JP2003523197A - 薬物標的探索のための遺伝子破壊法 - Google Patents

薬物標的探索のための遺伝子破壊法

Info

Publication number
JP2003523197A
JP2003523197A JP2001560347A JP2001560347A JP2003523197A JP 2003523197 A JP2003523197 A JP 2003523197A JP 2001560347 A JP2001560347 A JP 2001560347A JP 2001560347 A JP2001560347 A JP 2001560347A JP 2003523197 A JP2003523197 A JP 2003523197A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
seq
sequences
genes
nos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001560347A
Other languages
English (en)
Inventor
ロエマー，テリー
ジャン，ボゥ
ブーネ，シャルレス
ブッセイ，ハワード
Original Assignee
エリトラ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エリトラ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド filed Critical エリトラ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Publication of JP2003523197A publication Critical patent/JP2003523197A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、二倍体病原生物のゲノム中のいずれかの遺伝子が必須遺伝子であるか否か、または毒性もしくは病原性に必要な遺伝子であるか否かを実験的に決定することができる方法および組成物を提供する。該方法は、条件付き発現下に配置された遺伝子の１の対立遺伝子の中の遺伝子突然変異体の構築を含む。必須遺伝子および有毒な感染の伝播に重要な遺伝子の同定は、該病原生物に対する新規薬剤のスクリーニングの開発の基本を提供する。本発明はさらに、カンジダ・アルビカンスの遺伝子の、必須であることがわかっているものおよび薬物スクリーニングの潜在的な標的であるものを提供する。標的遺伝子のヌクレオチド配列を種々の薬物探索のために用いることができる。組換えタンパク質の発現、ハイブリダイゼーションアッセイおよび核酸アレイの構築などが含まれる。必須遺伝子によりコードされるタンパク質の使用、および必須遺伝子の改変対立遺伝子を含む遺伝子操作した細胞の種々のスクリーニング方への使用は、本発明に包含される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、2000年2月18日に出願された米国仮出願第60/183,534号(この出願は
参照により本明細書に組み入れられる)についての優先権を主張するものである
。
【０００２】1. 緒言 本発明は、(1)治療的介入(therapeutic intervention)に有効な標的としての
遺伝子産物の同定および確認に有用な株(strains)を構築する方法、(2)治療的介
入に有効な標的としての遺伝子産物を同定および確認する方法、(3)同定された
必須遺伝子の収集、ならびに(4)新規薬物発見のためのスクリーニング方法およ
びアッセイ手順に関する。
【０００３】2. 発明の背景 薬物スクリーニング目的での細胞標的の確認には、一般に、その遺伝子産物の
不活化によりその細胞が生存不能のままになるという実験的証拠が含まれる。し
たがって、例えば病原性真菌によって発現される同必須遺伝子産物に対して活性
な薬物は、有効な治療薬であると予測される。同様に、真菌の病原性および毒性
に必要な遺伝子産物も、薬物スクリーニングプログラムに好適な標的を提供する
ものと予想される。この場合の標的確認は、毒力因子をコードする遺伝子の不活
化によって、動物モデル研究において病原性が低いか、または理想的には無毒性
であることが示される真菌株が作出されるという証拠に基づくものである。薬物
標的の同定および確認は、新規薬物の検出および発見にとって重要な問題である
。なぜなら、これらの標的が医薬品工業におけるハイスループットスクリーニン
グの基礎を形成しているからである。
【０００４】 標的の発見は、従来から費用と時間のかかるプロセスであり、かかるプロセス
では、新たに同定された遺伝子および遺伝子産物を、個別に薬物標的として適切
であるかの可能性について解析している。全ゲノムのDNA配列分析は、遺伝子発
見プロセスを著しく促進させた。したがって、新しい方法およびツールには、こ
の情報を分析し、第1に生物の遺伝子全てを同定し、次いで、どの遺伝子が、有
効な無毒性の薬物発見に適した標的である産物をコードしているかを見分けるこ
とが必要である。配列分析による遺伝子発見だけでは公知または新規の遺伝子を
薬物標的として確認することはできない。遺伝子が必須であるかどうかの基本的
な決定からのその遺伝子の機能の解明は、適切な薬物標的の同定に本質的な障害
を依然として提供する。これらの障害は、特に、二倍体生物において明白である
。
【０００５】 C.アルビカンス(C.albicans)はヒトの主要な真菌病原体である。この生物にお
いて同定された特異的で、感受性の高い、特有の薬物標的が無いということが、
臨床上の使用に有効な無毒性化合物の開発を妨げている。全C.アルビカンスのゲ
ノムのDNA配列分析が最近完了したが、このことが新たな抗真菌薬物標的を同定
しようとする取り組みを復活させた。それにもかかわらず、有用な薬物標的の開
発に対するかかる情報の利用には、２つの主な障害、すなわち、C.アルビカンス
における遺伝子操作に適したマーカーの不足、およびこの二倍体生物において特
定の遺伝子が必須産物をコードしているかどうかを確立することの固有の困難性
、が残っている。2000年2月18日に出願された同時係属中の仮特許出願は、有力
な選択マーカーの同定と、そのマーカーをコードする２つの遺伝子の構築を開示
している。これらのマーカーは、C.アルビカンスの形質転換および遺伝子破壊に
好適である。
【０００６】 C.アルビカンス(図1)における遺伝子破壊の現在の方法は、典型的には、「URA
ブラスター」遺伝子カセットをそのゲノム内への組み込みに使用し、目的の標的
遺伝子と置き換える多段階プロセスを含む。URAブラスターカセットは、CaURA3
マーカーを含み、このマーカーは、対応する栄養要求性宿主内で選択可能であり
、かつサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)HisG遺伝子の定方
向リピート(direct repeat)が隣接している。URAブラスターカセットはまた、置
換すべき遺伝子に対応するフランキング配列も有し、この配列は、相同的組換え
によってその遺伝子の正確な置換を容易にする。推定上のヘテロ接合性形質転換
体は、欠失した標的遺伝子の対立遺伝子の１つを有しており、ウラシル原栄養体
として選択され、その正体および染色体構造はサザンブロットおよびPCR分析に
よって確認される。染色体内組換え事象がHisGリピート間で生じ、CaURA3遺伝子
の切出しおよび組込みカセットの消失が生じている分離株を、5-フルオロオロチ
ン酸(5-FOA)含有培地上で選択した。これは、標的遺伝子の第2の対立遺伝子の破
壊に対して、Ura-ブラスターの再利用を含むプロセス全体の繰り返しを可能にす
る。標的遺伝子が非必須である場合、ホモ接合性遺伝子破壊が第2ラウンドの遺
伝子置換で生じ、サザンブロットおよびPCR分析で同定される。
【０００７】 しかしながら、ホモ接合性欠失株は、必須の遺伝子の両対立遺伝子が欠けてお
り、生存可能ではないであろう。したがって、Uraブラスター法は、標的遺伝子
の必須の性質を確立する明白な結果をもたらさないだろう。なぜなら、生存可能
な突然変異株の増殖の低さといった代わりの説明が、得られた負の結果について
同様に考えられ得るからである。必須遺伝子同定のためのさらに最近の手法には
、Wilson,R.B., Davis, D., Mitchell, A.P.(1999) J. Bacteriol. 181:1868-74
に開示された手法などがあり、複数の栄養要求性マーカーおよびPCRベースの遺
伝子破壊方法を使用している。そのような方法は、Uraブラスターカセットを使
用する必要性を効果的に克服するが、所与の遺伝子が必須であるかどうか、よっ
て潜在的に有用な標的であるかどうかの決定は、多大な労力を要し、ゲノムワイ
ド分析(genome-wide analyses)に不適なままである。カンジダ・アルビカンス(C
andida albicans)における遺伝子破壊に対してUraブラスターカセットまたは複
数の栄養要求性マーカーベースの方法を用いる場合、所与の遺伝子が必須である
という統計学的に確かな結論をサポートするにはかなりの労力が必要である。典
型的には、30〜40個の第2ラウンドの形質転換体全てを、その遺伝子が必須であ
るという特許請求の範囲に対する統計的サポートがなされる前に、破壊断片と予
め構築された破壊対立遺伝子との間の相同的組換えから得られた再構築されたヘ
テロ接合性株として(PCRまたはサザンブロット分析を用いて)確認しなければな
らない。さらに、第2の突然変異は、形質転換ステップまたは5-FOA対抗選択(Ura
ブラスターカセットが再利用される場合)のいずれかで選択可能であるので、２
つの独立に構築されたヘテロ接合性株は、第2の対立遺伝子の破壊の試みの際に
調べられるのが好ましい。さらに、特定の表現型が標的遺伝子のホモ接合性突然
変異(第2の突然変異ではない)に関連しているという証拠は、遺伝子の野生型コ
ピーを破壊株に形質転換により戻すことによる欠陥の補完を必要とする。
【０００８】 最後に、Uraブラスター法は遺伝子の不可欠性の直接的な立証を妨げる。した
がって、必須の標的遺伝子に特徴的な末端表現型を決定的に評価することは不可
能である。その結果、確認された薬物標的遺伝子の不活化により、細胞死(すな
わち殺傷最終表現型)対増殖抑制(すなわち静的最終表現型)が生じるかどうかを
確立することは、そのような情報が、薬物開発における適合性に関して薬物標的
に優先順位をつけることにおいて提供する価値にもかかわらず、現在の手法では
不可能である。
【０００９】 明らかに、現在の遺伝子破壊法は多大な労力を要し、標的確認のためのハイス
ループット方法に対してかなり不応性であるので、二倍体の病原性真菌、特にカ
ンジダ・アルビカンス中の必須遺伝子の明白、迅速かつ正確な同定に有効な方法
およびツールが必要とされている。本発明は、迅速な同定、確認および薬物標的
の優先順位づけをもたらすことで薬物スクリーニングを促進するハイスループッ
ト方法を可能にすることによって、現在の薬物発見手法におけるこれらの制約を
克服するものである。
【００１０】３．発明の概要 本発明は、生物のゲノム内の各遺伝子について、その遺伝子が、必須であるか
否か、およびさらには病原性生物については、毒性または病原性に必須であるか
否かについて実験的に決定することを可能とする効果的かつ効率的な方法を提供
する。必須遺伝子および毒性感染の拡大に重要な遺伝子の同定および評価により
、病原性生物に対する新規な薬物についてのハイスループットスクリーニングの
開発の基本が提供される。
【００１１】 本発明は、倍数性とは関係なく任意の生物、特に病原性真菌で実施することが
できる。好ましくは、病原性真菌は二倍体病原性真菌であり、例えば、カンジダ
・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus
fumigatus)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)
などを含むが、これらに限定されない。
【００１２】 ある実施形態では、本発明は、遺伝子の１つの対立遺伝子が発現可能な優性選
択マーカーを含むカセットの挿入またはこれによる置換によって改変されている
、二倍体真菌株を構築する方法に関する。このカセットは、遺伝子組換えによっ
て染色体内に導入されることにより、遺伝子の第１対立遺伝子が不活性化したヘ
テロ接合体株を提供する。
【００１３】 遺伝子のもう一方の対立遺伝子を、遺伝子組換えにより、異種プロモーターを
含むプロモーター置換断片を導入することにより、遺伝子の第２対立遺伝子の発
現が異種プロモーターによって制御されるように改変する。異種プロモーターか
らの発現は、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含むトランスアクチ
ベータータンパク質が存在することにより制御することができる。このトランス
アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインは、異種プロモーター中の配列を
認識してこれに結合し、プロモーターの転写を増大させる。トランスアクチベー
タータンパク質は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現によって細
胞中に産生されうる。
【００１４】 遺伝子の両方の対立遺伝子が改変されている二倍体真菌を構築するためのかか
る方法を、生物の各遺伝子それぞれについて平行して実施することにより、遺伝
子の改変対立遺伝子をそれぞれに含む二倍体真菌細胞の集団を構築することを可
能にする。この集団は、したがって、二倍体生物の遺伝子の実質的に全ての改変
対立遺伝子を含む。本明細書中に用いる場合、「実質的に全て」という語は、少
なくとも全体の少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または99%を意味する。好ま
しくは二倍体生物のゲノムの全遺伝子すべてが集団中に存在する。
【００１５】 遺伝子の改変対立遺伝子を含む二倍体病原性真菌株などの二倍体生物も本発明
に包含される。ここで、該生物では、遺伝子の第１対立遺伝子が発現可能な優性
選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を挿入またはこれで置換することに
よって不活性化されており、該遺伝子の第２対立遺伝子もまた、該第２対立遺伝
子の発現が異種プロモーターにより制御されるように改変されている。本発明の
１態様では、突然変異体二倍体病原性真菌株中の改変対立遺伝子が、株の増殖、
生存活性および生存に必要な必須遺伝子に相当する。本発明の他の態様では、改
変対立遺伝子が宿主生物に対する病原性二倍体真菌株の毒性および病原性に必要
な遺伝子に相当する。両方の場合、必須遺伝子および毒性/病原性遺伝子が潜在
的な薬物標的である。
【００１６】 したがって、本発明は、それぞれが異なる遺伝子の改変対立遺伝子を含む複数
の株をそれぞれに含む、突然変異二倍体真菌株の集団を包含する。本発明の株の
集団は、真菌のゲノム中の実質的に全ての異なる必須遺伝子、または病原性真菌
のゲノム中の実質的に全ての異なる毒性遺伝子についての改変対立遺伝子を含む
。
【００１７】 他の実施形態では、本発明は、基盤上のアレイ中に特定可能な位置に配置され
た複数の所定のヌクレオチド配列を含む核酸マイクロアレイにも関する。所定の
ヌクレオチド配列は、二倍体病原性生物の増殖および生存に必要である該二倍体
病原性生物の必須遺伝子のヌクレオチド配列、該生物の病原性または毒性に寄与
する遺伝子のヌクレオチド配列、および/または各突然変異株をマークするため
に用いた特有な分子タグに相補的でこれらにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレ
オチドを含みうる。
【００１８】 本発明はまた、二倍体生物の生存に必須な遺伝子、および二倍体病原性生物の
毒性および/または病原性に寄与する遺伝子を同定するための方法にも関する。
まず、本発明は、突然変異真菌細胞などの二倍体生物の突然変異体を用意する。
該突然変異体は、ある遺伝子の１つの対立遺伝子が破壊カセットの挿入または該
カセットによる置換によって不活性化ており、他方の対立遺伝子は該第２の対立
遺伝子の発現は異種プロモーターの制御下となるように、異種制御プロモーター
を含む核酸分子によって改変されている。第２に、このような突然変異細胞を、
改変された遺伝子の第２対立遺伝子が実質的に発現されない条件下で培養する。
そして、該細胞の生存活性または病原性を測定する。生存活性の消失または顕著
な増殖不全が認められる場合は、該突然変異細胞において改変された遺伝子は、
病原性真菌の生存に必須であることを示す。同様に、突然変異細胞の毒性および
/または病原性の消失が認められる場合には、改変された遺伝子が病原性真菌の
毒性および/または病原性に寄与する遺伝子であることを示す。
【００１９】 本発明の他実施形態では、本明細書中に開示する方法によって構築された突然
変異病原性真菌株が病原性真菌に対する効果的な抗真菌剤の検出に有用である。
本発明の突然変異細胞を、試験化合物の存在下または非存在下の異なる増殖条件
下で培養する。すると、増殖速度を比較することにより、標的遺伝子産物に対す
る活性のある化合物か否かを示す。標的遺伝子の第２対立遺伝子を実質的に発現
抑制することができ、これにより、改変対立遺伝子によって発現される遺伝子産
物に対して活性のある化合物に対する感受性が増大した細胞を提供する。あるい
は、第２対立遺伝子を実質的に過剰発現させて、標的遺伝子の改変対立遺伝子に
より発現される遺伝子産物に対して活性のある化合物に耐性が増大された細胞を
提供する。
【００２０】 本発明の他の実施形態では、本明細書中に開示する方法によって構築された株
は、ヒトなどの動物または植物の非感染性疾患の治療に有効な治療薬のスクリー
ニングに用いられる。植物または動物の対応物と標的のアミノ酸配列の類似性、
または配列類似性の欠損の結果として、同定された活性な化合物は植物または動
物における疾患、特にヒトにおける癌や免疫障害などの疾患の治療に対する治療
的用途を有しうる。
【００２１】 他の実施形態では、本発明はさらに、既知の薬物の存在下などの種々の条件下
で、必須および/または毒性遺伝子の発現を解析するための転写プロファイリン
グおよびプロテオミクス技術の使用を包含する。このような研究から得られる情
報は、既知の薬物の標的および機序を解明するため、既知の薬物と同じ様式で作
用する新規薬物を発見するため、および生物の増殖および生存に必須な遺伝子産
物と、生物の毒性および病原性に寄与する遺伝子産物との間の相互作用の概要を
明らかにするために用いることができる。
【００２２】 本発明のさらなる実施形態では、病原性生物の遺伝子のセットを薬物スクリー
ニングに対する潜在的な標的として同定する。かかる遺伝子は、該方法および本
明細書中に開示された基準を用いて、病原性真菌の生存ならびに/または病原性
真菌の毒性および/もしくは病原性に必須であると特定された遺伝子を含む。本
発明により提供される病原性生物の必須遺伝子または病原性遺伝子（即ち、標的
遺伝子）のポリヌクレオチドを種々の薬物発見の目的により利用することができ
る。限定はされないが、該ポリヌクレオチドを、特性解析、スクリーニングまた
は治療用途のための組換えタンパク質の発現に使用することができ、病原性生物
が侵入したまたは存在する（恒常的に、または特定の進行段階もしくは疾患状態
のいずれかにおいて）宿主組織に対するマーカーとしての使用；潜在的にオーソ
ログである必須遺伝子または毒性遺伝子を同定するための近縁のまたは近縁では
ない他の病原性生物のDNA配列と比較するための使用；発現パターンの試験のた
めの核酸アレイに接着させるためのオリゴマーの選択および作製するための使用
；DNA免疫化技術を用いた抗タンパク質抗体の誘起するための使用；抗DNA抗体を
誘起するためのまたは他の免疫応答を誘発するための抗原；および治療薬（アン
チセンスなど）としての使用が可能である。該ポリヌクレオチドが他のタンパク
質に結合するまたは結合する可能性のあるタンパク質をコードする場合（レセプ
ター-リガンド相互作用における場合など）、ポリヌクレオチドは、それに結合
する他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するためのアッセイま
たは結合相互作用の阻害剤を同定するためのアッセイに用いることもできる。
【００２３】 本発明により提供される、必須遺伝子および毒性遺伝子によってコードされる
ポリペプチドまたはタンパク質（即ち標的遺伝子産物）は、生物学的活性の測定
に用いることができ、ハイスループットスクリーニングのための複数のタンパク
質からなるパネルまたはアレイの構成要素としての使用；抗体の誘起または免疫
応答の誘発のための使用；生物学的液体におけるタンパク質（またはその受容体
）のレベルの定量的測定のために設計されるアッセイにおける使用；病原性生物
が侵入したまたは存在する（恒常的に、または特定の進行段階もしくは疾患状態
のいずれかにおいて）宿主組織に対するマーカーとしての使用；およびもちろん
、関連する受容体またはリガンド（結合パートナーという場合もある）の単離、
特に毒性因子の場合における単離への使用が挙げられる。タンパク質が他のタン
パク質に結合する場合（例えば、レセプター-リガンド相互作用における場合な
ど）、該タンパク質を用いて、それと結合する他のタンパク質の同定または結合
相互作用の阻害剤の同定が可能である。これらの結合相互作用に関与するタンパ
ク質を用いて、結合相互作用のペプチドもしくは低分子阻害剤またはアゴニスト
（病原性生物の侵入性および病原性に関与するものを含む）をスクリーニングす
るために用いることもできる。
【００２４】 これらの薬物の探索に有用な物はいずれも全ては、研究用製品として市販され
るキットに開発することが可能である。キットは、本発明の複数の必須遺伝子お
よび毒性遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよび/もしくはポリペプチド、抗
体ならびに/または他の試薬を含みうる。
【００２５】5. 本発明の詳細な説明 5.1 遺伝子破壊および薬物標的同定(Drug Target Discovery) 本発明は、薬物標的の同定および評価のための系統的で効率的な方法を提供す
る。該方法は、ゲノム情報ならびに個々の遺伝子の生物学的機能に基づく。
【００２６】 本発明の方法により、遺伝子突然変異体の集団が作製される。該集団において
は、特定の遺伝子の量を変化させて(モジュレートして)、増殖、生存および/ま
たは病原性に関するそれら遺伝子の機能を調べることができるようにしてもよい
。そのような研究から得られた情報により、潜在的な薬物標的としての個々の遺
伝子産物の同定が可能となる。さらに本発明は、遺伝子突然変異体を個々にもし
くは集団として、薬物スクリーニングにおよび薬物作用機構の研究に使用する方
法を提供する。
【００２７】 一般的に、遺伝子破壊実験において、二倍体の生物におけるある遺伝子の対立
遺伝子の両方についてのホモ接合性欠失を作製できないという観察によって、そ
れ自体で、該遺伝子が必須遺伝子であるという結論が支持されるわけではない。
むしろ、問題の遺伝子の発現が該遺伝子を有する細胞の生存度と結びついている
ことの直接的な証明が、問題の遺伝子が必須であるという明白な立証のために必
要である。
【００２８】 所定の遺伝子が細胞の生存に必須であることの直接的な証明は、一倍体の時期
がある二倍体の生物において該遺伝子の発現を破壊することによって、立証する
ことができる。例えばSaccharomyces cerevisiaeにおいては、二倍体細胞型にお
ける遺伝子破壊法を通じて遺伝子産物を完全に除去し、続いて胞子形成および減
数分裂の結果としての４つの分子の分離により、単一の突然変異による差異を有
する一倍体酵母株の直接比較が可能となることによって、上記の証明が行われる
。しかしながら、このような方法は大部分の病原性二倍体細胞型を含む無性生殖
酵母株に適用することができず、推定上の必須遺伝子の発現を排除するためには
別の方法が必要である。
【００２９】 一実施形態において、本発明はある生物の二倍体突然変異型細胞の作製方法を
提供する。この方法では、その突然変異型細胞において特定の遺伝子の量を変化
させる(モジュレートする)ことができる。この本発明の方法によって、生物の二
倍体細胞中の標的遺伝子の一方の対立遺伝子を破壊し、一方で第2の対立遺伝子
を、該対立遺伝子のプロモーターを異種の制御プロモーターに置換することによ
って改変する。このようにして構築された株を、改変型対立遺伝子対(すなわち
、双方の対立遺伝子が上記のように改変されている遺伝子)を含むと言う。生物
のゲノムDNA配列が利用可能な場合には、この工程を生物の各々全ての遺伝子に
ついて繰り返すことができ、それによって、突然変異型生物(各生物は、破壊さ
れた対立遺伝子と条件付きで発現することができる対立遺伝子とを有する)の集
団を構築することができる。従って、この遺伝子破壊ストラテジーは、ある生物
に対する潜在的な薬物標的遺伝子の実質的に完全なセットを提供する。この突然
変異型生物集団は、改変型対立遺伝子対の実質的に完全なセットを含み、ハイス
ループット薬物スクリーニングアッセイ開発のための基礎を形成する。生物のゲ
ノム配列が完全に配列決定されていない場合でさえも、このような突然変異型生
物の集団を作製することができる。より小さな突然変異型生物集団を作製し得る
ことが意図される。この場合、各突然変異型生物においては、所望の遺伝子サブ
セットのうちの一方の対立遺伝子が破壊され、このサブセットにおける遺伝子の
もう一方の対立遺伝子が条件付き発現下に置かれる。このような株の構築に用い
られる本発明の方法を本明細書ではGRACE法と呼ぶ。GRACE法の頭字語は、遺伝子
置換および条件付き発現(gene replacement and conditional expression)とい
うフレーズに由来する。
【００３０】 一方の対立遺伝子の条件付き発現とともにもう一方の対立遺伝子の破壊を含む
GRACE法は、URAブラスターカセットを用いた破壊の反復サイクルと、続くその減
失に対する対抗選択に頼る方法の限界を克服する。GRACE法により、病原性真菌
などの二倍体病原性微生物における大規模な標的評価が可能となる。
【００３１】 二倍体細胞に適用する本発明のGRACE法は、以下の2ステップを含む：(i)挿入
、トランケーションおよび/または欠失による一方の野生型対立遺伝子のコード
領域および/または非コード領域の破壊を生じる遺伝子置換、および(ii)プロモ
ーター置換または条件付きタンパク質不安定性による残るもう一方の野生型遺伝
子の条件付き発現(図２)。該方法の詳細な説明は、後節で規定する。
【００３２】 GRACE法を適用することで生じ、単離した突然変異型生物を、本明細書ではそ
の生物のGRACE株と呼ぶ。ある生物のそのような突然変異型株は、本発明に包含
される。特定の実施形態において、特定の生物のゲノム中の実質的に全ての異な
る遺伝子をGRACE法による改変に供することによって生成されるGRACE株の集団が
提供される。この集団において、各々の株が異なる遺伝子の改変型対立遺伝子を
含み、該生物の実質的に全ての遺伝子が集団において提示される。目的の生物に
おける全ての遺伝子に対するGRACE株が生成されることが意図される。あるいは
、ある生物のGRACE株のより小さな集団を生成することができ、その場合には、
該生物の所望の遺伝子サブセットがGRACE法によって改変される。
【００３３】 一般的には、生物の生存度および/または正常な増殖が、ある遺伝子の発現に
結び付けられるかまたは依存する場合に、該遺伝子が必須であると考えられる。
細胞における必須機能は、部分的には該細胞の遺伝子型に、および部分的には細
胞環境に依存する。必須機能、例えばエネルギー代謝、細胞構造の生合成、遺伝
材料の複製および修復などの中には、複数の遺伝子を必要とするものがある。し
たがって、生物における多数の遺伝子の発現がその生物の増殖および/または生
存に必須である。従って、規定の条件セット下にあるGRACE株の生存度または正
常な増殖が、改変型対立遺伝子対のうちの残存する機能的な対立遺伝子の条件付
き発現に結び付けられるかまたは依存する場合には、この株においてGRACE法で
改変された遺伝子を生物の「必須遺伝子」と呼ぶ。
【００３４】 生物の病原性が少なくとも部分的にある遺伝子の発現に関連する場合には、一
般的に該遺伝子は生物の毒性/病原性に寄与すると考えられる。生物の多数の遺
伝子が、生物の毒性および/または病原性に寄与すると予想される。従って、規
定の宿主または宿主由来の規定の細胞セットに対するGRACE株の毒性および/また
は病原性が、改変型対立遺伝子対のうちの残存する機能的な対立遺伝子の条件付
き発現に関連する場合には、この株においてGRACE法で改変された遺伝子を生物
の「毒性遺伝子」と呼ぶ。
【００３５】 本発明は、病原生物の必須遺伝子を同定し、かつ薬物同定プログラムにおける
それら遺伝子の有用性を評価するための便利で効率的な方法を提供する。同様に
、本発明の方法を用いて病原生物の毒性遺伝子を同定することができる。GRACE
法によって同定される、これらの生物の必須遺伝子および毒性遺伝子の正体は、
本発明に包含される。生物の実質的に全ての必須遺伝子および毒性遺伝子が、本
発明のGRACE法によって同定され評価され得る。
【００３６】 このように同定された各々の必須遺伝子および毒性遺伝子は、生物に対する潜
在的な薬物標的に対応し、個々にまたは集団として薬物スクリーニングの種々の
方法に用いることができる。薬物スクリーニングプログラムの目的および標的疾
患に応じて、本発明の必須遺伝子および毒性遺伝子を、遺伝子産物の構造的特徴
、機能的特性および発現プロファイルに基づいてサブセットに分類し、区分する
ことができる。各サブセット内の必須遺伝子および毒性遺伝子によってコードさ
れる遺伝子産物は、類似の生物学的活性、類似の細胞内局在、構造的相同性およ
び/または配列相同性を共有し得る。また類似のもしくは遠縁の分類学的グルー
プ中の他の生物に対する配列相同性もしくは類似性(例えば、Saccharomyces cer
evisiae遺伝子もしくはヒト遺伝子に対する相同性)または他の生物(例えば、S.
cerevisiaeもしくはヒト)の遺伝子に対する配列類似性もしくは相同性の完全な
欠如に基づいて、サブセットを作成してもよい。また、改変型遺伝子を有する生
物による殺菌最終表現型または静菌最終表現型の提示に基づいてサブセットを作
成してもよい。必須遺伝子セットまたは毒性遺伝子セットと呼ばれるこのような
サブセットは、薬物スクリーニングプログラムにおいて１つのグループとして都
合よく研究することができる。このようなサブセットが本発明によって提供され
る。従って、本発明は複数の突然変異型生物、例えば各GRACE株が異なる遺伝子
の改変型対立遺伝子を含む、GRACE株の集団を提供する。この場合の各遺伝子は
細胞の増殖および/または生存に必須なものである。
【００３７】 特定の実施形態においては、病原性真菌のゲノム中の実質的に全ての必須遺伝
子がGRACE法によって同定され、その必須遺伝子の改変型対立遺伝子対を含有す
るGRACE株がGRACE株集団に含まれる。別の特定の実施形態においては、病原性真
菌のゲノム中の実質的に全ての毒性遺伝子がGRACE法によって同定され、その毒
性遺伝子の改変型対立遺伝子対を含有するGRACE株がGRACE株集団に含まれる。
【００３８】 Candida albicansにおいて、ゲノム全体に対するGRACE株集団はC. albicansの
ゲノム配列分析に基づく約7000個の遺伝子の改変型対立遺伝子対を含み得る。C.
albicansの必須遺伝子の完全なセットは、約1000個の遺伝子を含むと算出され
ている。本発明は、C. albicansのこれらの遺伝子のうちの幾つかの正体、およ
び薬物標的としてのこれらの遺伝子およびそれらの遺伝子産物の種々の使用を提
供する。さらに、この病原体の毒性に関与する遺伝子数についての推定値は、10
0〜400遺伝子である。一旦、必須遺伝子の正体が既知になれば、GRACE法以外の
その他の方法によって作製した１コピー以上の突然変異した必須遺伝子を含有す
る種々の型の突然変異体が考えられ、それらは本発明に包含される。
【００３９】 また本発明は生物学的方法およびコンピューター使用の方法、ならびに同定さ
れたC. albicansの必須遺伝子および毒性遺伝子に相同的な遺伝子の単離および
同定を可能にする試薬を提供する。二倍体生物のGRACE株から得られた情報を用
いて、一倍体生物における相同配列を同定することができる。またこのような相
同遺伝子の正体および使用も本発明に包含される。
【００４０】 考察を明快にするために、本発明を下記のサブセクションで病原性真菌である
Candida albicansを例にして説明する。しかしながら、植物およびヒトを含む動
物に対するその他の病原体および寄生虫の必須遺伝子および毒性遺伝子に、その
原理を同様に適用することができる。GRACE法は、生活環に複相を有する病原生
物のいずれにも適用することができる。従って、二倍体病原生物という用語は、
二倍体形態のみで存在する生物に限定されず、生活環に単相と複相の双方を有す
る生物も包含する。
【００４１】 例えば、薬物標的同定および評価のためのGRACE法は、その他の病原性真菌に
直接的に適用することができる。不完全菌類(Deuteromycetous fungi)、すなわ
ち性周期および古典遺伝学にあてはまらない真菌(この中には、C. albicansが含
まれる)は、ヒト真菌病原体の大部分に相当する。Aspergillus fumigatusはこの
門の医学的に重要なもう1つのメンバーである。より厳密には、この門には子嚢
菌および担子菌のメンバーが含まれる。A. fumigatus、子嚢菌は、免疫無防備状
態の患者において、呼吸器感染または侵入性アスペルギルス症(IA)を引き起こす
主要な空気感染性真菌因子である。20年前では比較的知られていないかったが、
今日、IAの症例数は1年当たり数千例であると推定されている。IAの死亡率は50
％を超え、アンホテリシン(amphothericin)Bもフルコナゾールもあまり有効では
ない。これらの問題を合わせると、この生物の新規な薬物標的の同定はこの生物
において標的評価されている現状によって限定されている。
【００４２】 以下の理由により、C. albicansで示したGRACE法はA. fumigatusへの使用に容
易に適応される。A. fumigatusは一倍体ゲノムを有するが、GRACE法を単純化し
て野生型プロモーターを1ステップで条件付きプロモーターに置換する方法とす
ることができる。Candida albicansとは対照的に、A. fumigatusは普遍遺伝コー
ドに忠実であるので、C. albicansに対してGRACE法を操作するために必要である
ような広範な部位特異的突然変異誘発を必要としないだろう。さらにA. fumigat
usに対する、形質転換、および相同的組換えによる遺伝子破壊などの必須な分子
生物学技法が開発されている。選択マーカーがA. fumigatusにおけるこれらの技
法に利用可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシンBおよびフレオ
マイシンに対する抗生物質耐性を付与する遺伝子、ならびに栄養要求性マーカー
、ura3が挙げられる。さらには、公的および民間の双方のA. fumigatusゲノム配
列決定プロジェクトが存在する。従って、配列情報はGRACE法を用いた推定上の
必須遺伝子の同定ならびにこれらの薬物標的の実験的評価の双方に利用可能であ
る。GRACE法を適用することができるさらなる病原性不完全菌類には、Aspergill
us flavus、Aspergillus nigerおよびCoccidiodes immitisが含まれる。
【００４３】 本発明の別の態様において、薬物標的の同定および評価のためのGRACE法は担
子菌の病原性真菌に適用される。この門の特に医学的に重要な1メンバーは、Cry
ptococcus neoformansである。この空気伝染性病原体は、AIDS患者において生命
を危うくする感染の原因として一般にみとめられているうちの4番目(7〜8％)に
相当するものである。C. neoformansに対する形質転換および遺伝子破壊ストラ
テジーは存在しており、また公的に資金が提供されたこの生物に対するゲノム配
列決定プロジェクトが整っている。C. neoformansは性周期を有し、従ってGRACE
法を一倍体株および二倍体株の双方に用いることが可能である。その他の医学的
に重要な担子菌類としては、Trichosporon beigeliiおよびSchizophylum commun
eが挙げられる。
【００４４】 同様に、医学的に関連する真菌病原体がGRACE法を用いた合理的な薬物標的同
定に好適である。したがって、さらに植物真菌病原体および動物病原体を調査し
て農業的および獣医学的目的の新規な薬物標的を同定することができる。果実、
木の実、野菜、イネ、ダイズ、オートムギ、オオムギおよびコムギを含めた多く
の農作物の品質および収量は、植物真菌病原体によってかなり低減される。例と
しては、葉の病斑(Septoria tritici)、包頴の病斑(Septoria nodorum)、様々な
コムギさび病(Puccinia recondita、Puccinia graminis)、ウドンコ病(様々な種
)および茎/根茎(stem/stock)の腐敗病(Fusarium spp.)を引き起こすコムギ真菌
病原体が挙げられる。その他の特に有害な植物病原体の例としては、ジャガイモ
飢饉の原因微生物、Phytophthora infestans、オランダエルム病を引き起こす子
嚢菌類、Ophiostoma ulmi、トウモロコシ黒穂病を引き起こす病原体、Ustilago
maydis、およびイネいもち病を引き起こす病原体、Magnapurtla griseaが挙げら
れる。抗真菌剤耐性を有する植物病原体の新たな出現および単一栽培実施への依
存の増大は、新規かつ改良された抗真菌性化合物の必要性が増大していることを
明らかに示す。従って、本発明は、植物および家畜の病原体および寄生虫におけ
る薬物標的を同定および評価するためのGRACE法の適用を包含する。表Iに、医学
的、農業的または商業的な価値のある一倍体および二倍体真菌の代表的なグルー
プを挙げる。
【００４５】 Candida glabrataを除く全てのCandida種は、生活環に単相を欠く真正の二倍
体種であり、従ってGRACE法の適用を受ける。
【００４６】5.2 GRACE株の構築 本発明に従って、二倍体生物のGRACE株において、遺伝子の一方の対立遺伝子
のみを削除する一方で、第二の対立遺伝子を異種プロモーターの制御下に置いて
、その活性を調節することができる。その遺伝子が必須である場合、対立遺伝子
を両方とも削除すると、致死となるか、又は増殖がひどく損なわれる。従って、
本発明において、異種プロモーターは、第二の対立遺伝子の発現のレベルの範囲
を定めるために使用される。条件に応じて、第二の対立遺伝子は、その対立遺伝
子がその天然プロモーターに結合している場合と比較して、非発現性、低発現性
、過剰発現性又は通常レベルの発現性であり得る。異種プロモーターは、同じ病
原生物の異なる遺伝子から得られるプロモーターであるか、又は異なった種から
得られるプロモーターであり得る。
【００４７】 標的遺伝子の正確な置換は、目的の株において発現できる選択マーカー(好ま
しくは優性選択マーカー)を含む遺伝子破壊カセットを用いることにより、容易
になる。2つの別個の優性選択マーカーを利用できることにより、標的遺伝子の
両方の対立遺伝子において、従来の方法に固有の対抗選択工程を必要とすること
なく、遺伝子置換工程を実施できるようになる。
【００４８】 特に、本発明は、遺伝子の両方の対立遺伝子を改変する、二倍体病原性真菌細
胞株の構築のための方法を含む。この方法は、(a)二倍体病原性真菌細胞の遺伝
子の第一の対立遺伝子を、その細胞内で発現できる選択マーカーをコードするヌ
クレオチド配列を含む遺伝子破壊カセットを用いて組換えを行うことにより改変
し、このことにより遺伝子の第一の対立遺伝子が不活性化されたヘテロ接合体の
病原性真菌細胞を提供する工程、及び(b)異種プロモーターを含むプロモーター
置換断片によって組換えを行うことにより、遺伝子の第二の対立遺伝子が異種プ
ロモーターにより制御されるように、ヘテロ接合体の二倍体病原性真菌細胞にお
ける遺伝子の第二の対立遺伝子を改変する工程を含む。
【００４９】 この方法を、遺伝子の所望のサブセットについて繰り返すことにより、それぞ
れの株が異なった遺伝子の改変型対立遺伝子対を含むGRACE株の集団を作製する
。この方法を病原性真菌の遺伝子の全てについて反復することにより、病原性真
菌のゲノム全体に相当するGRACE株の完全なセットを得ることができる。このよ
うに本発明は、その細胞のそれぞれが異なった遺伝子の改変型対立遺伝子を含む
、二倍体病原性真菌細胞の集団を構築するための方法を提供する。この方法は、
対立遺伝子対を改変する工程を複数回反復することを含み、各反復により、異な
る対立遺伝子対が改変され、このことによりそれぞれ異なった遺伝子の改変型対
立遺伝子を含む二倍体病原性真菌細胞の集団が提供される。
【００５０】 GRACE株構築のための好適な実施例は、次の2工程法を用いる。C.アルビカンス
(C.albicans)を例として用いる。
【００５１】5.2.1 遺伝子破壊によるヘテロ接合体構築 ヘテロ接合性突然変異体を作製するために、いくつかの従来より既知の方法を
利用することができる。それほど好ましくない実施例において、栄養要求性マー
カー(限定しないが、例えば、CaURA3、CaHIS3、CaLEU2又はCaTRP1)を、所望なら
ば遺伝子破壊のために用いることができる。しかし、二倍体真菌におけるヘテロ
接合体構築の好適な方法においては、遺伝的に改変された優性選択マーカーを利
用する。C.アルビカンスは、1ミリリットル当たり200マイクログラムの濃度のヌ
クレオシド様の抗生物質であるストレプトトリシンに感受性である。C.アルビカ
ンス中の大腸菌SAT1(Escherichia coli SAT1)遺伝子の存在により、薬物がアセ
チル化されて非毒性になり、1ミリリットル当たり200マイクログラムの濃度のス
トレプトトリシンの存在下でも、株が増殖できる。C.アルビカンスにおけるSAT1
遺伝子の発現は、そのDNA配列がこの生物体の遺伝コードと適合するように変更
する遺伝子操作を行い、かつCaACT1プロモーター(Morschhauserら、(1998) Mol.
Gen. Genet. 257:412-420)及びCaPCK1ターミネーター配列(Leukerら、(1997) G
ene 192:235-40)を与えることにより可能となる。この遺伝的に改変されたマー
カーは、CaSAT1と呼ばれ、2001年2月16日に出願された同時継続中の米国通常特
許出願の主題である。
【００５２】 C.アルビカンスは、第二の殺真菌性化合物であるブラストサイジンに対しても
感受性があり、それと同系のバチルス・セレウス(Bacillus cereus)由来の耐性
遺伝子であるBSRは、同様に、C.アルビカンス(CaBSR1)において発現するように
遺伝的に操作されると、優性薬物耐性表現型を与えることが示された。破壊すべ
きC.アルビカンス遺伝子の5'及び3'の配列と同一の約65bpの隣接配列を含むよう
に、それぞれの優性選択マーカーをPCR増幅することにより、あらゆるC.アルビ
カンス遺伝子について遺伝子破壊カセットの構築が可能となる。
【００５３】 Baudinら(1993, Nucleic Acids Research 21:3329-30)の方法を利用すること
により、PCR増幅された遺伝子破壊カセットによるC.アルビカンス株の形質転換
、及び優性選択マーカーにより野生型遺伝子が正確に置換された薬物耐性形質転
換体の選択に続いて遺伝子破壊の結果を得ることができる。このような突然変異
体株は、限定しないが、ストレプトトリシンのような薬物の存在下における増殖
に対して選択することができる。得られる遺伝子破壊は、二倍体C.アルビカンス
において一般的にヘテロ接合性であり、相同染色体上の対立遺伝子対の一方のコ
ピーが破壊され、他方の相同染色体上のもう一方の対立遺伝子は、初めの親株に
みられるような野生型対立遺伝子として残る。破壊された対立遺伝子は機能せず
、その遺伝子のこの対立遺伝子からの発現はない。この方法を、生物のゲノム中
のすべての遺伝子について反復することにより、その生物のすべての遺伝子につ
いて、遺伝子破壊のセットを得ることができる。この方法は、所望の遺伝子のサ
ブセットに対して適用することもできる。
【００５４】5.2.2. テトラサイクリン制御プロモーターによる条件付き発現 本発明の実施例において使用される条件付き発現系は、制御プロモーター及び
プロモーター活性を制御するための手段を含む。先のセクション５．１．１に記
載のように構築されるヘテロ接合体の残存する野生型対立遺伝子の条件付き発現
は、そのプロモーターを、S.セレビシエ(S.cerevisiae)について最初に開発され
るが、C.アルビカンスで用いるために改変されるテトラサイクリン制御プロモー
ター系によって置換することにより達成される。Gariら、1997, Yeast 13:837-8
48;及びNagahashiら、1997, Mol. Gen. Genet. 255:372-375を参照のこと。
【００５５】 要約すると、条件付き発現は、第一に、S.セレビシエGAL4(アミノ酸785〜881)
又はHAP4(アミノ酸424〜554)の転写活性化ドメインと融合した大腸菌TetRテトラ
サイクリンリプレッサードメイン又はDNA結合ドメイン(アミノ酸1〜207)を含む
、トランス活性化融合タンパク質を構築することにより達成される。C.アルビカ
ンスの遺伝コードに対応させるために、複数のCTGコドン修正が誘導される。大
腸菌TetR(アミノ酸1〜207)にS.セレビシエGAL4(アミノ酸785〜881)を加えたもの
、及び大腸菌TetR(アミノ酸1〜207)にS.セレビシエHAP4(アミノ酸424〜554)を加
えたもの(これらの両方とも、C.アルビカンスにおける適切な発現のために改変
されている)のトランス活性化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は
、本発明に含まれる。従って、本発明は、細胞で発現され得るトランス活性化融
合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる、一倍体又は二
倍体細胞を提供し、ここで、トランス活性化融合タンパク質は、DNA結合ドメイ
ン及び転写活性化ドメインを含む。
【００５６】 C.アルビカンスにおけるトランス活性化融合タンパク質の構成性発現は、CaAC
T1プロモーター及びCaACT1ターミネーター配列を与えることにより達成される。
しかし、C.アルビカンスにおいて機能的であるあらゆる制御領域、プロモーター
及びターミネーターを、融合タンパク質の発現に使用できることは明らかである
。このように、C.アルビカンスにおいて機能的であるプロモーター、トランス活
性化融合タンパク質のコード領域、及びC.アルビカンスにおいて機能的であるタ
ーミネーターを含む核酸分子は、本発明に含まれる。このような核酸分子は、プ
ラスミド、コスミド、トランスポゾン又は可動遺伝因子であり得る。好適な実施
形態において、TetR-Gal4又はTetR-Hap4トランス活性化因子を、それぞれura3及
びhis3栄養要求性マーカーを用いることにより、C.アルビカンス株に安定的に結
合させることができる。
【００５７】 この実施形態において、本発明はさらに、トランス活性化融合タンパク質のDN
A結合ドメインにより認識されるヌクレオチド配列を少なくとも１コピー含む異
種プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む、プロモーター置換断片を
提供する。ここで、トランス活性化融合タンパク質の結合は、異種プロモーター
の転写を増加させる。異種テトラサイクリンプロモーターは、最初にS.セレビシ
エ遺伝子発現のために開発され、ADH13'ターミネーター配列、テトラサイクリン
オペレーター配列の可変数のコピー(2、4又は7つのコピー)及びCYC1基準プロモ
ーターを含む。そのテトラサイクリンプロモーターは、目的の遺伝子のオープン
リーディングフレームのすぐ上流に配置された場合、テトラサイクリンプロモー
ター依存的制御に有利な方向で、CaHIS3及びCaSAT1選択マーカーの両方に隣接す
るようにサブクローニングされた。CaHIS3-TetプロモーターカセットのPCR増幅
は、標的遺伝子のヌクレオチド位置-200〜-1(開始コドンに対して)の辺りのプロ
モーター配列と相同性のある65bpの隣接配列相同性を含むようにし、それにより
形質転換のための条件付きプロモーター置換断片を作製する。CaSAT1破壊カセッ
トを用いて上記セクション５．１．１で述べたようにC.アルビカンス株を形質転
換してヘテロ接合体として作製した場合、プロモーター置換断片と野生型対立遺
伝子プロモーターの間の相同性組換えにより、残存する野生型が、テトラサイク
リンプロモーターによる条件付き制御遺伝子とする株を作製する。形質転換は、
His原栄養株として選択され、サザンブロット法及びPCR解析により検証される。
【００５８】 この特定の実施形態において、プロモーターはテトラサイクリンの不在下で導
入され、テトラサイクリンの存在により抑制される。テトラサイクリンの類似体
(クロルテトラサイクリン、デームクロサイクリン、ドキシサイクリン、メクロ
サイクリン、メトサイクリン、ミノサイクリンヒドロクロリド、アンヒドロテト
ラサイクリン及びオキシテトラサイクリン等があるが、これらに限定されない)
もまた、GRACE株において、改変型対立遺伝子の発現の抑制のために用いること
ができる。
【００５９】 本発明はまた、tetR'と呼ばれる突然変異型テトラサイクリンリプレッサー(te
tR)分子に基づく、テトラサイクリンプロモーター系の代替変異株も包含する。
この変異株は、tetR'が野生型tetRに代えて、又は野生型tetR'に加えて用いられ
る場合、抗生物質エフェクター分子の結合により活性化されて(すなわち、それ
と同系のオペレーター配列に結合して)発現を促進し、また抗生物質エフェクタ
ーの不在下においては、抑制される(すなわち、オペレーター配列に結合しない)
。例えば、GRACE法は、薬物輸送に関与する遺伝子(例えば、CaCDR1、CaPDR5又は
CaMDR1)を遮断するなどして、テトラサイクリンが存在しない条件下での抑制が
必要とされる場合に、tetRに代えて、tetR'を用いて行うことができる。GRACE法
はまた、tetRが活性化因子ドメインに融合し、tetR'が一般的なリプレッサー（
例えばCaSsr6またはCaTup1）に融合して、抗生物質エフェクター分子の存在下に
おいて発現を増強するか、又はさらに抑制する場合、tetR及びtetR'分子の両方
を、活性化因子／リプレッサーの二元系に組み入れるように適合させることがで
きる(Belliら、1998, Nucl Acid Res 26:942-947。参照により本明細書に組み入
れる)。条件付き発現を提供するこれらの方法もまた意図される。
【００６０】 本発明のもう一つの実施形態において、この方法は、遺伝子の発現が異種プロ
モーターにより条件付きで制御されるようにして、異種プロモーターをコードす
るヌクレオチド配列を含むプロモーター置換断片を用いた対立遺伝子の組換えに
より、遺伝子の対立遺伝子の一方を改変することにより、一倍体病原性真菌にも
適用することができる。一倍体病原生物の遺伝子の好適なサブセット又はその完
全なゲノムの遺伝子に対してこの方法を反復することにより、条件付き突然変異
株の集団又は完全なセットを得ることができる。遺伝子の好適なサブセットは、
他の生物(例えば、C.アルビカンス及びS.セレビシエ)の標的遺伝子に対するヌク
レオチド配列の実質的な相同性を共有する遺伝子を含む。例えば、本発明に対す
る変形は、限定しないが、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus
)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・フラビス(A
spergillus flavis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、クリプトコッ
カス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、コッキジオイデス・イミ
ティス(Coccidioides immitis)、エキソファリア・デルマティディティス(Exoph
alia dermatiditis)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、ヒス
トプラスマ・カプスラトゥム(Histoplasma capsulatum)、フヌモシスティス・カ
リニイ(Phneumocystis carinii)、トリコスポロン・ベイゲルイイ(Trichosporon
beigelii)、リゾプス・アルルヒズス(Rhizopus arrhizus)、ムコール・ロキシ
イ(Mucor rouxii)、リゾムコール・プシルス(Rhizomucor pusillus)もしくはア
ブシディア・コリムビゲラ(Absidia corymbigera)等の動物真菌病原体、又はボ
トリティス・シネレア(Botrytis cinerea)、エリシフェ・グラミニス(Erysiphe
graminis)、マグナポルテ・グリセア(Magnaporthe grisea)、プッキニア・レコ
ディタ(Puccinia recodita)、セプトリア・トリティシイ(Septoria triticii)、
チレチア・コントロベルサ(Tilletia controversa)、ウスチラゴ・マイディス(U
stilago maydis)等の植物真菌病原体又は上記の種のいずれかの属に入る他の任
意の種のような一倍体真菌病原体に適用することができる。
【００６１】 条件付き発現を達成するための手段は、テトラサイクリンプロモーター系に限
定されず、他の条件付きプロモーターを用いて行うことができる。このような条
件付きプロモーターは、例えば、誘導因子が存在する場合等に、特定の条件下に
おいて、プロモーターからの転写を抑制するリプレッサー、又はプロモーターか
らの転写を増加するトランス活性化因子により制御され得る。例えば、C.アルビ
カンスのCaPCK1プロモーターは、グルコースの存在下では転写されないが、スク
シナートのような他の炭素源上で増殖した細胞中では、高レベルで発現し、従っ
て、GRACE株における改変型対立遺伝子の条件付き発現に適合させることもでき
る。このためには、上記の説明におけるテトラサイクリンプロモーターの代わり
にCaPCK1プロモーターを用いるグルコース含有培地上では、CaHIS1及びCaSAT1の
両方が増殖に必須であることが示される。この場合、CaPCK1プロモーターは、生
物に対してではなく、発現される遺伝子に対して異種性であり、このような異種
プロモーターも本発明に含まれる。テトラサイクリンプロモーターと機能的に置
換することができる代替的なプロモーターは、限定しないが、他の抗生物質に基
づいて制御できるプロモーター系(例えば、プリスチナマイシン誘導プロモータ
ー又はPIP)並びにカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)条件付き制御プロ
モーター(例えば、MET25、MAL2、PHO5、GAL1、GAL10、STE2又はSTE3)を含む。
【００６２】 GRACE法の好適な実施形態において、遺伝子破壊を行うことによりまず、ヘテ
ロ接合体株を構築し、そして薬物標的評価の工程によって、ヘテロ接合体株集団
として分離して集めることができる。このようなC.アルビカンスヘテロ接合体株
集団は、集団内で評価された標的に対するハプロインサフィシエンシーに基づく
薬物スクリーニング法を可能とする。ここで使用する「ハプロインサフィシエン
シー」の語は、所与の遺伝子についてのヘテロ接合体株が、特定の遺伝子産物の
通常の二倍体レベルの約半分発現することにより示される現象を言う。結果とし
て、これらの株は、コードされる遺伝子産物のレベルが低い構築物を提供し、こ
れらは抗真菌化合物のスクリーニングにおいて直接用いることができる。ここで
、そのヘテロ接合性誘導体と比較して、この二倍体の親と異なる感受性が示され
れば、コードされる遺伝子産物に対してその薬物が活性を有することを示す。
【００６３】 本発明のこの実施形態に従った対立遺伝子の改変の順序は決定的ではなく、条
件付き発現をする対立遺伝子をまず構築し、残存する野生型対立遺伝子の破壊を
続いて行うような、異なった順序でこれらの工程を実施することができることは
、当業者には明らかである。しかし、プロモーター置換工程が第一に行われる場
合、遺伝子破壊工程において使用されるものと相同性のある配列を削除するよう
に注意するべきである。
【００６４】 標的遺伝子CaKRE9の改変型対立遺伝子を構築するために使用されるGRACE法の
特定の適用については、第6章で説明する。
【００６５】5.2.3 条件付き発現の他の方法 本発明の他の実施形態においては、条件付き発現は、条件プロモーターを利用
する以外の方法で達成することができる。例えば、条件付き発現はヘテロ接合型
株の野生型対立遺伝子をin vitroで誘導した温度感受性対立遺伝子に置換するこ
とによって達成され得る。その後、その表現型を、発現できない温度(nonpermis
sive temperature)にて分析する。関連する方法では、ユビキチン化シグナルを
残りの野生型対立遺伝子に挿入して活性化条件時での遺伝子産物を不安定化させ
ることを、遺伝子不活性化の結果おこる表現型への影響を確認するために採用す
ることができる。まとめると、これらの実施例は、C.アルビカンス(C. albicans
)遺伝子を破壊し、GRACE法を用いて条件的に制御することが可能な方法を示す。
【００６６】 本発明の他の実施形態においては、切除可能なトランスアクチベーターにより
制御される構成性プロモーターを利用することができる。該プロモーターは標的
遺伝子の上流に配置されて、該プロモーターに固有の基本レベルにまで発現を抑
制する。例えば、真菌細胞において、lexAオペレーター因子を含有する異種プロ
モーターを、lexA DNA結合ドメインおよび何らかの転写アクチベータードメイン
（例えば、GAL4、HAP4、VP16）からなる融合タンパク質と組み合わせて使用して
、標的遺伝子の構成性発現を引き起こすことができる。5-FOAにより仲介される
対抗選択を利用して、融合タンパク質をコードする遺伝子を切除した細胞を選択
することができる。この方法によって、機能し得る転写アクチベーターの不在下
でのlexA異種プロモーターによる発現の基本レベルへの標的遺伝子の抑制に関係
する表現型の確認が可能となる。この手順で生じたGRACE株は、以下の章で詳述
する薬物標的評価に利用できる。この系では、異種プロモーターに関わる低い基
本レベルの発現が重要である。このように、この代替的なシャットオフシステム
を標的評価のためにより有用なものとするためには、プロモーターの発現基本レ
ベルが低いことが好ましい。
【００６７】 あるいは、標的遺伝子の条件付き発現は、DNA結合性の転写アクチベーター領
域を含有するトランスアクチベーターを使用せずに達成することができる。異種
構成性プロモーターを、例えばURA3選択マーカー（標的遺伝子の5’部分と相同
な配列を含有する直接反復配列と隣接する）の下流に含ませるように、カセット
を組み込むことができる。このカセットに標的遺伝子の上流に相同配列をさらに
加えた場合、相同的組換えが容易になり、また、天然プロモーターを、標的遺伝
子の開始コドンまたはオープンリーディングフレームの直ぐ上流にある上記異種
プロモーターカセットで置換することが容易になる。条件付き発現は、異種構成
性プロモーターとURA3マーカーを切除した（即ち、結果として標的遺伝子の発現
に必要な該遺伝子の上流の調節配列を欠く）菌株を、5-FOA含有培地を使用して
選択し、そして、選択した菌株の増殖を同一条件下で増殖させた野生型株と対比
して調査することによって実現される。
【００６８】5.3 必須遺伝子と病原性遺伝子の同定 5.3.1 必須遺伝子 本発明は、GRACE株中の改変された遺伝子が、注目している病原性生物におい
て必須遺伝子であるのか病原性遺伝子であるのかを決定する方法を提供する。あ
る遺伝子がある生物において必須遺伝子であるかどうかを決定するために、該遺
伝子の改変型対立遺伝子を含有するGRACE株を、条件付き発現される遺伝子の改
変型第二対立遺伝子が実質的に低発現されるか発現されない条件下で培養する。
GRACE株の生育性および／または増殖を同じ条件下で培養した野生型株のそれと
比較する。生育性または増殖の喪失または低下は、該遺伝子が病原性真菌の生育
に必須であることを示す。従って、本発明は、二倍体病原性生物における必須遺
伝子を同定するための方法を提供し、該方法は、数多くのGRACE株を、各GRACE株
において改変された遺伝子の第二の対立遺伝子が実質的に低発現されるか発現さ
れない条件下で培養するステップ；該細胞の生育性および／または増殖の指標を
判定するステップ；および、それを野生型細胞の生育性および／または増殖の指
標と比較するステップを含む。第二の対立遺伝子の発現レベルは、未改変の対立
遺伝子の50％より低くてよく、30％より低くてよく、20％より低くてよく、そし
て好ましくは10％よりも低くてよい。使用する異種プロモーターに応じて、発現
のレベルは、例えば抗生物質、金属イオン、特定の化学物質、栄養物質、pH、温
度などにより制御され得る。
【００６９】 本明細書ではカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）を、GRACE法で分
析した例として利用する。
【００７０】 例えば、GRACE法を用いたC. アルビカンスの条件遺伝子発現は、CaKRE1、CaKR
E5、CaKRE6、およびCaKRE9用いて行われている（図3）。CaKRE5、CaKRE6、およ
びCaKRE9は、Uraブラスター法(Ura blaster method)を用いて遺伝子を破壊する
ことにより示されるように、C. アルビカンスにおいて必須である、または条件
付きで必須である（CaKRE9を持たない株はグルコース上では生育できないが、ガ
ラクトース上では生育できる）と予想される。CaKRE1は、Uraブラスター法を用
いて、C. アルビカンスにおいて必須ではない遺伝子であることが実証されてい
る。上記遺伝子に関してヘテロ接合型の株を、CaSAT1破壊用カセットおよびそれ
に続く野生型対立遺伝子の天然プロモーターのテトラサイクリン制御プロモータ
ーへの置換を利用した、PCRに基づく遺伝子破壊法により構築した。これらの株
の各々の旺盛な増殖は、発現が通常はテトラサイクリンの不在下でおこることを
示唆する。テトラサイクリンを増殖培地に添加すると、これらのテトラサイクリ
ンプロモーターにより制御される遺伝子の発現は大幅に減少するか消失する。テ
トラサイクリンの存在下では、上記の３つの必須のC. アルビカンス遺伝子のう
ちの1つをそれぞれ含むGRACE株細胞は増殖が停止する。予想通り、CaKRE1 GRACE
株のみがCaKRE1の発現が抑制されたにもかかわらず旺盛な増殖を示す。
【００７１】 標的評価におけるGRACE法の有用性をさらに調査するために、既知の必須遺伝
子CaTUB1、CaALG7、CaAUR1、およびCaFKS1の発現を制御した4つの更なるGRACE株
の増殖を誘導的条件と抑制的条件とで比較し、予想される必須遺伝子CaSAT2およ
びCaKRE1についても同様にして比較した（図4）。予想通り、CaTUB1、CaALG7、C
aAUR1、およびCaFKS1のGRACE株は、必須ではないCaKRE1 GRACE株と異なり、抑制
的条件下では増殖しなかった。そのうえ、予想通り、CaSAT2 GRACE株は、この遺
伝子がC. アルビカンスにおいて必須であることを示す。CaSAT2遺伝子（C. アル
ビカンスにおいて使用する有力な選択マーカーとして作られたものである）は、
S.セレビシエの遺伝子と相同なC. アルビカンスの遺伝子であるが、大腸菌のSat
1遺伝子とは関係が無い。
【００７２】 導かれた他の破壊データに基づく全ての場合において、このことは、テトラサ
イクリン制御遺伝子がテトラサイクリンの存在下で機能しないレベルにまで抑制
される場合に予想される反応である。さらに、条件付き遺伝子破壊のGRACE法を
、そのS.セレビシエにおける等価物が必須ではないことが知られている２つの更
なるC.アルカビンス遺伝子（CaYPD1、およびCaYNL194c）に適用すると、これら
の株をテトラサイクリンの存在下でインキュベートしたときに増殖の阻害は観察
されなかった。これらの結果は、GRACE株を用いた条件付き遺伝子発現の方法が
遺伝子の必須性の信頼できる指標であることを証明する。
【００７３】 更にまた、C.アルカビンスにおける必須遺伝子の完全なセットを同定する迅速
で正確な手段としての本発明の有用性が、遺伝子破壊と条件付き発現とからなる
GRACEの二段階法を用いる、多くの遺伝子のヌル表現型(null phenotype)の分析
により示された。標的遺伝子を、真菌特異的かつ必須であるとして選択した。そ
のような遺伝子を、下記のスクリーニングアッセイにおいて標的必須遺伝子と称
する。
【００７４】 文献検索により、合計89個の遺伝子についてURAブラスターに基づく遺伝子破
壊実験の報告があることがわかり、そのうち13個は、ホモ接合型欠失株が構築で
きないということに基づいて、必須であると推測された。13個の遺伝子とは、Ca
CCT8 (Rademacherら, Microbiology, UK 144, 2951-2960 (1998)); CaFKS1 (Mio
ら, J. Bacteriol, 179, 4096-105); およびDouglasら, Antimicrob Agents Che
mother 41, 2471-9 (1997)); CaHSP90 (Swobodaら, Infect Immun 63, 4506-14
(1995)); CaKRE6 (Mioら, J. Bacteriol 179, 2363-72 (1997)); CaNMT1 (Weinb
ergら, Mol Microbiol 16, 241-50 (1995)); CaPRS1 (Payneら, J. Med. Vet. M
ycol. 35, 305-12 (1997)); CaPSA1 (Careら, Mol Microbiol 34, 792-798 (199
9)); CaRAD6 (Careら, Mol Microbiol 34, 792-798 (1999)); CaSEC4 (Maoら, J
. Bacteriol 181, 7235-7242 (1999)); CaSEC14 (Monteolivaら, Yeast 12, 109
7-105 (1996)); CaSNF1 (Petterら, Infect Immun. 65, 4909-17 (1997)); CaTO
P2 (Kellerら, Biochem J., 329-39 (1997)); およびCaEFT2 (Mendozaら, Gene
229, 183-1991 (1999))である。C. アルビカンスのこらら13個の必須だと推定さ
れる遺伝子、並びにCaTUB1、CaALG1、およびCaAUR1は、元々はGRACE法により同
定されたものではなかった。しかしながら、これら17個の遺伝子のいずれか1つ
の改変対立遺伝子を含むGRACE株およびそれらの使用は、本発明に包含される。
例えば、図4においてはCaTUB1、CaALG1およびCaAUR1 GRACE株であり、図3におい
てはCaKRE6 GRACE株である。これら17個の遺伝子はいずれも、本発明の方法を比
較するための対照としてもよく、または、本発明の必須遺伝子の収集における必
須性についての陽性対照としてもよい。これら17個の遺伝子のうちのいずれかに
対応するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本発明の薬物探索法において薬物
標的として使用してもよく、または、個別にまたは小集団で、本発明のキットも
しくは核酸マイクロアレーにおいて対照として含まれていてもよい。
【００７５】 従来の方法を使用するのと対照的に、GRACE法の応用によって既に、全C.アル
ビカンス研究共同体の全ての努力によりこれまでに決定されたよりも、非常に多
くのC.アルビカンスの必須遺伝子を同定している。本明細書とともに示すデータ
は、本発明の方法に固有の迅速さを確立し、そしてそれゆえに、GRACE法をC.ア
ルビカンスゲノムの全遺伝子の調査に適用範囲を拡張することの実現可能性、こ
の二倍体真菌病原体の必須遺伝子の完全なセットの同定、および他の種へのその
応用を確立する。
【００７６】 GRACE株における改変型遺伝子の必須性を評価するには別の方法が利用可能で
ある。本発明によれば、GRACE株における改変された遺伝子対立遺伝子の発現の
抑制は、トランスアクチベータータンパク質をコードする遺伝子の相同的組換え
を介した切除により実現し得る。好ましい実施形態では、標的遺伝子の条件付き
発現がテトラサイクリン制御プロモーターを用いて達成される場合、（非抑制的
条件下での）構成性発現は、トランスアクチベーター遺伝子（TetR-GAL4AD）の
相同的組換えを介した切除により抑制され得る。この方法では、絶対的に達成で
きる抑制レベルは、トランスアクチベータータンパク質のテトラサイクリンによ
る不活性化により生じる抑制レベルとは独立に生じる。トランスアクチベーター
遺伝子の切除は、GRACE株の構築に用いる選択マーカーおよび組み込み手法に基
づいて可能になる。TetR-GAL4ADトランスアクチベーター遺伝子を含有するCaURA
3-標識プラスミドをCaLEU2遺伝子座に安定して組み込むことにより、当該組み込
まれたプラスミドに隣接するCaLEU2のタンデム複製(tandem duplication)がおこ
る。後に、5-FOA含有培地上で対抗選択を行って、CaURA3-標識トランスアクチベ
ーター遺伝子の切除を選択することができ、そして、この代替的な抑制手法が標
的遺伝子が必須であることを証明するどうかを直接に試験することができる。
【００７７】 5-FOAを含有する培地上で必須であるとされたが、テトラサイクリン添加培地
上で増殖の減失が何ら検出できない遺伝子の3つの例は、遺伝子CaYCL052c、CaYN
L194cおよびCaYJR046cである。おそらくは、このことは、標的遺伝子が、トラン
スアクチベーター遺伝子を完全に除去した条件下では、テトラサイクリンの添加
により遺伝子産物が不完全に不活性化された条件下よりもさらに低い発現の基本
レベルを示すことに拠るものであろう。かくして、GRACE法は、所定の遺伝子が
宿主株の生育に必須であるかどうかを決定するための２つの独立した方法を提供
する。
【００７８】5.3.2 毒性／病原性遺伝子 本発明はまた、毒性／病原性遺伝子を同定するために二倍体病原性生物のGRAC
E株を用いる方法を提供する。病原性生物の必須遺伝子を明らかにするのに加え
て、GRACE法は、該病原性生物により引き起こされる疾患の治療に有用な薬物の
スクリーニングに関わっている可能性のある他の遺伝子および遺伝子産物の同定
を可能にする。従って、病原体の必須でない遺伝子および遺伝子産物であって、
それにもかかわらず病気の発生過程において不可欠な役割を示す遺伝子および遺
伝子産物は、予防薬の開発のための潜在的な薬物標的として役立つことがあり、
かつ、既存の殺傷性の(cidal)治療法と組み合わせて治療計画を改良するために
使用することもできる。毒性および／または病原性に関わる遺伝子およびそれら
の産物は、潜在的な薬物標的のもう一つの重要なクラスとなりうる。そのうえ、
毒性および／または病原性に関わる遺伝子のうちのいくつかは、種特異的である
ことがあり、そして、病原体の特定の株に特有のことがある。C. アルビカンス
配列決定計画により同定された遺伝子のうちの約6〜7％がS. セレビシエには存
在しないと推定されている。このことは、病原性または毒性の過程に関与する可
能性のある、420個ものカンジダ・アルビカンス特異的遺伝子を表している。こ
の遺伝子のセットのかかる大規模な機能評価は、本発明のGRACE法を用いた場合
にのみ実現できる。
【００７９】 必須遺伝子は好ましい標的を提供するものの、同定された必須ではないC.アル
ビカンス特異的遺伝子にも価値はあるであろう。病原性の発生における必須では
ないC.アルビカンス特異的遺伝子の潜在的な役割を、毒性アッセイ（例えば、口
腔上皮細胞吸着アッセイおよびマクロファージアッセイ）ならびにマウスまたは
他の動物モデルを用いた種々のC.アルビカンス感染研究（例えば、経口、経膣、
全身性）により、評価しそして序列をつけてもよい。必須遺伝子について先に記
載したのと同様にして、GRACE株集団を含む必須でない遺伝子が病原性に必要で
あるかどうかを細胞アッセイまたはマウスモデル系で実証することは、同様に実
現可能性がある。従って、テトラサイクリン（または他の遺伝子不活性化手段）
による遺伝子不活性化の条件下でマウスに真菌感染を引き起こすことができない
GRACE株は、遺伝子のGRACE毒性／病原性サブセットを明確にする。病原性遺伝子
の明確にされたサブセット、例えば、病原性発生の特定の段階（例えば、吸着ま
たは侵入）に必要な遺伝子を、株のうちでGRACE病原性サブセットを、対応する
過程を測定するin vitroアッセイに適用することによって、決定することができ
る。例えば、GRACE病原性株を、口腔吸着アッセイまたはマクロファージアッセ
イで各遺伝子の条件付き発現により調査すると、吸着または細胞侵入のそれぞれ
に必要な病原性の要因が同定される。そのうえ、部分的に不活性化されただけで
毒性または増殖速度の実質的な低下を示す必須遺伝子は、最低限の阻害性を示す
特異性の高い化合物でさえそれに対して治療上の価値を示す「多因性」薬物標的
を示す。
【００８０】 従って、ある遺伝子がある宿主中で病原性生物の毒性／病原性に寄与している
のかどうかを判定するために、該遺伝子の改変された対立遺伝子を含む該病原菌
のGRACE株を、条件付き発現下にある該遺伝子の第二の改変された対立遺伝子が
実質的に低発現されるか発現されない条件下で、宿主細胞または宿主動物に感染
させる。宿主細胞および／または宿主動物を適切な期間該GRACE株と接触させた
後、該細胞および／または動物の状況を、同じ条件下において野生型株で感染さ
せた細胞および／または動物と比較する。感染細胞の形態、生理機能、および／
または生化学の種々の側面は当該技術分野で公知の方法で測定できる。動物モデ
ルを用いた場合、疾患の進行、症状の重篤度、および／または宿主の生存を測定
できる。GRACE株が示す毒性または病原性の喪失または減少はいずれも、該株に
おいて改変された遺伝子が、ウイルスの毒性および／または病原性に寄与してい
ることまたは重要であることを示している。かかる遺伝子を、下記のスクリーニ
ングアッセイにおいて標的毒性遺伝子と呼ぶ。
【００８１】 本発明の他の実施形態においては、GRACE法は、病原性の発生に必須であるこ
とが知られている遺伝的経路の同定および説明のために利用できる。例えば、S.
セレビシエにおける広範な研究は、細胞吸着、シグナル伝達、細胞骨格集合 (cy
toskeletal assembly)を含む、酵母と菌糸形態との間の二形態転換において機能
する多数の過程を明らかにしている。C.アルビカンス、A.フムガツス(A. fumiga
tus)、およびC.ネオホルマンス(C. neoformans)などの病原性真菌において、機
能的に相同な細胞経路に関与するオルソロガスな遺伝子の欠失は、明確に、付随
する毒性の喪失を示す。従って、C.アルビカンスおよび他の病原性真菌に見られ
るオルソロガス遺伝子のGRACE株を利用すると、それを不活性化すると菌糸の発
達と病原性を低減させることになる、潜在的な抗真菌薬物の標的遺伝子を迅速に
評価できる。
【００８２】５．３．３．薬物標的をコードする遺伝子の評価 標的遺伝子の評価とは、遺伝子産物が、その遺伝子産物の機能もしくは構造の
モジュレーターを見つけるためのスクリーニング法またはアッセイで使用するの
に適していると同定されるプロセスを指す。しかし、薬物スクリーニングの標的
として遺伝子産物を評価するために使用される基準は、防御しようとする宿主、
ならびに探索される化合物が持つ所望の作用様式によって異なり得る。
【００８３】 本発明の１つの態様において、必須遺伝子の改変型対立遺伝子対のみを有する
と同定および分類されたGRACE株のセットを薬物スクリーニングで直接使用する
ことができる。
【００８４】 他の態様において必須遺伝子の最初のセットは、例えばヌクレオチド配列比較
を用いてさらに特徴付けられ、菌類に対して特異的なこれらの遺伝子のみを含む
必須遺伝子のサブセット、つまり病原体の宿主（例えばヒト等）において相同体
（homolog）を持たない必須遺伝子産物をコードする遺伝子のサブセットを同定
する。ヒトの真菌病原体におけるこのような遺伝子のサブセットのモジュレータ
（および好ましくはインヒビター）は、ヒトを治療するために用いられる場合に
毒性の副作用を持つ可能性がずっと低いと思われる。
【００８５】 同様に、より大きな必須遺伝子セットの他のサブセットは、獣医学的用途で使
用することができると期待される化合物のを検出するために、１以上の宿主（例
えば哺乳動物）種において相同配列を持たない改変型対立遺伝子対を担持するGR
ACE株のみを含むものと定義することができる。さらに、他の相同性基準を用い
て、農芸に関する病原体に対して活性である抗菌化合物であって防御しようとす
る作物において相同体を持たない標的を阻害する化合物の検出に使用されるであ
ろうGRACE株のサブセットを同定することができるであろう。
【００８６】 現在のC.アルビカンス遺伝子破壊法は、ホモ接合性ヌル突然変異体の作製に失
敗したことから、非必須遺伝子を同定し、また他の遺伝子が必須であるという推
測を可能とする。薬物標的のヌル表現型は、この標的に作用する「完璧な」薬物
の絶対的な効力を予測する。例えば、特定の薬物標的についての殺傷性（細胞死
）vs静的（阻害的成長）の最終的なヌル表現型の差異等である。URAブラスター
法を用いてホモ接合性CaERG11欠失株を構築するのに失敗したので、CaERG11（フ
ルコナゾールの薬物標的）の遺伝子破壊は重要であると考えられる。しかし、そ
のヌル表現型が殺傷性であるか静的であるかの直接的評価は、病原体中で行うこ
とができず、またフルコナゾールの発見後に初めて、薬物およびおそらく薬物標
的の両方が殺傷性ではなく静的であると生化学的に決定することが可能となった
。フルコナゾールは市場で成功を収めているが、その静真菌的な作用様式は、そ
の主な限界（すなわち長期にわたる治療の後の薬物耐性）に貢献している。した
がって、初めて、本発明により提供される病原体の中で評価された薬物標的につ
いて殺傷性ヌル表現型を同定および評価する能力は、今や、静真菌的な作用様式
を特に示す抗真菌薬を同定するための直接的手法を可能とする。
【００８７】 必須遺伝子を含む単一のGRACE株またはGRACE株の所望の集団を用いて、１以上
の標的遺伝子を殺傷性もしくは静的ヌル表現型のいずれかを示すものとして直接
評価することができる。これは、液体培養中での様々な時間の間に第２対立遺伝
子を条件付き発現させるための抑制条件下でまずGRACE株をインキュベートし、
そして、抑制を和らげる増殖条件に所定数の細胞を接種した後に生細胞のパーセ
ンテージを測定することによって、決定される。非抑制条件に戻した後に残る生
細胞のパーセンテージは、殺傷性（低生存率）または静的（高生存率）表現型の
いずれかを反映する。あるいは、メチレンブルーやヨードプロピジウムなどの生
体染料（vital dye）を用いて、抑制条件vs誘導条件下で特定の株についての細
胞の生存率（％）を定量しうる。公知の殺菌性薬物標的としては、GRACE株集団
に含まれるもの（例えばCaAUR1）があり、この標準的な殺菌性薬物標的と該薬物
標的セットを含む新規標的との直接比較を行うことができる。このように、標的
セットの各メンバーをすぐにランク付けし、業界標準の殺傷性薬物標的に対して
優先順位を付け、適当な薬物標的および最も迅速に作用する殺傷性化合物を同定
するためのスクリーニングアッセイを選択する。
【００８８】 ５．４．必須遺伝子および毒性遺伝子 ５．４．１．標的をコードする核酸、ベクターおよび宿主細胞 本発明の方法を実施することにより、生物のゲノム中の実質的に全ての遺伝子
の必須性および毒性への貢献度を決定することができる。本発明の方法によって
過去に明らかにされた二倍体病原性生物（カンジダ・アルビカンス等）の必須遺
伝子および毒性遺伝子の同定により、本発明者らはこれらの機能を研究しおよび
薬物標的としてのこれらの有用性を評価することができるようになった。個々の
必須遺伝子または毒性遺伝子の遺伝子産物の構造および機能についての情報によ
って、その病原性生物の中でのその発現もしくは機能を阻害する化合物を見つけ
るための試薬およびアッセイを設計することができる。従って、本発明は、ある
遺伝子またはその産物がその病原性生物の成長、生存もしくは増殖にとって必須
であるか否か、あるいはある遺伝子またはその産物が宿主に対するその生物の毒
性または病原性に貢献することについての情報を提供する。この情報に基づいて
、本発明はさらに、様々な実施形態において、ある病原性生物に対抗して作用す
る薬物を発見するために、該病原性生物の毒性または病原性に必要なおよび/ま
たは貢献する遺伝子のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の新規な使
用を提供する。さらに、本発明は特に、非病原性酵母（例えばサッカロミセス・
セレビシエ等）におけるこれらの必須遺伝子のオルソログ（ortholog）を同定す
るための上記情報の使用、および薬物スクリーニング法におけるこれらのオルソ
ログの使用を提供する。S.セレビシエにおけるこれらの必須遺伝子のオルソログ
のヌクレオチド配列は公知であるが、これらのS.セレビシエ遺伝子が病原性真菌
に対する薬物を発見するのに有用であることは認識されていなかった。
【００８９】 本明細書中で用いられる「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子または生物学的に活性
なリボ核酸（RNA）を指す。この用語はさらに、上流、下流および/またはイント
ロンのヌクレオチド配列を含む核酸分子も含み得る。「オープンリーディングフ
レーム（ORF）」という用語は、停止コドンを含まないアミノ酸をコードする一
連のヌクレオチド・トリプレットを意味し、このトリプレット配列は、特定の生
物に適したコドン用法の情報を用いてタンパク質に変換されることができる。
【００９０】 本明細書中で使用される「標的遺伝子」という用語は、本発明で（特に薬物ス
クリーニングで）有用な必須遺伝子または毒性遺伝子のいずれかを指す。「標的
必須遺伝子」および「標的毒性遺伝子」という用語は、遺伝子の２つのグループ
を別々に指すのに適している場合に用いられる。しかし、幾つかの遺伝子は毒性
に貢献し、且つ生物の生存に必須であることが考えられる。本発明の標的遺伝子
は、従来公知の方法および/または以下に教示する方法によって、薬物標的とし
て、一部特徴付ける、完全に特徴付ける、または評価することができる。本明細
書中で使用される「標的生物」という用語は、病原性生物を指し、その必須遺伝
子および/または毒性遺伝子は本発明において有用である。
【００９１】 「ヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチドのヘテロポリマー（リボヌ
クレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）、
またはこれらのヌクレオチドの配列を指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド
」という用語もまた、本明細書において、ヌクレオチドのヘテロポリマー（未改
変のもしくは改変されたDNAまたはRNAであってもよい）を指すのに交換可能に使
用される。例えば、ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖DNA、一本鎖領域お
よび二本鎖領域からなる混合物であるDNA、および一本鎖領域および二本鎖領域
からなる混合物を有するDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子あってもよい。さ
らに、ポリヌクレオチドは、DNAもしくはRNAまたはこれら両方を含む三本鎖領域
から構成されるものであってもよい。またポリヌクレオチドは、１以上の修飾塩
基、あるいはヌクレアーゼ耐性もしくは他の理由のために改変されたDNAまたはR
NA主鎖も含み得る。一般に、本発明によって提供される核酸セグメントは、ゲノ
ムの断片または短いオリゴヌクレオチドから、一連のオリゴヌクレオチドから、
または個々のヌクレオチドから組み立てて、合成核酸を提供することができる。
【００９２】 ポリペプチドまたはタンパク質を指すために本明細書中で使用される「組換え
体」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質が組換え（例えば微生物また
は哺乳動物の）発現系に由来することを意味する。「微生物（の）」とは、微生
物または真菌（例えば酵母等）発現系において作製される組換えポリペプチドま
たはタンパク質を指す。産物として、「組換え微生物の」とは、関連する天然グ
リコシル化を本質的に伴わないポリペプチドまたはタンパク質を定義する。多く
の細菌培養（例えば大腸菌）において発現されるポリペプチドまたはタンパク質
は、グリコシル化修飾を含まない。酵母で発現されるポリペプチドまたはタンパ
ク質はグリコシル化される。
【００９３】 「発現ビヒクルまたはベクター」という用語は、ヌクレオチド配列からポリペ
プチドを発現するためのプラスミド、ファージまたはウイルスを指す。発現ビヒ
クルは、（１）遺伝子発現において調節的役割を果たす１以上の遺伝子エレメン
ト、例えばプロモーターやエンハンサー等、（２）mRNAに転写されタンパク質に
翻訳される構造配列またはコード配列であって（１）のエレメントに機能的に連
結されている配列、および（３）適当な転写開始および終結配列、からなるアセ
ンブリを含む転写ユニット（発現構築物とも呼ばれる）を含み得る。「機能的に
連結されている」とは、調節領域および発現対象のDNA配列が、転写および最終
的には翻訳を可能とするような形で連結および配置されている連結を指す。C. a
lbicansの場合、その珍しいコドン用法のために、期待されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドがこの生物において産生されるようにするためには、他の生物
に由来するコード配列を改変する必要がある場合がある。酵母もしくは真核生物
発現系において使用するための構造ユニットとしては、好ましくは、宿主細胞に
より翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能とするリーダー配列が挙げられる
。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列（transport sequ
ence）無しで発現される場合、これはN末端メチオニン残基を含み得る。この残
基は、その後発現された組換えタンパク質から切断されるまたは切断されずに、
最終的な産物を提供する。
【００９４】 「組換え宿主細胞」という用語は、染色体DNA中に安定に組み込まれた組換え
転写ユニットを有する、または染色体外に組換え転写ユニットを安定に保有する
培養細胞を意味する。本明細書中で定義される組換え宿主細胞は、異種ポリペプ
チドもしくはタンパク質、および組換え転写ユニット中のDNAセグメントまたは
合成遺伝子によりコードされるRNAを発現する。またこの用語は、遺伝子発現に
おいて調節的役割を果たす１以上の安定に組み込まれた組換え遺伝子エレメント
（例えばプロモーターやエンハンサー等）を有する宿主細胞も意味する。本明細
書中で定義される組換え発現系は、発現させようとする内因性DNAセグメントま
たは遺伝子に連結された調節エレメントを誘導すると、その細胞の内因性RNA、
ポリペプチド、またはタンパク質を発現する。この細胞は原核細胞であっても真
核細胞であってもよい。
【００９５】 「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によりアミノ酸を互いに結合さ
せることにより形成される分子を指し、また遺伝子によりコードされる20種の通
常使用されるアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「活性ポリペプチド」という
用語は、任意の天然ポリペプチドの生物学的および/または免疫学的活性を保持
する形態のポリペプチドを指す。「天然ポリペプチド」という用語は、遺伝子操
作されていない細胞によって産生されるポリペプチドであって、特にそのポリペ
プチドの翻訳後修飾（例えばタンパク質分解プロセシング、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化（lipidation）およびアシル化な
どを含むがこれらに限定されない）により生じる様々なポリペプチドが予期され
る。
【００９６】 本明細書中で使用される「単離された」という用語は、天然源においてその核
酸またはポリペプチドと一緒に存在する少なくとも１つの高分子成分（例えば核
酸やポリペプチド等）から分離された該核酸またはポリペプチドを指す。１つの
実施形態において、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する所定の
生物学的高分子群の少なくとも95重量％、より好ましくは少なくとも99.8重量％
を構成するように精製される（ただし、水、緩衝液、および他の小分子、特に分
子量1000ダルトン未満の分子が存在し得る）。
【００９７】 表IIは、それぞれのGRACE株においてテトラサイクリン抑制系の下で条件付き
で発現させたとき、またはトランスアクチベータータンパク質をコードする遺伝
子を5-FOAアッセイにおいてそれぞれのGRACE株において切り出したときの、C.ア
ルビカンスにおいて重要であることが示された真菌特異的遺伝子からなるセット
をリストアップしている。
【００９８】
【表２】 １つの実施形態において、本発明は、61個の必須遺伝子の同定を提供する。多
くのこれらの遺伝子のヌクレオチド配列およびリーディングフレームは公知であ
るが、これらの遺伝子がカンジダ・アルビカンスの成長および/または生存に必
須であるという事実は、本発明者等が発見するまで知られていなかった。したが
って、これらの遺伝子およびこれらの遺伝子産物の使用は、本発明により包含さ
れる。また、表IIには、本明細書中において同定された各必須遺伝子のオープン
リーディングフレーム、推定アミノ酸配列、および関連オリゴヌクレオチド配列
を同定するために使用される配列番号も記載されている。
【００９９】 従って、配列番号１〜配列番号62はそれぞれ同定された必須遺伝子のオープン
リーディングフレーム（ORF）のヌクレオチド配列を同定する。配列番号１〜62
として示されるヌクレオチド配列は、カンジダ・アルビカンス配列決定プロジェ
クトによってアセンブルされたカンジダ・アルビカンスゲノム配列データベース
のバージョン６から得た（インターネットでスタンフォード大学およびミネソタ
大学のウェブサイトにアクセス可能である；http:// www-sequence.stanford.ed
u:8080およびhttp:// alces.med.umn.edu/Candida.htmlを参照）。
【０１００】 同定された必須遺伝子の推定アミノ酸配列が配列番号63〜123に記載されてお
り、これらは、リーディングフレームを決定した配列番号1〜61のヌクレオチド
配列の概念的翻訳によって得られる。当分野において周知であるように、コドン
CTGは、他の生物においては通常ロイシンに翻訳されるが、C.アルビカンスでは
セリン残基に翻訳される。したがってORFの概念的翻訳は、C.アルビカンスのコ
ドン用法を用いて行われる。
【０１０１】 DNA配列は、配列決定反応によって作製されたものであり、誤って同定された
ヌクレオチド、挿入および/または欠失として存在し得るマイナーエラーを含み
得る。しかし、このようなマイナーエラーが仮に配列データベース中に存在した
としても、本発明の必須遺伝子としてのORFの同定を妨害するものではない。ORF
を含むクローンが利用可能であるため、配列決定を繰返してこのマイナーエラー
を修正することが簡単にできる。さらに、本発明の方法は染色体DNA配列とプラ
イマーまたは組換えDNA中の遺伝子の配列との間の完全な配列同一性を必要とし
ないので、マイナー配列エラーはGRACE株の構築およびGRACE株の使用に影響を及
ぼさない。ある場合には、C.アルビカンス遺伝子の正確なリーディングフレーム
は、そのアミノ酸配列全体を既知のS.セレビシエ配列と比較することにより同定
することができる。
【０１０２】 このように、本発明の１つの実施形態において、配列番号62のヌクレオチド配
列の概念的翻訳は、S.セレビシエにおけるそのオルソログに比べてオープンリー
ディングフレームの明らかな成熟前停止をもたらす。このリーディングフレーム
を維持するために、４つのヌクレオチドを加えて配列番号58（これは配列番号12
0のアミノ酸配列になる）を作製した。他の実施形態において、本発明は、同定
された必須遺伝子のゲノム配列であって、配列番号490に記載されたゲノム配列
がイントロンを含むものを提供する。イントロン配列を含まずタンパク質をコー
ドする未公表のヌクレオチド配列が配列番号39に記載されている。
【０１０３】 配列番号124〜486は、対応する同定必須遺伝子のためのGRACE株を構築するた
めに設計および使用されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを指す
。すなわち、配列番号124〜184は、ノックアウト上流プライマー（KO-UP）；配
列番号185〜245はノックアウト下流プライマー（KO-Down）；配列番号246〜306
はテトラサイクリンプロモーター上流プライマー（Tet-Up）；配列番号307〜367
はテトラサイクリンプロモーター下流プライマー（Tet-Down）；および配列番号
368〜489は、それぞれのGRACE株を同定するためのプライマー（プライマーAおよ
びプライマーB）である。したがって、オリゴヌクレオチドの各セットを用いて
、ユニークな必須遺伝子およびユニークなGRACE株を、例えばハイブリダイゼー
ションやPCRによって同定することができる。
【０１０４】 表IIに記載された必須遺伝子は、当業者に周知のクローニング法を用いて得る
ことができ、そのような手法としては適当なcDNAまたはgDNA（ゲノムDNA）ライ
ブラリーの中の遺伝子を検出するための適当なプローブの使用があるがこれに限
定されない。例えばSambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Laboratories（本明細書中に参照として全て組み込ま
れる）を参照されたい。本明細書中で同定された配列のためのプローブは、本明
細書中に配列番号1〜62として開示されたDNA配列に基づいて合成することができ
る。
【０１０５】 本明細書中で使用される「標的遺伝子」（すなわち必須および/または毒性遺
伝子とは、（ａ）配列番号1〜配列番号62に記載されたDNA配列および/またはそ
の断片の少なくとも１つを含む遺伝子、（ｂ）ユニバーサルな遺伝コードまたは
C.アルビカンスのコドン用法を用いて配列番号63〜配列番号123に記載されたア
ミノ酸配列をコードする任意のDNA配列またはその断片、（ｃ）ストリンジェン
トな条件下、高ストリンジェント条件下、または当業者に自明な他のハイブリダ
イゼーション条件（例えばAusubel, F.M.ら編, 1989, Current Protocols in Mo
lecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wil
ey & Sons, Inc., New York, pp.6.3.1-6.3.6および2.10.3を参照されたい）下
において、配列番号1〜配列番号62に記載されたヌクレオチド配列の相補配列に
ハイブリダイズする任意のDNA配列。ここで該ストリンジェントな条件とは、例
えばフィルタに結合させたDNAに6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）
中で約45℃にてハイブリダイズさせた後、約50〜65℃で0.2×SSC/0.1％ SDS中で
１回以上洗浄する条件であり、また該高ストリンジェント条件とは、例えばフィ
ルタに結合させた核酸に6×SSC中で約45℃にてハイブリダイズさせた後、約68℃
で0.1×SSC/0.2％ SDS中で１回以上洗浄する条件である。好ましくは、本明細書
中に開示されるDNA配列の相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、
遺伝子産物（例えば標的遺伝子によりコードされる遺伝子産物と機能的に同等な
遺伝子産物など）をコードする。先に記載したように、標的遺伝子配列は、C.ア
ルビカンスにおいて配列番号63〜123のアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオ
チド配列だけでなく、C.アルビカンス以外の生物において翻訳されたときに配列
番号63〜123のアミノ酸配列のうちの１つを含むアミノ酸またはその断片を生成
するであろう縮重ヌクレオチド配列も含む。当業者であれば、適当なコドンをど
のように選択すべきか、またはC.アルビカンスまたは他の生物において標的遺伝
子配列を用いたときに配列番号１〜62のヌクレオチド配列をどのように改変すべ
きかが分かるであろう。さらに、「標的遺伝子」という用語は、サッカロミセス
・セレビシエまたはその変異体において天然に生じる遺伝子であって、配列番号
１〜配列番号62に記載されたDNA配列のうちの１つを有するC.アルビカンス遺伝
子と非常に高いヌクレオチド配列相同性を有する遺伝子、すなわちS.セレビシエ
におけるオルソログを包含する。C.アルビカンス遺伝子に適用することができる
薬物スクリーニング法は、非病原性S.セレビシエにおいて同じ遺伝子のオルソロ
グにも適用することができると考えられる。
【０１０６】 他の実施形態において、本発明は、以下のポリヌクレオチド、このようなポリ
ヌクレオチドを発現する宿主細胞、およびこのようなヌクレオチドの発現産物も
包含する：（ａ）その機能的ドメインに対応する標的遺伝子産物の一部をコード
するポリヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチド配列によってコードされ
るポリペプチド産物であって、受容体型遺伝子産物の場合は、このようなドメイ
ンはシグナル配列、細胞外ドメイン（ECD）、膜貫通ドメイン（TM）および細胞
質ドメイン（CD）を含むがこれらに限定されない；（ｂ）標的遺伝子産物の突然
変異体をコードするポリヌクレオチドであって、そのドメインのうちの１つの全
体または一部が欠失もしくは変更され、また受容体型遺伝子産物の場合は、この
ような突然変異体は、シグナル配列が切断された成熟タンパク質、TMの全てまた
は一部が欠失した可溶性受容体、およびCDの全てまたは一部が欠失した非機能的
受容体を含むがこれらに限定されない；ならびに（ｄ）他のポリペプチドに融合
されたそのドメインのうちの１つまたは標的遺伝子産物を含む融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチド。
【０１０７】 また本発明は、標的遺伝子配列のDNA配列にハイブリダイズし、したがって該D
NA配列の相補配列である、ポリヌクレオチド（好ましくはDNA分子）も含む。こ
のようなハイブリダイゼーション条件は、上記に記載しまた当分野で公知である
ように、高いストリンジェント条件であっても、またやや高いストリンジェント
条件であってもよい。上記記載のDNA配列にハイブリダイズする本発明の核酸分
子は、ストリンジェントもしくは高ストリンジェント条件下で標的遺伝子にハイ
ブリダイズするオリゴデオキシヌクレオチド（「オリゴ」）を含む。一般に、14
〜70ヌクレオチド長のオリゴの場合、融解温度（Tm）は以下の式を用いて算出さ
れる： Tm(℃)＝81.5+16.6（log[一価カチオン（モル）]+0.41（％G+C）-（500/N） 式中、Nはプローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを
含む溶液中で行われる場合、融解温度は以下の等式を用いて算出される： Tm(℃)＝81.5+16.6（log[一価カチオン（モル）]）+0.41（％G+C）-（0.61）
（％ホルムアミド）+（500/N） 式中Nはプローブの長さである。一般にハイブリダイゼーションは、（DNA-DNA
ハイブリッドでは）Tmより約20〜25℃低い温度、または（RNA-DNAハイブリッド
では）Tmより約10〜15℃低い温度で行われる。他の例示的な高ストリンジェント
条件とは、例えば（14塩基オリゴでは）37℃、（17塩基オリゴでは）48℃、（20
塩基オリゴでは）55℃、および（23塩基オリゴでは）60℃での6×SSC/0.05％ピ
ロリン酸ナトリウムでの洗浄を指す。このようなオリゴの例は、配列番号124〜4
89に記載されている。
【０１０８】 これらの核酸分子は、例えば標的遺伝子の調節において有用な標的遺伝子アン
チセンス分子として、および/または標的遺伝子ヌクレオチド配列の増幅反応に
おけるアンチセンスプライマーとして機能するまたはこれらをコードすることが
できる。さらに、このような配列は、リボザイムおよび/または３重らせん配列
の一部として使用することができ、また、標的遺伝子調節にも有用である。また
さらに、このような分子は、病原体の存在を検出することができる診断方法の成
分として使用することができる。これらの核酸分子の使用について以下に詳細に
記載する。
【０１０９】 本発明の標的遺伝子の断片は少なくとも10ヌクレオチド長であってもよい。他
の実施形態において、該断片は、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200
、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000ま
たはそれ以上の連続するヌクレオチド長であってもよい。あるいは、該断片は、
標的遺伝子産物の少なくとも10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、3
50、400、450またはこれ以上の連続するアミノ酸残基をコードするヌクレオチド
配列を含むものであってもよい。また本発明の標的遺伝子の断片は、上記核酸分
子のエキソンまたはイントロン、ならびにシグナル配列、細胞外ドメイン（ECD
）、膜貫通ドメイン（TM）および細胞質ドメイン（CD）等の機能的ドメインをコ
ードする核酸分子のようなコード領域の一部も指す。
【０１１０】5.4.2 相同標的遺伝子 上記のCandida albicansのヌクレオチド配列に加え、他の種に存在し得るこれ
らの標的遺伝子配列の相同体またはオーソログを当技術分野で周知の分子生物学
的技術により同定し単離し、さらに過度の実験を行うことなく本発明の方法に使
用することができる。例えば、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumi
gatus）、黄色コウジ菌（Aspergillus flavus）、黒色コウジ菌（Aspergillus n
iger）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッ
カス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプ
スラーツム（Histoplasma capsulatum）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ph
ytophthora infestans）、プッチニア・セコンジリ（Puccinia secondilii）、
ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、または上記種のいずれか
の属に含まれるいずれかの種の相同標的遺伝子がある。カンジダ属(Candida)、
サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyce
s)、スポロボロミセス属(Sporobolomyces)、トルロプシス属(Torulopsis)、トリ
コスポロン属(Trichosporon)、白癬菌属(Tricophyton)、皮膚糸状菌属(Dermatop
hytes)、小胞子菌属(Microsproum)、ウィッカーハミア属(Wickerhamia)、アシュ
ビア属(Ashbya)、ブラストミセス属(Blastomyces)、カンジダ属(Candida)、シテ
ロミセス属(Citeromyces)、クレブロセキウム属(Crebrothecium)、クリプトコッ
クス属(Cryptococcus)、デバリオミセス属(Debaryomyces)、エンドミコプシス属
(Endomycopsis)、ゲオトリクム属(Geotrichum)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ク
ラエケラ属(Klaeckera)、クリュイベロミセス属(Kluyveromyces)、リポミセス属
(Lipomyces)、ピキア属(Pichia)、ロドスポリジウム属(Rhodosporidium)、ロド
トルラ属(Rhodotorula)およびヤロビア属(Yarrowia)その他の酵母も含まれる。
また、これらの標的遺伝子配列の相同体としては、アスペルギルス・フミガツス
（Aspergillus fumigatus）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、黄色アスペ
ルギルス(Aspergillus flavus)、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis
）カンジダ・パラプシロプシス（Candida parapsilopsis）、カンジダ・クルセ
イ（Candida krusei）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus n
eoformans）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、エクソ
ファリア・ダーマチジス（Exophalia dermatiditis）、フサリウム・オキシスポ
ルム（Fusarium oxysporum）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma
capsulatum）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、トリコス
ポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、リゾパス・アルヒズムス（Rhizo
pus arrhizums）、ムカー・ロウキシ（Mucor rouxii）、リゾムカー・プシラス
（Rhizomucor pusillus）、もしくはアブシディア・コリムビゲラ(Absidia cory
mbigera)などの動物病原菌、またはアルテナリア・ソラニ（Alternaria solani
）、灰色かび病菌(Botrytis cinerea)、うどんこ病菌(Erysiphe graminis)、イ
ネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、コムギ赤さび病(Puccinia recondita)、菌
核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、コムギ葉枯病菌(Septoria tritici)、オオ
ムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia controversa)、黒穂病菌(Ustilago maydis)、
黒星病菌(Venturia inaequalis)、半身萎凋病菌(Verticillium dahliae)、もし
くは上記種のいずれかの属に含まれるいずれかの種などの植物病原菌から同定、
単離されたものも挙げることができる。
【０１１１】 よって、本発明は標的遺伝子のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であり
、かつSaccharomyces cerevisiaeおよびCandida albicans以外の種のものである
ヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態では、本発明は配列番号1〜62から
なる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも50%の同一性があるヌクレ
オチド配列を含んでなる単離された核酸を包含する。別の実施形態では、本発明
は配列番号1〜62からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第２の核酸
と中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を
含む単離された核酸を包含する。
【０１１２】 さらに別の実施形態では、本発明はそのアミノ酸配列が配列番号63〜123から
なる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有するポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸(ここで、ポリペプチ
ドはSaccharomyces cerevisiaeおよびCandida albicans以外の種のものである)
を包含する。
【０１１３】 S. cerevisiaeのかかる遺伝子の相同体またはオーソログのヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列についてはほとんど知られているが、S. cerevisiaeのかか
る相同体またはオーソログの薬物スクリーニングにおける使用については知られ
ていないため、本発明で特に提供する。S. cerevisiaeのかかるヌクレオチドお
よび/またはアミノ酸配列を使用するために、Stanford Genomic Resources(www-
genome.stanford.edu)、Munich Information Centre for Protein Sequences(ww w.mips.biochem.mpg.de )またはProteome(www.proteome.com)のような公開データ
ベースを利用して配列を同定、検索してもよい。S. cerevisiaeにおいてC. albi
cans遺伝子のオーソログまたは相同体が分かっている場合には、表Iの1列目括弧
内にS. cerevisiaeの遺伝子名を記載している。S. cerevisiaeのオーソログもま
た、配列番号1〜61および490のヌクレオチド配列のいずれか1つからなる核酸プ
ローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより同定することができる。
【０１１４】 本発明のヌクレオチド配列としてはさらに、配列番号1〜62で記載されたヌク
レオチド配列と少なくとも40%、45%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%
、95%、98%以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列が挙げられ
る。また、本発明のヌクレオチド配列としては、配列番号63〜123に記載したア
ミノ酸配列と少なくとも25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、98%以上のアミノ酸配列同一性または類似性を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列も挙げられる。
【０１１５】 2つのアミノ酸配列または2つのヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージを
決定するために、その配列を最適に比較できるようにアラインさせる(例えば、
第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列と最適な状態にアラインするために第１
のアミノ酸またはヌクレオチド配列の配列内にギャップを導入してもよい)。そ
の後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基または
ヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置に第2の配列の対応する位置と
同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在するならば、その分子はその位置に
おいて同一である。2つの配列間の同一性%は配列を共有している同一位置数の関
数である(すなわち、同一性%=同一オーバーラッピング位置数/全位置数×100%)
。ある実施形態では、2つの配列が同じ長さである。
【０１１６】 2つの配列間の同一性%の決定は数学的アルゴリズムによっても達成することが
できる。2つの配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの好ましい例は、限定
されるものではないが、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 90: 5873-5877の場合のように改変したKarlinおよびAltschul (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 2264-2268のアルゴリズムである。かか
るアルゴリズムは、Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-0のNBLASTおよ
びXBLASTプログラムに組み入れられている。NBLASTヌクレオチドプログラムパラ
メーター設定、例えばスコア=100、ワード長=12によりBLASTヌクレオチド検索を
行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。XBLAST
プログラムパラメーター設定、例えばスコア=50、ワード長=3によりBLASTタンパ
ク質検索を行い、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることがで
きる。比較のためのギャップを入れたアラインメントを得るために、Altschulら
, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されるようにGapped BLASTを
利用することができる。また、PSI-BLASTを使用して分子(遺伝基質)間の遠類関
係を調べる繰り返し検索を行うこともできる。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-B
LASTプログラムを利用する場合には、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAS
T)のデフォルトパラメーターを使用することができる(例えば、http://www.ncbi
.nlm.nih.gov参照)。配列比較に使用する数学的アルゴリズムの別の好ましい例
は、限定されるものではないが、MyersおよびMiller, (1988) CABIOS 4: 11-17
のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフト
ウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられ
ている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを使用する場合には、 PAM120
weight residue table、ギャップ長スペナルティ 12およびギャップペナルティ
4を使用できる。
【０１１７】 相同標的遺伝子を単離するために、上記のC. albicans標的遺伝子配列を標識
、使用して、対象とする生物体から得られたmRNAから構築したcDNAライブラリー
をスクリーニングすることができる。標識配列の起源である生物種とは異なる生
物体からcDNAライブラリーを誘導する場合にはハイブリダイゼーション条件を低
ストリンジェンシーなものにすべきである。cDNAスクリーニングにより同種また
は異種のいずれかのスプライシングした転写産物から誘導されたクローンを同定
することができる。また、標識断片をさらに好適なストリンジェント条件で用い
て、対象とする生物体から誘導したゲノムライブラリーをスクリーニングするこ
とができる。低ストリンジェント条件について当業者は周知であるが、ライブラ
リーおよび標識配列の起源である生物種によって異なると考えられる。かかる条
件に関する指針については、例えばSambrookら, 1989, Molecular Cloning, A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; およびAusubelら, 1989
, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates a
nd Wiley Interscience, N. Y.)を参照。
【０１１８】 さらに、対象とする標的遺伝子にあるアミノ酸配列に基づいて設計された2つ
の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてポリメラーゼ鎖反応(PCR)
を行うことで相同標的遺伝子配列を単離することができる。この反応の鋳型は、
対象とする生物体から調製したmRNAの逆転写により得られたcDNAであってよい。
PCR産物をサブクローニング、配列決定して、増幅された配列が相同標的遺伝子
配列の配列を示していることを確認することができる。
【０１１９】 次いで、当業者に周知の種々の方法により、PCR断片を用いて全長cDNAクロー
ンを単離することができる。また、標識断片を用いてゲノムライブラリーをスク
リーニングすることができる。
【０１２０】 PCRテクノロジーは全長cDNA配列の単離にも利用することができる。例えば、
標準的な手法に従って、対象とする生物体からRNAを単離することができる。第1
鎖合成を開始するために、増幅断片の最も5’末端側に特異的なオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いてRNAで逆転写反応を行う。次いで、標準末端トランスフ
ェラーゼ反応を用いてRNA/DNAハイブリッドにグアニンを「末端に連結(tail)」し
、ハイブリッドをRNAアーゼHで消化し、さらにその後、ポリ-Cプライマーによっ
て第2鎖合成を開始する。このようにして、増幅断片上流にあるcDNA配列を容易
に単離することができる。使用できるクローニング戦略の概要については、例え
ばSambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press, N. Y.; およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecul
ar Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.)
を参照。
【０１２１】 さらに、対象とする生物から単離されたDNAまたは合成されたcDNAを用いて発
現ライブラリー構築することができる。この方法では、相同標的遺伝子によって
作製された遺伝子産物を発現させ、以下に記載するC. albicans遺伝子産物に対
して誘起される抗体に関連する標準的抗体スクリーニング技術により、スクリー
ニングすることができる。(スクリーニング技術に関しては、例えばHarlow, E.
およびLane, eds., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harborを参照。) かかる標識抗体との反応によっ
て検出されたライブラリークローンを精製し、周知の方法によって配列解析を行
うことができる。
【０１２２】 また、増殖、毒性または病原性に関係する標的遺伝子またはポリペプチドと所
望のレベルの相同性を有する配列を同定するためのデータベースを検索すること
で相同標的遺伝子またはポリペプチドを同定してもよい。当業者ならばGenBank
およびGenSeqをはじめとする様々なデータベースを利用できる。種々の実施形態
では、データベースをスクリーニングして、標的ヌクレオチド配列またはその一
部と少なくとも97%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくと
も80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%の
同一性を有する核酸を同定する。別の実施形態では、データベースをスクリーニ
ングして、増殖、毒性または病原性に関係するポリペプチドまたはその一部と少
なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%
、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%または少なく
とも25%の同一性または類似性を有するポリペプチドを同定する。
【０１２３】 また、機能的に同種である標的配列またはポリペプチドを、遺伝子機能を排除
または改変した表現型を有する突然変異体を作り出すことで同定してもよい。例
えば、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicansおよびAspergillus fumiga
tusなどの所与の真菌種の1個または全ての遺伝子に対してこれを行うことができ
る。ある真菌種の遺伝子に変異があることにより、機能的相補性検定により、他
の種の機能的類似遺伝子(オーソログ)または関連遺伝子(パラログ)の同定方法が
提供される。
【０１２４】 所与の種、例えばCandida albicansから遺伝子のライブラリーまたは遺伝子の
メッセンジャーRNAのcDNAコピーを作製し、そのライブラリーをベクターへクロ
ーニングすることで、第2の種、例えばSaccharomyces cerevisiaeでその遺伝子
を発現(例えば、Candida albicansプロモーターまたはSaccharomyces cerevisia
eプロモーターによって)させることができる。かかるライブラリーを「異種ライ
ブラリー」という。Candida albicans異種ライブラリーを、同定された遺伝子に
ついて機能的欠陥のある所定のSaccharomyces cerevisiae変異体へ形質転換し、
さらに変異性欠陥の全体または一部の表現型機能を修復する異種ライブラリーの
遺伝子をスクリーニングまたは選択することを「異種機能的補完」といい、この例
ではSaccharomyces cerevisiaeの変異遺伝子と機能的に関連のあるCandida albi
cansの遺伝子の同定がなされる。この機能的補完法では本来、核酸またはポリペ
プチドの配列類似性がなくとも遺伝子機能を修復することが可能である；すなわ
ち、この方法によれば、配列類似性比較によってかかる保存を現すまたは示すこ
とができない場合であっても、保存された生物学的機能を有する遺伝子の異種間
同定が可能である。
【０１２５】 調べようとする遺伝子が必須遺伝子である場合には、異種機能的補完検定の実
施に関して数多くの可能性が存在する。必須遺伝子の変異は、限定されるもので
はないが、温度感受性対立遺伝子、調節可能なプロモーターから条件のより発現
される対立遺伝子、またはmRNA転写産物またはコードされた遺伝子産物を条件に
より不安定にする対立遺伝子などの条件対立遺伝子であってよい。また、必須遺
伝子に変異を有する鎖を天然型遺伝子のコピー(同一種由来の変異遺伝子の野生
型コピー)を用いて選択マーカーを含むベクターで増殖させることで、ベクター
およびそこに含まれる野生型対立遺伝子のコピーをほとんどまたは全く有してい
ない鎖の選択が可能になる。このように構築された鎖を異種ライブラリーで形質
転換し、異種遺伝子が必須遺伝子変異を機能的に補完し得るクローンを、野生型
遺伝子を有するプラスミドの維持を許容しない培地で選択する。
【０１２６】 以下の例では、機能的相補性によるSaccharomyces cerevisiae遺伝子のCandid
a albicans相同体、KRE9の同定について説明する。(Lussierら 1998, “The Can
dida albicans KRE9 gene is required for cell wall β-1,6-glucan synthesi
s and is essential for growth on glucose,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 5 : 9825-30)。宿主株は重度の増殖欠陥表現型を有するKRE9のSaccharomyces cer
evisiaeハプロイドヌル変異体、kre9::HIS3であった。宿主株はLYS-2に基づくpR
S317シャトルベクター上に天然のSaccharomyces cerevisiaeKRE9遺伝子の野生型
コピーを有しており、それをCandida albicansゲノムライブラリーで形質転換し
た。選択マーカーとしてURA3遺伝子を有する、多重コピープラスミドYEp352をベ
クターとして使用してこの異種ライブラリーを構築した。kre9::HIS3変異宿主の
増殖を助けるプラスミドをスクリーニングするために、ヒスチジン、リジンおよ
びウラシルの不在下で増殖可能な約20,000コロニーを窒素源としてα-アミノア
ジパートを含有する最少培地に複製播種し、LYS-2プラスミドに基づくKRE9のコ
ピーはないが、機能的に補完するCandida albicansオーソログ、CaKRE9のコピー
を有する細胞の選択を可能とした。これらの細胞をさらにリジン不在下での増殖
能力のないことによりpRS317-KRE9プラスミドが存在しないことについても調べ
、YEp352に基づくCandida albicansゲノムDNAをそれらから回収した。Saccharom
yces cerevisiae kre9::HIS3変異体の再形質転換では、増殖を部分的に修復でき
るCandida albicansの特定の8kbゲノムインサートを回収した。選択に関する機
能的補完性を利用したさらなるサブクローニングにより、機能的Candida albica
nsKRE9遺伝子を含有する1.6kb DNA断片を得た。
【０１２７】 異種機能的補完性試験はCandida albicansとSaccharomyces cerevisiaeとの間
の遺伝情報の交換に制限されるものではない;上記の真菌種のいずれかの対を用
いて機能的補完性検定を行うことができる。例えば、菌核病菌(Sclerotinia scl
erotiorum)のCRE1遺伝子はAspergillus nidulansのCREA遺伝子のcreAD30変異体
を機能的に補完することができる(Vautardら 1999, ”The glucose repressor g
ene CRE1 from Sclerotininia sclerotiorum is functionally related to CREA
from Aspergillus nidulans but not to the Mig proteins from Saccharomyce
s cerevisiae, “FEBS Lett. 453: 54-58参照)。
【０１２８】 さらに別の実施形態では、遺伝子発現アレイに置かれた核酸とアレイとハイブ
リダイズする核酸プローブとが2つの異なる生物種を起源とする場合、その組合
せによっては2種間の相同遺伝子の迅速な同定が可能である。
【０１２９】 さらに別の実施形態では、本発明は(a)標的遺伝子の上記コード配列および/ま
たはそれらの相補配列(アンチセンスなど)のいずれかを含んでなるヌクレオチド
配列を含有するDNAベクター; (b)コード配列の発現を指示する制御エレメントと
機能しうる形で連結された上記コード配列のいずれかを含むヌクレオチド配列を
含有するDNA発現ベクター; および(c)宿主細胞でコード配列の発現を指示する制
御エレメントと機能しうる形で連結された標的遺伝子の上記コード配列; のいず
れかを含有する遺伝子操作した宿主細胞もまた包含する。他の種(S. cerevisiae
を除く)の相同標的遺伝子のコード配列を含有するベクター、発現構築物、発現
ベクターおよび遺伝子操作した宿主細胞もまた意図するものである。また、他の
種の相同標的遺伝子の変異対立遺伝子を含有する遺伝子操作した宿主細胞も意図
するものである。本明細書で使用する制御エレメントとしては、限定されるもの
ではないが、誘導または非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよ
び発現を駆動および制御する当業者に公知なその他のエレメントが挙げられる。
かかる制御エレメントとしては、限定されるものではないが、lac系、trp系、te
t系およびその他の抗生物質に基づく抑制系(例えば、PIP)、TAC系、TRC系、ファ
ージAの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制
御領域および3-ホスホグリセリン酸キナーゼの真菌類プロモーター、酸ホスファ
ターゼ、酵母接合フェロモン反応性プロモーター(例えば、STE2およびSTE3)およ
び炭水化物代謝に関係する遺伝子から単離したプロモーター(例えば、GALプロモ
ーター)、リン酸反応性プロモーター(例えば、PHO5)、またはアミノ酸代謝(例え
ば、MET遺伝子)が挙げられる。本発明は本明細書で開示したDNAベクター配列の
いずれもの断片を包含する。
【０１３０】 種々の技術を利用して同定された必須遺伝子および毒性遺伝子をさらに特性解
析することができる。第1に、同定された遺伝子のヌクレオチド配列を用いて、
同定された遺伝子産物の生物学的機能に関する情報を得ることができる1以上の
公知な配列モチーフとの相同性を示すことができる。当技術分野で周知のコンピ
ュータプログラムを使用して、かかる関係を確認することができる。第2に、同
定された遺伝子の配列を用いて、in situハイブリダイゼーションのような標準
技術により、その遺伝子を別の生物体、例えばSaccharomyces cerevisiaeに関し
て構築した同様のマップと相関させ得る染色体マップおよび遺伝子マップに配置
することができる。かかる特性解析によって得られた情報よりCandida albicans
およびその他の病原体に対する薬物を発見するためのポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドを用いる好適な方法を示すことができる。
【０１３１】 上記の使用を行うための方法については当業者には周知である。かかる方法を
開示する参考文献としては、限定されるものではないが、“Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, “2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sam
brook, J., E. F. FritschおよびT. Maniatis eds., 1989, および”Methods in
Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, “Academic Press, Be
rger, S. L.およびA. R. Kimmel eds., 1987が挙げられる。同定された必須遺伝
子のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいくつかの使用については以下で詳
細に記載する。 5.4.3 標的遺伝子産物 本発明の方法および組成物に使用され、包含される標的遺伝子産物としては、
配列番号1〜62で記載した標的遺伝子配列のような上記の標的必須遺伝子配列に
よってコードされる遺伝子産物(例えば、RNAまたはタンパク質)が挙げられる。
表２では、配列番号63〜123のアミノ酸配列を、C. albicansのコドン使用頻度に
より配列番号1〜61の各ヌクレオチド配列から論理的に推測している。しかしな
がら、C. albicans以外の生物体で発現させる場合、配列番号63〜123のアミノ酸
配列を有する標的遺伝子のタンパク質産物は普遍的遺伝子コードによって翻訳さ
れたヌクレオチド配列によりコードされ得る。コドン使用頻度のかかる違いを調
整するのに必要な改変については当業者には明らかである。
【０１３２】 さらに、本発明の方法および組成物では機能的に同等な遺伝子産物であるタン
パク質およびポリペプチドも使用しさらに包含する。かかる機能的に同等な遺伝
子産物としては、限定されるものではないが、配列番号63〜123で記載したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの天然の変異体が挙げられる。
【０１３３】 かかる同等な標的遺伝子産物は、上記の標的遺伝子配列によってコードされる
アミノ酸配列内に、例えばアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有する可能
性はあるが、結果としてサイレントな変化であるため、機能的に同等な標的遺伝
子産物が生じる。アミノ酸置換は関連残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水
性および/または両親媒性における類似性に基づいてなされ得る。例えば、無極
性(すなわち、疎水性)アミノ酸残基としては、アラニン(AlaまたはA)、ロイシン
(LeuまたはL)、イソロイシン(IleまたはI)、バリン(ValまたはV)、プロリン(Pro
またはP)、フェニルアラニン(PheまたはF)、トリプトファン(TrpまたはW)および
メチオニン(MetまたはM)が挙げられる;極性中性アミノ酸残基としては、グリシ
ン(GlyまたはG)、セリン(SerまたはS)、トレオニン(ThrまたはT)、システイン(C
ysまたはC)、チロシン(TyrまたはY)、アスパラギン(AsnまたはN)およびグルタミ
ン(GlnまたはQ)が挙げられる;正電荷(すなわち、塩基性)アミノ酸残基としては
、アルギニン(ArgまたはR)、リジン(LysまたはK)およびヒスチジン(HisまたはH)
が挙げられる;さらに負電荷(すなわち、酸性)アミノ酸残基としては、アスパラ
ギン酸(AspまたはD)およびグルタミン酸(GluまたはE)が挙げられる。
【０１３４】 ある特定の実施形態では、配列番号63〜123のうち1つを有するポリペプチドの
天然の変異体の混合物を含んでなる組成物を提供する。当技術分野では、C. alb
icansにおいてコドンCTGを認識するtRNA分子の99%がセリン残基により帯電して
おり、1%がロイシン残基により帯電していることが分かっていることから、生合
成中にロイシンを伸長しているポリペプチド鎖に組み込む可能性がある。よって
、コドンCTGを含んでなるヌクレオチド配列をC. albicansで翻訳させる場合、得
られるポリペプチドのわずかな割合のものが(C. albicansのコドン使用頻度に従
って)CTGによりコードされたセリン残基が存在すると予測される位置にロイシン
残基を有していると思われる。かかるヌクレオチド配列の翻訳産物は、ヌクレオ
チド配列のCTGコドンに対応する位置に少数のロイシン/セリン変異を有するポリ
ペプチド混合物を含んでなると考えられる。
【０１３５】 本明細書で使用する「機能的に同等」とは、表２に記載した1種以上の標的遺伝
子配列によりコードされるC. albicans標的遺伝子産物と実質的に同じin vivo活
性を示し得るポリペプチドをいう。また、以下で記載するアッセイの一部として
使用する場合の「機能的に同等」とは、標的遺伝子産物の対応する部分が他の細胞
または細胞外分子と相互作用するのと実質的に同じ方法でかかる他の分子と相互
作用し得るペプチドまたはポリペプチドをいう。好ましくは、本発明の機能的に
同等な標的遺伝子産物が表２に記載した1種以上の標的遺伝子配列によりコード
される標的遺伝子産物と同じサイズまたはほぼ同じサイズでもある。
【０１３６】 本発明の別の実施形態では、Saccharomyces cerevisiaeのRNAまたはタンパク
質である標的遺伝子産物の使用を提供する。
【０１３７】 標的遺伝子産物の1以上のドメイン(例えば、シグナル配列、TM、ECD、CDまた
はリガンド結合ドメイン)に対応するペプチドまたはポリペプチド、末端切断型
または欠失標的遺伝子産物(例えば、標的遺伝子産物の1以上のドメインを欠失し
たポリペプチド)および融合標的遺伝子タンパク質(例えば、全長または末端切断
型もしくは欠失標的遺伝子産物、または標的遺伝子産物の1以上のドメインに対
応するペプチドもしくはポリペプチドと関連のないタンパク質とを融合したタン
パク質)もまた本発明の範囲である。かかるペプチドまたはポリペプチド(キメラ
タンパク質またはポリペプチドとも呼ばれる)は、表２に記載した標的遺伝子ヌ
クレオチドおよびアミノ酸配列に基づいて当業者によって容易に設計され得る。
融合タンパク質の例としては、限定されるものではないが、エピトープ結合試薬
を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる標的遺伝子産物の単離を容易
にするエピトープタグ融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質のその他の
例としては、例えば、融合タンパク質が細胞膜に固定されることによって標的遺
伝子ポリペプチドが細胞表面に提示され得るいずれかのアミノ酸配列との融合物
;または酵素(例えば、Kluyveronmyces lactisのLAC4遺伝子によりコードされる
β-ガラクトシダーゼ(Leukerら, 1994, Mol. Gen. Genet., 245: 212-217))、蛍
光タンパク質(例えば、Renilla reniformis由来(Srikanthaら, 1996, J. Bacter
iol. 178: 121-129))またはマーカー機能を提供し得る発光タンパク質との融合
物が挙げられる。よって、本発明は第2のポリペプチドと融合した、配列番号63
〜123のうちの1つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも6個の連続残基から
なる第1のポリペプチド断片を含んでなる融合タンパク質を提供する。
【０１３８】 上記の標的遺伝子産物コード配列に別の改変を行って、例えば選択された宿主
細胞での発現、スケールアップ等により好適なポリペプチドを得ることができる
。例えば、システイン残基を欠失させるまたは別のアミノ酸で置換することでジ
スルフィド結合を排除することができる。
【０１３９】 本発明の標的遺伝子産物は、好ましくは(すなわち、標的遺伝子産物に対して
向けられた抗体によって認識される遺伝子産物の)エピトープ断片を提示するの
に必要な少なくとも同じ数の連続アミノ酸残基を含んでなる。例えば、かかるタ
ンパク質断片またはペプチドは特異的に発現された全長のまたは経路遺伝子産物
の少なくとも約8個の連続アミノ酸残基を含んでなることができる。別の実施形
態では、本発明のタンパク質断片およびペプチドは、標的遺伝子産物の約6、10
、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450
個以上の連続したアミノ酸残基を含んでなることができる。
【０１４０】 本発明の方法および組成物に使用され、包含される標的遺伝子産物は、本発明
の1種以上の上記標的遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列(ここで、これ
らの配列またはその断片の1以上のエキソンによりコードされることの多いドメ
インは欠失している)も包含する。本発明の標的遺伝子産物は、またさらに、限
定されるものではないが、糖付加、アセチル化およびミリスチル化などの翻訳後
修飾を含んでなる。
【０１４１】 本発明の標的遺伝子産物は、例えば合成技法または当業者には周知の技術を用
いる組換えDNA技法により容易に製造することができる。したがって、本発明の
標的遺伝子産物の製造方法については本明細書に記載する。まず、本発明のポリ
ペプチドおよびペプチドを当技術分野で周知の技術により合成または製造する。
例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れるCreighton, 1983, Protein
s: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y. を参
照。例えば、ペプチドを固相支持体上または溶液中で合成することができる。
【０１４２】 あるいは、当業者に周知の組換えDNA法を用いて、配列番号1〜61で示されるも
ののような標的遺伝子タンパク質コード配列および適当な転写/翻訳制御シグナ
ルを含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては、例えば、in v
itro組換えDNA法、合成技法およびin vivo組換え法/遺伝学的組換え法が挙げら
れる。例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, N.Y., Plaら, Yeast 12:1677-1702 (1996)(参照に
より本明細書にその全文を組み入れる)およびAusubel, 1989, 前掲に記載の方法
を参照。あるいは、標的遺伝子タンパク質配列をコードし得るRNAは、例えばシ
ンセサイザーを用いて化学的に合成することもできる。例えば、Oligonucleotid
e Synthesis, 1984, Gait, M.J編, IRL Press, Oxford )(参照により本明細書に
その全文を組み入れる)に記載の技術を参照。
【０１４３】 本発明の標的遺伝子コード配列を発現させるには種々の宿主-発現ベクター系
を用いることができる。かかる宿主-発現ベクター系は、対象とするコード配列
がそれによって産生され、次ぎに精製されるビヒクルであるが、適当なヌクレオ
チドコード配列で形質転換またはトランスフェクトした際に本発明の標的遺伝子
タンパク質をin situで発現することができる細胞である。これらのものとして
は、限定されるものではないが、標的遺伝子タンパク質コード配列を含む組換え
バクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質
転換した細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)；標的遺伝子タンパク質コード配列を含
む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、サッカロミセス属、分
裂酵母属、赤パンカビ属、コウジカビ属、カンジダ属、ピキア属)などの微生物
；標的遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば
、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；標的遺伝子タンパク質コード配
列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスC
aMV；タバコモザイクウイルスTMV)を感染させた、または組換えプラスミド発現
ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞；あるいは哺乳類細胞
ゲノム由来プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)、または哺乳
類ウイルス由来プロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワク
シニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する哺乳類細胞
系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられる。必要であれば、コード領
域のヌクレオチド配列はその翻訳産物が正しいアミノ酸配列を有するように、宿
主のコドン使用頻度に従って改変してもよい。
【０１４４】 細菌系では、発現される標的遺伝子タンパク質に意図される使用に応じていく
つかの発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体の作製またはペプチドラ
イブラリーのスクリーニングのためにかかるタンパク質を大量に産生させる際に
は、例えば容易に精製される融合タンパク質産物を高レベルで発現することを指
示するベクターが望まれ得る。かかるベクターとしては、限定されるものではな
いが、融合タンパク質が産生されるように標的遺伝子タンパク質コード配列が個
々にlacZコード領域とフレーム内で連結し得る大腸菌発現ベクターpUR278 (Ruth
erら, 1983, EMBO J. 2:1791；pINベクター (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic
Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:
5503-5509)などが挙げられる。また、pGEXベクターを用いてグルタチオンS・ト
ランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させ
ることもできる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であって、グルタチオ
ン-アガロースビーズに吸着させた後に遊離グルタチオンの存在下で溶離させる
ことにより溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターはクローニ
ングされた標的遺伝子タンパク質がGST部分から遊離し得るようにトロンビンま
たはファクターXaプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１４５】 哺乳類宿主細胞で標的遺伝子を発現させようとする場合には、ウイルスに基づ
くいくつかの発現系を利用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる
場合、対象とする標的遺伝子コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体
、例えば後期プロモーターと三部リーダー配列と連結させることができる。この
キメラ遺伝子は次ぎにin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノ
ムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1また
はE3)に挿入すると、活性があり、かつ、感染宿主において標的遺伝子産物を発
現させ得る組換えウイルスが得られる(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照)。また、挿入された標的遺伝子コード配
列が効果的に翻訳されるには特異的開始シグナルも必要とされ得る。これらのシ
グナルにはATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。その固有の開始コドンお
よび隣接配列を含む全標的遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合には、さ
らなる翻訳制御シグナルは必要でない。しかし、標的遺伝子コード配列の一部だ
けを挿入する場合には、おそらくはATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグ
ナルを提供しなければならない。さらに、全インサートを確実に翻訳するには開
始コドンは所望のコード配列の読み取りフレームと同期していなければならない
。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然および合成双方の
種々の起源のものであってよい。発現効率は適当な転写増強エレメント、転写タ
ーミネーターなどを含めることによって増強させることができる(Bittnerら, 19
87, Methods in Enzymol. 153:516-544参照)。
【０１４６】 さらに、挿入配列の発現を調節する、または所望の特定の様式で遺伝子産物を
修飾およびプロセシングする宿主細胞系統を選択することができる。タンパク質
産物のかかる修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)
はタンパク質機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳
後プロセッシングおよび修飾に関して特徴および特定のメカニズムを持っている
。発現した外来タンパク質の適切な修飾およびプロセッシングを確実なものとす
るために適当な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的で、一次
転写産物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化
のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用できる。
【０１４７】 組換えタンパク質を長期にわたって高い収率で生産するには、安定発現が好ま
しい。例えば、標的遺伝子タンパク質を安定発現する細胞系が操作可能である。
宿主細胞は適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配
列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)により制御されるDNAおよび
選択マーカーで形質転換させることができる。外来DNAを導入した後、操作細胞
を完全培地で1〜2日間増殖させ、その後、選択培地に切り替えてもよい。組換え
プラスミド中の選択マーカーは選択耐性を付与し、細胞はそれらの染色体にプラ
スミドを安定して組み込むことができ、次ぎに細胞増殖巣から増殖させ、これを
次ぎにクローン化して細胞系へと拡張することができる。この方法は標的遺伝子
タンパク質を発現する細胞系の操作に有利に用いることができる。かかる操作細
胞は内在する標的遺伝子タンパク質の活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニン
グおよび評価に特に有用であり得る。
【０１４８】 限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler
ら, 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026
)およびアデニンホスホリボシルトランフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22:817)
遺伝子をはじめとするいくつかの選択系がそれぞれtk-、hgprt-、またはaprt-細
胞で使用できる。また、メトトレキサート(Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77:3567; O’Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527耐
性を付与するdhfr、ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg, 198
1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072、アミノグリシドG-418耐性を付与する
neo(Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1)およびハイグロマイシン
耐性を付与するhygro(Santerreら, 1984, Gene 30:;147)に対する選択の基礎と
して抗代謝産物耐性を用いることができる。
【０１４９】 あるいは、融合タンパク質は発現される融合タンパク質に特異的な抗体を用い
ることで容易に精製することができる。例えば、Janknechtらにより記載されて
いる系はヒト細胞系で発現した非変性融合タンパク質の精製を容易にする(Jankn
echtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976)。この系では、対象
とする遺伝子を、その遺伝子のオープンリーディングフレームが6個のヒスチジ
ン残基からなるアミノ末端タグに翻訳上融合されるようにワクシニア組換えプラ
スミドにサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスに感染させた細胞か
らの抽出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムに添加し、ヒスチジンタグ付
きタンパク質をイミダゾール含有バッファーで選択的に溶出する。また、標的遺
伝子産物のカルボキシ末端における融合も考えられる。
【０１５０】 本明細書に記載されているもののようなアッセイ系において構成要素として用
いる場合、標的遺伝子タンパク質は、標的遺伝子タンパク質と試験物質との間で
形成される複合体の検出を容易にするために直接的または間接的に標識すること
ができる。限定されるものではないが、125Iなどの放射性同位元素、基質に曝さ
れた際に検出可能な比色定量シグナルまたは光を発する酵素標識系、および蛍光
標識をはじめとする種々の好適な標識系のいずれかを使用することができる。
【０１５１】 間接的標識はいずれかの標的遺伝子産物と特異的に結合する標識抗体などのタ
ンパク質の使用を含む。かかる抗体としては、限定されるものではないが、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、
一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーに
よって作製されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記のい
ずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
【０１５２】 同定された標的ヌクレオチド配列によってコードされる標的遺伝子タンパク質
が発現した後、そのタンパク質を精製する。タンパク質精製法は当技術分野で周
知である。同定された外因性ヌクレオチド配列17sにコードされ、それから発現
したタンパク質はポリエチレングリコールによる沈殿のような沈殿法を用いて部
分精製することができる。あるいは、タンパク質のエピトープタグを用いてタン
パク質の簡便なワンステップ精製をしてもよい。さらにまた、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイトカラムの使用、固定化反応性色
素、クロマト電気泳動、および高速液体クロマトグラフィーの使用などのクロマ
トグラフィー法を用いてタンパク質を精製することもできる。精製方法としては
、一次元ゲル電気泳動、高分解二次元ポリアクリルアミド電気泳動、等電点電気
泳動その他などの電気泳動法が考えられる。また本発明の精製法としては、固相
結合抗体、リガンド提示カラムおよびその他のアフィニティークロマトグラフィ
ーマトリックスを含んでなるアフィニティークロマトグラフィー法も考えられる
。
【０１５３】 さらに、精製された標的遺伝子産物、その断片、またはその誘導体を薬学上許
容される担体で個体に投与してそのタンパク質またはポリペプチドに対する免疫
応答を誘発してもよい。好ましくは、この免疫応答はその個体を防御する防護免
疫応答である。タンパク質(アジュバントを含む)および薬学上許容される担体の
適当な用量を決定する方法は当業者に公知である。
【０１５４】5.4.4 標的遺伝子産物特異的抗体 ここでは上記の1以上の標的遺伝子産物のエピトープを特異的に認識し得る抗
体の作製方法を記載する。かかる抗体としては、限定されるものではないが、ポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体
、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリー
によって作製されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗-Id)抗体、および上記
のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
【０１５５】 標的遺伝子または遺伝子産物に対する抗体を作製するには、種々の宿主動物を
標的遺伝子タンパク質またはその一部を注射することで免疫化する。かかる宿主
動物としては、限定されるものではないがいくつか挙げると、ウサギ、マウス、
およびラットが挙げられる。宿主種にもよるが、免疫応答を増強するには、限定
されるものではないが、フロイント(完全および不完全)アジュバント、水酸化ア
ルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニ
オン、ペプチド、オイルエマルション、キーホール・リンペット・ヘモシアニン
、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、BCG(bacille Calmett-Guerin)およ
びCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントをはじめとす
る種々のアジュバントを使用できる。従って本発明は、単離されたポリペプチド
(そのアミノ酸配列は配列番号63から123の1つの、少なくとも6個の連続する残基
を含んでなる)を含んでなる免疫原性組成物を動物に導入することを含んでなる
、動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。
【０１５６】 ポリクローナル抗体は標的遺伝子産物のような抗原、またはその抗原機能誘導
体で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である。ポリクロー
ナル抗体を作製するには、上記のような宿主動物を、これもまた上記のようなア
ジュバントを添加した、異なる発現の、または異なる経路の遺伝子産物を注射す
ることによって免疫化することができる。免疫動物における抗体力価は、固定化
ポリペプチドを用いる酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などの標準的な技術によ
って経時的にモニタリングすることができる。必要であれば、抗体分子は、動物
から(例えば、血液から)単離してもよいし、Aタンパク質クロマトグラフィーな
どの周知の技術によってさらに精製してIgG画分を得てもよい。
【０１５７】 モノクローナル抗体は特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるが、これは
連続細胞培養系により抗体分子を産生させるいずれの技術によっても得ることが
できる。これらには、限定されるものではないが、Kohler and Milstein (1975,
Nature 256:495-497;および米国特許第4,376,110号)のハイブリドーマ法、ヒト
B細胞ハイブリドーマ法(Kosborら, 1983, Immunology Today 4:72; Coleら, 198
3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、およびEBV-ハイブリドーマ法(
Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, In
c., 77-96頁)が挙げられる。かかる抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびその
いずれかのサブクラスをはじめ、いずれの免疫グロブリンであってもよい。本発
明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養可能である。
現在のところin vivoにおいて高力価のmAbを産生させることが好ましい産生方法
となっている。
【０１５８】 モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、組換えコンビナ
トリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージ提示ライブラリー)
を目的のポリペプチドでスクリーニングすることで、本発明のポリペプチドに対
して向けられたモノクローナル抗体を同定および単離できる。ファージ提示ライ
ブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは、市販されている(例
えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-0
1；およびStratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。さ
らに、抗体提示ライブラリーを作製およびスクリーニングする際に使用するのに
特に向いている方法および試薬の例は、例えば米国特許第5,223,409号；PCT公報
第WO 92/18619号；PCT公報第WO 91/17271号；PCT公報第WO 92/20791号；PCT公報
第WO 92/15679号；PCT公報第WO 93/01288号；PCT公報第WO 92/01047号；PCT公報
第WO 92/09690号；PCT公報第WO 90/02809号；Fuchsら(1991) Bio/Technology 9:
1370-1372；Hayら (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら (1989)
Science 246:1275-1281；Griffithsら (1993) EMBO J. 12:725-734に記載されて
いる。
【０１５９】 さらに、標準的組換えDNA技術を用いて作製できる、ヒトおよび非ヒト部分の
両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、本発明
の範囲内にある。キメラ抗体は、マウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロ
ブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子で
ある(例えば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号；およびBossら、米国特許第4
,816397号を参照。これらの文献はその内容全体が参照により本明細書に組み入
れる)。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域(CDR)、およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来の枠組み構造領域を有する非ヒト種由来の抗体分子で
ある(例えば、Queen、米国特許第5,585,089号を参照のこと。この文献は、その
内容全体が参照により本明細書に組み入れる)。このようなキメラおよびヒト化
モノクローナル抗体は、例えば、PCT公報第WO 87/02671号；欧州特許出願第184,
187号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願第173,494号；PCT公報第WO 86/
01533号；米国特許第4,816,567号；欧州特許出願第125,023号；Betterら(1988)
Science 240:1041-1043；Liuら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3
443；Liuら (1987) J. Immunol. 139:3521-3526；Sunら (1987) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 84:214-218；Nishimuraら (1987) Canc. Res. 47:999-1005；Wood
ら (1985) Nature 314:446-449；およびShawら (1988) J. Natl. Cancer Inst.
80:1553-1559)；Morrison (1985) Science 229:1202-1207；Oiら (1986) Bio/Te
chniques 4:214：米国特許第5,225,539号；Jonesら (1986) Nature 321:552-525
；Verhoeyanら (1988) Science 239:1534；ならびにBeidlerら (1988) J. Immun
ol. 141:4053-4060に記載される方法を用いて、当該技術分野で公知の組換えDNA
技術により作製することができる。
【０１６０】 完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。このような抗
体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は発現できないが、ヒト重鎖
および軽鎖遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生できる。
このトランスジェニックマウスを、選択した抗原(例えば、本発明のポリペプチ
ド全体またはその一部)で通常の様式で免疫化する。抗原に向けられたモノクロ
ーナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランス
ジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の
間に再編成し、その後クラススイッチおよび体細胞変異を経る。従って、このよ
うな技術を用いて、治療的に有用なIgG、IgAおよびIgE抗体を産生することが可
能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Lonbergおよ
びHuszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照のこと。ヒト抗体および
ヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な議論、ならびにこの
ような抗体の産生プロトコールについては、例えば、米国特許第5,625,126号；
米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；お
よび米国特許第5,545,806号を参照のこと。
【０１６１】 選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択(guided selecti
on)」と称される技術を用いて産生できる。この方法においては、選択された非ヒ
トモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)を用いて、同じエピトープを認識す
る完全ヒト抗体の選択を導く(Jespersら (1994) Bio/technology 12:899-903)。
【０１６２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により産生でき
る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により
産生され得るF(ab')2フラグメント、ならびにF(ab')2フラグメントのジスルフィ
ド結合を還元することで産生され得るFabフラグメントなどが挙げられるが、こ
れらに限定されない。あるいはまた、Fab発現ライブラリーを構築して(Huseら,
1989, Science 246:1275-1281)、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラ
グメントの迅速かつ簡単な同定を可能にできる。
【０１６３】 本発明の抗体はまた、標的遺伝子産物に対するそれらの結合親和性の点からも
説明または特定できる。好ましい結合親和性としては、5×10-6Ｍ、10-6Ｍ、5×
10-7Ｍ、10-7Ｍ、5×10-8Ｍ、10-8Ｍ、5×10-9Ｍ、10-9Ｍ、5×10-10Ｍ、10-10
Ｍ、5×10-11Ｍ、10-11Ｍ、5×10-12Ｍ、10-12Ｍ、5×10-13Ｍ、10-13Ｍ、5×10 -14 Ｍ、10-14Ｍ、5×10-15Ｍ、または10-15Ｍ未満の解離定数すなわちKdを有す
るものが挙げられる。
【０１６４】 標的遺伝子産物に向けられた抗体またはそのフラグメントを使用して標的遺伝
子産物を検出して、様々な環境条件下、異なる形態学的形態(菌糸体、酵母、胞
子)および生物のライフサイクルの異なる段階におけるポリペプチドの発現の存
在度およびパターンを評価できる。標的遺伝子産物に向けられた抗体またはその
フラグメントを診断のために使用して、臨床検査手法の一部として(例えば、所
与の治療処方計画の有効性を決定するために)、感染宿主の組織中の標的遺伝子
産物のレベルをモニターできる。抗体を検出可能な物質と結合させることにより
検出し易くできる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍
光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素
の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガ
ラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分
子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチ
ンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイ
ン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルア
ミン(dichlorotriazinylamine)フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコ
エリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発
光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げ
られ；ならびに適切な放射性物質の例としては125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが
挙げられる。
【０１６５】 さらに、標的遺伝子産物に向けられた抗体またはそのフラグメントを治療のた
めに用いて、感染を予防および/または病原体の増殖を阻害することにより、感
染性疾患を治療できる。抗体はまた、標的遺伝子産物の生物学的活性を改変する
ためにも使用できる。毒性または病原性に関係する遺伝子産物に対する抗体を使
用して、感染を防ぎ、生物による感染に関連する１以上の症状を緩和することも
できる。この治療的効果を促進または増強するために、抗体(またはそのフラグ
メント)を、毒素または殺真菌剤などの治療成分とコンジュゲートしてもよい。
治療成分を抗体とコンジュゲートさせるための技術は周知であり、例えば、Thor
peら, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjug
ates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照のこと。
【０１６６】 治療成分がコンジュゲートされたまたはされていない抗体は、単独または化学
治療薬物との組合せで投与される治療薬として使用できる。
【０１６７】5.4.5 アンチセンス分子 遺伝子発現の阻害剤としてのアンチセンス分子の使用は、具体的な、遺伝子に
基づいた治療的アプローチであり得る(レビューについては、69章、5節 "Cancer
: Principle and Practice of Oncology"、第４版、DeVitaら編、J.B. Lippinco
tt, Philadelphia 1993に掲載のSteinを参照)。本発明は、標的必須遺伝子また
は毒性遺伝子またはその一部のアンチセンスである少なくとも６ヌクレオチドの
核酸の治療的または予防的な使用を提供する。本明細書で使用する「アンチセン
ス」標的核酸とは、いくらかの配列相補性により、標的遺伝子RNA(好ましくはmRN
A)の一部にハイブリダイズ可能な核酸を指す。本発明は、以下に記載するように
、薬学上許容される担体中に有効量の本発明のアンチセンス核酸を含む医薬組成
物をさらに提供する。
【０１６８】 別の実施形態では、本発明は、C.アルビカンス(C.albicans)などの対象とする
生物中の標的遺伝子のin vitroまたはin vivoでの発現を阻害する方法であって
、本発明のアンチセンス核酸を含む有効量の組成物を細胞に提供することを含む
方法に関する。異なる標的遺伝子にハイブリダイズ可能な複数のアンチセンスポ
リヌクレオチドを組み合わせて、順番にまたは同時に使用してもよい。
【０１６９】 別の実施形態では、本発明は、上述した方法により同定された必須遺伝子の発
現をモジュレートする方法であって、必須遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を阻
害するアンチセンスRNA分子を調節可能プロモーターから発現させる方法に関す
る。本実施形態の一態様では、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)のGR
ACE株、または別の二倍体病原性生物から構築された別のGRACE株においてアンチ
センスRNA分子を発現させる。本実施形態の別の態様では、アンチセンスRNA分子
を、カンジダ・アルビカンスまたは別の二倍体病原性生物(アスペルギルス・フ
ミガタス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nige
r)、アスペルギルス・フラヴィス(Aspergillus flavis)、カンジダ・トロピカリ
ス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilopsis
)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、クリプトコッカス・ネオフォルマン
ス(Cryptococcus neoformans)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides i
mmitis)、エキソファリア・デルマチジチス(Exophalia dermatiditis)、フサリ
ウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、ヒストプラズマ・カプスラータム
(Histoplasma capsulatum)、ニューモシスチス・カリニ(Phneumocystis carinii
)、トリコスポロン・ベイジェリー(Trichosporon beigelii)、リゾパス・アルヒ
ズムス(Rhizopus arrhizus)、ムコール・ルキシー(Mucor rouxii)、リゾムコー
ル・プシラス(Rhizomucor pusillus)もしくはアブシディア・コリンビゲラ(Absi
dia corymbigera)などの動物真菌類病原体、または灰色かび病菌(Botrytis cine
rea)、うどんこ病菌(Erysiphe graminis)、イネいもち病菌(Magnaporthe grisea
)、コムギ赤さび病菌(Puccinia recodita)、コムギ葉枯病菌(Septoria triticii
)、オオムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia controversa)、黒穂病菌(Ustilago may
diss)などの植物真菌類病原体、または上記種の属に該当するあらゆる種を含む)
の野生型または他の非GRACE株において発現させる。
【０１７０】 本発明のアンチセンスヌクレオチド配列を含む核酸分子は、標的遺伝子mRNAの
コードおよび/または非コード領域に相補的であり得る。アンチセンス分子は、
相補的標的遺伝子mRNA転写物に結合し、翻訳を低下させるかまたは予防する。絶
対的相補性は、好ましいが必須ではない。本明細書でいうRNAの一部に「相補的な
」配列は、該RNAとハイブリダイズして、安定した二本鎖を形成するのに充分な相
補性を有する配列を意味する；二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖DNAの一
本鎖をこのようにテストできるか、または三重らせん形成をアッセイできる。ハ
イブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に
依存する。当業者は、標準的手順を使用してミスマッチの許容程度を確認して、
ハイブリダイズされた複合体の融点を決定できる。
【０１７１】 メッセージの5'端(例えば、AUG開始コドンまでを含む5'非翻訳配列)に相補的
な核酸分子は、翻訳を阻害するのに最も効率的に作用するはずである。しかし、
mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も同様に、mRNAの翻訳を阻害するのに有効で
あることが最近示された。Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335を全般的に参
照のこと。
【０１７２】 mRNAの5'非翻訳領域に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子は、AUG開始
コドンの相補配列を含むことができる。mRNAコード領域に相補的なアンチセンス
核酸分子は、それほど効率的でない翻訳阻害剤であるが、本発明に従って使用で
きる。標的遺伝子mRNAの5'-、3'-またはコード領域にハイブリダイズするように
設計されたか否かに関わらず、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの
長さを有し、6〜約50ヌクレオチドの長さにわたるオリゴヌクレオチドであるこ
とが好ましい。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオ
チド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌ
クレオチド、または少なくとも200ヌクレオチドである。
【０１７３】 標的遺伝子配列の選択に関係なく、in vitro調査をまず行って、遺伝子発現を
阻害するアンチセンス分子の能力を定量することが好ましい。これらの調査では
、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生物学的影響とを区
別する対照を利用することが好ましい。また、これらの調査では、標的RNAまた
はタンパク質のレベルを、内部対照RNAまたはタンパク質のレベルと比較するこ
とが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果
を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られたものと比較することが想定される
。対照オリゴヌクレオチドがテストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列との特異的ハイブリダイゼ
ーションを予防するのに必要なだけアンチセンス配列と異なることが好ましい。
【０１７４】 アンチセンス分子は、一本鎖または二本鎖の、DNA、RNAもしくはキメラ混合物
、またはそれらの誘導体もしく改変体であり得る。アンチセンス分子は、塩基部
分、糖部分、またはリン酸骨格において改変されて、例えば、分子、ハイブリダ
イゼーションなどの安定性を向上させる。アンチセンス分子は、ペプチド(例え
ば、細胞受容体をin vivoで標的化するため)、ハイブリダイゼーション誘発型切
断薬物(例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976を参照)、または挿入
剤(intercalating agents)(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549を参照)
などの他のさらなる群を含み得る。この目的のために、アンチセンス分子を別の
分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイ
ブリダイゼーション誘発型切断剤など)とコンジュゲートしてもよい。
【０１７５】 アンチセンス分子は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラ
シル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、
5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル
-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、
1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニ
ン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7
-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-
チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウ
ラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラ
シル-5-オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、プソイドウラシル
、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル
、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル
、ウラシル-5-オキシ酢酸(ｖ)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-
カルボキシプロピル)ウラシル、(acp.3)w、および2,6-ジアミノプリンを含むが
これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変型塩基部分を含み
得る。
【０１７６】 アンチセンス分子はまた、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロ
ースおよびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくと
も１つの改変型糖部分も含む。
【０１７７】 さらに別の実施形態では、アンチセンス分子は、ホスホロチオエート、ホスホ
ロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミダイト、ホスホロジ
アミダイト、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルム
アセタールまたはそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの改
変型リン酸骨格を含む。
【０１７８】 さらに別の実施形態では、アンチセンス分子は、α-アノマーオリゴヌクレオ
チドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβユニットとは逆に、
鎖が互いに対して平行に延びる相補的RNAと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを
形成する(Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641)。オリゴヌクレオ
チドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6
131-6148)、またはキメラRNA-DNA類似体(Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215:327-3
30)である。
【０１７９】 本発明のアンチセンス分子は、例えば自動化DNA合成器(これらは、Biosearch
、Applied Biosystemsなどから市販されている)を使用して、当該技術分野で公
知の標準的な方法により合成され得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドはSteinら(1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)の方法により合成でき、
メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された多孔性ガラス高分子支持体
などを使用して調製できる(Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85
:7448-7451)。
【０１８０】 標的遺伝子のコード領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用できる一
方で、転写された非翻訳領域に相補的なものも好ましい。
【０１８１】 薬学上許容される担体中に有効量のアンチセンス核酸を含む本発明の医薬組成
物を、対象とする病原体に感染した被検体に投与できる。
【０１８２】 病原体により生じる特定の疾患の治療に有効なアンチセンス核酸の量は、感染
部位または症状に応じ、標準的な技術により決定できる。可能であれば、治療し
ようとする病原体のアンチセンス細胞毒性をin vitroで測定し、その後、ヒトで
テストおよび使用する前に有用な動物モデル系で測定することが望ましい。
【０１８３】 アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するための多数の方法が開発されてき
た。例えば、アンチセンス分子を、病原体が存在する組織部位に直接注射しても
よいし、または所望の細胞を標的化するように設計された改変型アンチセンス分
子(例えば、病原体の細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合
するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス分子)を全身投与してもよい。
アンチセンス分子は、送達複合体を介して所望の細胞集団に送達できる。特定の
実施形態では、標的遺伝子のアンチセンス核酸を含む医薬組成物を、生体高分子
(例えばポリ-β-1→4-N-アセチルグルコサミンポリサッカリド)、リポソーム、
微粒子またはマイクロカプセルを介して投与する。本発明の様々な実施形態では
、このような組成物を使用して、アンチセンス核酸の持続性放出を得ることが有
用であるかもしれない。特定の実施形態では、特異的な同定可能な病原体抗原に
特異的な抗体を介して標的化したリポソームを利用することが望ましいかもしれ
ない(Leonettiら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2448-2451；Renne
isenら, 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342)。
【０１８４】5.4.6 リボザイム分子 リボザイムはRNAの特異的な切断を触媒することが可能な酵素性RNA分子である
（総説として、例えば、Rossi, J., 1994, Current Biology 4:469-471参照）。
リボザイムの作用機構は、リボザイム分子と相補的な標的RNAとの配列特異的ハ
イブリダイゼーションと、それに次ぐ、内ヌクレオチド結合分解性(endonucleol
ytic)切断を伴う。リボザイム分子の構成は、標的遺伝子mRNAに相補的な１つ以
上の配列を含まなければならず、またmRNA切断に携わる既知の触媒配列を含まな
ければならない。この配列については、参照により全文を本明細書に組み入れる
、米国特許第5,093,246号を参照されたい。従って、標的遺伝子タンパク質をコ
ードするRNA配列の特異的且つ効果的な内ヌクレオチド結合分解性切断を触媒す
る、改変ハンマーヘッド型リボザイム分子は、本発明の範囲内である。
【０１８５】 特異的な標的遺伝子mRNA転写産物を触媒的に切断するよう設計されたリボザイ
ム分子はまた、標的遺伝子mRNAの翻訳および標的遺伝子の発現を抑制するために
も使用されうる。特異的な認識配列部位でmRNAを切断するリボザイムが標的遺伝
子mRNAを破壊するために使用されうる場合、ハンマーヘッドリボザイムが好まし
い。ハンマーヘッドリボザイムは、標的遺伝子mRNAと相補的な塩基対を形成する
領域との隣接によって指定される位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件は、標
的mRNAが次の2塩基、すなわち5'-UG-3'の配列を持つことだけである。ハンマー
ヘッドリボザイムの構築と産生は当技術分野でよく知られており、Haseloffおよ
びGerlach, 1988, Nature, 334:585-591において、より完全に記載されている。
効率を増加させ、機能を持たないmRNA転写産物の細胞内蓄積を最小にするために
、切断認識部位は標的遺伝子mRNAの5'末端付近に位置することが好ましい。
【０１８６】 本発明のリボザイムはまた、Tetrahymena thermophilaに本来存在し（IVSまた
はL-19 IVS RNAとして知られる）、Thomas Cechおよび共同研究者らによって広
範にわたって記述された（Zaugら、1984, Science, 224:574-578; ZaugおよびCe
ch, 1986, Science, 231:470-475; Zaugら、1986, Nature, 324:429-433; Unive
rsity Patents Inc.によって発表された国際出願番号WO88/04300; BeenおよびCe
ch, 1986, Cell, 47:207-216）ようなRNAエンドリボヌクレアーゼ（以下、「Cec
h型リボザイム」）をも含む。Cech型リボザイムは、標的RNA配列とハイブリダイ
ズし、その後標的RNAの切断を起こす、8塩基対の活性部位を持つ。本発明は、標
的遺伝子に存在する8塩基対の活性部位配列を標的とするそれらのCech型リボザ
イムを包含する。
【０１８７】 アンチセンス法の場合と同様に、リボザイムは（例えば、改善された安定性、
ターゲッティングなどのために）改変されたオリゴヌクレオチドで構成すること
ができ、in vivoにおいて標的遺伝子が発現している細胞に送達されるべきであ
る。アンチセンス分子とは異なりリボザイムは触媒であるため、その効果のため
により低い細胞内濃度しか必要としない。異なる標的遺伝子に対する複数のリボ
ザイム分子もまた、連続してまたは同時に組み合わせて用いることができる。
【０１８８】 本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、あるいは三重らせん分子は
、DNAおよびRNA分子の合成のために当技術分野で知られている任意の方法によっ
て調製されうる。これらは、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成などの、当
技術分野において既知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌク
レオチドを化学合成するための技術を含む。別の方法としては、アンチセンスRN
A分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivoでの転写によって、RNA分子
を生成することができる。T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なR
NAポリメラーゼプロモーターを組み込んだ各種のベクターに、このようなDNA配
列を組み込むことができる。別の方法としては、用いられるプロモーターに依存
して構成的または誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスDNA構築物を
、細胞株に安定して導入することができる。これらの核酸構築物を、送達複合体
を介して望ましい細胞集団に選択的に投与することができる。
【０１８９】 細胞内における安定性または半減期を増大させる手段として、DNA分子に既知
の様々な改変を導入することができる。実施可能な改変は、分子の5'末端および
/または3'末端にリボもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を付加する
こと、或いは、オリゴデオキシリボヌクレオチド骨格中のホスホジエステラーゼ
結合よりむしろホスホロチオエートまたは2'O-メチルを使用することを含むが、
それに限定されるものではない。
【０１９０】5.5 スクリーニングアッセイ 下記のアッセイは、標的遺伝子産物、標的遺伝子産物と相互作用する他の細胞
内タンパク質、および標的遺伝子産物と他の細胞内タンパク質との相互作用を妨
げる化合物に結合する化合物を同定するために考案された。このような方法によ
って同定される化合物は、本発明の標的遺伝子によってコードされるポリペプチ
ドの活性を調節する（すなわち、その化合物の非存在下で観察される活性と比べ
て、その活性を増加または減少させる）化合物を含む。あるいは、このような方
法によって同定される化合物は、そのポリヌクレオチドの発現を調節する（すな
わち、その化合物の非存在下で観察される発現レベルと比べて、発現を増加もし
くは減少させる）、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる発現産物
の安定性を増加もしくは減少させる化合物を含む。本発明の方法によって同定さ
れるような化合物は、それらの活性・発現を調節する能力について、当業者にお
いて既知の標準的なアッセイを用いて調べることができる。
【０１９１】 従って、本発明は、遺伝子産物の活性またはレベルを調節する化合物を同定す
るための多数の化合物のスクリーニングを含む、抗カビ化合物の同定のための方
法を提供する。当該の遺伝子産物は、配列番号1〜61からなる群から選択された
ヌクレオチド配列、またはSaccharomyces cerevisiaeにおいて天然に存在するヌ
クレオチド配列、および、配列番号1〜61からなる群からから選択されたヌクレ
オチド配列を持つオーソログ遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされてい
る。
【０１９２】5.5.1 in vitroでのスクリーニングアッセイ 本発明の標的遺伝子産物に結合できる化合物を同定するために、in vitroでの
システムが設計された。この方法で同定された化合物は、例えば、野生型および
/または突然変異の標的遺伝子産物の活性を調節するために有用であり、標的遺
伝子産物の生物学的機能を解明するために有用であり、正常な標的遺伝子産物の
相互作用を妨げる他の化合物を同定するためのスクリーニングに利用され、また
は、このような相互作用の阻害のためにそれ自体有用である。
【０１９３】 標的遺伝子産物に結合する化合物を同定するために用いたアッセイの原理は、
２つの成分が相互作用して結合し、その後、反応混合物から除去および／または
検出される複合体を形成しうる十分な時間および条件下で、標的遺伝子産物と試
験化合物を含む反応液を調製することを含む。これらのアッセイは、様々な方法
で行われる。例えば、1つの方法は、標的遺伝子産物または検体を固相上へ固着
させ、分子間の結合反応を介して、反応終末に固相に固定した標的遺伝子産物/
試験化合物複合体を検出することを含む。そのような方法の1つの実施形態では
、標的遺伝子産物は固体表面上へ固着され、固着されていない試験化合物は直接
的または間接的のいずれかで標識される。
【０１９４】 実際には、マイクロタイタープレートが固相として簡便に利用される。固定化
される成分は、非共有または共有結合によって固定される。非共有結合は、単に
固体表面をタンパク質の溶液で覆い、覆われた表面を乾燥することによって行わ
れうる。あるいは、固定化されるタンパク質に特異的な固定された抗体、望まし
くはモノクロナール抗体が、固相表面にタンパク質を固定させるために用いられ
る。表面を調製して保存する。
【０１９５】 かかるアッセイを行うために、固定されていない成分は、固定された成分を維
持する被覆表面に添加される。反応が完了した後、形成された任意の複合体が固
相表面に固定されたまま残るような条件下で、（例えば洗浄によって）反応して
いない成分が除去される。固相表面に固定された複合体の検出は様々な手段で行
われる。前述の固定されていない成分が事前に標識されている場合、表面上に固
定された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。前述の固定されていない
成分が事前に標識されていない場合、表面上に固定された複合体を検出するため
に、間接的な標識が用いられる。例えば、前述の固定されていない成分に特異的
な標識抗体が用いられる（抗体自身は、直接標識されるか、または標識抗Ig抗体
で間接的に標識される）。
【０１９６】 あるいは、反応は液相で行われ、反応生成物は反応しなかった成分から分離さ
れ、複合体が検出される。例えば、溶液中で形成された複合体を固定するための
、標的遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定化抗体、および、固着された
複合体の検出を可能にするための、複合体の他方の成分に特異的な標識二次抗体
が用いられる。
【０１９７】5.5.1.1 標的遺伝子産物と相互作用するタンパク質のためのアッセイ タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために適切な任意の方法は、新し
い標的タンパク質と細胞あるいは細胞外タンパク質との相互作用を特定するため
に使用されうる。
【０１９８】 本発明の標的遺伝子産物はin vivoで、１つ以上の細胞性のあるいは細胞外の
タンパク質のような高分子と相互作用する。このような高分子は、上述の方法で
同定された核酸分子およびタンパク質を含むが、それに限定されるものではない
。これを論述するために、このような細胞性および細胞外の高分子は本明細書で
は「結合パートナー」と呼ぶ。このような相互作用を阻害する化合物は、標的遺
伝子タンパク質、特に突然変異の標的遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有
用でありうる。このような化合物は、上述されたような、抗体、ペプチドなどの
分子を含むが、それに限定されるものではない。
【０１９９】 標的遺伝子産物とその細胞性もしくは細胞外の結合パートナーとの相互作用を
阻害する化合物を同定するために用いられたアッセイ系の基本原理は、双方が相
互作用して結合し、その後、複合体を形成しうるのに十分な時間および条件下で
、標的遺伝子産物と結合パートナーとを含む反応混合物を調製することを含む。
ある化合物の阻害活性を調べるために、反応混合物はその試験化合物を含むもの
と含まないものが調製される。試験化合物は初めから反応混合物に含まれている
かまたは、標的遺伝子産物とその細胞性もしくは細胞外の結合パートナーの添加
に続いて加えられる。対照の反応混合物は試験化合物なしでインキュベートされ
る。標的遺伝子タンパク質と細胞性または細胞外の結合パートナーとの間での複
合体の形成は、その後検出される。対照反応混合物で複合物が形成され、試験化
合物を含む反応混合物では形成されないことは、その化合物が標的遺伝子タンパ
ク質とそれに相互作用する結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
加えて、試験化合物と正常な標的遺伝子タンパク質を含む反応混合物中での複合
体形成は、また、試験化合物と突然変異の標的遺伝子タンパク質を含む反応混合
物中での複合体形成と比較されうる。この比較は、正常な標的遺伝子産物ではな
く突然変異を含む分子間相互作用を阻害する化合物を同定することが望ましい場
合に、重要でありうる。
【０２００】 標的遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を阻害する化合物のためのアッ
セイは、異種のまたは同種の形式のいずれかで実施される。異種アッセイは、固
相上に標的遺伝子産物または結合パートナーのいずれかを固定させ、反応の後に
固相上に固定された複合体を検出することを含む。同種アッセイでは、反応のす
べては液相で行われる。いずれの方法でも、反応物の添加の順序は、調べる化合
物に関する異なる情報が得られるように変更される。例えば、標的遺伝子産物と
結合パートナーとの間の相互作用を、例えば競合によって、阻害する試験化合物
は、試験物質の存在下で反応を行うことによって、すなわち標的遺伝子産物およ
び相互作用する細胞性または細胞外の結合パートナーより先に、あるいはそれと
同時に試験物質を反応混合物に添加することによって、同定される。代わりに、
既に形成された複合体を阻害する試験化合物、例えば複合体の構成要素の1つと
置換するようなより高い結合定数を持つ化合物は、複合体が形成された後、試験
化合物を反応混合物に添加することによって調べられる。様々な形式は以下に簡
潔に記述される。
【０２０１】 異種アッセイ系において、標的遺伝子タンパク質または相互作用性細胞性もし
くは細胞外結合パートナーのいずれかを固体表面に固定し、一方で固定していな
い種を直接または間接的に標識する。実際には、マイクロタイタープレートを用
いるのが便利である。固定化種を非共有結合的または共有結合的接着のいずれか
によって固定する。非共有結合的吸着は、単に固体表面を標的遺伝子産物または
結合パートナーの溶液でコートし、そしてコートした表面を乾かすことによって
達成される。あるいは、固定化される種に特異的な固定化抗体を用いて、種を固
体表面に固定する。表面はあらかじめ準備し、保存しておく事ができる。
【０２０２】 アッセイを行うために、固定化種のパートナーを試験化合物と共にまたはそれ
なしでコート化表面に曝露する。反応終了後、未反応成分を除去し（例えば洗浄
によって）、そして形成したいかなる複合体も固体表面に固定されて維持される
ようにする。固体表面に固定された複合体の検出はいくつかの方法で達成される
。非固定化種が予め標識化されている場合、表面に固定化された標識の検出は複
合体が形成されたことを示す。非固定化種が予め標識化されていない場合、間接
的標識を用いて表面に固定化された複合体を検出するようにする。例えば、最初
に固定化していない種に特異的な標識化抗体を用いる（抗体を次に、標識化抗Ig
抗体で直接的に標識化または間接的に標識化する）。反応成分の添加の必要性に
よって、複合体形成を阻害するまたは既に形成した複合体を破壊させる試験化合
物が検出される。
【０２０３】 あるいは、反応を、試験化合物の存在下または非存在下で液相中で行い、反応
産物を未反応成分および検出された複合体から分離する（例えば、結合化合物の
１つに特異的な固定化抗体を用いて、液体中で形成されたあらゆる化合物も固定
するようにし、そして２番目に、他のパートナーに特異的な標識化抗体を用いて
固定化化合物を検出するようにする）。再び、液層に反応物を添加する必要性に
よって、化合物形成を阻害するまたは既に形成した複合体を破壊させる試験化合
物を同定する。
【０２０４】 本発明の別の実施形態において、同種アッセイを用いることができる。この研
究方法において、標的遺伝子タンパク質と相互作用的細胞性または細胞外結合パ
ートナーとの既に形成した複合体を準備し、ここで標的遺伝子産物またはその結
合パートナーは標識されており、しかし、該標識によって生じるシグナルは、複
合体形成のために消失する（例えば、この研究方法をイムノアッセイに用いてい
るRubensteinによる米国特許第4,109,496号を参照）。既に形成した複合体由来
の種の１つに競合し置換する試験物質の添加は、バックグラウンド以上のシグナ
ルを生じる結果となる。この方法において、標的遺伝子タンパク質／細胞性また
は細胞外結合パートナー相互作用を破壊させる試験物質を同定する。
【０２０５】 特定の実施形態において、前記の組換えDNA技術を用いて固定化のために標的
遺伝子産物を準備する。例えば、標的遺伝子コード領域を融合ベクターを用いて
、pGEX-5X-1のようなグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子と融合
させると、得られる融合タンパク質においてその結合活性が維持される。当技術
分野で日常的に行われている前記の方法を用いて、相互作用的細胞性または細胞
外結合パートナーを精製し、そしてモノクローナル抗体を作出するために用いる
。例えば、当技術分野で日常的に行われている方法によって抗体を放射性同位体 125 Iで標識する。異種アッセイにおいて、例えばGST標的遺伝子融合タンパク質
はグルタチオン−アガロースビーズに固定される。次に、相互作用的細胞性また
は細胞外結合パートナーを、相互作用および結合を起こす方法で試験化合物の存
在下または非存在下において加える。反応時間の終わりに、非結合物質を洗い去
り、そして標識化モノクローナル抗体を該系に加え、そして合成化合物に結合す
るようにする。標的遺伝子タンパク質および相互作用的細胞性または細胞外結合
パートナー間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと結合した残存す
る放射能の量の測定によって検出する。試験化合物による相互作用の阻害が成功
すると、結果として測定した放射能が減少する。
【０２０６】 あるいは、GST標的遺伝子融合タンパク質および相互作用的細胞性または細胞
外結合パートナーを、固相グルタチオン−アガロースビーズの存在しない液体中
で共に混合する。試験化合物を、種が相互作用する際またはその後に加える。こ
の混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加え、そして非結合物質を洗い去
る。再び標的遺伝子産物／結合パートナー相互作用の阻害の程度を標識化抗体の
添加およびビーズに結合した放射能の測定により検出する。
【０２０７】 本発明の別の実施形態において、全長タンパク質の１つまたは両方の代わりに
、標的遺伝子産物および／あるいは相互作用的細胞性または細胞外結合パートナ
ー（結合パートナーがタンパク質である場合において）の結合領域に対応するペ
プチド断片を用いて、これらの同様の技術が使用される。当技術分野で日常的に
行われている方法のいくつかは結合部位の同定および単離に用いられる。これら
の方法はタンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異および免疫共沈降アッ
セイにおける結合の破壊に対するスクリーニングを含むが、しかしこれに限定さ
れない。次に、複合体中の２番目の種をコードする遺伝子における補完性の突然
変異を選抜する。各々のタンパク質をコードする遺伝子の配列解析は、相互作用
的結合に含まれるタンパク質の領域に対応する突然変異を示す。あるいは、上記
の方法を用いて１つのタンパク質を固体表面に固定し、そしてトリプシンなどの
タンパク質分解酵素で処理したその標識化結合パートナーと相互作用および結合
させるようにする。洗浄の後、結合領域を含む短い標識化ペプチドは固相物質に
結合して残留し、そしてアミノ酸配列によって単離および同定することができる
。また、細胞性または細胞外結合パートナーをコードする遺伝子を一度得れば、
短い遺伝子断片を遺伝子操作することにより、タンパク質のペプチド断片を発現
させるようにし、それらを結合活性について試験し、そして精製または合成する
。
【０２０８】 例えば、限定するわけではないが、GST標的遺伝子融合タンパク質を作製し、
グルタチオンアガロースビーズへの結合させることにより標的遺伝子産物を上述
のように固相物質に固定させる。相互作用的細胞性または細胞外結合パートナー
を35Sなどの放射性同位体で標識し、トリプシン等のタンパク質分解酵素で切断
する。切断産物を固定化GST標的遺伝子融合タンパク質に加え、結合させる。非
結合ペプチドを洗い去った後、標識化結合材料で細胞性または細胞外結合パート
ナー結合領域に相当するものを溶出、精製し、そして周知の方法によりアミノ酸
配列を解析する。このように同定されたペプチドを周知の組換えDNA技術を用い
て、合成的に生成または適切な容易なタンパク質に融合する。
【０２０９】５．５．１．２ コンビナトリアルケミストリーライブラリーのスクリーニング 本発明の１つの実施形態において、本発明の方法を用いて同定された菌類の遺
伝子によってコードされるタンパク質を単離および発現させる。次にこれらの組
換えタンパク質をアッセイの標的として用い、潜在的な薬物候補のための化合物
のライブラリーをスクリーニングする。化学ライブラリーの作製は当技術分野に
おいて公知である。例えば、コンビナトリアルケミストリーはここに記述するア
ッセイにおいてスクリーニングするための化合物のライブラリーを作製するのに
用いる。コンビナトリアルケミストリーライブラリーは、複数の化学的「ビルデ
ィングブロック」試薬を結合させることにより化学合成または生物学的合成のい
ずれかで作製された種々の化合物の集団である。例えば、ポリペプチドライブラ
リーのような線状のコンビナトリアルケミストリーライブラリーは、所与の長さ
のペプチドを得るために考えられ得る全ての組み合わせにおいてアミノ酸を結合
させることで作られる。このような化学的ビルディングブロックの組合わせた混
合によって、理論上、無数の化学化合物を合成する事ができる。例えば、１人の
研究者は、100種の交換可能な化学ビルディングブロックの系統的な組み合わせ
の混合の結果、１億個の四量体化合物または100億個の五量体化合物の理論上に
おける合成を生じる事を認めた（Gallopら、"Application of Combinational Te
chnologies to Drug Discovery, Background and Peputide Combinatorial Libr
aries," Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 37, No. 9, 1233-1250（1994
））。当業者に知られている他の化学ライブラリーもまた用いてもよく、天然産
物ライブラリーも含む。
【０２１０】 一度作製したら、コンビナトリアルライブラリーを望ましい生化学的性質を有
する化合物に対してスクリーニングする。例えば、薬物としてまたは薬物を開発
するために有用となるであろう化合物は、上記のように同定、発現および精製し
た標的タンパク質と結合する能力を有するかも知れない。さらに、もし同定した
標的タンパク質が酵素であれば、候補化合物は標的タンパク質の酵素的性質を妨
害するかも知れない。例えば、標的タンパク質の酵素的機能は、プロテアーゼ、
ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、輸送タンパク質、転写酵素
、複製コンポーネントおよび既知または未知のあらゆるタイプの酵素として役立
ててもよい。従って、本発明は前述のタンパク質産物を用いて組み合わせ化学ラ
イブラリーをスクリーニングする事を意図する。
【０２１１】 本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質の生化学的活性と同様にタ
ンパク質が働く基質の化学的構造が知られている。本発明の他の実施形態におい
て、標的タンパク質の生化学的活性は未知であり、および標的タンパク質は既知
の基質を有さない。
【０２１２】 本発明のいくつかの実施形態において、化合物のライブラリーをスクリーニン
グして標的遺伝子産物の阻害剤として機能する化合物を同定するようにする。初
めに、当技術分野で周知の組み合わせライブラリー形成の方法を用いて小さな分
子のライブラリーを作出する。「所望の特性を有する化合物を自動的に作製する
ための系および方法（System and Method of Automatically Generating Chemic
al Compounds with Desired Propaties）」と題されたAgrafiotisらの米国特許
第5,463,564および5,574,656号の２つは（この開示は参考により全文を本明細書
に組み込まれる）これについて教示するものである。次に、ライブラリー化合物
をスクリーニングして、所望の構造的および機能的性質を有する化合物を同定す
る。米国特許第5,684,711号は(その開示が参照により全文を本明細書中に組み込
む)、ライブラリーのスクリーニングのための方法を述べている。
【０２１３】 スクリーニングの手順を説明すると、標的遺伝子産物、酵素およびライブラリ
ーの化合物を混合して、互いに相互作用可能とする。標識化基質をインキュベー
ションに加える。基質の標識は、代謝された基質分子から放出されて検出可能で
ある。シグナルの放出は、コンビナトリアルライブラリーの化合物の非存在下で
放出されるシグナルと比較することにより、標的酵素の酵素活性におけるコンビ
ナトリアルライブラリーの化合物の効果を測定することを可能にする。各々のラ
イブラリー化合物の特徴を符号化し、酵素に対する活性を示す化合物を解析する
事ができ、そして同定された多様な化合物に共通の性質を特定することができ、
そしてライブラリーの更なる相互作用に結び付ける事ができる。
【０２１４】 一度化合物のライブラリーをスクリーニングすれば、標的酵素に対する活性を
有すると初回のスクリーニングで示された性質を有する化学ビルディングブロッ
クを用いて次のライブラリーを作製する。この方法を用いて、酵素に対して高い
特異性を有する一群の酵素阻害剤が見つかるまで、候補化合物を次々と反復する
と、標的酵素の機能を阻害するのに必要な構造的および機能的性質をより有する
ようになる。次に、これらの化合物を哺乳動物に用いるための抗生物質としての
それらの安全性および有効性に対してさらに試験することができる。
【０２１５】 この特定のスクリーニング方法がただの具体例であるということは、容易にわ
かるであろう。他の方法は当業者に周知である。例えば、標的タンパク質の生化
学的機能がわかっている場合、多数の天然に存在する標的についての多様なスク
リーニング技術が知られている。例えば、いくつかの技術は、薬物リード物質を
同定および開発するために、標的タンパク質を生化学的および遺伝子学的に調べ
、そして解析するための小さなポリペプチドの生成して利用することを含む。こ
のような技術はPCT国際公開WO9935494、WO9819162、WO9954728に記述されている
方法を含み、この開示は参照によって全文を本明細書に組み込むものとする。
【０２１６】 同様の方法を、ここに記述したCandida albicans標的タンパク質と相同的なCa
ndida albicans以外の生物由来のタンパク質の活性を阻害する化合物を同定する
ために用いてもよい。例えば、タンパク質はAspergillus fumigatus、Aspergill
us niger、Aspergillus flavis、Candida tropicalis、Candida parapsilopsis
、Candida krusei、Cryptococcus neoformans、Coccidioides immitis、Exophal
ia dermatiditis、Fusarium oxysporum、Histoplasma capsulatum、Phneumocyst
is carinii、Trichosporon beigelii、Rhizopus arrhizus、Mucor rouxii、Rhiz
omucor pusillusもしくはAbsidia corymbigeraのような動物真菌病原体、または
Botrytis cinerea、Erysiphe graminis、Magnaporthe grisea、Puccinia recodi
ta、Septoria triticii、Tilletia controversa、Ustilago maydisのような植物
真菌病原体、あるいはあらゆる上記の種の属の中に含まれるあらゆる種由来のも
のでもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質はSaccharomyces cerevi
siae以外の生物由来である。
【０２１７】５．５．１．３ In vitro酵素アッセイ 細胞の生存活性に不可欠であることが示される生化学的活性のin vitroアッセ
イを開発するためにGRACE法および株を用いた。GRACEの条件下での発現方法によ
って同定されるいくつかの不可欠な遺伝子は、他の生物由来の生化学的に特性解
析された遺伝子産物との統計的に重要な類似性を示す。例えば、アミノ酸配列の
類似性に基づくと、表IIに列挙したいくつかの不可欠な菌類特異的遺伝子が以下
の生化学的活性を有する事が予想される。
【０２１８】 CaRHO1 (1,3)-β-グルカン合成および極性に関与するGTPase CaYHR118c(ORC6) 複製起点複合体のサブユニット CaYPL128c(TBP1) テロメア結合タンパク質 CaYNL256w ジヒドロプテロエート合成酵素 CaYKL004w(AUR1) ホスファチジルイノシトール：セラミドホスホイノシトール
転移酵素 CaYJL090c(DPB11) DNA polBサブユニット CaYOL149w(DCP1) mRNAデキャッピング酵素 CaYNL151c(RPC31) RNA polIIIサブユニット CaYOR148c(SPP2) RNAスプライシング CaYER026c(CHO1) ホスファチジルセリン合成酵素 従って、いくつかのよく特性解析された標準的なin vitro生化学的アッセイ（
例えば、DNA結合、RNA修飾、GTP結合および加水分解ならびにリン酸化）は容易
にこれらの効果的な薬物標的に適応される。例えば効果的な標的であるCaRHO1は
、広範なかかるタンパク質のために開発された標準的なGTPaseアッセイを適用す
ることによりin vitroに基づく薬物スクリーニングに用いられる。あるいは、我
々のGRACE株の集団中の効果的な薬物標的と関係する生化学的情報を用いた新規
のアッセイが開発される。当技術分野で知られている、同様の生化学的活性（例
えば、作用機構、基質の種類）を有する酵素についてのあらゆるアッセイが、こ
れらの必須なC. albicans遺伝子によってコードされる酵素の阻害剤のスクリー
ニングに適応される。
【０２１９】 例えば、多数の性質により、C. albicans遺伝子であるCaTBF1がin vitroアッ
セイ開発の候補となる。CsTBF1はS. cerevisiaeにおける対応物であるテロメア
結合因子TBF1と重要な相同性を共有する。さらに、CaTBF1pが認識するDNA配列は
既知であり、比較的短く（Koeringら、Nucleic Acid Res. 28:2519-2526、参照
として全文を本明細書に組み込むものとする）、このエレメントに対応するオリ
ゴヌクレオチドの安価な合成を可能にする。さらに、このアッセイに必要なのは
標的タンパク質およびこれを認識するヌクレオチド配列を含むDNA断片のみであ
るため、CaTBF1pタンパク質の精製だけがin vitro結合アッセイを開発するため
に必要である。このin vitroアッセイの１つの好適な実施形態は、DNAエレメン
トのウエルの底への交差結合、タンパク質−DNA結合を促進するための放射性標
識化CaTBF1pのインキュベート、非結合材料の除去のための一連の洗浄、および
結合した放射性標識化CaTBF1pの割合の測定を含む。あるいは、精製したCaTBF1p
をウエルに付着させ、そして放射性標識化オリゴヌクレオチドを加える。薬物ス
クリーニングはハイスループットスクリーニング技術の使用を含み、このアッセ
イにおいて測定されるタンパク質−DNA結合を阻害する化合物の検索によって実
施される。
【０２２０】 同様に、第２の有効な薬物標的であるCaORC6をこのタイプのアッセイに用いる
。というのは、このS. cerevisiaeのホモログであるORC6が酵母染色体の複製起
点の中のDNAエレメントに直接結合するためである（Mizushimaら、2000, Genes
& Development 14:1631-1641、参考により全文を本明細書に組み込むものとする
）。これらのあらゆる標的の生化学的精製も可能であり、例えば、C. albicans
のヘテロ接合体株のPCRに基づく構築物によるもので、そのCaORC6タンパク質を
コードする遺伝子は炭素末端ヘキサヒスチジンタグを含むように修飾されており
、標準的なNi+2アフィニティーカラムクロマトグラフィー技術を用いたキメラタ
ンパク質の精製を可能にする。
【０２２１】 CaDPB11様の他の標的については、S. cerevisiaeにおけるホモログはSld2pと
物理的に結合するタンパク質をコードし（Kamimuraら、1998, Cell Biol. 18:61
02-6109、参考により全文を本明細書に組み込むものとする）、前述のものと同
様のin vitroアッセイを開発する。さらに、既知の物理的相互作用に基づいたツ
ーハイブリッドアッセイはGRACE株の集団におけるあらゆる確認された標的のた
めに開発される。
【０２２２】 本発明はまた、好適な生化学的標的のためのin vitroアッセイの確立において
有用な細胞抽出物を提供する。例えば、本発明の実施形態において、GRACEによ
り得られるC. albicans株を恒常的発現条件下または転写抑制条件下のいずれか
で増殖させ、過剰生産または特定の遺伝子産物を減少させるようにする。これら
の２つの条件下でインキュベートした株から生じた細胞抽出物を同様に増殖させ
た野生型株から調製した抽出物と比較する。次に、これらの抽出物を標的の迅速
な評価のために用いるが、それには、遺伝子産物を精製することなく、既存のin
vitroアッセイまたは新規の遺伝子産物に対する新しいアッセイを用いる。in v
itroアッセイ開発のためのこのような全細胞抽出物研究方法は、細胞壁生合成経
路（例えば、(1,3)-β-グルカン合成またはキチン合成）に含まれる標的（機能
的活性に必要とされる不可欠な翻訳後修飾を受ける前に分泌経路を通過する複数
の遺伝子産物を含む）のために特に不可欠である。これらまたは他の細胞壁経路
（例えば(1,6)-β-グルカン合成）に関与する標的遺伝子の条件付き発現のため
のGRACEに由来する株は、C. albicansにおいて直接実行されるin vitroアッセイ
を可能にする。
【０２２３】５．５．２ 細胞に基づいたスクリーニングアッセイ 薬物の発見および開発に向けた化合物の確認または特性決定に使用される現在
の細胞に基づいたアッセイは、被験化合物が細胞内または細胞表面に存在する標
的分子の活性を調節する能力の検出に依存する場合が非常に多い。ほとんどの場
合、そのような標的分子は、酵素、受容体などのタンパク質である。しかし標的
分子には、DNA類、脂質、炭水化物ならびにメッセンジャーRNA類、リボソームRN
A類、tRNA類などのRNA類のような他の分子も含まれる。被験化合物と具体的な標
的分子との結合および相互作用の検出を行う上で、当業者は多くの高感度の細胞
に基づいたアッセイ方法を利用可能である。しかしこれらの方法は、被験化合物
が、親和性が中程度または低い標的分子と結合その他の相互作用を行う場合には
、一般的にあまり効果的ではない。さらに標的分子は、溶液で被験化合物に容易
に近づくことができない場合がある。それは例えば、標的分子が細胞内にある場
合または細菌細胞の周辺質のような細胞区画内にある場合である。従って、現在
の細胞に基づいたアッセイ方法には、標的と中程度または低い親和性で相互作用
する化合物または容易に近づけない標的と相互作用する化合物の確認または特性
決定には有効ではないという点で制限がある。
【０２２４】 本発明の細胞に基づいたアッセイ方法は、現在の細胞に基づいたアッセイに勝
る大きい長所を有する。その長所は、真菌の増殖、有毒性または病原性に必要な
少なくとも１種類の遺伝子産物(標的分子)のレベルまたは活性が、それの機能の
有無が真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性の律速段階となる程度まで
特異的に低下した感作細胞の使用に由来するものである。そのような感作細胞は
、影響された標的分子に対して活性な化合物に対してかなり感受性が高くなる。
例えば、感作細胞は、真菌の成長、生存、増殖、有毒性もしくは病原性に必要な
レベルの遺伝子産物を提供して、その機能の有無が真菌の成長、生存、増殖、有
毒性もしくは病原性の律速段階となる濃度の誘導因子または抑制因子存在下でGR
ACE株を成長させることで得られる。そこで本発明の細胞に基づいたアッセイは
、そのような化合物が非感作細胞に対してよりも感作細胞に対してかなり強力で
あることから、対象となる標的分子に対して低または中程度の効力を示す化合物
を検出することができる。その効果は、非感作細胞と比較して感作細胞で試験を
行った場合に、被験化合物が、２ないし数倍強力、少なくとも10倍強力、少なく
とも20倍強力、少なくとも50倍強力、少なくとも100倍強力、少なくとも1000倍
強力、または1000倍よりさらに強力となり得るようなものであることができる。
【０２２５】 一部には、病原菌における抗生物質耐性が認められるため、そしていくつかの
現在使用されている抗生物質に関連する強い副作用のため、新たな標的で作用す
る新規抗生物質が、当業界では切望されている。しかし、細胞に基づいたアッセ
イに関係する現行技術における別の限界として、同じ限られた種類の生体経路で
同じ種類の標的分子に対するヒット（hit）を繰り返し確認するという問題があ
る。新標的と比較して、「旧」標的で作用する化合物の方がより高頻度で遭遇し
、より強力であることから、それはそのような新たな標的で作用する化合物を廃
棄したり、無視したり、あるいは検出しない場合に生じ得る。その結果、現在使
用されている抗生物質の大半が、より限られた種類の生体経路内の比較的少数の
標的分子と相互作用する。
【０２２６】 本発明の感作細胞を使用することで、２通りの方法で上記の問題が解決される
。第一に、新標的であるか既知であるがほとんど利用されていない標的であるか
を問わず、対象となる標的で作用する所望の化合物を、本発明の感作細胞で試験
を行った場合に、そのような所望の化合物の効力における特異的かつ実質的な上
昇のため、「旧」標的で作用する化合物の「ノイズ」より上で検出することがで
きる。第二に、対象標的で作用する化合物に対して細胞を感作するのに使用され
る方法は、同じ生体経路内の他の標的分子で作用する化合物に対してその細胞を
感作させる場合もある。例えば、リボソームタンパク質の機能が真菌の成長、生
存、増殖、有毒性または病原性に対して律速となるようなレベルでのリボソーム
タンパク質をコードする遺伝子の発現は、そのリボソームタンパク質で作用する
化合物に対して、リボソームのいずれかの構成要素(タンパク質またはrRNA)で作
用する化合物に対して、あるいはさらにタンパク質合成経路の一部である標的で
作用する化合物に対して細胞を感作することが予想される。そこで、本発明の重
要な利点は、これまで薬物開発方法で容易に利用できなかった新たな標的および
経路を明らかできるという点である。
【０２２７】 本発明の感作細胞は、標的分子の活性またはレベルを低下させることで得られ
る。標的分子は、本明細書に記載の真菌の成長、生存、増殖、有毒性もしくは病
原性に必要な核酸から産生されるRNAまたはポリペプチドなどの遺伝子産物であ
ることができる。さらに標的は、本明細書に記載の真菌の成長、生存、増殖、有
毒性もしくは病原性に必要な核酸と同じ生体経路でのRNAまたはポリペプチドで
あることができる。そのような生体経路には、酵素的、生化学的および代謝的経
路ならびに細胞膜などの細胞構造の産生に関与する経路などがあるが、これらに
限定されるものではない。
【０２２８】 医化学および複合的化学の分野で現在使用されている方法は、直接結合アッセ
イおよび細胞に基づいたアッセイなどの各種生物アッセイでの化合物の試験から
得られる構造−活性相関データを利用することができる。場合により化合物を、
十分に強力なアッセイで直接、開発対象薬物として確認する。さらに多くの場合
、初回ヒット化合物は中程度または低い効力を示す。ヒット化合物が低または中
程度の効力を有することが示されたら、指向的化合物ライブラリーを合成し、試
験を行って、より強力な主導的化合物を確認する。その指向的ライブラリーは、
ヒット化合物と関連するが、各種構造的特徴の付加、削除および置換などの系統
的変更を有する構造を持った化合物からなる複合化学ライブラリーである。標的
分子に対する活性について試験をする場合、単独または他の特徴との組み合わせ
で活性を促進または低下させる構造的特徴を確認する。このデータを用いて、標
的分子に対する活性が高い化合物を含むその後の指向的ライブラリーを設計する
。このプロセスを１回または数回繰り返した後、標的分子に対してかなり高い活
性を有する化合物を確認し、薬物としてさらに開発することができる。選択され
た標的で作用する化合物はそのような細胞に基づいたアッセイで高い効力を示す
ことから、このプロセスは本発明の感作細胞を使用することで促進される。そこ
で、より多くの化合物の特性決定を行って、他の方法で得られると思われるより
多くの有用なデータを得ることができる。
【０２２９】 そこで、本発明の細胞に基づいたアッセイを用いて、以前には細胞に基づいた
アッセイを用いて容易に利用できなかった標的で作用する化合物など、これまで
は容易に確認および特性決定されなかったと考えられる化合物の確認または特性
決定を行うことが可能となる。同数の被験化合物の場合に、より多くの構造−機
能相関データが明らかになる可能性があることから、初期ヒット化合物から強力
な薬物に進展させるプロセスも、本発明の細胞に基づいたアッセイによって大幅
に改善される。
【０２３０】 この細胞感作方法には必ず、好適な遺伝子の選択がある。好適な遺伝子は、感
作される細胞の成長、生存、増殖、有毒性または病原性に発現が必要である遺伝
子である。次の段階は、標的のレベルまたは活性を、それが成長、生存、増殖、
有毒性または病原性の律速となるレベルまで低下させることができる細胞の取得
である。例えば細胞は、選択遺伝子が調節プロモーターの制御下にあるGRACE株
であることができる。選択遺伝子から転写されたRNAの量は、調節プロモーター
に作用することで、RNAのプロモーター推進転写の活性を変える誘発因子または
抑制因子の濃度を変えることによって制限される。そこで、選択遺伝子産物の機
能が真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性の律速となるほどのRNAレベ
ルを生じる誘発因子もしくは抑制因子濃度に細胞を曝露することで、その細胞を
感作する。
【０２３１】 細胞に基づいたアッセイの１実施形態では、本明細書に記載のCandida albica
nsの真菌成長、生存、増殖、有毒性もしくは病原性に必要な配列が調節プロモー
ターの制御下にあるGRACE株を、その配列がコードする遺伝子産物の機能が、真
菌の成長、生存、増殖、有毒性、または病原性の律速となるようにする濃度の誘
発因子もしくは抑制因子の存在下に成長させる。その目標を達成するため、真菌
増殖に必要な制限されたレベルの遺伝子産物によって生じる相当する成長阻害に
対して誘発因子または抑制因子の各種用量をプロットすることで、誘発因子また
は抑制因子の成長阻害用量曲線を計算する。この用量−応答曲線から、誘発因子
または抑制因子のない成長と比較して１〜100％の各種成長速度を与える条件を
決定することができる。例えば、調節プロモーターをテトラサイクリンによって
抑制する場合、GRACE株を各種レベルのテトラサイクリン存在下に成長させるこ
とができる。同様に、誘導性プロモーターを用いることができる。その場合、GR
ACE株を、各種濃度の誘発因子存在下に成長させる。例えば、成長速度をほとん
ど低下させない誘発因子または抑制因子の最高濃度を、前記用量−応答曲線から
推算することができる。細胞増殖は、OD測定による増殖培地濁度によってモニタ
リングすることができる。別の例では、成長を25％低下させる誘発因子または抑
制因子の濃度を、用量−応答曲線から予測することができる。さらに別の例では
、成長を50％低下させる誘発因子または抑制因子の濃度を、用量−応答曲線から
予測することができる。さらには、コロニー形成単位（cfu）などの別のパラメ
ータを用いて、細胞の成長、生存および／または生存率を測定する。
【０２３２】 本発明の別の実施形態では、個々の一倍体株を同様に、抗真菌薬または治療薬
の検出のための基礎として用いることができる。この実施形態では、試験微生物
(例：表Ｉに示したAspergillus fumigatus、Cryptococcus neoformans、Magnapo
rtha griseaまたは他の一倍体微生物)は、異種調節プロモーターを含むプロモー
ター置換フラグメントで組換えて、遺伝子発現を異種プロモーターによって条件
的に調節するようにすることで、１段階で標的遺伝子の単一対立遺伝子を修飾す
ることによって構築された株である。個々の二倍体GRACE株同様、感作単一倍体
細胞を全細胞に基づいたアッセイ法で用いて、影響された標的に対する優先的活
性を示す化合物を確認することもできる。
【０２３３】 各種実施形態において、異種プロモーターが比較的低レベルで発現される（す
なわち部分的に抑制）第１の組み合わせの条件下で成長させ、成長程度を測定す
る。この実験を被験化合物存在下に繰り返し、２回目の成長測定値を得る。そう
して、被験化合物の存在下および不在下での成長程度を比較して、第１の指標値
を得る。標的遺伝子が第１の組み合わせの条件よりかなり高いレベルで発現され
る非抑制成長条件を用いて、さらに２回の実験を行う。成長程度を、第２の組み
合わせの条件下に被験化合物の存在下および不在下にて測定して、第２の指標値
を得る。次に、第１および第２の指標値を比較する。指標値が実質的に同じであ
る場合、そのデータは被験化合物が試験標的を阻害しないことを示唆している。
しかし上記２つの指標値が実質的に異なる場合、データは標的遺伝子産物の発現
レベルが被験化合物による阻害程度を決定し得ることを示している。従って、遺
伝子産物がその被験化合物の標的である可能性が高い。複数の感作株の集団また
はサブセットを含む全細胞に基づいたアッセイも、例えば一連の96ウェル、384
ウェルまたは1586ウェル微量定量プレートでスクリーニングすることができ、各
ウェルには感作した個々の株を含有させて、真菌特異的、病原体特異的な所望の
生化学的機能、ヒト同族体、細胞局在および信号伝達カスケード標的セットから
なる群から選択される標的セットまたはサブセット（これらに限定されるもので
はない）を含む各影響を受けた標的に対して優先的活性を示す化合物を確認する
。
【０２３４】 アッセイ対象の細胞を、上記測定された濃度の誘発因子または抑制因子に曝露
する。この亜致死濃度での誘発因子または抑制因子の存在によって、増殖に必要
な遺伝子産物の量を、成長を支持する細胞において最低の量まで低下させる。従
って、この濃度の誘発因子または抑制因子存在下での細胞成長は、対象とする増
殖に必要なタンパク質またはRNAの阻害薬に対して、ならびに対象とする増殖に
必要なタンパク質またはRNAと同じ生体経路におけるタンパク質またはRNAの阻害
薬に対して特異的により感受性が高いが、無関係のタンパク質またはRNAの阻害
薬に対しては特異的に感受性が高くない。
【０２３５】 亜阻害濃度の誘発因子または抑制因子で前処理することで、増殖に必要な標的
遺伝子産物の量が低下している細胞を用いて、細胞成長を低下させる化合物のス
クリーニングを行う。誘発因子または抑制因子の亜致死濃度は、その遺伝子産物
が非律速である対照細胞より細胞が感受性が高い候補化合物を確認するためのア
ッセイの所期の使用と一致する濃度であることができる。例えば誘発因子または
抑制因子の亜致死濃度は、成長阻害が少なくとも約５％、少なくとも約８％、少
なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少
なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約75％、少なくとも80％、少な
くとも90％、少なくとも95％または95％強となるようにすることができる。前記
の方法を用いて前感作した細胞は、その細胞が野生型細胞より少ない標的タンパ
ク質を含むことから、標的タンパク質に対する感受性が高い。
【０２３６】 同様の方法を用いて、有毒性または病原性を阻害する化合物を確認することが
できることは明らかであろう。そのような方法では、有毒性または病原性に関与
する律速レベルの遺伝子産物を発現する候補化合物に曝露した細胞の有毒性また
は病原性を、遺伝子産物レベルが律速でない候補化合物に曝露した細胞の有毒性
または病原性と比較する。有毒性または病原性は、本明細書に記載の方法を用い
て測定することができる。
【０２３７】 本発明の細胞に基づいたアッセイの別の実施形態では、真菌の成長、生存、増
殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子産物のレベルまたは活性を、真菌の成長
、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な配列における温度感受性突然変異な
どの突然変異ならびに温度感受性突然変異との併用で、増殖に対して律速である
真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子産物レベルを提供
する誘発因子または抑制因子レベルを用いて低下させる。突然変異が真菌の成長
、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子におけるものである温度感受
性突然変異株の許容温度と制限温度の間の中間温度で細胞を成長させることで、
成長、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子産物の活性が低下した細
胞が得られる。誘発因子または抑制因子の濃度を選択して、真菌の成長、生存、
増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子産物の活性をさらに低下させる。増殖
に必要な遺伝子産物をコードする核酸の発現が低下し、許容温度と制限温度の間
の温度で成長する細胞が、真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性に必要
な遺伝子産物の発現が低下しておらず、許容温度で成長する細胞より、被験化合
物に対してかなり感受性が高いか否かを測定することで、温度感受性突然変異あ
るいは誘発因子または抑制因子単独を用いて認められなかった可能性のある薬物
を確認することができる。誘発因子または抑制因子単独あるいは温度感受性突然
変異単独を用いて以前に認められた薬物も、上記２種類の手法を組み合わせて細
胞で使用した場合に異なる感受性プロファイルを有する場合があり、その感受性
プロファイルは、遺伝子産物の１以上の活性の阻害における薬物のより特異的な
作用を示す場合がある。
【０２３８】 温度感受性突然変異は、遺伝子内の各種部位で局在する場合があり、タンパク
質の異なる領域内にある場合がある。例えば、大腸菌のdnaB遺伝子は、複製フォ
ークDNAへリカーゼをコードする。DnaBはオリゴマー化、ATP加水分解、DNA結合
、プライマーゼとの相互作用、DnaCとの相互作用およびDnaAとの相互作用のため
の領域などのいくつかの領域を有する。DnaBの各種領域における温度感受性突然
変異は、制限温度で各種表現型を与え、それにはDNA破壊を伴うまたは伴わないD
NA複製における突然の停止または緩やかな停止（Wechsler, J. A. and Gross, J
. D. 1971 Escherichia coli mutants temperature-sensitive for DNA synthes
is. Mol. Gen. Genetics 113 : 273-284）および成長または細胞死の終了などが
ある。従って、タンパク質の各種領域における温度感受性突然変異を、タンパク
質の発現が調節プロモーターの制御下にあるGRACE株と組み合わせて使用するこ
とができる。
【０２３９】 上記の方法を、真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子
産物の活性またはレベルを低下させるがなくすものではない突然変異を用いて行
うことができることは明らかであろう。
【０２４０】 真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子産物に対して抗
菌剤のスクリーニングを行う場合、その遺伝子産物を限られた量で含む細胞の成
長阻害、有毒性または病原性のアッセイを行うことができる。成長阻害は、実験
サンプルと対照サンプルの間で、未接種増殖培地と比較した培養物の光学密度に
よって測定される成長量を直接比較することで測定することができる。別の細胞
増殖アッセイ方法には、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター構築物放出の測
定、各種酵素的活性アッセイおよび当業界で公知の他の方法などがある。有毒性
および病原性は、本明細書に記載の方法を用いて測定することができる。
【０２４１】 上記の方法は、固相、液相、その２種類の培地の組み合わせまたはin vivoで
行うことが可能であることは明らかであろう。例えば、増殖に必要な遺伝子産物
を発現するのに用いられる調節プロモーターで作用する誘発因子または抑制因子
を含む栄養寒天で成長させた細胞を、寒天表面にスポット添加した化合物に曝露
させることができる。化合物の効果は、生じる殺菌ゾーンの直径、細胞が成長し
ない化合物添加箇所周囲の面積から判定することができる。複数の化合物を寒天
プレートに移し、多チャンネルピペット（例：Beckman Multimek）および多チャ
ンネルスポッタ（例：Genomic Solutions Flexys）など（これらに限定されるも
のではない）の自動および半自動装置を用いて同時に調べることができる。この
ようにして、複数のプレートおよび数千ないし数百万個の化合物を１日に調べる
ことができる。
【０２４２】 化合物はまた、以下に記載の微量定量プレートを用いて完全に液相で調べる。
液相スクリーニングを、１個の微量定量プレート当たり96、384、1536またはそ
れ以上のウェルを有する微量定量プレートで行って、１日に複数のプレートおよ
び数千ないし数百万の化合物のスクリーニングを行うことができる。試薬添加（
例：細胞および化合物）および細胞密度測定用に自動および半自動装置を用いる
。
【０２４３】 化合物についてはさらに、本明細書に記載の方法を用いてin vivoで試験を行
う。
【０２４４】 上記各細胞に基づいたアッセイを用いて、本明細書に記載のCandida albicans
遺伝子産物に対して相同性であるCandida albicans以外の微生物からの遺伝子産
物の活性を阻害する化合物を確認することができることは明らかであろう。例え
ば、標的遺伝子産物は、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergil
lus flavis、Candida tropicalis、Candida parapsilopsis、Candida krusei、C
ryptococcus neoformans、Coccidioides immitis、Exophalia dermatiditis、Fu
sarium oxysporum、Histoplasma capsulatum、Phneumocystis carinii、Trichos
poron beigelii、Rhizopus arrhizus、Mucor rouxii、Rhizomucor pusillusまた
はAbsidia corymbigeraなどの動物性真菌病原体あるいはBotrytis cinerea、Ery
siphe graminis、Magnaporthe grisea、Puccinia recodita、Septoria triticii
、Tilletia controversa、Ustilago maydisまたは上記いずれかの菌種の属に属
する菌種などの植物性真菌病原体からのものであることができる。一部の実施形
態において遺伝子産物は、Saccharomyces cerevisiae以外の微生物からのもので
ある。
【０２４５】５．５．２．１ GRACE株を用いる細胞に基づいたアッセイ 真菌の成長、生存、増殖、有毒性または病原性に必要な遺伝子の一方の対立遺
伝子が失活し、他方の対立遺伝子が調節プロモーターの制御下にあるGRACE株は
、本明細書に記載の方法を用いて構築される。この例に関して、調節プロモータ
ーは本明細書に記載のテトラサイクリン調節プロモーターであることができるが
、いずれの調節プロモーターも使用可能であることは明らかであろう。
【０２４６】 本発明の１実施形態においては、個々のGRACE株を、二倍体病原性真菌細胞に
対して活性な治療薬の検出のための基礎として用いる。この実施形態では、試験
微生物は、遺伝子の第１の対立遺伝子が発現可能な優性選択マーカーをコードす
るヌクレオチド配列の挿入またはそれによる置換によって失活しており、第２の
対立遺伝子が組換えによって修飾されて、第２の対立遺伝子が異種プロモーター
の制御された発現下にある修飾対立遺伝子対を有するGRACE株である。この試験G
RACE株を、異種プロモーターが比較的低レベルで発現される（「抑制」）第１の
組み合わせの条件下で成長させ、成長程度を測定する。この測定は、光学密度、
ペレット化細胞の湿重量、総細胞数、生存数、DNA含有量などの当業者には公知
の適切な基準を用いて行うことができる。この実験を、被験化合物存在下で行い
、第２回の成長測定値を得る。指標値によって簡便に表すことができる被験化合
物の存在下および不在下での成長の程度を比較する。成長値または指標値の程度
における相違によって、被験化合物が標的必須遺伝子産物と相互作用することが
できる指標が得られる。
【０２４７】 さらに多くのデータを得るため、異種プロモーターの制御下、第２の対立遺伝
子が上記の第１の組み合わせの条件の場合よりかなり高いレベルで発現される第
２の組み合わせの「非抑制」成長条件を用いて、さらに別の２種類の実験を行う
。成長値または指標値の程度を、この第２の組み合わせの条件下に、被験化合物
の存在下および不在下で測定する。被験化合物の存在下および不在下での成長値
または指標値の程度を比較する。成長値または指標値の程度における相違は、標
的必須遺伝子産物と相互作用可能性の指標を与える。
【０２４８】 さらに、第１および第２の成長条件での成長程度も比較することができる。成
長程度が実質的に同じである場合、そのデータは、調べたGRACE株が有する修飾
対立遺伝子対がコードする遺伝子産物を被験化合物が阻害しないことを示唆する
。しかし、成長程度が実質的に異なる場合、そのデータは、対象遺伝子産物の発
現レベルが被験化合物による阻害の程度を決定し得ることを示す。従って、対象
遺伝子産物がその被験化合物の標的であると考えられる。
【０２４９】 各GRACE株を個別に調べることができるが、GRACE株集団のセットまたはサブセ
ットを１回でスクリーニングするのがより有効である。従って本発明の１態様に
おいては、アレーを構成することができ、例えば一連の96ウェル微量定量プレー
トで、各ウェルが１種類のGRACE株を有するようにする。ある代表的な手法では
（それに限定されるものではないが）、２つのプレート対を有する４個の微量定
量プレートを用い、一方の対における増殖培地が、他方のプレート対における培
地より、各株での残りの活性対立遺伝子を制御する異種プロモーターを多く発現
させるようにする。各プレート対の１個のプレートに被験化合物を補給し、各GR
ACE株の成長測定値を、各被験単離物についての指標値を得るための標準法を用
いて求める。そのような治療薬スクリーニング法で使用される二倍体病原性GRAC
E株の集団は、例えば微生物の全ての修飾対立必須遺伝子対の実質的に全ての群
を含むことができ、その微生物または集団の全ての修飾対立必須遺伝子対の実質
的に全ての群は、真菌特異的、病原体特異的、所望の生化学的機能、ヒト相同体
、細胞局在および信号伝達カスケード標的群からなる群（これらに限定されるも
のではない）から選択されるGRACE株のサブセットから選択することができる。
【０２５０】 GRACE株を、ある範囲のテトラサイクリン濃度を有する培地で増殖させて、各
株について成長阻害用量−応答曲線を得る。最初に、GRACE株のシード培養物を
適切な培地で増殖させる。次に、シード培養物のアリコートを各種濃度のテトラ
サイクリンを含む培地で希釈する。例えばGRACE株を、テトラサイクリンの２倍
連続希釈液を含む２連の培地で増殖させることができる。さらに、対照細胞をテ
トラサイクリン不在下で２連で増殖させる。対照培養物は、対象のGRACE株の同
じ初期シード培養物由来の等量の細胞から開始する。細胞を適切な期間増殖させ
、成長程度を適切な方法を用いて測定する。例えば成長程度は、培養物の光学密
度を測定することで求めることができる。対象培養物が中間対数期（mid-log ph
ase）に達したら、各テトラサイクリン含有培養物についての成長パーセント（
対象培養物に対して）を、テトラサイクリンの対数濃度に対してプロットして、
テトラサイクリンに関する成長阻害用量−応答曲線を得る。０mMのテトラサイク
リン対照（０％成長阻害）と比較して細胞成長を50％阻害するテトラサイクリン
濃度（IC50）を、その曲線から計算する。別の成長測定方法も想定される。その
方法の例としては、操作により被験細胞で発現され、その発現を容易に測定可能
なタンパク質の測定などがある。そのようなタンパク質の例としては、緑色蛍光
タンパク質（GFP）および各種酵素などがある。
【０２５１】 細胞を選択濃度のテトラサイクリンで前処理してから、候補化合物に対する細
胞群の感受性を調べるのに使用する。例えば細胞を、少なくとも約５％、少なく
とも約８％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なく
とも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約75％、少なく
とも80％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％強だけ成長を阻害する濃
度のテトラサイクリンで前処理することができる。次に、細胞を候補化合物と接
触させ、テトラサイクリン含有培地での細胞の成長を、テトラサイクリンを含ま
ない培地での対照対照の成長と比較して、候補化合物が感作細胞（すなわち、テ
トラサイクリン存在下で増殖させた細胞）の成長を阻害するか否かを確認する。
例えば、テトラサイクリン含有培地での細胞の成長を、テトラサイクリンを含ま
ない培地での細胞の成長と比較して、候補化合物が感作細胞（すなわち、テトラ
サイクリン存在下で増殖させた細胞）の成長を、テトラサイクリン不在下で成長
させた細胞の成長を候補化合物が阻害するより大きい程度に阻害するか否かを確
認する。例えば、感作細胞（すなわち、テトラサイクリン存在下で増殖させた細
胞）と非感作細胞（すなわち、テトラサイクリン不在下で増殖させた細胞）との
間で成長に有意差が認められる場合、その候補化合物を用いて微生物の増殖を阻
害することができるか、あるいはその微生物の成長、生存または増殖を阻害する
さらに高い能力を有する化合物の確認をさらに至適化することができる。
【０２５２】 同様に、有毒性または病原性に必要な遺伝子産物を律速量で発現する候補化合
物に曝露した細胞の有毒性または病原性を、有毒性または病原性に必要な遺伝子
産物の発現レベルが律速量ではない候補化合物に曝露された細胞の有毒性または
病原性と比較することができる。そのような方法では、試験動物にGRACE株を接
種し、所望量のテトラサイクリンおよび候補化合物を含む飼料を摂取させる。そ
うして、試験動物を感染させたGRACE株は、律速量の有毒性または病原性に必要
な遺伝子産物を発現する（すなわち、試験動物におけるGRACE細胞を感作する）
。対照動物にGRACE株を接種し、候補化合物を含有するがテトラサイクリンを含
有しない飼料を摂取させる。試験動物におけるGRACE株の有毒性または病原性を
、対照動物におけるものと比較する。例えば、試験動物におけるGRACE株の有毒
性または病原性を、対照動物におけるものと比較して、候補化合物が感作GRACE
細胞（すなわち、飼料がテトラサイクリンを含んでいた動物における細胞）の有
毒性または病原性を、飼料にテトラサイクリンが含まれていなかった動物で候補
化合物がGRACE細胞の成長を阻害する程度より高い程度まで阻害するか否かを確
認することができる。例えば、感作GRACE細胞（すなわち、飼料がテトラサイク
リンを含んでいた動物における細胞）と非感作細胞（すなわち、飼料がテトラサ
イクリンを含まなかった動物における細胞）との間で成長に有意差が認められる
場合、その候補化合物を用いて、微生物の誘導性または病原性を阻害することが
できるか、あるいは微生物の有毒性または病原性を阻害する能力がさらに高い化
合物の確認をさらに至適化することができる。有毒性または病原性は、本明細書
に記載の方法を用いて測定することができる。
【０２５３】 上記細胞に基づいたアッセイを用いて、本明細書に記載のCandida albicans遺
伝子産物に対して相同性であるCandida albicans以外の微生物からの遺伝子産物
の活性を阻害する化合物を確認することができることは明らかであろう。例えば
、前記遺伝子産物は、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergillu
s flavis、Candida tropicalis、Candida parapsilopsis、Candida krusei、Cry
ptococcus neoformans、Coccidioides immitis、Exophalia dermatiditis、Fusa
rium oxysporum、Histoplasma capsulatum、Phneumocystis carinii、Trichospo
ron beigelii、Rhizopus arrhizus、Mucor rouxii、Rhizomucor pusillusまたは
Absidia corymbigeraなどの動物性真菌病原体あるいはBotrytis cinerea、Erysi
phe graminis、Magnaporthe grisea、Puccinia recodita、Septoria triticii、
Tilletia controversa、Ustilago maydisまたは上記いずれかの菌種の属に属す
る菌種などの植物性真菌病原体からのものであることができる。一部の実施形態
において遺伝子産物は、Saccharomyces cerevisiae以外の微生物からのものであ
る。
【０２５４】 上記の細胞に基づいたアッセイを用いて、真菌の増殖、有毒性または病原性に
必要な核酸あるいは核酸などの遺伝子産物が関わる生体経路を確認することもで
きる。そのような方法では、真菌の増殖、有毒性もしくは病原性に必要な律速レ
ベルの標的核酸を発現する細胞および標的核酸の発現が律速レベルではない対照
細胞を、各種経路で作用することが知られている抗生物質群と接触させる。抗生
物質が、標的核酸またはそれの遺伝子産物が関わる経路で作用する場合、標的核
酸の発現が律速レベルである細胞は、標的核酸の発現が律速レベルではない細胞
より、抗生物質に対する感受性が高い。
【０２５５】 対照として、標的遺伝子などの、増殖、有毒性もしくは病原性に必要な多くの
異なる遺伝子レベルが律速である細胞群と接触させることで、アッセイ結果を確
認することができる。抗生物質が特異的に作用している場合、標的遺伝子が律速
レベルである細胞（または標的遺伝子と同じ経路の遺伝子が律速レベルである細
胞）でのみ抗生物質に対する高い感受性が認められ、増殖、有毒性もしくは病原
性に必要な遺伝子産物が律速レベルである細胞では一般的に認められない。
【０２５６】 増殖、有毒性もしくは病原性に必要な核酸が関わる生体経路を確認するための
上記方法は、本明細書に記載のCandida albicans核酸と相同性であるCandida al
bicans以外の微生物からの核酸に適用することができることは明らかであろう。
例えばその核酸は、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergillus
flavis、Candida tropicalis、Candida parapsilopsis、Candida krusei、Crypt
ococcus neoformans、Coccidioides immitis、Exophalia dermatiditis、Fusari
um oxysporum、Histoplasma capsulatum、Phneumocystis carinii、Trichosporo
n beigelii、Rhizopus arrhizus、Mucor rouxii、Rhizomucor pusillusまたはAb
sidia corymbigeraなどの動物性真菌病原体あるいはBotrytis cinerea、Erysiph
e graminis、Magnaporthe grisea、Puccinia recodita、Septoria triticii、Ti
lletia controversa、Ustilago maydisまたは上記いずれかの菌種の属に属する
菌種などの植物性真菌病原体からのものであることができる。一部の実施形態に
おいて前記核酸は、Saccharomyces cerevisiae以外の微生物からのものである。
【０２５７】 同様に、上記方法を用いて、被験抗生物質などの被験化合物が作用する経路を
確認することができる。遺伝子産物が既知経路に関わっている、それぞれが真菌
の増殖、有毒性もしくは病原性に必要な律速量の遺伝子産物を発現する細胞群を
、作用する経路を確認することが望ましい化合物と接触させる。細胞群の被験化
合物に対する感受性を、増殖、有毒性もしくは病原性に必要な遺伝子産物をコー
ドする核酸の発現が律速レベルである細胞および増殖、有毒性もしくは病原性に
必要な遺伝子産物の発現が律速レベルではない対照細胞において求める。被験化
合物が増殖、有毒性または病原性に必要な特定の遺伝子産物が関わる経路で作用
する場合、その特定の遺伝子産物の発現が律速レベルである細胞は、他の経路で
の遺伝子産物が律速レベルである細胞より、化合物に対する感受性が高い。さら
に、真菌の増殖、有毒性または病原性に必要な特定遺伝子の発現が律速レベルで
はない対照細胞は、その化合物に対して高い感受性を示さない。このようにして
、被験化合物が作用する経路を確認することができる。
【０２５８】 被験化合物が作用する経路を確認するための上記方法を、本明細書に記載のCa
ndida albicans遺伝子産物と相同性である遺伝子産物の活性またはレベルが律速
レベルである細胞群を用いることで、Candida albicans以外の微生物に適用でき
ることは明らかであろう。例えば、その遺伝子産物は、Aspergillus fumigatus
、Aspergillus niger、Aspergillus flavis、Candida tropicalis、Candida par
apsilopsis、Candida krusei、Cryptococcus neoformans、Coccidioides immiti
s、Exophalia dermatiditis、Fusarium oxysporum、Histoplasma capsulatum、P
hneumocystis carinii、Trichosporon beigelii、Rhizopus arrhizus、Mucor ro
uxii、Rhizomucor pusillusまたはAbsidia corymbigeraなどの動物性真菌病原体
あるいはBotrytis cinerea、Erysiphe graminis、Magnaporthe grisea、Puccini
a recodita、Septoria triticii、Tilletia controversa、Ustilago maydisまた
は上記いずれかの菌種の属に属する菌種などの植物性真菌病原体からのものであ
ることができる。一部の実施形態において前記遺伝子産物は、Saccharomyces ce
revisiae以外の微生物からのものである。以下の示す実施例6.4は、そのような
アッセイを行う１法について説明するものである。
【０２５９】 当業者であれば、真菌の増殖、有毒性もしくは病原性に必要な遺伝子産物を律
速レベルで産生するのに用いられる誘発因子もしくは抑制因子の濃度などのアッ
セイ条件および／またはそのアッセイに用いられる成長条件（例：インキュベー
ション温度および培地成分）をさらに至適化することで、示される抗生物質感作
の選択性および／または強さをさらに高めることが可能であることは明らかであ
る。
【０２６０】 成長、生存、増殖、有毒性もしくは病原性に必要な遺伝子が関わる経路または
抗生物質が作用する経路を確認するための上記方法を、本明細書に記載のCandid
a albicans遺伝子産物と相同性である遺伝子産物が律速レベルであるCandida al
bicans以外の微生物を用いて行うことができることは明らかであろう。例えばそ
の遺伝子産物は、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergillus fl
avis、Candida tropicalis、Candida parapsilopsis、Candida krusei、Cryptoc
occus neoformans、Coccidioides immitis、Exophalia dermatiditis、Fusarium
oxysporum、Histoplasma capsulatum、Phneumocystis carinii、Trichosporon
beigelii、Rhizopus arrhizus、Mucor rouxii、Rhizomucor pusillusまたはAbsi
dia corymbigeraなどの動物性真菌病原体あるいはBotrytis cinerea、Erysiphe
graminis、Magnaporthe grisea、Puccinia recodita、Septoria triticii、Till
etia controversa、Ustilago maydisまたは上記いずれかの菌種の属に属する菌
種などの植物性真菌病原体からのものであることができる。一部の実施形態にお
いて前記遺伝子産物は、Saccharomyces cerevisiae以外の微生物からのものであ
る。
【０２６１】 さらに、上記で議論したように、GRACE株群を用いて、作用機序未知の抗生物
質などの、必須生体経路に影響する何らかの化合物の介入箇所の特性決定を行う
ことができる。
【０２６２】 本発明の別の実施形態は、被験抗生物質化合物が活性である生体経路の決定方
法であって、真菌の成長、生存、増殖、有毒性もしくは病原性に必要な経路に関
与するタンパク質の核酸の活性を、そのタンパク質もしくは核酸に対して作用す
る亜致死濃度の既知抗生物質と細胞を接触させることで低下させる方法である。
その方法は、GRACE株において律速量で遺伝子産物を発現することで真菌の増殖
、有毒性もしくは病原性に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低下させるの
ではなく、遺伝子産物の活性またはレベルを、その遺伝子産物に対して作用する
亜致死レベルの既知抗生物質を用いて低下させる以外、被験抗生物質がどの経路
に作用するかを決定するための上記方法と類似している。
【０２６３】 亜致死濃度の既知抗生物質が存在することで生じる成長阻害は、少なくとも約
５％、少なくとも約８％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約
30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％または少なくと
も約75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％強で
あることができる。
【０２６４】 別法として、成長阻害を測定するのではなく、標的の増殖に必要な遺伝子産物
の活性を測定することで、前記既知抗生物質の亜致死濃度を求めることができる
。
【０２６５】 亜致死レベルの既知抗生物質群の各薬物と各種濃度の被験抗生物質とを組み合
わせたものと、細胞を接触させる。対照として、その細胞を各種濃度の被験構成
物質のみと接触させる。前記の既知抗生物質の存在下および不在下での被験抗生
物質のIC50を求める。前記既知薬物の存在下および不在下でのIC50が実質的に同
様である場合、被験薬物と既知薬物は異なる経路に作用している。そのIC50値が
実質的に異なる場合、被験薬物と既知薬物は同じ経路に作用している。
【０２６６】 同様の方法を、本明細書に記載のCandida albicans配列と相同性の遺伝子産物
に作用する既知抗生物質を用いて行うことができる。その相同性遺伝子産物は、
Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergillus flavis、Candida tr
opicalis、Candida parapsilopsis、Candida krusei、Cryptococcus neoformans
、Coccidioides immitis、Exophalia dermatiditis、Fusarium oxysporum、Hist
oplasma capsulatum、Phneumocystis carinii、Trichosporon beigelii、Rhizop
us arrhizus、Mucor rouxii、Rhizomucor pusillusまたはAbsidia corymbigera
などの動物性真菌病原体あるいはBotrytis cinerea、Erysiphe graminis、Magna
porthe grisea、Puccinia recodita、Septoria triticii、Tilletia controvers
a、Ustilago maydisまたは上記いずれかの菌種の属に属する菌種などの植物性真
菌病原体からのものであることができる。一部の実施形態において前記遺伝子産
物は、Saccharomyces cerevisiae以外の微生物からのものである。
【０２６７】 本発明の他の実施形態は、抗生物質として使用するための候補化合物を同定す
る方法であり、該方法においては、細胞を標的タンパク質または核酸に対して作
用する公知の抗生物質の致死量以下の濃度に接触させることによって、真菌の増
殖、毒性または病原性に必要な経路に関与する標的タンパク質または核酸の活性
を減じる。この方法は、遺伝子産物の律速濃度を発現するＧＲＡＣＥ株を用いて
増殖、ビルレンスまたは病原性に要求される遺伝子産物の活性または濃度を減じ
るよりもむしろ、遺伝子産物活性または濃度が、増殖に必要な遺伝子産物に対し
て作用する知られた抗生物質の致死量以下の濃度を用いて減少することを除いて
、抗生物質として使用の候補化合物を同定する上記のものと類似する。
【０２６８】 知られた抗生物質の致死量以下の濃度による増殖阻害は、少なくとも約５％、
少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３
０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なく
とも約７５％、又はそれ以上であり得る。
【０２６９】 あるいは、公知の抗生物質の致死量以下の濃度は、増殖阻害を測定するよりも
むしろ、標的増殖に必要な遺伝子産物の活性を測定することにより決定できる。
【０２７０】 目的の試験化合物を特性評価するために、細胞を、致死量以下の濃度の公知の
抗生物質のパネル、及び１つ以上の濃度の試験化合物と接触させる。対照として
、細胞を、同一濃度の試験化合物単独と接触させる。公知の抗生物質の存在下及
び不在下における試験化合物のＩＣ５０を測定する。試験化合物のＩＣ５０が、
公知の薬物の存在下及び不在下で実質的に異なる場合、該試験化合物は、抗生物
質としての使用するための良好な候補物質となる。既に考察したように、候補化
合物が上記の方法を用いて同定されると、その構造を、コンビナトリアルケミス
トリーなどの標準方法を用いて最適化し得る。
【０２７１】 同様の方法が、本明細書に記載されたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ配列
と相同の遺伝子産物に作用する公知の抗生物質を用いて実施できる。相同遺伝子
産物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔ
ｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｐｓｉｓ、Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ
ｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｅｘｏｐｈａｌｉａ ｄｅｍａｔｉ
ｄｉｔｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｉ
ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ
、Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＡ
ｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｇｅｒａなどの動物性真菌病原体、またはＢｏｔ
ｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｍａｇｎａ
ｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｄｉｔａ、Ｓｅｐｔ
ｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ、Ｕ
ｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓなどの植物性真菌病原体、または上記種のいずれ
かの属に入る任意の種に由来するものであってもよい。幾つかの実施形態におい
て、遺伝子産物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ以外の生
物に由来する。
【０２７２】 代表的な標的遺伝子産物は、ＣａＴＢＦ１によりコードされる。多くの特徴に
より、このＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子産物が貴重な薬物標的となる。第１に、
ＣａＴＢＦ１によりコードされるタンパク質は、その活性を阻害する化合物のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏの高スループットスクリーニングと適合する。全細胞アッセイに
おいて、この遺伝子産物の改変発現をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイと平行して行う
ことにより、同定される阻害化合物として可能性ある物質のスペクトルを広げる
ことができる。さらに、ＣａＴｂｆｌｐと染色体テロメラーゼとの間の予想され
た物理的相互作用の証拠は、薬物スクリーニングのためのルーハイブリッドアッ
セイの開発に使用できた。最後に、ＣａＴＢＦ１が真菌特異的遺伝子であること
から、そのヌクレオチド配列は、真菌感染に対するＰＣＲに基づく診断手段の設
計に寄与することができた。
【０２７３】 好ましい薬物標的を表すＧＲＡＣＥ誘導収集株に含まれる、他に確認された薬
物標的には、以下のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子によりコードされた産物が含ま
れる：ＣａＲＨＯ１、ＣａＥＲＧ８、ＣａＡＵＲ１およびＣａＣＨＯ１、並びに
配列番号：１〜６２によりコードされるものである。本発明のＧＲＡＣＥ法を用
いてこれらの遺伝子を操作する能力は、これら重要な遺伝子産物の阻害剤を同定
するために設計された、現在使用されている薬物スクリーニングの実務を改善す
ることとなる。
【０２７４】 本発明の他の実施形態において、病原体に対する薬物標的でありうるものは、
例えば光学密度又は遠心分離後のペレットサイズにより測定される増殖を各ウェ
ルごとに測定できる９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットを用いて
、化合物のライブラリーに対して同時にスクリーニングできた。薬物スクリーニ
ングのためのゲノム法は、どの標的をスクリーニングすべきかの評価において用
いられる潜在的に恣意的かつ人為的な基準に頼ることをやめ、その代わり全ての
可能性のある標的をスクリーニングすることを可能にする。この方法は、好まし
い過程（例えば、細胞壁生合成遺伝子産物）を阻害する特定の化合物を同定する
可能性を提供するのみならず、そのライブラリ内の全ての殺真菌性化合物を確認
する可能性並びにこれらをコグネイト細胞標的と結合する可能性も提供する。
【０２７５】 本発明のさらに他の実施形態において、ＧＲＡＣＥ株をスクリ−ニングして、
総合的な致死性変異を同定でき、それによって重要な治療的価値を有する薬物標
的の潜在的な新規クラスを発見することができた。例えば、２種の分離遺伝子は
、共通かつ本質的な細胞機能に関与する相同タンパク質をコードし、この機能の
本質的性質は、双方のファミリーのメンバーを不活化したときにのみ明らかとな
る。したがって、各遺伝子のヌル表現型を別々に試験しても、組合わされた遺伝
子産物の本質を明らかにされず、その結果、この潜在的薬物標的は同定されない
。遺伝子産物が、互いに高度相同であれば、１つのフェミリーのメンバーを阻害
すると判った化合物は、他のものを阻害する可能性が高く、したがって、遺伝学
的に示された総合的増殖阻害に近似するものと予想される。しかしながら、他の
場合、総合的な致死性は、表面上無関係な（また、しばしば非本質的な）プロセ
スを明らかにするが、これらを組合せると、相乗的増殖障害（細胞死）を生じる
。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ遺伝子ＲＶＳ１６１の破壊は、この単独変異
を有する酵母において認識可能な栄養繁殖のいかなる増殖表現型をも示さないが
、少なくとも他の９種の遺伝子はＲＶＳ１６１の不活化と組合せると総合的致死
効果を示すことが知られている。これらの遺伝子は、細胞骨格構築およびエンド
サイトーシスからシグナル導入および脂質代謝までの範囲の過程に関与し、組合
せの薬物標的ストラテジーを追跡する複数の手段を同定する。必須のおよび非必
須の薬物標的による総合的致死性相互作用を明らかにする直接的方法が実施され
、該方法においては、薬物標的に対する活性を減じたレベルで発現することでは
なく、その変異が第２の薬物標的の阻害と組合せて総合的に致死性となることに
よって、ＧＲＡＣＥ株またはヘテロ接合体株は、試験化合物に対して増強された
感受性を示すものとして同定される。該化合物が、感作ＧＲＡＣＥ株またはヘテ
ロ接合体の薬物標的を特異的に阻害するか否か、又は第２の標的化が全ＧＲＡＣ
Ｅ株又はヘテロ接合体株をスクリ−ニングすることによって達成されるかを認識
することにより、該化合物に対して等しいかまたはより大きな感受性を示す追加
の変異株を設定し、次いで２つの変異間で総合的致死性を示す二重変異株の遺伝
学的特性評価を行う。
【０２７６】５．５．２．２ ＧＲＡＣＥ株による非抗真菌性治療剤のスクリーニング 病原性の真菌とそれが感染する哺乳動物宿主との間に存在する生化学的類似性
は、臨床上有用な抗有系核分裂化合物の範囲を限定する。しかし、この類似性は
、ＧＲＡＣＥ株集団を用いて開発され、抗真菌剤として使用されないが、癌、炎
症などの幅広い疾病の治療に有用な治療剤の発見を促進できる。
【０２７７】 本発明のこの実施形態において、動物または植物における疾病発生遺伝子に相
同な真菌遺伝子が選択され、この一連の遺伝子のＧＲＡＣＥ株は、これら遺伝子
産物に対して強力かつ特異的なバイオアベイラビリティーを示す化合物の同定に
使用され、したがって疾病治療において潜在的な医薬上の価値を有する。必須お
よび非必須の遺伝子並びにこのような遺伝子の修飾対立遺伝子対を担持する対応
するＧＲＡＣＥ株は、本発明のこの実施形態において有用である。Ｃ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓゲノム内に見出された４０％もの遺伝子は、ヒトの機能性相同物を共有
することが予知されている。またヒト遺伝子の１％程度がヒトの疾病に関与し、
したがって潜在的な薬物標的として機能しうると予知されている。したがって、
ＧＲＡＣＥ株集団内の多くの遺伝子は、疾病を引き起こすヒト遺伝子と相同であ
り、この遺伝子セットの個々のメンバーを特異的に不活化する化合物は、実際に
別の治療的価値を有する。本発明は、修飾対立遺伝子が、動物または植物の１種
以上の疾病に関連する遺伝子と、配列類似性、構造的類似性および／または機能
的類似性を共有する真菌遺伝子であるような、複数のＧＲＡＣＥ株を提供する。
【０２７８】 例えば、細胞サイクルの進行を促進し、種々の癌においてしばしば摂動するシ
グナル伝達機構の多くが、真菌類において保存されている。これら遺伝子の多く
は、サイクリン、サイクリン依存キナーゼ類（ＣＤＫ）、ＣＤＫ阻害剤、ホスフ
ァターゼ類並びに構造的および機能的に関連する転写因子をコードする。その結
果、これらの機能的タンパク質のクラスの内の任意のものに特異性を示すことが
判った化合物は、潜在的抗癌活性に関して試験する第２のスクリーニングにより
評価できた。しかし、この方法で同定された細胞毒性化合物は、治療上の可能性
を示すために、癌を引き起こす標的に作用させる必要はない。例えば、乳癌およ
び卵巣癌の治療薬として有望である抗癌化合物のタキソ−ルファミリーは、チュ
ーブリンと結合し、微小管の構築を促進し、それにより通常の微小管動態を破壊
する。酵母チューブリンは、タキソールに対し同様の感受性を示し、これは、酵
母とヒトとの間で共有される他の基本的細胞過程に影響を与える追加の化合物を
同様に同定でき、抗腫瘍活性を評価できることを示唆する。
【０２７９】 異常発生現象は、微生物の分類境界をはるかに超えて拡大し、究極的には基礎
的な生理学を反映する。多くの点、癌の現象は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなどの日
和見病原体による異常発生の過程と類似している。両者は、体自体の細胞または
天然動物相に由来する微生物のいずれかにより発生した非感染性の疾病である。
これらの細胞は、免疫系によりチェックされない挙動で増殖し、両者の場合にお
いて、疾病は、生体器官の転移増殖および最終的には死に至る組織損傷により発
現する。主に、両者の場合の原因因子が宿主に対して高度な関連性を有すること
から、両者の疾病に関して、有効な薬物に基づく治療は、わかりにくい。
【０２８０】 実際、癌に無関係な過程に影響を与える多くの成功した治療薬はまた、抗真菌
薬スクリーニングプログラムを通して発見されている。化合物のうち１つの臨床
上重要なクラスには、保存されたシグナル伝達構成要素を阻害する免疫抑制薬分
子であるラパマイシン、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６が含まれる。シクロ
スポリンＡおよびＦＫ５０６は、カルシウムおよびカルモジュリン依存ホスファ
ターゼ、カルシネウリンの調節サブユニットと結合し不活化する別個の薬物−プ
ロリルイソメラーゼ複合体（それぞれ、ＣｙＰＡ−シクロスポリンＡおよびＦＫ
ＢＰ１２−ＦＫ５０６）を形成する。ラパマイシンはまた、ＦＫＢＰ１２と複合
体化するが、しかしこの薬物−タンパク質複合体はまた、ホスファチジルイノシ
トールキナーゼ類のＴＯＲファミリーに結合して、翻訳および細胞サイクル進行
を阻害する。各場合において、薬物作用および薬物標的自身両方の機構は、酵母
からヒトまで高度に保存されている。
【０２８１】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ標的薬物の同定、および標的を必須遺伝子、真菌特異的
および病原体特異的標的セットに分類することは、これら標的の任意の個々のメ
ンバーと相互作用し、これを阻害する化合物についての全細胞スクリーニングを
開発するための基礎を提供する。したがって、同様の分析を使用して、他の特異
的な共通の機能または特性を有する薬物標的をコードする改変対立遺伝子対を有
するＧＲＡＣＥ株の他のセットを同定できる。例えば、ヒト遺伝子に対して高度
に相同な遺伝子標的、または共通の生化学的機能、酵素活性を示す遺伝子標的、
または炭素化合物の異化作用、生合成、分子輸送（輸送体活性）、細胞局在化、
シグナル伝達カスケード、細胞サイクル制御、細胞接着、転写、翻訳、ＤＮＡ複
製などに関与する遺伝子標的を含んで成るＧＲＡＣＥ株のサブセットを確立でき
る。
【０２８２】５．５．２．３ 標的遺伝子投与に基づく全細胞アッセイ そこから遺伝子機能を推測し得る表現型を示すコード遺伝子の発現レベルを調
節することを含む実験は、本発明の株と方法を用いてＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉ
ｃａｎｓなどの病原性二倍体真菌類において実施できる。薬物スクリーニングの
薬物−標的−レベルの変異の原理は、薬物標的の発現レベルを変動させて特定の
薬物耐性または薬物感受性の表現型を同定すること、それにより薬物標的を特定
の化合物に結合させることを含む。多くの場合、これらの表現型は、この化合物
の実際の薬物標的をコードする標的遺伝子の指標となる。これがあてはまらない
例の場合、それでもなお候補標的遺伝子は、該化合物により阻害されたもの（例
えば、総合的表現型の産生）に関連する経路または過程のいずれかにおいて機能
するか、またはその代わりに同定化合物に関連する薬物耐性機構として機能する
真の標的遺伝子についての重要な洞察を提供し得る。
【０２８３】 標的タンパク質の発現レベルの変動はまた、薬物スクリーニングおよび薬物標
的同定法の双方に取り入れられる。二倍体生物における遺伝子産物の全細胞発現
レベルは、その産物をコードする遺伝子の１種の対立遺伝子を破壊させることに
より改変され、それにより“ハプロインサフィシェント”表現型が生じ、その機
能活性が半分に減じる。ヘテロ接合体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株集団は、この
ようなハプロインサフィシェントスクリーニングに用いられて、薬物に基づく耐
性および過敏性の表現型をヘテロ接合体薬物標的に結びつける。非必須遺伝子は
、一倍体欠失株集団を用い、特定の表現型または“化学型”について化合物ライ
ブラリーに対して直接スクリーニングする。しかし、この方法は、標的遺伝子が
必須である二倍体生物に用いることはできない。
【０２８４】 所定の遺伝子産物の発現レベルはまた、遺伝子を、細胞内に多コピーで維持さ
れるプラスミドベクターにクローン化することにより上昇する。コード遺伝子の
過剰発現は、遺伝子産物の対応するオープンリーディングフレームを、多コピー
プラスミド上に担持されるより強力なプロモーターと融合することによっても達
成される。これらの方法を用いて、多くの過剰発現スクリーニングがＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅに使用されて成功を治め、特性評価された薬物標的と相互作用す
る新規化合物を発見すると同時に、既存の治療用化合物が結合したタンパク質標
的が同定された。
【０２８５】 ＧＲＡＣＥ株集団は、薬物標的についての劇的な範囲の遺伝子発現レベルを、
病原体内に直接供することにより、全細胞薬物スクリーニングにおけるＳ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅの代用的使用を排除する（図５）。本発明の一実施形態では、
これは、ＧＲＡＣＥ株を構築するためのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ適応テトラサイク
リンプロモーター系を用いて達成される。非抑制条件下（すなわちテトラサクリ
ンの無い）で増殖した３０種の異なるＧＲＡＣＥ株のノーザン法解析は、試験し
た条件付き発現遺伝子の８３％が、野生型の３倍以上の過剰発現レベルを維持し
、および試験した全ての遺伝子の６０％が、ＧＲＡＣＥ株構築に用いられた野生
型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株の５倍以上の発現を示した。各ＧＲＡＣＥ株が、実際
はへテロ接合体であるので、それぞれヘテロ接合体株と比較すると、発現範囲は
恐らく２倍になる。したがってほとんどのＧＲＡＣＥ株について、これは、標準
の２μに基づく多コピープラスミドを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて
典型的に達成されるものに匹敵する上昇した発現レベルを表し、ＣａＡＣＴ１プ
ロモーターにより供されたものと同等の構成的発現の絶対レベルを表す。したが
って、本発明のＧＲＡＣＥ株集団は、抑制条件下での標的確認に有用であるのみ
ならず、全細胞アッセイ開発および薬物スクリーニングのための、非抑制条件下
で同様に確認された薬物標的を過剰発現する株の集団としても有用である。
【０２８６】 ＧＲＡＣＥ株における標的遺伝子産物の発現レベルの変異はまた、抗真菌性化
合物に対する耐性を探索するのに用いられる。既存の抗真菌治療薬に対する耐性
は、限定された数の利用できる抗真菌薬物、および臨床医がそれらを処方する際
にもつ不安にさせる依存性と信頼性の双方を反映する。例えば、真菌感染の治療
にのためのフルコナゾールなどのアゾールベース化合物への依存症は、この化合
物の臨床治療上の価値を劇的に削減した。ＧＲＡＣＥ株集団は、フルコナゾール
の細胞標的と相互作用する遺伝子産物を同定することによりフルコナゾール耐性
を除去するのに用いられる。このような産物を同定して、フルコナゾールと一緒
に不活化される際に、相乗効果をもたらし、それにより、この化合物が単独で使
用される際に見られるフルコナゾール耐性に打ち勝つ薬物標的を同定するする。
例えば、これは、ＧＲＡＣＥ株集団を用いて薬物耐性を増強する遺伝子を過剰発
現させることにより達成される。このような遺伝子には、ＡＴＰ−結合カセット
（ＡＢＣ）輸送体、および多剤耐性（ＭＤＲ）流出ポンプ、多形質発現性薬物耐
性（ＰＤＲ）転写因子、並びにプロテインキナーゼおよびホスファターゼなどの
新規または既知の原形質膜エクスポーターが含まれる。あるいは、示差的薬物感
受性を特異的に示す遺伝子は、標的セットの個々のメンバーを減少したレベル（
テトラサクリンプロモーターによるハプロインサフィシェントリー発現または閾
値発現のいずれかによる）で発現するＧＲＡＣＥ株をスクリーニングすることに
より同定される。このような遺伝子を同定することにより、既存の抗真菌治療薬
の効力を増強するための薬物に基づく不活化に目標を定めることができる薬物耐
性機構に対し重要な手がかりを提供する。
【０２８７】 本発明の他の態様において、全細胞アッセイを目的とする標的遺伝子の過剰発
現は、テトラサイクリンプロモーター系以外のプロモーターにより支持される（
５．３．１節参照）。例えば、ＣａＰＧＫ１プロモーターは、Ｃ．ａｌｂｉｃａ
ｎｓ薬物標的遺伝子を過剰発現させるのに用いられる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅにおいて、ＰＧＫ１プロモーターは、グルコース存在下、強力な構成的発現を
もたらすことが知られている。Ｇｕｔｈｒｉｅ、Ｃ．、およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ
、１９９１年、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４
：３７３〜３９８を参照。ＣａＰＧＫ１プロモーター（ＣａＫＲＥ９、ＣａＥＲ
Ｇ１１、ＣａＡＬＧ７、ＣａＴＵＢ１およびＣａＡＵＲ１）の制御下に置かれた
５種のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子の予備的解析は、ノーザンブロット解析によ
り判定したところ、野生型に対し劇的な過剰発現を示した。全ての遺伝子におい
て達成された過剰発現のレベルは、テトラサクリンプロモーターにより得られた
ものを３〜４倍上回る。さらに、テトラサクリンプロモーターを用いて構成的に
発現された際に、有意に過剰発現されなかったＣａＡＵＲ１は、野生型ＣａＡＵ
Ｒ１発現レベルに相対して５倍過剰発現され、ＣａＰＧＫ１プロモーターは、テ
トラサクリンプロモーターにより通常過剰発現しない遺伝子を過剰発現するのに
有用であることを示唆した。
【０２８８】 本発明の他の態様において、ＧＲＡＣＥ株集団内の個々の薬物標的の中間発現
レベルは、ユニークな全細胞アッセイの開発に適合させる株を提供するように遺
伝子操作される。本発明のこの実施形態において、ＧＲＡＣＥ株は、転写の部分
的抑制のみを提供するために決定されたテトラサクリン濃度を含有する培地中で
増殖される。これらの条件下で、構成的に発現された過剰産生株と野生型株との
間の発現レベル、同時に野生型株よりも低い発現レベルを維持することは可能で
ある。すなわち、細胞生存に最小限必要な発現レベルを滴定することは可能であ
る。遺伝子発現をこの厳しい状態に抑制することにより、機能変異の部分的損失
（すなわち、低次形態変異体の表現型）により産生した表現型に似た新規表現型
を産生することが可能であり、全細胞アッセイの開発および薬物スクリーニング
に適用できる追加の標的発現レベルを提供する。残っている必須遺伝子の対立遺
伝子の発現を生存に必要な閾値レベルに抑制することは、この必須遺伝子産物に
対して活性な化合物への増強された感受性を有する株を提供する。
【０２８９】 薬物スクリーニングのための全細胞アッセイにおける標的レベル発現の有用性
を証明するために、ＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株とテトラサクリンプロモーター
制御ＣａＨＩＳ３ＧＲＡＣＥ株の両方を、３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）
に対し感受性の野生型（二倍体）ＣａＨＩＳ３株と比較した（実施例６．３）。
これらの実験から導かれたデータは、病原体内に合成された標的遺伝子産物の明
確なレベルが、全細胞アッセイに基づく薬物スクリーニングに直接適用でき、Ｇ
ＲＡＣＥ法を用いて確認された新規薬物標的に対して活性な新規抗真菌化合物を
同定できることを明らかに示す。
【０２９０】５．５．２．４ タグ化株の使用 本発明のさらに別の態様において、ユニークなオリゴヌクレオチド配列タグま
たは“バーコード”が、確認された標的のヘテロ接合体株集団内に含まれる個々
の変異株に取り込まれる。これらの配列タグの存在は、薬物スクリーニングに対
する代替の全細胞アッセイ法を可能にする。多標的株は、混合集合（別々よりも
）において同時にスクリ−ニングが可能であり、特定の薬物標的とその阻害剤と
の間で表現型を同定することができる。
【０２９１】 大スケールの平行分析を、全バーコード化ヘテロ接合体必須株集団標的セット
の混合集合を用いて実施し、化合物存在下、増殖前後で混合集合内における個々
の株の相対的表現を比較する。ユニークなバーコード化株の薬物依存的枯渇また
は過剰表現は、混合集合内の全バーコードのＰＣＲ増幅、および蛍光標識化、お
よび生じたＰＣＲ産物の相補的オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリッド形成
によって測定される。バーコード化株間の示唆的表現は、遺伝子特異的過敏性た
は耐性を示し、対応する遺伝子産物が、試験した化合物の分子標的を表しうるこ
とを示唆する。
【０２９２】 １つの具体的実施形態において、変異株は、ＧＲＡＣＥ株であり、各ＧＲＡＣ
Ｅ株のセットは、ユニークな分子タグを含んで成り、これは一般に、改変される
第１の対立遺伝子対に置き換えるのに用いられたカセッテ内に取り込まれる。各
分子タグには、試験したセットの全てのメンバーに共通であるプライマー配列に
が隣接する。増殖は、試験した化合物の存在下又は不在下で抑制培地および非抑
制培地で実施される。各株の相対的増殖は、埋め込まれた配列タグの全集団の同
時ＰＣＲ増幅を実施することにより評価される。
【０２９３】 本発明の１つの非限定的態様において、ＰＣＲ増幅は、蛍光プライマーにより
非対称的様式で実施され、生じた１本鎖核酸産物は、表面に固定され、相補配列
の対応するセットをすべて含むオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズする
。次に各蛍光分子タグ配列のレベル解析が実施され、試験した化合物の存在下及
び不在下において、これら培地中のＧＲＡＣＥ株セットの相対的増殖量を評価す
る。
【０２９４】 したがって、この方法の１つの非限定的実施例においては、試験した各ＧＲＡ
ＣＥ株のセットに対し、生存集合内に見出された対応する分子タグのレベルにつ
いての４つの値が存在した。これらは、試験した化合物の存在下及び不在下の双
方において、抑制条件および非抑制条件下での細胞増殖に対応する。試験化合物
の存在下及び不在下における増殖の比較は、増殖培地の各セットに対する値また
は“指標”を提供する；すなわち、抑制条件および非抑制条件下で導かれた指標
である。再度この２つの指標値の比較すると、試験化合物が、試験ＧＲＡＣＥセ
ットの特定のメンバーにより担持される改変対立遺伝子対により発現された遺伝
子産物に対し活性であるかどうかを示すことになる。
【０２９５】 本発明のさらに別の態様において、このヘテロ接合体のタグ化またはバーコー
ド化集団における各々の潜在的薬物標的は、続いてのＴｅｔプロモーターまたは
残っている破壊されていない対立遺伝子の上流の他の強力な構成的発現プロモー
ター（たとえば、ＣａＡＣＴ１、ＣａＡＤＨ１およびＣａＰＧＫ１）のいずれか
を導入することにより過剰発現し得る。これらの構築物によって、混合固体群薬
物感受性試験において使用される個々の必須遺伝子のコード標的遺伝子産物の投
与量をさらに増加させることができる。過剰発現はそれ自体、多くの集合メンバ
ーの正常な増殖速度を混乱させるが、さらに信頼性のある比較を模擬培養と薬物
処理混合培養との間で行うことにより、化合物に特異的な増殖差を同定できる。
【０２９６】 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅにおいて、３−アミノ−トリアゾール、ベノミル、ツ
ニカマイシンおよびフルコナゾールなどのいくつかの十分に特性評価された化合
物の分子薬物標的が同様の方法で同定された。この試験において、ＨＩＳ３、Ｔ
ＵＢ１、ＡＬＧ７およびＥＲＧ１１におけるヘテロ接合変異体を担持するバーコ
ード化株（すなわち、上記の化合物に対するそれぞれの薬物標的）は、混合固体
群において一緒に増殖する場合の他のヘテロ接合体バーコード化株よりも、それ
ぞれの化合物によりチャレンジした場合に有意により大きな感受性を示した。
【０２９７】 本発明の他の態様において、抗真菌化合物のスクリ−ニングは、標的株に対し
て活性な少なくとも１種の化合物を含んで成る化合物の複雑な混合物を用いて実
施できる。ＧＲＡＣＥ株集団をタグ化またはバーコード化することは、遺伝子セ
ットを同定するのに必要な、並びに特定の遺伝子セット内の個々の標的を評価し
および究極的に評価するのに必要な多くの大スケール分析を促進する。例えば、
バーコード化ＧＲＡＣＥ株集団を用いる混合集合薬物スクリーニングは、包括的
な全細胞アッセイとして有効に機能する。複雑な化合物ライブラリーの最小量は
、集団内の個々の必須標的遺伝子に作用する化合物を同定するのに十分である。
これは、集団を整列させる必要なしに行なわれる。また、任意の特定の化合物ラ
イブラリーの‘豊富さ’に関する強力な予知を、薬物スクリーニングに委託する
前に行うことができる。したがって例えば、炭水化物ベースの化学ライブラリー
が、天然産物または合成化合物ライブラリーよりも大きな殺真菌活性を所有する
かどうかを評価することが可能となる。任意の分子複合ライブラリー内の特に強
力な化合物を直ちに同定でき、薬物スクリーニングに利用できる標的およびアッ
セイの優先順位に従って評価できる。あるいは、本発明は、“適合”スクリ−ニ
ングの開発に対しこの情報の適用を提供し、特定の化合物ライブラリーにより混
合集合実験において不活化されていることが示された標的のみが、引き続くアレ
イフォーマット化スクリ−ニングに含まれる。
【０２９８】 慣例的に、薬物発見プログラムは、確認された薬物標的の個々のまたは限定さ
れたセットに依存していた。前記の例は、このようなアプローチはもはや必要で
はなく、高スループット標的評価と薬物スクリーニングが可能であることを強調
する。しかしながら、個々の標的の選択に基づいた直接のアプローチも、専門的
技術、興味、戦略、または薬物発見プログラムの予算に依って、依然として好ま
しいと思われる。
【０２９９】５．５．３ 動物モデル系における標的評価 現在、必須の薬物標的の確認が、標準的実験室条件下で遺伝子不活化効果を調
べることにより証明されている。標準的実験室条件下で必須でないと思われる推
定の薬物標的遺伝子が、動物モデル内、例えば野生型に対して標的遺伝子の欠失
したヘテロ接合株の病原性を試験することにより調べられる。しかし、必須の薬
物標的は、動物モデル試験から排除される。したがって、最も望ましい薬物標的
は、最も妥当条件からそれらの標的評価まで省略される。
【０３００】 本発明の実施形態において、ＧＲＡＣＥ必須株集団により提供される条件付き
の発現は、宿主環境内の標的確認に対するこの長年の限界を克服する。動物試験
は、ＧＲＡＣＥ必須株を接種したマウスを用い、条件つきの発現による遺伝子不
活化効果を試験することにより実施できる。本発明の好ましい実施形態において
、ＧＲＡＣＥ必須株の致死接種物を注入されたマウスに対する効果は、マウスが
薬物標的遺伝子発現を不活化するために適切な濃度のテトラサクリンを与えられ
ているかどうかに依存して決定できた。したがって、実験室条件下で必須である
と証明された遺伝子の発現の欠失は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの末期感染の予防と
関連しうる。このタイプの実験は、テトラサクリン補足水で“処理された”マウ
スのみが、標的遺伝子の不活化が宿主内のＧＲＡＣＥ株病原体を殺したため感染
に生き残ると予想される。
【０３０１】 本発明のさらに他の実施形態においては、遺伝子が３０℃で機能的であるが、
マウスの正常な体内温度では不活性となるように、標的遺伝子または特定の薬物
標的の温度感受性対立遺伝子を制御するための温度応答プロモーターを用いて、
条件付発現を達成できた。
【０３０２】 必須遺伝子に関して上記と同様に、ＧＲＡＣＥ株集団を含む非必須遺伝子が、
マウスモデル系の病原性に必要であるかを同等に証明することができる。ヌル表
現型の増殖を減少させ、病原体の毒性を減じ得る複数の遺伝子がこのセットに含
まれる。遅い増殖の表現型を示す多くの変異体は、ＧＲＡＣＥ株を構築するのに
用いられる条件付発現法により単純に不完全に不活化された他の必須遺伝子（別
法により証明される）において低次形態変異を表し得る。このような株の１つの
重要な用途は、任意の所定の必須遺伝子が、毒性の過程で二重に機能するかを評
価することである。部分的にのみ不活化される場合、実質的に減少した毒性と増
殖速度を示す必須遺伝子は、それに対して最小限の阻害高特異性化合物さえも治
療上の価値を示すと思われる“多因子性の”薬物標的を表す。ひとまとめにして
、テトラサイクリンによる遺伝子不活化条件下（または別の遺伝子不活化手段）
でマウスの真菌感染を引き起こせない全てのＧＲＡＣＥ株は、病原性に必要な遺
伝子サブセット、すなわちＧＲＡＣＥ病原性サブセットを規定する。病原性遺伝
子のより明らかなサブセット、例えば発病における特定の段階（例えば、癒着ま
たは侵襲）に必要なこれらの遺伝子は、対応する過程を測定するｉｎ ｖｉｔｒ
ｏアッセイにＧＲＡＣＥ株病原性サブセットを適用することにより決定できる。
例えば、個々の遺伝子の条件付発現によるバッカル癒着アッセイまたはマクロフ
ァージアッセイにおいてＧＲＡＣＥ病原性株を調査することにより、それぞれ癒
着または細胞浸潤に必要なこれらの病原性因子を確認する。
【０３０３】 ＧＲＡＣＥ株集団またはその所望のサブセットはまた、動物モデル系内にいて
獲得耐性／抑制を評価し、不活化薬物標的に対する殺真菌性／静真菌性表現型間
を識別するのに都合がよい。本発明のこの実施形態において、各種必須の薬物標
的遺伝子の発現において抑制されるＧＲＡＣＥ株を、テトラサイクリンの補足水
で飼育されたマウスに接種する。次に各ＧＲＡＣＥ株を、それらが感染した異な
るマウス集団に関する死亡頻度によって比較する。ＧＲＡＣＥにおける必須遺伝
子のテトラサイクリン依存性不活化によってもたらされる真菌細胞死によって、
感染マウスのほとんどが健康を維持すると予想される。しかし、遺伝子外抑圧を
より発生し易い薬物標的を担持するＧＲＡＣＥ株は、殺真菌性標的よりも静真菌
性標的であり、または宿主環境内で活性な別の生理学的過程により抑制されるの
で、この特定の株に感染したマウスで検出された致死性感染の高い発生率により
同定できる。この方法により、個々の薬物標的遺伝子が宿主環境内で耐性を発生
し得る可能性を評価／ランク付けることが可能である。
【０３０４】５．５．４ 結合化合物の合理的デザイン 本明細書に記載されたようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば感
染症因子の増殖阻害、および／または感染症の改善に有用であり得る。化合物は
、限定しないが、他の細胞タンパク質を含むことができる。結合化合物は、限定
しないが、ペプチド類、例えば溶解性ペプチド、例えば標的遺伝子産物トランス
メンブランレセプター類の細胞外部分を含むペプチド類、並びにＤ−および／ま
たはＬ−配位アミノ酸類から作られた無作為ペプチドライブラリのメンバー（Ｌ
ａｍら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２〜８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、
１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４〜８６を参照）、合理的にデザインされ
たアンチペプチド（Ｈｕｒｂｙら、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈ
ｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｅｐｔｉｅｄｅｓ、“Ｉ
ｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ”
、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク（１９９２年）、ｐｐ．２８９〜３０
７を参照）、抗体（限定しないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒ
ト化、抗イディオタイプ、キメラまたは１本鎖抗体、およびＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’
）２およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、およびそれらのエピトープ結合断片を
含む）、および小さな有機分子または無機分子を挙げることができる。レセプタ
ー型標的分子の場合、このような化合物には、ＥＣＤに結合し、天然のリガンド
（すなわちアゴニスト類）により引きおこされる活性を擬態する有機分子（ペプ
チド擬似体など）；並びにペプチド、抗体又はその断片、及びＥＣＤ（またはそ
の部分）を擬態し、結合して天然リガンドを“中和する”その他の有機分子（例
えばペプチドミメチック類）が含まれうる。
【０３０５】 コンピュータモデリングおよび検索技術は、化合物の同定または既に同定され
た化合物の改良を可能にし、標的遺伝子の発現または活性を変調できる。このよ
うな化合物または組成物を同定して、好ましくは活性部位または領域を同定する
。レセプター分子に影響を与える化合物の場合、このような活性部位は、一般に
はリガンドとレセプター自体との相互作用ドメインなどのリガンド結合部位であ
ると思われる。活性部位は、例えば、アミノ酸のペプチド配列、核酸のヌクレオ
チド配列または天然リガンドを有する関連化合物の複合体または組成物の研究か
らなど、当業界で公知の方法を用いて同定される。後者の場合、化学的方法また
はＸ線結晶回折法を使用して、複合リガンドがどこに見られるかを見つけだすこ
とにより、活性部位を見出す。
【０３０６】 次に好ましくは、活性部位の三次元幾何学構造が決定される。これは、完全な
分子構造を決定するＸ線結晶回折法など、公知の方法で行なわれる。固相または
液相ＮＭＲはまた、活性部位および／またはリガンド結合複合体内の、ある一定
の分子内距離を測定するために使用される。当業者に知られた他の実験的構造決
定法は、部分的または完全な幾何学構造を得るためにまた使用される。この幾何
学構造は、決定される活性部位構造の精度を増す複合リガンド、天然物または人
工物とともに測定される。コンピュータベースの多くのモデリング法は、構造を
完全なものにするために（例えば、不完全なまたは不十分な精密構造を決定する
実施形態において）、またはその精度を改善するために使用される。
【０３０７】 最後に、活性部位の構造を決定して、実験、モデリング、または組合せにより
、候補モジュレート化合物が、分子構造の情報を伴った化合物を含む検索データ
ベースにより同定される。このような検索は、決定された活性部位構造とマッチ
し、活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物を探索する。この
ような検索は手動でできるが、好ましくはコンピュータを用いる。この検索から
見出されたかかる化合物は、可能性のある標的または経路の遺伝子産物をモジュ
レートする化合物である。
【０３０８】 あるいは、これらの方法は、既知のモジュレート化合物またはリガンドから改
良したモジュレート化合物を同定するのに使用される。既知の化合物の構成要素
は改変され、改変による構造的な効果は、実験的および上記のコンピュータモデ
リング法を用いて新規組成物に適用して決定される。次に、変化した構造を化合
物の活性部位の構造と比較して、改良された適合(fit)または相互作用が得られ
るかを測定する。この様式で、側鎖を変えることなど、構成要素の系統的な変化
を迅速に評価して、改変されたモジュレート化合物または特異性または活性の改
良されたリガンドを獲得する。
【０３０９】 標的もしくは経路の遺伝子または遺伝子産物の活性部位および関連するシグナ
ル伝達および転写因子の同定に基づくモジュレート化合物を同定するのに有用な
さらなる実験的およびコンピュータモデリング法は、当業者にとって明らかであ
る。
【０３１０】 以下のものをはじめ、特定の蛋白質と相互作用する薬物のコンピュータモデリ
ングの技術を概説する多くの文献がある：Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８年、
Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅｎｎｉｃａ９７：１５９〜１６
６；Ｒｉｐｋａ、（１９８８年６月１６日）、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ５４
〜５７；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９年、Ａｎｎｕ、Ｒ
ｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１＝１１２；Ｐｅｒ
ｒｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｓｉｇｎ ｐｐ．１８９〜１９３（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８９年）
；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．London２３
６：１２５〜１４０および１〜１６２；および核酸成分のモデルレセプターに関
して、Ａｓｋｅｗら、１９８９年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０
８２〜１０９０． 結合性を変化させ得る化合物の設計および製造するために、参照として一般的
なものを上記したが、天然の産物または合成化学物質を含む既知の化合物、並び
に蛋白質を含む他の生物学的活性物質のライブラリーを、阻害剤または活性化剤
である化合物についてスクリーニングすることもできる。
【０３１１】５．６ 転写プロファイル ５．６．１ 遺伝子発現解析 遺伝子発現プロファイリング法は、好適な生化学的標的の同定、並びに既知の
化合物の作用様式の決定にとって重要な手段である。C. albicansゲノム配列の
完成およびこの情報を取り込む核酸ミクロアレイの開発は、この複相病原性真菌
類を用いて実施するゲノム全体に亘る遺伝子発現解析を可能にする。したがって
、本発明は、Candida albicansの必須遺伝子および毒性／病原性遺伝子の双方に
関する転写応答プロファイルを獲得する方法を提供する。必須遺伝子の条件付き
発現は、例えばC. albicansに焦点を合わせた薬物スクリーニングプログラムの
設計に有用な制御的相互作用の概要を明らかにするのに寄与する。
【０３１２】 本発明の実施形態において、GRACE株集団は、この病原体内の必須遺伝子の発
現解析に使用される。このような株集団の１つの特に強力な用途には、病原体内
全体の必須遺伝子セット、または必須遺伝子の所望のサブセットに関する包括的
な転写プロファイルデータベースの構築が含まれる。このようなデータベースは
、リード抗真菌性化合物に特徴的な応答プロファイルと新規抗真菌化合物により
得られたプロファイルと比較するのに用いられ、類似のものと別の作用様式のも
のとを区別する。リード化合物で株を処理した後に測定された転写応答プロファ
イルを、抑制条件下で、特定の必須標的遺伝子によって得られたものとのマッチ
ング（または部分的な重ね合わせ）することは、標的と可能性のある薬物作用様
式を同定するのに用いられる。
【０３１３】 必須遺伝子の遺伝子発現解析はまた、病原体内の調べようとする遺伝子の生物
学的機能および制御をも可能にし、この情報は薬物スクリーニングプログラムに
組込まれる。例えば、C. albicansの必須薬物標的の転写プロファイルは、既存
の薬物標的について解明されたものと同一の細胞内プロセスまたは経路に関与す
る新規薬物標的の同定、またはさもなければ病原体で直接実験することなく同定
できなかった新規薬物標的の同定を可能にする。これらは、病原体に特有な遺伝
子を含むのみならず、病原体内で別個の機能を有するかまたは異なる制御に関与
する広範な遺伝子種も含む。さらに、病原体特異的経路が明らかにされ、初めて
解明される。
【０３１４】 本発明の他の態様において、非抑制または誘導条件下でGRACE由来株の遺伝子
発現プロファイルは、１種以上の薬物標的に関する過剰発現応答プロファイルを
評価するために確立される。例えば、シグナル伝達経路において機能を果たす遺
伝子の過剰発現は、上記条件下で経路の無制御な活性を示すことが多い。さらに
、幾つかのシグナル経路は、病原性の発生過程において機能を果たすことが証明
された。C. albicans の GRACE 株を過剰発現することにより生成された転写応
答プロファイルは、このような経路により制御される遺伝子セットに係る情報、
すなわち、そのうちのいずれが病原性の発生において不可欠な役割を潜在的に担
っており、したがって有望な薬物標的であるかという情報を提供する。さらに、
発現プロファイルの解析により、その発現が調節カスケード全体に続く発現に重
要な１種以上の遺伝子を明らかにすることができる。したがって、これらの遺伝
子は、薬物探索にとって特に重要な標的であり、対応する改変対立遺伝子対を担
持する変異体は、作用機序に基づくスクリーニングアッセイの基礎を成す。現在
、このようなアプローチは不可能である。現行の薬物探索では、大量の数の「候
補」化合物が得られているが、それらの作用様式はほとんど解明されていない。
GRACE株集団を用いて作成される遺伝子シャットオフおよび過剰発現のプロファ
イル双方を含む転写応答データベースは以下のことによって、この薬物発現の障
壁に対する解決を提供するものである；１）野生株の抗真菌性阻害により得られ
る転写応答またはプロファイルを決定する、そして、２）この応答をGRACE株集
団を含む薬物標的の不活性化または過剰発現により得られる転写プロファイルと
比較する。
【０３１５】 薬物標的の遺伝子変更および野生型細胞の化学物質／化合物阻害双方から生じ
る適合した、または関連性の高い転写プロフィールは、化合物をその細胞の薬物
標的と結合させる証拠を提供しその作用機序を示唆する。
【０３１６】 したがって、本発明は、配列同定番号１〜６１の１つを含んで成るヌクレオチ
ド配列によりコード化された標的遺伝子産物に対する該化合物を評価する方法を
提供し、この方法は以下のステップを含んで成る。すなわち、（ａ）野生型二倍
体真菌細胞または対照細胞を化合物と接触させ、第１の転写プロフィールを生成
するステップ、（ｂ）標的遺伝子の第２の対立遺伝子が実質的に過小発現される
か発現されない、または過剰発現される条件下で培養され、培養細胞に関して第
２の転写プロフィールを生成しているＧＲＡＣＥなどの変異体の二倍体真菌細胞
の転写プロフィールを決定し、第１の転写プロフィールを、第２の転写プロフィ
ールと比較して、それらのプロフィールにおける類似性を特定するステップ。比
較において、プロフィール間の類似性は、指標値として表現され、この指標値が
高いほど、該化合物はより望ましい。
【０３１７】５．６．２ 第２標的の同定 第２標的の同定を目的としてここに方法を記載する。ここに用いられる“第２
標的”とは、その遺伝子産物が、規定された条件セット下で、生物の増殖および
／または生存に関与する標的遺伝子産物（すなわち標的必須遺伝子産物）、また
は宿主の感染時に生体の病理機構に関与する標的遺伝子産物（すなわち標的毒性
遺伝子産物）と相互作用する能力を表す遺伝子を言う。
【０３１８】 遺伝子産物と標的遺伝子産物との相互作用を同定することにより第２標的遺伝
子産物を同定するために、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに好適
な任意の方法を用いることができる。このような知られた遺伝子産物は細胞内タ
ンパク質でも、または細胞外タンパク質でもあり得る。このような知られた遺伝
子産物と相互作用する遺伝子産物は、第２標的遺伝子産物であり、それらをコー
ド化する遺伝子は第２標的である。
【０３１９】 従来から用いられる方法には、共免疫沈殿、架橋、および勾配またはクロマト
グラフィーカラムによる共精製がある。このような方法を利用することにより、
第２標的遺伝子産物の同定が可能である。第２標的遺伝子産物が同定されると、
それは対応する第２標的を同定するために、標準的方法と組合せて用いられる。
例えば、エドマン分解法（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３年、“Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ、ニューヨーク州ｐｐ．３４
〜４９を参照）によるなど、当業者によく知られた方法を用いて、第２標的遺伝
子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部分を確認する。得られたアミノ酸配列は
、第２標的遺伝子配列のスクリーニングに使用し得るオリゴヌクレオチド混合物
生成の指標として用いることができる。スクリーニングは、例えば標準的なハイ
ブリダイゼーションまたはＰＣＲ法により達成できる。オリゴヌクレオチド混合
物の生成法およびスクリーニング法はよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅ
ｌ、上記、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｂａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ｉｎｎｉｓ、Ｍ．
ら、編集 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ、ニューヨークを参照）。
【０３２０】 したがって、これらの方法を用いることにより規定された条件セット下で、生
物の増殖および／または生存に関与するタンパク質または宿主の感染時に生体の
病理機構に関与するタンパク質と相互作用するタンパク質をコード化する第２標
的を同時に同定することができる。これらの方法としては、例えば知られた、ま
たはこれらの機構に関与していると示唆される、またはこれらの機構に重要であ
ると示唆される標識化第１標的遺伝子タンパク質により、λｇｔ１１ファージラ
イブラリの抗体プローブ化というよく知られた方法と同様の方法でこのタンパク
質を用いる、発現ライブラリのプローブ化が挙げられる。
【０３２１】 In vivoでのタンパク質相互作用を検出する一方法であるツーハイブリッドシ
ステムを、限定のためではなく、例示のみの目的で詳細に記載する。このシステ
ムの一変法の記載は既にあり（Ｃｈｅｉｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８〜９５８２）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社（カリフォルニア州パロアルト）から市販されている。
【０３２２】 手短に言うと、このような方法を利用して、ハイブリッドタンパク質をコード
化する２種のプラスミドを構築する。１つは知られたタンパク質、この場合は生
物の増殖または病原性に関与することが知られているタンパク質に融合した転写
活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインから成り、もう１つは、ｃＤＮＡラ
イブラリの部分として、このプラスミド内に組換えられたｃＤＮＡによりコード
化される未知のタンパク質に融合した活性化因子タンパク質の活性化ドメインか
ら成る。プラスミドを、調節領域に転写活性化因子の結合部位を含むリポーター
遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）を含有する酵母株 S. セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）へ形質転換する。どちらのハイブリッドタンパク質も単独ではリポ
ーター遺伝子の転写を活性化できない。ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは活性
化機能を与えないために、また活性化ドメインハイブリッドは活性化因子の結合
部位に局在化できないために、活性化できない。この２種のハイブリッドタンパ
ク質の相互作用により、機能し得るハイブリッドタンパク質が再構成され、リポ
ーター遺伝子の発現が生じ、これがリポーター遺伝子産物に関するアッセイによ
って検出される。
【０３２３】 このツーハイブリッドシステムまたはそれに関連する方法を、知られた“おと
り”遺伝子産物と相互作用するタンパク質に関する活性化ドメインライブラリの
スクリーニングに用いる。限定のためではなく例示の目的で標的必須遺伝子産物
および標的毒性遺伝子産物がおとり遺伝子産物として用いられている。標的必須
遺伝子産物、標的病原性遺伝子産物またはそれらの部分をコード化する全ゲノム
またはｃＤＮＡ配列を活性ドメインをコード化するＤＮＡに融合する。ライブラ
リと、ＤＮＡ結合ドメインに融合されたおとり遺伝子産物のハイブリッドをコー
ド化するこのプラスミドを、酵母のリポーター株に共形質転換し、その結果生じ
た形質転換体をリポーター遺伝子を発現するものに関してスクリーニングする。
限定のためではなく例示の目的で、おとり遺伝子をＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ
結合ドメインをコード化するＤＮＡに翻訳融合されるようにベクター内にクロー
ン化する。これらのコロニーを精製し、リポーター遺伝子発現の原因となるライ
ブラリ−プラスミドを単離する。次にＤＮＡ配列決定を利用して、ライブラリ−
プラスミドがコード化するタンパク質を同定する。
【０３２４】 おとり遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出されることになる細胞系の
ｃＤＮＡライブラリを当業界で慣例化した方法を用いて作製する。ここに記載さ
れた特定の方法により、例えばｃＤＮＡ断片を、ＧＡＬ４活性化ドメインに翻訳
融合されるようにベクター内に挿入する。このライブラリをおとり遺伝子−ＧＡ
Ｌ４融合プラスミドと共に、ＧＡＬ４活性化配列を含有するプロモーターにより
駆動されるＬａｃＺ遺伝子を含む酵母株内に共形質転換する。ｃＤＮＡがコード
化するタンパク質は、ＧＡＬ４活性化ドメインに融合され、それがおとり遺伝子
産物と相互作用して、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、それによってｌａｃ
Ｚ遺伝子発現を駆動する。ｌａｃＺを発現するコロニーは、Ｘ−ｇａｌ存在下、
青色により検出される。次にｃＤＮＡをこれらの株から精製して、当業界で慣例
化した方法を用いておとり遺伝子と相互作用するタンパク質を生産し、単離する
ために用いることができる。
【０３２５】 第２標的を同定し単離したら、これをさらに特性化して、本発明の方法による
薬物発見に用いる。
【０３２６】５．６．３ 遺伝子発現アレイの使用 プロファイリングを行うために、遺伝子発現アレイおよびマイクロアレイを用
いることができる。遺伝子発現アレイとは、ガラス表面上、シリコン上、または
ナイロン薄膜上などの特異的な位置に沈着したＤＮＡサンプルの高密度アレイで
ある。このようなアレイは、異なる条件下相対的な遺伝子発現を定量化するため
に研究者により使用される。この技術の例が米国特許第５８０７５２２号に見ら
れ、これは参照により本発明細書に組み入れられる。
【０３２７】 単一アレイを用いて、特定の微生物のゲノムにおける実質的に全ての遺伝子発
現を研究することができる。例えば、アレイはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎ
ｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からのＯＲＦに相当するＰＣＲ産物を含む１２×
２４ｃｍのナイロンフィルターから構成されていてもよい。それぞれ１０ナノグ
ラムの産物をフィルター上に１．５ｍｍ毎にスポットする。一本鎖の標識された
ｃＤＮＡを、（第２のストランド合成または増幅ステップは行わない）アレイに
ハイブリダイズさせるために調製し、そしてフィルターに接触させる。それゆえ
、標識されたｃＤＮＡは「アンチセンス」配向である。ホスホリメージャーを用
いて定量分析を行う。
【０３２８】 総細胞ｍＲＮＡのサンプルからのｃＤＮＡを、そのようなアレイにハイブリダ
イズさせた後、当業者に知られている１つまたはそれ以上の多くの技術により結
合を検出すると、ｃＤＮＡがハイブリダイズするアレイ上の各点においてシグナ
ルが得られる。それゆえアレイ中のそれぞれの位置で得られたハイブリダイゼー
ションシグナルの強度は、サンプル中に存在していた特定の遺伝子についてのｍ
ＲＮＡ量を反映している。それゆえ、異なる条件下で増殖した細胞から単離した
ｍＲＮＡについて得られた結果を比較すれば、異なる条件下で増殖している間で
のそれぞれの個々の遺伝子の発現の相対量を比較することができる。
【０３２９】 遺伝子発現アレイは、真菌の繁殖、毒性または病原性のために必要とされる遺
伝子産物のレベルまたは活性を低下させた後の多くの時点で、全ｍＲＮＡ発現パ
ターンを分析するために用いられる。調節可能なプロモーターに結合した核酸産
物が真菌の増殖、残存、増殖、毒性または病原性に関して律速となる条件下にＧ
ＲＡＣＥ株が増殖することにより、または標的遺伝子産物のレベルまたは活性を
低下さっせる薬剤と細胞とを接触させることにより、遺伝子産物のレベルまたは
活性の低下が起こる。アレイへのハイブリダイゼーションにより示された発現パ
ターンの分析により、遺伝子産物のレベルまたは活性の低下により発現が影響を
受ける他の遺伝子についての情報が得られる。例えば、他のｍＲＮＡレベルは、
増殖、生存、繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子産物のレベルまたは活性の
低下の後に増加、減少または維持することを観察してもよい。それゆえ、増殖、
生存、繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子産物のレベルまたは活性の低下の
後に観察されるｍＲＮＡ発現パターンは、増殖、生存、繁殖、毒性または病原性
に必要な他の核酸を特定する。加えて、真菌類を候補薬剤化合物または知られて
いる抗生物質に暴露したときに観察されるｍＲＮＡ発現パターンを、真菌類の増
殖、生存、繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子産物のレベルまたは活性が低
下する時に観察されるｍＲＮＡ発現パターンと比較する。候補薬剤化合物を用い
たときに観察されるｍＲＮＡ発現パターンが、遺伝子産物のレベルが低下する時
に観察されるｍＲＮＡ発現パターンと同様の場合、薬剤化合物は有力な治療候補
である。それゆえ、薬剤開発に使用するための有力な候補薬剤化合物の選択を補
助するものとして、該アッセイは有用である。
【０３３０】 アレイに沈着した核酸の源およびアレイにハイブリダイズする核酸の源が２種
の異なる微生物からである場合、遺伝子発現は２種の微生物中の相同性遺伝子と
一致する。
【０３３１】５．７ プロテオミクスアッセイ 本発明の他の実施形態において、およびＧＲＡＣＥ株集団が病原体内でプロフ
ァイリングが出来るのとほぼ同様の方法において、ＧＲＡＣＥ株集団はゲノムの
発現されたタンパク質の総量を分析するための貴重な資源を提供する。抑圧およ
び非抑圧増殖条件下にＧＲＡＣＥ株集団のメンバーにより全タンパク発現を評価
することにより、細胞のタンパク発現のパターン間の相関が、必須遺伝子の非発
現または発現レベルにより得られる。したがって、本発明は、タンパク質発現パ
ターンを確立することが当技術分野でよく知られている、２次元ゲル電気泳動法
などの方法により測定される、ＧＲＡＣＥ株における一連のタンパク質の発現パ
ターンを提供する。株を異なる条件でおよび修飾した対立遺伝子の１つの発現レ
ベルが異なるように培養すると、多くのタンパク質発現パターンが１つのＧＲＡ
ＣＥ株に関して発生するであろう。
【０３３２】 また他の実施形態において、まだ定義していない化合物で株を処理することに
より観察される株に相当するタンパク発現プロフィールを示す株を作り出すため
に、明確な遺伝子突然変異を構築することができる。このように、真菌特異的標
的で作用し、そしてその活性モードを測定することができる他の有力なリード化
合物から、複雑な方法で多くの標的に作用する抗真菌化合物を区別することは可
能である。
【０３３３】 細胞内で発現したタンパク質の総数を計算することは、２次元ポリアクリルア
ミドゲルでまたは他の分離技術により検出可能な全タンパク質種を確実に同定す
ることに依存する。しかしながら、これらのタンパク質の大部分は極めて低量で
あり、ペプチド配列決定または質量分析法により確実に同定するために必要な閾
値に達していない。それにも関わらず、これらの「みなしご」タンパク質は、個
々のＧＲＡＣＥ株によるタンパク質発現の分析を用いて検出可能である。抑圧的
対非抑圧的条件または過剰発現条件下でのＧＲＡＣＥ株のタンパク質プロフィー
ルを比較することにより、低量の遺伝子産物の条件付き発現は確実な同定を促進
する。多くの場合、多重タンパク質に関する定常状態レベルが変化するため、よ
り複雑なタンパク質プロフィールになる結果となり、これは問題になっている低
量の遺伝子をマニピュレートすることにより間接的に引き起こされる。ＧＲＡＣ
Ｅ株集団内の個々の標的を過剰発現させると、ペプチド配列決定または質量分析
法のために充分な物質を提供することにより、みなしごタンパク質の同定を直接
的に助けることもできる。
【０３３４】 多くの実施形態において、本発明は、二倍体病原性真菌細胞の発現タンパク質
量の定量分析法を提供する。最初のタンパク質発現プロフィールを対照二倍体病
原性真菌（これは標的遺伝子のための２種の非修飾対立遺伝子を有する）につい
て開発する。例えばＧＲＡＣＥ株において標的遺伝子の１つの対立遺伝子が不活
性化されている対照株の突然変異体が、遺伝子破壊カセットの挿入または置換に
より発生する。この第２の対立遺伝子の発現が異種の制御されたプロモーターの
制御下であるように他の対立遺伝子を修飾する。第２のタンパク発現プロフィー
ルはこの突然変異体真菌のために開発され、これは対照株中の遺伝子の２つの対
立遺伝子の発現と比較して、第２の対立遺伝子が実質的に過剰発現される条件下
に行われる。同様に、所望であれば、第３のタンパク質発現プロフィールは、対
照株中の遺伝子の２つの対立遺伝子の発現と比較して、第２の対立遺伝子が実質
的に不充分に発現される条件下に開発される。そして最初のタンパク発現プロフ
ィールを第２の発現プロフィールと、および妥当な場合、第２のプロフィールに
おいて高レベルで、そして妥当な場合、最初のプロフィールにおけるレベルと比
較して第３のプロフィールにおける低レベルで、検出された発現タンパク質を同
定するために第３のタンパク質発現プロフィールと比較する。
【０３３５】 したがって、本発明は、配列番号１から６１の１つを含むヌクレオチド配列に
よりコード化された標的遺伝子産物に対して化合物を評価する方法を提供する。
この方法は、（ａ）野生型二倍体真菌細胞または対照細胞を化合物と接触させ、
そして最初のタンパク質発現プロフィールを発生させ、（ｂ）ＧＲＡＣＥ株など
の、標的遺伝子の第２の対立遺伝子が実質的に不充分に発現され、発現されない
、または過剰に発現される条件下に培養された、突然変異体二倍体真菌細胞のタ
ンパク発現プロフィールを決定し、培養細胞についての第２のタンパク質発現プ
ロフィールを発生させて、プロフィールにおける同一性を同定するために、第２
のタンパク質発現プロフィールと第１のタンパク質発現プロフィールとを比較す
るステップを含む。比較において、プロフィールの同一性は、指示値として表す
ことができ、より高い指示値の化合物が好ましい。
【０３３６】５．８ 医薬組成物およびその使用 本明細書に記載する本発明の方法により同定される核酸分子を含む化合物は、
カンジダ・アルビカンスなどの病原性生物による感染症を処置または予防するた
めに、治療的に効果的な用量で被験者に投薬できる。標的によっては、本化合物
は、被験者における癌などに制限はされないがこれらの非感染症の治療にも有用
である。治療的に効果的な用量とは、処置された被験者に健康上の利益を与える
のに充分な（核酸分子を含む）化合物の量を指す。通常、化合物は、配列番号１
〜６２から成る群より選択される配列を含む核酸によりコード化された遺伝子産
物の活性またはレベルを低下させることにより作用するが、これに限定されるも
のではない。処置されるべき被験者は、植物、脊椎動物、哺乳動物、鳥類、また
はヒトであり得る。これらの化合物は、カンジダ・アルビカンスによる対象の汚
染を予防または阻止するために用いることも、またはカンジダ・アルビカンスを
含む生物膜の表面での形成を予防または抑制するために用いることもできる。カ
ンジダ・アルビカンスを含む生物膜は、外科用具、移植用装置、カテーテルおよ
びステントなどの医療用具表面に見られるが、これらに限定されるものではない
。
【０３３７】５．８．１ 効果的用量 化合物の毒性および治療的有効性は、例えばＬＤ５０（集合の５０％を死に至
らしめる用量）およびＥＤ５０（集合の５０％に治療的効果がある用量）を決定
するための、培養細胞または実験動物中の標準薬剤処方により決定することがで
きる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比
として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作
用を示す化合物を用いるときは、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小化
し、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織部位にこの種
の化合物を標的化する送達システムを設計することに注意を払わねばならない。
【０３３８】 ヒトに使用するための用量範囲を明確にするために、細胞培養アッセイおよび
動物試験から得られたデータを用いることができる。このような化合物の用量は
、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であることが
好ましい。使用した投薬形態および使用した投薬方法によって、用量をこの範囲
内で変えることができる。本発明の方法に使用したどの化合物においても、治療
的に効果的な用量を細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。細胞培
養中で決定したようにＩＣ５０（すなわち、症状を最大抑制の半分にする試験化
合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を実現するために動物モデルに用量を製
剤化できる。ヒトに有用な用量をより正確に決定するために、このような情報を
用いることができる。例えば高速液体クロマトグラフィにより、血漿中レベルを
測定できる。有効な用量は、体重１ｋｇに対して０．００１ｍｇから１０ｍｇの
範囲である。
【０３３９】５．８．２ 製剤および使用 本発明に従って使用するための薬剤組成物を、１つ以上の生理学的に許容でき
る担体または賦形剤を用いた従来の方法によって製剤化できる。
【０３４０】 それゆえ、該化合物およびこれらの生理学的に許容できる塩および溶液を吸入
またはガス吸入（経口または経鼻）による投与、または経口、舌下、非経口また
は直腸投与のために製剤化できる。
【０３４１】 経口投与のためには、薬剤組成物は、例えば、接着剤（例えば、アルファ化ト
ウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶性のセルロースまたはリン酸水素カ
ルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ
）；崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）
；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容できる
賦形剤を用いて従来の方法により調製した錠剤またはカプセル剤の形態を取るこ
とができる。錠剤は当技術分野においてよく知られている方法によってコーティ
ングを施すことができる。経口投与ための液体調製品は、例えば、溶液、シロッ
プまたは懸濁液の形態であり、または使用前に水またはその他の適切な媒体で構
成する乾燥製品として存在することができる。このような液体調製品は、懸濁化
剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または食用硬化油脂）；
乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモ
ンドオイル、油性エステル類、エチルアルコール、または分別植物油）；および
保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビ
ン酸）などの薬学的に許容できる添加剤を用いて従来の方法により調製できる。
調製品は、緩衝塩、香味料、着色料および甘味剤を適当に含むこともできる。
【０３４２】 経口投与にのための調製品は、活性化合物の放出を制御するように適切に製剤
化できる。
【０３４３】 舌下投与ため、組成物を従来の方法によって製剤化した錠剤またはトローチ剤
の形態にすることができる。
【０３４４】 吸入による投与ため、本発明に従って使用するための化合物は、例えば、ジク
ロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエ
タン、ニ酸化炭素またはその他の適切な気体などの適切な噴霧剤を用い、加圧包
装されたエアゾール噴霧器またはネブライザーの形で簡便に送達される。加圧エ
アゾール噴霧器の場合、用量単位は、定量を送達するための供給弁によって決定
することができる。吸入器または通気器での使用において、例えばゼラチンなど
のカプセルおよびカートリッジは、化合物および乳糖またはでんぷんなどの適切
な粉末基剤の混合粉末を含むように製剤化できる。
【０３４５】 例えばボーラス注射または連続注入などの注射による非経口投与（例えば、静
脈内または筋肉内投与）のために化合物を製剤化できる。注射用製剤は、保存剤
を加えて例えばアンプル中または多用量容器中に単位用量形態で提供できる。組
成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳化液などの形態をと
ることができ、および懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤
を含むことができる。あるいは、活性成分は使用前に、例えば滅菌パイロジェン
フリー水などの適切な担体で構成される粉末形態にできる。
【０３４６】 化合物は、例えば、ココアバターまたはその他のグリセリド類などの従来から
の坐薬基材を含む坐薬または保持浣腸剤などの直腸配合物にも製剤化できる。
【０３４７】 前述の製剤に加えて、化合物は蓄積調製品としても製剤化できる。この種の長
時間作用性製剤は埋め込み（例えば、皮下へのまたは筋肉内への）によってまた
は筋肉内注射によって投与できる。それゆえ例えば、化合物は、適切な重合体材
料または疎水性材料（例えば、許容できる油脂中の乳化液などの）またはイオン
交換樹脂とともに、または例えば、やや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導
体類として製剤化できる。
【０３４８】６．実施例 ６．１ ＣａＫＲＥ９の修飾対立遺伝子を含むＧＲＡＣＥ株の構築 ステップ１（すなわち、遺伝子交換）にて使用したＳＡＴ選択可能標識をＰＣ
Ｒ増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＲＣ１８−ＡＳＰ中のＳ
ＡＴ破壊カセット（disruption cassette）と相補的な２５個のヌクレオチド、
およびＣａＫＲＥ９オープンリーディングフレームに隣接する領域と相同の６５
個のヌクレオチドを含む。ＰＣＲ増幅後に産出された２．２ｋｂのｃａｋｒｅ９
△：：ＳＡＴ破壊フラグメント、およびその結果得られる形質転換後の相同性組
み換えによる最初の野生型ＣａＫＲＥ９対立遺伝子の遺伝子置換を図２に示す。
ＰＣＲ条件は以下の通りである：５〜５０ｎｇのｐＲＣ１８−ＡＳＰ、１００ｐ
ｍｏｌの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３
）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｇｉｂｃｏ）。ＰＣＲ増幅時間は、９４℃で５分間、５４℃で１分間
、７２℃で２分間を１サイクル、９４℃で４５秒間、５４℃で４５秒間、７２℃
で２分分間を30サイクルである。ＢｒａｕｎおよびＪｏｈｎｓｏｎによるカンジ
ダ・アルビカンスに合わせた酢酸リチウム法（Ｂ．Ｒ．ＢｒａｕｎおよびＡ．Ｄ
．Ｊｏｈｎｓｏｎの「転写性抑制ＴＵＰＩによるカンジダ・アルビカンス中のフ
ィラメント形成制御」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻、１０５〜１０９頁、１９９
７年）を用い、３０℃および４２℃でのインキュベーション時間を短くし（それ
ぞれ１時間および５分間）、および形質転換される物質量をより多くする（エタ
ノールで沈殿させたｃａｋｒｅ９△：：ＳＡＴ ＰＣＲ産物５０μｇ）など少し
修飾して、形質転換を行った。ストレプトスライシン（４００μｇ／ｍｌ）を含
むＹＰＤ培地上にレプリカをプレートする前に、ＳＡＴの発現のためにプレイン
キュベート時間を与えるように、形質転換細胞をＹＰＤプレート上に塗布して３
０℃で終夜インキュベートした。ストレプトスライシン−耐性コロニーを３６時
間後検出し、ＣａＫＲＥ９およびｃａｋｒｅ９△：：ＳＡＴ対立遺伝子の両方を
増幅する適切なプライマーを用いるＰＣＲ分析により、ｃａｋｒｅ９△：：ＳＡ
Ｔ／ＣａＫＲＥ９ヘテロ接合型を同定した。
【０３４９】 ステップ２（すなわち、プロモーター置換）にて使用する条件付きプロモータ
ーをＰＣＲ増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＢＳＫ−ＨＴ４
中のＣａＨＩＳ３−標識テトラサイクリン制御プロモーターカセットに相補的な
２５個のヌクレオチド、および転写開始点およびＣａＫＲＥ９オープンリーディ
ングフレームのヌクレオチド１〜６５に関する、−２７０から−２０５のプロモ
ーター領域と相同な６５個のヌクレオチドを含む。得られた２．２ｋｂのＰＣＲ
産物を、ステップ１にて生成したｃａｋｒｅ９△：：ＳＡＴ／ＣａＫＲＥ９ヘテ
ロ接合型株であってＹＮＢ寒天上に選択されたＨｉｓ＋形質転換体に形質転換し
た。ｃａｋｒｅ９△：：ＳＡＴ対立遺伝子およびＣａＨＩＳ３−Ｔｅｔ−ＣａＫ
ＲＥ９対立遺伝子の両方を含むボナファイドＣａＫＲＥ９ ＧＲＡＣＥ株をＰＣ
Ｒ分析により決定した。典型的には、所定の薬剤標的の最終表現型を正確に決定
するために、２つの独立したＧＲＡＣＥ株を構築し評価する。最終表現型は、必
須遺伝子の遺伝子産物が無いことにより引き起こされる。
【０３５０】６．２ ＣａＫＲＥ９ ＧＲＡＣＥ株の表現型決定 得られたＧＲＡＣＥ株の最終表現型を３種の独立した方法で評価した。最初に
、ＹＮＢプレートおよび１００μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む、ＹＮＢプレ
ートの両方におよそ１．０×１０６細胞をストリーキングし、室温で４８時間後
の増殖速度を比較して、ＣａＫＲＥ９ ＧＲＡＣＥ株の最終表現型を素早く決定
した。ＣａＫＲＥ９などの必須遺伝子では、テトラサイクリンの存在下で有意な
増殖は検出されない。第２の手段として、テトラサイクリンプロモーター制御標
的遺伝子の発現のために通常必要であるトランスアクチベーター遺伝子を（目標
とする組み込みが行われている間に形成されるＣａＬＥＵ２配列複製間の組換え
により）切除したｕｒａ−細胞を選択するために、６２５μｇ／ｍｌの５−フル
オロオロチン酸（５ＦＯＡ）および１００μｇ／ｍｌのウリジンを含むカザミノ
酸プレート上にＣａＫＲＥ９ ＧＲＡＣＥ株をストリーキングすることにより、
遺伝子の必須性を決定することができる。再び、このような条件下必須でないＧ
ＲＡＣＥ株は盛んに増殖するのに対して、必須ＧＲＡＣＥ株は増殖しない。テト
ラサイクリンが欠乏しているかまたは１００μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補
足したかの何れかの５．０ｍｌのＹＮＢ中でインキュベートした終夜での培養２
．０×１０３細胞／ｍｌを用い、そして３０℃で２４および４８時間インキュベ
ートした後の吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）を測定して、必須ＧＲＡＣＥ株に関連す
る最終表現型の定量的評価を行った。典型的には、必須ＧＲＡＣＥ株において、
４８時間後に吸光度の有意な増加は検出されない。示された必須遺伝子に対する
細胞死（殺傷性の（ｃｉｄａｌ））最終表現型と増殖抑制（静的な）最終表現型
との間の区別は、インキュベート２４および４８時間後の上記テトラサイクリン
−処置培養から（Ｔ＝０で２×１０３個の洗浄した細胞相当体からの多くのコロ
ニー形成単位（ＣＦＵ）の数により判断して）、生細胞の割合を決定することに
より行われる。殺傷性の最終表現型を産出する必須ＧＲＡＣＥ株は、抑制条件下
でインキュベートした後に生細胞の割合が低下（すなわち、＜２×１０３ＣＦＵ
）していることを示すものである。
【０３５１】６．３ 細胞全体のアッセイにおける標的レベル変化 薬剤スクリーニングのための細胞全体のアッセイにおける標的レベル発現の有
用性を示すために、３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）に対する選択性に関し
て、ＣａＨＩＳ３ヘテロ接合型株とテトラサイクリンプロモーター−制御ＣａＨ
ＩＳ３ ＧＲＡＣＥ株の両方を、野生型（二倍体）ＣａＨＩＳ３株と比較した（
図６）。３−ＡＴはＣａＨＩＳ３によりコード化される酵素であるリン酸イミダ
ゾールグリセロールデヒドラターゼの拮抗阻害剤であり、薬剤および薬剤標的そ
れぞれに対するモデルとして共に用いる。テトラサイクリンプロモーターにより
維持されるＣａＨＩＳ３の構成性発現レベルによりなされる過剰発現は、野生型
およびＣａＨＩＳ３ヘテロ接合型株の両方の増殖を完全に阻害するのに充分なレ
ベルで３−ＡＴ耐性を与える（図６Ａ）。観察された表現型は、ノーザンブロッ
ト分析により決定されたＣａＨＩＳ３の７．５倍の予測された過剰発現を考慮し
て予測されたものと一致している（図５参照）。ヘテロ接合型ＣａＨＩＳ３株は
、野生型またはテトラサイクリンプロモーターに基づく過剰生産ＣａＨＩＳ３株
の何れにも著しい効果がない、中間体である３−ＡＴ濃度に対して高められた感
応性を示す（図６Ｂ）。３−ＡＴに対する特異な感受性のために評価した第３の
ＣａＨＩＳ３発現レベルは、通常は完全に除外するために用いられるテトラサイ
クリンが０．１％である閾値濃度を用いて、ＧＲＡＣＥ ＣａＨＩＳ３株の部分
的抑制により生じた。
【０３５２】 このＣａＨＩＳ３発現レベルは、生存可能ために必要な最低発現レベルを表し
、予測されるように、中間の３−ＡＴ濃度でヘテロ接合型ＣａＨＩＳ３株に相対
して高められた薬剤感受性を示している（図６Ｃ）。同様に、フルコナゾールお
よびツニカマイシンに対するＧＲＡＣＥ株−特異的薬剤抵抗性および感受性表現
型は、これらそれぞれについて知られている薬剤標的、ＣａＥＲＧ１１およびＣ
ａＡＬＧ７、の発現レベルが増加することおよび減少することにより示されてき
た。これらの結果をまとめると、３種の異なる発現レベルがカンジダ・アルビカ
ンスＧＲＡＣＥ株集団を用いて達成され、そしてこれらは知られている薬剤およ
びこれら知られている薬剤標的の間の予測された薬剤感受性表現型を示すことが
明示される。更には、これらの実験は、ＧＲＡＣＥ法を用いて確認されたこれら
の新規な薬剤標的に対する新規な抗真菌性化合物を同定するために、病原体内で
合成された標的遺伝子産物のレベルが、全細胞アッセイに基づく薬剤スクリーニ
ングに如何にはっきり直接適応するかを明確に示している。
【０３５３】６．４ 標的経路の同定 標的経路とは、１つ以上の経路の成分（例えば、酵素、情報伝達分子など）が
、本発明の方法により決定される薬剤標的である、遺伝経路または生化学経路で
ある。
【０３５４】６．４．１ アッセイのためのＧＲＡＣＥ株貯蔵物の調製 スクリーニングのための一定の細胞源を得るために、宿主ＧＲＡＣＥ株の凍結
貯蔵物を標準の微生物学技術を用いて調製した。例えば、細胞増殖のための栄養
物およびＧＲＡＣＥ株がそれに対する抵抗力を付与する遺伝子を含む抗生物質を
含む寒天プレート上に最初の貯蔵物サンプルをストリーキングすることにより、
微生物の単一クローンを単離することができる。終夜で増殖させた後、単離した
コロニーを無菌針を用いてプレートから取り出し、そしてＧＲＡＣＥ株がそれに
対して抵抗力を持つ抗生物質が含まれる適切な液体増殖培地に移す。指数関数的
増殖で株を産出する適切な増殖条件下で細胞をインキュベートする。細胞は標準
の技術を用いて凍結する。
【０３５５】６．４．２ アッセイに使用するためのＧＲＡＣＥ株の増殖 アッセイを行う前に、貯蔵バイアルを冷凍庫から取り出し、素早く解凍し、そ
して細胞増殖のための栄養素およびＧＲＡＣＥ株がそれに対して抵抗力を付与す
る遺伝子を含む抗生物質を含む寒天プレート上に培養液を1ループ分だけストリ
ーキングする。終夜で増殖させた後、無作為に選択し単離したコロニーを、ＧＲ
ＡＣＥ株がそれに対して抵抗力を与える遺伝子を含む抗生物質を含む培地を含む
無菌チューブにプレート（無菌種菌ループ）から移す。均一の細胞懸濁液を形成
するために激しく攪拌した後、懸濁液の吸光度を測定し、そして必要であれば、
懸濁液の一部を培地と抗生物質とを含む第２のチューブ中に希釈する。そして細
胞がアッセイに使用するために適切な吸光度になるまで培養液をインキュベート
する。
【０３５６】６．４．３ アッセイに使用する培地の選択 ＧＲＡＣＥ株の真菌の繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子に結合している
調節可能なプロモーターのためのインデューサーまたはリプレッサーの２倍希釈
群を、ＧＲＡＣＥ株がそれに対する抵抗力を与える遺伝子を含む適切な抗生物質
を含む培養液中で発生させる。多くの培地を横に並べて試験し、それぞれの培地
中それぞれの濃度でインデューサーまたはリプレッサーの効果を評価するために
３から４のウェルを用いる。等容量の試験培地−インデューサーまたはリプレッ
サーおよびＧＲＡＣＥ株を、３８４ウェルのマイクロタイタプレートのウェルに
加え、混合する。細胞を上述のように調製し、試験抗生物質を含む適切な培地中
に希釈した後、直ちにマイクロタイタプレートウェルに添加する。対照として、
インデューサーまたはリプレッサーを含まないそれぞれの培地の多くのウェルに
も細胞を添加する。ウェルの吸光度を監視することにより、インキュベートによ
る細胞増殖を常時監視する。インデューサーまたはリプレッサーのそれぞれの濃
度により引き起こされる増殖抑制の割合を、インデューサーまたはリプレッサー
のない培地中での細胞増殖により示される増殖に対して対数増殖速度を比較する
ことにより算出する。インデューサーまたはリプレッサーに最も高い感受性を有
する培地を、以下に示すアッセイで使用するために選択する。
【０３５７】６．４．４ 標的遺伝子産物のレベルが律速でないＧＲＡＣＥ株における試験抗 生物質感受性の測定 知られた作用機構の抗生物質の２倍希釈群を、ＧＲＡＣＥ株を維持するために
使用する抗生物質を用いて補足したアッセイをさらに開発するために選択した培
養液中で発生させる。異なる経路で作用することが知られている試験抗生物質の
集合を、それぞれの濃度で細胞増殖に対する試験抗生物質の効果を評価するため
に用いられている３から４のウェルをと横に並べて試験する。等容量の試験抗生
物質および細胞を、３８４ウェルのマイクロタイタプレートのウェルに加え、混
合する。ＧＲＡＣＥ株を維持するために必要な抗生物質を用いて補足したアッセ
イ開発のために選択した培地を用いて、細胞を上述のように調製し、同一の培地
に希釈した後、直ちにマイクロタイタプレートウェルに添加する。対照として、
抗生物質が欠乏しているが、抗生物質を溶解するために用いた溶剤は含んでいる
多くのウェルにも細胞を添加する。ウェルの吸光度を監視するマイクロタイタプ
レートリーダー中でインキュベートすることにより細胞増殖を常時監視する。抗
生物質のそれぞれの濃度により引き起こされる増殖抑制の割合を、抗生物質のな
い培地中での細胞増殖により示される増殖に対して対数増殖速度を比較すること
により算出する。ｌｏｇ［抗生物質濃度］に対する抑制割合のプロットから、そ
れぞれの抗生物質についてのＩＣ５０値を推定する。
【０３５８】６．４．５ 標的遺伝子産物のレベルが律速となるＧＲＡＣＥ株における試験抗 生物質感受性の測定 アッセイに使用するために選択した培養液に、上述のように所望量だけ細胞増
殖を抑制することが示されている濃度で、インデューサーまたはリプレッサー並
びにＧＲＡＣＥ株を維持するために用いる抗生物質を補足する。上記で用いた試
験抗生物質のパネルの２倍希釈群を、これらそれぞれの培地中で発生させる。そ
れぞれの濃度で細胞増殖に対する抗生物質の効果を評価するために用いる３から
４のウェルとともに、多くの抗生物質をそれぞれの培地中で横に並べて試験する
。等容量の試験抗生物質および細胞を、３８４ウェルのマイクロタイタプレート
のウェルに加え、混合する。ＧＲＡＣＥ株を維持するために必要な抗生物質を用
いて補足したアッセイに使用するために選択した培地を用いて、細胞を上述のよ
うに調製する。所望量だけ細胞増殖を抑制することが示されているインデューサ
ー濃度を含む同一の培地の２分割に１：１００で細胞を希釈し、そして適切な増
殖条件下でインキュベートする。ＧＲＡＣＥ株を維持するために用いられるイン
デューサーおよび抗生物質を同一濃度で補足した加温殺菌培地中に希釈すること
により適切な吸光度に培養液を調整した後、直ちにマイクロタイタプレートウェ
ルに添加する。対照として、抗生物質を含んではいないが、試験抗生物質を溶解
するために用いた溶剤は含んでいる多くのウェルにも細胞を添加する。ウェルの
吸光度を監視するマイクロタイタプレートリーダー中で適切な増殖条件下にイン
キュベートすることにより細胞増殖を常時監視する。抗生物質のそれぞれの濃度
により引き起こされる増殖抑制の割合を、抗生物質のない培地中での細胞増殖に
より示される増殖に対して対数増殖速度を比較することにより算出する。ｌｏｇ
［抗生物質濃度］に対する抑制割合のプロットから、それぞれの抗生物質につい
てのＩＣ５０値を推定する。
【０３５９】６．４．６ 試験抗生物質の特異性の測定 真菌の繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子産物レベルが律速である場合ま
たは律速でない場合の条件で、作用機構が知られている抗生物質により発生した
ＩＣ５０の比較により、真菌の繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子産物が存
在する経路の同定が可能になる。真菌の繁殖、毒性または病原性に必要な遺伝子
産物を律速するレベルで発現する細胞が、特定の経路で作用する抗生物質に選択
的に感受性がある場合、ＧＲＡＣＥ株中の調節可能なプロモーターに結合した遺
伝子によりコード化される遺伝子産物は、抗生物質が作用する経路に含まれる。
【０３６０】６．４．７ 試験抗生物質が作用する経路の同定 上述のように、細胞に基づくアッセイを、試験抗生物質が作用する経路を決定
するために用いることもできる。このような分析において、ＧＲＡＣＥ株のパネ
ルの各メンバーにおける調節可能なプロモーターの制御下に遺伝子が存在する経
路は、上述のように同定される。真菌の繁殖、毒性または病原性に必要な、知ら
れている生物学的経路にある、繁殖、毒性または病原性を必要とする核酸の転写
を指揮する調節可能なプロモーターをそれぞれ含む細胞のパネルを、試験抗生物
質と接触させる。該抗生物質については、核酸の遺伝子産物が律速であるかまた
は律速でない条件下に作用する経路を決定することが望ましい。高められた感受
性が、遺伝子産物が特定の経路にある遺伝子産物に対して律速である細胞内で観
察されるが、他の経路にある遺伝子産物を律速レベルで発現する細胞内では観察
されない場合、試験抗生物質は、高められた感受性が観察される経路に作用して
いる。
【０３６１】 本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態の範囲に制限されるものではな
い。実際、本明細書に記載したものに加えて本発明の多くの修飾が、前述の記載
および添付している図から当業者に明らかになるであろう。このような修飾は添
付した特許請求の範囲の見地内であることを意図している。
【０３６２】 多くの参照を本明細書に示した。これらの開示内容はそれら全体が参照により
取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Candida albicansにおける遺伝子破壊のためのURAブラスター法を示
す。
【図２】 図２は、遺伝子(CaKRE9)の一方の対立遺伝子の遺伝子破壊の構築、および異種
プロモーターによる条件付きの調節制御下にもう一方の対立遺伝子を置く、該標
的遺伝子のもう一方の対立遺伝子のプロモーター置換を行うGRACE法を示す。
【図３】 図３は、GRACE技術を用いた、KRE1、KRE5、KRE6およびKRE9の条件付き遺伝子
発現を示す。
【図４】 図４は、GRACE技術を用いた、CaKRE1、CaTUB1、CaALG7、CaAUR1、CaFKS1およ
びCaSAT2の条件付き遺伝子発現を示す。
【図５】 図５は、非抑制条件下での発現の上昇を示すための、GRACE株から単離したCaH
IS3、CaALR1、CaCDC24およびCaKRE9のmRNAのノーザンブロット分析を示す。
【図６】 図６は、3-アミノトリアゾール(3-AT)の存在下および不在下での野生型二倍体
CaHIS3株の増殖と比較したCaHIS3ヘテロ接合体株およびテトラサイクリンプロモ
ーター制御CaHIS3 GRACE株の増殖を示す。 図６Aは、阻害レベルの3-アミノトリアゾールの存在下での、テトラサイクリ
ンプロモーター制御イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼを構成的に
発現するCaHIS3 GRACE株と比較した、野生型株およびCaHIS3ヘテロ接合体株の増
殖を示す。 図６Bは、中間レベルの3-アミノトリアゾールの存在下での、野生型株、ハプ
ロインサフィシエント(haploinsufficient)CaHIS3ヘテロ接合体株、およびテト
ラサイクリンプロモーター制御イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ
を構成的に発現するCaHIS3 GRACE株、の増殖を示す。 図６Cは、中間レベルの3-アミノトリアゾールの存在下での、野生型株、一倍
体不全（ハプロインサフィシエント：haploinsufficient）CaHIS3ヘテロ接合体
株、およびテトラサイクリンプロモーター制御イミダゾールグリセロールリン酸
デヒドラターゼを最少量で発現するCaHIS3 GRACE株、の増殖を示す。 図６Dは、中間レベルの3-アミノトリアゾールの存在下での、テトラサイクリ
ンプロモーター制御イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼを最少量で
発現するCaHIS3 GRACE株の高感受性を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 31/10 ４Ｃ０８４ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/37 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 31/10 14/39 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/37 19/00 ４Ｈ０４５ 14/39 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 37/00 １０２ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:725 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 15/00 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:725） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジャン，ボゥ カナダ国 エイチ３ダブリュ ２イー６ ケベック モントリオール，グロベルト ストリート 5231 (72)発明者 ブーネ，シャルレス カナダ国 エム４ティー １ケイ９ オン タリオ トロント，グレンローズ アヴェ ニュー 254 (72)発明者 ブッセイ，ハワード カナダ国 エイチ３ゼット ２エヌ１ ケ ベック ウエストマウント，ビクトリア アヴェニュー 325 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB03 BB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB03 FB04 FB07 4B024 AA20 BA80 CA04 CA06 DA12 EA04 FA10 GA11 4B063 QA18 QQ07 QQ43 QQ48 QR33 QR41 QS31 4B064 AG01 CA06 CA19 CC24 DA13 4B065 AA73X AA99Y AB01 AC20 BA02 CA46 4C084 AA13 AA17 NA14 ZB352 4C085 AA13 AA14 AA15 AA16 BA49 BB33 BB35 BB36 BB41 BB43 CC05 CC22 CC23 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB35 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 EA50 EA60 FA74

Claims (75)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子の両対立遺伝子が改変された二倍体真菌細胞株を構築
    する方法であって、以下のステップ： (a) 二倍体真菌細胞の第1対立遺伝子を、発現可能な選択マーカーをコードす
    る第1ヌクレオチド配列を含む遺伝子破壊カセットを用いて遺伝子組換えするこ
    とにより改変して、該遺伝子の第1対立遺伝子が不活性化されているヘテロ接合
    体二倍体真菌細胞を提供すること；および (b) 該ヘテロ接合体二倍体真菌細胞における遺伝子の第2対立遺伝子を、異種
    プロモーターをコードする第2のヌクレオチド配列を含むプロモーター置換断片
    を用いて遺伝子組換えすることにより、異種プロモーターによって遺伝子の第2
    対立遺伝子の発現が制御されるように改変すること、 を含む、上記方法。
  2. 【請求項２】 それぞれに異なる遺伝子の対立遺伝子が改変されている二倍
    体真菌細胞の集団を構築する方法であって、以下のステップ： (a) 二倍体真菌細胞の第１の遺伝子の第1対立遺伝子を、発現可能な選択マー
    カーをコードする第1ヌクレオチド配列を含む遺伝子破壊カセットを用いて遺伝
    子組換えすることにより改変して、該遺伝子の第1対立遺伝子が不活性化されて
    いるヘテロ接合体二倍体真菌細胞を提供すること；および (b) 該ヘテロ接合体二倍体真菌細胞における第１の遺伝子の第2対立遺伝子を
    、異種プロモーターをコードする第2のヌクレオチド配列を含むプロモーター置
    換断片を用いて遺伝子組換えすることにより、異種プロモーターによって該遺伝
    子の第2対立遺伝子の発現が制御されるように改変して、第1の遺伝子の改変され
    た対立遺伝子対を含む二倍体真菌細胞の第1の株を得ること；および (c) 上記ステップ(a)および(b)を複数回繰り返し、1回繰り返す毎に異なる遺
    伝子が改変されることにより、それぞれに異なる遺伝子の改変対立遺伝子を含む
    二倍体真菌細胞の集団を得ること、 を含む、上記方法。
  3. 【請求項３】 遺伝子破壊カセット内の選択マーカーが、第1領域と第2領域
    の間に配置されており、ここで、第1領域と第2領域は、二倍体真菌細胞の遺伝子
    の第1対立遺伝子の連続していない領域に別々にハイブリダイズするものである
    、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 選択マーカーが、CaSAT1、CaBSR1、CaURA3、CaHIS3、CaLEU2
    、CaTRP1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請
    求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 二倍体真菌細胞が、アスペルギルス・フミガツス（Aspergil
    lus fumigatus）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、黄色アスペルギルス(A
    spergillus flavus)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ
    ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラプシロプシス（Candid
    a parapsilopsis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、クリプトコッカ
    ス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、コクシジオイデス・イミ
    チス（Coccidioides immitis）、エクソファリア・ダーマチジス（Exophalia de
    rmatiditis）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、ヒストプ
    ラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ニューモシスチス・カリ
    ニ（Pneumocystis carinii）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beige
    lii）、リゾパス・アルヒズムス（Rhizopus arrhizums）、ムコール・ルキシー(
    Mucor rouxii)、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、アブシディ
    ア・コリムビゲラ(Absidia corymbigera)、灰色かび病菌(Botrytis cinerea)、
    うどんこ病菌(Erysiphe graminis)、イネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、コ
    ムギ赤さび病菌(Puccinia recodita)、コムギ葉枯病菌(Septoria triticii)、オ
    オムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia controversa)および黒穂菌（Ustilago maydi
    s）からなる群より選択される種の真菌細胞である、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 二倍体真菌細胞がカンジダ属の細胞である、請求項１記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 さらに、 (ｃ) DNA結合ドメインと転写活性化ドメインを含むトランス活性化融合タン
    パク質をコードする、二倍体真菌細胞内で発現可能なヌクレオチド配列を導入す
    ること； を含み、ここで、プロモーター置換断片中の異種プロモーターは、トランス活性
    化融合タンパク質のDNA結合ドメインが結合するヌクレオチド配列の少なくとも1
    コピーを含んでいるために、トランス活性化融合タンパク質の結合が異種プロモ
    ーターからの転写を増大させることを特徴とする、請求項１または２記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 プロモーター置換断片が選択マーカーをさらに含む、請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】 選択マーカーが、CaHIS3、CaSAT1、CaBSR1、CaURA3、CaLEU2
    、CaTRP1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請
    求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 1つの遺伝子の改変対立遺伝子を含む二倍体真菌細胞株で
    あって、該遺伝子の第1対立遺伝子は発現可能な選択マーカーをコードするヌク
    レオチド配列を含む遺伝子破壊カセットを用いて遺伝子組換えすることにより不
    活性化されており、該遺伝子の第2対立遺伝子の発現は、該遺伝子の第2対立遺伝
    子のコード領域に機能し得る形で連結された異種プロモーターにより制御される
    ことを特徴とする、上記二倍体真菌細胞株。
  11. 【請求項１１】 DNA結合ドメインと転写活性化ドメインとを含むトランス
    活性化融合タンパク質をコードする、二倍体真菌細胞内で発現可能なヌクレオチ
    ド配列をさらに含み、かつ、プロモーター置換断片中の異種プロモーターは、ト
    ランス活性化融合タンパク質のDNA結合ドメインが結合するヌクレオチド配列の
    少なくとも1コピーを含んでいるために、トランス活性化融合タンパク質の結合
    が異種プロモーターからの転写を増大させることを特徴とする、請求項１０記載
    の二倍体真菌細胞。
  12. 【請求項１２】 遺伝子が細胞の増殖および/または生存に必須な遺伝子で
    あることを特徴とする、請求項１０または１１記載の二倍体真菌細胞株。
  13. 【請求項１３】 遺伝子が細胞の真菌細胞の宿主生物に対する毒性および/
    または病原性に寄与する遺伝子であることを特徴とする、請求項１０または１１
    記載の二倍体真菌細胞株。
  14. 【請求項１４】 それぞれの株が異なる遺伝子の改変された対立遺伝子を含
    み、真菌のゲノム中の異なる遺伝子の実質的に全ての改変されたものが集団の中
    に存在している、請求項１０記載の二倍体真菌細胞株の集団。
  15. 【請求項１５】 それぞれの株が異なる遺伝子の改変された対立遺伝子を含
    み、該遺伝子のそれぞれが細胞の増殖および/または生存に必須な遺伝子である
    ことを特徴とする、請求項１０記載の二倍体真菌細胞株の集団。
  16. 【請求項１６】 病原性真菌のゲノム中の必須遺伝子の実質的に全ての改変
    されたものが集団の中に存在している、請求項１５記載の二倍体真菌細胞株の集
    団。
  17. 【請求項１７】 それぞれの株が異なる遺伝子の改変対立遺伝子を含み、該
    遺伝子のそれぞれが細胞の真菌細胞の宿主生物に対する毒性および/または病原
    性に寄与する遺伝子であることを特徴とする、請求項１０記載の二倍体真菌細胞
    株の集団。
  18. 【請求項１８】 真菌細胞の宿主生物に対する毒性および/または病原性に
    寄与する、二倍体真菌のゲノム中の遺伝子の実質的に全ての改変されたものが集
    団の中に存在している、請求項１７記載の二倍体真菌細胞株の集団。
  19. 【請求項１９】 集団中に存在する必須遺伝子の全てが、類似の生物学的活
    性、類似の細胞内分布、構造的相同性、配列相同性、殺傷性(cidal)最終表現型
    、静的(static)最終表現型、ヒト遺伝子に対する配列相同性、生物に関する排他
    性(exclusivity)からなる群より選択される特性を共有していることを特徴とす
    る、請求項１４記載の二倍体真菌細胞株の集団。
  20. 【請求項２０】 それぞれの株の細胞が、各株に特有の配列を有する約20ヌ
    クレオチドの分子タグをさらに含む、請求項１４、１５、１７または１９記載の
    集団。
  21. 【請求項２１】 分子タグが遺伝子破壊カセット内に存在している、請求項
    ２０記載の集団。
  22. 【請求項２２】 複数の核酸分子を含む核酸分子マイクロアレイであって、
    各核酸分子が配列番号１〜６２までの配列からなる群より選択される標的ヌクレ
    オチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、上
    記マイクロアレイ。
  23. 【請求項２３】 複数の核酸分子を含む核酸分子マイクロアレイであって、
    各核酸分子が、二倍体真菌細胞の増殖に必須であるかまたは宿主生物に対する二
    倍体真菌細胞の毒性および/または病原性に寄与する遺伝子のヌクレオチド配列
    にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、上記マイクロ
    アレイ。
  24. 【請求項２４】 真菌の生存に必須な遺伝子を同定する方法であって、以下
    のステップ： (a) 請求項１０記載の二倍体真菌細胞を、遺伝子の第２対立遺伝子が実質的
    に発現抑制されるかまたは発現されない条件下で培養すること：および (b) 細胞の生存活性を測定すること、ここで、対照に比べて生存活性が消失
    または低減している場合は、改変された遺伝子が真菌の生存に必須であることを
    示す； を含む、上記方法。
  25. 【請求項２５】 真菌の増殖に必須な遺伝子を同定する方法であって、以下
    のステップ： (a) 請求項１０記載の二倍体真菌細胞を、その遺伝子の第２対立遺伝子が実
    質的に発現抑制されるかまたは発現されない条件下で培養すること：および (b) 細胞の増殖を測定すること、ここで、対照に比べて細胞の増殖が消失ま
    たは低減している場合は、改変された遺伝子が真菌の増殖に必須であることを示
    す； を含む、上記方法。
  26. 【請求項２６】 真菌の毒性および/または病原性に寄与する遺伝子を同定
    する方法であって、以下のステップ： (a) 請求項１０または１１記載の二倍体真菌細胞を、その遺伝子の第２対立
    遺伝子が実質的に発現抑制されるかまたは発現されない条件下で培養すること；
    および (b) 宿主細胞または生物に対する細胞の毒性および/または病原性を測定する
    こと、ここで、対照に比べて毒性および/または病原性が低減している場合は、
    改変された遺伝子が真菌の毒性および/または病原性に寄与するものであること
    を示す； を含む、上記方法。
  27. 【請求項２７】 抗真菌剤に対する真菌の耐性に寄与する遺伝子を同定する
    方法であって、以下のステップ： (a) 請求項１０記載の二倍体真菌細胞を、抗真菌剤の存在下、かつ第２対立
    遺伝子が実質的に過剰発現される条件下で培養すること：および (b) 細胞の生存活性を測定すること、ここで、対照に比べて生存活性が増加
    している場合は、改変された遺伝子が二倍体真菌の抗真菌剤に対する耐性に寄与
    するものであることを示す； を含む、上記方法。
  28. 【請求項２８】 二倍体真菌細胞の増殖を阻害する抗真菌剤を同定する方法
    であって、以下のステップ： (a) 請求項１２記載の二倍体真菌細胞を得ること；および (b) 該二倍体真菌細胞を、試験化合物の存在下、かつその遺伝子の第２対立
    遺伝子が発現抑制される条件下で培養すること； を含み、対照に比べて該二倍体真菌細胞の増殖が消失または低減している場合は
    、試験化合物が抗真菌剤であることを示すことを特徴とする、上記方法。
  29. 【請求項２９】 哺乳動物の疾患の治療用の治療薬を同定する方法であって
    、以下のステップ： (a) 二倍体細胞の改変された遺伝子は必須遺伝子であり、かつ疾患に関連す
    る哺乳動物の遺伝子に配列相同性を示すものである、請求項１０記載の二倍体真
    菌細胞を得ること；および (b) 該二倍体真菌細胞を、試験化合物の存在下、かつその遺伝子の第２対立
    遺伝子が過剰発現または発現抑制される条件下で培養すること； を含み、該二倍体真菌細胞の増殖が対照の増殖と比較して差がある場合は、試験
    化合物が治療薬であることを示すことを特徴とする、上記方法。
  30. 【請求項３０】 二倍体真菌細胞の増殖または繁殖の阻害とタンパク質レベ
    ルの変動とを相関付ける方法であって、以下のステップ： (a) 遺伝子の２つの野生型対立遺伝子を含む対照の二倍体真菌細胞について
    の第１のタンパク質発現プロファイルを作成すること； (b) 請求項１２記載の二倍体真菌細胞を、遺伝子の第２対立遺伝子が実質的
    に発現抑制されるか、発現されないか、または過剰発現される条件下で培養して
    、培養した細胞についての第２のタンパク質発現プロファイルを作成すること；
    および （c） 第１のタンパク質発現プロファイルと第２のタンパク質発現プロファ
    イルとを比較してタンパク質レベルの差を特定すること； を含む、上記方法。
  31. 【請求項３１】 二倍体真菌細胞の増殖または繁殖の阻害と遺伝子転写産物
    レベルの変動とを相関付ける方法であって、以下のステップ： (a) 遺伝子の２つの野生型対立遺伝子を含む対照の二倍体真菌細胞について
    の転写産物プロファイルを作成すること； (b) 請求項１２記載の二倍体真菌細胞を、遺伝子の第２対立遺伝子が実質的
    に発現抑制されるか、発現されないか、または過剰発現される条件下で培養して
    、培養した細胞についての第２の転写産物プロファイルを作成すること；および （c） 第１の転写産物プロファイルと第２の転写産物プロファイルとを比較
    して遺伝子転写産物レベルの差を特定すること； を含む、上記方法。
  32. 【請求項３２】 カンジダ・アルビカンス（Candida Albicans)の繁殖に必
    要な、配列番号６３〜１２３のうちの１つのアミノ酸配列を含む遺伝子産物をコ
    ードするヌクレオチド配列によって本質的に構成されている、精製または単離さ
    れた核酸分子。
  33. 【請求項３３】 ヌクレオチド配列が配列番号１〜６１のうちの１つである
    、請求項３２記載の核酸分子。
  34. 【請求項３４】 配列番号１〜６２のうちの１つの断片を含む核酸分子であ
    って、該断片は、配列番号１〜６２のうちの１つの連続した少なくとも10ヌクレ
    オチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30
    ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチドおよび少なくとも100ヌクレオチドを
    含む断片からなる群より選択されたものであることを特徴とする、上記核酸分子
    。
  35. 【請求項３５】 以下の (a) 配列番号１〜６２のうちの１つからなる群より選択されるヌクレオチド
    配列、または (b) 配列番号６３〜１２３のうちの１つからなる群より選択されるアミノ酸
    配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、 からなる第２核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌク
    レオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、ストリンジェントな条件は、約
    45℃で６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でフィルターに結合した
    DNAにハイブリダイゼーションさせた後、約50〜65℃で0.2×SSC/0.1％SDSで１回
    以上洗浄することを含むこととする、上記核酸分子。
  36. 【請求項３６】 配列番号４２９〜４８６の配列からなる群から選択される
    ヌクレオチド配列からなる、請求項３４または３５記載の核酸分子。
  37. 【請求項３７】 配列番号１〜６２の配列、配列番号１〜６２の連続した少
    なくとも25ヌクレオチドを含む断片、配列番号１〜６２に相補的な配列および配
    列番号１〜６２の連続した少なくとも25ヌクレオチドを含む断片に相補的な配列
    からなる群より選択された配列に少なくとも30％の同一性を有するヌクレオチド
    配列を含む、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)またはサッカロミセス
    ・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）以外の生物から得た精製または単離
    された核酸分子。
  38. 【請求項３８】 上記生物が、アブシディア・コリムビゲラ（Absidia cory
    mbigera）、黄色コウジ菌（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガツ
    ス（Aspergillus fumigatus）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、灰色かび
    病菌(Botrytis cinerea)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カン
    ジダ・ヅブリネンシス(Candida dublinensis)、カンジダ・グラブラータ（Candi
    da glabrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシ
    ロプシス（Candida parapsilopsis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropi
    calis）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコ
    ッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、うどんこ病菌(Erysip
    he graminis)、エクソファリア・ダーマチジス（Exophalia dermatiditis）、フ
    サリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、ヒストプラスマ・カプスラ
    ーツム（Histoplasma capsulatum）、イネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、ム
    コール・ルキシー(Mucor rouxii)、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis c
    arinii）、プッチニア・グラミニス（Puccinia graminis）、コムギ赤さび病菌(
    Puccinia recodita)、プッチニア・ストリイフォルミス（Puccinia striiformis
    ）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、リゾパス・アルヒズス
    （Rhizopus arrhizus）、セプトリア・アベナエ（Septoria avenae）、セプトリ
    ア・ノドルム（Septoria nodorum）、コムギ葉枯病菌(Septoria triticii)、オ
    オムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia controversa)、チレチア・トリチシ（Tillet
    ia tritici）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、および
    黒穂菌（Ustilago maydis）からなる群より選択される、請求項３７記載の精製
    または単離された核酸。
  39. 【請求項３９】 請求項３２、３３、３４、３５、または３７記載の核酸分
    子に機能しうる形で連結したプロモーターを含むベクター。
  40. 【請求項４０】 プロモーターが制御可能であることを特徴とする、請求項
    ３９記載のベクター。
  41. 【請求項４１】 プロモーターが、アブシディア・コリムビゲラ（Absidia
    corymbigera）、黄色コウジ菌（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミ
    ガツス（Aspergillus fumigatus）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、灰色
    かび病菌(Botrytis cinerea)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、
    カンジダ・ヅブリネンシス(Candida dublinensis)、カンジダ・グラブラータ（C
    andida glabrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラ
    プシロプシス（Candida parapsilopsis）、カンジダ・トロピカリス（Candida t
    ropicalis）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプ
    トコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、うどんこ病菌（E
    rysiphe graminis）、エクソファリア・ダーマチジス（Exophalia dermatiditis
    ）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、ヒストプラスマ・カ
    プスラーツム（Histoplasma capsulatum）、イネいもち病菌(Magnaporthe grise
    a)、ムコール・ルキシー(Mucor rouxii)、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocy
    stis carinii）、プッチニア・グラミニス（Puccinia graminis）、コムギ赤さ
    び病菌(Puccinia recodita)、プッチニア・ストリイフォルミス（Puccinia stri
    iformis）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、リゾパス・アル
    ヒズス（Rhizopus arrhizus）、セプトリア・アベナエ（Septoria avenae）、セ
    プトリア・ノドルム（Septoria nodorum）、コムギ葉枯病菌(Septoria triticii
    )、オオムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia controversa)、チレチア・トリチシ（T
    illetia tritici）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、お
    よび黒穂菌（Ustilago maydis）からなる群より選択される生物で活性であるこ
    とを特徴とする、請求項３９記載のベクター。
  42. 【請求項４２】 請求項３９記載のベクターを含有する、宿主細胞。
  43. 【請求項４３】 配列番号６３〜１２３の配列からなる群から選択されるア
    ミノ酸配列を含む、精製または単離されたポリペプチド。
  44. 【請求項４４】 配列番号６３〜１２３の配列からなる群より選択されたア
    ミノ酸配列に、FASTAバージョン3.0t78を用いてデフォルトパラメータで測定し
    た場合に、少なくとも30％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、カンジダ・ア
    ルビカンス（Candida albicans）またはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharo
    myces cerevisiae）以外の生物から得た精製または単離されたポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 生物が、アブシディア・コリムビゲラ（Absidia corymbig
    era）、黄色コウジ菌（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガツス（A
    spergillus fumigatus）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、灰色かび病菌(
    Botrytis cinerea)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ
    ・ヅブリネンシス(Candida dublinensis)、カンジダ・グラブラータ（Candida g
    labrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシロプ
    シス（Candida parapsilopsis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicali
    s）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカ
    ス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、エリシフェ・グラミニス
    （Erysiphe graminis）、エクソファリア・ダーマチジス（Exophalia dermatidi
    tis）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、ヒストプラスマ
    ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、イネいもち病菌(Magnaporthe g
    risea)、ムコール・ルキシー(Mucor rouxii)、ニューモシスチス・カリニ（Pneu
    mocystis carinii）、プッチニア・グラミニス（Puccinia graminis）、コムギ
    赤さび病菌(Puccinia recodita)、プッチニア・ストリイフォルミス（Puccinia
    striiformis）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、リゾパス・
    アルヒズス（Rhizopus arrhizus）、セプトリア・アベナエ（Septoria avenae）
    、セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）、コムギ葉枯病菌(Septoria trit
    icii)、オオムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia controversa)、チレチア・トリチ
    シ（Tilletia tritici）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii
    ）、および黒穂菌（Ustilago maydis）からなる群より選択されることを特徴と
    する、請求項４４記載のポリペプチド。
  46. 【請求項４６】 第２のポリペプチドに融合した第１のポリペプチドの断片
    を含む融合タンパク質であって、該断片は、配列番号６３〜１２３の配列からな
    る群から選択されるアミノ酸配列の連続する少なくとも６残基からなるものであ
    る、上記融合タンパク質。
  47. 【請求項４７】 ポリペプチドを作製する方法であって、配列番号６２〜１
    ２３の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列に機能しうる形で連結したプロモーターを含むベクター
    を細胞に導入し、該細胞を培養して上記ヌクレオチド配列を発現させることを含
    む、上記方法。
  48. 【請求項４８】 ポリペプチドを作製する方法であって、配列番号６２〜１
    ２３の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列に機能しうる形で連結した異種プロモーターを含む細胞
    を用意し、該細胞を培養して上記ヌクレオチド配列を発現させることを含む、上
    記方法。
  49. 【請求項４９】 配列番号１〜６２の配列からなる群から選択されるヌクレ
    オチド配列を含む核酸にコードされる遺伝子産物の活性を変化させる化合物を同
    定する方法であって、以下のステップ： (a) 化合物に上記遺伝子産物を接触させること；および (b) 化合物が該遺伝子産物の活性を変化させるか否かを測定すること； を含む、上記方法。
  50. 【請求項５０】 上記遺伝子産物の活性が阻害されることを特徴とする、請
    求項４９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 上記遺伝子産物がポリペプチドであり、かつその活性が酵
    素活性、炭素化合物異化活性、生合成活性、トランスポーター活性、転写活性、
    翻訳活性、シグナル伝達活性、DNA複製活性および細胞分裂活性からなる群から
    選択されることを特徴とする、請求項４９記載の方法。
  52. 【請求項５２】 動物の免疫応答を誘発する方法であって、配列番号６３〜
    １２３の配列のうちの１つの連続する少なくとも６残基を含むアミノ酸配列を有
    する単離されたポリペプチドを含む組成物を動物に導入することを含む、上記方
    法。
  53. 【請求項５３】 配列番号１〜６２の配列からなる群より選択されるヌクレ
    オチド配列を含む遺伝子の第１対立遺伝子が不活性化されており、該遺伝子の第
    ２対立遺伝子が異種プロモーターの制御下にあることを特徴とする、カンジダ・
    アルビカンス(Cadida albicans)株。
  54. 【請求項５４】 異種プロモーターの制御下にある、配列番号１〜６２の配
    列から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有することを特徴とする
    、カンジダ・アルビカンス(Cadida albicans)株。
  55. 【請求項５５】 異種プロモーターが制御可能なものであることを特徴とす
    る、請求項５３または５４記載の株。
  56. 【請求項５６】 配列番号６３〜１２３の配列からなる群より選択されるア
    ミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する化合物または結合パートナーを同定す
    る方法であって、以下のステップ： (a) 複数の化合物または１つ以上の結合パートナーを含む調製物にポリペプ
    チドまたはその断片を接触させること；および (b) ポリペプチドまたはその断片に結合する化合物または結合パートナーを
    同定すること； を含む、上記方法。
  57. 【請求項５７】 カンジダ・アルビカンス(Cadida albicans)の増殖または
    繁殖を阻害する能力を有する化合物を同定する方法であって、以下のステップ： (a) カンジダ・アルビカンス(Cadida albicans)細胞に配列番号１〜６２の配
    列からなる群より選択される核酸によりコードされる遺伝子産物のレベルまたは
    活性を、野生型細胞に比べて低下させること、ただし、該細胞にとってこのレベ
    ルの低下は致死的なものではない；および (b) 化合物に該細胞を接触させること；および (c) 化合物が該細胞の増殖または繁殖を阻害するか否かを測定すること； を含む、上記方法。
  58. 【請求項５８】 上記遺伝子産物のレベルまたは活性を低下させるステップ
    が、該遺伝子産物が低下したレベルで発現される条件下で制御可能なプロモータ
    ーにより該遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を転写させることを含むも
    のである、請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 上記遺伝子産物が、配列番号６３〜１２３の配列によって
    コードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチドで
    あることを特徴とする、請求項５８記載の方法。
  60. 【請求項６０】 カンジダ・アルビカンス(Cadida albicans)細胞の増殖ま
    たは繁殖を阻害する方法であって、(i)配列番号１〜６２の配列からなる群より
    選択されるヌクレオチド配列のレベルを低減するかまたは活性を阻害する化合物
    、または(ii)配列番号１〜６２の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配
    列によってコードされる遺伝子産物のレベルを低減するかまたは活性を阻害する
    化合物に、細胞を接触させることを含む、上記方法。
  61. 【請求項６１】 遺伝子産物が配列番号６３〜１２３の配列によってコード
    されるポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    であることを特徴とする、請求項６０記載の方法。
  62. 【請求項６２】 化合物が抗体、抗体断片、アンチセンス核酸分子またはリ
    ボザイムである、請求項６０記載の方法。
  63. 【請求項６３】 抗真菌性化合物を製造するための方法であって、以下のス
    テップ： (a) 複数の候補化合物をスクリーニングし、配列番号１〜６２の配列からな
    る群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物の活性ま
    たはレベルを低減させる化合物を同定すること；および (b) かかる同定された化合物を製造すること； を含む、上記方法。
  64. 【請求項６４】 上記遺伝子産物が配列番号１〜６１の配列によってコード
    されるポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    であることを特徴とする、請求項６３記載の方法。
  65. 【請求項６５】 対象のカンジダ・アルビカンス(Cadida albicans)による
    感染を治療するための方法であって、配列番号１〜６２の配列からなる群より選
    択された配列を含む核酸によってコードされる遺伝子産物の活性またはレベルを
    低減させる化合物を治療に有効な量で含む医薬組成物を該対象に投与することを
    含む、上記方法。
  66. 【請求項６６】 化合物が抗体、抗体断片、アンチセンス核酸分子またはリ
    ボザイムである、請求項６５記載の方法。
  67. 【請求項６７】 物体のカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)による
    混入を予防または含有するための方法であって、配列番号１〜６２の配列からな
    る群より選択された配列を含む核酸によってコードされる遺伝子産物の活性また
    はレベルを低減させる化合物を有効な量で含む組成物に物体を接触させることを
    含む、上記方法。
  68. 【請求項６８】 表面にカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を含む
    生物膜が形成することを予防または阻害するための方法であって、配列番号１〜
    ６２の配列からなる群より選択された配列を含む核酸によってコードされる遺伝
    子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を有効な量で含む組成物に表面を
    接触させることを含む、上記方法。
  69. 【請求項６９】 薬学的に許容されうる担体中に配列番号１〜６１の配列か
    らなる群より選択された核酸によってコードされる遺伝子産物の活性またはレベ
    ルを低減させる化合物を治療に有効な量で含む医薬組成物。
  70. 【請求項７０】 対象が、植物、脊椎動物、哺乳動物、鳥類動物およびヒト
    からなる群より選択される、請求項６５記載の方法。
  71. 【請求項７１】 請求項４３または４４記載のポリペプチドに結合する抗体
    調製物。
  72. 【請求項７２】 モノクローナル抗体を含む、請求７１記載の抗体調製物。
  73. 【請求項７３】 配列番号１〜６１の配列の１つを含むヌクレオチド配列に
    よりコードされる標的遺伝子産物について化合物を評価するための方法であって
    、以下のステップ： (a) 化合物に野生型二倍体真菌細胞を接触させて第１のタンパク質発現プロ
    ファイルを作成すること； (b) 標的遺伝子の第２対立遺伝子が実質的に発現抑制されるか、発現されな
    いか、または過剰発現される条件下で培養した、請求項１２記載の二倍体真菌細
    胞のタンパク質発現プロファイルを測定し、該培養細胞についての第２のタンパ
    ク質発現プロファイルを作製すること；および （c） 第１のタンパク質発現プロファイルと第２のタンパク質発現プロファ
    イルとを比較してプロファイルの類似性を特定すること； を含む、上記方法。
  74. 【請求項７４】 配列番号１〜６１の配列の１つを含むヌクレオチド配列に
    よりコードされる標的遺伝子産物について化合物を評価するための方法であって
    、以下のステップ： (a) 化合物に野生型二倍体真菌細胞を接触させて第１の転写プロファイルを
    作成すること； (b) 標的遺伝子の第２対立遺伝子が実質的に発現抑制されるか、発現されな
    いか、または過剰発現される条件下で培養した、請求項１２記載の二倍体真菌細
    胞の転写プロファイルを測定し、該培養細胞についての第２の転写プロファイル
    を作製すること；および （c） 第１の転写プロファイルと第２の転写プロファイルとを比較してプロ
    ファイルの類似性を特定すること； を含む、上記方法。
  75. 【請求項７５】 抗真菌性化合物を同定するための方法であって、複数の化
    合物をスクリーニングして、配列番号１〜６１の配列からなる群より選択された
    ヌクレオチド配列を有する遺伝子のサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyce
    s cerevisiae）中に天然に存在するオーソログであるヌクレオチド配列によって
    コードされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を同定すること
    を含む、上記方法。
JP2001560347A 2000-02-18 2001-02-20 薬物標的探索のための遺伝子破壊法 Pending JP2003523197A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18353400P 2000-02-18 2000-02-18
US60/183,534 2000-02-18
PCT/US2001/005551 WO2001060975A2 (en) 2000-02-18 2001-02-20 Gene disruption methodologies in fungi for drug target discovery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003523197A true JP2003523197A (ja) 2003-08-05

Family

ID=22673211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001560347A Pending JP2003523197A (ja) 2000-02-18 2001-02-20 薬物標的探索のための遺伝子破壊法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1292668A2 (ja)
JP (1) JP2003523197A (ja)
KR (1) KR20020097180A (ja)
AU (1) AU2001243204A1 (ja)
CA (1) CA2398861A1 (ja)
NZ (1) NZ521037A (ja)
WO (1) WO2001060975A2 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180953A1 (en) * 2000-12-29 2003-09-25 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
AU2002355155A1 (en) * 2001-07-24 2003-02-17 Affinium Pharmaceuticals Inc. Methods for gene disruption and uses thereof
AU2003231152A1 (en) 2002-04-26 2003-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Novel essential fungal polynucleotides, polypeptides, and methods of use
GB0228704D0 (en) * 2002-12-09 2003-01-15 Oxford Glycosciences Uk Ltd Novel therapeutic target
GB0228697D0 (en) * 2002-12-09 2003-01-15 Oxford Glycosciences Uk Ltd Novel therapeutic target
GB0228694D0 (en) * 2002-12-09 2003-01-15 Oxford Glycosciences Uk Ltd Novel threapeutic target
GB0228702D0 (en) * 2002-12-09 2003-01-15 Oxford Glycosciences Uk Ltd Novel therapeutic target
EP1466974A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-13 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Inducible site-directed mutagenesis through conditional gene rescue
CN108707554B (zh) * 2018-05-21 2021-06-29 河北省农林科学院植物保护研究所 一对玉蜀黍黑粉菌组合及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824545A (en) * 1995-11-01 1998-10-20 Millennium Pharaceuticals, Inc. Identification of eukaryotic growth-related genes and promoter isolation vector and method of use
CA2218446A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-12 Mcgill University New candida albicans kre9 and uses thereof
CA2366069A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-14 Gpc Biotech, Inc. Generation of conditional yeast mutants, methods and reagents related thereto

Also Published As

Publication number Publication date
EP1292668A2 (en) 2003-03-19
AU2001243204A1 (en) 2001-08-27
KR20020097180A (ko) 2002-12-31
CA2398861A1 (en) 2001-08-23
WO2001060975A2 (en) 2001-08-23
WO2001060975A3 (en) 2002-04-25
NZ521037A (en) 2004-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2005514899A (ja) 薬物標的探索のための遺伝子破壊法
US20030119013A1 (en) Identification of essential genes of Aspergillus fumigatus and methods of use
Kitagawa et al. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex
Willems et al. Cdc53 targets phosphorylated G1 cyclins for degradation by the ubiquitin proteolytic pathway
García-Sánchez et al. Global roles of Ssn6 in Tup1-and Nrg1-dependent gene regulation in the fungal pathogen, Candida albicans
Clark et al. Yeast pheromone response pathway: characterization of a suppressor that restores mating to receptorless mutants
WO2004067709A2 (en) Identification of essential genes of aspergillus fumigatus and methods of use
Forsburg et al. Analysis of the Schizosaccharomyces pombe cyclin puc1: evidence for a role in cell cycle exit
US20040014955A1 (en) Identification of essential genes of cryptococcus neoformans and methods of use
US6221597B1 (en) Essential genes of yeast as targets for antifungal agents, herbicides, insecticides and anti-proliferative drugs
JP2003523197A (ja) 薬物標的探索のための遺伝子破壊法
Clever et al. Specific negative effects resulting from elevated levels of the recombinational repair protein Rad54p in Saccharomyces cerevisiae
EP0690874B1 (en) Materials and methods relating to proteins that interact with casein kinase i
JP2004511756A (ja) 抗真菌性化合物および使用法
US20050019931A1 (en) Nucleic acids encoding antifungal drug targets and methods of use
US20050079619A1 (en) Gene disruption methodologies for drug target discovery
WO1998057978A1 (en) Methods and compositions for rapid purification of proteasomes and methods of use of components thereof
Franko et al. Molecular cloning and functional characterization of two murine cDNAs which encode Ubc variants involved in DNA repair and mutagenesis
Peng et al. Rad2, Rad14 and Rad26 recover Metarhizium robertsii from solar UV damage through photoreactivation in vivo
JP4842440B2 (ja) カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）必須真菌特異的遺伝子の同定および抗真菌薬剤の発見におけるそれらの使用
US20060240021A1 (en) Mammalian genes involved in rapamycin resistance and tumorgenesis: rapr7 genes
US20020103154A1 (en) Essential genes of yeast as targets for antifungal agents, herbicides, insecticides and anti-proliferation drugs
AU2002231144A1 (en) Gene disruption methodologies for drug target discovery
AU2002254729A1 (en) Identification of essential genes of aspegillus fumigatus and methods of use
Zordan The Molecular Mechanism of White-Opaque Switching in Candida albicans

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20060223

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20060223