될 것이다. 따라서, 칸디다 알비칸스에서 작용성인 프로모터, 전사활성화 융합 단백질의 암호화 영역 및 칸디다 알비칸스에서작용성인 종결유전자를 포함하는 핵산 분자가 본 발명에 포함된다. 이러한 핵산 분자는 플라스미드, 코스미드, 트랜스포손 또는 이동성 유전자 요소일 수 있다. 바람직한 실시양태에서,TetR-Gal4또는TetR-Hap4전사활성화 유전자는ura3및his3영양요구성 표지를 사용함으로서 칸디다 알비칸스 균에 안정하게 삽입될 수 있다.
이러한 실시양태에서, 본 발명은 이형 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 치환 단편을 추가로 제공하며, 이때 이형 프로모터는 전사활성화 융합 단백질의 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 복사본을 포함하고, 전사활성화 융합 단백질이 결합함으로써 그의 전사가 증가된다. 초기에 사카로마이세스 세레비시아에의 유전자 발현을 위해 개발된 이형 테트라사이클린 프로모터는ADH13' 종결유전자 서열, 다양한 수의 테트라사이클린 작동 유전자 서열의 복사본(2, 4 또는 7개의 복사본), 및CYC1기본 프로모터를 함유한다. 테트라사이클린 프로모터는 원하는 유전자의 개방 판독틀로부터 바로 위 업스트림(upstream)에 위치하는 경우, 테트라사이클린 프로모터-의존성 조절에 바람직한 배향으로CaHIS3및CaSAT1선별성 표지 둘다에 인접하게 서브클로닝되어 있다.CaHIS3-Tet프로모터 카세트를 PCR 증폭시키면, 목표 유전자의 뉴클레오타이드 위치 -200 및 -1(출발 코돈에 대해) 주위에서 프로모터 서열에 동종인 65pb의 측위 서열이 포함되며, 이에 따라 형질전환용 조건적 프로모터 치환 단편이 생산된다. 섹션 5.1.1에서 기술된 바와 같이CaSAT1분열 카세트를 사용하여 칸디다 알비칸스 균주에서 제조된 이형접합체를 형질전환시키는 경우, 프로모터 치환 단편과 야생형 대립유전자의 프로모터 사이의 동종 재조합이 일어나 남아있는 야생형 유전자가 테트라사이클린 프로모터에 의해서 조건적으로 조절되는 유전자로 되는 균주가 생성된다. 형질전환체는 His 원영양체로서 선별되며 서던 블롯(Southern blot) 및 PCR 분석에 의해 확인된다.
이러한 특정 실시양태에서, 프로모터는 테트라사이클린의 부재하에 유도되며 테트라사이클린의 존재하에 억제된다. 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메클로사이클린, 메토사이클린, 미노사이클린 하이드로클로라이드, 언하이드로테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 테트라사이클린의 유사체도 또한 GRACE 균주에서 변형된 대립유전자의 발현을 억제시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 돌연변이된 테트라사이클린 억제 유전자(tetR) 분자(tetR'로 명명됨)에 기초하여 테트라사이클린 프로모터 시스템의 선택적인 변형 시스템을 포함하는데, 이 시스템은tetR'가 야생형tetR대신 사용되거나tetR과 함께 사용되는 경우, 발현을 촉진시키는 항생물질 이펙터(effector) 분자가 결합함으로써 활성화되고(즉, 그의 동류 작동 유전자 서열에 결합하고), 항생물질 이펙터의 부재하에 억제된다(즉, 작동 유전자 서열에 결합하지 않는다). 예를 들어, GRACE 방법은 테트라사이클린이 존재하지 않는 조건하에 억제되는 것이 바람직한 경우, 예를 들어 약물 전달에 관여하는 유전자(예:CaCDR1,CaPDR5또는CaMDR1)를 셧-오프(shut-off)시키는 경우,tetR대신tetR'를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 이중 활성화 유전자/억제 유전자 시스템에tetR및tetR'를 둘다 포함시켜tetR이 활성화 유전자 도메인에 융합되고tetR'가 일반적인 억제 유전자(예:CaSsr6또는CaTup1)에 융합되어 항생물질 이펙터 분자의 존재하에 발현이 증가되거나 또는 억제되도록 GRACE 방법을 변형시킬 수 있다(본원에 참고로 인용된 벨리(Belli) 등의 문헌[Nucl. Acid Res.,26:942-947, 1998] 참조). 조건적 발현을 제공하는 이러한 방법도 또한 고려된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 유전자의 발현이 이형 프로모터에 의해 조건적으로 조절되도록 대립유전자의 재조합을 통해 단일 대립유전자를 이형 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 치환 단편으로 변형시킴으로써 일배체 병인성 진균류에 적용할 수 있다. 일배체 병인성 유기체 또는 그의 전체 게놈에서 바람직한 유전자의 서브세트에 대해 이러한 방법을 반복함으로써, 조건적 돌연변이 균주의 집합체 또는 완전한 세트를 수득할 수 있다. 바람직한 유전자의 서브세트는 기타 유기체, 예를 들어 칸디다 알비칸스 및 사카로마이세스 세레비시아에의 목표 유전자와 상당한 뉴클레오타이드 서열 상동성을 공유하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 이러한 변형된 방법은 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 플라비스(Aspergillus flavis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오이데스 임미티스, 엑소팔리아 더마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysprum), 히스토플라스마 캡술라툼, 뉴모시스티스 카리니(Phneumocystis carinii), 트리코스포론 베이젤리, 리조푸스 아리주스, 무코르 룩시, 리조무코르 푸실러스 또는 앱시디아 코림비게라(Absidia corymbigera)와 같은 동물성 진균류 병원체, 또는 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis), 마그나포르테 그리세아, 푸치니아 레코디타(Puccinia recodita), 셉토리아 트리티시, 틸레티아 콘트로버사 또는 우스틸라고 매이디스와 같은 식물성 진균류 병원체, 또는 상기 종들중 임의의 종들의 속에 속하는 종들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 일배체 진균류 병원체에 적용될 수 있다.
조건적 발현을 수행하는 수단은 테트라사이클린 프로모터 시스템으로 제한되지 않으며, 기타 조건적 프로모터를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 조건적 프로모터는, 예를 들어 특정 조건하에서 프로모터로부터 전사를 억제하는 억제 유전자에 의해 또는 유도유전자가 존재하는 경우와 같이 프로모터로부터 전사를 증가시키는 전사활성화 유전자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 칸디다 알비칸스CaPCK1프로모터는 글루코스의 존재하에 전사되지 않지만, 숙시네이트와 같은 다른 탄소원상에서 생육된 세포에서는 높은 수준으로 발현되며, 따라서 GRACE 균주에서 변형된 대립유전자의 조건적 발현에 대해 채택될 수도 있다. 이러한 목적으로,CaHIS1및CaSAT1은 둘다 상기 설명에서 테트라사이클린 프로모터 대신CaPCK1프로모터를 사용하여 글루코스-함유 배지상에서 생육시키는데 필수적인 것으로 밝혀졌다. 이 경우,CaPCK1프로모터는 발현된 유전자에는 이형이나 유기체에는 이형이 아니며, 이러한 이형 프로모터는 또한 본 발명에 포함된다. 테트라사이클린 프로모터를 작용적으로 대체할 수 있는 또다른 프로모터는MET25, MAL2, PHO5, GAL1, GAL10, STE2또는STE3과 같은 칸디다 알비칸스 조건적-조절된 프로모터 뿐만 아니라 다른 항생물질계 조절성 프로모터 시스템(예: 프리스티나마이신-유도된 프로모터 또는 PIP)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
GRACE 방법의 바람직한 실시양태에서, 먼저 유전자 분열을 수행함으로써 이형접합 균주를 구성할 수 있으며, 약물 목표 확인 공정 동안 이형접합 균주의 집합체로서 별도로 수거할 수 있다. 이러한 칸디다 알비칸스 이형접합 균주를 집합체로서 수거함으로써 확인된 목표물에 대한 일배체불충분성(haploinsufficiency)에 기초하여 집합체내에서 약물 선별 방법을 수행할 수 있다. "일배체불충분성"이란 용어는 특정 유전자에 대해 이형접합 균주가 특정한 유전자 산물의 정상적인 2배체 수준의 대략 반을 발현시키는 현상을 지칭한다. 결과적으로, 이들 균주는 절반 수준의 암호화된 유전자 산물을 갖는 구성물을 제공하며, 이들은 항진균성 화합물을 탐색하는데 직접적으로 사용될 수 있다. 이형접합 유도체와 비교할 때, 본원에서 2배체 모 균주의 차별적 민감성은 약물이 암호화된 유전자 산물에 대해 활성임을 지시할 것이다.
본 발명의 이러한 실시양태에서 수행된 대립유전자 변형의 순서는 중요하지 않으며, 조건적-발현되는 대립유전자가 먼저 구성되고 남아있는 야생형 대립유전자가 이어서 분열되도록 상기 단계들을 다른 순서로 수행할 수 있음을 당해 분야의 숙련자라면 명백히 이해할 것이다 . 그러나, 프로모터 치환 단계가 먼저 수행되는 경우, 유전자 분열 단계에서 사용된 서열에 동종인 서열은 제거하여야 함에 주의하여야 한다.
목표 유전자CaKRE9의 변형된 대립유전자를 구성하는데 사용된 바와 같이GRACE 방법의 특정한 적용예는 섹션 6에 제공된다.
5.2.3 조건적 발현의 대체 방법
본 발명의 다른 실시양태에서, 조건적 발현은 조건적 프로모터에 의존하는 대신 다른 수단에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 조건적 발현은 이형접합 균주의 야생형 대립유전자를 시험관내에서 유래된 온도 민감성 대립유전자로 대체한 후, 이들의 표현형을 비허용적인 온도에서 분석함으로써 이루어질 수 있다. 관련된 방법에서, 남아있는 야생형 대립유전자에 편재화 신호를 삽입시켜 활성화 조건 동안 유전자 산물을 불안정화시킴으로써 유전자 불활성화에 의한 표현형 효과를 검사할 수 있다. 총체적으로, 이들 예는 칸디다 알비칸스 유전자가 GRACE 방법을 사용하여 분열되고 조건적으로 조절될 수 있는 방식을 나타낸다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 제거가능한 전사활성화 유전자에 의해 조절되는 항구적 프로모터를 사용할 수 있다. 이 프로모터는 목표 유전자의 업스트림에 위치하여 발현을 프로모터의 특징적인 기본 발현 수준으로 억제시킨다. 예를 들어, 진균류 세포에서,lexA작동 유전자 요소를 함유하는 이형접합 프로모터를lexADNA 결합 도메인 및 임의의 전사 활성화 유전자 도메인(예:GAL4, HAP4, VP16)으로 구성된 융합 단백질과 함께 사용하여 목표 유전자의 항구적 발현을 제공할 수 있다. 5-FOA에 의해 매개되는 역선별 방법을 사용하여 융합 단백질을 암호화하는 유전자가 제거된 세포들을 선별할 수 있다. 이러한 절차에 의해 작용적 전사 활성화 유전자의 부재하에 목표 유전자를lexA이형 프로모터에 의해 제공된 기본 수준의 발현으로 발현되도록 억제시키는 것과 관련하여 표현형을 조사할 수 있다. 이러한 방법에 의해 제조된 GRACE 균주를 하기 섹션들에서 자세히 기술한 바와 같은 약물 목표 확인 방법에 대해 사용할 수 있다. 이 시스템에서, 이형 프로모터와 관련된 낮은 기본 발현 수준이 중요하다. 따라서, 프로모터의 기본 수준의 발현은 이러한 대체적인 셧-오프 시스템을 목표 확인 방법에 더욱 유용하게 만들도록 낮은 것이 바람직하다.
또 다르게는, 목표 유전자의 조건적 발현은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 유전자 도메인을 함유하는 전사활성화 유전자를 사용하지 않고도 수행될 수 있다. 목표 유전자의 5' 부분에 동종 서열을 함유하는 동향 반복서열이 양옆에 존재하는, 예를 들어 URA3 선별성 표지의 다운스트림(downstream)에 위치하는 이형 항구적 프로모터를 함유하도록 카세트를 조합할 수 있다. 목표 유전자의 업스트림에 위치하는 또다른 동종 서열은 상기 카세트에 삽입되는 경우, 자생 프로모터와, 목표 유전자의 출발 코돈 또는 개방 판독특의 바로 위 업스트림에 존재하는 상기 이형 프로모터 카세트와의 동종 재조합 및 치환을 촉진시킬 것이다. 조건적 발현은 5-FOA 함유 배지를 사용하여 이형 항구적 프로모터 및 URA3 표지가 제거된(따라서 유전자 발현에 필요한 목표 유전자의 업스트림에 위치하는 조절 서열이 존재하지 않는) 균주를 선별하고, 생성된 균주의 생육을 동일한 조건하의 야생형 균주의 생육과 비교하여 조사함으로써 달성된다.
5.3 필수 유전자 및 독성 유전자의 확인
5.3.1 필수 유전자
본 발명은 GRACE 균주에서 변형된 유전자가 목적하는 병인성 유기체에서 필수 유전자인지 또는 독성 유전자인지를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 유전자가 유기체에서 필수 유전자인지를 결정하기 위해서, 변형된 대립유전자를 함유하는 GRACE 균주를 조건적 발현하에 잇는 제 2 변형된 대립유전자가 실질적으로 낮게 발현되거나 발현되지 않는 조건하에서 배양한다. GRACE 균주의 생존성 및/또는 생육을 동일 조건하에 배양된 야생형 균주와 비교한다. 생존성 또는 생육의 손실 또는 감소는 유전자가 병인성 진균류의 생존에 필수적임을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 다수의 GRACE 균주를 각각의 GRACE 균주에서 변형된 각각의 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 낮게 발현되거나 발현되지 않는 배양 조건하에서 배양하는 단계; 세포의 생존성 및/또는 생육 지시자(들)를 측정하는 단계; 및 야생형 세포의 생존성 및/또는 생육 지시자(들)와 비교하는 단계를 포함하는, 2배체 병인성 유기체에서 필수 유전자를 확인하는 방법을 제공한다. 제 2 대립유전자의 발현 수준은 비변형된 대립유전자의 50% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 및 바람직하게는 10% 미만일 수 있다. 사용된 이형 프로모터에 따라, 발현 수준은 예를 들어 항생물질, 금속 이온, 특정 화학물질, 영양소, pH, 온도 등에 의해 제어될 수 있다.
칸디다 알비칸스는 본원에서 GRACE 방법에 의해 분석되는 한 예로서 사용된다.
예를 들어, GRACE 방법을 사용한 칸디다 알비칸스의 조건적 유전자 발현은CaKRE1, CaKRE5, CaKRE6 및 CaKRE9를 사용하여 수행하였다(도 3 참조).CaKRE5, CaKRE6및CaKRE9는 Ura 블래스터 방법을 사용하여 유전자 분열에 의해 입증된 바와 같이 칸디다 알비칸스에서 필수적이거나 조건적으로 필수적일 것으로예상된다(CaKRE9가 없는 균주는 글루코스에서는 생존할 수 없지만 갈락토스에서는 생존할 수 있다).CaKRE1은 칸디다 알비칸스에서 Ura 블래스터 방법을 사용하여 비필수 유전자로서 입증되었다. 상기 유전자에 대해 이형접합 균주는CaSAT1분열 카세트를 사용하여 PCR에 기초한 유전자 분열 방법을 수행한 후, 야생형 대립유전자의 자생 프로모터를 테트라사이클린 조절된 프로모터로 치환하여 구성되었다. 이들 각각의 균주가 잘 생육하는 것은 발현이 테트라사이클린의 부재하에 정상적으로 진행됨을 암시한다. 테트라사이클린이 생육 배지에 첨가되는 경우, 이러한 테트라사이클린 프로모터-조절된 유전자의 발현은 크게 감소되거나 전혀 발현되지 않는다. 테트라사이클린의 존재하에, 상기 3개의 칸디다 알비칸스 필수 유전자들중 각각 1개를 함유하는 GRACE 균주 세포는 생육을 멈춘다. 예상된 바와 같이, 단지CaKRE1GRACE 균주만이CaKRE1발현을 억제하지 않고도 잘 생육함이 확인되었다.
목표 확인 방법에서 GRACE 방법의 유용성을 추가로 검증하기 위해, 예상된 필수 유전자인CaSAT2및CaKRE1뿐만 아니라 공지된 필수 유전자인CaTUB1, CaALG7, CaAUR1및CaFKS1의 발현을 제어하는 4개의 추가의 GRACE 균주의 생육을 유도 조건 대 억제 조건하에서 비교하였다(도 4). 예상된 바와 같이,CaTUB1, CaALG7, CaAUR1및CaFKS1의 GRACE 균주는 비-필수CaKRE1GRACE 균주와는 달리 억제 조건하에서 생육하지 못하였다. 또한, 예견된 바와 같이,CaSAT2GRACE 균주는 칸디다 알비칸스에서 이 유전자의 필수성을 나타냈다. 칸디다 알비칸스에서 사용하기 위한 우성 선별성 표지로서 유전공학적으로 조작된CaSAT2유전자는 사카로마이세스 세레비시아에 유전자에 동종이지만 이 콜라이의Sat1유전자와는 관련성이없는 칸디다 알비칸스 유전자이다.
생성된 기타 분열 데이터에 기초한 모든 경우에서, 이는 테트라사이클린 조절된 유전자가 테트라사이클린의 존재하에 비작용성인 수준으로 억제되는 경우에 예상되는 반응이다. 또한, 조건적 유전자 분열의 GRACE 방법을 2개의 추가적인 칸디다 알비칸스 유전자(CaYPD1및CaYNL194c)(이들의 사카로마이세스 세레비시아에 대응유전자는 필수적이지 않은 것으로 공지되어 있다)에 적용하는 경우, 이들 균주는 테트라사이클린의 존재하에 배양될 때 어떠한 생육의 억제도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 GRACE 균주를 사용하는 조건적 유전자 발현 방법이 유전자 필수성을 나타내는 신뢰성있는 지시자임을 입증하는 것이다.
또한, 칸디다 알비칸스에서 필수 유전자의 완전한 세트를 확인하기 위한 신속하고 정확한 수단으로서의 본 발명의 유용성은 유전자 분열 및 조건적 발현의 GRACE 2단계 방법을 사용하여 다수의 유전자들의 무(null) 표현형을 분석함으로써 확인되었다. 목표 유전자는 진균류에 특이적이고 필수적인 것으로 선별되었다. 이러한 유전자는 하기 기술된 선별 분석에서 목표 필수 유전자로서 지칭된다.
문헌들을 찾아본 결과, 총 89개의 유전자에 대한 URA 블래스터-형 유전자 분열 실험들이 보고되어 있음이 확인되었는데, 이들중 13개의 유전자는 동종접합성 결실 균주를 구성할 수 없음에 근거하여 필수적인 것으로 예측되었다. 이들 13개 유전자는CaCCT8(라데마체르(Rademacher) 등의 문헌[Microbiology, UK,144, 2951-2960, 1998]);CaFKS1(미오(Mio) 등의 문헌[J. Bacteriol.,179, 4096-105, 1997] 및 더글라스(Douglas) 등의 문헌[Antimicrob Agents Chemother,41, 2471-9,1997]);CaHSP90(스우보다(Swoboda) 등의 문헌[Infect Immun.,63, 4506-14, 1995]);CaKRE6(미오 등의 문헌[J. Bacteriol.,179, 2363-72, 1997]);CaNMT1(바인베르크(Weinberg) 등의 문헌[Mol. Microbiol.,16, 241-50, 1995]);CaPRS1(페인(Payne) 등의 문헌[J. Med. Vet. Mycol.,35, 305-12, 1997]);CaPSA1(케어(Care) 등의 문헌[Mol. Microbiol.,34, 792-798, 1999]);CaRAD6(케어 등의 문헌[Mol. Microbiol.,34, 792-798, 1999]);CaSEC4(마오(Mao) 등의 문헌[J. Bacteriol.,181, 7235-7242, 1999]);CaSEC14(몬테올리바(Monteoliva) 등의 문헌[Yeast,12, 1097-105, 1996]);CaSNF1(페터(Petter) 등의 문헌[Infect Immunol.,65, 4909-17, 1997]),CaTOP2(켈러(Keller) 등의 문헌[Biochem J., 329-39, 1997]); 및CaEFT2(멘도자(Mendoza) 등의 문헌[Gene,229, 183-1991, 1999])이다. 이들 13개의 추정적 필수 유전자 및 칸디다 알비칸스의CaTUB1, CaALG1및CaAUR1은 초기에는 GRACE 방법에 의해 확인되지 않는다. 그러나 이들 17개의 유전자들중 어느 1개의 변형된 대립유전자를 함유하는 GRACE 균주 및 이들의 용도는 본 발명에 포함되며, 예를 들어CaTUB1, CaALG1및CaAUR1GRACE 균주는 도 4에 도시되어 있고,CaKRE6GRACE 균주는 도 3에 도시되어 있다. 이들 17개의 유전자들중 어느 1개를 본 발명의 방법에서 비교 대조군으로 또는 본 발명의 필수 유전자들의 집합체에서 필수성에 대한 양성 대조군으로 포함될 수 있다. 이들 17개의 유전자들중 어느 1개에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 약물 목표물로서 본 발명의 약물 개발 방법에 사용되거나, 또는 본 발명의 키트(kit) 또는 핵산 마이크로배열(microarray)에서 대조군으로서 개별적으로 또는 아군(subgroup)으로 포함될 수 있다.
종래 방법을 사용하는 것과는 반대로, GRACE 방법을 사용함으로써 전체 칸디다 알비칸스 연구 단체들의 총체적인 노력에 의해 이전에 밝혀진 것보다 상당히 더욱 많은 수의 칸디다 알비칸스 필수 유전자가 이미 확인되었다. 본원에서 제시된 데이터는 본 발명의 방법의 고유한 속도를 나타내는 것으로, 따라서 GRACE 방법을 캔디아 알비칸스 게놈의 모든 유전자를 조사하고, 이러한 2배체 진균류 병원체의 필수 유전자의 완전한 세트를 확인하고, 기타 종들에 적용하는데까지 확장하여 사용할 수 있음을 의미한다.
또다른 방법을 GRACE 균주에서 변형된 유전자의 필수성을 평가하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 따라, GRACE 균주내의 변형된 대립유전자의 발현을 전사활성화 단백질을 암호화하는 유전자를 동종 재조합-매개된 방법으로 제거함으로서 억제할 수 있다. 목표 유전자의 조건적 발현이 테트라사이클린-조절된 프로모터를 사용하여 달성되는 바람직한 실시양태에서, 항구적 발현(비억제 조건하에)은 전사활성화 유전자(TetR-GAL4AD)를 동종 재조합-매개된 방법으로 제거함을써 억제할 수 있다. 이러한 방식으로, 절대적으로 달성가능한 억제 수준은 전사활성화 단백질의 테트라사이클린-매개된 불활성화에 의해 생산된 수준과는 관계없이 생산된다. 전사활성화 유전자는 GRACE 균주 구성에 사용된 선별성 표지 및 삽입 전략에 의해 제거될 수 있다.TetR-GAL4AD전사활성화 유전자를 함유하는CaURA3-표지된 플라스미드를CaLEU2좌위로 안정하게 삽입시키면, 삽입된 플라스미드의 양옆에 위치하는CaLEU2가 탄뎀(tandem) 복제된다. 그다음 5-FOA 함유 배지상에서 역선별함으로써CaURA3-표지된 전사활성화 유전자의 제거에 대해 선별하고 이러한 선택적인 억제 전략이 목표 유전자가 필수적임을 입증하는지를 직접적으로 조사할 수 있다.
5-FOA 함유 배지상에서는 필수 유전자이지만 테트라사이클린 보충된 배지에서는 임의의 검출가능한 생육의 손실이 없는 유전자로서 정의되는 3개의 유전자 예는CaYCL052c, CaYNL194c및CaYJR046c유전자이다. 추정적으로, 이는 목표 유전자가 테트라사이클린을 첨가함으로써 불완전하게 불활성화된 그의 유전자 산물보다 전사활성화 유전자가 완전하게 제거된 조건하에서 더욱 낮은 수준으로 발현되기 때문이다. 따라서, GRACE 방법은 특정 유전자가 숙주 균주의 생존성에 필수적인지 필수적이지 않은지를 결정하는데 있어서 2가지 독립적인 방법을 제공한다.
5.3.2 독성/병인성 유전자
본 발명은 또한 독성/병인성 유전자를 확인하기 위해 2배체 병인성 유기체의 GRACE 균주를 사용하는 방법을 제공한다. GRACE 방법에 의해 병인성 유기체의 필수 유전자를 밝히는 것 이외에, 병인성 유기체에 의해 야기된 질환들을 치료하는데 유용한 약물을 선별하는데 적절할 수 있는 기타 유전자 및 유전자 산물을 확인할 수 있다. 따라서, 발병기전에서 필수불가결한 역할을 담당하는 병원체의 비필수 유전자 및 그의 유전자 산물은 예방적인 약물 개발을 위한 잠재적인 약물 목표물로서 기능할 수 있으며, 치료 전략을 향상시키기 위해 기존의 살생물적 치료제와 병용하여 사용할 수 있다. 따라서, 독성 및/또는 병인성과 관련된 유전자 및 그의 산물은 또다른 중요한 계열의 잠재적인 약물 목표물이다. 또한, 독성 및 병인성과 관련된 일부 유전자는 종-특이적일 수 있으며 특정 균주의 병원체에서 고유할 수있다. 칸디다 알비칸스 서열분석 프로젝트를 통해 확인된 유전자의 대략 6 내지 7%가 사카로마이세스 세레비시아에에 존재하지 않음이 밝혀졌다. 이는 발병기전 또는 독성 공정에 잠재적으로 참여하는 420개만큼 많은 수의 칸디다 알비칸스-특이적 유전자가 존재함을 나타낸다. 이러한 유전자 세트의 대규모 작용성 평가는 본 발명의 GRACE 방법을 사용하여서만 이루어질 수 있다.
필수 유전자가 바람직한 표적을 제공할지라도 동정된 비필수 C. 알비칸스 고유 유전자도 중요하다. 병인론에 있어서 비필수 C. 알비칸스 고유 유전자의 중요한 역할은 마우스 또는 기타 동물 모델을 사용한 독성 분석(예컨대 구강 상피세포 유착 분석 및 대식세포 분석) 및 각종 C. 알비칸스 감염 연구(예컨대 경구, 질, 전신)에 따라 평가 및 우선순위결정될 수 있다. 필수 유전자에 대하여 상기한 바와 동일한 방법으로, 세포 분석 또는 마우스 모델 시스템에 있어서 GRACE(GRACE) 균주군을 포함하는 비필수 유전자가 병인성에 필요한지 여부를 마찬가지로 결정할 수 있다. 따라서, 테트라사이클린(또는 대체 유전자 불활성화 수단)에 의한 유전자 불활성화 조건하에 마우스의 진균 감염을 유발하지 못하는 GRACE 균주는 GRACE 독성/병인성 유전자 아군을 한정한다. 더욱 한정된 병인성 유전자 아군, 예를 들면 병인론에 있어서 특정 단계(예컨대 유착 또는 침입)에 필요한 유전자는 상응하는 과정을 측정하는 시험관내 분석에 GRACE 병인성 균주 아군을 적용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 개별 유전자의 조건적 발현에 의해 구강 유착 또는 대식세포 분석으로 GRACE 병인성 균주를 검사하여 유착 또는 세포 침입에 필요한 병인성 인자를 각각 동정한다. 더욱이, 독성 및 성장속도가 실질적으로 감소된 필수 유전자는 부분적으로만 불활성화되었을 때 최소한의 억제율로 높은 특이성으로 화합물이 치료효과를 보이는 "다인성" 약물 표적을 나타낸다.
따라서, 숙주에서 병인성 유기체의 독성/병인성에 대해 유전자가 기여하는지의 여부를 결정하기 위해, 변형 대립유전자를 함유하는 병원체의 GRACE 균주를 조건적 발현하의 제 2 변형 대립유전자가 실질적으로 덜 발현되거나 발현되지 않는 조건하에 숙주 세포 또는 동물을 감염시키도록 한다. 숙주 세포 및/또는 동물을 적절한 시간동안 GRACE 균주와 접촉시킨 후 세포 및/또는 동물의 조건을 동일한 조건하의 야생형 균주로 감염된 세포 및/또는 동물과 비교한다. 감염된 세포의 다양한 형태학적, 생리학적 및/또는 생화학적 양태를 당업계에 공지된 방법으로 특정할 수 있다. 동물 모델을 사용한 경우, 질병의 진행정도, 증상의 경중도 및/또는 숙주의 생존여부를 결정할 수 있다. GRACE 균주에 의해 나타난 독성 또는 병인성의 손실 또는 감소는 균주에서 변형된 유전자가 바이러스의 독성 및/또는 병인성에 기여하거나 결정적임을 시사한다. 이러한 유전자는 하기하는 바와 같은 선별 분석에 있어서 표적 독성 유전자로서 지칭된다.
본 발명의 또하나의 양태에 있어서, GRACE 방법론은 병인성 발달에 필수적인 것으로 알려진 유전 경로의 확인 및 기술에 사용될 수 있다. 예를 들면, S. 세레비시아에에서의 연장된 작업에 의해, 효모와 균사 형태학 사이의 동종이형 전이에 중요한 역할을 하는 세포 유착, 신호 전달 및 세포골격 조립을 비롯한 다수의 과정이 밝혀졌다. C. 알비칸스, 에이. 푸미가투스 및 C. 네오포르만스와 같은 병인성 진균에서 기능적으로 상동성인 세포 경로에 참여하는 오르토로그 유전자의 결실에의해 동반적인 독성 손실이 명확하게 입증되었다. 따라서, C. 알비칸스 및 기타 병인성 진균에서 발견되는 GRACE 균주의 오르토로그 유전자를 사용하면 불활성화로 인해 균사 발달 및 병인성에 손상을 주는 강력한 항진균성 약물 표적 유전자를 신속하게 확인할 수 있었다.
5.3.3. 약물 표적 암호화 유전자의 확인
표적 유전자 확인은 유전자 산물의 기능 또는 구조의 조절제를 발견하기 위하여 선별 방법 또는 분석에 사용하기에 적합한 것으로 유전자 산물을 확인하는 방법을 지칭한다. 그러나, 약물 선별의 표적으로서 유전자 산물을 확인하는데 사용되는 표준은 화합물이 갖는 목적 작용 및 보호될 숙주에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 필수 유전자의 변형 대립유전자만을 갖는 것으로 동정 및 분류된 일군의 GRACE 균주는 약물 선별에 직접 사용될 수 있다.
또하나의 양태에 있어서, 초기 필수 유전자 군은 진균에 특이적인 유전자만을 포함하는 필수 유전자 아군, 즉 인간과 같은 병원체 숙주에서 상동성을 갖지 않는 필수 유전자 산물 암호화 유전자 아군을 동정하기 위하여 예를 들면 뉴클레오타이드 서열 비교를 사용하여 더욱 특성화된다. 인간인 진균 병원체내의 유전자 아군의 조절제, 바람직하게는 억제제는 인간 치료에 사용시 독성 부작용이 훨씬 덜 생길 것으로 예상된다.
유사하게, 보다 큰 필수 유전자의 기타 아군은 하나 이상의 숙주(예컨대 포유류) 종에 상동서열을 갖지 않아 가축병 치료에 사용될 것으로 예상되는 화합물을 검출할 수 있는 변형 대립유전자 쌍을 갖는 GRACE 균주만을 포함하는 것으로 한정될 수 있다. 또한, 기타 상동 표준을 사용하여 GRACE 균주 아군을 사용하여 보호 작물에 상동성을 갖지 않는 표적을 억제하는 농작물 병원체에 대해 활성인 항진균 화합물을 검출하여 동정할 수 있다.
현재의 C. 알비칸스 유전자 분열 기법은 비필수 유전자를 동정하고, 동형접합 부존재 돌연변이체를 생성하지 못하는 것에 근거하여 기타 유전자가 필수적이라는 추측을 허용한다. 약물 표적의 부존재 표현형은 이러한 표적에 "완전" 약물 작용을 하는 절대 효험을 예측한다. 예를 들면, 특정 약물 표적에 대한 사멸(세포 사멸) 대 정지(억제 성장) 부존재 말단 표현형 사이의 차. 플루코나졸의 약물 표적인 CaERG11의 유전자 분열은 URA 블래스터 방법을 사용하여 동형접합 CaERG11 결실 균주를 구축하지 못하는 것에 근거하여 필수적인 것으로 예측된다. 그러나, 사멸 또는 정지 부존재 표현형의 직접적인 평가는 병원체내에서 수행될 수 없었고, 플루코나졸을 발견한 이후에 비로소 약물 둘다를, 사멸보다는 정지 약물 표적인 것으로, 생화학적으로 결정할 수 있었다. 플루코나졸은 시장에서 성공적임에도 불구하고 그 진균 작용이 일차 제한, 즉 지연 처리후 약물 내성에 기여한다. 따라서, 본 발명에 의해 처음으로 병원체내의 확인된 약물 표적에 대해 사멸 부존재 표현형을 동정 및 평가하는 능력이 제공되어 특이적으로 진균 작용을 나타내는 항진균 약물을 직접적으로 동정하는 기술이 가능해졌다.
필수 유전자를 포함하는 단일 GRACE 균주 또는 목적 GRACE 균주군을 사용하여 하나 이상의 표적 유전자를 사멸 또는 정지 부존재 표현형을 나타내는 것으로 직접적으로 평가할 수 있다. 이는 액체 배지에서 시간 길이를 변화시키는 제 2 대립유전자의 조건적 발현을 위한 억제 조건하에 GRACE 균주를 먼저 배양한 후 억제를 완화시키는 성장 조건에 한정된 수의 세포를 도말하여 세포의 생존율을 측정함으로써 결정된다. 비억제 조건으로 복귀후 유지되는 세포의 생존율은 사멸(생존율 낮음) 또는 정지(생존율 높음) 표현형을 반영한다. 다르게는, 메틸렌 블루 또는 프로피듐 요오다이드와 같은 생체 염료를 사용하여 억제 대 유도 조건하에 특정 균주의 세포 생존율을 정량할 수 있다. 공지된 진균 약물 표적은 GRACE 균주군(예컨대 CaAUR1)에 포함되므로, 약물 표적군을 포함하는 신규 표적과 표준 진균 약물 표적을 직접적으로 비교할 수 있다. 이러한 방식으로 적절한 약물 표적을 선택하기 위한 산업 표준 사멸 약물 표적 및 대부분의 신속 작용 사멸 화합물을 동정하기 위한 선별 분석에 대해 각각의 표적 군을 직접적으로 등급매겨 우선순위를 정할 수 있다.
5.4. 필수 유전자 및 독성 유전자
5.4.1. 표적, 벡터 및 숙주 세포를 암호화하는 핵산
본 발명의 방법을 실시하여, 유기체 게놈내의 실질적으로 모든 유전자의 필수성 및 독성에 대한 기여도를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 밝혀진 칸디다 알비칸스와 같은 2배체 병인성 유기체의 필수 유전자 및 독성 유전자를 동정하여 본 발명자들은 그 기능을 연구하고 약물 표적으로서의 그 유용성을 평가하였다. 개별 필수 유전자 또는 독성 유전자의 유전자 산물의 구조 및 기능에 대한 정보는 병인성 유기체의 발현 또는 기능을 방해하는 화합물을 찾기 위한 시약 및 분석을 설계할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 병인성 유기체의 성장, 생존 또는증식에 유전자 또는 그 산물이 필수적인지 여부 또는 숙주와 관련하여 유전자 또는 그 산물이 유기체의 독성 또는 병인성에 기여하는지에 대한 정보를 제공한다. 이 정보에 근거하여, 본 발명은 또한 다양한 양태로서 병인성 유기체에 대해 작용을 하는 약물을 발견할 목적으로 병인성 유기체의 독성 또는 병인성에 필수적이고/이거나 기여하는 유전자의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열의 신규한 용도를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 사카로마이세스 세레비시아에와 같은 비병인성 효모의 필수 유전자의 오르토로그를 확인하기 위한 상기 정보의 용도 및 약물 선별 방법에 있어서의 상기 오르토로그의 용도를 구체적으로 제공한다. 사카로마이세스 세레비시아에의 필수 유전자의 오르토로그의 뉴클레오타이드 서열은 공지된 것일 수 있지만, 사카로마이세스 세레비시아에 유전자가 병인성 진균에 대한 약물을 발견하는데 유용할 수 있음은 인지되지 않았다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 폴리펩타이드 또는 생물학적으로 활성인 리보핵산(RNA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 상류, 하류 및/또는 인트론 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "개방 판독 프레임(ORF)"은 임의의 말단 코돈 없이 아미노산을 암호화하기 위한 일련의 뉴클레오타이드 트리플렛을 의미하고, 트리플렛 서열은 특정 유기체에 적절한 코돈 사용 정보를 사용하여 단백질로 번역될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 유전자"는 특히 약물 선별과 관련하여 본 발명에 유용한 필수 유전자 또는 독성 유전자를 지칭한다. 용어 "표적 필수 유전자" 및 "표적 독성 유전자"는 별도로 2개 군의 유전자를 지칭하는데 적절한 경우 사용된다. 그러나, 일부 유전자는 독성에 기여하고 유기체의 생존에 필수적인 것으로 예상된다. 본 발명의 표적 유전자는 당업계에 공지된 방법 및/또는 이하 교시된 방법에 의해 약물 표적으로서 부분 특성화, 완전 특성화 또는 확인될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 유기체"는 본 발명에 유용한 병인성 유기체, 필수 및/또는 독성 유전자를 지칭한다.
용어 "뉴클레오타이드 서열"은 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 (이들로 한정되지는 않음) 뉴클레오타이드의 이형중합체 또는 이들 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 비변형 또는 변형 DNA 또는 RNA일 수 있는 뉴클레오타이드의 이형중합체를 지칭하는 것으로 상호교환적으로 사용되기도 한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA일 수 있고, 단일가닥 및 이중가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역의 혼합물과 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 또는 이들 둘다를 포함하는 삼중가닥 영역으로 이루어질 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레아제 내성 또는 기타 이유로 변형된 하나 이상의 변형된 염기 또는 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 핵산 분절은 게놈 분절 및 올리고뉴클레오타이드 단편, 또는 일련의 올리고뉴클레오타이드, 또는 개별 뉴클레오타이드로부터 조립되어 합성 핵산을 제공할 수 있다.
본원에서 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭할 때 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 단백질이 재조합체(예컨대 미생물 또는 포유류) 발현계로부터 유도됨을 의미한다. "미생물"은 세균 또는 진균(예컨대 효모) 발현계에서 제조된 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 산물로서 "재조합 미생물"은 관련된 천연 글리코실화가 본질적으로 수반되지 않은 폴리펩타이드 또는 단백질로 정의된다. 대부분의 세균 배양물, 예컨대 이. 콜라이에서 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질은 글리코실화 변형이 없고, 효모내에 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질이 글리코실화된다.
용어 "발현 비히클 또는 벡터"는 뉴클레오타이드 서열로부터 폴리펩타이드를 발현하기 위한 플라스미드 또는 파지 또는 바이러스를 지칭한다. 발현 비히클은 (1) 유전자 발현에 있어서 조절 역할을 하는 유전자 요소(들), 예컨대 프로모터 또는 증강제, (2) (1)의 요소와 작동가능하게 연결되어 mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 암호 서열, 및 (3) 적절한 전사 개시 및 종료 서열의 조립체를 포함하는, 발현 구조물로도 언급되는, 전사 단위를 포함할 수 있다. "작동가능하게 연결"은 조절 영역 및 발현될 DNA 서열이 전사 및 궁극적으로 번역되도록 하는 방식으로 연결 및 위치되는 링크를 지칭한다. C. 알비칸스의 경우는, 그의 이상 코돈 사용으로 인해, 다른 유기체로부터 유도된 암호 서열의 변형이 예상 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 이 유기체에서 반드시 생성될 수 있도록 하는데 필수적일 수 있다. 효모 또는 진핵세포 발현계용 구조 단위는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능케하는 리더 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 다르게는, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우에는, N-말단메티오닌 잔기를 포함할 수 잇다. 이 잔기는 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단되어 최종 산물을 제공하거나 하지 않을 수 있다.
용어 "재조합 숙주 세포"는 재조합 전사 단위를 염색체 DNA에 안정하게 통합시키거나 재조합 전사 단위를 염색체외로 안정하게 보유하는 배양 세포를 의미한다. 본원에 정의된 바와 같이 재조합 숙주 세포는 이형 폴리펩타이드 또는 단백질, 및 재조합 전사 단위내의 DNA 분절 또는 합성 유전자에 의해 암호화된 RNA를 발현한다. 또한, 이 용어는 유전자 발현에 있어서 조절 역할을 하는 재조합 유전자 요소(들), 예컨대 프로모터 또는 증강제를 안정하게 통합시킨 숙주 세포를 의미한다. 본원에 정의된 바와 같이 재조합 발현계는 발현될 내인성 DNA 분절 또는 유전자에 연결된 조절 요소의 도입시 세포에 내인성인 RNA, 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현한다. 이 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산을 펩타이드 결합으로 서로 연결함으로써 형성된 분자를 지칭하고 통상적으로 사용되는 20개의 유전자-암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수도 있다. 용어 "활성 폴리펩타이드"는 임의의 천연 폴리펩타이드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드 형태를 지칭한다. 용어 "천연 폴리펩타이드"는 유전적으로 가공되지 않은 세포에 의해 생성된 폴리펩타이드를 지칭하고 구체적으로 단백질분해처리, 아세틸화, 카복실화, 글리코실화, 포스포릴화, 지질화 및 아실화를 포함하는 (이들로 한정되지는 않음) 폴리펩타이드의 번역후 변형으로부터 생성된 다양한 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 천연 공급원으로 핵산 또는 폴리펩타이드와함께 존재하는 하나 이상의 고분자 성분(예컨대 핵산 또는 폴리펩타이드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 하나의 양태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 95 중량% 이상, 보다 바람직하게는 99.8 중량% 이상의 지시된 생물학적 고분자(그러나, 물, 완충제, 및 기타 소분자, 특히 분자량 1000 달톤 미만의 분자가 존재할 수 있다)로 구성되도록 정제된다.
표 II는 각각의 GRACE 균주내의 테트라사이클린 억제 시스템하에 조건적으로 발현되었을 때 또는 활성교환제 단백질 암호화 유전자가 5-FOA 분석시 각각의 GRACE 균주에서 절제되었을 때 C. 알비칸스에 필수적인 것으로 입증된 일군의 진균 고유 균주를 명시한다.
한 양태에 있어서, 본 발명은 61개의 필수 유전자의 동정성(同定性)을 제공한다. 이들 다수 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 판독 프레임은 공지되어 있으나, 상기 유전자들이 칸디다 알비칸스의 성장 및 생존에 필수적이란 사실은 본 발명자들의 발견 이전까지는 알려지지 않았다. 따라서, 상기 유전자들의 용도 및 그들 유전자 생성물은 본 발명에 의해 성취된다. 또한, 본원에서 각각의 동정화된 필수 유전자에 대한 개방 판독 프레임, 추정 아미노산 서열 및 관련된 올리고뉴클레오타이드 서열을 동정화하는데 사용되는 SEQ ID NO가 표 II에 제공되어 있다.
따라서, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 62는 동정화된 필수 유전자의 개방 판독 프레임(ORF)의 뉴클레오타이드 서열을 동정화한다. SEQ ID NO:1-62로서 표지된 뉴클레오타이드 서열은 칸디다 알비칸스 게놈 서열화 프로젝트에 의해 어셈블리된 칸디다 알비칸스 서열 데이터베이스 버전 6으로부터 수득되며 스탠포드 대학 및 미네소타 대학의 인터넷 웹 사이트에서 찾을 수 있다(참조: http://www-sequence.stanfrod.edu:8080/ 및 http://alces.med.umn.edu/Candida.html).
동정화된 필수 유전자의 예측된 아미노산 서열은 판독 프레임이 결정되는 경우 SEQ ID NO:1 내지 61의 뉴클레오타이드 서열의 개념적인 해석을 통해 수득되는 SEQ ID NO:63 내지 SEQ ID NO:123으로 제시된다. 당해 기술분야에 익히 공지된 바와 같이, 코돈 CTG는 다른 유기체에서의 통상의 류신 대신에 C. 알비칸스에서는 세린 잔기로 해석된다. 따라서, ORF의 개념적인 해석은 C. 알비칸의 코돈 용량을 사용하여 수행된다.
DNA 서열은 서열화 반응에 의해 생성되며, 잘못 동정화된 뉴클레오타이드, 삽입 및/또는 결여로서 존재할 수 있는 미소한 오류를 함유할 수 있다. 그러나, 서열 데이터 베이스에 상기와 같은 미소한 오류가 존재하는 경우 본 발명의 필수 유전자인 ORF의 동정화를 방해하지 못한다. ORF를 함유하는 클론이 유용한 경우 서열화를 용이하게 반복할 수 있으며 상기 미소 오류를 보정할 수 있다. 더욱이, 상기 방법들은 유전자의 크로모소멀 DNA 서열 및 프라이머 또는 재조합 DNA에서 유전자의 서열 사이의 절대적인 동정성을 요구하지 않으므로 미소한 서열 오류는 GRACE 균주의 구조 및 용도에 영향을 주지 않는다. 일부 경우에 있어서, C. 알비칸 유전자의 보정 판독 프레임은 총괄적인 아미노산 서열을 공지의 S. 세레비시아에와 비교함으로써 동정화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태에 있어서, SEQ ID NO:62의 뉴클레오타이드 서열의 개념적인 해석은 S. 세레비시아에 중의 오르토로그와 비교하는 경우 개방 판독 프레임의 외견상 예비숙성 종결을 유도한다. 판독 프레임을 유지하기 위해 4개의 뉴클레오타이드를 가하여 SEQ ID NO:58을 생성하고 이것은 SEQ ID NO:120의 아미노산서열을 생성하게 된다. 또다른 양태에 있어서, 본 발명은 동정화된 필수 유전자의 게노믹 서열을 제공하는 것이며, SEQ ID NO:490로 제시되는 상기 게노믹 서열은 인트론을 함유한다. 인트론 서열을 함유하지 않으며 단백질을 암호화하는 미공개 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:39로 제시된다.
SEQ ID NO:124-486은 상응하는 동정화된 필수 유전자를 위한 GRACE 균주의 구조를 위해 설계되고 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 시료를 의미한다. (즉, SEQ ID NO:124-184 녹아웃 업스트림 프라이머(KO-UP); SEQ ID NO:195-245 녹아웃 업스트림 프라이머(KO-Down); SEQ ID NO:246-306 테트라사이클린 프로모터 업스트림 프라이머(Tet-Down); 및 각각의 GRACE 균주의 동정화를 위한 SEQ ID NO:368-489 프라이머(프라이머 A 및 B). 따라서, 각각의 올리고뉴클레오타이드 셋은 예를 들어 하이브리드화 또는 PCR에 의해 특유의 필수 유전자 및 특유의 GRACE 균주를 동정화하는데 사용될 수 있다.
표 II에 수록된 필수 유전자는 당해 기술분야에 공지된 클로닝 방법을 이용하여 수득될 수 있으며 적절한 cDNA 또는 gDNA(게노믹 DNA) 라이브러리 내의 유전자를 검출하는 적절한 시료의 사용을 포함하나, 이로써 제한되지는 않는다. (참조: 예를 들어 Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories; 상기 문헌은 본원에서 참조로 인용된다) 본원에서 동정화된 서열을 위한 시료는 본원에서 SEQ ID NO:1-62로 개시된 DNA 서열을 기본으로 하여 합성될 수 있다.
본원에서 사용되는 "표적 유전자"(즉, 필수 및/또는 발명 유전자)는 (a) SEQID NO:1 내시 SEQ ID NO:62로 제시되는 DNA 서열 및/또는 단편을 하나 이상 함유하는 유전자; (b) 전체적인 유전정보 또는 C. 알비칸의 코돈 용량을 이용하여 SEQ ID NO:63 내지 SEQ ID NO:123으로 제시되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 또는 단편; (c) 엄격한 조건하의 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:62로 제시된 뉴클레오타이드 서열의 보충물에 하이브리드화, 예를 들어 약 45℃에서 6 × 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중의 필터-결합된 DNA에 하이브리드화시킨 다음 약 50 내지 65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS 중에서, 또는 고도로 엄격한 조건하에서 1회 이상의 세척시킴, 예들 들어 약 45℃에서 6 × SSC 중의 필터-결합된 핵산에 하이브리드화시킨 다음 68℃에서 또는 당해 분야의 숙련가들에게 명백한 다른 하이브리드화 조건하에서 0.1×SSC/0.2% SDS 중에서 1회 이상 세척함. (참조: 예를 들어 Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, at pp. 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3) 바람직하게는 본원에 개시된 DNA 서열의 보충물에 하이브리드화시키는 폴리뉴클레오타이드는 유전자 생성물, 예를 들어 표적 유전자에 의해 암호화된 유전자 생성물과 기능적으로 등가물인 유전자 생성물을 암호화한다. 위에서 기술한 바와 같이, 표적 유전자 서열은 C. 알비칸스 중에서 SEQ ID NO:63 내지 123의 아미노산 서열을 암호화하는 변성 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 C. 알비칸스 이외의 유기체에서 해석되는 경우 SEQ ID NO:63 내지 123의 아미노산 서열 중의 하나 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하게 되는 변성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 적당한 코돈을 선택하거나 C. 알비칸스 또는 다른 유기체에서 표적 유전자 서열을 사용하는 경우 SEQ ID NO:1 내지 62의 뉴클레오타이드 서열을 변경시키는 방법을 알 수 있을 것이다. 더욱이, "표적 유전자"는 사타로마이세스 세레비시아에 또는 이의 변이체에서 자연적으로 생성되며 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 62로 제시되는 DNA 서열 중의 하나, 즉 S. 세레비시아에에서 오르토로그를 갖는 C. 알비칸스 유전자와 광대한 뉴클레오타이드 서열 유전자를 공유하는 유전자를 포함한다. C. 알비칸스 유전자에 적용될 수 있는 약물 스크리닝 방법은 비발병학적 S. 세레비시아에 중의 동일 유전자의 오르토로그에도 적용될 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한 하기 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 셀 및 상기 뉴클레오타이드의 발현 생성물을 포함한다: (a) 표적 유전자 생성물의 일부를 그의 기능적인 도메인과 상응하도록 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화되는 것으로, 수용체 유형의 유전자 생성물의 경우 도메인이 제한되지는 않지만 신호 서열, 특수한 도메인(ECD), 트랜스멤브레인 도메인(TM) 및 사이토플라스믹 도메인(CD)을 포함하는 폴리펩타이드 생성물; (b) 표적 유전자 생성물의 돌연변이체를 암호화하는 것으로, 그의 도메인 중 하나의 전부 또는 일부가 없어지거나 변경되거, 수용체 유형의 유전자 생성물의 경우 상기 돌연변이체가 제한되지는 않지만 신호 서열의 제거되는 숙성 단백질 TM의 전부 또는 일부가 없어지는 가용성 수용체, 및 CD의 전부 또는 일부가 없어지는 비기능성 수용체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (d) 표적 유전자 생성물 또는 또다른 폴리펩타이드에 융합된 도메인 중 하나를 함유하는융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명은 표적 유전자 서열의 DNA 서열에 하이브리드화시키고 따라서 상기 DNA 서열의 보충물로 되는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 하이브리드화 조건은 위에서 기술되었고 당해 분야에 공지된 바와 같이 고도로 엄격하거나 덜 엄격할 수 있다. 상기 DNA 서열에 하이브리드화시키는 본 발명의 핵산 분자는 고도로 엄격하거나 엄격한 조건하에서 표적 유전자에 하이브리드화하는 올리고데옥시뉴클레오타이드("올리고스")를 포함한다. 일반적으로 길이가 14 내지 70뉴클레오타이드인 올리고스에 있어서 용융온도(Tm)은 수학식 Tm(℃)=81.5+16.6(log[1가 양이온(몰랄)]+0.41(%G+C)-(500/N)를 이용하여 계산한다. 상기 수학식에서 N은 시료의 길이이다.
하이브리드화가 포름아미드를 함유하는 용액 속에서 수행되는 경우 용융 온도는 수학식 Tm(℃) = 81.5+16.6(log[1가 양이온(몰랄)]+0.41(%G+C)-(0.61)(%포름아미드)-(500/N)를 이용하여 계산한다. 상기 수학식에서 N은 시료의 길이다.
일반적으로 하이브리드화는 Tm보다 낮은 약 20 내지 25℃(DNA-DNA 혼성의 경우) 또는 Tm보다 낮은 약 10 내지 15℃(RNA-DNA 혼성의 경우)에서 수행된다. 또다른 고도로 엄격한 조건은 예를 들어 37℃(14-베이스 올리고스의 경우), 48℃(17-베이스 올리고스의 경우) 및 60℃(23-베이스 올리고스의 경우)에서 6×SSC/0.05% 나트륨 피로포스페이트 중에서의 세척을 의미할 수 있다. 상기 올리고스의 예는 SEQ ID NO:124-489로 제시된다.
이러한 핵산 분자는 예를 들어 표적 유전자 조절에 유용한 표적 유전자 안티센스 분자 및/또는 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열의 증폭(amplification) 반응에서의 안티센스 프라이머로서 암호화하거나 작동할 수 있다. 추가로, 상기 서열은 또한 표적 유전자 조절에 유용한 리보지메의 일부 및/또는 트리플 헬릭스 서열로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 분자는 진단방법의 성분으로서 사용되어 병원성 물질을 검출할 수 있다. 이러한 핵산 분자의 용도는 하기에서 상세히 논의된다.
본 발명의 표적 유전자는 길이가 10 뉴클레오타이드 이상일 수 있다. 또다른 양태에 있어서, 단편은 길이가 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 이상의 연속적인 뉴클레오타이드일 수 있다. 또한, 단편은 연속적인 아미노산 잔기를 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450개 또는 그 이상 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적 유전자의 단편은 또한 상기 핵산 분자의 엑손 또는 인트론뿐만 아니라 신호 서열, 특수한 도메인(ECD), 트랜스멤브레인 도메인(TM) 및 사이트플라즈믹 도메인(CD)와 같은 기능적인 도메인을 암호화하는 핵산 분자의 암호화 영역의 일부를 의미할 수 있다.
5.4.2. 동종 표적 유전자
상기 칸디다 알비칸스의 뉴클레오타이드 서열 이외에 상이한 종으로 존재할 수 있는 표적 유전자 서열의 동종 또는 오르토로그는 당해 기술분야에 공지되고 과도한 실험없이 본 발명에 사용되는 분자생물학적 기법에의 동정 또는 단리될 수 있다. 예를 들어 아르페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 니게르, 코시디오데스 이미티스, 그라이프토코쿠스 네오포르만스, 히스토플라스마 캅술란툼, 피토프토라 인페스탄스, 푸시니아 세콘디티, 프네우모시스티스 카리니 또는 상기 종들의 속에 속하는 종에서의 동종 표적 유전자. 칸디다, 사카로미세스, 쉬조사카로미세스, 스포로볼로미세스, 토룰로프시스, 트리코스포론, 트리코피톤, 데르마토피테스, 미크로스프로움, 위케르하미아, 아쉬비아, 블라스토미세스, 칸디다, 시테로미세스, 크레브로세시움, 크리프토코쿠스, 데바리오미세스, 엔도미코프시스, 게오트리쿰, 한세눌라, 클로에케라, 클루버로미세스, 리포미세스, 피치아, 로도스포리디움, 로도토룰라 및 야로위아의 속 중의 다른 효모가 또한 고려될 수 있다. 또한, 아스페르길루스 푸미게이투스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실로프시스, 칸디다 크루세이, 크리프토코쿠스 네오포르만스, 코시디오이데스 이미티스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 캅프설라툼, 프네우모시스티스 카리니, 트리코스포론 베이겔리, 리조푸스 아르히주스, 무코르 로욱시, 리조무코르 푸실루스, 또는 아브시디아 코림비게라와 같은 동물의 균류 병원체, 또는 알테르나리아 솔라니, 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르테 그리세아, 푸시니아 레코디타, 스크레로티니아 스크레로티오룸, 세프토리아 트리티디, 틸레티아 콘트로베르사, 우스틸라고 마이디스, 벤투리아 이네쿠알리스, 베르티쿠리움 다흐리애와 같은 식물의 균류 병원체, 또는 상기 종의 속에 속하는 종으로부터 동정되고 단리될 수 있다.
따라서, 본 발명은 표적 유전자의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화될 수 있으며 사카로미세스 세레비시아에 및 칸디다 알비칸스와는 다른 종인 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO:62로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상이 동정성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 본 발명은 중간정도의 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO:62로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 제 2 핵산에 하이브리드화되는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO. 63 내지 123로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 50% 이상이 동정성인 아미노산 서열인 폴리펩타이드[여기서, 폴리펩타이드는 사카로미세스 세레비시아에 및 칸디다 알비칸스와는 상이한 종의 것이다]를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
S. 세레비시아에에서 유전자의 동종 또는 오르토로그의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 대부분 공개되어 있으나, 약물 스크리닝에서 S. 세레비시아에에 상기 동종 또는 오르토로그를 사용하는 것은 알려지지 않았으며 따라서 본 발명에 의해 특별히 제공된다. S. 세레비시아에의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 사용하는 것은 스탠포드 게노믹 리소시스(www-genome.stanford.edu), 단백질 서열을 위한 문니치 인포메이션 센터(www.mips.biochem.mpg.de), 또는 프로테오메(www.proteome.com)와 같은 데이터베이스를 사용하여 그 서열을 확인하고 정정(retrieve)할 수 있다. S. 세레비시아에 중의 알비칸스 유전자의 오르토로그 또는 동종이 공지되어 있는 경우의 S. 세레비시아에 유전자의 명칭은 표 I의 칼럼1의 괄호안에 표시되어 있다. 에스 세레비시아에의 오르토로그는 또한 SEQ ID NO: 1 내지 61, 및 490의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나로 이루어진 핵산 시료를 이용한 하이브리드화 분석에 의해 동정될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드는 추가로 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO:62로 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대하여 40%, 45%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상의 아미노산 서열의 동정성 또는 유사성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열의 % 동정성을 결정하기 위해 그 서열이 최적의 비교용으로 정렬된다. (예를 들어 제 2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 최적의 정렬을 위한 제 1 아미노산 도는 뉴클레오타이드 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있다) 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우 그 위치에서 분자는 동일하다. 두 서열 사이의 % 동정성은 그 서열에 의해 공유되는 다수의 동일 위치의 수의 함수이다. (즉, % 동정성 = 동일한 중복 위치/위치의 총수 × 100) 한 양태에 있어서, 상기 두 서열은 길이가 동일하다.
또한, 두 서열 사이에서 % 동정성을 결정하는 것은 수학적 알고리듬을 이용하여 수행될 수 있다. 두 서열을 비교하기 위해 사용될 수 있는 제한되지는 않으나 바람직한 수학적 알고리듬의 예는 문헌[참조: Karlin and Altschul(1990) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]에 개시되어 있다. 이와 같은 알고리듬이 하기 프로그램[The NBLAST and XBLAST programs of Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-0]에 사용되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드의 연구는 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 파라미터 셋(예를 들어 스코어 = 100, 워드길이 = 12)를 사용하여 수행하여 본 발명의 핵산 분자와 동종인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 연구는 XBLAST 프로그램 파라미터 셋(예를 들어 스코어 = 50, 워드길이 = 3)을 사용하여 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 동종인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교목적의 갭핑된 정렬을 수득하기 위해 갭핑된 BLAST가 문헌[참조: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바대로 이용될 수 있다. 또한, PSI-BLAST를 사용하여 분자들(Id.) 사이의 원격 관계를 탐지하는 반복적인 연구를 수행할 수 있다. BLAST, 갭핑된 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우 각각의 프로그램(예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 서열의 비교를 위해 사용되는 제한되지는 않지만 바람직한 또다른 수학적 알고리듬의 예는 문헌[참조: Myers and Miller, (1988) CABIOS 4:11-17]에 개시되어 있는 알고리듬이다. 상기 알고리듬은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 사용되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다.
동종 표적 유전자를 단리시키기 위해서는 전술한 C. 알비칸스 표적 유전자 서열이 표지되어 유익한 유기체로부터 수득된 mRNA로부터 구성된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. cDNA 라이브러리가 표지된 서열이 유도되는 유기체의 유형과는 상이한 유기체로부터 유도되는 경우 낮은 엄격도가 요구된다. cDNA 스크리닝은 또한 동일하거나 상이한 종에서 선택적으로 꼬인 트랜스크립트로부터 유도된 클론을 동정할 수 있다. 낮은 엄격도 조건은 당해분야의 숙련가들에게 알려져 있으며 라이브러리 및 표지된 서열이 유도되는 특정 유기체에 따라 예측가능하게 변한다. 이러한 조건은 문헌[예를 들어 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratroy Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.]을 참조할 수 있다.
추가로, 동종 표적 유전자 서열은 유익한 표적 유전자 내의 아미노산 서열을 기준으로 하여 설계된 2개의 변성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 풀을 사용하여 중합효소 쇄 반응(PCR)을 수행함으로써 단리시킬 수 있다. 반응을 위한 템플레이트는 유익한 유기체로부터 제조된 mRNA의 리버스 트랜스크립션에 의해 수득된 cDNA일 수 있다. PCR 생성물은 서브클로닝되어 확대된 서열이 동종 표적 유전자 서열의 서열을 나타내는 것을 보장하도록 시이퀀싱될 수 있다.
이어서, PCR 단편은 당해분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 충분한 길이의 cDNA 클론을 단리시키는데 사용될 수 있다. 또한, 표지된 단편이 게노믹 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또한, PCR 기술은 충분한 길이의 cDNA 서열을 단리시키는데 이용될 수 있다. 리버스 트랜스크립션 반응은 제 1 가닥 합성의 프라이밍을 위한 확대된 단편의 최고 5' 말단에 대한 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 RNA 상에서 수행될 수 있다. 생성되는 RNA/DNA 혼성물은 표준 종지 전이효소 반응을 이용하여 구아닌에 "테일링(tailing)"될 수 있으며, 상기 혼성물은 RNAase H로 다이제스팅될 수 있으며, 이어서 제 2 가닥 합성이 폴리-C-프라이머로 프라이밍될 수 있다. 따라서, 확대된 단편의 cDNA 서열 업스트림은 용이하게 단리될 수 있다. 사용될 수 있는 클로닝 방법은 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.)을 참조한다.
추가로, 발현 라이브러리는 유익한 유기체로부터 합성된 cDNA로부터 단리된 DNA를 이용하여 구성될 수 있다. 이러한 방식에 있어서, 동종 표적 유전자에 의해 제조된 유전자 생성물은 C. 알비칸스 유전자 생성물에 대해 일어나는 항체와 함께 표준 항체 스크리닝 기법을 이용하여 발현되고 스크리닝될 수 있다. [스크리닝 기법과 관련하여 예를 들어 문헌(Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual,:Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor) 참조] 상기 표지된 항체와의 반응으로 탐지된 라이브러리 클론을 당해 분야에 공지된 방법에 따라 정제한 다음 분석한다.
또한, 증식, 발병 또는 병원성과 관련된 표적 유전자 또는 폴리펩타이드에 대해 원하는 수준의 동종을 갖는 서열을 동정화하는 데이터베이스를 조사함으로써 동종 표적 유전자 또는 폴리펩타이드가 동정화될 수 있다. GenBank 및 GenSeq를 포함하는 이와 같은 다양한 데이터베이스를 당해분야의 숙련가은 구할 수 있다. 각종 양태에 있어서, 데이터베이스를 스크리닝하여 표적 뉴클레오타이드 서열 및 이의 일부에 대해 97% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 또는 40% 이상의 동종을 갖는 핵산을 동정화하도록 스크리닝된다. 또다른 양태에 있어서, 데이터베이스는 증식, 발병 또는 병원성과 관련된 폴리펩타이드 또는 이의 일부에 대해 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상 또는 25% 이상의 동정성 또는 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 동정화하도록 스크리닝된다.
또한 기능적으로 동종인 표적 서열 또는 폴리펩타이드는 유전자의 기능을 제거하거나 변경시킴으로써 표현형을 갖는 돌연변이를 생성함으로써 동정화될 수 있다. 이것은 예를 들어 사카로미세스 세레비시아에, 칸디다 알비칸스 및 아스페르길루스 푸미가투스를 포함하는 주어진 균종에서 하나 또는 전부의 유전자에 대해 수행될 수 있다. 하나의 균종의 유전자에 돌연변이체를 갖는 경우 기능적인 보충 시험에 의해 다른 종에서 기능적으로 유사한 유전자(오르토로그) 관련된 유전자(파라로그)을 동정화하는 방법을 제공한다.
메신저 RNA의 유전자 또는 cDAN 복제물의 라이브러리는 주어진 종, 예를 들어 칸디다 알비칸스로부터 제조될 수 있으며 상기 라이브러리는 제 2 종 예를 들어 사카로미세스 세레비시아에 중의 유전자의 벡터 허용 발현(예를 들어 칸디다 알비칸스 프로모터 또는 사카로미세스 세레비시아에 프로모터를 갖는)으로 클로닝될 수 있다. 칸디다 알비칸스 이형 라이브러리의 동정화된 유전자와 관련하여 기능적으로 결핍된 사카로미세스 세레비시아에의 정의된 돌연변이체로의 형질변환, 및 상기 돌연변이성 결핍체의 일부 또는 전부에서 표현형성 기능을 복원하는 이형 라이브러리에서의 유전자에 대한 스크리닝 또는 선택은 "이형 기능 보충으로서 언급되며 본 실시예에서 사카로미세스 세레비시아에 중의 돌연변이된 유전자와 기능적으로 관련된 칸디다 알비칸스 중의 유전자의 동정화를 허용한다. 상기 기능적인 보충방법의 특유성은 핵산 또는 폴리펩타이드의 서열 유사성에 대한 요건없이 유전자 능력을 복원하는 것이다. 즉, 상기 방법은 서열 유사성 비교가 보존을 드러내거나 암시하지 않는 경우에도 보존된 생물학적 기능을 갖는 유전자의 상호특이적 동정성을 허용한다.
시험되는 유전자가 필수 유전자인 경우에 있어서, 이형 기능 보충 시험의 수행과 관련하여 다수의 가능성이 존재한다. 필수 유전자 중의 돌연변이는 제한되지는 않으나 온도 민감성 대립 유전자, 조절가능한 프로모터로부터 조건적으로 발현된 대립 유전자, 또는 mRNA 트랜스크립트 또는 암호화된 유전자 생성물 조건적으로 불안정하게 하는 대립 유전자를 포함하는 조건적 대립 유전자일 수 있다. 또한, 필수 유전자에서 돌연변이를 수반하는 균주는 벡터 및 포함된 야생 유형의 대립 유전자의 복제가 거의 또는 전혀 없는 균주에 대한 선택을 허용하는 선택될 수 있는 표시자를 벡터 상에서 고유 유전자의 복제를 이용하여 증식될 수 있다. 이와 같은 방식으로 구성된 균주는 이형 라이브러리로 형질 전환되며, 이형 유전자가 필수 유전자 돌연변이를 기능적으로 보충할 수 있는 클론은 야생 유형의 유전자를 수반하는 플라스미드의 유지에 중간정도의 허용성의 관점에서 선택된다.
하기 실시예에 있어서, 사카로미세스 세레비시아에 유전자, KRE 9의 칸디다 알비칸스 동종의 기능적인 보충에 의한 동정화는 문헌[참조: Lussier et al. 1998, "The Candida albicans KRE 9 gene is required for cell wall β-1,6-glucan synthesis and is essential for growth on glucose,"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9825-30]에 기술되어 있다. 숙주 균주는 KRE9, kre 9::HIS3에서 사카로미세스 세레비시아에 합로이드 널 돌연변이체이었으며 상기 돌연변이체는 심각한 성장 결함 표현형을 갖는다. 숙주 균주는 LYS-2 기본 pRS317 tu틀 벡터 상에서 고유의 사카로미세스 세레비시아에 KRE 9 유전자의 야생형 복제를 지녔으며 칸디다 알비칸스 게노믹 라이브러리로 형질 전환되었다. 이러한 이형 라이브러리는 벡터로서, 선택가능한 표지제로서 URA3을 지니는 다중 목제 플라스미드 YEp352를 사용하여 구성되었다. kre 9::HIS 3 돌연변이체의 플라스미드지지 성장을 스크리닝하기 위해서는 히스티딘, 리신 및 우라실의 부재하에서 성장할 수 있는 대략 20,000개의 클로니가 KRE 9KRE 9의 LYS2 플라스미드 기본복제능을 상실하고 기능적으로 보충하는 칸디다 알비칸스 오르토로그 CaKRE 9의 복제능을 보유하는 세포에 대한 선택을 허용하는 질소 공급원으로서 α-아미노 아디페이트를 함유하는 최소 매질 상에서 복제 플레이팅된다. 이들 세포는 리신의 부재하의 성장 불가능성으로 인해 pRS317-KRE 9의 손실에 대해 추가로 시험된다. 사카로미세스 세레비시아에 kre 9:HIS3 돌연변이체의 재형질변환시 YEp352 기본 칸디다 알비칸스의 8kb의 특정 게노믹 삽입은 성장이부분적으로 복원될 수 있도록 회복시킨다. 선택을 위한 기능적인 보충을 이용한 추가의 서브클로닝에 따라 기능성 칸디다 알비칸스 KRE 9 유전자를 함유하는 1.6kg의 DNA 단편이 수득되었다.
이형 기능적인 보충 시험은 칸디다 알비칸스와 사카로미세스 세레비시아에 사이의 유전정보의 교환으로 제한되지 않으며, 임의의 균종 쌍을 이용하여 기능적인 보충 시험이 전술한 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어 균류 슬러로티니니아 슬러로티오룸의 CRE1 유전자는 아스페르길루스 니둘란스의 CREA 유전자의 creAd30 돌연변이체를 기능적으로 보충할 수 있다. [참조: Vautard et al. 1999, "The glucose repressor gene CRE1 from SClerotininia sclerotiorum is functionally related to CREA from Aspergillus nidulans but not to the Mig proteins from Saccharomyces cerevisiae, "FEBS Lett.453: 54-58]
유전자 발현 배열상에 침적된 헥산의 공급원 및 배열로 하이브리드화된 헥산 프로브의 공급원이 2종의 상이한 종의 유기체로부터 유래하는 다른 실시양태에서, 결과물은 2종의 동종 유전자의 신속한 확인을 가능하게 한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 (a) 표적 유전자 및/또는 이들의 보체(안티센스를 포함)의 임의의 전술한 암호 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 벡터; (b) 암호 서열의 발현을 지향하는 조절용 요소와 시술가능하도록 연결되어 있는 임의의 전술한 암호 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 발현 벡터; 및 (c) 숙주 세포내의 암호 서열의 발현을 지향하는 조절용 요소와 시술가능하도록 연결된 표적 유전자의 임의의 전술한 암호 서열을 함유하는유전공학적으로 조작된 숙주 세포를 포함한다. 다른 종(S. 세레비시아에(S. Cerevisiae)를 포함함)의 동종 표적 유전자의 암호 서열을 함유하는, 벡터, 발현 구성물, 발현 벡터, 및 유전학적으로 조작된 숙주 세포 또한 포함한다. 다른 종의 동종 표적 유전자내 돌연변이 대립유전자를 함유하는 유전학적으로 조작된 숙주 세포 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 경우, 조절용 요소란 유발성 프로모터, 비-유발성 프로모터, 개선제, 작동 유전자 및 발현을 유도하고 조절하는 것으로 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 그밖의 요소를 포함하지만 이로서 한정하는 것은 아니다. 이러한 조절용 요소는lac시스템,trp시스템,tet시스템과 기타 항생제계 발현 시스템(예: PIP),TAC시스템, TRC 시스템, 파지 A의 주요 작동 유전자 및 프로모터 영역, Fd 코팅 단백질의 조절 영역, 및 3-포스포글리세레이트 키나제, 산 포스파타제의 진균 프로모터, 효모 교배용 페로몬 반응성 프로모터(예: STE2 및 STE3), 및 탄수화물 물질 대사내 유전자로부터 분리된 프로모터(예: GAL 프로모터), 포스페이트-반응성 프로모터(예: PHO5), 또는 아미노산 물질대사(예: MET 유전자)를 들 수 있지만, 이로서 한정하는 것은 아니다. 본 발명은 본원에서 개시한 임의의 DNA 벡터 서열의 분절을 포함한다.
다양한 기법이 확인된 필수 유전자 및 발병력 유전자를 추가로 특징화하는데 사용될 수 있다. 우선, 확인된 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 확인된 유전자 산물의 생물적 작용에 관한 정보를 수득할 수 있는 1종 이상의 공지된 서열 모티브와의 상동성을 밝히는데 사용될 수 있다. 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램은 이러한 관계를 확인하는데 사용될 수 있다. 두번째로, 확인된 유전자의 서열은, 동일반응계 하이브리드화와 같은 표준 기법을 사용하여, 다른 유기체, 예를 들어사카로마이세스 세레비시아에에 대해 구성된 유사한 지도와 연관될 수 있는 크로모좀 지도 및 유전자 지도에 유전자를 위치시키는데 사용할 수 있다. 이러한 특성화를 통해 수득된 정보는 칸디다알비칸스및 그밖의 병원균에 대한 약물의 발견을 위해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 사용하는 관련 방법을 제안할 수 있다.
전술한 바와 같은 사용을 가능하게 하는 방법이 당해 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 이러한 방법에 관한 문헌은 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, and "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques," Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987]에 제안되어 있지만, 이로서 한정하는 것은 아니다. 확인된 필수 유전자의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 다수의 용도는 하기에서 상세히 논의되어 있다.
5.4.3 표적 유전자 산물
본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되고 논의되는 표적 유전자 산물은 전술한 바와 같은 표적 필수 유전자 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 1 내지 62의 표적 유전자 서열에 의해 암호화되는 유전자 산물(예: RNA 또는 단백질)을 포함한다. 표 II에서, 서열 63 내지 123의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1 내지 61의 개별적인 뉴클레오타이드 서열로부터의C. 알비칸스의 코돈을 사용하여 유추된다. 그러나, 시. 알비칸스 이외의 유기체내에서 발현하는 경우, SEQ ID NO:63 내지 123의 아미노산 서열을 갖는 표적 유전자의 단백질 산물은 만능 유전자 암호를 사용하여 해독된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 당해 분야의 숙련자라면 코돈 사용시 이와 같은 차이점을 조절하는데 필요한 개질법을 알 것이다.
그러나, 추가로, 본 발명의 방법 및 조성물은 기능적으로 동등한 유전자 산물을 제공하는 단백질 및 폴리펩타이드를 사용 및 포함한다. 이러한 기능적으로 동등한 유전자 산물은 SEQ ID NO:63 내지 123의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 천연 변종을 포함하지만 이로서 한정하는 것은 아니다.
이러한 동등한 표적 유전자 산물은, 예를 들어 전술한 표적 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열 내부에 아미노산 서열의 결손부, 첨가부 또는 치환부를 함유할 수 있지만, 이들은 변화를 유발하지 않아 기능적으로 동등한 표적 유전자 산물을 생산한다. 아미노산 치환부는 포함된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성이 유사할 수 있다. 예를 들어, 비극성(즉, 소수성) 아미노산 잔기로는 알라닌(Ala 또는 A), 루신(Leu 또는 L), 이소루신(Ile 또는 I), 발린(Val 또는 V), 프롤린(Pro 또는 P), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 트립토판(Trp 또는 W) 및 메티오닌(Met 또는 M)를 들 수 있고; 극성 중성 아미노산 잔기로는 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S) , 트레오닌(Thr 또는 T), 시스틴(Cys 또는 C), 티로신(Tyr 또는 Y), 아스파라진(Asn 또는 N) 및 글루타민(Gln 또는 Q)을 들 수 있고, 양으로 하전된(즉, 염기성) 아미노 산 잔기로는 알기닌(Arg 또는 R), 리신(Lys 또는 K) 및 히스티딘(His 또는 H)를 포함할 수 있고; 음으로 하전된(즉, 산성인) 아미노산 잔기는 아스파르트산(Asp 또는 D) 및글루타민산(Glu 또는 E)를 들 수 있다.
구체적인 실시양태에서, SEQ ID NO: 63 내지 123를 보유하는 폴리펩타이드의 천연 변종의 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 당해 분야에 C. 알비칸스에는 코돈 CTG를 인식하는 tRNA 분자의 99%가 세린 잔기에 의해 하전되고, 1%가 루신 잔기에 의해 하전되기 때문에, 생합성 과정에서 루신이 성장하는 폴리펩타이드 쇄내로 도입될 가능성이 있다. 따라서, 코돈 CTG를 포함하는 뉴클레오타이드 서열이C. 알비칸스에서 해독되는 경우, 생성된 폴리펩타이드의 함량중 소량은 CTG에 의해 암호화되는 세린 잔기(C. 알비칸스의 코돈 사용과 일치함)가 발현되는 위치에서 루신 잔기를 보유할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드의 해독 산물은 뉴클레오타이드 서열내 CTG 코돈에 상응하는 위치에서 소량의 루신/세린 변종를 포함하는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어로서 "기능적으로 동등한"이란 용어는 표 II에서 기술한 1종 이상의 표적 서열에 의해 암호화되는칸디다 알비칸스표적 유전자 산물로서 실질적으로 유사한 생체내 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 선택적으로, 전술한 바와 같은 분석의 일부로서 사용되는 경우, "기능적으로 동등한"이라는 용어는 표적 유전자 산물의 상응하는 부분이 상이한 분자와 반응하는 방식과 실질적으로 유사한 방식으로 다른 세포내 또는 세포외 분자와 반응할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 기능적으로 동등한 표적 유전자 산물은 또한 표 II에서 기술한 1종 이상의 표적 유전자 서열에 의해 암호화하는 표적 유전자 산물과 동일한 크기 또는 거의 동일한 크기이다.
본 발명의 다른 실시양태에서,사카로마이세스 세레비시아에의 RNA 또는 단백질인 표적 유전자 산물의 사용이 제공된다.
표적 유전자 산물의 하나 이상의 도메인(예: 신호 서열, TM, ECD, CD 또는 리간드-결합 도메인), 끝이 잘리거나 결손된 표적 유전자 산물(예컨대, 표적 유전자 산물의 하나 이상의 도메인이 결손된 폴리펩타이드) 및 접합 표적 유전자 단백질(예컨대, 전체 길이 또는 끝이 짤리거나 결손된 유전자 산물, 또는 표적 유전자 산물의 하나 이상의 도메인에 상응하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 미관련 단백질에 접합된 단백질)에 상응하는 펩타이드 및 폴리펩타이드가 본 발명의 범주에 속한다. 이러합 펩타이드 및 폴리펩타이드(본원에서는 키메라 단백질 또는 폴리펩타이드로 지칭함)은 표 II의 표적 유전자 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 기초로 하여 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 설계될 수 있다. 예시적인 접합 단백질로는 에피토프(epitope)에 결합된 시약을 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 표적 유전자 산물의 분리를 용이하게 하는 에피토프 태그-접합 단백질을 들 수 있지만 이로서 한정하는 것은 아니다. 다른 예시적인 접합 단백질은, 접합 단백질을 세포 막에 고정시켜 표적 유전자 폴리펩타이드가 세포 막상에 나타나는 임의의 아미노산 서열; 또는 접합부가 효소(예:클루이베론마이세스 락티스(Kluyveronmyces lactis); 문헌[Leuker et al, 1994, Mol. Gen. Genet., 245:212-217] 참고)의 LAC 4 유전자에 의해 암호화된 β-갈락토시다제), 형광 단백질(예컨대,레닐라 레니포르미스(Renilla Reniformis; 문헌[Srikantha et al, 1996, J. Bacteriol. 178:121-129] 참조)에서 유래함), 또는 마커 기능을 제공할 수 있는 발광 단백질에 접합될 수 있는 임의의 아미노산 서열에 대한 접합부를 제공한다. 따라서, 본 발명은 제 2 폴리펩타이드에 접합된 제 1 폴리펩타이드의 분절을 포함하는 접합 단백질을 포함하고 여기서 상기 제 1 폴리펩타이드의 분절은 SEQ ID NO: 63 내지 123중에서 선택된 아미노산 서열의 6개 이상의 연속 잔기로 구성된다.
전술한 바와 같은 표적 유전자 산물 암호 서열의 그밖의 변종은 선택된 숙주 세포에서 예를 들어 스케일 업(scale up)을 위한 발현 등에 보다 적당한 폴리펩타이드를 발생시키도록 제조될 수 있다. 예를 들어 시스테인 잔기는 디설파이드 브릿지를 제거하기 위해서 다른 아미노산으로 치환되거나 제거될 수 있다.
본 발명의 표적 유전자 산물은 바람직하게는 에피토프 분절을 나타내는데(즉, 유전자 산물이 표적 유전자 산물의 항체에 의해 인식될 수 있도록) 요구되는 것과 적어도 동등한 수의 인접 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 이러한 단백질 분절 또는 펩타이드는 전체 길이에서 차등적으로 발현되거나 일련인 유전자 산물로부터 약 8개 이상의 인접 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 선택적인 실시양태에서, 본 발명의 단백질 분절 및 펩타이드는 약 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450개 이상의 표적 유전자 산물의 근접 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되고 포함되는 표적 유전자 산물은 또한 도메인이 이들의 서열의 하나 이상의 엑손에 의해 암호화되거나 이들이 분절이 제거되어 있는 본 발명의 전술한 표적 유전자 서열 1종 이상에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 표적 유전자 산물은 여전히 글리코실화, 아세틸화 및 마이리스틸화를 비롯한 후-해독 개질법을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 표적 유전자 산물은 합성 기법 또는 당해 분야에 공지된 기법을 사용하는 재조합 DNA 기법의 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 표적 유전자 산물을 제조하는 방법은 본원에 논의되어 있다. 우선, 본 발명의 폴리펩타이드 및 펩타이드는 당해 분야에 공지된 바와 같은 기법에 의해 합성 또는 제조될 수 있다. 본원에서 그 전체가 참고로 인용된 문헌[Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y.]을 참조한다. 예를 들어, 펩타이드는 고체 지지체 상 또는 용액내에서 합성될 수 있다.
선택적으로, 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 재조합 DNA 방법을 사용하여 SEQ ID NO: 1 내지 61 및 적당한 전사/해독 조절 신호와 같은 표적 유전자 단백질 암호 서열을 함유하는 발현 벡터를 형성할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전 재조합 기법을 들 수 있다. 예를 들어, 본원에서 그 전체가 참조로 인용되는 샘블룩(Sambrook)의 문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., Pla et al., Yeast 12: 1677-1702(1966)] 및 아우스벨(Ausubel)의 전술한 문헌을 참고한다. 선택적으로, 표적 유전자 단백질 서열을 암호화할 수 있는 RNA는 예를 들어 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어 본원에서 그 전체를 참고로 인용하는 문헌[OligonucleotideSynthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford.]에서 기술한 기법을 참조한다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 표적 유전자 암호 서열을 발현할 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은, 주목하는 암호 서열이 형성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 적당한 뉴클레오타이드 암호 서열로 형질전환 또는 트랜스팩션되는 경우 동일반응계에서 본 발명의 표적 유전자 단백질을 나타낼 수 있는 세포를 나타낼 수 있다. 이들중에는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 표적 유전자 단백질 암호 서열을 함유하는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예:이. 콜라이(E. Coli),비, 서브틸리스(B. subtilis)); 표적 유전자 단백질 암호 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예:사카로마이세스,치조사카호마이세스(Schizosaccarhomyces),뉴로스포라(Neurospora),아스페르길루스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia)); 표적 유전자 단백질 암호 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스(Baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 토바코 모자이크 바이러스, TMV)으로 감염되거나 표적 유전자 단백질 암호 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예: 아데노바이러스 프로모터, 바시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구조물을 포함하는 포유동물 세포 시스템(예: COS, CHO, BHK, 293, 3T3)과 같은 미생물을 들 수 있지만 이로서 한정하는 것은 아니다. 필요한 경우, 암호화 영역의 뉴클레오타이드 서열은, 해독된 산물이 정확한 아미노산 서열을 보유하도록 숙주의 코돈 사용에 상응하도록 개질될 수 있다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현될 표적 유전자 단백질에 대해 의도한 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 상기 단백질이 항체 형성을 위해 제조되거나 펩타이드 라이브러리(library)를 선별하기 위한 경우, 용이하게 정제되는 접합 단백질 산물을 고도로 발현하는 것을 지향하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는, 표적 유전 단백질 암호 서열이 lacZ 암호화 영역을 포함하는 프레임내에서 벡터에 개별적으로 라이게이션되어 접합 단백질이 제조될 수 있는 이 콜라이 발현 벡터 pUR278(문헌[Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791] 참고); pIN 벡터(문헌[Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3108; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509] 참고) 등을 들 수 있지만 이로서 한정하는 것은 아니다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)를 보유한 접합 단백질로서 외계 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 이러한 접합 단백질을 가용성이고, 글루타티온-아가로즈 비드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재하에 용리시킴으로써 알칼리화 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 팩터 XA 프로테아제 절단 사이트를 보유하도록 고안되어서 클로닝 표적 유전자 단백질이 GST 잔기로부터 방출될 수 있다.
표적 유전자가 포유동물 숙주 세포내에서 발현되는 경우, 다수의 바이러스계 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 주목되는 표적 유전자 암호 서열은 다데노바이러스 전사/해독 조절용 착체, 예를 들어 후반 프로모터 및 3개로 갈라진 리더 서열에 라이게이션될 수 있다. 그다음, 이러한 키메라 유전자는 생체내 또는 시험관내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예: 영역 E1 또는 E3)내 삽입은 감염된 숙주내에서 생존가능하고 표적 유전자 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 형성할 것이다(예: 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659] 참조). 특이적 개시 신호는 또한 삽입된 표적 유전자 암호 서열의 효율적인 해독에 요구될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 이들 자체의 개시 코돈 및 인접 서열을 비롯한 전체 표적 유전자가 적당한 발현 벡터에 삽입되는 경우, 임의의 부가적인 해독 조절용 신호는 사용될 필요가 없다. 그러나, 표적 유전자 암호 서열의 일부만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 비롯한 외인성 해독 조절용 신호가 제공되어야 한다. 추가로, 개시 코돈은 전체 삽입부의 해독을 보장하기 위해서 목적하는 암호 서열의 해독 프레임을 포함하는 상내에 존재해야만 한다. 이러한 외인성 해독 조절용 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성을 비롯한 다양한 기원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 개선자용 요소, 전사 종결제 등을 도입함으로써 개선될 수 있다(문헌[Bitter et al., 1987, Methos in Enzymol. 153:516-544 ] 참고).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 요구되는 특이적 형태의 유전자 산물을 개질하고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 이러한 단백질 산물의 개질법(예: 글리코실화) 및 처리(예: 절단)은 단백질 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 후-해독 공정 및 개질화를 위한 특징적 및 특이적 기작을 보유한다. 적당한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외계 단밸질의 정확한 개질 및 처리를 보장하도록 선택될 수 있다. 이러한 목적에서, 유전자 산물의 일차 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적당한 공정을 위한 세포용 조직을 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다.
장기간 동안, 안정한 발현의 재조합 단백질을 고도의 수율도 생산하는 것이 바람직하다. 에를 들어, 안정하게 표적 유전자 단백질을 발현하는 세포주가 유전공학적으로 처리될 수 있다. 숙주 세포는 적당한 발현 조절용 요소(예: 프로모터, 개선제, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 조절된 DNA 및 선택가능한 마커에 의해 형질전환될 수 있다. 외계 DNA의 도입 이후에, 유전공학 처리된 세포를 증균 배지에서 1 내지 2일동안 성장시킨 후, 선택적인 배지로 대체하였다. 재조합 플라스미드내 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 플라스미드가 그들의 크로모좀 내부로 안정하게 통합되도록 세포를 유도하여, 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있는 부위를 형성하도록 성장한다. 이러한 방법은 표적 유전자 단백질을 발현하는 세포주를 처리하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이렇게 처리된 세포주는 표적 유전자 단백질의 내인성 활성을 유발하는 화합물을 선별하고 평가하는데 특히 유용할 수 있다.
tk-, hgprt-, 또는 aprt-세포에서 사용가능한 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(문헌[Wigler et al., 1977, Cell 11:223] 참고), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스페라제(문헌[Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026] 참조) 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제(문헌[Lowy et al., 1980, Cell 22:817] 참조) 유전자가 사용될 수 있지만, 이로서 한정하는 것은 아니다. 또한, 메토트렉세이트에 내성을 나타내는, dhfr 유전자(문헌[Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527] 참고); 미코페놀산에 대해 내성을 제공하는 gpt 유전자(문헌[Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072] 참고); 아미노글리코사이드 G-418에 대해 내성을 제공하는 neo 유전자(문헌[Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1] 참고); 및 하이그로마이센에 대해 내성을 제공하는 hygro 유전자(문헌[Santerre et al., 1984, Gene 30:147 ] 참고)에 대한 선택 기준으로서 사용될 수 있다.
선택적으로, 임의의 접합 단백질이 발현된 접합 단백질에 대해 특이적인 항체를 사용함으로써 용이하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 장크넷(Janknecht) 등에 의해 기술된 시스템은 인간 세포주에서 발현된 미-변성된 접합 단백질를 용이하게 정제가능하게 한다(문헌[Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976] 참고). 이러한 시스템에서, 주목하는 유전자는 백신 재조합 플라스미드로 서브클로닝되어 유전자의 개방 판독 프레임(open reading frame)이 6개의히스티딘 잔기로 구성된 아미노 말단 태그에 해독적으로 접합될 수 있다. 재조합 백신 바이러스로 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni2+니트릴로아세트산-아가로즈 컬럼상에 적하하고, 히스티딘-태그화 단백질은 이미다졸-함유 완충액에 의해 선택적으로 용리된다. 표적 유전자 산물의 카복시 말단에서의 접합 또한 의도된다.
본원에서 기술하는 바와 같은 분석 시스템내의 성분으로서 사용하는 경우, 표적 유전자 단백질은 직접적 또는 간접적으로 라벨링되어 표적 유전자 단백질과 시험용 물질간에 형성된 착체의 검출을 용이하게 할 수 있다. 이로서 한정하는 것은 아니지만125I와 같은 방사선 동위원소; 기질에 노출되는 경우 검출가능한 색상 신호 또는 광을 발생시키는 효소 라벨링 시스템; 및 발광 라벨을 비롯한 임의의 다양한 적당한 라벨링 시스템이 사용될 수 있다.
간접적 라벨링은 표적 유전자 산물에 특이적으로 결합된 라벨링 항체와 같은 단백질의 사용을 포함한다. 이러한 항체로는 다클론성 항체, 단클론성 항체(mAbs), 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 분절, F(ab')2분절, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 분절, 항개별특이성(anti-I) 항체, 및 전술한 것의 에피토프-결합 분절을 들 수 있지만, 이로서 한정하는 것은 아니다.
확인된 표적 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 표적 유전자 단백질을 발현시킨 후, 단백질을 정제한다. 단백질 정제 기법은 당해 분야에 공지되어 있다. 확인된 외인성 뉴클레오타이드 서열 17로부터 암호화되고 발현된 단백질은 침전법, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜에 의한 침전법을 사용하여 부분적으로 정제될 수 있다. 선택적으로, 단백질의 에피토프 태그화는 단백질의 간단한 1단계 정제에 사용될 수 있다. 또한, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 하이드록시아팹타이트 컬럼, 부동화 반응성 염료, 크로마토포커스화의 사용, 및 고성능 액체 크로마토그래피의 사용과 같은 크로마토그래피 방법을 사용하여 단백질을 정제할 수 있다. 1차원 겔 전기영동, 고 해상도의 2차원 폴리아크릴아미드 전기영동, 등전압 포커스화, 및 그밖의 방법과 같은 전기영동 방법을 정제 방법으로서 주목할 수 있다. 또한, 고상 결합된 항체, 리간드 존재 컬럼 및 그밖의 친화 크로마토그래피를 비롯한 친화 크로마토그래피 방법이 본 발명의 정제 방법으로 주목할 수 있다.
또한, 정제된 표적 유전자 산물, 이들의 분절, 또는 이들의 유도체를 약학적으로 허용가능한 담체에서 개인에게 투여하여 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 바람직하게, 면역 반응은 개인을 보호하는 보호용 면역 반응이다. 단백질(아쥬번트를 포함함) 및 약학적으로 허용가능한 담체의 적당한 투여량을 결정하는 방법은 당해 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
5.4.4 표적 유전자 산물에 대해 특이적 항체
전술한 하나 이상의 표적 유전자 산물의 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 제조하기 위한 방법이 본원에 개시되어 있다. 이러한 항체로는 다클론성 항체, 단클론성 항체(mAbs), 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 분절, F(ab')2분절, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 분절, 항개별특이성(anti-Id) 항체, 및 전술한 것의 에피토프-결합 분절을 들 수 있지만이로서 한정하는 것은 아니다.
항체를 표적 유전자 또는 유전자 산물로 생산하기 위해서, 다양한 숙주 동물은 표적 유전자 단백질 또는 이들의 일부를 주사함으로써 면역화될 수 있다. 이러한 숙주 동물은 토끼, 마우스, 및 래트를 들 수 있으며 이로서 한정하는 것은 아니다. 이로서 한정하는 것은 아니지만 플룬드(Freund's)(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 라이졸렉틴과 같은 표면 활성화제, 플루론계 폴리올, 다가음이온, 폴리펩타이드, 오일 유화제, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트, 예를 들어 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및코리네박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)와 같은 다양한 아쥬반트가 숙주 종에 따른 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단리된 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 63 내지 123의 6개 이상의 연속성 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 면역성 조성물을 동물에게 도입하는 단계를 포함하는, 동물내 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다.
다가클론성 항체가 표적 유전자 산물과 같은 항원 또는 이들의 항원 작용성 유도체에 의해 면역화된 동물의 동일개체로부터 유도된 항체 분자의 외인성 집단이다. 다가클론성 항체의 제조를 위해, 전술한 바와 같은 숙주 동물은 전술한 바와 같은 아쥬반트에 의해 보충된 차등적 발현 또는 일련의 유전자 산물을 주입함으로써 면역화할 수 있다. 면역화된 동물내 항체 역가는 부동화 폴리펩타이드를 사용하는 효소 면역 측정법(ELISA)와 같은 표준 기법에 의해 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 목적하는 경우, 항체 분자는 동물(예: 혈액)으로부터 분리될 수 있고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 공지된 기법에 의해 추가로 정제되어 IgG 분획을 수득할 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 균질화 집단이 배양액내 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 요구하는 임의의 기법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 방법으로는 콜레러 및 밀스타인의 하이브리도마(hybridoma) 기법(문헌[1975, Nature 256:495-497; 및 미국 특허 제 4,376,110] 참고), 인간 B-세포 하이브리도마 기법(문헌[Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030] 참조) 및 EBV-하이브리도마 기법(문헌[Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96] 참조)을 들 수 있지만, 이로서 한정하는 것은 아니다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 임의의 하위부류를 비롯한 임의의 면역글로블린 부류일 수 있다. 본 발명의 mAb를 제조하는 하이브리도마는 생체내 또는 시험관내에서 배양할 수 있다. 생체내에서 높은 역가의 mAbs를 생산함으로써 현존하는 바람직한 제조 방법이 되도록 한다.
단클론성 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 것에 대체 방법으로서, 본 발명의 폴리펩타이드를 지향하는 단클론성 항체가, 주목하는 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 조합성 면역글로불린 라이브러리(예: 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 선별함으로써 확인되어 분리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 발생하여 선별하기 위한 키트가 시판중이다(예: 파마시아 재조합 파지 항체시스템(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System), 카다로그 번호 제 27-9400-01; 및 스트라타젠(Stratagene) SurfZAP(등록상표) 파지 디스플레이 키트, 카다로그 번호 제 240612 호). 추가로, 항체 디스플레이 라이브러리를 발생하고 선별하는데 사용하는데 특히 익숙한 방법 및 시약의 예는, 예를 들어 미국 특허 제 5,223,409 호, 국제특허 공개공보 제 WO 92/18619 호; 국제특허 공개공보 제 WO 91/17271 호; 국제특허 공개공보 제 WO 92/20791 호; 국제특허 공개공보 제 WO 92/15679 호; 국제특허 공개공보 제 WO 93/01288 호; 국제특허 공개공보 제 92/01047 호; 국제특허 공개공보 제 92/09690 호; 국제특허 공개공보 제 WO 90/02809 호; 푸츠(Fuchs) 등의 문헌[(1991) Bio/Technology 9:1370-1372], 헤이(Hay) 등의 문헌[(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85], 휴즈(Huse) 등의 문헌[(1989) Science 246:1275-1281]; 크리피쓰(Griffiths) 등의 문헌[(1993) EMBO J. 12:725-734]에서 찾을 수 있다.
또한, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성될 수 있는 것으로, 키메라 항체 및 인간화적 단클론 항체와 같이, 인간 및 비인간 부분을 모두 포함하는 재조합 항체는 본 발명의 범주에 포함된다. 쥐과의 mAb 및 인간의 면역 글로불린 불변 부위로부터 유래된 다양한 부위를 갖는 분자와 같이, 키메라적 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 상이한 부위를 포함하는 분자이다(예: 본원에 참조문헌에 포함되는, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제 4,815,567 호; 및 보스(Boss) 등의 미국 특허 제 4,816397 호를 참조한다.). 인간화적 항체는 비인간 종으로부터의 상호보완적 결정 지역(CDRs) 하나 이상 및 인간 면역 글로불린 분자로부터의 골격 부위를갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다(본원의 참조문헌에 포함되는, 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제 5,585,089 호를 참조한다.). 이러한 키메라적 단클론 항체 및 인간화적 단클론 항체는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술, 예를 들어, PCT 출원 국제 공개공보 제 WO 87/02671 호; 유럽 특허 출원 제 184,187 호; 유럽 특허 출원 제 171,496 호; 유럽 특허 출원 제 173,494 호; PCT 출원 국제 공개공보 제 WO 86/01533 호; 미국 특허 제 4,816,567 호; 유럽 특허 출원 제 125,023 호; 베터(Better) 등의 문헌[(1998) Science 240:1041-1043]; 리우(Liu) 등의 문헌[(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443]; 리우 등의 문헌[(1987) J. Immunol. 139:3521-3526]; 선(Sun) 등의 문헌[(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218]; 니시무라(Nishimura) 등의 문헌[(1987) Canc. Res. 47:999-1005]; 우드(Wood) 등의 문헌[(1985) Nature 314:446-449]; 및 쇼우(Shaw) 등의 문헌[(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1533-1559]; 모리슨(Morrison) 등의 문헌[(1985) Science 229:1202-1207]; 오이(Oi) 등의 문헌[(1986) Bio/Techniques 4:214]; 미국 특허 제 5,225,539 호; 존스(Johnes) 등의 문헌[(1986) Nature 321:552-525]; 베르호이안(Verhoeyan) 등의 문헌[(1988) Science 239:1534]; 및 베들러(Beidler) 등의 문헌[(1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료에 특히 바람직하다. 이러한 항체는, 내인성 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시킬 수는 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시킬 수 있는 형질전환 쥐를 사용하여 제조될 수 있다. 상기형질전환 쥐는 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 전체 또는 일부분을 사용하여 표준 방식으로 면역화된다. 상기 항원에 대해 지정된 단클론 항체는 종래의 하이브리도마 기술에 의해 수득될 수 있다. 형질전환 쥐에 의해 서식된 인간 면역 글로불린 전이 유전자는 B 세포 분화 동안 재배열하고, 이어서 종 전환 및 체세포 돌연변이를 일으킨다. 따라서, 상기 기술을 사용함으로서, 치료용으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 제조할 수 있다. 인간 항체의 제조를 위한 상기 기술은 론버그(Lonberg) 및 휴저(Huszar)의 문헌[1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론 항체를 제조하기 위한 상기 기술 및 상기 항체를 제조하기 위한 프로토콜에 대한 상세한 논의는, 예를 들어 미국 특허 제 5,625,126 호; 미국 특허 제 5,633,425 호; 미국 특허 제 5,569,825 호; 미국 특허 제 5,661,016 호; 및 미국 특허 5,545,806 호를 참조한다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "유도 선택(guided selection)"으로 지칭되는 기술을 사용하여 발생시킬 수 있다. 이 방법에서, 선택된 비인간 단클론 항체, 예를 들어 쥐의 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는데 사용된다(제스퍼스(Jespers) 등의 문헌[(1994) Bio/Technology 12:899-903]을 참조한다).
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술을 사용하여 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2단편, 및 상기 F(ab')2단편의 이황화물 다리를 환원시켜 발생시킬 수 있는Fab 단편을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 다르게는, Fab 발현 라이브러리를 구성하여(휴즈(Huse) 등의 문헌[1989, Science 246:1275-1281]을 참조한다) 목적하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 표적 유전자 산물에 대한 결합 친화도의 측면에서 기술되거나 설명될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 5 × 10-6M, 10-6M, 5 × 10-7M, 10-7M, 5 × 10-8M, 10-8M, 5 × 10-9M, 10-9M, 5 × 10-10M, 10-10M, 5 × 10-11M, 10-11M, 5 × 10-12M, 10-12M, 5 × 10-13M, 10-13M, 5 × 10-14M, 10-14M, 5 × 10-15M, 10-15M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 결합 친화도를 포함한다.
다양한 주변 조건하에서, 상이한 형태론적 형태(균사체, 효모, 포자) 및 상이한 유기체의 생명 주기 단계의 폴리펩타이드의 존재비 및 발현 경향을 평가하기 위하여, 표적 유전자 산물을 감지하는데 표적 유전자 산물 또는 이들의 단편에 대해 지정된 항체를 사용할 수 있다. 표적 유전자 산물 또는 이들의 단편에 대해 지정된 항체는, 임상 시험 과정의 일부분으로서 감염된 숙주의 조직 내의 표적 유전자 산물의 단계를 감시하여, 예를 들어 설정된 처리 요법의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다. 감지가능한 기질에 상기 항체를 결합시킴으로써 감지를 촉진시킬 수 있다. 감지가능한 기질의 예는 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적당한 효소의 예는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알카리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는아세틸콜린스테라제를 포함하고; 적당한 보철 그룹 복합물의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적당한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루레신, 플루레신 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물 발광 물질의 예는 루시페라아제, 루시페린 및 애쿠오린(aequorin)을 포함하고; 적당한 방사성 물질의 예는125I,131I,35S 또는3H를 포함한다.
또한, 표적 유전자 산물 또는 이들의 단편에 대해 지정된 항체는 감염을 방지하고/하거나 병원균 성장을 억제하여 전염성 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 항체는 표적 유전자 산물의 생물학적 활성을 개질하는데 사용될 수 있다. 또한, 독성 또는 병인성에 관련된 유전자 산물에 대한 항체는 감염을 방지하고, 유기체에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 완화시키는데 사용될 수 있다. 이들의 치료 효과를 촉진하기 위해, 독소 또는 살균제와 같은 치료용 잔기에 항체(또는 이들의 단편)를 결합시킬 수 있다. 항체에 치료용 잔기를 결합시키기 위한 기술은 익히 공지되어 있다(예: 토르페(Thorpe) 등의 문헌["The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58(1982)]을 참조한다).
치료용 잔기가 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체는 단독으로 또는 화학 요법제와 결합하여 투여되는 치료제로서 사용될 수 있다.
5.4.5 안티센스 분자
유전자 발현의 억제제로서 안티센스 분자를 사용하는 것은, 특이적, 유전성 관련 치료법일 수 있다(문헌[Stein, in Ch. 69, Section 5 "Cancer: Principle and Practice of Oncology", 4th ed., by DeVita et al., J.B. Lippincott, Philadelphia 1993]을 참조한다). 본 발명은 표적 필수 유전자 또는 독성 유전자 또는 이들의 일부분에 대해 안티센스인 6개 이상의 뉴클레오타이드의 핵산을 사용하는 치료법 또는 예방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "안티센스" 표적 핵산은, 일부 서열 상보성의 힘으로 표적 유전자 RNA(바람직하게는 mRNA이다)의 일부분에 하이브리드화될 수 있는 핵산을 의미한다. 또한, 본 발명은, 후술되는 바와 같이, 약학적으로 허용될 수 있는 보균자 내에 본 발명의 안티센스 핵산을 효과량 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 관심있는 유기체 내의 표적 유전자, 예를 들어 본 발명의 안티센스 핵산을 포함하는 조성물을 효과량 사용한 세포의 제공을 포함하는 시험관내 또는 생체내의 C. 알비칸스의 발현을 억제하는 방법을 교시한다. 상이한 표적 유전자에 하이브리드화 가능한 다중 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 재조합되어, 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법, 즉 필수 유전자로부터 전사된 mRNA의 해독을 억제하는 안티센스 RNA 분자가 조절가능한 촉진제로부터 발현되는 방법에 따라 확인된 필수 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 실시양태의 한 양상에서, 안티센스 RNA 분자는, 칸디다 알비칸스의GRACE(GRACE)주 또는 또다른 이중 병인성 유기체로부터 구성된 또다른 GRACE주에서 발현된다. 본 실시양태의 다른 양상에서, 안티센스 RNA 분자가 야생형 또는 칸디다 알비칸스 또는 또다른 이중 병인성 유기체의 비-GRACE 균주에서 발현되며, 상기 유기체는 아스페르킬루스 퍼미가투스, 아스페르킬루스 니게르, 아스페르킬루스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실롭시스, 칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오이데스 임미티스균, 엑소팔리아 더마티디티스, 푸사리움 옥시스포럼, 히스토플라스마 캡슐라툼, 뉴모시스티스 카리니, 트리코스포론 바이겔리, 리조푸스 아르히주스, 무코 룩시, 리조무코 푸실러스, 또는 압시디아 코림비게라와 같은 동물균 병원체, 또는 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis,) 매그나포테 그리세아, 푸치니아 레코디타, 셉토리아 트리티치, 틸레티아 콘트로버사, 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydiss)와 같은 식물 균 병원체, 또는 상기 종들의 임의의 유전자들에 포함되는 임의의 종을 포함한다.
본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 표적 유전자 mRNA의 암호화 부위 및/또는 비암호화 부위에 보완적일 수 있다. 상기 안티센스 분자는 상보성 표적 유전자 mRNA 전사에 결합되고 해독을 감소 또는 방해할 것이다. 절대 상보성은, 바람직하더라도 요구되지 않는다. 본원에서 사용되는, RNA의 일부분에 대해 "상보적"인 서열은 RNA와 하이브리드화되어 안정한 쌍가닥을 형성할 수 있을 만큼 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미한다; 이중쇄 안티센스 핵산의 경우에는, 쌍가닥 DNA 중 하나의 가닥이 시험되거나 3중 가닥의 형성이 시도될수 있다. 하이브리드화 능력은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길이에 좌우될 것이다. 당해 분야의 숙련자들은 표준 방법을 사용하여 하이브리드된 복합물의 융점을 측정함으로써 허용가능한 불일치 정도를 확인할 수 있다.
메시지의 제 5 말단, 예를 들어 제 5 미해독 서열까지 상보적이고, AUG 개시 코돈을 포함하는 핵산 분자는 해독의 억제시 최고의 효력을 발휘해야 한다. 그러나, 최근에 mRNA의 제 3 미해독 서열에 대해 상보적인 서열 또한 mRNA 해독 억제시 효율적인 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 바그너, 알(Wagner, R)의 문헌[1994, Nature 372:333-335]을 참조한다.
mRNA의 제5 미해독 부위에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 AUG 출발 코돈의 보체를 포함할 수 있다. mRNA 암호화 부위에 대해 상보적인 안티센스 핵산 분자는 해독 억제에 덜 효율적이나 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 표적 유전자 mRNA의 제 5, 제 3 또는 암호화 부위에 하이브리드화되도록 고안되었는지의 여부에 관계 없이, 안티센스 핵산은 6개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 가져야 하며, 바람직하게는 6 내지 약 50 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 특정 양태에서는, 상기 올리코뉴클레오타이드가 10 뉴클레오타이드 이상, 17 뉴클레오타이드 이상, 25 뉴클레오타이드 이상, 50 뉴클레오타이드 이상, 또는 200 뉴클레오타이드 이상이다.
표적 유전자 서열의 선택과 무관하게, 우선 시험관내 연구를 수행하여 유전자 발현을 억제하는 안티센스 분자의 능력을 측정하는 것이 바람직하다. 상기 연구는 안티센스 유전자 억제 및 올리고뉴클레오타이드의 비특이성 생물학적 효과를구별하기 위한 대조군을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 연구는 표적 RNA 또는 단백질의 수준과 내부의 대조 RNA 또는 단백질의 수준을 비교하는 것이 바람직하다. 추가로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수득된 결과와 대조 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수득된 결과를 비교하도록 계획한다. 대조 올리고뉴클레오타이드는 시험 올리고뉴클레오타이드와 동일한 길이이고, 안티센스 서열과 상이한 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 표적 서열에 대한 특이성 하이브리드화를 방지하는데 필수적인 것이 바람직하다.
상기 안티센스 분자는 DNA 또는 RNA 또는 키메라적 혼합물 또는 유도체 또는 이들의 개질된 형태, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 안티센스 분자는 염기 잔기, 당 잔기, 또는 인산염 골격에서 개질되어, 예를 들어 분자의 안정성 및 하이브리드화 등을 개선시킬 수 있다. 안티센스 분자는, 펩타이드(예: 생체내 세포 수용체를 표적화하기 위한), 하이브리드화-유발 분해제(크롤(Krol) 등의 문헌[1998, Bio Techniques 6:958-976]을 참조한다) 또는 중격제(존(Zon) 등의 문헌[1988, Pharm. Res. 5:539-549]을 참조한다)와 같은 기타 추가 그룹을 포함할 수 있다. 마지막으로, 안티센스 분자는 또다른 분자, 예를 들어 펩타이드, 하이브리드화 유발 교차결합제, 운반제 및 하이브리드화 유발 분해제 등에 결합될 수 있다.
상기 안티센스 분자는, 5-플루오로우라실, 5-브로무우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노신큐에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 수도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나 이들로 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된, 개질된 염기 잔기를 하나 이상 포함할 수 있다.
또한, 안티센스 분자는 아라비노스, 2-플로오로아라비노스, 자일루로스 및 헥소스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된 개질된 당 잔기를 하나 이상 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 안티센스 분자는, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 이들의 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택된, 개질된 인산염 골격을 하나 이상 포함한다.
또다른 실시양태에서, 안티센스 분자는 α-아노머 올리고뉴클레오타이드이다. α-아노머 올리고뉴클레오타이드는 일반적인 β-단위와 달리 각 가닥이 서로 평행한 상보성 RNA 특이성 이중쇄 하이브리드를 형성한다(고티에르(Gautier) 등의 문헌[1987, Nucl. Acid Res. 15:6625-6641]을 참조한다). 상기 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메틸리보뉴클레오타이드(이노우에(Inoue) 등의 문헌[1987, Nucl. Acid Res, 15:6131-6148]을 참조한다) 또는 키메라적 RNA-DNA 유사체(이노우에 등의 문헌[1987, FEBS Lett. 215:327-330]을 참조한다)이다.
본 발명의 안티센스 분자는 당해 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어 자동화 DNA 합성기(예: 바이오서치(Biosearch) 및 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 등에서 시판중임)를 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오네이트 올리고뉴클레오타이드는 스테인(Stein) 등의 방법(문헌[1988, Nucl. Acids Res. 16:3209])에 의해 합성될 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 제어된 동공을 갖는 유리 중합체 지지체(사린(Sarine) 등의 문헌[1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451]) 등을 사용하여 제조될 수 있다.
표적 유전자의 암호화 부위에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드가 사용될 수 있지만, 전사된 미해독 부위에 대해 상보적인 뉴클레오타이드가 또한 바람직하다.
약학적으로 허용가능한 보균자 내에 효과량의 안티센스 핵산을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 관심있는 병원체로 감염된 대상에 투여될 수 있다.
병원체에 의해 유발된 특정 질병의 치료에 효능을 가질 안티센스 핵산의 양은 감염의 위치 또는 조건에 좌우되고, 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 가능하다면, 시험관내 치료되는 병원체의 안티센스 세포분열을 측정하고, 이어서 인체에 시험 및 사용하기 전에 유용한 동물 모델 시스템에서 처리하는 것이 바람직하다.
안티센스 DNA 또는 RNA를 세포로 전달하기 위해 여러 가지 방법들이 개발되어 왔다; 예를 들어, 병원체가 거주하는 조직 부위에 안티센스 분자를 직접 주입할 수 있다. 또는 목적하는 세포를 표적화하도록 고안된, 개질된 안티센스 분자(예컨대, 병원체의 세포 표면 위에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 항체에 결합된 안티센스 분자)를 전신 투여할 수 있다. 안티센스 분자는 전달 복합물에 의해 목적하는 세포 집단으로 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자의 안티센스 핵산을 포함하는 약학 조성물은 생물 중합체(예: 폴리-β-1-4-N-아세틸글루코스아민 폴리사카라이드), 리포좀, 미립자, 또는 미소캡슐에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 안티센스 핵산의 일관된 방출을 달성하기 위하여, 상기 조성물을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서는, 특정 확인가능한 병원체 항원에 대한 항체를 통해 표적화된 리포좀을 이용하는 것이 바람직할 수 있다(레오네티(Leonetti) 등의 문헌[1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2448-2451]; 레네이젠(Renneisen) 등의 문헌[1990, J. Bio. Chem. 265:16337-16342]을 참조한다).
5.4.6 라이보자임 분자
라이보자임은 RNA의 특이성 분해를 촉매화할 수 있는 효소성 RNA 분자이다(예: 로시(Rossi), J. 등의 문헌[1994, Current Biology 4:469-471]을 참조한다). 라이보자임 활성의 메커니즘은 상보성 표적 RNA에 대한 라이보자임 분자의 서열 특이성 하이브리드화 및 이어서 발생하는 엔도뉴클레오타이드성 분해이다. 라이보자임 분자의 조성물은 표적 유전자 mRNA에 대해 상보성인 서열을 하나 이상 포함해야 하고, mRNA 분해에 응답하는 익히 공지된 촉매성 서열을 포함해야 한다. 상기 서열(미국 특허 제 5,093,246 호를 참조한다)은 모두 본원의 참조문헌에 포함된다. 이에 따라, 본 발명의 범주 안에서 표적 유전자 단백질을 부호화하는 RNA 서열의 엔도뉴클레오타이드성 분해를 특이적 및 효율적으로 촉매화하는, 망치머리형 모티프 라이보자임을 다룬다.
또한, 표적 유전자 mRNA의 해독 및 표적 유전자의 발현을 방지하기 위해 특이성 표적 유전자 mRNA 전사를 촉매적으로 분해하도록 고안된 라이보자임 분자를 사용할 수 있다. 표적 유전자 mRNA를 분열하기 위해서는 특정 인식 서열의 위치에서 mRNA를 분해하는 라이보자임을 사용할 수 있지만, 망치머리형 라이보자임을 사용하는 것이 바람직하다. 망치머리형 라이보자임은 표적 유전자 mRNA와의 상보 염기쌍을 형성하는 측면 부위에 의해 표시되는 위치에서 mRNA를 분해한다. 유일한 요건은 표적 mRNA가 2개의 염기가 하기의 서열을 갖는 것이다: 5'-UG-3'. 망치머리형 라이보자임의 구성 및 제조는 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 하셀로프(Haseloff) 및 거라치(Gerlach)의 문헌[1988, Nature, 334: 585-591]에 보다 상세히 기술되어 있다. 바람직하게는, 라이보자임은, 분해 인식 위치가 표적 유전자 mRNA의 제 5 말단 근처에 위치하도록, 즉, 효율성을 증가시키고 비-작용성 mRNA 전자의 세포내 축적을 최소화하도록 처리된다.
또한, 본 발명의 라이보자임은, 테트라히메나 테르포필라(Tetragymena thermophila)(IVS 또는 L-19 IVS RNA로 공지됨) 내에서 자연적으로 발생하고, 토마스 세치(Thomas Cech) 등에 의해 광범위하게 기술된 것(조그(Zaug) 등의 문헌[1984, Science, 224:574-578]; 조그 및 세치의 문헌[1986, Science, 231:470-475]; 조그 등의 문헌[1986, Nature, 324:429-433]; 유니버시티 페이턴트 인코포레이티드(University Patent Inc.)의 국제 공개공보 제 WO 88/04300 호; 빈(Been) 및 세치의 문헌[1986, Cell, 47:207-216])과 같은 RNA 엔도리보뉴클리아제(이후로 "세치형 라이보자임"으로 지칭됨)를 포함한다. 세치형 라이보자임은, 표적 RNA의 분해가 발생한 위치에, 표적 RNA 서열에 하이브리드화되는 8개의 염기쌍 활성 위치를 갖는다. 본 발명은 표적 유전자 내에 존재하는 8개의 염기쌍 활성 위치 서열을 표적화하는 세치형 라이보자임을 포함한다.
안티센스 방법에서와 같이, 상기 라이보자임은 개질된 올리고뉴크레오티드(예컨대, 개선된 안정성 및 표적화 등을 위한)로 구성될 수 있고, 생체내 표적 유전자를 발현하는 세포로 전달되어야 한다. 안티센스 분자와 달리, 라이보자임은 촉매이기 때문에, 효율성 측면에서 보다 낮은 세포내 농도가 요구된다. 상이한 표적 유전자에 대해 지정된 다중 라이보자임 분자는 재조합되어, 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
본 발명의 안티센스 RNA 및 DNA, 라이보자임 및 삼중나선 분자는 DNA 및 RNA 분자의 합성을 위해 당해 분야의 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이이들은 예를 들어, 고체상 포스포르아미다이트 화학적 합성과 같이, 당해 분야에 익히 공지된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 올리고리보뉴클레오타이드의 화학적 합성 기술을 포함한다. 다르게는, 안티센스 RNA 분자를 부호화하는 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 전사에 의해 RNA 분자를 발생시킬 수 있다. 이러한 DNA 서열은, T7 또는 SP6 중합효소 촉진제와 같은, 적당한 RNA 중합효소 촉진제를 포함하는광범위한 매개체에 포함될 수 있다. 다르게는, 사용된 촉진제에 따라, 안티센스 RNA를 구성적 또는 유도적으로 합성하는 안티센스 cDNA 구성은 세포 라인 속에 안정적으로 도입될 수 있다. 이러한 핵산 구성은 전달 복합체를 통해 목적하는 세포 집단으로 선택적으로 투여될 수 있다.
익히 공지된 DNA 분자의 개질은 세포내 안정성 및 반감기를 증가시켜 도입될 수 있다. 가능한 개질은, 분자의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 리보- 또는 데옥시 뉴클레오타이드의 플랭킹 서열의 첨가, 또는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 골격 내에 포스포디에스테라아제 연결부가 아닌 포스포로티오네이트 또는 2' O-메틸을 사용하는 것을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
5.5 선별 측정
하기 평가는 표적 유전자 산물, 표적 유전자 산물과 상호작용하는 기타 세포 단백질, 및 표적 유전자 산물과 기타 세포 단백질의 상호작용을 억제하는 화합물에 결합된 화합물을 규명하도록 고안된다. 이러한 방법을 통해 규명된 화합물은, 본 발명의 표적 유전자에 의해 부호화된 폴리펩타이드의 활성을 조정하는(즉, 화합물의 부재시 관찰되는 활성과 비교하여 활성을 증가시키거나 감소시키는) 화합물을 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 방법을 통해 규명된 화합물은 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조정하는(즉, 상기 화합물의 부재시 관찰되는 발현 정도와 비교하여, 발현을 증가시키거나 감소시키는) 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법을 통해 규명된 화합물과 같은 화합물의 조정/발현 능력은 당해 분야의 숙련자들에게 익히 공지된 표준 평가에 의해 시험될 수 있다.
따라서, 본 발명은 복수개의 화합물을 선별하여, SEQ ID NO: 1 내지 61로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 사카로마이세스 세레비시에에서 자연적으로 발생하고 SEZ ID NO: 1 내지 61로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자의 오르토로그인 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 유전자 산물의 활성 또는 수준을 조정하는 화합물을 규명하기 위한 방법을 제공한다.
5.5.1 시험관내 선별 측정
시험관내 시스템은 본 발명의 표적 유전자 산물을 결합시킬 수 있는 화합물을 규명하도록 고안된다. 이러한 방식으로 규명된 화합물은, 예를 들어 야생형 표적 유전자 산물 및/또는 돌연변이 표적 유전자 산물의 활성을 조정하는데 유용하고, 표적 유전자 산물의 생물학적 작용을 밝히는데 유용하고, 정상 표적 유전자 산물의 상호작용을 방해하지 않는 기타 화합물을 규명하기 위한 선별에 사용되거나, 상기 상호작용을 억제하기 위해 그들 자체로서 유용하다.
표적 유전자 산물에 결합하는 화합물을 규명하는데 사용되는 상기 측정의 원리는 표적 유전자 산물을 포함하는 반응 혼합물 및 여러 조건하에서의 시험 화합물을 제조하고, 두 성분이 상호작용 및 결합하기에 충분한 시간을 허용하고, 이로써 복합물을 형성하고, 반응 혼합물 내에서 제거되고/되거나 감지되는 복합물을 형성하는 것이다. 상기 측정은 다양한 방식으로 수행된다. 예를 들어, 한가지 방법은 표적 유전자 산물 또는 시험 기질을 고체상에 고정하고, 분자간 결합 반응을 통해 반응 종결시 고체상에 고정된 표적 유전자 산물/시험 화합물 복합물을 감지한다.이러한 방법의 한가지 실시양태에서, 표적 유전자 산물은 고체상에 고정되고, 고정되지 않은 시험 화합물은 직접 또는 간접적으로 라벨링된다.
수행중, 고체상으로서 마이크로티터 플레이트를 통상적으로 사용한다. 고정된 성분은 비공유 또는 공유 부착에 의해 고정화된다. 비공유 부착은 단백질 용액으로 고체 표면을 간단하게 코팅하고, 코팅된 표면을 건조함으로써 수행될 수 있다. 다르게는, 고체 표면에 단백질을 고정하기 위해, 고정화될 단백질에 특이성을 갖는 고정화된 항체, 바람직하게는 단클론 항체를 사용한다.
상기 평가를 수행하기 위해, 비고정화된 성분을 고정된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가한다. 반응이 완결된 후, 임의의 형성된 복합물이 고체 표면 위에 고정화된채 유지되게 하는 조건에서 미반응 성분을 제거한다(예컨대, 세척에 의해). 고체 표면상에 고정된 복합물의 감지는 여러 방법으로 수행된다. 앞서 비고정화된 성분이 예비라벨링되는 반면, 표면상에 고정화된 라벨링의 감지는 복합물이 형성되었음을 표시해준다. 미리 비고정화된 화합물이 예비라벨링되지 않는 경우에는, 표면상에 고정된 복합물을 감지하는데 간접적 라벨링이 사용된다; 예를 들어, 미리 비고정화된 성분에 특이성을 갖는 라벨링된 항체를 사용한다(항체는, 라벨링된 안티-Ig 항체로 직접 또는 간접적으로 교대 라벨링된다).
다르게는, 반응을 액체상에서 수행하고, 반응 산물을 미반응 성분으로부터 분리하고, 복합물을 감지(예컨대, 표적 유전자 산물 또는 시험 화합물에 특이성을 갖는 고정화된 항체를 사용한다)하여 용액내 형성된 복합물을 고정하고, 상기 복합물의 기타 성분에 특이성을 갖는 항체에 제 2 라벨링하여 고정된 복합물을 감지한다.
5.5.1.1 표적 유전자 산물과 상호작용하는 단백질을 대한 분석
신규한 표적 단백질-세포 또는 세포외 단백질 상호작용을 동정하기 위해 단백질-단백질 상호작용을 검출하기에 적합한 임의의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 표적 유전자 산물은 생체내에서 하나 이상의 세포 또는 세포외 거대분자, 예를 들면 단백질과 상호작용한다. 이러한 거대분자는 위에서 기술한 방법과 같은 방법을 통해 동정된 단백질 및 핵산 분자를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 이러한 논의를 위해, 이러한 세포 및 세포외 거대분자는 본원에서 "결합 파트너"로 지칭된다. 이러한 상호작용을 붕괴시키는 화합물은 표적 유전자 단백질, 특히 돌연변이 표적 유전자 단백질의 활성을 조절하는데 유용할 수 있다. 이러한 화합물은 기술한 바와 같이 항체, 펩타이드 등과 같은 분자를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
표적 유전자 산물과 그의 세포 또는 세포외 결합 파트너 또는 파트너들 사이의 상호 작용을 방해하는 화합물을 동정하는데 사용되는 분석 시스템의 기초 원리는 표적 유전자 산물 및 결합 파트너가 상호작용하고 결합시키기에 충분한 조건 및 시간동안 이들 둘을 함유한 반응 혼합물을 제조하여 착체를 형성하는 것을 포함한다. 억제 활성을 위한 화합물을 시험하기 위해, 반응 혼합물은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 제조된다. 시험 화합물은 초기에 반응 혼합물에 포함되거나 표적 유전자 산물 및 그의 세포 또는 세포외 결합 파트너의 첨가 후 첨가된다. 대조 반응 혼합물은 시험 화합물 없이 항온처리된다. 이어서, 표적 유전자 단백질과 세포또는 세포외 결합 파트너 사이의 착체의 형성이 검출된다. 시험 화합물을 함유한 반응 혼합물이 아닌 대조 반응에서 착체의 형성은 화합물이 표적 유전자 단백질과 상호작용성 결합 파트너의 상호작용을 방해하는 것을 나타낸다. 추가로, 시험 화합물 및 일반 표적 유전자 단백질을 함유한 반응 혼합물 내에서의 착체 형성은 또한 시험 화합물 및 돌연변이 표적 유전자 단백질을 함유한 반응 혼합물내에서의 착체 형성과 비교될 수 있다. 이러한 비교는 일반 표적 유전자 단백질이 아닌 돌연변이 표적 유전자 단백질을 포함하는 분자내 상호작용을 붕괴시키는 화합물을 동정하는 것이 바람직한 경우 중요할 수 있다.
표적 유전자 산물 및 결합 파트너의 상호작용을 방해하는 화합물을 위한 분석은 이형 또는 동종 형태로 수행된다. 이형 분석은 표적 유전자 산물 또는 결합 파트너를 고상위로 앵커링하는 단계 및 고상에 앵커링된 착체를 반응 종료시 검출하는 단계를 포함한다. 동종 분석에서, 전체 반응은 액상에서 수행된다. 두 방식에서, 반응물의 첨가 순서는 시험되는 화합물에 관한 상이한 정보를 얻기 위해 변화된다. 예를 들면, 표적 유전자 산물 및 결합 파트너 사이의 상호작용을 예를 들면 경쟁에 의해 방해하는 시험 화합물은 시험 물질의 존재하에 반응을 수행함으로써, 즉 표적 유전자 단백질 및 상호작용 세포 또는 세포외 결합 파트너를 첨가하기 전에 또는 이와 동시에 시험 물질을 반응 혼합물에 첨가함으로써 동정된다. 다르게는, 예비형성된 착체를 붕괴시키는 시험 화합물, 예를 들면 착체로부터 성분 중 하나를 치환하는 높은 결합 상수를 갖는 화합물은 착체 형성 후 시험 화합물을 반응 혼합물에 첨가함으로써 시험된다. 다양한 형태가 이하 간단하게 기술된다.
이형 분석 시스템에서, 표적 유전자 단백질 또는 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너는 고체 표면위로 앵커링되고, 앵커링되지 않은 종은 직접 또는 간접적으로 라벨링된다. 실행에서, 마이크로역가 판을 사용하는 것이 편리하다. 앵커링된 종은 비공유 또는 공유 결합에 의해 고정된다. 비공유 결합은 단순히 고체 표면을 표적 유전자 산물의 용액으로 피복되거나 파트너를 결합시키고 피복된 표면을 건조시킴으로써 수행된다. 다르게는, 앵커링된 종에 대해 특이성인 고정된 항체는 종을 고체 표면에 앵커링하는데 사용된다. 표면은 미리 제조되고 저장될 수 있다.
분석을 수행하기 위해, 고정된 종의 파트너는 시험 화합물을 갖거나 갖지 않는 피복된 표면에 노출된다. 반응 완료 후, 반응하지 않은 성분은 제거되고(예를 들면, 세척에 의해) 형성된 임의의 착체는 고체 표면에 고정된다. 고체 표면에 앵커링된 착체의 검출은 많은 방법으로 수행된다. 고정되지 않은 종이 미리 라벨링되는 경우, 표면상에 고정된 라벨의 검출은 착체가 형성된 것을 나타낸다. 고정되지 않은 종이 미리 라벨링되지 않은 경우, 간접 라벨은 예를 들면 초기에 고정되지 않은 종에 대해 특이성인 라벨링된 항체를 사용하여(항체는 순차적으로 라벨링된 항-Ig 항체로 직접 라벨링되거나 간접적으로 라벨링된다) 표면에 앵커링된 착체를 검출하는데 사용될 수 있다. 반응 성분의 첨가 순서에 따라, 착체 형성을 억제하거나 예비형성된 착체를 붕괴시키는 시험 화합물이 검출된다.
다르게는, 반응은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 액상으로 수행되고, 반응 산물은 반응하지 않은 성분으로부터 분리되고, 예를 들면 결합 성분 중 하나에대해 특이성인 고정된 항체를 사용하여 용액에서 형성된 임의의 착체를 앵커링하고 다른 파트너에 대해 특이성인 제 2 라벨링된 항체를 사용하여 앵커링된 착체를 검출함으로써 착체가 검출된다. 다시, 반응물을 액상에 첨가하는 순서에 따라, 착체를 억제하거나 예비형성된 착체를 붕괴시키는 시험 화합물이 동정된다.
본 발명의 다른 양태에서, 동종 분석이 사용될 수 있다. 이 방법에서, 표적 유전자 산물 또는 그의 결합 파트너가 라벨링되나 라벨에 의해 생성된 신호가 착체 형성으로 인해 중지된 표적 유전자 단백질 및 상호작용 세포 또는 세포외 결합 파트너의 예비형성된 착체가 제조된다(예를 들면 면역분석을 위한 이 방법을 사용하는 루벤스타인(Rubenstein)의 미국 특허 제 4,109,496 호를 참조한다). 예비형성된 착체로부터 하나의 종과 경쟁하고 치환하는 시험 물질을 첨가하는 경우 백그라운드 이상의 신호를 발생시킨다. 이 방법으로, 표적 유전자 단백질/세포 또는 세포외 결합 파트너를 붕괴시키는 시험 물질이 동정된다.
특별한 양태에서, 표적 유전자 산물은 위에 기술한 재조합 DNA 기법을 사용하는 고정화를 위해 제조된다. 예를 들면, 표적 유전자 암호화 영역은 그의 결합 활성이 생성된 융합 단백질에서 유지되는 방식으로 pGEX-5X-1과 같은 융합 벡터를 사용하여 글루타티온-S-전이효소(GST) 유전자에 융합된다. 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너는 정제되고 당해 분야에서 통상적으로 사용되거나 위에서 기술한 바와 같은 방법을 사용하여 단일세포 유래성 항체를 생성하는데 사용된다. 이 항체는 당해 분야에서 통상적으로 실행되는 방법에 의해 방사성 동위원소125I로 라벨링된다. 이형 분석에서, 예를 들면 GST-표적 유전자 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 비드에 앵커링된다. 이어서, 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너는 상호작용 및 결합이 일어나게 하는 방식으로 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 첨가된다. 반응 말기에, 결합되지 않은 물질은 세척될 수 있고, 라벨링된 단일세포 유래성 항체는 시스템에 첨가되고 착체화된 성분에 결합된다. 표적 유전자 단백질과 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너사이의 상호작용은 글루타티온-아가로스 비드와 결합된 방사능의 양을 측정함으로써 검출된다. 시험 화합물에 의해 상호작용이 성공적으로 억제되는 경우 측정된 방사능이 감소된다.
다르게는, GST-표적 유전자 융합 단백질 및 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너는 고체 글루타티온-아가로스 비드의 부재하에 액상으로 함께 혼합된다. 시험 화합물은 종이 상호작용하는 동안 또는 이후 첨가된다. 이 혼합물은 글루타티온-아가로스 비드에 첨가되고 결합되지 않은 물질은 세척된다. 다시, 표적 유전자 산물/결합 파트너 상호작용의 억제도는 라벨링된 항체를 첨가하고 비드와 결합된 방사능을 측정함으로써 검출된다.
본 발명의 다른 양태에서, 이러한 동일한 기법은 전체 길이 단백질중 하나 또는 둘을 대신하여 표적 유전자 산물 및/또는 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너(결합 파트너가 단백질인 경우)의 결합 도메인에 상응하는 펩타이드 단편을 사용함으로써 사용된다. 당해 분야에서 통상적으로 실행되는 방법이 결합 부위를 동정하고 분리하는데 사용된다. 이러한 방법은 한 단백질의 유전자 암호화 단백질의 돌연변이유발 및 공-면역침전 분석에서 결합의 붕과를 위한 선별을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 이어서, 착체에서 제 2 종을 암호화하는 유전자에서 돌연변이의 보충이 선택된다. 개별 단백질을 암호화하는 유전자의 서열 분석을 통해 상호작용성 결합에 포함된 고체 단백질의 영역에 상응하는 돌연변이를 나타낸다. 다르게는, 하나의 단백질은 상기 방법을 사용하여 고체 표면에 앵커링되고 트립신과 같은 단백질 가수분해 효소로 처리된 그의 라벨링된 결합 파트너와 상호작용하고 결합된다. 세척 후, 결합 도메인을 포함하는 짧은 라벨링된 펩타이드는 고체 물질과 결합되고, 분리되고 아미노산 서열화에 의해 동정될 수 있다. 또한, 세포 또는 세포외 결합 파트너를 위해 암호화하는 유전자가 수득되는 경우 짧은 유전자 단편이 처리되어 단백질의 펩타이드 단편을 발현하고 이것은 결합 활성을 위해 시험되고 정제되거나 합성된다.
예를 들면 무제한적으로, 표적 유전자 산물은 GST-표적 유전자 융합 단백질을 제조하고 이것을 글루타티온 아가로스 비드에 결합시킴으로써 기술한 바와 같이 고체 물질에 앵커링된다. 상호작용성 세포 또는 세포외 결합 파트너는35S와 같은 방사성 동위원소로 라벨링되고 트립신과 같은 단백질 가수분해 효소로 분해된다. 분해 산물은 앵커링된 GST-표적 유전자 융합 단백질에 첨가되고 결합된다. 결합되지 않은 펩타이드를 세척한 후, 세포 또는 세포외 결합 파트너 결합 도메인을 나타내는 라벨링된 결합 물질이 용출되고 정제되고 익히 공지된 방법에 의해 아미노산 서열에 대해 분석한다. 동정된 펩타이드는 합성적으로 생성되거나 공지된 재조합 DNA 기법을 사용하여 적당한 용이한 단백질에 융합된다.
5.5.1.2 조합 화학 라이브러리의 선별
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 동정된 진균류 유전자에 의해 암호화된 단백질은 분리되고 발현된다. 이어서, 이러한 재조합 단백질은 잠재적인 약물 후보를 위한 화합물의 라이브러리를 선별하기 위한 분석에서 표적으로서 사용된다. 화학 라이브러리의 생성은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 조합 화학은 본원에 기술한 분석에서 선별되는 화합물의 라이브러리를 생성하는데 사용된다. 조합 화학 라이브러리는 많은 화학 "빌딩 블록" 시약을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성되는 다양한 화학 화합물의 수집물이다. 예를 들면, 폴리펩타이드 라이브러리와 같은 선형 조합 화학 라이브러리는 주어진 길이의 펩타이드를 수득하기 위해 모든 가능한 조합으로 아미노산을 조합함으로써 형성된다. 많은 화학 화합물은 화학적 빌딩 블록의 이러한 조합 혼합을 통해 이론적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 한 실험자는 100개의 상호교환가능한 화학적 빌딩 블록의 시스템적 조합 혼합이 1억개의 사합체성 화합물 또는 10조개의 오합체성 화합물을 이론적으로 합성하는 것을 관찰하였다(갤롭(Gallop) 등의 문헌["Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery, Background and Peptide Combinatorial Libraries", Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 37, No. 9, 1233-1250(1994)]). 천연 산물 라이브러리를 포함하는 당해 분야에 공지되어 있는 다른 화학 라이브러리도 사용될 수 있다.
생성되면 조합 라이브러리는 바람직한 생물학적 특성을 갖는 화합물에 대해 선별된다. 예를 들면, 약물로서 유용할 수 있거나 약물을 증폭시키는 화합물은 위에서 논의한 바와 같이 동정되고 발현되고 정제된 표적 단백질에 결합하는 능력을 갖는다. 추가로, 동정된 표적 단백질이 효소인 경우 후보 화합물은 표적 단백질의 효소 특성을 방해한다. 예를 들면, 표적 단백질의 효소 기능은 단백질 분해효소, 뉴클레아제, 포스파타제, 탈수소효소, 수송 단백질, 전사 효소, 복제 성분, 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 유형의 효소로서 작용하는 것이다. 따라서, 본 발명은 조합 화학 라이브러리를 선별하기 위해 위에 기술한 단백질 산물을 사용하는 것을 고려한다.
본 발명의 일부 양태에서, 단백질이 작용하는 기질의 화학적 구조 뿐만 아니라 단백질의 생화학적 활성은 공지되어 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 표적 단백질의 생화학적 활성은 알려지 있지 않고 표적 단백질은 알려져 있는 기질을 갖지 않는다.
본 발명의 일부 양태에서, 화합물의 라이브러리는 표적 유전자 산물의 억제제로서 작용하는 화합물을 동정하기 위해 선별된다. 우선, 작은 분자의 라이브러리는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 조합 라이브러리 형성 방법을 사용하여 생성된다. 본원에 참고로 인용되어 있는 발명의 명칭이 "System and Method of Automatically Generating Chemical Compounds with Desired Properties"인 아그라피오티스(Agrafiotis) 등의 미국 특허 제 5,463,564 호 및 제 5,574,656 호가 이러한 내용을 교시한다. 이어서, 라이브러리 화합물은 바람직한 구조적 및 작용적 특성을 갖는 화합물을 동정하기 위해 선별된다. 또한, 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,684,711 호에는 라이브러리의 선별 방법이 논의되어 있다.
선별 방법을 예시하기 위해, 표적 유전자 산물, 효소 및 라이브러리의 화학 화합물은 조합되고 서로 상호작용한다. 라벨링된 기질은 항온처리물에 첨가된다. 기질상의 라벨은 검출가능한 신호가 물질대사된 기질 분자로부터 방출되는 것이다. 신호가 방출되는 경우 이 신호를 조합 라이브러리 화합물의 부재하에 방출된 신호와 비교함으로써 표적 효소의 효소 활성에 대한 조합 라이브러리 화합물의 효과를 측정하게 한다. 각각의 라이브러리 화합물의 특성은 효소에 대한 활성을 나타내는 화합물이 분석되고 동정된 여러 화합물에 일반적인 특징이 분리되고 이후 반복되는 라이브러리로 조합될 수 있도록 암호화된다.
화합물의 라이브러리가 선별되는 경우 표적 효소에 대한 활성을 갖는 것으로 제 1 회의 선별에서 나타난 특징을 갖는 이러한 화학적 빌딩 블록을 사용하여 이후의 라이브러리는 생성된다. 이 방법을 사용하면, 이후 반복되는 후보 화합물은 효소에 대한 높은 특이성을 갖는 효소 억제제의 그룹이 발견될 때까지 표적 효소의 기능을 억제하는데 요구되는 더 많은 구조적 및 기능적 특징을 갖는다. 이어서, 이러한 화합물은 포유동물에 사용하기 위한 항생제로서 이들의 안전성 및 효과에 대해 추가로 시험된다.
이러한 특별한 선별 방법은 단지 예시적인 것으로 쉽게 생각될 것이다. 다른 방법은 당해 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 표적 단백질의 생화학적 기능이 공지되어 있는 경우 다양한 선별 방법이 다수의 천연 표적을 위해 공지되어 있다. 예를 들면, 일부 기법은 약물 인도를 동정하고 전개하기 위해 생화학적 및 유전학적으로 표적 단백질을 규명하고 분석하기 위한 작은 펩타이드의 생성 및 사용을 포함한다. 이러한 기법은 본원에 참고로 인용되어 있는 국제 특허 공개공보 제 WO9935494 호, 제 WO9819162 호 및 제 WO 9954728 호에 기술된 방법을 포함한다.
본원에 기술된 칸디다 알비칸스 표적 단백질과 동족인 칸디다 알비칸스와는 다른 유기체로부터의 단백질의 활성을 억제하는 화합물을 동정하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 단백질은 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 크루세이, 클립토코쿠스 네오포르만스, 코시디오이데스 임미티스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 캄술라툼, 네모시스티스 카리니, 트리코스포론 베이겔리, 리조푸스 아리주스, 무코 로욱시, 리조무코 푸실루스, 압시디아 코림비게라, 또는 식물 진균 병원균, 예를 들면 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르테 그리세아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시, 틸레티아 콘트로베르사, 우스틸라고 바이디스, 또는 상기 종의 임의의 속에 속하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 단백질은 사카로마이세스 세레비시아에와는 다른 유기체로부터 유래된다.
5.5.1.3 생체외 효소 분석
GRACE법 및 균주는 세포 생존성에 필수적인 것으로 나타난 생화학적 활성을 대한 생체외 분석을 전개하기 위해 사용된다. GRACE 조건 발현 방법에 의해 동정된 많은 필수적인 유전자는 다른 유기체로부터 생화학적으로 특성화된 유전자 산물과 통계적으로 상당한 유사성을 나타낸다. 예를 들면, 아미노산 서열 유사성을 기준으로 하여 표 2에 나타낸 많은 필수적인 진균 특이성 유전자는 하기 생화학적 활성을 갖는 것으로 예상된다.
CaRHO1 (1,3)-b-글루칸 합성 및 극성에 포함된 GTP아제
CaYHR118c (ORC6)복제 착체 아단위의 기원
CaYPL128c (TBP1)텔로미어(Telomere) 결합 단백질
CaYNL256w디하이드롭테로에이트 합성효소
CaYKL004w (AUR1)포스파티딜리노시톨: 세라미드 포스포이노시톨 전달효소
CaYJL090c (DPB11)DNA polB 아단위
CaYOL149w (DCP1)mRNA 탈캡핑화 효소
CaYNL151c (RPC31)RNA polIII 아단위
CaYOR148c (SPP2)RNA 겹침
CaYER026c (CHO1)포스파티딜세린 합성효소
따라서, 많은 특성화된 표준 생체외 생화학적 분석(예를 들면, DNA 결합, RNA 처리, GTP 결합 및 가수분해 및 포스포릴화)은 이들 확인된 약물 표적을 위해 쉽게 조정된다. 예를 들면 확인된 표적,CaRHO1은 넓은 범위의 이런 단백질을 위해 전개된 표준 GTP아제 분석을 조정함으로써 생체외계 약물 선별내에서 사용된다. 다르게는, 신규한 분석은 본 발명의 GRACE 균주 수집물내에서 확인된 약물 표적에 속하는 생화학적 정보를 사용하여 전개된다. 유사한 생화학적 활성(예를 들면, 작용 기작, 기질의 부류)을 갖는 효소에 대한 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 분석은 이들 필수적인 C. 알비칸스 유전자에 의해 암호화되는 효소의 억제제에 대해선별하기 위해 조정된다.
예를 들면, 많은 특징은 C. 알비칸스 유전자(CaTBFI)를 생체외 전개를 위한 후보이게 한다.CaTBFI는 그의 S. 세레비시아에 상대(TBFI, 텔로미어 결합 인자)에 대한 상당한 상동성을 공유한다. 또한, CaTBF1p가 인식하는 DNA 서열은 공지되어 있고 비교적 짧아서(본원에 참고로 인용되어 있는 코에링(Koering) 등의 문헌[Nucleic Acid Res. 28:2519-2526]) 이 요소에 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 합성 비용을 감소시킬 수 있다. 더구나, 이 분석은 단지 표적 단백질 및 이것이 인식하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한 DNA 단편을 요구하므로 단지 CaTBF1p 단백질의 정제만이 생체외 결합 분석에서 전개하기 위해 필요하다. 이 생체외 분석의 한 바람직한 양태는 DNA 요소를 웰의 바닥에 가교결합하는 것, 방사성원소 라벨링된 CaTBF1p를 항온처리하여 단백질-DNA 결합을 용이하게 하는 것, 일련의 세척을 수행하여 결합되지 않은 물질을 제거하는 것 및 결합된 방사성원소 라벨링된 CaTBF1p의 %를 측정하는 것을 포함한다. 다르게는, 정제된 CaTBF1p는 웰에결합되고 방사성원소 라벨링된 올리고뉴클레오타이드가 첨가된다. 높은 처리량 선별 기법의 사용을 포함하는 약물 선별은 이 분석에서 측정된 단백질-DNA 결합을 억제하는 화합물을 조사함으로써 수행된다.
유사하게, 제 2 확인된 약물 표적인CaORC6은 그의 S. 세레비시아에 동족체인ORC6이 직접 효모 염색체의 복제의 기원내의 DNA 요소를 결합시키므로 이 유형의 분석에 사용된다(본원에 참고로 인용되어 있는 미즈시마(Mizusima) 등의 문헌[2000, Genes & Development 14:1631-1641]). 임의의 이들 표적의 생화학적정제는 예를 들면CaORC6단백질을 암호화하는 유전자가 표준 Ni+2친화성 컬럼 크로마토그래피 기법을 사용하여 치머성(chimeric) 단백질의 정제를 가능하게 하는 카복시-말단 헥사히스티딘 태그를 포함하도록 개질되는 C. 알비칸스 이질접합 균주의 PCR계 구성에 의해 달성될 수 있다.
S. 세레비시아에가 Sld2p와 물리적으로 결합하는 단백질을 암호화하는 것의 동족체인CaDPB11과 같은 다른 표적의 경우(본원에 참고로 인용되어 있는 가미무라(Kamimura) 등의 문헌[1998, Cell Biol. 18:6102-6109]), 위에 기술한 것과 유사한 생체외 분석이 전개된다. 또한, 공지된 물리적 상호작용을 기본으로 한 2-혼성 분석은 GRACE 균주 수집물내에 임의의 확인된 표적에 대해 전개된다.
본 발명은 또한 적합한 생화학적 표적을 위한 생체외 분석을 수립하는데 유용한 세포 추출물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 양태에서, GRACE-유도된 C. 알비칸스 균주는 특별한 유전자 산물을 과잉생산하거나 고갈하기 위한 구성 발현 조건 또는 전사 억제 조건하에 성장된다. 이러한 두 조건하에 항온처리된 균주로부터 생성된 세포 추출물은 동일하게 성장된 야생형 균주로부터 제조된 추출물과 비교된다. 이어서, 이러한 추출물은 유전자 산물을 정제할 필요없이 기존의 생체외 분석 또는 신규한 유전자 산물을 향한 신규한 분석을 사용하여 표적의 신속한 평가를 위해 사용된다. 생체외 분석 전개를 위한 이러한 전체 세포 추출 방법은 전형적으로 이들의 작용성 활성을 위해 요구되는 필수적인 후-번역 개질을 수용하기 전에 분비 경로를 통과하는 다중 유전자 산물을 포함하는 세포벽 생합성 경로(예를 들면, (1,3)-β-글루칸 합성 또는 키틴 합성)에 포함된 표적을 위해 필요하다. 이들 또는 다른 세포벽 경로(예를 들면, (1,6)-β-글루칸 합성)에 포함된 표적 유전자의 조건 발현을 위한 GRACE-유도된 균주는 생체외 분석이 C. 알비칸스에서 직접 수행될 수 있게 한다.
5.5.2 세포계 선별 분석
약물 발견 및 전개를 위한 화합물을 동정하거나 특정화하는데 사용되는 최근의 세포계 분석은 종종 세포 내에 위치하거나 세포의 표면에 위치하는 표적 분자의 활성을 조정하기 위한 시험 화합물의 능력을 검출하는데 달려 있다. 매우 종종 이러한 표적 분자는 효소, 수용체 등과 같은 단백질이다. 그러나, 표적 분자는 또한 DNA, 지방, 탄수화물, 및 메신저 DNA, 리보솜 RNA, tRNA 등을 포함하는 RNA와 같은 다른 분자를 포함한다. 많은 고감도 세포계 분석 방법은 시험 화합물과 특이한 표적 분자의 결합 및 상호작용을 검출하기 위해 당해 분야의 숙련자가 사용가능하다. 그러나, 이들 방법은 시험 화합물이 적당하거나 낮은 친화성을 갖는 그의 표적 분자와 결합하거나 다르게는 상호작용하는 경우 일반적으로 매우 효과적이지는 않다. 또한, 표적 분자는 예를 들면 표적 분자가 세포 내부에 또는 박테리아벽의 세포질과 같은 세포 구획내에 위치하는 경우와 같이 용액중의 시험 화합물에 용이하게 접근할 수 없다. 따라서, 최근의 세포계 분석 방법은 이들이 적당하거나 낮은 친화성을 갖는 이들의 표적과 상호작용하는 화합물 또는 쉽게 접근할 수 없는 표적과 상호작용하는 화합물을 동정하거나 특성화하는데 효과적이지 않다는 점에서 제한된다.
본 발명의 세포계 분석 방법은 최근의 세포계 분석에 비해 실질적인 이점을 갖는다. 이들 이점은 진균 증식, 독성 또는 병인성(표적 분자)을 위해 요구되는 하나 이상의 유전자 산물의 수준 또는 활성이 그의 기능의 존재 또는 부재가 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위한 속도 결정 단계가 되는 점으로 특이적으로 감소되는 감작화된 세포의 사용으로부터 유래된다. 이러한 감작화된 세포는 감염된 표적 분자에 대해 활성을 갖는 화합물에 훨씬 더 민감성이 된다. 예를 들면, 감작화된 세포는 그의 기능의 존재 또는 부재가 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위한 속도 결정 단계가 되도록 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 요구되는 유전자 산물의 수준을 제공하는 유도인자 또는 억제인자의 농도의 존재하에 GRACE 균주를 성장시킴으로써 수득된다. 따라서, 본 발명의 세포계 분석은 이러한 화합물이 감작화되지 않은 세포보다 감작화된 세포에 대해 더 큰 잠재성을 가지므로 관심있는 표적 분자에 대한 낮거나 적당한 잠재성을 나타내는 화합물을 검출할 수 있다. 효과는 시험 화합물이 감작화되지 않은 세포에 비해 감작화된 세포에서 시험한 경우 2 내지 수배, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 1000배 이상 또는 심지어는 1000배보다 훨씬 더 큰 잠재성을 가질 수 있는 것일 수 있다.
부분적으로 병인성 미생물에서 내항생제성의 증가된 표출 및 일부 최근에 사용되는 항생제와 관련된 상당한 부작용으로 인해, 신규한 표적에서 작용하는 신규한 항생제는 당해 분야에서 이후 많이 연구되고 있다. 그러나, 세포계 분석에 관련된 최근 기술의 다른 제한은 동일한 제한된 세트의 생물학적 경로에서 동일한 종류의 표적 분자에 대해 반복적으로 히트를 동정하는 문제이다. 이것은 "오래된" 표적에서 작용하는 화합물이 보다 빈번하게 조우하게 되고 신규한 표적에서 작용하는 화합물보다 더 잠재성이 있으므로 이러한 신규한 표적에서 작용하는 화합물이 제거 또는 무시되거나 검출되지 않는 경우에 일어날 수 있다. 결과적으로, 최근에 사용되는 대부분의 항생제는 훨씬 더 제한된 세트의 생물학적 경로내에서 비교적 적은 수의 표적 분자와 상호작용한다.
본 발명의 감작화된 세포의 사용은 두가지 방식으로 상기 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 우선, 신규한 표적 또는 이전에 공지되어 있었으나 별로 연구되지 않은 표적이든 간에 관심있는 표적에서 작용하는 원하는 화합물은 본 발명의 감작화된 세포에 대해 시험되는 경우 이러한 원하는 화합물의 잠재성의 특이적이고 실질적인 증가로 인해 "오래된" 표적에서 작용하는 화합물의 "노이즈" 이상에서 검출될 수 있다. 두 번째로, 관심있는 표적에서 작용하는 화합물에 대해 세포를 감작화시키는데 사용되는 방법은 또한 동일한 생물학적 경로내에서 다른 표적 분자에서 작용하는 화합물에 대해 이들 세포를 감작화시킬 수 있다. 예를 들면, 리보솜 단백질의 기능이 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위한 속도 결정 단계가 되게 하는 수준으로 리보솜 단백질을 암호화하는 유전자의 발현은 세포를 임의의 리보솜 성분(단백질 또는 rRNA)에서 작용하는 화합물 또는 단백질 합성 경로의 일부인 임의의 표적에서 작용하는 화합물에 대한 리보솜 단백질에서 작용하는 화합물에 대해 감작화시키는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 중요한 이점은 이전에 약물 발견 방법에 쉽게 접근할 수 없는 신규한 표적 및 경로를 드러내는 능력이다.
본 발명의 감작화된 세포는 표적 분자의 활성 또는 수준을 감소시킴으로써 제조된다. 표적 분자는 본원에 기술된 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 요구되는 핵산으로부터 생성된 RNA 또는 폴리펩타이드와 같은 유전자 산물일 수 있다. 또한, 표적은 본원에 기술된 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 요구되는 핵산으로서 동일한 생물학적 경로에서의 RNA 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 생물학적 경로는 효소적, 생화학적 및 물질대사적 경로 뿐만 아니라 세포막과 같은 세포 구조의 생성에 수반되는 경로를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
의약 화학 및 조합 화학 분야에서 현재 사용되는 방법은 직접적인 결합 분석법 및 세포에 기초된 분석법을 포함하는 다양한 생물학적 분석법에서의 시험 화합물로부터 유도된 표면-활성 관계 정보를 이용할 수 있다. 때때로, 약물로서 개발되기에 충분히 효능있는 화합물이 상기 분석법에서 직접 확인된다. 보다 가끔은, 초기 히트(hit) 화합물은 중간 또는 낮은 효능을 나타낸다. 히트 화합물이 일단 낮은 또는 중간의 효능을 갖는 것으로 확인되면, 화합물의 직접적인 라이브러리가 합성되고 시험되어 보다 강한 유도를 확인한다. 일반적으로 이러한 직접적인 라이브러리는 히트 화합물과 관련된 구조를 갖는 화합물로 이루어지지만 다양한 구조적 특징의 부가, 삭감 및 치환을 포함하는 조직적인 변화를 함유하는 조합적인 화학적 라이브러리이다. 표적 분자에 대한 활성에 대해 시험하는 경우, 단독으로 또는 기타 특징과 함께 활성을 증강 또는 감소시키는 구조적 특징이 확인된다. 이러한 정보는 표적 분자에 대한 증강된 활성을 갖는 화합물을 함유하는 후속적인 직접적 라이브러리를 설계하는데 사용된다. 이러한 공정을 한번 또는 여러번 반복한 후, 표적 분자에 대한 실질적으로 증가된 활성을 갖는 화합물이 확인되고 이는 또한 약물로서 개발될 수 있다. 선택된 표적에서 작용하는 화합물이 세포 기초된 분석법에서 증가된 효능을 나타내므로 본 발명의 감작된 세포의 사용에 의해 상기 공정이 용이해지며, 따라서 이제 보다 많은 화합물은 달리 얻어지는 것보다 더 유용한 정보를 제공함을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 이제 본 발명의 세포 기초된 분석법을 사용함으로써, 세포 기초된 분석법을 사용하여 이전에는 쉽게 개발될 수 없었던 표적에서 작용하는 화합물을 포함함을 특징으로 하거나, 이전에는 쉽게 확인되지 않았던 화합물을 확인 또는 특성화시킬 수 있게 되었다. 초기 히트 화합물로부터의 효능있는 약물 유도를 발달시키는 공정은 실질적으로 본 발명의 세포 기초된 분석법에 의해 개선되는데, 이는 동일한 수의 시험 화합물에 대해 보다 많은 구조적 작용 관계 정보가 밝혀지기 때문이다.
세포를 감작하는 방법은 적합한 유전자를 선택하는 것을 필요로 한다. 적합한 유전자는 감작되는 세포의 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 표현을 갖는다. 다음의 단계는 표적의 수준 또는 활성을 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 속도 제한적인 수준으로 감소시킬 수 있는 세포를 수득하는 것이다. 예를 들어, 상기 세포는 선택된 유전자가 조절성 촉진제의 제어하에 있는 GRACE(GRACE) 균일 수 있다. 선택된 유전자로부터 전사된 RNA의 양은 조절성 촉진제에 따라 작용하는 유도 인자 또는 억제제의 농도를 변화시켜 RNA의 전사를 유도하는 촉진제의 활성을 변화시킴으로써 제한된다. 따라서, 세포는 선택된 유전자 산물의 기능이 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 속도 제한적이 되도록 하는 RNA 수준을 생성시키는 유도 인자 또는 억제제 농도에 세포를 노출시킴으로써 감작된다.
세포 기초된 분석법의 한 양태에 있어서, 본원에 기술된 칸디다 알비칸스의 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 서열이 조절성 촉진제의 제어하에 있는 GRACE 균주은, 상기 서열에 의해 암호화된 유전자 산물의 기능을 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 속도 제한적이 되도록 유도하는 유도 인자 또는 억제제의 농도의 존재에서 성장된다. 상기 목적을 달성하기 위해, 유도 인자 또는 억제제의 성장 억제 투여량 곡선은 진균 증식을 위해 요구되는 유전자 산물의 제한된 수준에 의해 유발되는 상응하는 성장 억제에 대한 유도 인자 또는 억제제의 다양한 투여량을 작도함으로써 계산된다. 이러한 투여량-반응 곡선으로부터, 유도 인자 또는 억제제-자유 성장과 비교되는 1 내지 100%의 다양한 성장률을 제공하는 조건이 결정될 수 있다. 예를 들어, 조절성 촉진제가 테트라사이클린에 의해 억제되는 경우, GRACE 균주는 다양한 수준의 테트라사이클린의 존재에서 성장될 수 있다. 유사하게, 유도성 촉진제가 사용될 수 있다. 이 경우, GRACE 균주는 다양한 농도의 유도 인자의 존재에서 성장된다. 예를 들어, 성장률을 상당히 감소시키지 않는 유도 인자 또는 억제제의 최고 농도는 투여량-반응 곡선으로부터 평가될 수 있다. 세포 증식은 OD 측정량을 통해 성장 배지 혼탁에 의해 모니터될 수 있다. 다른 예에서, 25%까지 성장을 감소시키는 유도 인자 또는 억제제의 농도는 투여량-반응 곡선으로부터 예측될 수 있다. 다른 예에서, 50%까지 성장을 감소시키는 유도 인자 또는 억제제의 농도는 투여량-반응 곡선으로부터 게산될 수 있다. 집락 형성 단위(colony forming unit; cfu)와 같은 추가의 파라미터가 또한 성장, 생존 및/또는 생존력을 측정하는데 사용된다.
본 발명의 다른 양태에서, 개별적인 반수체 균이 항진균제 또는 치료제의 검출을 위한 기초로서 유사하게 사용될 수 있다. 이러한 양태에서, 시험 유기체(아스페르질루스 푸미가투스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 마그나포르싸 그리시아(Magnaportha grisea) 또는 표 1에 나타낸 기타 반수체 유기체)는, 유전자의 표현이 이형 촉진제에 의해 조건적으로 조절되도록, 이형 조절성 촉진제를 포함하는 촉진제 대체 단편을 사용한 재조합에 의해 한 단계에서 표적 유전자의 단일 대립유전자를 개질시킴으로써 구성된 균이다. 개별적인 2배체 GRACE 균주와 같이, 감작된 반수체 세포는 전체의 세포 기초된 분석법 방법에서 유사하게 사용되어 작용받은 표적에 대해 우선적인 활성을 나타내는 화합물을 확인할 수 있다.
다양한 양태에서, 개질된 균은 이형 촉진제가 비교적 낮은 수준(즉, 부분적으로 억제되는)으로 표현되고 성장 범위가 결정되는 제 1 세트의 조건하에서 성장된다. 이러한 실험은 시험 화합물 및 수득된 성장의 제 2 측정량의 존재하에서 반복된다. 시험 화합물의 존재 및 부재에서의 성장 범위를 비교하여 제 1 표지기 수치를 제공한다. 2개의 추가의 실험은 표적 유전자가 제 1 세트의 조건에서보다는 실질적으로 높은 수준에서 표현되는 비억제 성장 조건을 사용하여 수행된다. 성장범위는 제 2 세트의 조건하에서 시험 화합물의 존재 및 부재에서 결정되어 제 2 표지기 수치가 수득된다. 제 1 및 제 2 표지기 수치를 비교한다. 표지기 수치가 본질적으로 동일한 경우, 데이터는 시험 화합물이 시험 표적을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 2개의 표지기 수치가 실질적으로 상이한 경우, 데이터는 표적 유전자 산물 표현 수준이 시험 화합물에 의한 억제 정도를 결정하여 유전자 산물이 시험 화합물의 표적이라는 것을 나타낸다. 다수의 감작된 균의 집합 또는 부분 집합을 포함하는 전체적인 세포 분석법은 예를 들어 일련의 96-웰(well), 384-웰 또는 1586-웰 마이크로적정 판에서 감작된 개별적인 균을 함유하는 각각의 웰을 사용하여 선별되어, 진균 특유, 병원체 특유, 목적하는 생화학적 기능, 인간 동족체, 세포 위치 및 신호 변환 다단계 표적 세트로 이루어진 군으로부터 선택되나 이로 제한되지 않는 표적 세트 또는 부분 집합을 포함하는 각각의 작용화된 표적에 대한 우선적인 활성을 나타내는 화합물을 확인할 수 있다.
분석되는 세포는 유도 인자 또는 억제제의 상기 결정된 농도에 노출된다. 이러한 치사량 이하의 농도에서의 유도 인자 또는 억제제의 존재는 증식 요구된 유전자 산물의 양을 성장을 지지하는 세포에서의 최소 양으로 감소시킨다. 따라서, 이러한 농도의 유도 인자 또는 억제제의 존재에서 성장된 세포는 증식 요구된 단백질 또는 흥미있는 RNA의 억제제 뿐만 아니라 증식 요구된 단백질 및 흥미있는 RNA와 동일한 생물학적 경로에서 단백질 또는 RNA의 억제제에 대해 보다 민감하나, 관련이 없는 단백질 또는 RNA의 억제제에 대해서는 보다 민감하지 않다.
유도 인자 또는 억제제의 반억제성 농도로 예비 처리되어 감소된 양의 증식요구된 표적 유전자 산물을 함유하는 세포는 세포 성장을 감소시키는 화합물을 위해 선별하는데 사용된다. 유도 인자 또는 억제제의 치사량 이하의 농도는 분석의 의도된 용도와 일치하는 임의의 농도이어서 세포가 유전자 산물이 속도 제한적이지 않은 대조군 세포인 것보다 더욱 민감한 후보 화합물을 확인한다. 예를 들어, 유도 인자 또는 억제제의 치사량 이하의 농도는 성장 억제가 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이도록 하는 농도일 수 있다. 상기 방법을 사용하여 예비 감작된 세포는 야생 유형의 세포보다 억제에 대한 더 적은 표적 단백질을 함유하므로 표적 단백질의 억제제에 더 민감하다.
유사한 방법이 독성 또는 병인성을 억제하는 화합물을 확인하는데 사용될 수 있는 것으로 평가된다. 이러한 방법에서, 독성 또는 병인성에 포함되는 유전자 산물의 속도 제한적인 수준을 나타내는 후보 화합물에 노출된 세포의 독성 또는 병인성을, 유전자 산물의 수준이 속도 제한적이지 않은 후보 화합물에 노출된 세포의 독성 또는 병인성과 비교한다. 독성 또는 병인성은 본원에 기술된 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 세포 기초된 분석법의 다른 양태에서, 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 요구되는 유전자 산물의 수준 또는 활성은, 온도 민감성 변이와 조합으로 증식에 대해 속도 제한적인 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물의 수준을 제공하는 유도 인자 또는 억제제 수준, 및 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 순서로 온도 민감성변이와 같은 변이를 사용하여 감소된다. 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자에서 변이가 존재하는 온도 민감성 변이의 허용 온도와 제한 온도 사이의 중간 온도에서 세포를 성장시키면, 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성을 위해 요구되는 유전자 산물의 감소된 활성을 갖는 세포가 생성된다. 유도 인자 또는 억제제의 농도는 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물의 활성을 추가로 감소하도록 선택된다. 온도 민감성 변이 또는 유도 인자 또는 억제제만을 사용하여 발견될 수 없는 약물은, 증식 요구된 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 표현이 감소되고 허용 온도와 제한 온도 사이의 온도에서 성장되는 세포가 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물의 표현이 감소되고 허용 온도에서 성장되는 세포보다 시험 온도에 대해 실질적으로 더욱 민감한지를 결정함으로써 확인될 수 있다. 또한, 유도 인자 또는 억제제만의 사용 또는 온도 민감성 변이만을 사용하는 것으로부터 미리 발견된 약물은 2개의 접근자를 조합하는 세포에서 사용되는 경우의 상이한 민감도 프로파일을 가질 수 있으며, 이 민감도 프로파일은 유전자 산물의 하나 이상의 활성을 억제하는데 있어서 약물의 보다 특유한 작용을 나타낼 수 있다.
온도 민감성 변이는 유전자 내의 상이한 부위에 위치될 수 있고, 단백질의 상이한 도메인내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 대장균(Escherichia coli)의 dnaB 유전자는 복제 분기 DNA 헬리케이즈(helicase)를 암호화한다. DnaB는 올리고머화, ATP 가수분해, DNA 결합, 프리메이즈와의 상호작용, DnaC와의 상호작용 및 DnaA와의 상호작용을 위한 도메인을 포함하는 여러 가지 도메인을 갖는다. DnaB의 상이한 도메인의 온도 민감성 변이는 DNA 붕괴(문헌[Wechsler, J.A. and Gross, J.D. 1971Escherichia colimutants temperature-sensitive for DNA synthesis. Mol. Gen. Genetics 113:273-284]) 및 성장 종결 또는 세포 사망을 사용하거나 사용하지 않고서 DNA 복제에서의 급격한 정지 또는 느린 정지를 포함하는 제한 온도에서 상이한 표현형을 제공한다. 따라서, 단백질의 상이한 도메인에서 온도 민감성 변이는 단백질의 표현이 조절성 촉진제의 제어하에 있는 GRACE 균주와 함께 사용될 수 있다.
상기 방법은 진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 요구되는 유전자 산물의 활성 또는 수준을 제거하지 않지만 감소시키는 임의의 변이를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 평가된다.
진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물에 대한 항미생물성 제제에 대해 선별하는 경우, 제한된 양의 유전자 산물을 함유하는 세포의 성장 억제, 독성 또는 병인성이 분석될 수 있다. 성장 억제는 실험 샘플과 대조 샘플 사이에서 비접종된 성장 배지에 대한 환경의 광 밀도에 의해 측정되는, 성장량을 집적적으로 비교하여 측정될 수 있다. 세포 증식을 분석하는 다른 방법은 녹색 형광성 단백질(GFP) 보고자 구조 방출 측정, 다양한 효소 활성 분석 및 기타 당해 분야에 익히 공지된 방법을 포함한다. 독성 및 병인성은 본원에 기술된 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
고상, 액상, 이들의 조합, 또는 생체내에서 상기 방법이 수행될 수 있는 것으로 평가된다. 예를 들어, 증식 요구된 유전자 산물을 표현하는데 사용되는 조절성 촉진제에 따라 작용하는 유도 인자 또는 억제제를 함유하는 영양물 세균 배양기에서 성장된 세포는 세균 배양기 표면상에서 발견되는 화합물에 노출될 수 있다. 화합물의 효과는 세포가 성장하지 않는 화합물 적용 지점 근처 영역인 생성되는 치사 대역의 직경으로부터 판단될 수 있다. 다수의 화합물은 세포 배양기 판으로 전달될 수 있고, 유사하게 다수의 채널 피펫(예: 베크만 물티멕(Beckman Multimek) 및 다수의 채널 감시기(예: 제노믹 솔루션스 플렉시스(Genomic Solutions Flexys))를 포함하나 이로 제한되지 않는 자동 및 반자동 장치를 사용하여 유사하게 시험될 수 있다. 이러한 방식으로 다수의 판 및 수천 수만 화합물이 날마다 시험될 수 있다.
화합물은 또한 후술되는 마이크로적정 판을 사용하여 액상에서 전체적으로 시험된다. 액상 선별은 다수의 판 및 수천 수만의 화합물을 날마다 선별하기 위해 한 개의 마이크로적정 판 당 96, 384, 1536개 이상의 웰을 함유하는 마이크로적정 판에서 수행될 수 있다. 자동 및 반자동 장치는 시약의 첨가(예: 세포 및 화합물) 및 세포 밀도의 결정을 위해 사용된다.
화합물은 또한 본원에 기술된 방법을 사용하여 생체내에서 시험된다.
상기 세포 기초된 분석법은 각각 본원에 기술된 칸디다 알비칸스 유전자 산물에 대해 동종인 칸디다 알비칸스 이외의 다른 유기체로부터 유전자 산물의 활성을 억제하는 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자 산물은 아스페르질루스 푸미가투스, 아스페르질루스 니게르, 아스페르질루스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오이데스 이미티스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라즈마 캡술라툼, 뉴모키스티스 카리니, 트리코스포론 베이겔리, 리조푸스 아르히주스, 무코르 룩시, 리조무코르 푸실루스 또는 아브시디아 코림비게라와 같은 동물성 진균 병원균, 또는 보트리티스 시네리아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르싸 그리시아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시, 틸레티아 콘트로베르사(Tiletia controversa), 유스틸라고 메이디스와 같은 식물성 진균 병원균 또는 상기 종들 중 임의의 유전자내에 속하는 임의의 종으로부터의 유전자 산물일 수 있다. 일부의 양태에서, 유전자 산물은 사카로마이세스 세레비시아에 이외의 다른 유기체로부터의 유전자 산물이다.
5.5.2.1 GRACE 균주를 사용한 세포 기초된 분석법
진균 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자의 하나의 대립유전자가 다른 대립유전자가 조절성 촉진제의 제어하에 있는 동안 비활성화되는 GRACE 균주를 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조하였다. 본 예의 목적을 위해, 조절성 촉진제는 본원에 기술된 테트라사이클린 조절된 촉진제일 수 있지만, 임의의 조절성 촉진제가 사용될 수 있는 것으로 평가된다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 개별적인 GRACE 균주는 2배체 병인성 진균 세포에 대한 치료학적 제제 활성의 검출의 기초로서 사용된다. 이러한 양태에서, 시험 유기체는 개질된 대립유전자 쌍을 갖는 GRACE 균주이며, 여기서 유전자의 제 1 대립유전자는 표현가능한 주된 선택성 표시기를 암호화하는 뉴클레오타이드 순서에 의한 삽입 또는 치환에 의해 비활성화되고, 제 2 대립유전자는 재조합에 의해 개질되어 이형 촉진제의 제어된 표현하에 상기 제 2 유전자를 위치시킨다. 이러한 시험 GRACE 균주는 이형 촉진제가 비교적 저수준("억제")에서 표현되고 성장 범위가 결정되는 제 1 세트의 조건하에서 성장된다. 이러한 측정은 광 밀도, 펠릿화된 세포의 습윤량, 총 세포 수, 생존가능한 수, DNA 수 등을 포함하는 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 임의의 적합한 표준을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 실험은 수득된 성장의 제 2 측정치 및 제 1 화합물의 존재하에서 반복된다. 표지기 수치의 면에서 편리하게 표현될 수 있는 시험 화합물의 존재 및 부재에서의 성장 범위를 비교한다. 성장 또는 표지기 수치의 범위에서의 비유사성은 시험 화합물이 표적 본질 유전자 산물과 상호작용할 수 있음을 제공한다.
보다 많은 정보를 얻기 위해, 2개의 추가의 실험을, 이형 촉진제의 제어하에서 제 2 대립유전자가 전술한 제 1 세트의 조건에서보다 실질적으로 높은 수준으로 표현되는 제 2 세트의 "비억제" 성장 조건을 사용하여 수행한다. 성장 범위 또는 표지기 수치는 이러한 제 2 세트의 조건하에서 시험 화합물의 존재 및 부재에서 결정된다. 시험 화합물의 존재 및 부재에서의 성장 또는 표지기 수치의 범위를 비교한다. 성장 또는 표지기 수치의 범위에서의 비유사성은 표적 본질적 유전자 산물과 상호작용할 수 있음을 지시한다.
더욱이, 제 1 및 제 2 세트의 성장 조건에서의 성장 범위를 또한 비교할 수 있다. 성장 범위가 본질적으로 동일한 경우, 데이터는 시험된 GRACE 균주에 의해 수행된 개질된 대립유전자 쌍에 의해 암호화되는 유전자 산물을 시험 화합물이 억제하지 않음을 나타낸다. 그러나, 성장 범위가 실질적으로 상이한 경우, 데이터는대상 유전자 산물의 표현 수준이 시험 화합물에 의한 억제 정도를 결정하고, 따라서 대상 유전자 산물이 시험 화합물의 표적일 수 있음을 나타낸다.
GRACE 균주는 개별적으로 시험될 수 있지만, 한번에 GRACE 균주 집합의 전체 세트 또는 부분 집합을 선별하는데 더욱 효과적이다. 따라서, 본 발명의 한 양상에서, 분석은 예를 들어 각각의 웰이 하나의 GRACE 균주를 함유하는 일련의 96-웰 마이크로적정 판에서 달성될 수 있다. 제한적인 접근은 아니지만 대표적으로, 다른 쌍의 판에서의 배지보다 각각의 균에서 잔류하는 활성 대립유전자를 제어하는 이형 촉진제의 보다 많은 표현을 한쌍에서의 성장 배지가 지지하는 두 쌍을 포함하는 4개의 마이크로적정 판이 사용된다. 각각의 쌍의 하나의 요소는 시험되는 화합물로 보충되고, 각각의 GRACE 균주의 성장 측정은 시험되는 각각의 고립을 위한 표지기 수치를 제공하기 위한 표준 절차를 사용하여 결정된다. 치료제를 위한 선별 방법에서 사용되는 2배체 병인성 GRACE 균주의 집합은 예를 들어 유기체의 개질된 대립유전자 쌍의 완전 세트를 포함하며, 상기 완전 세트 또는 집합은 진균 특유, 병원체 특유, 목적하는 생화학적 기능, 인간 동족체, 세포 위치 및 신호 변환 다단계 표적 세트로 이루어진 군으로부터 선택되나 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택된 GRACE 균주의 부분 집합으로부터 선택될 수 있다.
GRACE 균주는 테트라사이클린 농도 범위를 포함하는 배지에서 성장되어 각각의 균에 대한 성장 억제성 투여량-반응 곡선을 제공한다. 우선, GRACE 균주의 씨 배양은 적합한 배지에서 성장된다. 후속적으로, 씨 배양의 분취량은 테트라사이클린의 다양한 농도를 함유하는 배지로 희석된다. 예를 들어, GRACE 균주는 2곱의일련의 테트라사이클린의 희석액을 함유하는 이중 배양에서 성장될 수 있다. 추가로, 대조군 세포는 테트라사이클린 없이 이중 성장된다. 대조군 배양은 흥미있는 GRACE 균주의 동일한 초기 씨 배양으로부터 유도된 세포의 동일한 양으로부터 출발된다. 세포는 적절한 시간 동안 성장되고, 성장 범위는 임의의 적합한 기법을 사용하여 결정된다. 예를 들어, 성장 범위는 배양의 광 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 대조군 배양이 중간 로그 상에 도달하는 경우, 테트라사이클린 함유 배양의 각각에 대한 %성장(대조군 배양에 대해)을 테트라사이클린에 대한 성장 억제성 투여량 반응 곡선을 산출하기 위해 테트라사이클린의 로그 농도에 대해 작도된다. 0mM 테트라사이클린 대조군(0% 성장 억제)과 비교해 볼 때 50%로 세포 성장을 억제하는(IC50) 테트라사이클린의 농도는 상기 곡선으로부터 계산된다. 성장을 측정하는 다른 방법이 또한 고려된다. 이러한 방법의 예는 단백질의 측정을 포함하며, 여기서 상기 단백질의 표현은 시험되는 세포로 조종되고 쉽게 결정될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 녹색 형광성 단백질(GFT) 및 다양한 효소를 포함한다.
세포는 테트라사이클린의 선택된 농도로 예비처리되고 후보 화합물에 대한 세포 집단의 민감도를 시험하는데 사용된다. 예를 들어, 세포는 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상까지 성장을 억제시키는 테트라사이클린의 농도로 예비처리될 수 있다. 이어서, 세포는 후보 화합물과 접촉되고, 테트라사이클린 함유 배지에서의 세포의 성장을 테트라사이클린이 결핍된 배지에서의 대조군 세포의 성장과 비교하여, 후보 화합물이 감작된 세포(즉, 테트라사이클린의 존재에서 성장된 세포)의 성장을 억제하는지를 결정한다. 예를 들어, 테트라사이클린 함유 배지에서의 세포의 성장을 테트라사이클린 결핍 배지에서의 세포의 성장과 비교하여, 후보 화합물이 감작된 세포(즉, 테트라사이클린의 존재에서 성장된 세포)의 성장을 테트라사이클린의 부재에서 성장된 세포의 성장을 억제하는 것보다 더욱 큰 범위로 억제하는지를 결정한다. 예를 들어, 상당한 성장에서의 차이가 감작된 세포(즉, 테트라사이클린의 존재에서 성장된 세포)와 비감작된 세포(즉, 테트라사이클린의 부재에서 성장된 세포) 사이에서 발견되는 경우, 후보 화합물은 유기체의 증식을 억제하는데 사용될 수 있거나, 추가로 최적화되어 유기체의 성장, 생존, 또는 증식을 억제하는 훨씬 우수한 능력을 가지는 화합물을 확인한다.
유사하게는, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물의 속도 제한적인 양을 나타내는 후보 화합물에 노출된 세포의 독성 또는 병인성을, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물의 표현 수준이 속도 제한적이지 않은 후보 화합물에 노출된 세포의 독성 또는 병인성과 비교할 수 있다. 이러한 방법에서, 시험 동물은 GRACE 균주으로 자극시키고, 목적하는 양의 테트라사이클린 및 후보 화합물을 함유하는 음식물을 공급한다. 따라서, 시험 동물을 감염시키는 GRACE 균주는 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물의 속도 제한적인 양을 표현한다(즉, 시험 동물내 GRACE 세포가 감작된다). 대조군 동물은 GRACE 균주으로 자극시키고, 테트라사이클린이 결핍된 후보 화합물을 함유하는 음식물을 공급한다. 시험동물내 GRACE 균주의 독성 또는 병인성을 대조군 동물의 독성 또는 병인성과 비교한다. 예를 들어, 시험 동물내 GRACE 균주의 독성 또는 병인성을 대조군 동물의 독성 또는 병인성을 비교하여 후보 화합물이 감작된 GRACE 세포(즉, 음식물에 테트라사이클린이 포함된 동물의 세포)의 독성 또는 병인성을, 후보 화합물이 음식물에 테트라사이클린을 결핍시켜 공급한 동물내 GRACE 세포의 성장을 억제하는 것보다 큰 범위로 억제시키는지를 결정한다. 예를 들어, 성장에서의 상당한 차이가 감작된 GRACE 세포(즉, 음식물에 테트라사이클린이 포함된 동물의 세포)와 비감작된 세포(즉, 음식물에 테트라사이클린이 포함되지 않은 동물의 세포) 사이에서 발견되는 경우, 후보 화합물은 유기체의 독성 또는 병인성을 억제하는데 사용될 수 있거나, 추가로 최적화되어 유기체의 독성 또는 병인성을 억제하는 훨씬 우수한 능력을 가지는 화합물을 확인한다. 독성 또는 병인성은 본원에 기술된 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
상기 세포 기초된 분석법은 각각 본원에 기술된 칸디다 알비칸스 유전자 산물에 대해 동종인 칸디다 알비칸스 이외의 다른 유기체로부터 유전자 산물의 활성을 억제하는 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 산물은 아스페르질루스 푸미가투스, 아스페르질루스 니게르, 아스페르질루스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오이데스 이미티스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라즈마 캡술라툼, 뉴모키스티스 카리니, 트리코스포론 베이겔리, 리조푸스 아르히주스, 무코르 룩시, 리조무코르 푸실루스 또는 아브시디아 코림비게라와 같은 동물성 진균 병원균, 또는 보트리티스 시네리아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르싸 그리시아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시, 틸레티아 콘트로베르사, 유스틸라고 메이디스와 같은 식물성 진균 병원균 또는 상기 종들 중 임의의 유전자내에 속하는 임의의 종으로부터의 유전자 산물일 수 있다. 일부의 양태에서, 유전자 산물은 사카로마이세스 세레비시아에 이외의 다른 유기체로부터의 유전자 산물이다.
전술한 세포 기초된 분석법은 진균 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 핵산 또는 상기 핵산의 유전자 산물이 위치하는 생물학적 경로를 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 진균 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 표적 핵산의 속도 제한적인 수준을 표현하는 세포 및 표적 핵산의 표현이 속도 제한적이지 않은 대조군 세포는 다양한 경로에서 작용하는 것으로 공지된 항생 작용의 패널과 접촉한다. 상기 항생 작용이 표적 핵산 또는 그의 유전자 산물이 위치하는 경로에서 작용하는 경우, 표적 핵산의 표현이 속도 제한적인 세포는 표적 핵산의 표현이 속도 제한적이지 않은 세포보다 항생 작용에 대해 더욱 민감하다.
대조군으로서, 분석법의 결과는 표적 유전자를 포함하는 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 많은 상이한 유전자의 수준이 속도 제한적인 세포의 패널을 접촉시킴으로써 확립될 수 있다. 항생이 특히 작용되는 경우, 항생 작용에 대한 높은 민감도는 표적 화합물이 속도 제한적인 세포(또는 표적 유전자와 동일한 경로에서의 유전자가 속도 제한적인 세포)에서만 관찰되나, 증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 유전자 산물이 속도 제한적인 것으로 나타나지 않는다.
증식, 독성 또는 병인성에 대해 요구되는 핵산이 위치하는 생물학적 경로를 확인하기 위한 상기 방법은 본원에 기술된 칸디다 알비칸스 핵산에 대해 동종인 칸디다 알비칸스 이외의 다른 유기체로부터의 핵산에 적용될 수 있는 것으로 평가된다. 예를 들어, 핵산은 아스페르질루스 푸미가투스, 아스페르질루스 니게르, 아스페르질루스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오이데스 이미티스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라즈마 캡술라툼, 뉴모키스티스 카리니, 트리코스포론 베이겔리, 리조푸스 아르히주스, 무코르 룩시, 리조무코르 푸실루스 또는 아브시디아 코림비게라와 같은 동물성 진균 병원균, 또는 보트리티스 시네리아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르싸 그리시아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시, 틸레티아 콘트로베르사, 유스틸라고 메이디스와 같은 식물성 진균 병원균 또는 상기 종들 중 임의의 범위내에 속하는 임의의 종으로부터의 핵산일 수 있다. 일부의 양태에서, 핵산은 사카로마이세스 세레비시아에 이외의 다른 유기체로부터의 핵산이다.
유사하게, 상기 방법은 시험 항생물질과 같은 시험 화합물이 작용하는 경로를 결정하는데 사용될 수도 있다. 유전자 산물이 공지된 경로에 놓이는, 진균류 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물을 속도 제한적 양으로 각각 발현시키는 세포들의 패널을, 화합물의 작용 경로를 결정하는데 요구되는 화합물과 접촉시킨다. 시험 화합물에 대한 세포 패널의 감응성을, 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 발현이 속도 제한적 수준에 있는 세포, 및증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물의 발현이 속도 제한적 수준에 있지 않은 대조 세포에서 측정한다. 시험 화합물이 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 특정 유전자 산물이 놓이는 경로에 작용하는 경우, 상기 특정 유전자 산물의 발현이 속도 제한적 수준에 있는 세포는 기타 경로내의 유전자 산물이 속도 제한적 수준에 있는 세포보다 상기 화합물에 더 감응성이게 된다. 또한, 진균류 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 특정 유전자의 발현이 속도 제한적이지 않은 대조 세포는 상기 화합물에 대해 증강된 감응성을 나타내지 않을 것이다. 이러한 방식으로, 시험 화합물이 작용하는 경로를 결정할 수 있다.
시험 화합물이 작용하는 경로를 결정하기 위한 상기 방법은 본원에 기술된 칸디다 알비칸스 유전자 산물에 상동성인 유전자 산물의 활성 또는 양이 속도 제한적인 세포 패널을 사용함으로써 칸디다 알비칸스 이외의 유기체에도 적용될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 유전자 산물은 동물의 진균류 병원체, 예를 들어 아스페르길러스 푸미가투스, 아스페르길러스 니게르, 아스페르길러스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스,칸디다 파라프실롭시스,칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오디데스 임미티스, 엑소팔리아 더마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 카프술라툼, 뉴모사이스티스 카리니이, 트리코스포론 베이겔리이, 리조푸스 아리주스, 무코 룩시이, 리조무코 푸실루스 또는 압시디아 코림비게라, 또는 식물의 진균류 병원체, 예를 들어 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르테 그리세아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로버사, 우스틸라고 마이디스, 또는 상기 임의의 종의 속에 속하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서는 유전자 산물이 사카라마이세스 세레비시아에 이외의 유기체로부터 유래된다. 하기에 제공된 실시예 6.4는 이러한 분석을 수행하기 위한 한가지 방법을 기술하고 있다.
당해 기술분야의 숙련자는 진균류 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물의 속도 제한적 수준을 생성하는데 사용되는 인듀서 또는 리프레서의 농도와 같은 분석 조건 및/또는 분석에 사용되는 성장 조건(예컨대, 항온처리 온도 및 배지 성분)을 더욱 최적화하면, 나타나는 항생물질 감응성의 선택성 및/또는 크기를 더욱 증가시킬 수 있음을 알 수 있을 것이다.
성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자가 놓이는 경로 또는 항생물질이 작용하는 경로를 동정하기 위한 상기 방법은 본원에 기술된 칸디다 알비칸스 유전자 산물에 상동성인 유전자 산물이 속도 제한적인 칸디다 알비칸스 이외의 유기체를 사용하여 수행될 수도 있음을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 유전자 산물은 동물의 진균류 병원체, 예를 들어 아스페르길러스 푸미가투스, 아스페르길러스 니게르, 아스페르길러스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스,칸디다 파라프실롭시스,칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오디데스 임미티스, 엑소팔리아 더마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 카프술라툼, 뉴모사이스티스 카리니이, 트리코스포론 베이겔리이, 리조푸스 아리주스, 무코 룩시이, 리조무코 푸실루스 또는 압시디아 코림비게라, 또는 식물의 진균류 병원체, 예를 들어 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르테 그리세아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로버사, 우스틸라고 마이디스,또는 상기 임의의 종의 속에 속하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서는 유전자 산물이 사카라마이세스 세레비시아에 이외의 유기체로부터 유래된다.
또한, 상기한 바와 같이, GRACE 균주의 패널은 공지되지 않은 작용 메카니즘을 갖는 항생물질을 비롯한, 본질적인 생물학적 경로에 영향을 미치는 임의의 화합물의 개재 지점을 특성화하는데 사용될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 단백질 또는 핵산에 작용하는 공지된 항생물질을 아치사 농도로 세포와 접촉시킴으로써 진균류 성장, 생존, 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 경로에 관련된 단백질 또는 핵산의 활성을 감소시키는, 시험 항생물질 화합물이 활성을 갖는 경로를 결정하기 위한 방법이다. 이 방법은 GRACE 균주에서 유전자 산물을 속도 제한적 양으로 발현시킴으로써 진균류의 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 것이 아니라 유전자 산물에 작용하는 공지된 항생물질을 아치사 농도로 사용하여 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 것을 제외하고는, 시험 항생물질이 작용하는 경로를 결정하기 위한 상기 기술된 방법과 유사하다.
아치사 농도의 공지된 항생물질이 존재함으로 인해 생기는 성장 억제는 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과일 수 있다.
또는, 성장 억제를 측정하는 것이 아니라 표적 증식에 필요한 유전자 산물의활성을 측정함으로써 공지 화합물의 아치사 농도를 결정할 수도 있다.
세포를 아치사 농도의 공지 항생물질 패널의 각 구성원과 다양한 농도의 시험 항생물질의 조합물과 접촉시킨다. 대조용으로서, 다양한 농도의 시험 항생물질 단독과 접촉시킨다. 공지 항생물질의 존재 또는 부재 하에 시험 항생물질의 IC50을 측정한다. 공지 약물의 존재 및 부재 하의 IC50이 실질적으로 유사한 경우, 시험 약물과 공지 약물은 상이한 경로에 작용한다. 상기 IC50이 실질적으로 상이한 경우, 시험 약물과 공지 약물은 동일한 경로에 작용한다.
본원에 기술된 칸디다 알비칸스 서열에 상동성인 유전자 산물에 작용하는 공지 항생물질을 사용하여 유사한 방법을 수행할 수 있다. 상동 유전자 산물은 동물의 진균류 병원체, 예를 들어 아스페르길러스 푸미가투스, 아스페르길러스 니게르, 아스페르길러스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스,칸디다 파라프실롭시스,칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오디데스 임미티스, 엑소팔리아 더마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 카프술라툼, 뉴모사이스티스 카리니이, 트리코스포론 베이겔리이, 리조푸스 아리주스, 무코 룩시이, 리조무코 푸실루스 또는 압시디아 코림비게라, 또는 식물의 진균류 병원체, 예를 들어 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르테 그리세아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로버사, 우스틸라고 마이디스, 또는 상기 임의의 종의 속에 속하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서는 유전자 산물이 사카라마이세스 세레비시아에 이외의 유기체로부터 유래된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 표적 단백질 또는 핵산에 작용하는 공지 항생물질을 아치사 농도로 세포와 접촉시킴으로써 진균류 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 경로에 관련된 표적 단백질 또는 핵산의 활성을 감소시키는, 항생물질로서 사용하기 위한 후보 화합물을 동정하기 위한 방법이다. 이 방법은 유전자 산물을 속도 제한적 양으로 발현시키는 GRACE 균주를 사용하여 진균류의 증식, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 것이 아니라 유전자 산물에 필요한 증식에 작용하는 공지 항생물질을 아치사 농도로 사용하여 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 것을 제외하고는, 항생물질로서 사용하기 위한 후보 화합물을 동정하기 위한 상기 기술된 방법과 유사하다.
아치사 농도의 공지 항생물질로 인한 성장 억제는 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상 또는 약 75% 이상, 또는 그 이상일 수 있다.
또는, 성장 억제를 측정하는 것이 아니라 표적 증식에 필요한 유전자 산물의 활성을 측정함으로써 공지 화합물의 아치사 농도를 결정할 수도 있다.
관심있는 시험 화합물을 특성화하기 위해, 세포를 아치사 농도의 공지 항생물질 패널 및 한가지 이상의 농도의 시험 화합물과 접촉시킨다. 대조용으로서, 세포를 동일한 농도의 시험 화합물 단독과 적촉시킨다. 공지 항생물질의 존재 또는 부재 하의 시험 화합물의 IC50을 측정한다. 공지 약물의 존재 및 부재 하의 IC50이 실질적으로 상이한 경우, 시험 화합물은 항생물질로서 사용하기 위한 양호한 후보가 된다. 상기한 바와 같이, 상기 방법을 사용하여 후보 화합물이 동정되면 그의 구조를 순열조합 화학과 같은 표준 기법을 사용하여 최적화할 수 있다.
본원에 기술된 칸디다 알비칸스 서열에 상동성인 유전자 산물에 작용하는 공지 항생물질을 사용하여 유사한 방법을 수행할 수 있다. 상동 유전자 산물은 동물의 진균류 병원체, 예를 들어 아스페르길러스 푸미가투스, 아스페르길러스 니게르, 아스페르길러스 플라비스, 칸디다 트로피칼리스,칸디다 파라프실롭시스,칸디다 크루세이, 크립토코쿠스 네오포르만스, 콕시디오디데스 임미티스, 엑소팔리아 더마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 카프술라툼, 뉴모사이스티스 카리니이, 트리코스포론 베이겔리이, 리조푸스 아리주스, 무코 룩시이, 리조무코 푸실루스 또는 압시디아 코림비게라, 또는 식물의 진균류 병원체, 예를 들어 보트리티스 시네레아, 에리시페 그라미니스, 마그나포르테 그리세아, 푸시니아 레코디타, 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로버사, 우스틸라고 마이디스, 또는 상기 임의의 종의 속에 속하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서는 유전자 산물이 사카라마이세스 세레비시아에 이외의 유기체로부터 유래된다.
예시적인 표적 유전자 산물은CaTBF1에 의해 암호화된다. 다수의 특징으로 이러한 칸디다 알빈칸스 유전자 산물은 유용한 약물 표적이 된다. 첫째로,CaTBF1에 의해 암호화된 단백질은 그의 활성을 억제하는 화합물의 시험관내 고효율 선별(high throughput screening)에 적합하다. 동정되는 가능한 억제 화합물의 범위를 넓히기 위해, 전세포 분석에서의 유전자 산물의 조절된 발현을 시험관내 분석과 동시에 수행할 수 있다. 또한,CaTbf1p와 염색체 텔로머라제 사이에 예측되는물리적 상호작용을 입증하여 약물 선별 목적을 위한 2 혼성(two-hybrid) 분석을 개발할 수 있다. 마지막으로,CaTBF1이 진균류 특이적 유전자이기 때문에, 그의 뉴클레오타이드 서열이 진균류 감염을 위한 PCR-기초 진단 수단을 설계하는데 사용될 수 있다.
바람직한 약물 표적을 나타내는 GRACE-유래 균주 집합체에 포함되는 다른 유효한 약물 표적으로는 칸디다 알비칸스 속CaRHO1,CaERG8, CaAUR1및CaCHO1에 의해 암호화되는 산물 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 1 내지 62에 의해 암호화되는 산물을 포함한다. 이들 속을 본 발명의 GRACE 방법을 사용하여 조작할 수 있는 능력은 이러한 중요한 유전자 산물의 억제제를 동정하도록 설계되어 있는, 현재 사용중인 약물 선별 관행을 개선시킬 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 병원체의 모든 잠재적인 약물 표적을, 예를 들어 96웰 마이크로역가 플레이트 포맷을 사용하여 화합물들의 라이브러리에 대해 동시에 선별할 수 있는데, 이 때 원심분리 후의 광학 밀도 또는 펠릿 크기에 의해 측정되는 성장을 각 웰에서 측정할 수 있다. 약물 선별에 대한 게놈 접근법은 어느 표적을 선별하는 가를 평가하는데 사용되는 임의적 및 인위적인 기준에 잠재적으로 의존하는 것을 없애고, 그 대신 모든 잠재적 표적을 선별할 수 있게 한다. 이러한 접근법은 바람직한 과정을 억제하는 특정 화합물(예컨대, 세포벽 생합성 유전자 산물)의 동정 가능성 뿐만 아니라 그 라이브러리 내에 있고 상기 화합물을 그의 동족 세포 표적에 결합시키는 모든 항균 화합물의 동정 가능성을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, GRACE 균주를 선별하여 합성적 치사 돌연변이를 동정하고, 이로써 유의적인 치료값을 갖는 잠재적으로 신규한 부류의 약물 표적을 밝힌다. 예를 들어, 2종의 별개 유전자가 공통적이고 본질적인 세포 기능에 관여하는 상동 단백질을 암호화할 수 있고, 이 때 이러한 기능의 본질적 성질은 단지 두 부류 구성원 모두의 불활성화시에만 명백해질 것이다. 따라서, 각 유전자의 가치없는 표현형을 별도로 조사하는 것은 조합된 유전자 산물의 본질적 성질을 드러내지 않을 것이고, 결과적으로 이러한 잠재적 약물 표적은 동정되지 않을 것이다. 유전자 산물이 서로에 대해 고도로 상동성이면, 하나의 부류 구성원을 억제하는 것으로 밝혀진 화합물은 다른 구성원도 억제할 것이고, 따라서 유전적으로 입증된 합성적 성장 억제에 도달하는 것으로 예상된다. 그러나, 다른 경우에는 합성적 치사성이, 조합될 때 상승적 성장 감소(세포 사멸)를 가져오는, 겉보기에는 관련이 없는 것 같은(종종 비본질적인) 과정을 밝힐 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에 유전자RVS161의 분열이 이러한 단일 돌연변이를 포함한 효모에서 어떠한 식별가능한 식물 성장 표현형도 제공하지 않더라도, 9가지 이상의 다른 유전자가RVS161의 불활성화와 조합될 때 합성적 치사 효과를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 이들 유전자는 세포골격 조립체 및 세포내 분열물로부터 시그널 형질도입에서 지질 대사작용에 이르는 과정에 과정에 관여하고, 약물 표적 전략을 추적하는 다중 길(avenue)을 동정한다. 본질적 및 비본질적 약물 표적과의 밝혀진 합성적 치사적 상호작용에 대한 직접적 접근법을 이제 수행하고, 이 때 GRACE 균주 또는 이형접합 균주는 시험 화합물에 대해 향상된 감응성을 나타내는 것으로 동정되는데, 이는 이것이 약물 표적에 대해 감소된 수준의 활성을 나타내기 때문이 아니라 그의 돌연변이가 제 2 약물 표적의 억제와 조합되어 합성적으로 치사성이기 때문이다. 화합물이 감응성화된 GRACE 균주 또는 이형접합 균주 내의 약물 표적 또는 제 2 표적을 특이적으로 억제하는 지를 식별하는 것은 전체 GRACE 또는 이형접합 균주 세트를, 화합물에 대해 동일하거나 보다 큰 감응성을 나타내는 추가의 돌연변이 균주를 선별하고, 그후 2가지 돌연변이 사이에 합성적 치사성을 나타내는 이중 돌연변이 균주를 유전적으로 특성화함으로써 달성될 수 있다.
5.5.2.2 GRACE 균주에 의한 비-항진균성 치료제 선별
병인성 진균류 및 이에 의해 감염되는 포유류 숙주 사이에 존재하는 생물화학적 유사성은 임상적으로 유용한 항균 화합물의 범위를 제한한다. 그러나, 이러한 유사성을 GRACE 균주 집합체를 사용하여 활용해서, 항균제로서 사용되지 않고 암, 염증 등과 같은 광범위한 범위의 질환 치료에 유용한 치료제의 발견을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 이러한 실시양태에서, 동물 또는 식물 내의 질병 유발 유전자에 상동성인 진균 유전자를 선택하고 이러한 유전자 세트의 GRACE 균주를, 이들 유전자에 대해 강력하고 특이적인 생활성을 나타내서 질환 치료에 잠재적인 의학적 가치를 갖는 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 본질적 및 비본질적 유전자 및 이러한 유전자의 대립형질 쌍을 갖는 상응하는 GRACE 균주가 본 발명의 이러한 실시양태에 유용하다. 칸디다 알비칸스 게놈 내에서 발견된 유전자의 40%가 인간의 기능성 상동체를 공유하고 있는 것으로 예상되어 왔다. 또한, 인간 유전자의 1% 이상이 인간 질환에 관련되어 있어 잠재적인 약물 표적으로서 작용할 수 있는 것으로 예상되어 왔다. 따라서, GRACE 균주 집합체 내의 많은 유전자가 질환 유발 인간 유전자에 상동성이고, 이러한 유전자 세트의 개개 구성원을 특이적으로 불활성화시키는 화합물이 실제로 대안적인 치료적 가치를 가질 수 있다. 본 발명은 변형된 대립형질 유전자가 동물 또는 식물의 1종 이상의 질환과 관련된 유전자와 서열, 구조적 및/또는 기능적 유사성을 공유하는 다수의 GRACE 균주를 제공한다.
예를 들어, 세포 주기 진행을 촉진시키고 종종 다양한 암으로 혼란이 일어나는 시그널 형질도입 기구의 다수가 진균류 내에 유지된다. 이들 유전자의 다수는 구조적으로도 기능적으로도 관련이 있는 사이클린, 사이클린 의존성 키나제(CDK) CDK 억제제, 포스파타제 및 전사 인자를 암호화한다. 그 결과, 임의의 이들 기능성 부류의 단백질에 대해 특이성을 나타내는 것으로 밝혀진 화합물은 잠재적 항암 활성을 시험하기 위해 2차 선별에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 이러한 방법으로 동정된 세포독성 화합물은 암 유발 표적에 작용할 필요가 없어서 치료적 잠재성을 나타낸다. 예를 들어, 흉부암 및 난소암용 치료제로서 유망한 항암 화합물의 탁솔(taxol) 부류는 튜불린에 결합하고 미소세관 조립체를 촉진킴으로써 정상적인 미소세관 동태를 분열시킨다. 효모 튜불린은 탁솔에 대해 유사한 감응성을 나타내며, 이는 효모와 인간 사이에 공유된 다른 기본적 세포 과정에 영향을 미치는 추가의 화합물이 유사하게 동정될 수 있고 항종양 활성에 대해 평가될 수 있음을 암시해준다.
발병 현상은 미생물의 발생학적 경계를 훨씬 넘어서 확장되고, 궁극적으로는 그 기초를 이루는 생리학을 반영한다. 많은 방법에서, 암 현상은 칸디다 알비칸스와 같은 기회성 병원체에 의한 발병 과정과 유사하다. 이들은 둘다 사람 자신의 세포 또는 그의 자연적 파우나로부터의 미생물에 의해 야기되는 비-감염성 질환이다. 이들 세포는 면역계에 의해 억제되지 않는 방식으로 성장하고, 둘다의 경우 생명 유지에 필요한 기관의 콜로니화 및 결과적인 조직 손상에 의해 질환이 나타나게 되어 죽음을 초래하게 된다. 효과적인 약물-기초 치료는 또한 두 질환을 잘 알 수 없는데, 그 주된 이유는 두 경우의 병원체가 숙주와 매우 관련이 있기 때문이다.
실제로, 암과 관련이 없는 과정에 영향을 미치는 다수의 성공적 치료 약물이 또한 항진균성 약물 선별 프로그램을 통해 발견되었다. 한가지 임상적으로 중요한 부류의 화합물로는 면역억제제 분자인 라파마이신, 사이클로스포린 A 및 FK506을 포함하는데, 이는 보존된 시그널 형질도입 성분을 억제한다. 사이클로스로린 A 및 FK506은 독특한 약물-프롤릴 이소머라제 복합체(각각 CyPA-사이클로스포린 A 및 FKBP12-FK506)를 형성하고, 이는 칼슘 및 칼모둘린 의존성 포스파타제 칼시뉴린의 정규적(regulatory) 하위단위에 결합하여 이를 불활성화시킨다. 또한 라파마이신은 FKBP12와 복합체를 형성하지만 이러한 약물-단백직 복합체는 또한 포스파티딜리노시톨 키나제의 TOR 부류에도 결합하여 번역 및 세포 주기 진행을 억제한다. 각각의 경우, 약물 작용 메카니즘 및 약물 표적 자체는 모두 효모와 인간 사이에서 크게 보존된다. 칸디다 알비칸스 약물 표적의 동정 및 본질적 유전자, 진균 특이적 및 병원체 특이적 표적 세트로의 상기 약물 표적의 집단화(grouping)는 임의의 이들 표적의 개개 구성원과 상호작용하여 이를 억제하는 화합물을 위한 전세포 선별 개발의 기초를 제공한다. 따라서, 다른 특이적인 공통 기능 또는 특성을 갖는 약물 표적을 암호화하는 유전자의 변형된 대립형질 쌍을 갖는 다른 GRACE 균주 세트를 동정하는데 유사한 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자에 고도로 상동성인 유전자 표적, 또는 공통의 생화학적 기능 및 효소 활성을 나타내거나 탄소 화합물 이화작용, 보신서시스(bosynthesis), 분자 수송(트랜스포터 활성), 세포 국소화, 시그널 형질도입 캐스케이드, 세포 주기 조절, 세포 흡착, 전사, 번역, DNA 복제 등에 관련된 유전자 표적을 포함하는 GRACE 균주의 하위세트를 규정할 수 있다.
5.5.2.3
표적 유전자 투여량-기초 전세포 분석
유전자 기능을 추정할 수 있는 표현형을 밝히기 위해 암호화 유전자의 발현량을 조절하는 것을 포함하는 실험은 칸디다 알비칸스와 같은 병인성 2배체 진균에서 본 발명의 균주 및 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 약물 선별에서의 약물-표적-양 변화의 원리는 약물 표적의 발현량을 조절하여 특이적 약물 내성 및 약물 감응성 표현형을 동정함으로써 약물 표적을 특정 화합물에 결합시키는 것을 포함한다. 종종, 이들 표현형은 이러한 화합물의 진정한 약물 표적을 암호화하는 표적 유전자를 나타낸다. 그렇지 않은 예에서는, 그럼에도 불구하고 후보 표적 유전자가, 화합물에 의해 억제된 것과 관련된 경로 또는 과정에서 기능하거나(예컨대, 합성적 표현형을 생성하거나) 또는 그 대신 동정된 화합물과 관련된 약물 내성 메카니즘으로서 기능하는 진정한 표적 유전자에 대해 중요한 판별력을 제공한다.
표적 단백질의 발현량 변화는 또한 약물 선별법 및 약물 표적 동정법 모두에도입된다. 2배체 유기체의 유전자 산물의 총 세포 발현량은 상기 유전자 산물을 암호화하는 유전자의 대립형질 유전자 1개를 분열시켜 그의 기능적 활성을 절반으로 감소시켜 "하플로인서피시언트(haploinsufficient)" 표현형을 생성시킴으로써 변형된다. 이형접합성 사카로마이세스 세레비시아에 균주 집합체를 이러한 하플로인서피시언트 선별에 사용하여 약물-기초 내성 및 과감응성 표현형을 이형접합성 약물 표적에 결합시켜 왔다. 비본질적 유전자는 하플로이드 결실 균주 집합체를 사용하여 특이적 표현형 또는 "케모형(chemotype)"을 위한 화합물 라이브러리에 대해 직접 선별한다. 그러나, 이러한 방법은 표적 유전자가 본질적인 것인 경우에는 하플로이드 유기체에 사용할 수 없다.
또한, 주어진 유전자 산물의 발현량은 유전자를 세포 내에 다중카피로 유지된 플라스미드 벡터로 클로닝함으로써 평가한다. 또한, 암호화 유전자의 과발현은 유전자 산물의 상응하는 개방 판독 프레임을 플라스미드 다중카피 상에 포함된 보다 강력한 프로모터에 융합시킴으로써 달성된다. 이들 방법을 이용하여, 다수의 과발현 균주를 사카로마이세스 세레비시아에서 성공적으로 사용하여 기존의 치료 화합물에 의해 한정된 단백질 표적을 동정할 뿐만 아니라 특성화된 약물 표적과 상호작용하는 신규한 화합물을 발견하였다.
GRACE 균주 집합체는 병원체 내에서 직접 약물 표적을 위한 유전자 발현량을 극적인 범위로 제공함으로써 전세포 약물 선별에 있어서 사카로마이세스 세레비시아에를 대신한다(도 5). 본 발명의 한 실시양태에서, 이는 칸디다 알비칸스-적합성 테트라사이클린 프로모터 시스템을 사용하여 GRACE 균주를 구성함으로써 달성된다. 비억제된 조건(즉, 테트라사이클린이 없는 조건) 하에서 성장된 30가지의 상이한 GRACE 균주의 노던 블롯 분석 결과, 시험한 조건 발현된 유전자의 83%가 야생형의 3배보다 많거나 그와 동일한 발현량을 유지하고, 실험한 모든 유전자의 60%가 GRACE 균주 구성에 사용된 야생형 칸디다 알비칸스 균주의 5배보다 많거나 그와 동일하게 발현됨이 밝혀졌다. 각각의 GRACE 균주가 실제로 이형접합성이기 때문에, 이러한 발현 범위는 그의 각각의 이형접합체 균주와 비교할 경우 2배가 될 것으로 추측된다. 대부분의 GRACE 균주의 경우, 이는 표준 2μ기준 다중카피 플라스미드를 사용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 전형적으로 달성되는 상승된 발현량 경쟁, 및CaACT1프로모터에 의해 제공되는 구성적 발현에 필적하는 절대량의 구성적 발현을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 GRACE 균주 집합체는 억제 조건 하에서의 표적 유효화에 유용할 뿐만 아니라, 전세포 분석법 개발 및 약물 선별을 위한 비억제 조건 하에 이들 유효화된 약물 표적을 과발현하는 균주의 집합체로서도 유용하다.
GRACE 균주중 표적 유전자 산물의 발현량 변화는 또한 항균 화합물에 대한 내성을 조사하는데도 사용된다. 기존의 항진균성 치료제에 대한 내성은 이용가능한 항진균성 약물 수의 제한 및 놀라운 의존성 둘다를 반영해주고, 의존 약리학자들이 이들을 규명하고 있다. 예를 들어, 진균류 감염 치료를 위한 플루코나졸과 같은 아졸계 화합물에 대한 의존성은 이러한 화합물의 임상적 치료 가치를 크게 불식시켰다. GRACE 균주 집합체는 플루코나졸의 세포 표적과 상호작용하는 유전자 산물을 동정함으로써 플루코나졸 내성과 싸우는데 사용된다. 이러한 산물은, 플루코나졸과 협력하여 불활성화될 경우 상승 효과를 제공하여 이러한 화합물이 단독으로 사용될 때 보이는 플루코나졸 내성을 극복하는 약물 표적을 동정하는데 사용된다. 이는 예를 들어 약물 내성을 향상시키는 유전자를 과발현시키는데 GRACE 균주 집합체를 사용함으로써 달성된다. 이러한 유전자로는 ATP-결합 카셋트(ABC) 트랜스포터 및 다중약물 내성(MDR) 에플럭스 펌프, 플레이오트로픽(pleiotroic) 약물 내성(PDR) 전사 인자, 및 단백질 키나제 및 포스파타제를 비롯한 신규하거나 공지된 혈장 막 엑스포터(exporter)를 포함한다. 또는, 상이한 약물 감응성을 특이적으로 나타내는 유전자는 표적 유전자의 개개 구성원을 감소된 양으로(테트라사이클린 프로모터를 통한 하플로인서피시언트 또는 문턱 발현으로) 발현하는 GRACE 균주를 선별함으로써 동정된다. 이러한 유전자를 동정하는 것은 약물-기초 불활성화를 표적화하여 기존의 항진균성 치료제의 효능을 향상시킬 수 있는 약물 내성 메카니즘에 대한 중요한 단서를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 전세포 분석 목적을 위한 표적 유전자의 과발현은 테트라사이클린 프로모터 시스템 이외의 프로모터에 의해 뒷받침된다(5.3.1 부분 참조). 예를 들어,CaPGK1프로모터는 칸디다 알비칸스 약물 표적 유전자를 과발현하는데 사용된다. 사카로마이세스 세레비시아에서 PGK1 프로모터는 글루코스의 존재하에 강한 구성적 발현을 제공하는 것으로 공지되어 있다. 구쓰리에(Guthrie, C.) 및 핀크(G. R. Fink)의 문헌[1991. Guide to yeast genetics and molecular biology. Methods Enzymol. 194:373-398]을 참조한다.CaPGK1프로모터의 제어 하에 놓인 5가지 칸디다 알비칸스 유전자(CaKRE9,CaERG11, CaALG7, CaTUB1및CaAUR1)의 예비 분석 결과, 노던 블롯 분석에 의해 판단할 때 야생형에 비하여 극적인 과발현을 함이 밝혀졌다. 모든 유전자에서 달성된 과발현의 양은 테트라사이클린 프로모터에 의해 수득되는 양을 3 내지 4배 초과한다. 또한, 테트라사이클린 프로모터를 사용하여 구성적으로 발현될 경우 현저히 과발현되지 않은aAUR1은 야생형CaAUR1발현량에 비하여 5배 과발현되었고, 이는aPGK1프로모터가 테트라사이클린 프로모터에 의해 정상적으로 발현되지 않은 유전자를 과발현하는데 유용함을 암시해준다.
본 발명의 또 다른 양태에서, GRACE 균주 집합체 내의 개개의 약물 표적의 중간체 발현량은 독특한 전세포 분석의 개발을 위해 개조된 균주를 제공하도록 조절될 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서는, GRACE 균주를 전사물의 부분적 발현만을 제공하는 것으로 측정된 테트라사이클린 농축물을 함유한 배지에 성장시켰다. 이러한 조건 하에서는 구성적으로 발현된 과생성 균주의 발현량과 야생형 균주의 발현량 사이의 발현량 뿐만 아니라 야생형 균주의 발현량보다 낮은 발현량을 유지시키는 것이 가능하다. 즉, 발현량을 세포 생존력에 필요한 최소값으로 적정하는 것이 가능하다. 유전자 발현을 이러한 임계적 상태로 억제함으로써, 기능 돌연변이의 부분적 상실에 의해 제조되는 것을 닮은 신규한 표현형(즉, 하이포모픽(hypomorphic) 돌연변이체)를 제조하고, 전세포 분석법 개발 및 약물 선별에 적용가능한 추가의 표적 발현량을 제공할 수 있다. 따라서, 본질적 유전자의 나머지 대립형질 유전자의 발현을 생존력에 필요한 문턱 양으로 억제하면, 이러한 본질적 유전자 산물에 활성인 화합물에 대해 향상된 감응성을 갖는 균주가 제공될것이다.
약물 선별에 대한 전세포 분석의 이용가능성을 입증하기 위해,CaHIS3이형접합 균주 및 테트라사이클린 프로모터-조절된CaHIS3GRACE 균주 둘다를 3-아미노트리아졸(3-AT)에 대해 야생형(2배체)CaHIS3균주와 비교하였다(실시예 6.3). 이들 실험으로부터 얻어진 데이터는 병원체 내에서 합성된 독특한 양의 표적 유전자 산물을 약물 선별을 기초로 한 전세포 분석에 직접 적용하여, GRACE 방법을 사용하여 입증된 신규한 약물 표적에 활성인 신규한 항진균성 화합물을 동정할 수 있음을 명백히 나타낸다.
5.5.2.4 태그 균주의 사용
본 발명의 또다른 양태에서, 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열 태그 또는 "바 암호(bar code)"를 유효한 표적 유전자의 이형접합 균주 집합체내에 포함된 개개의 돌연변이 균주로 도입한다. 이들 서열 태그의 존재는 약물 선별에 대한 대안적인 전체 세포 분석 시도를 가능하게 한다. 다수의 표적 균주를 혼합된 군집에서 (개별적이기 보다는) 동시에 선별하여 특정 약물 표적 및 그의 억제성 제제 사이의 표현형을 확인할 수 있다.
대규모 평행 분석은, 전체가 바 암호화된 이형접합 필수 균주 집합체 표적 세트의 혼합된 군집을 사용하여 화합물의 존재하에 성장 전후에 혼합된 군집내에서 비교적 대표적인 개개의 균주를 비교함으로써 수행된다. 독특한 바-암호화된 균주의 약물-의존성 결실 또는 과발현은, 혼합된 군집내에서 모든 바 암호를 PCR-증폭시키고 형광 표지하고, 생성된 PCR 산물을 상보적 올리고뉴클레오타이드의 배열로하이브리드화함으로써 측정된다. 바 암호화된 균주 사이의 상이한 발현은 유전자-특이적 과민반응 및 내성을 나타내고, 상응하는 유전자 산물이 시험된 화합물의 분자 표적을 나타낼 수 있음을 제시한다.
구체적인 제 1 실시양태에서, 돌연변이 균주는 GRACE 균주이고, GRACE 균주 세트는 각각 독특한 분자 태그를 포함하는데, 이는 일반적으로 첫 번째 대립유전자 쌍을 대체하여 변형시키는데 사용되는 카세트내로 도입된다. 각각의 분자 태그의 양측면에 시험될 세트의 모든 1종에 공통적인 프라이머 서열이 위치한다. 성장은 시험될 화합물의 존재 및 부재하에 억제성 배지 및 비억제성 배지에서 수행된다. 각각의 균주의 상대적인 성장은 끼워진 서열 태그의 전체 집합체의 PCR 증폭을 동시에 수행함으로써 평가된다.
본 발명의 한 비제한적인 양태에서, PCR 증폭은 형광 프라이머를 사용하여 비대칭 방법으로 수행되고, 그 결과 수득된 단일 표준 핵산 산물은 표면에 고정된 올리고뉴클레이티드 배열로 하이브리드화되어 전체 상응하는 상보적 서열의 세트를 포함한다. 각각의 형광 분자 태그 서열의 분석값을 결정하여 시험된 화합물의 존재 및 부재하에, 세트 중 GRACE 균주의 성장의 상대적인 양을 상기 배지에서 평가하였다.
따라서, 시험된 세트의 각각의 GRACE 균주에 대해, 이러한 방법의 한 비제한적인 실시예로는, 생존하는 군집내에서 발견되는 상응하는 분자 태그의 양에 대한 4개의 값일 수 있었다. 이들은 시험될 화합물의 존재 및 부재하 억제성 및 비억제성 조건하의 세포 성장에 상응할 것이다. 시험 화합물의 존재 및 부재하에 성장을비교하면 각각의 성장 배지 세트에 대한 값 또는 "지표"(즉 억제성 및 비억제성 조건하에 유도된 지표)를 제공한다. 또한, 2개의 지표 값을 비교하면, 시험되는 GRACE 세트의 구체적인 1종에 의해 운반되는 변형된 대립유전자 쌍에 의해 발현되는 유전자 산물에 대한 시험 화합물의 활성 여부가 밝혀질 것이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 이형접합 태그 또는 바-암호 집합체에서 각각의 가능한 약물 표적 유전자는 Tet 프로모터 또는 다른 강력한 구조적으로 발현되는 프로모터(예:CaACTI, CaADHI 및 CaPGKI)를 잔류하는 분열되지 않은 대립유전자의 업스트림으로 후속적으로 도입시킴으로써 과발현될 수 있다. 이들 구조물은 혼합된 군집 약물의 민감성 연구에 사용되는 개개의 필수 유전자의 암호화된 표적 유전자 산물의 투여량을 추가로 증가시킨다. 과발현 자체는 다수종의 군집의 정상적인 성장 속도를 혼란시킬 수 없지만, 모형물 및 약물-처리된 혼합 배향물 사이를 여전히 확실히 비교할 수 있어 화합물-특이적 성장 차이를 확인할 수 있다.
사카라마이세스 세레비시아에에서, 3-아미노-트리아졸, 베노밀, 투니카마이신 및 플루코나졸을 비롯한 몇몇의 잘 특징지워진 화합물의 분자 약물 표적은 유사한 시도에 의해 확인되었다. 상기 연구에서, HIS3, TUB1, ALG7 및 ERG11에서 이형접합 돌연변이를 갖는 바-암호화된 균주는, (즉 상기 언급된 화합물에 대한 각각의 약물 표적) 혼합된 군집에서 함께 성장시켰을 때의 다른 이형접합 바-암호화된 균주 보다 각각의 화합물이 투여되었을 때 훨씬 더 큰 민감성을 나타냈다.
본 발명의 다른 양태에서, 항진균성 화합물에 대한 선별은 표적 균주에 대한 1개 이상의 화합물을 포함하는 화합물의 착체 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다.GRACE 균주 집합체의 태깅 또는 바-암호화는 유전자 세트를 확인하고 특정 유전자 세트내에서 개개의 표적을 궁극적으로 평가하는데 필요한 다수의 대규모 분석을 용이하게 한다. 예를 들어, 바-암호화된 GRACE 균주 집합체를 사용하는 혼합된-군집 약물 선별은 포괄적인 전체 세포 분석으로서의 기능을 효율적으로 한다. 착체 화합물 라이브러리의 최소량은 집합체내 각각의 필수 표적 유전자에 작용하는 화합물을 확인하는데 충분한다. 이는 상기 집합체를 배열시킬 필요없이 수행된다. 또한, 약물 선별에 넘기기 전에 임의의 특정 화합물 라이브러리가 '풍부'하다는 것에 대해 유력하게 예측할 수 있었다. 예를 들어, 카보하이드레이트-계 화학적 라이브러리가 천연 산물 또는 합성 화합물 라이브러리 보다 큰 살진균성 활성을 갖는지에 대해 평가할 수 있게 되었다. 분자의 임의의 착체 라이브러리내에서 특히 유력한 화합물을 약물 선별에 이용가능한 표적의 우선순위 및 분석에 따라 즉시 확인하고 평가할 수 있다. 또다르게는, 본 발명은 이러한 정보를 제공하여, 혼합된 군집 실험에서 특정 화합물 라이브러리에 의해 불활성화되는 것으로 판명되었던 표적만이 후속적인 배열-포맷이 지정된 선별에 포함되는, "테일러드(tailored)" 선별을 개발하는데 적용한다.
전형적으로, 약물 개발 프로그램은 유효한 약물 표적의 개별적인 또는 제한된 세트에 의존한다. 상기 실시예는 이러한 시도가 더 이상 필요하지 않고 높은 작업처리량의 표적 평가 및 약물 선별이 현재 가능함을 강조한다. 그러나, 약물 개발 프로그팸의 전문적인 기술, 이해관계, 전략 또는 예산에 따라 각각의 표적을 선택하는 것을 기준으로 하는 직접적인 시도가 바람직할 수 있다.
5.5.3 동물 모델 시스템에서의 표적 평가
현재, 필수 약물 표적의 유효성은 표준 실험 조건하에 유전자 불활성화의 효과를 조사함으로써 증명된다. 표준 실험 조건하에서 필수적이지 않게 될 추정 약물 표적 유전자는, 동물 모델내에서, 예를 들어 야생형 대한 표적 유전자의 결실에 대해 균주 동종접합체의 병인성을 시험함으로써 조사될 수 있다. 그러나, 필수 약물 표적은 동물 모델 연구로부터 배제된다. 따라서, 가장 바람직한 약물 표적은 이들 표적 평가와 가장 관련이 있는 조건으로부터 생략된다.
본 발명의 실시양태에서, GRACE 필수 균주 집합체가 제공하는 조건 발현은 숙주 환경내의 표적 유효화에 관해 오랫동안 계속되었던 제한을 극복하게 한다. 동물 연구는 GRACE 필수 균주가 접종된 마우스를 사용하고 조건 발현에 의한 유전자 불활성화의 효과를 조사함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, GRACE 필수 균주의 치사 접종량이 주입된 마우스에 미치는 영향은 약물 표적 유전자의 발현을 불활성화하는 접합한 농도의 테트라사이클린이 마우스에게 제공되었는지에 따라 측정될 수 있었다. 따라서, 실험 조건에서 필수적인 것으로 판명된 유전자 발현의 결여는 말단 칸디다 알비칸스(C. albicans) 감염의 예방과 서로 관련이 있을 수 있다. 이러한 유형의 실험에서, 표적 유전자의 불활성화는 숙주내에서 GRACE 균주 병원균을 죽이기 때문에 테트라사이클린-보충된 물로 "처리된" 마우스만이 감염에도 불구하고 생존할 것으로 예측된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 조건 발현은 표적 유전자의 발현을 조절하는 온도-감응 프로모터, 또는 30℃에서는 기능성이지만 마우스의 정상 체온내에서는 불활성화되는 특정 약물 표적의 온도 민감성 대립유전자를 사용하여 달성될 수 있었다.
필수 유전자에 대해 전술한 바와 동일한 방법으로, GRACE 균주 집합체를 포함하는 비필수 유전자가 마우스 모델 시스템에서 병인성에 요구되는지를 판명하는 것은 동시에 실행가능하다. 영 표현형이 성장 속도를 감소시키고, 병원균의 독성을 약화시킬 수 있는 다수의 유전자가 상기 세트에 포함된다. 느린 성장 표현형을 나타내는 많은 돌연변이체는 GRACE 균주를 제조하는데 사용되는 조건 발현 방법에 의해 단순히 완전히 불활성화되지 않는 다른 필수 유전자에서(대안적인 방법에 의해 판명된 바와 같이) 하이포모픽(hypomorphic) 돌연변이를 나타낼 수 있다. 상기 균주의 한가지 중요한 용도는 임의의 특정 필수 유전자가 독성 작용에서 이중으로 기능하는지를 평가하는 것이다. 부분적으로만 불활성화된 경우 실질적으로 감소된 독성 및 성장 속도를 나타내는 필수 유전자는 최소 억제성 고 특이성 화합물이 치료값을 나타내기 때문에 "다중요인" 약물 표적을 나타낸다. 총괄적으로, 테트라사이클린(또는 대안적인 유전자 불활성화 수단)에 의한 유전자 불활성화의 조건하에 마우스에서 진균성 감염을 일으키는데 실패한 모든 GRACE 균주는 병인성에 요구되는 유전자의 서브세트, 즉 GRACE 병인성 서브세트를 한정한다. 보다 한정된 병인성 유전자, 예를 들어 발병시 특정 단계(예: 유착 또는 침입)에 요구되는 유전자는 균주의 GRACE 병인성 서브세트를 상응하는 과정을 측정하는 시험관내 분석에 적용함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 각각의 유전자의 조건 발현에 의해 구강 유착 또는 마크로파지 분석에서 GRACE 병인성 균주를 조사하면 유착 또는 세포 침입각각에 요구되는 병인성 인자가 확인될 것이다.
GRACE 균주 집합체 또는 그의 바람직한 서브세트는, 또한 후천적인 내성/억제 유전자를 평가하거나 동물 모델내 불활성화 약물 표적에 대한 살진균성/정진균성 표현형을 구별하는데 매우 적합하다. 본 발명의 실시양태에서, 상이한 필수 약물 표적 유전자의 발현을 위해 억제되는 GRACE 균주를 테트라사이클린-보충된 물에 부풀린 마우스에 접종할 것이다. 그 다음, 각각의 GRACE 균주는 감염된 상이한 마우스 군집과 관련해서 사멸 빈도수에 따라 비교될 것이다. 대다수의 감염된 마우스는 GRACE 균주에서 필수 유전자의 테트라사이클린-의존성 불활성화에 의한 진균류 세포 사멸로 인해 건강하게 남아있을 것이다. 그러나, 정진균성 표적 보다는 살진균성 표적이므로 유전자외 억제 유전자를 좀더 발생시킬 것 같고, 또는 숙주 환경내에서 활성인 대안적인 생리학적 과정에 의해 억제되는, 약물 표적을 숨기는 GRACE 균주는, 특정 균주로 감염된 마우스에서 발견되는 치사 감염의 높은 발병률에 의해 확인될 수 있다. 이 방법에 의해, 각각의 약물 표적 유전자는 숙주 환경내에서 내성을 발생시킬 수 있는 가능성을 평가하고 등급을 매길 수 있다.
5.5.4 결합 화합물의 합리적인 설계
본원에 기술된 바와 같은 분석을 통해 확인된 화합물은, 예를 들어 점염성 제제의 성장을 억제하고/하거나 감염 징후를 완화하는데 유용할 수 있다. 화합물은 다른 세포 단백질을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 결합 화합물은 예를 들어 표적 유전자 산물 트랜스멤브레인 수용체의 세포외 부분, 및 D형 및/또는 L형 아미노산으로 만들어진 랜덤 펩타이드 라이브러리 1종(램(Lam) 등의문헌[Nature 35482-84, 1991]; 호우텐(Houghten) 등의 문헌[Nature 35484-86, 1991] 참조), 합리적으로 설계된 안티펩타이드 펩타이드(허비(Hurby) 등의 문헌[Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides," InSnythetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY (1992), pp. 289-307] 참조), 항체(폴리클론성, 단일클론성, 인간, 인간화, 항-유전자형, 키메라 또는 단쇄 항체, 및 FAb, F(ab')2및 FAb 발현 라이브러리 분절, 및 그의 에피토프-결합 분절) 및 작은 유기 또는 무기 분자를 비롯한 가용성 펩타이드와 같은 펩타이드를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 수용체형 표적 유전자 분자의 경우, 이 화합물은 ECD와 결합하거나, 또는 천연 리간드(즉, 작용물질) 뿐만 아니라 그의 펩타이드, 항체 또는 분절에 의해 개시되는 활성을 모방하는 유기 분자(예: 펩티도미메틱), 및 ECD(또는 그의 일부)를 모방하여 "중화" 천연 리간드와 결합하는 다른 유기 화합물을 포함할 수 있다.
컴퓨터 모델링 및 탐색 기술은 표적 유전자 발현 또는 활성을 조정할 수 있는 화합물의 확인, 또는 이미 확인된 화합물의 개선을 가능하게 한다. 이러한 화합물 또는 조성물을 확인하면, 활성 부위 또는 영역이 바람직하게 확인된다. 수용체 분자에 영향을 주는 화합물의 경우, 이러한 활성 부위는 전형적으로는 수용체와 상호작용하는 리간드 영역과 같은 리간드 결합 부위일 수도 있다. 활성 부위는 예를 들어 펩타이드의 아미노산 서열로부터, 핵산의 뉴클레오타이드 서열로부터, 또는 관련 화합물 또는 조성물과 그의 천연 리간드의 착체의 연구로부터 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 확인된다. 후자의 경우, 착화된 리간드가 어느 인자에서 발견되는지를 밝힘으로써 화학적 또는 X-선 결정 방법은 활성 부위를 찾는데 사용된다.
활성 부위의 3차원 기하 구조는 그 다음 바람직하게 결정된다. 이는 완전한 분자 구조를 결정하는, X-선 결정법을 비롯한 공지된 방법에 의해 수행된다. 활성 부위내 및/또는 리간드 결합 착체에서 특정 분자내 거리를 측정하는데 고체 또는 액체 상 NMR이 또한 사용된다. 부분 또는 완전한 기하 구조를 수득하는데 당해 기술분야의 숙련자들에게 공지된 구조 결정의 기타 실험적인 방법이 또한 사용된다. 기하 구조는 착화된 천연 또는 인위적 리간드를 사용하여 결정되고, 이는 결정된 활성 부위 구조의 정확성을 증가시킨다. (예: 정확한 구조가 불완전하거나 불충분하게 결정된 실시양태에서) 구조를 완성하거나 그의 정확성을 개선하기 위해 컴퓨터 이용 수치 모델링 방법이 사용된다.
실험적으로 모델링 또는 조합에 의해 활성 부위의 구조를 결정하면, 후보 조정 화합물은 이들의 분자 구조에 대한 정보에 따라 화합물을 함유한 데이터베이스를 탐색함으로써 확인된다. 이러한 탐색은 결정된 활성 부위 구조에 정합하고 활성 부위를 한정하는 기들과 상호작용하는 구조를 갖는 화합물을 찾는다. 이러한 탐색은 수동적일 수 있지만 바람직하게는 컴퓨터로 보조된다. 상기 탐색으로부터 찾아진 이들 화합물은 잠재적인 표적 또는 경로 유전자 산물 조정 화합물이다.
또다르게는, 이들 방법은 이미 알려진 조정 화합물 또는 리간드로부터 개선된 조정 화합물을 확인하는데 사용된다. 공지된 화합물의 조성은 변형되고, 변형물의 구조적인 효과는 신규한 조성물에 적용되는 전술한 실험 및 컴퓨터 모델링 방법을 사용하여 결정된다. 변형된 구조는 화합물의 활성 부위 구조와 비교하여 개선된 정합성 또는 상호작용이 일어나는지를 결정한다. 이러한 방법으로, 예를 들어 사이드 기의 변화에 의한 조성물 중 시스템 변화는 신속하게 평가되어 개선된 특이성 또는 활성을 갖는 변형된 조정 화합물 또는 리간드를 수득하게 된다.
표적 또는 경로 유전자 또는 유전자 산물의 활성 부위 및 관련된 형질도입 및 전자 인자의 확인을 기준으로 조정 화합물을 확인하는데 유용한 추가 실험 및 컴퓨터 모델링 방법은 당해 기술분야의 숙련자에게 자명하다.
특정 단백질과 상호작용하는 약물의 컴퓨터 모델링 분야에 관해 기술한 많은 논문들(예: 로티비넨(Rotivinen) 등의 문헌[Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166, 1998]; 리프카(Ripka)의 문헌[New Scientist54-57 June 16, 1988]; 맥키날린(McKinaly) 및 로스만(Rossmann)의 문헌[Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 111-122, 1989]; 페리(Perry) 및 다비스(Davies)의 문헌[OSAR:Quantitiative Structure-Activity Relationships in Drug Designpp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989)]; 루이스(Lewis) 및 딘(Dean)의 문헌[Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 및 1-162, 1989]); 및 핵산 성분에 대한 모델 수용체에 관한 논문(애스큐(Askew) 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. 1111082-1090, 1989])이 있다.
결합을 변화시킬 수 있는 화합물의 설계 및 생성에 관해 상기에서 일반적으로 기술하였지만, 억제제 또는 활성화제인, 화합물에 대한 천연 산물 또는 합성 화학약품 뿐만 아니라 단백질을 비롯한 기타 생물학적 활성 물질을 포함하는 공지된화합물의 라이브러리를 또한 탐색할 수 있었다.
5.6 전사 프로파일
5.6.1 유전자 발현 분석
유전자 발현 프로파일링 기술은 적합한 생화학적 표적의 확인 뿐만 아니라 공지된 화합물의 작용 모드의 측정에 중요한 수단이다. 칸디다 알비칸스 게놈 서열을 완성하여 이러한 정보가 있는 핵산 미세배열을 전개하면 이러한 2배체 병인성 진균으로 게놈형 유전자 발현 분석이 수행될 수 있을 것이다. 따라서, 본발명은 칸디다 알비칸스의 필수 및 독성/병인성 유전자 둘다에 대한 전사 응답 프로파일을 수득하기 위한 방법을 제공한다. 필수 유전자의 조건 발현은 칸디다 알비칸스에 집중된 프로그램의 약물 선별 프로그램의 설계에 유용한, 예를 들어 조절 상호작용을 서술하는 기능을 한다.
본 발명의 실시양태에서, GRACE 균주 집합체는 이 병원균내 필수 유전자 발현의 분석을 위해 사용된다. 특히, 이러한 균주 집합체의 강력한 용도는 병원균내 전체 필수 유전자 세트 또는 필수 유전자의 목적하는 서브세트에 대한 상보적 전사 프로파일 데이터베이스의 건설을 포함한다. 이러한 데이터베이스는, 독특한 작용 모드를 갖는 화합물과 유사한 화합물을 구별하기 위해 리드 항유사분열성 화합물의 응답 프로파일 특징을 신규한 항-진균성 화합물을 사용하여 수득된 프로파일과 비교하는데 사용된다. 균주를 리드 화합물로 처리한 후 결정된 전사 응답 프로파일은 억압 조건하에 특정 필수 표적 유전자를 사용하여 수득된 것과 정합함(또는 부분적으로 겹쳐지게 함)은 약물 작용의 표적 및 가능한 모드를 확인하는데 사용한다.
또한, 필수 유전자의 유전자 발현 분석은, 상기 유전자의 생물학적 기능 및 조절을 병원균내에서 관찰하여 이 정보를 약물 선별 프로그램에 도입하게 한다. 예를 들어, 칸디다 알비칸스에서 필수 약물 표적의 전사 프로파일링은 존재하는 약물 표적에 대해 밝혀진 동일한 세포 과정 또는 경로에 참여하여, 직접적인 실험없이 병원균내에서 달리 확인될 수 없었던 신균한 약물 표적의 확인을 가능하게 한다. 이들은 병원균과는 별개인 유전자 뿐만 아니라 독특한 기능을 갖거나 병원균에서 상이하게 조절되는 넓은 범위의 유전자 부류를 포함한다. 또한, 병원균-특이 경로는 첫 번째로 밝혀지고 이용될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 비억제성 또는 유도 조건하에 GRACE-유도된 균주의 유전자 발현 프로파일을 설립하여 하나 이상의 약물 표적에 대한 과발현 응답 프로파일을 평가한다. 예를 들어, 단일 형질도입 경로에서 유전자 기능의 과발현은 종종 상기 조건에서 경로가 조절되지 않은 활성화를 나타낸다. 또한, 몇몇 신호 경로는 발병 과정에서 기능을 하는 것으로 판명되었다. 칸디다 알비칸스 GRACE 균주의 과발현에 의해 생성되는 전사 응답 프로파일은 이러한 경로에 의해 조절되는 유전자 세트에 관한 정보를 제공하고, 이는 잠재적으로 발병 과정에서 필수적인 역할을 하므로 유력한 약물 표적을 나타낼 수 있다. 또한, 발현 프로파일을 분석하여 발현이 전체 조절 캐스케이드의 후속적인 발현에 결정적인 유전자를 하나 이상 밝혀낼 수 있다. 따라서, 이들 유전자는 약물 발견을 위해 특히 중요한 표적이고, 돌연변이체를 수반하는 상응하는 변형된 대립유전자 쌍은 선별 분석을 기준으로 한 작용 메카니즘의 기초를 형성한다. 현재, 이러한 시도는 가능하지 않다. 현재 약물 발견의 실행으로 매우 많은 "후보물질" 화합물이 생성되었지만 이들의 작용 모드에 대한 이해는 거의 없다. GRACE 균주 집합체를 사용하여 생성된 유전자 차단 및 과발현 프로파일을 둘다 포함하는 전사 응답 데이터베이스는 1) 야생형 균주의 항진균성 억제에 기인한 전사 응답 또는 프로파일을 결정하고, 2) GRACE 균주 집합체를 포함하는 약물 표적의 불활성화 또는 과발현에 기인한 전사 프로파일에 대한 응답을 비교함으로써 이러한 약물 발견의 애로사항에 대한 해결책을 제공한다.
약물 표적의 유전자 변형 및 야생형 세포의 화학적/화합물 억제에 기인한 전사 프로파일을 정합하거나 상당히 상관시켜, 화합물이 세포성 약물 표적에 결합한 증거를 제공하고, 그의 작용 메카니즘을 제시하게 된다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 61 중 1개를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 표적 유전자 산물에 대한 화합물을 평가하기 위한 방법으로서, (a) 야생형 2배체 진균 세포 또는 조절 세포를 화합물과 접촉시키고 일차 전사 프로파일을 생성하는 단계; (b) 표적 유전자의 이차 대립유전자가 실절적으로 발현되기 직접에 있거나, 발현되지 않거나 과발현되는 조건하에 배양된 GRACE 균주와 같은 돌연변이체 2배체 진균 세포의 전사 프로파일을 결정하고, 배양된 세포를 위한 이차 전사 프로파일을 생성하고, 일차 전사 프로파일을 이차 전사 프로파일과 비교하여 프로파일에서 유사성을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 비교시, 프로파일의 유사성은 지표 값으로서 나타낼 수 있고, 지표 값이 높을수록 화합물이 보다 바람직하다.
5.6.2 이차 표적의 확인
이차 표적을 확인하기 위한 방법을 본원에서 기술한다. 본원에 사용된 "이차 표적"란 유전자 산물이 제한된 조건의 세트하에 유기체의 성장 및/또는 생존에 포함된 표적 유전자 산물(즉, 표적 필수 유전자 산물), 또는 숙주의 감염 동안에 유기체의 병인성 메카니즘에 포함된 표적 유전자 산물(즉, 표적 독성 유전자 산물)과 상호작용하는 능력을 나타내는 유전자를 말한다.
단백질-단백질 상호작용의 검출에 적합한 임의의 방법은, 유전자 산물 및 표적 유전자 산물 사이의 상호작용을 확인함으로써 이차 표적 유전자 산물을 확인하는데 이용될 수 있다. 이렇게 공지된 유전자 산물은 세포 또는 세포외 단백질일 수 있다. 이러한 공지된 유전자 산물과 상호작용하는 이들 유전자 산물은 이차 표적 유전자 산물을 나타내고, 이들을 암호화하는 유전자는 이차 표적을 나타낸다.
이용되는 전형적인 방법 중에는 공동-면역침강법, 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 가교 및 공동-정화법이 있다. 이와 같은 방법을 이용하여 이차 표적 유전자 산물의 확인이 가능해졌다. 일단 확인되면, 이차 표적 유전자 산물을 표준 기법과 함께 사용하여 상응하는 이차 표적을 확인한다. 예를 들어, 이차 표적 유전자 산물의 아미노산 서열의 적어도 일부를, 에드만(Edman) 분해 기법(예: 크라이톤(Creighton)의 문헌["Proteins: Structures and Molecular Principles," W.H. Freeman & Co., N.Y., pp. 34-49, 1983] 참조)과 같은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려진 기법을 이용하여 확인한다. 수득된 아미노산 서열은 이차 표적 유전자서열을 선별하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 생성을 위한 가이드로서 사용될 수 있다. 선별은, 예를 들어 표준 하이브리드화 또는 PCR 기법에 의해 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 생성 및 선별을 위한 기법은 잘 알려져 있다(문헌[Ausubel,supra., and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., eds. Academic Press, Inc., New York] 참조).
또한, 제한된 조건의 세트하에 유기체의 성장 및/또는 생존, 또는 숙주의 감염 동안에 유기체의 병인성 메카니즘에 포함된 단백질과 상호작용하는 단백질을 암호화하는 이차 표적을 동시에 확인하게 하는 방법을 이용한다. 이들 방법으로는, 예를 들어 λgt11 파지 라이브러리의 항체를 프로빙하는 잘 알려진 기법과 유사한 방식으로 표지된 일차 표적 유전자 단백질을 사용하여, 이들 메카니즘에 포함되거나 이에 결정적인 것으로 공지되거나 상기 단백질을 사용하여 발현 라이브러리를 프로빙하는 것을 포함한다.
생체내 단백질 상호작용을 검출하는 한 방법인 2가지-혼성 시스템을, 제한하기 위해서가 아니라 단지 예시하기 위한 목적으로 상세히 기술한다. 이 시스템의 한 변형을 기술하였고(치엔(Chien) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad, Sci.USA,88: 9578-9582, 1991]), 클론테크(Clontech)(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 시판된다.
간단히 말해서, 이러한 시스템을 이용하여, 2개의 혼성 단백질(이중 하나는 공지된 단백질, 이 경우에는 유기체의 성장에 포함되는 것으로 공지된 단백질에 접합된 전사 활성자 단백질의 DNA-결합 도메인으로 구성되고, 다른 하나는 cDNA 라이브러리의 일부로서 상기 플라스미드로 재조합된 cDNA에 의해 암호화된 공지되지 않은 단백질에 접합된 활성자 단백질의 활성화 도메인으로 구성됨)을 암호화하는 플라스미드가 만들어진다. 상기 플라스미드는 조절 영역이 전사 활성자 결합 부위를 함유하는 수용체 유전자(예: lacZ)를 함유한 효모균 사카라마이세스 세레비시아에의 균주로 형질전환된다. 혼성 단백질은 단독으로 수용체 유전자의 전사를 활성화할 수 없고, DNA-결합 도메인 혼성은 활성화 기능을 제공하지 못하므로 수용체 유전자의 전사를 활성화할 수 없고, 활성화 도메인 혼성은 활성자 결합 부위를 국소화할 수 없으므로 수용체 유전자의 전사를 활성화할 수 없다. 2가지 혼성 단백질의 상호작용으로 기능성 활성자 단백질을 재구성하고, 수용체 유전자를 발현시키고, 이는 수용체 유전자 산물에 대한 분석에 의해 검출된다.
2가지 혼성 시스템 또는 이와 관련된 방법은 공지된 "포착" 유전사 산물과 상호작용하는 단백질에 대한 활성화 도메인 라이브러리를 선별하는데 사용된다. 제한하기 위해서가 아니라 예를 들어, 표적 필수 유전자 산물 및 표적 독성 유전자 산물을 포착 유전자 산물로서 사용한다. 표적 필수 유전자 산물, 표적 독성 유전자 산물 또는 이들의 일부를 암호화하는 전체 게놈 또는 cDNA 서열은 활성화 도메인을 암호화하는 DNA에 접합된다. DNA-결합 도메인에 접합된 포착 유전사 산물의 혼성을 암호화하는 이 라이브러리 및 플라스미드는 효모균 수용체 균주로 함께 형질전환되고, 생성되는 형질전환체는 수용체 유전자를 발현시키는 것들에 대해 선별된다. 제한하기 위해서가 아니라, 예를 들어 포착 유전자는 벡터로 클로닝되어GAL4 단백질의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 DNA에 번역상 접합된다. 이들 콜로니는 정제되고 수용체 유전자 발현을 초래하는 라이브러리 플라스미드는 분리된다. 그 다음, DNA 서열은 라이브러리 플라스미드에 의해 암호화된 단백질을 확인하는데 사용된다.
포착 유전자 산물과 상호작용하는 단백질이 검출되는 세포계의 cDNA 라이브러리는 당해 기술분야에서 통상적으로 실행되는 방법을 사용하여 만들어진다.
본원에 기술된 특정 시스템에 따라, 예를 들어, cDNA 분절은 벡터에 삽입되어 GAL4의 활성화 도메인에 벅역상 접합된다. 이 라이브러리는 포착 유전자-GAL4 접합 플라스미드에 따라 GAL4 활성화 서열을 함유한 프로모터에 의해 유도된 lacZ 유전자를 함유한 효모균 균주로 함께 형질전환된다. 포착 유전자 산물과 상호작용하는 GAL4 활성화 도메인에 접합된 cDNA 암호화 단백질은 활성 GAL4 단백질을 재구성하고, 이로써 lacZ 유전자의 발현을 유도한다. lacZ를 발현시키는 콜로니는 X-갈의 존재하에 청색에 의해 검출된다. 그 다음, cDNA는 이들 균주로부터 정제되고, 당해 기술분야에서 통상적으로 실행되는 기법을 이용하여 포착 유전자-상호작용 단백질을 생성하고 분리하는데 사용된다.
일단 이차 표적이 확인되고 분리되면, 본 발명의 방법에 의해 추가로 특성화되고 약물 발견에 사용된다.
5.6.3 유전자 발현 배열의 용도
프로파일을 수행하기 위해, 유전자 발현 배열 및 미세배열을 이용할 수 있다. 유전자 발현 배열은 유리 표면, 규소, 나일론 막 등의 특정 위치에 놓인 밀도가 높은 DNA 샘플 배열이다. 연구자들은 이러한 배열을 사용하여 상이한 조건하에 상대적인 유전자 발현을 정량한다. 이러한 기법의 예는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5807522 호에서 찾을 수 있다.
단일 배열을 사용하여 특정 미생물 유기체의 게놈에서의 모든 유전자의 실질적인 발현을 연구할 수 있다. 예를 들어, 배열은 칸디다 알비칸스로부터 얻은 ORF에 상응하는 PCR 산물을 함유한 12x24㎝ 나일론 필터로 구성될 수 있다. 각각의 PCR 산물 10ng을 필터 위에서 1.5㎜마다 점으로 찍는다. 단일 표준 표지된 cDNA는 배열에 대한 하이브리드화하기 위해 제조되고(어떠한 2차 표준 합성 또는 증폭 단계도 수행되지 않음), 필터와 접촉하게 놓는다. 따라서, 표지된 cDNA는 "안티센스" 방향이다. 정량 분석은 포스포리미저(phosphorimager)를 사용하여 수행된다.
전체 세포 mRNA의 샘플로부터 제조된 cDNA를 이러한 배열로 하이브리드화하고 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 하나 이상의 다양한 기법에 의해 결합을 검출하여, cDNA가 하이브리드화되는 배열위의 각각의 위치에서 신호를 제공한다. 따라서, 배열의 각각의 위치에서 수득된 하이브리드화 신호의 강도는 샘플에 존재하는 특정 유전자에 대한 mRNA의 양을 반영한다. 따라서, 상이한 조건하에 성장된 세포로부터 분리된 mRNA에 대해 수득된 결과들을 비교하면, 상이한 조건하에 성장하는 동안의 각각의 개별적인 유전자 발현의 상대적인 양을 비교할 수 있게 한다.
유전자 발현 배열은 진균 확산, 독성 또는 병인성에 요구되는 유전자 산물의 양 또는 활성을 감소시킨 후, 다양한 시점에서 총 mRNA 발현 패턴을 분석하는데 사용된다. 유전자 산물의 양 또는 활성의 감소는, 조절 프로모터에 연결된 핵산 산물이 진균 성장, 생존, 확산, 독성 또는 병인성을 제한하는 속도인 조건하에 GRACE 균주를 성장시키거나, 세포를 표적 유전자 산물의 양 또는 활성을 감소시키는 제제와 접촉시킴으로써 달성된다. 배열로의 하이브리드화에 의해 나타난 발현 패턴의 분석은 발현이 유전자 산물의 양 또는 활성의 감소에 의해 영향을 받는 다른 유전자에 관한 정보를 제공한다. 예를 들어, 다른 mRNA의 양은 성장, 생존, 확산, 독성 또는 병인성에 요구되는 유전자 산물의 양 또는 활성이 감소한 후 동일하게 증가, 감소 또는 지속되는 것으로 관찰된다. 따라서, 성장, 생존, 확산, 독성 또는 병인성에 요구되는 유전사 산물의 양 또는 활성의 감소 후에 관찰되는 mRAN 발현 패턴은 성장, 생존, 확산, 독성 또는 병인성에 요구되는 다른 핵산으로 확인된다. 또한, 진균류가 후보 약물 화합물 또는 공지된 항생물질에 노출된 경우 관찰되었던 mRNA 발현 패턴을 진균류의 성장, 생존, 활산, 독성 또는 병인성에 요구되는 유전자 산물의 양 또는 활성이 감소된 경우 관찰되었던 것들과 비교한다. 후보 약물 화합물을 사용하여 관찰된 mRNA 발현 패턴이 유전자 산물의 양이 감소된 경우 관찰되었던 것과 유사하면, 약물 화합물은 유력한 치료 후보물질이다. 따라서, 상기 분석은 약물 발견에서 사용하기 위한 유력한 후보 약물 화합물을 선택하는 것을 돕는데 유용하다.
배열에 놓인 핵산원 및 배열로 하이브리드화된 핵산원이 2종의 상이한 미생물로부터 얻은 경우, 유전자 발현은 2종 미생물에서의 동종 유존자로 확인된다.
5.7 프로테오믹 분석
본 발명의 다른 양태에서, GRACE 균주 집합체가 병원균 내의 전사 프로파일링을 가능하게 하는 것과 같이 GRACE 균주 집합체는 게놈의 발현 단백질 보체의 분석을 위한 귀중한 공급원을 제공한다. 억제 및 비억제 성장 조건하에서 GRACE 균주 집합체의 구성원에 의해 전체 단백질 발현을 평가함으로써, 세포의 단백질 발현 패턴과 필수 유전자의 비발현 또는 발현 수준과의 상관관계를 이끌 수 있다. 따라서, 본 발명은 2차원 전기 영동법과 같은, 단백질 발현 패턴을 확립하기 위한 당해 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정된 GRACE 균주 내의 단백질 세트의 발현 패턴을 제공한다. 대부분의 단백질 발현 패턴은, 개질된 대립 형질 중 하나와 상이한 조건 및 상이한 발현 수준 하에서 배양되는 GRACE 균주에서 기인될 것이다.
또 다른 양태에서, 명시된 유전자 돌연변이가, 이전에 밝혀지지 않은 화합물로 균주 처리에서 관찰된 것과 필적할만한 단백질 발현 프로파일을 나타내는 균주를 만들도록 구성될 수 있다. 이러한 방법으로, 복잡한 방법에서 다중 표적에 대해 작용하는 항진균성 화합물과 독특한 진균 특이 표적 및 결정될 수 있는 작용 양식에 작용하는 기타 잠재적인 납 화합물을 구별할 수 있다.
세포 내에서 발현되는 단백질의 완전한 보체 평가는 2차원 폴리아크릴아미드 겔 또는 기타 분리 기법에 의해 검출가능한 모든 단백질 종의 명확한 규명에 의존한다. 그러나, 이들 단백질의 중요한 분획은 단백질 서열 분석 또는 질량 스펙트럼에 의한 명확한 규명에 필용한 검출한계보다 양이 불충분하다. 그럼에도 불구하고 이들 "오르판"(orphan) 단백질은 각각의 GRACE 균주에 의한 단백질 발현 분석을 사용하여 검출 가능해진다. 불충분한 양의 유전자 산물 조건부 발현은 GRACE 균주 단백질 프로파일을 억제 조건에 대한 비억제 또는 과발현 조건하에서 비교함으로써이들의 명확한 규명을 용이하게 한다. 어떤 경우, 문제가 있는 불충분한 양의 유전자를 조작함으로써 간접적으로 야기되는 다수의 단백질 정류 상태 수준을 변화시킴으로써 좀 더 복잡한 단백질 프로파일이 야기된다. 또한, GRACE 균주 집합체 내의 각각의 표적의 과발현은 단백질 서열 분석 또는 질량 스펙트럼에 충분한 재료를 공급함으로써 오르판 단백질 규명에 직접적으로 도움이 될 수 있다.
다양한 양태에서, 본 발명은 2배체 병인성 진균 세포의 발현된 단백질 보체의 정량 분석 방법을 제공한다: 제 1 단백질 발현 프로파일은 표적 유전자에 대한 2개의 비개질된 대립유전자를 갖는 2배체 병인성 진균의 억제로 발전된다. 표적 유전자 중 1개의 대립유전자가 비활성화되는 억제 균주, 예를 들어 분열 카세트로 치환되거나 삽입된 GRACE 균주 변이체가 생성된다. 다른 하나의 대립유전자는, 제 2 대립유전자의 발현이 이형 조절 프로모터의 억제 하에 있도록 개질된다. 제 2 단백질 발현 프로파일은, 제 2 대립유전자가 억제 균주 내의 유전자의 2개의 대립유전자의 발현에 비해 본질적으로 과발현되는 조건하에서 상기 변이체 진균으로 발전된다. 유사하게, 필요한 경우 제 3 단백질 발현 프로파일은, 제 2 대립유전자가 억제 균주 내에 있는 유전자의 2개의 대립유전자의 발현에 비해 본질적으로 과발현되는 조건하에서 상기 변이체 진균으로 발전된다. 이어서, 제 1 단백질 발현 프로파일을, 제 2 프로파일에서 더 높은 수준으로 검출되는, 필요한 경우 제 1 프로파일의 수준과 비교해 제 3 프로파일에서 더 낮은 수준으로 검출되는 발현 단백질을 규명하기 위해 제 2 발현 프로파일과, 필요한 경우 제 3 단백질 발현 프로파일과 비교한다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 61 중 하나를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 표적 유전자 산물에 대한 화합물을 평가하는 방법을 제공하고, 이 방법은 (a) 야생 유형의 2배체 진균 세포 또는 억제 세포가 이 화합물과 접촉하여 제 1 단백질 발현 프로파일을 생성하고; (b) 표적 유전자의 제 2 대립유전자가 본질적으로 발현되거나 발현되지 않거나, 또는 과발현되는 조건하에서 배양된 GRACE 균주와 같은 변이체 이베체 진균 세포의 단백질 발현 프로파일을 결정하여 배양되는 세포에 대한 제 2 단백질 발현 프로파일을 생성하여 상기 프로파일에서 유사성을 규명하기 위해 제 1 단백질 발현 프로파일과 제 2 단백질 발현 프로파일을 비교하는 단계를 포함한다. 비교하기 위해 이들 프로파일의 유사성은 지시값으로 나타낼 수 있고, 지시값이 클수록 보다 바람직한 화합물이다.
5.8 약학 조성물 및 그의 용도
본원에 기술된 발명의 방법에 의해 규명된 핵산 분자를 포함하는 화합물은 칸디다 알비칸과 같은 병인성 유기체에 의한 감염을 치료하거나 예방하는데 유효한 치료 투여량으로 투여할 수 있다. 또한, 표적에 따라 상기 화합물은 암과 같은 비-감염성 질병 치료에 유용할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료에 유효한 투여량은 치료되는 대상에 건강상 잇점을 야기시키기에 충분한 양의 화합물(핵산 분자를 포함함)을 언급한다. 전형적으로, 이 화합물은 SEQ ID NO: 1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 작용을 하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료되는 대상은 식물, 척추 동물, 포유 동물, 조류 또는 인간일 수 있다.또한, 이들 화합물은 칸디다 알비칸에 의한 어떤 대상의 오염을 예방하거나 함유하는데 사용할 수 있거나, 또는 칸디다 알비칸을 포함하는 바이오필름(biofilm)의 표면 상의 형성을 예방하거나 억제하는데 사용할 수 있다. 칸디다 알비칸을 포함한 바이오필름은 외과용 도구, 이식 장치, 카테테르 및 스텐트와 같은(이에 제한되는 것은 아님) 의학 장치 표면 상에서 발견될 수 있다.
5.8.1 유효한 투여량
화합물의 독성 및 치료 유효성은 세포 배양 또는 실험용 동물에서의 예를 들어, LD50(군집의 50% 치사량) 및 ED50(군잡의 50% 치료 유효량)을 결정하기 위한 표준 약학 방법에 의해 결정할 수 있다. 독성과 치료 유효성 사이의 투여량 비율은 치료 지수이고, 이는 비율 LD50/ED50로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있는 반면, 비감염된 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하기 위해 영향을 받는 조직 자리에 대한 화합물을 표적으로 하는 운반 시스템을 설계하는데 주의를 기울여 부작용을 감소시켜야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터를, 인간의 투여량의 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 아주 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 존재한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 좌우되는 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대하여, 치료 유효 투여량을 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정할 수 있다. 투여량을 동물 모형에서 제형화하여 세포 배양에서 결정된 IC50(즉, 증후 억제 최대의 반을 달성하는 시험 화합물 농도)를 포함하는 순환 플라즈마 농도 범위에 달성될 수 있다. 이러한 정보를, 인간에 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용할 수 있다. 플라즈마 수준은, 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 유용한 투여량은 몸무게 1kg 당 0.001 내지 10mg의 범위이다.
5.8.2 제형 및 용도
본 발명에 따른 용도를 위한 약학 조성은, 1종 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용한 통상적인 방법에서 제형화될 수 있다.
따라서, 상기 화합물 및 그의 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매를, 흡입 또는 살포(입이나 코를 통한)에 의한 투여 또는 경구 투여, 구강 투여, 비경구 투여 또는 직장 투여를 위해 제형화할 수 있다.
경구 투여에서는 약학 조성물이, 예를 들어 결합제(예: 전아교화된 옥수수 녹말, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스), 충전제(예: 락토스, 미세결정질 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘), 윤활제(예: 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카), 정제 분해 물질(감자 녹말 또는 글리콜산나트륨 녹말) 또는 습윤제(예: 라우릴 황산 나트륨)과 같은 약학적으로 허용가능한 부형제로 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐 형태를 취할 수 있다. 정제는 당해 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 코팅할 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는, 예를 들면 용액, 시럽 또는 현탁액 형태를 취할 수 있거나, 또는 사용 전 물 또는 기타 적당한 배지와 함께 구성될 수 있는 무수 산물로서 존재할 수도 있다. 이러한 액체 제제는, 현탁화제(예: 소비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 기름), 유화제(예: 레시틴 또는 아카시아), 비수용성 배지(예: 아몬드 오일, 유질 에스테르, 에틸알콜 또는 분별증류된 식용류) 및 보존제(예: 메틸- 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제로 통상적인 수단에 의해 제조할 수 있다. 또한 상기 제제는 완충 염, 향미료, 착색제 및 적당한 감미료를 함유할 수도 있다.
경구 투여용 제제를 적당히 제형화하면 활성 화합물을 조절하면서 방출할 수 있다.
구강 투여용 조성물은 통상적인 방법으로 제형화된 정제 또는 트로키제 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여에서, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은, 통상적으로 적당한 추진제(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적당한 기체)의 사용과 함께 가압된 팩 또는 분무제로부터 에어로졸 분사 형태로 운반된다. 가압되는 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 운반하는 밸브를 제공함으로써 결정할 수 있다. 흡입기 또는 살포기에 사용되는, 예를 들면 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 상기 화합물과 락토스 또는 녹말과 같은 적당한 분말 기재의 분말 혼합을 함유하도록 제형화할 수 있다.
상기 화합물은, 예를 들어 환약 주입 또는 연속 주입을 통한 주입에 의해 비경구 투여(즉, 정맥내 또는 근육내)를 위해 제형화할 수 있다. 주입용 제형은 첨가되는 보존제와 함께, 예를 들면 앰플(ampoule) 또는 다회 복용 컨테이너로 투여 형태 단위로 제공될 수 있다. 이 조성물은 유질 또는 수성 배지 내의 현탁액, 용액 또는 에멀션 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용 전 적당한 배지, 예를 들어 살균 무발열원 물과 함께 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
또한, 좌약 또는 분비 정지 관장제(예컨대, 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기재를 함유함)와 같은 직장 조성물로 제형화할 수 있다.
상기 기술된 제형 외에도, 상기 화합물은 데포 제제로서 제형화할 수도 있다. 이러한 제형은 이식(예: 피하에 또는 근육 내에) 또는 근육 내 주입에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 화합물은 적당한 중합체 물질, 소수성 물질(예컨대, 허용가능한 오일 내의 에멀션으로서), 이온교환 수지 또는 거의 녹지 않는 유도체(예: 거의 녹지 않는 염)로 제형화할 수 있다.
6. 실시예
6.1 CaKRE9의 개질된 대립유전자를 함유하는 GRACE 균주의 구성
단계 1(즉, 유전자 치환)에 사용되는 SAT 선택가능한 표식의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 pRC18-ASP 내의 SAT 분열 카세트에 상보하는 25개의 뉴클레오타이드 및 판독틀을 여는 CaKRE9 측면에 있는 구역과 상동한 65개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 도 2는, PCR 증폭 후 제조되고 형질전환 후 상동 재조합에 의한 제 1 야생 유형 CaKRE9 대립유전자의 유전자 치환을 야기하는, 2.2 kb cakre9Δ: :SAT 분열 조각을 예시한다. PCR 조건은 다음과 같다: 5 내지 50 ng pRC18-ASP, 100 pmol의 각 프라이머, 200 μM dNTP, 10 mM Tris-pH 8.3, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 단위 Taq DNA 중합효소(Gibco). PCR 증폭 시간은 다음과 같다: 1 사이클에 대해 5분 94℃, 1분 54℃, 2분 72℃; 30 사이클에 대해 45초 94℃, 45초 54℃, 2분 72℃. 균주는, 브라운(B.R. Braun) 및 죤슨(A.D. Johnson)의 문헌[Control of filament formation in Candida albicans by the transcriptional repressor TUP1, Science 277: 105-109, 1997]에 의한 C. 알비칸스에 적용된 아세트산리튬 방법을, 30℃ 및 42℃에서 더 짧은 배양 시간(각각 1시간 및 5분) 및 형질전환된 물질의 더 많은 양(50 μg의 에탄올로 침전시킨 cakre9Δ::SAT PCR 산물)을 포함하는 작은 개질과 함께 사용하여 형질전환을 수행하였다. 변형된 세포는 YPD 플레이트로 퍼져 30℃에서 하룻밤동안 배양하여, 스트렙토트리신을 함유하는(400 μg/ml) YPD 배지로 복제 깔기 전 SAT 발현을 위한 전배양 주기를 제공한다. 항 스트렙토트리신 콜로니는 36시간 후 검출하였고, cakre9Δ::SAT/CaKRE9 이형접합체는 CaKRE9 및 cakre9Δ::SAT 대립유전자 둘다를 증폭시키는 적당한 프라이머를 사용한 PCR 분석에 의해 규명하였다.
단계 2(즉, 프로모터 치환)에 사용되는 조건부 프로모터의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 pBSK-HT4 내에서 CaHIS3이 표시된 테트라사이클린 조절 프로모터 카세트에 상보하는 25개의 뉴클레오타이드; 및 전사 개시 지점및 판독틀을 여는 CaKRE9의 뉴클레오타이드 1 내지 65와 관련된 -270 내지 -205 프로모터 구역에 대응하는 상동 서열의 65개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 생성되는 2.2 kb PCR 산물은, 단계 1에서 생성되는 cakre9Δ::SAT /CaKRE9 이형접합 균주 및 YNB 아가 상에서 선택된 His+형질전환체로 변형되었다. cakre9Δ::SAT 대립유전자 및 CaHIS3-Tet-CaKRE9 대립유전자 둘다를 함유한 실제 CaKRE9GRACE 균주를 PCR 분석에 의해 결정하였다. 전형적으로 2개의 독립된 GRACE 균주는, 임의의 주어진 약물 표적의 말단 표현형의 신뢰할 만한 결정을 제공하기 위해 구성되고 평가된다. 말단 표현형은 필수 유전자의 유전자 산물의 부재로 야기되는 표현형이다.
6.2 CaKRE9 GRACE 균주의 표현형 결정
생성되는 GRACE 균주의 말단 표현형은 3가지 독립된 방법으로 평가하였다. 우선 CaKRE9 GRACE 균주의 말단 표현형은 약 1.0 × 106세포를, YNB 플레이트 및 100 μg/ml 테트라사이클린을 함유한 YTB 플레이트 상에 배열시켜 실온에서 48시간 후 성장률을 비교함으로써 달성되었다. CaKRE9과 같은 필수 유전자에 대해서는, 테트라사이클린의 존재 하에서는 중요한 성장이 검출되지 않는다. 두 번째 접근에서, 유전자의 본질적 성질은 CaKRE9 GRACE 세포를, 625 μg/ml 5-플루오로산(5FOA) 및 100 μg/ml 우리딘을 함유한 카스아미노산 플레이트에 배열시켜 테트라사이클린 프로모터로 조절된 표적 유전자 발현에 일반적으로 필요한 트랜스활성화제 유전자를 절개(표적된 통합 동안 만들어지는 CaLEU2 서열 복제를 통해)하는 원시세포를 선택한다. 또는, 비필수적 GRACE 균주가 이러한 조건하에서 확고한 성장을 입증하는 반면, 필수 GRACE 균주는 성장하지 못했다. 필수 GRACE 균주와 관련된 말단 표현형의 정량적 평가는 100 μg/ml 테트라사이클린이 빠지거나 보충된, YBN 5 ml로 주입된 2 × 103세포수/ml의 하룻밤 동안 배양물을 사용하여 수행하고, 30℃에서 24 내지 48시간 배양 후 광학 밀도(O.D.600)를 측정한다. 전형적으로, 필수 GRACE 균주에서는 48시간 후 광학 밀도의 현저한 증가가 검출되지 않는다. 입증된 필수 유전자에 대한 세포 죽음(사적)과 성장 억제(정적) 말단 표현형의 구별은 24 내지 48시간 배양 후 테트라사이클린으로 처리된 배양물 중 생육가능한 세포(T=0에서 등가의 2 × 103개의 세척된 세포 중 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 판단한 것으로서) 퍼센트를 결정함으로써 달성된다. 사적 말단 표현형을 제조하는 필수 GRACE 균주는 억제 조건하에서 배양 후 생육가능한 세포(즉 2 × 103CFU 미만) 퍼센트의 감소를 나타내는 것이다.
6.3 전체 세포 분석에서의 표적 수준 변화
약물 선별하는데 전체 세포 분석에서 표적 수준 발현의 유용성을 입증하기 위해, CaHIS3 이형접합체 균주 및 테트라사이클린 프로모터로 조절된 CaHIS3 GRACE 균주 둘다를, 야생 유형(2배체) CaHIS3 균주의 3-아미노트리아졸(3-AT)에 대한 감수성을 비교하였다(도. 6). 3-AT는 CaHIS3 및 이미다졸글리세롤 포스페이트 디하이드라테이스에 의해 암호화된 효소의 경쟁적 억제물질이고, 약물 및 약물 표적에 대한 각각의 모형으로 함께 수행한다. 테트라사이클린 프로모터에 의해 유지되는CaHIS3의 구조적 발현 수준에 의해 달성되는 과발현은 야생 유형 및 CaHIS3 이형접합체 균주 둘다의 성장을 완전히 억제하기에 충분한 농도에서 3-AT 내성을 부여한다(도 6A). 관찰되는 표현형은, 노던(Northern) 볼트 분석에 의해 결정된 CaHIS3의 예견된 7.5배 과발현 광선에서 예상되는 것과 일치한다(도 5 참조). 이형 CaHIS3 균주는 야생 유형 또는 테트라사이클린 프로모터를 기재로 하는 CaHIS3 균주를 현저히 과생성하는 것에 영향을 미칠 수 없는 중간 3-AT 농도에 증가된 감수성(즉, 뜻밖의 불충분한 표현형)을 입증한다. 3-AT에 대한 차동 감수성을 위해 평가한 제 3 CaHIS3 발현 수준은, 완전한 정지에 달성되는데 일반적으로 사용되는 테트라사이클린 0.1% 문턱 농도를 사용하여 GRACE CaHIS3 균주의 부분 억제에 의해 제조된다. 유사하게, 플루코나졸 및 튜니카마이신에 대한 GRACE 균주 특이 약물 내성 및 선택성은 약물 표적, CaERG11 및 CaALG7으로 각각 공지된 이들의 발현 수준을 증가시키고 감소시킴으로써 입증되었다. 이들 결과는 함께 3개의 상이한 수준의 발현이 C. 알비칸 GRACE 균주 집합체를 사용하여 달성되고, 이들은 공지된 약물과 이들의 공지된 약물 표적 사이의 예시된 약물 선택성 표현형을 나타냄을 입증한다. 또한, 이들 실험은 병원균 내에서 합성된 표적 유전자 산물이 GRACE 방법을 사용하여 확증된 신규한 약물 표적에 대한 신규한 항진균성 화합물을 규명하기 위해 약물 선별을 기재로 한 전체 세포 분석에 어떻게 상이하게 직접 적용될 수 있는지를 명맥하게 나타낸다.
6.4 표적 경로 규명
표적 경로는, 이 경로(예: 효소, 시그널링(signaling) 분자 등) 중 1종 이상의 성분이 본 발명의 방법에 의해 결정된 약물 표적인 유전학적 경로 또는 생화학적 경로이다.
6.4.1. 분석용 GRACE 균주 원료의 제조
선별에 일치하는 세포 공급원을 제공하기 위해, 숙주 GRACE 균주의 동결 원료를 표준 미세생물학적 기법을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 미생물의 하나의 클론은 원래의 원료의 시료를, 세포 성장을 위한 영양분 및 내성을 부여하는 유전자를 함유한 GRACE 균주에 대한 항생물질 상에 획선함으로써 단리할 수 있다. 하룻밤동안 성장시킨 후 단리된 콜로니를 살균한 바늘로 플레이트로부터 집어내어 GRACE 균주에 대한 내성이 있는 항생물질을 함유한 적당한 액체 성장 배지로 옮긴다. 세포를 적당한 성장 조건하에서 배양하여 지수적 성장으로 배양물을 수득한다. 이 세포를 표준 기법을 사용하여 동결시킨다.
6.4.2 분석에 사용하기 위한 GRACE 균주의 성장
분석을 수행하기 이전에, 원료 바이얼을 냉동기로부터 꺼내 급속하게 해동시키고 세포 성장용 영양분, 및 GRACE 균주가 내성을 부여하는 유전자를 함유하는 항생물질을 함유한 아가 플레이트 상에 배양물 루프를 획선한다. 하룻밤동안 성장시킨 후, 무작위로 선택된 단리된 콜로니를 플레이트(살균 접종물 루프)로부터 GRACE 균주가 내성을 부여하는 유전자를 함유는 항생물질을 포함하는 배지를 함유한 살균 튜브로 옮긴다. 격렬하게 혼합하여 균일한 세포 현탁액을 형성한 후 현탁액의 광학 밀도를 측정하고, 필요한 경우 현탁액 분취액을 배지와 항생물질의 제 2 튜브로 희석한다. 이어서, 세포가 분석에 사용하기에 적당한 광학 밀도에 도달할 때까지배양물을 배양한다.
6.4.3 분석에 사용되는 배지의 선택
진균의 확산, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자에 연결된 조절 프로모터의 2배로 희석한 일련의 유도물질 또는 억제물질은 GRACE 균주가 내성을 부여하는 유전자를 함유하는 적당한 항생물질을 함유한 배양 배지에서 생성된다. 몇몇 배지를 나란히 시험하고, 3 내지 4개의 웰을 각각의 배지에서 각각의 농도로 유도물질 또는 억제물질의 효과를 평가하는데 사용한다. 동일한 부피의 시험 배지-유도물질 또는 억제물질, 및 GRACE 세포를 384개 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 혼합한다. 세포를 전술한 바와 같이 제조하고, 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하기 직전에 시험 항생물질을 함유한 적합한 배지로 희석한다. 대조군을 위해, 유도물질 또는 억제물질을 함유하지 않은 각각의 배지의 몇몇 웰에 세포를 또한 첨가한다. 세포 성장은 웰의 광학 밀도를 모니터링하면서 배양함으로써 연속적으로 모니터링된다. 각각의 농도의 유도물질 또는 억제물질에 의해 생성되는 성장 억제율은 유도물질 또는 억제물질이 없는 배지에서 성장한 세포에 의해 나타나는 성장에 대한 성장의 로그비를 비교함으로써 계산된다. 유도물질 또는 억제물질에 큰 감수성을 나타내는 배지를 하기 기술된 분석에서 사용하기 위해 선택한다.
6.4.4 표적 유전자 산물의 양이 속도를 제한하지 않는 GRACE 균주에서 시험 항생물질 민감도의 측정
작용 메카니즘이 공지된 2배로 희석한 일련의 항생물질을, GRACE 균주를 유지하기 위해 사용된 항생물질을 보충하고 추가의 분석 전개를 위해 선택된 배양 배지에서 생성한다. 상이한 경로에 작용하는 것으로 알려진 시험 항생물질 패널은 세포 성장에 미치는 시험 항생물질의 영향을 각각의 농도에서 평가하는데 사용될 3 내지 4개의 웰을 사용하여 나란히 시험한다. 동일한 부피의 시험 항생물질 및 세포를 384개 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 혼합한다. GRACE 균주를 유지하는데 필요한 항생물질을 보충하고 분석 전개를 위해 선택된 배지를 사용하여 전술한 바와 같이 세포를 제조하고, 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하기 직전에 동일한 배지로 희석한다. 대조군을 위해, 항생물질은 없지만 항생물질을 용해시키는데 사용된 용매를 함유한 몇몇의 웰에 세포를 또한 첨가한다. 세포 성장은 웰의 광학 밀도를 모니터링하는 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 배양함으로써 연속해서 모니터링한다. 각각의 농도의 항생물질에 의해 생성되는 성장 억제율은 항생물질이 없는 배지에서 성장한 세포에 의해 나타나는 성장에 대한 성장의 로그비를 비교함으로써 계산된다. log[항생물질 농도]에 대한 억제율을 도시하여 각각의 항생물질에 대한 IC50값을 외삽할 수 있다.
6.4.5 표적 유전자 산물의 양이 속도를 제한하는 GRACE 균주에서 시험 항생물질 감수성의 측정
분석에 사용하기 위해 선택된 배양 배지에, 전술한 바와 같이 목적하는 양만큼 세포 성장을 억제하는 것으로 나타난 농도로 유도물질 또는 억제물질뿐만 아니라 GRACE 균주를 유지하기 위해 사용된 항생물질을 보충한다. 몇몇 항생물질은 세포 성장에 미치는 시험 항생물질의 영향을 각각의 농도에서 평가하는데 사용될 3내지 4개의 웰을 사용하여 각각의 배지에서 나란히 시험한다. 동일한 부피의 시험 항생물질 및 세포를 384개 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 혼합한다. GRACE 균주를 유지하는데 필요한 항생물질을 보충하고 분석에 사용하기 위해 선택된 배지를 사용하여 전술한 바와 같이 세포를 제조한다. 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하기 직전에 동일한 배지로 희석한다. 상기 세포를 목적하는 양만큼 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났고, 적당한 성장 조건하에서 배양된 유도물질의 농도를 함유한 동일한 배치의 2개의 분취량으로 1:100으로 희석한다. 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하기 직전에, GRACE 균주를 유지하는데 사용된 동일한 농도의 유도물질 및 항생물질이 보충된 따뜻한 살균 배지로 희석하여 배양물을 적당한 광학 밀도로 조절한다. 대조군을 위해, 시험 항생물질을 용해시키는데 사용된 용매를 함유하지만 항생물질을 함유하지 않은 몇몇의 웰에 세포를 또한 첨가한다. 세포 성장은 웰의 광학 밀도를 모니터링하는 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 적당한 성장 조건하에서 배양함으로써 연속해서 모니터링된다. 각각의 농도의 항생물질에 의해 생성되는 성장 억제율은 항생물질이 없는 배지에서 성장한 세포에 의해 나타나는 성장에 대한 성장의 로그비를 비교함으로써 계산된다. log[항생물질 농도]에 대한 억제율을 도시하여 각각의 항생물질에 대한 IC50값을 외삽할 수 있다.
6.4.6 시험 항생물질 특이성 결정
진균의 확산, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자의 양이 속도를 제한하거나제한하지 않은 조건하에 공지된 작용 메카니즘의 항생물질에 의해 생성된 IC50을 비교하여 진균의 확산, 독성 또는 병인성에 필요한 유전자 산물이 있는 경로를 확인할 수 있다. 진균의 확산, 독성 또는 병인성에 필요한, 속도를 제한하는 양의 유전자 산물을 발현시키는 세포가 특정 경로를 통해 작용하는 항생물질에 선택적으로 민감하면, GRACE 균주에서 조절 프로모터에 연결된 유전자에 의해 암호화된 유전자 산물은 항생물질이 작용하는 경로에 포함된다.
6.4.7 시험 항생물질이 작용하는 경로의 확인
전술한 바와 같이, 세포-기초 분석은 또한 시험 항생물질이 작용하는 경로에 반하는 경로를 결정하는데 사용할 수 있다. 이러한 분석에서, GRACE 균주의 패널의 각각의 종에서 조절 프로모터의 조정 하에 유전자가 있는 경로에 반하는 경로를 전술한 바와 같이 확인한다. 진균의 확산, 독성 또는 병인성에 필요한 생물학적 경로에 있는 핵산이 요구되는, 확산, 독성 또는 병인성의 전사에 관한 조절 프로모터를 각각 포함하는 세포 패널을, 핵산의 유전자 산물이 속도를 제한하거나 제한하지 않는 조건하에서 작용하는 경로를 결정하는데 바람직한 시험 항생물질과 접촉시킨다. 증가된 감수성이, 특정 경로에 있는 유전자 산물에 대한 속도를 제한하는 세포에서 관찰되고, 다른 경로에 있는 속도를 제한하는 양의 유전자 산물을 발현시키는 세포에서는 관찰되지 않는다면, 시험 항생물질은 증가된 감수성이 관찰되는 경로에 반하여 작용한다.
본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시양태으로 그 범위를 제한하고자 하는것은 아니다. 본원에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은, 전술한 기술내용 및 첨부된 도면으로부터 당해 기술분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구 범위내에 포함되어야 한다.
다양한 참고문헌이 본원에서 인용되었고, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
Claims (75)
- 유전자의 대립유전자 둘다가 변성된 2배체 세포 균주를 구성하는 방법으로서,(a) 발현가능한 선택성 마커를 암호화하는 제 1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 분열 카세트를 사용하는 재조합에 의해 2배체 진균 세포내 유전자의 제 1 대립유전자를 변성시킴으로써 제 1 대립유전자가 불활성화된 이형접합 2배체 진균 세포를 제공하는 단계; 및(b) 이형 프로모터를 암호화하는 제 2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 치환 분절을 사용한 재조합에 의해 상기 이형접합 2배체 진균 세포내 유전자의 제 2 대립유전자를 변성시켜 이형 프로모터에 의해 제 2 대립유전자의 발현이 조절되도록 하는 단계를 포함하는 방법.
- 각각이 상이한 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하는 2배체 진균 세포의 모임(collection)을 모으는 방법으로서,(a) 발현가능한 선택성 마커를 암호화하는 제 1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 분열 카세트를 사용하는 재조합에 의해 2배체 진균 세포내 유전자의 제 1 대립유전자를 변성시킴으로써 제 1 대립유전자가 불활성화된 이형접합 2배체 진균 세포를 제공하는 단계;(b) 이형 프로모터를 암호화하는 제 2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 치환 분절을 사용한 재조합에 의해 상기 이형접합 2배체 진균 세포내 유전자의 제2 대립유전자를 변성시켜 이형 프로모터에 의해 제 2 대립유전자의 발현이 조절되도록 함으로써, 제 1 유전자의 변성된 대립유전자 쌍을 포함하는 2배체 진균 세포의 제 1 주를 제공하는 단계; 및(c) 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하여 각 반복마다 상이한 유전자가 변성되게 함으로써 각각이 상이한 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하는 2배체 진균 세포의 모임을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,유전자 분열 카세트중의 선택성 마커가 제 1 영역과 제 2 영역 사이에 배치되고, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 개별적으로 2배체 진균 세포내 유전자의 제 1 대립유전자의 비접촉 영역에 교배되는 방법.
- 제 3 항에 있어서,선택성 마커가 CaSAT1, CaBSR1, CaURA3, CaHIS3, CaLEU2, CaTRP1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 1 항에 있어서,2배체 진균 세포가 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 플라비스(Aspergillus flavis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidatropicalis), 칸디다 파라프실롭시스(Candida parapsilopsis), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 콕시도이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 엑소팔리아 데르마티디티스(Exophalia dermatiditis), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 프뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 트리코스포론 베이겔리이(Trichosporon beigelii), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 무코르 로욱시이(Mucor rouxii), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 압시디아 코림비게라(Absidia corymbigera), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis), 마그마포르테 그리세아(Magnaporthe grisea), 푹시니아 레코디타(Puccinia recodita), 셉토리아 트리티시이(Septoria triticii), 틸레티아 콘트로베르사(Tilletia controversa), 및 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis)로 이루어진 군으로부터 선택된 균 종의 세포인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 2배체 진균 세포가 칸디다의 세포인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,(c) 2배체 진균 세포에서 발현가능하고 DNA 결합 영역 및 전사 활성화 영역을 포함하는 트랜스액티베이션(transactivation) 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 프로모터 치환 분절 내의 이형 프로모터가 트랜스액티베이션 융합 단백질의 DNA 결합 영역에 의해 결합된 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 사본을 포함하여 트랜스액티베이션 융합 단백질의 결합이 이형 프로모터로부터의 전사를 증가시키도록 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서,프로모터 치환 분절이 선택성 마커를 추가로 포함하는 방법.
- 제 8 항에 있어서,선택성 마커가 CaSAT1, CaBSR1, CaURA3, CaHIS3, CaLEU2, CaTRP1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하는 2배체 세포 균주로서, 유전자의 제 1 대립유전자는 발현가능한 선택성 마커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 분열 카세트를 사용하는 재조합에 의해 불활성화되고; 유전자의 제 2 대립유전자의 발현은 제 2 대립유전자의 암호화 영역에 연결된 이형 프로모터에 의해 조절되는 2배체 세포 균주.
- 2배체 진균 세포에서 발현가능하고 DNA 결합 영역 및 전사 활성화 영역을 포함하는 트랜스액티베이션 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 프로모터 치환 분절중의 이형 프로모터가 트랜스액티베이션 융합 단백질의 DNA결합 영역에 의해 결합된 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 사본을 포함하여 트랜스액티베이션 융합 단백질의 결합이 이형 프로모터로부터의 전사를 증가시키도록 하는 제 10 항의 2배체 진균 세포.
- 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서,유전자가 세포의 성장 및/또는 생존에 필수적인 유전자인 2배체 세포 균주.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,유전자가 숙주 유기체에 대한 균 세포의 독성 및/또는 병인성에 기여하는 유전자인 2배체 세포 균주.
- 균주 각각이 상이한 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하고, 균의 게놈의 모든 상이한 유전자가 실질적으로 변성되고 모임중에 나타나는 제 10 항의 2배체 균주의 모임.
- 각각이 상이한 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하고 각 유전자는 세포의 성장 및/또는 생존에 필수적인 제 10 항의 2배체 균주의 모임.
- 제 15 항에 있어서,병인성 균의 게놈중의 실질적으로 모든 필수적인 유전자가 변성되고 모임중에 존재하는 2배체 균주의 모임.
- 균주 각각이 상이한 유전자의 변성된 대립유전자를 포함하고, 각 유전자는 숙주 유기체에 대한 세포의 독성 및/또는 병인성에 기여하는 제 10 항의 2배체 균주의 모임.
- 제 17 항에 있어서,숙주 유기체에 대한 균 세포의 독성 및/또는 병인성에 기여하는 2배체 균의 게놈의 실질적으로 모든 유전자가 변성되고 모임중에 존재하는 2배체 균주의 모임.
- 제 14 항에 있어서,모임중에 존재하는 필수적인 유전자가 유사한 생물학적 활성, 유사한 세포내 국재화, 구조적 상동, 서열 상동, 살해(cidal) 말단 표현형, 정적(static) 말단 표현형, 인간 유전자에 대한 서열 상동, 및 유기체에 대한 배타성으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성을 모두 공유하는 2배체 균주의 모임.
- 제 14 항, 제 15 항, 제 17 항 또는 제 19 항에 있어서,각 균주의 세포가 약 20 뉴클레오타이드의 분자 태그를 추가로 포함하고, 상기 분자 태그의 서열은 각 균주에 대해 유일한 2배체 균주의 모임.
- 제 20 항에 있어서,분자 태그가 유전자 분열 카세트 내에 배치된 2배체 균주의 모임.
- 다수의 핵산 분자를 포함하고, 각 핵산 분자가 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:62로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 뉴클레오타이드 서열에 교배될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 미시정렬(microarray).
- 다수의 핵산 분자를 포함하고, 각 핵산 분자가 2배체 진균 세포의 성장에 필수적이거나 숙주 유기체에 대한 2배체 진균 세포의 독성 및/또는 병인성에 기여하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 교배될 수 있는 핵산 분자 미시정렬.
- 균의 생존에 필수적인 유전자를 확인하는 방법으로서,(a) 제 10 항의 2배체 진균 세포를 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나 발현되지 않는 조건하에서 배양하는 단계; 및(b) 세포의 생존도를 측정하는 단계를 포함함으로써 변성된 유전자가 균의 생존에 필수적이라는 것을 대조군에 비한 생존도의 손실 또는 감소로 지시하는 방법.
- 균의 성장에 필수적인 유전자를 확인하는 방법으로서,(a) 제 10 항의 2배체 진균 세포를 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나 발현되지 않는 조건하에서 배양하는 단계; 및(b) 세포의 성장을 측정하는 단계를 포함함으로써 변성된 유전자가 균의 성장에 필수적이라는 것을 대조군에 비한 성장의 손실 또는 감소로 지시하는 방법.
- 균의 독성 및/또는 병인성에 기여하는 유전자를 확인하는 방법으로서,(a) 제 10 항 또는 제 11 항의 2배체 진균 세포를 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나 발현되지 않는 조건하에서 배양하는 단계; 및(b) 세포의 독성 및/또는 병인성을 측정하는 단계를 포함함으로써 변성된 유전자가 균의 독성 및/또는 병인성에 기여한다는 것을 대조군에 비한 독성 및/또는 병인성의 감소로 지시하는 방법.
- 2배체 균의 항균제에 대한 저항에 기여하는 유전자를 확인하는 방법으로서,(a) 제 10 항의 2배체 진균 세포를 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과대발현되는 조건하 및 항균제 존재하에서 배양하는 단계; 및(b) 세포의 생존도를 측정하는 단계를 포함함으로써 변성된 유전자가 항균제에 대한 2배체 균의 저항에 기여한다는 것을 대조군에 비한 생존도의 감소로 지시하는 방법.
- 2배체 균의 성장을 억제하는 항균제를 확인하는 방법으로서,(a) 제 12 항의 2배체 진균 세포를 제공하는 단계; 및(b) 제 2 대립유전자가 과소발현되는 조건하 및 시험 화합물 존재하에서 2배체 진균 세포를 배양하는 단계를 포함함으로써 시험 화합물이 항균제라는 것을 대조군에 비한 2배체 진균 세포의 성장의 손실 또는 감소로 지시하는 방법.
- 포유류 질병 치료용 치료제를 확인하는 방법으로서,(a) 2배체 세포의 변성된 유전자가 필수적인 유전자이고 질병에 관련된 포유류 유전자와 서열 상동성을 나타내는 제 10 항의 2배체 세포를 제공하는 단계; 및(b) 유전자의 제 2 대립유전자가 과대발현되거나 과소발현되는 조건하 및 시험 화합물 존재하에서 2배체 진균 세포를 배양하는 단계를 포함함으로써 시험 화합물이 치료제라는 것을 대조군에 비한 2배체 진균 세포의 성장의 차이로 지시하는 방법.
- 2배체 진균 세포의 성장 또는 증식의 억제와 단백질의 수준 변화의 상관관계를 구하는 방법으로서,(a) 유전자의 두 와일드형 대립유전자를 포함하는 대조 2배체 진균 세포에 대한 제 1 단백질 발현 프로필을 생성하는 단계;(b) 제 12 항의 2배체 진균 세포를 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나, 발현되지 않거나, 과대발현되는 조건하에서 배양하고, 배양된 세포에 대한 제 2 단백질 발현 프로필을 생성하는 단계; 및(c) 제 1 단백질 발현 프로필을 제 2 단백질 발현 프로필과 비교하여 단백질 수준의 변화를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- 유전자 전사 수준의 변화와 2배체 진균 세포의 성장 또는 증식 억제의 상관관계를 구하는 방법으로서,(a) 유전자의 두 와일드형 대립유전자를 포함하는 대조 2배체 진균 세포에 대한 전사 프로필을 생성하는 단계;(b) 제 12 항의 2배체 진균 세포를 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나, 발현되지 않거나 과대발현되는 조건하에서 배양하여 배양된 세포에 대한 제 2 전사 프로필을 생성하는 단계; 및(c) 제 1 전사 프로필을 제 2 전사 프로필과 비교하여 유전자 전사 수준의 변화를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- 칸디다 알비칸스의 증식에 요구되며 SEQ ID NO:63 내지 123중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어진 정제되거나 분리된 핵산 분자.
- 제 32 항에 있어서,상기 뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NO:1 내지 61중 하나인 핵산 분자.
- SEQ ID NO:1 내지 62중 하나의 분절을 포함하고, 상기 분절이 SEQ ID NO:1 내지 62중 하나의 연속적인 뉴클레오타이드 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상 및 100 이상을 포함하는 분절로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 분자.
- 6x 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)중 약 45℃에서 여과기-결합된 DNA에 교배시킨 후 0.2xSSC/0.1% SDS중 50 내지 65℃에서 1회 이상 세척하는 것을 포함하는 엄중한 조건하에서 (a) SEQ ID NO:1 내지 62중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 (b) SEQ ID NO:63 내지 123중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 제 2 핵산 분자에 교배되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,SEQ ID NO:429 내지 486중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자.
- BLASTN 버전 2.0을 사용하여 디폴트 매개변수로써 측정한, SEQ ID NO:1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 30% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, SEQ ID NO:1 내지 62의 연속 뉴클레오타이드 25 이상을 포함하는 분절, SEQ ID NO:1 내지 62에 상보적인 서열 및 SEQ ID NO:1 내지 62의 연속 뉴클레오타이드 25 이상을 포함하는 분절에 상보적인 서열을 포함하고, 칸디다 알비칸스 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 이외의 유기체로부터 수득된 정제 또는 분리된 핵산 분자.
- 제 37 항에 있어서,상기 유기체가 압시디아 코림비게라, 아스페르길루스 플라비스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 니게르, 보트리티스 시네레아, 칸디다 알비칸스, 칸디다 두블리넨시스(Candida dublinensis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루세이, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 트로피칼리스, 콕시도이데스 이미티스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 에리시페 그라미니스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 캅술라툼, 마그마포르테 그리세아, 무코르 로욱시이, 프뉴모시스티스 카리니이, 푹시니아 그라미니스(Puccinia graminis), 푹시니아 레코디타, 푹시니아 스트리이포르미스(Puccinia striiformis), 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 아리주스, 셉토리아 아베나에(Septoria avenae), 셉토리아 노도룸(Septoria nodorum), 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로베르사, 트리코스포론 베이겔리이, 및 우스틸라고 마이디스로 이루어진 군으로부터 선택된 정제 또는 분리된 핵산 분자.
- 제 32 항, 제 33 항, 제 34 항, 제 35 항 또는 제 37 항의 핵산 분자에 조작가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 매개체.
- 제 39 항에 있어서,상기 프로모터가 조절가능한 것인 매개체.
- 제 39 항에 있어서,상기 프로모터가 압시디아 코림비게라, 아스페르길루스 플라비스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 니게르, 보트리티스 시네레아, 칸디다 알비칸스, 칸디다 두블리넨시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 트로피칼리스, 콕시도이데스 이미티스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 에리시페 그라미니스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 캅술라툼, 마그마포르테 그리세아, 무코르 로욱시이, 프뉴모시스티스 카리니이, 푹시니아 그라미니스, 푹시니아 레코디타, 푹시니아 스트리이포르미스, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 아리주스, 셉토리아 아베나에, 셉토리아 노도룸, 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로베르사, 트리코스포론 베이겔리이, 및 우스틸라고 마이디스로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체에서 활성이 있는 매개체.
- 제 39 항의 매개체를 함유하는 숙주 세포.
- SEQ ID NO:63 내지 123중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 정제 또는 분리된 폴리펩타이드.
- FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 디폴트 매개변수로써 측정된, SEQ ID NO:63 내지 123중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 30% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 칸디다 알비칸스 또는 사카로마이세스 세레비시아에 이외의 유기체로부터 수득된 정제 또는 분리된 폴리펩타이드.
- 제 44 항에 있어서,상기 유기체가 압시디아 코림비게라, 아스페르길루스 플라비스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 니게르, 보트리티스 시네레아, 칸디다 알비칸스, 칸디다 두블리넨시스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 크루세이, 칸디다 파라프실롭시스, 칸디다 트로피칼리스, 콕시도이데스 이미티스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 에리시페 그라미니스, 엑소팔리아 데르마티디티스, 푸사리움 옥시스포룸, 히스토플라스마 캅술라툼, 마그마포르테 그리세아, 무코르 로욱시이, 프뉴모시스티스 카리니이, 푹시니아 그라미니스, 푹시니아 레코디타, 푹시니아 스트리이포르미스, 리조무코르 푸실루스, 리조푸스 아리주스, 셉토리아 아베나에, 셉토리아 노도룸, 셉토리아 트리티시이, 틸레티아 콘트로베르사, 트리코스포론 베이겔리이, 및 우스틸라고 마이디스로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드.
- 제 2 폴리펩타이드에 융합된 제 1 폴리펩타이드의 분절을 포함하고, 상기 분절은 SEQ ID NO:63 내지 123중 하나로부터 선택된 아미노산 서열의 연속 잔기 6 이상으로 이루어진 것인 융합 단백질.
- SEQ ID NO:62 내지 123중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 조작가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 매개체를 세포에 도입시키는 단계; 및 상기 세포를 배양하여 상기 뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법.
- SEQ ID NO:62 내지 123중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 조작가능하게 연결된 이형 프로모터를 포함하는 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포를 배양하여 상기 뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법.
- SEQ ID NO:1 내지 62중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 방법으로서,(a) 상기 유전자 산물을 화합물과 접촉시키는 단계; 및(b) 상기 화합물이 상기 유전자 산물의 활성을 조절하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 49 항에 있어서,상기 유전자 산물의 활성이 억제되는 방법.
- 제 49 항에 있어서,상기 유전자 산물이 폴리펩타이드이고 그 활성은 효소 활성, 탄소 화합물 이화작용 활성, 생합성 활성, 수송자 활성, 전사 활성, 번역 활성, 신호 변환 활성, DNA 복제 활성, 및 세포 분할 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 아미노산 서열이 SEQ ID NO:63 내지 123중 하나의 연속 잔기 6 이상을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 도입하는 것을 포함하는 동물의 면역 반응을 유도하는 방법.
- SEQ ID NO:1 내지 62중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 제 1 대립유전자가 불활성이고 유전자의 제 2 대립유전자가 이형 프로모터의 제어하에 있는 칸디다 알비칸스의 균주.
- 이형 프로모터의 제어하에 SEQ ID NO:1 내지 62중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 칸디다 알비칸스의 균주.
- 제 53 항 또는 제 54 항에 있어서,상기 이형 프로모터가 조절가능한 것인 균주.
- SEQ ID NO:63 내지 123중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 분절에 결합하는 화합물 또는 결합 파트너를 확인하는 방법으로서,(a) 상기 폴리펩타이드 또는 그의 분절을 다수의 화합물 또는 하나 이상의 결합 파트너를 포함하는 제제와 접촉시키는 단계; 및(b) 폴리펩타이드 또는 그의 분절에 결합하는 화합물 또는 결합 파트너를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- 칸디다 알비칸소의 성장 또는 증식을 억제하는 능력이 있는 화합물을 확인하는 방법으로서,(a) 칸디다 알비칸스 세포내의 SEQ ID NO:1 내지 62를 포함하는 군으로부터 선택된 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 수준 또는 활성을 와일드형 세포에 비해 감소시키는 단계(상기 감소된 수준은 상기 세포에 대해 치명적은 아니다);(b) 상기 세포와 화합물을 접촉시키는 단계; 및(c) 상기 화합물이 상기 세포의 성장 또는 증식을 억제하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 57 항에 있어서,상기 유전자 산물의 수준 또는 활성을 감소시키는 단계가 상기 유전자 산물이 상기 감소된 수준에서 발현되는 조건하에서 조절가능한 프로모터로부터 상기 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 전사하는 것을 포함하는 방법.
- 제 58 항에 있어서,상기 유전자 산물이 SEQ ID NO:63 내지 123에 의해 암호화된 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 방법.
- 칸디다 알비칸스 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 세포를 (i) SEQ ID NO:1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 수준을 감소시키거나 활성을 억제하는 화합물, 또는 (ii) SEQ ID NO:1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 유전자 산물의 수준을 감소시키거나 활성을 억제하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
- 제 60 항에 있어서,상기 유전자 산물이 SEQ ID NO:63 내지 123에 의해 암호화된 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 방법.
- 제 60 항에 있어서,상기 화합물이 항체, 항체의 분절, 안티센스 핵산 분자, 또는 리보자임(ribozyme)인 방법.
- 항진균 화합물의 제조 방법으로서,(a) 다수의 후보 화합물을 선별하여 SEQ ID NO:1 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 화합물을 확인하는 단계; 및(b) 상기 확인된 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 63 항에 있어서,상기 유전자 산물이 SEQ ID NO:1 내지 61에 의해 암호화된 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 방법.
- SEQ ID NO:1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 약학적으로 효과적인 양의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 칸디다 알비칸스에 의한 환자의 감염을 치료하는 방법.
- 제 65 항에 있어서,상기 화합물이 항체, 항체의 분절, 안티센스 핵산 분자, 또는 리보자임인 방법.
- SEQ ID NO:1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 효과적인 양의 화합물을 포함하는 조성물과 대상을 접촉시키는 것을 포함하는, 칸디다 알비칸스에 의한 대상의 오염을 예방 또는 억제하는 방법.
- SEQ ID NO:1 내지 62로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 효과적인 양의 화합물을 포함하는 조성물과 표면을 접촉시키는 것을 포함하는, 표면에 칸디다 알비칸스를 포함하는 균막이 형성됨을 예방하거나 억제하는 방법.
- 약학적으로 허용가능한 담체중에 SEQ ID NO:1 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 치료적으로 효과적인 양의 시약을 포함하는 약학 조성물.
- 제 65 항에 있어서,대상이 식물, 척추동물, 포유류, 조류 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 43 항 또는 제 44 항의 폴리펩타이드와 결합하는 항체 제제.
- 제 71 항에 있어서,단클로닝성 항체를 포함하는 항체.
- SEQ ID NO:1 내지 61중 하나를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 표적 유전자 산물에 대하여 화합물을 평가하는 방법으로서,(a) 와일드형 2배체 진균 세포를 상기 화합물과 접촉시켜 제 1 단백질 발현 프로필을 생성하는 단계;(b) 표적 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나, 발현되지 않거나 과대발현되는 조건하에서 배양된 제 12 항의 2배체 진균 세포의 단백질 발현 프로필을 측정하여 배양된 세포의 제 2 단백질 발현 프로필을 생성하는 단계; 및(c) 상기 제 1 단백질 발현 프로필과 제 2 단백질 발현 프로필을 비교하여 프로필의 유사성을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- SEQ ID NO:1 내지 61중 하나를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 표적 유전자 산물에 대하여 화합물을 평가하는 방법으로서,(a) 와일드형 2배체 진균 세포를 상기 화합물과 접촉시켜 제 1 전사 프로필을 생성하는 단계;(b) 표적 유전자의 제 2 대립유전자가 실질적으로 과소발현되거나, 발현되지 않거나 과대발현되는 조건하에서 배양된 제 12 항의 2배체 진균 세포의 전사 프로필을 측정하여 배양된 세포의 제 2 전사 프로필을 생성하는 단계; 및(c) 상기 제 1 전사 프로필과 제 2 전사 프로필을 비교하여 프로필의 유사성을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- 다수의 화합물을 선별하여 사카로마이세스 세레비시아에에서 천연 발생하고 SEQ ID NO:1 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자의 오르토로그(ortholog)인 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 화합물을 확인하는 것을 포함하는, 항진균 화합물을 확인하는 방법.
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