KR20020082218A - 신규 리간드 및 그것의 제조 방법 - Google Patents

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KR20020082218A
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내셔날유니버서티오브싱가폴
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Abstract

모체 리간드에, 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제를 부착시켜 접합제와 리셉터 부분 사이에 공유 결합이 형성되도록 함으로써 모체 리간드를 변형시키는 방법이 개시된다. 또한 조성물, 프로브 및 본 발명의 변형된 리간드를 사용하여 리셉터를 검출 및/또는 정량화하는 방법이 개시된다.

Description

신규 리간드 및 그것의 제조 방법{NOVEL LIGANDS AND METHODS FOR PREPARING SAME}
본 발명은 일반적으로 리간드-리셉터 상호 작용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 그들의 동종 리셉터에 비가역적으로 결합하는 변형된 리간드와 그러한 리간드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 리간드는 특히 단백질 기능을 조사하기 위한 효용 및 약물로서(건강보호, 농업 및 환경 용도에서) 동종 리셉터 기능을 보다 효율적으로 억제하거나 또는 촉진하기 위한 효용을 갖는다.
본 발명은 그것의 개시가 전체적으로 여기에 참고문헌으로 포함된, 2000년 1월 28일 출원된 미국 가특허 출원 번호 60/178,756 의 우선권을 주장한다.
본 발명은 바람직한 구체예에 의해 예증된 바와 같이, 하기 도면을 참조하여 설명한다:
도 1은 쥐 골수종 SP2/0-Ag14 세포에서 평형3H-우리딘 운반체의 NEM 억제를 나타낸다.
도 2는 쥐 골수종 SP2/0-Ag14 세포에서3H-NBMPR 평형 결합의 동역학에서 NEM의 효과를 나타낸다.
도 3은 CrMCC 의 합성에 대한 일반적인 반응 개략도를 나타낸다.
도 4는 CrMCC 형성의 속도를 나타낸다.
도 5는 CrMCC 및 NBMPR의 광 흡수 프로파일을 나타낸다.
도 6은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에서의 CrMCC, 시티딘 및 SMCC에 의한3H-NBMPR 결합의 억제를 나타낸다.
도 7은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에서의 CrMCC, 시티딘 및 SMCC에 의한3H-NBMPR 동역학에 대한 억제를 나타낸다.
도 8은 HL-60 세포의 성장에 대한 CrMCC, 시티딘 및 SMCC의 효과를 나타낸다.
도 9는 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에서의3H-CrMCC의 시간 과정을 나타낸다.
도 10은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막의 결합 부위로부터3H-CrMCC 및3H-시티딘의 분해를 나타낸다.
도 11은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에 대한3H-CrMCC 결합의 농도 의존성을 나타낸다.
도 12는 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에서의 결합 부위로부터3H-CrMCC의 분리에 대한 pH의 효과를 나타낸다.
도 13은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에 대한3H-CrMCC 결합의 억제를 나타낸다.
도 14는 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에 대한 술피드릴 반응3H-시티딘 유사체의 공유 결합을 나타낸다.
도 15는 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막 단백질의 역상 크로마토그래피 UV 흡수 프로파일을 나타낸다.
도 16은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막 단백질의 역상 크로마토그래피의 방사능 프로파일을 나타낸다.
도 17은 인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에 대한 술프히드릴기 반응3H-아데노신 유사체의 공유 결합을 나타낸다.
도 18은 다양한 5-HT 유사체에 의해 쥐 뇌 막에 대한3H-5-HT의 억제를 나타낸다.
도 19a는 LBT3001 (1-[2-(5-히드록시-1H-인돌-3-일)-에틸]-피롤-2, 5-디온))의 화학 구조를 나타낸다.
도 19b는 LBT3001의 합성에 대한 반응 개략도를 나타낸다.
도 20a는 LBT3002 (4-(2, 5-디옥소-2, 5-디히드로-피롤-1-일)-N-[2-(5-히드록실-1 H-인돌-3-일)-에틸]-부티르아미드의 화학 구조를 나타낸다.
도 20b는 LBT3002 의 합성에 대한 반응 개략도를 나타낸다.
도 21b는 LBT3004의 합성에 대한 반응 개략도를 나타낸다.
도 22a는 LBT3005 (4- (2, 5-디옥소-2, 5디히드로-피롤-1-일-메틸)-시클로헥산 카르복실산 [2- (5-히드록시-1H- 인돌-3-일)-에틸]-아미드)의 화학 구조를 나타낸다.
도 22b는 LBT3005의 합성에 대한 반응 개략도를 나타낸다.
도 23는 접합제를 포함하도록 변형될 수있는 예의 리간드의 구조를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
1. 정의
다르게 정의되지 않으면, 여기서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기서 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있으며, 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 발명의 목적을 위해서, 하기의 용어가 하기에 정의된다.
관사 "a" 및 "an"은 여기서 관사의 문법적 목적의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 언급하는데 사용된다. 예를 들어, '원소"는 하나의 원소 또는 하나 이상의 원소를 의미한다.
"부착된"은 정상 생리학적 상태하에서 리간드로부터 접합제의 분리를 막기위한 방식으로 접합제가 리간드에 직접 또는 간접적인 부착을 의미한다. 따라서, 여기서 사용된 바와 같이 용어 "부착된"은 그것의 범위내에서 접합제와 리간드 사이에 형성하는 또는 각각 스페이서와 접합제와 리간드 사이를 개재하여, 정상 생리학적 상태하에서 리간드로부터의 접합제의 분리를 방해하는, 하나 더 이온 결합, 수소 결합, 반데르발스 힘, 공유 결합 또는 그것의 조합을 포함한다.
이 명세서 전반에 걸쳐, 다르게 정의되지 않으면, 용어 "포함한다" "포함하는"은 단계 또는 원소의 어떠한 다른 단계 또는 원소 또는 단계 또는 원소의 군의배제하고, 언급된 단계 또는 원소 또는 단계 또는 원소의 군의 개재를 의미하는 것으로 이해된다.
"접합제"는 변형된 리간드가 유도되는 모체 리간드에 결합하는 리셉터의 부분과 반응하는 변형된 리간드의 부분을 의미하고, 접합제와 리셉터 부분 사이에 공유 결합이 형성된다. 이러한 연결에서, 접합제는 그 자체 또는 리셉터 부분과 커플링하는 공유 결합을 촉진하는 보조 접합제의 존재하에서 충분할 수 있다. 보조 커플링제는 접합제와 상기 리셉터 부분 사이에 공유 결합을 형성시키는 촉매화하는 효소 또는 활성제가 될 수 있다.
"분리된"은 실질적으로 또는 본질적으로 음 상태에서 정상적으로 그것을 동반하는 성분으로부터 자유로운 재료를 의미한다.
여기서 사용된 바와 같이, 용어 "리간드"는 표적 리셉터와 결합하고, 상호작용하거나 그렇지 않으면 연합하는 약물을 언급한다. 표적 리셉터가 그것의 음 구조에 있을 때 또는 그것이 부분적으로 또는 전체적으로 닫혀있거나 변성될 때, 약물은 표적 리셉터를 결합시킬 수 있다. 본 발명에 따라서, 리간드는 예를 들어, 리셉터의 호르몬 결합 부위등의 표적 리셉터의 인지된 기능 영역을 결합시키는 약물로 제한되지 않는다. 본 발명의 실행에 있어서, 리간드는 또한 표적 리셉터의 어떠한 표면 또는 내부 서열 또는 구조적 도메인을 결합시키는 약물이 될 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 약물을 포함하는 분자 영향의 생리학적 기능이다. 리간드는 또한 내성 리간드가 될 수 있다.
"~으로부터 얻어진"은 예를 들어 리셉터가 인간, 동물, 식물 또는 미생물 근원을 포함하여 적절한 세포 또는 조직 공급원 과 같은 특정 공급원으로부터 분리되고, 또는 유도되는 것을 포함하는 적출물과 같은 샘플을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "환자"는 본 발명의 방법을 사용하는 리셉터와 관련된 상태의 치료요법 또는 예방이 요구되는 어떠한 유기체를 의미한다. 그러나, "환자"는 증상이 있는 것을 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 미생물, 식물, 또는 동물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 환자는 인간 또는 다른 포유류이고 본 발명의 방법을 사용하여 조사하거나 치료할 것이 요구되는 어떠한 개인을 포함한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 경구용 또는 계(system) 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 필러, 희석제, 또는 캡슐화 물질을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 변형된 리간드의 비독성 염을 의미하고, 일반적으로 유리 염기와 적절한 유기 또는 무기 산을 반응시킴으로써 제조된다. 대표적인 염은 하기의 염들을 포함한다: 아세테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비카르보네이트, 비술페이트, 비타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 칼슘 에데이트, 캄실레이트, 카르보네이트, 염화물, 클라불라네이트, 시트레이트, 디히드로염화물, 에데이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헥실레소르시네이트, 히드라바민, 히드로브로마이드, 히드로염화물, 히드록시나프토에이트, 요오드화물, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸브로마이드, 메틸니르레이트,메틸술페이트, 무케이트, 나프실레이트, 니르레이트, 올레산염, 옥살산염, 파마오트, 팔미테이트, 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실산염, 스테아르산염, 서브아세테이트, 숙신산염, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에트요오드화물, 발레르산염.
여기서 사용된 용어 "리셉터"는 리간드(들)과 리셉터를 결합하고, 상호 작용 또는 그렇지 않으면 리셉터와 연합하여 리셉터의 기능에 작용하고, 변화시키고 또는 무효화하는 하나 또는 그 이상의 리간드에 특이적인 분자 또는 분자의 클러스터를 포함하는 구조를 언급한다. 리셉터는 바람직하게는, 오로지 단백질이다. 대표적인 리셉터는 이것으로 제한되지는 않지만, 인슐린 리셉터, 표피 성장 인자 리셉터, y-아미노부티르산 리셉터, 니코틴 아세틸콜린 리셉터, 세로토닌 리셉터, α-및 β-안드레노셉터, 도파민 리셉터, 히스타민 리셉터, 프로스타노이드 리셉터, 아데노신 리셉터, 고리 뉴클레오티드 리셉터, 글루타메이트 리셉터, 시토킨 리셉터, 심방 naturetic 펩티드 리셉터, 및 프로스타클란딘 리셉터을 포함한다. 리셉터는 글루코스, 아미노 산 운반체, 나트륨-프로톤 교환기, 염화물-비카르보네이트 교환기, 나트륨 펌프, 칼슘 펌프, 프로톤 펌프와 같은 운반체 ; 나트륨 채널, 칼륨 채널, 칼슘 채널 및 염화물 채널 과 같은 채널 ; 옥시도리덕타제, 트렌스퍼라제, 히드로라제, 리아제, 이소머라제, 및 리가제와 같은 효소를 포함할 수 있다. 그러나, 리셉터가 단백질이 될 필요는 없고 예를 들어 본 발명에 따라서 아데닌에서 발견된 아미노기, 구아닌 및 시토신은 접합제에 의해 표적화될 수 있는 핵산을 포함할 수 있다고 이해된다. 대안으로는, 리셉터는 카르보히드레이트(예를 들어, 아미노페닐 글리코시드와 같은 아미노 함유 카르보히드레이트) 또는 하나 이상의 카르복실기, 및/또는 접합제에 의해 표적화될 수 있는 하나 이상의 아미노기를 갖는 지질(예를 들어, 일부 인지질의 포스페이트 헤드 기에 존재하는) 이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "리셉터 분자"는 화학적 천연에 의해, 식별가능한 신호를 분적적으로 제공하여 리간드와 그것의 접합제를 포함하는 복합체의 검출을 가능하게 하는 분자를 의미한다. 용어 "운반체 분자"는 또한 유액에서의 적혈구 세포 등과 같은 세포 응집의 사용 또는 응집의 억제까지 확장한다.
여기서 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 본 발명에 따르는 표적 리셉터를 함유할 수 있는 적절한 샘플을 언급한다. 샘플은 어떠한 적절한 공급원으로부터 추출하고, 미처리되고, 처리되고, 희석되고 또는 농축되고 하나 이상의 세포 및/또는 세포 막을 함유할 수 있다. 샘플은 전체 세포, 변성 세포, 세포 막 또는 그것의 일부를 포함할 수 있다. 대안으로서, 샘플은 분리된 리셉터를 함유할 수 있다. 적절하게, 샘플은 조직 생체 검사법으로부터 얻어진 세포를 포함할 수 있다. 대안으로서, 샘플은 생체외에서 배양된 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다.
여기서 사용된 용어 "스페이서"는 공간에서 접합제를 리간드로부터 분리시키는 화학 링커, 폴리머, 펩티드 등을 언급한다. 바람직하게는, 스페이서는 변형된 리간드의 리셉터에 대한 결합을 방해하지 않도록 선택된다.
"치료학적 유효량" 은, 리셉터와 연관된 상태의 치료와 관련하여, 치료가 필요한 환자에게 그 상태의 치료에 효과적인 단일 투여량 또는 일련의 일부로서 투여하는 양을 의미한다. 유효량은 치료받는 개인의 건강과 신체 상태, 치료받는 개인의 분류학적 군, 조성물의 제제, 의학 조건의 평가 및 다른 관련 인자에 따라 변한다. 양은 일상 시행을 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위에 있을 것이다.
2.변형된 리간드
본 발명은 적어도 부분적으로, 접합제가 가역적 결합하는 표적 리셉터에 비가역적으로 결합하는 변형된 리간드를 형성할 수 있는 모체 리간드가 모체 리간드에 부착될 수 잇다는 놀라운 발견에 있다. 리셉터에 대한 변형된 리간드의 비가역 결합은 접합제와 리셉터에 존재하는 부분 사이의 공유 결합의 형성에 의해 영향 받고, 이는 바람직하게는 하나 이상의 작용 아미노 산 측쇄기(종종 여기서 "작용기"로 언급된다)이다. 리섭터와 변형된 리간드의 결합에 의해 공유 결합이 형성된다. 변형된 리간드와 리셉터의 이러한 비가역적 상호작용은 리셉터 기능의 영구적 억제(길항제) 또는 촉진(작용물질)를 초래한다. 리셉터의 정상 기능 또는 활성은 오직 새로운 리셉터가 합성된 후에 재개된다.
변형될 수 있는 모체 리간드는 es 운반체 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드/뉴클레오염기-민감성 단백질과 상호작용하는 리간드를 포함한다. 두가지 형태의 뉴클레오시드 운반체는 NBMPR (니트로벤질티오이노신)에 의한 억제에 대한 그들의 민감성에 근거하여 분류된다. Griffith et al., Biochim. Biophys. Acta, vol. 1286, pp. 153-181 (1996)참조. NBMPR 에 민감한 운반체의 군은 es(평형 민감성)을 뜻하고, 무감각한 군은 ei(평형 무감각)을 뜻한다. 하나의 구체에에서, 화합물은 es 대, ei 리셉터에 결합하는 차별적 결합을 갖는다고 제공된다. 화합물은 선택적으로 그리고 비가역적으로 es 리셉터에 결합한다고 제공된다. es 리셉터의 표현은 양적으로 세포의 발암 물질 상태와 상호관련 된다.
공유 부착에 사용될 수 있는 es 뉴클레오시드 운반체에 대한 다수의 반응 작용 아미노산 측쇄 중에서, 아마도 시스테인 잔기의 술프히드릴기가 약리학적으로 생물학적으로 가장 중요하다. 일찍이 포유류 세포에서 뉴클레오시드 운반체에 대한 술피드릴 시약의 효과에 대한 연구는 다양한 배양 세포에 있어서 우리딘 흡수의 표지된 억제의 원인이 된다고 나타내었다(Plagemann & Richey (1974), Biochim. Biophs. Acta, vol. 344, pp. 263-305 ; Plagemann et al. (1978), J. Cell. Physiol., vol. 97, pp. 49-72 ; Plagemann & Wohlhueter (1980), Curr. Top. Membr. Transp., vol. 14, pp. 225-230 ; Belt (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 110, pp. 417-423 ; Belt (1983), Mol. Pharmacol., vol. 24, pp. 479-484). 그러나 일찍이 연구의 대부분은 총 뉴클레오시드 흡수쪽으로 지정되었고, es 및 ei 운송 시스템에 의해 술피드릴 시약을 향한 민감성의 미분을 구별해내는데는 거의 시도가 없었다. 게다가, 사용된 술피드릴 시약은 대부분 유기수은 화합물이었고, 이는 200 μM 만큼 낮은 농도에서 플라즈마 구조를 교란시키는 것으로 나타났다(Belt & Noel (1985), Biochem. J., vol. 232, pp. 681-688).
리간드는 세로토닌 (5-히드록시트립타민, 또는 5-HT)리셉터에 결합하는 리간드로 또한 변형될 수 있다. 5-HT 리셉터는 다양한 리셉터 하위종류(Peroutka, S. J., C9AS Drugs, (1995), vol. 4 (Suppl 1), pp. 18-28)를 포함한다. 5-HT3리셉터를 제외하고, 이온 채널(Derkash, Vet. al., Nature, (1989), vol. 339, pp. 706-709)인데, 다른 5-HT 리셉터는 7 트랜스막의 G 단백질-커플된 리셉터의 광범위 족에 속한다. 5-HT 의 효과의 임상적 중요성은 예를 들어, 두통, 불안, 우울, 정신분열증, 강박 신경장애, 정신병, 공격성, 적개심, 식사 장애, 위장 장애, 고혈압, 수면-각성 사이클에 있어서 주기 리듬의 유지, 성 활동, 강박 행동, 온도, 구토, 그리고 심장혈관 및 운동 기능을 포함하는 신경학, CNS, 정신의학 및 기분 장애에 있어서 명백하다. 5-HT 리셉터를 표적으로 하는 약물은 따라서 넓은 임상적 용도를 갖는다. 5-HT 리셉터에 결합하는 리간드는 예를 들어, 심장혈관계, 혈소판, 위장 관, 및 뇌에 결합함으로써 효과를 가질 수 있다(Erspamer, V., Ed."5-hydroxytryptamin and Related indoleealklylamines", Handbuch der Expermentellen Pharmakologie, Vol. 19. Springer-Verlag, Berlin, (1996), pp. 132-181).
따라서, 예를 들어, 리간드 5-HT는 여기서 개시된 바와 같이 변형될 수 있다. 변형될 수 있는 다른 리간드는 5-HT 선구체 및 5-HT 리셉터 작용물질 및 길항제를 포함한다. 예는 선구체 5-히드록시트립토판을 포함하고, 이것은 항우울 약물로서 사용되었다; 신경안정제 및 항고혈압제로 사용된 5-HTIA-작용물질 ; 수마트립탄, 선택적인 5HT1 리셉터 작용물질, 편두통에 사용됨; 메티세르지드와 같은 5-HT2-길항제, 편두통 예방 및 카르시노이드 종양 증후군에 사용됨 ; 케타세린와 같은 5-HT2-길항제, 고혈압 환자에 있어서 혈압을 낮추는데 사용됨 ; 세포 성장 억제제-및 방사선 유발 구토를 치료하는데 사용되는 선택적인 5-HT3-길항제를포함한다(Beasley, C. M., et. al., Psychopharmacology, (1992), vol. 107, pp. 1-10 ; Bolden-Watson, C., and Richelson, E., Life Sciences, (1993), vol. 52, pp. 1023-1029. ; Koe, B. K, J. Clin. Psychiatry, (1990), vol. 51, pp. 13-17).
변형될 수 있는 세로토닌 결합 리간드는 벤조디아제핀 또는 부스피론, 게피론, 입사피론, 및 플레시녹산과 같은 5-HTIA 작용물질과 같이 불안 등의 CNS 장애를 위해 개발된 것들을 포함할 수 있다. 불안제거제로서, 그들은 벤조디아제핀의 진정작용 및 약물 의존 장애가 부족하기 때문에 벤조디아제핀에 대한 그들은 이점을 갖는다(Barrett, JE., and Vanover, KE., Psychopharmacology, (1993), vol. 112, pp. 1-12.). 다른 세로토닌 결합 리간드는 SSRI와 같은 우울증의 치료를 위해 개발된 것들, 예를 들어 플루옥세틴을 포함한다. SSRI은 또한 식욕 이상 항진 및 공격-강박 장애의 치료에 효능이 있고 또한 비만, 공황 장애, 월경전 증후군, 당뇨병 신경장애, 만성 통증 및 특정 양상의 알츠하이머병의 치료에 유용할 수 있다. 5-HT2 리셉터에서 상대적으로 유력한 길항제인 다른 유용한 항우울제는 트라자돈 및 네파조돈을 포함한다(Cowen, P. J., and Anderson. I. M.,"5-lydroxytryptamin in Psychiatry" (Sandler, M, Coppen, A., & Harnett, S. Eds.), Oxford University Press, New York, (1991)). 리간드는 항정신병제 클로자핀, 리스페리돈 및 올란제핀을 포함하여, 정신분열증의 치료를 위해 개발된 화합물을 포함한다. (Weil-Malherbe, H., serotonin and schizophrenia. In"The Central Nervous System. Vol. 3, serotonin in Health and 디sease", Essman, W. B., Ed, Spectrum Publications, Inc., New York, (1978), pp. 231-291). SSRIs 및 펜풀루라민와 같이, 식사 장애의 치료와 관련된 리간드가 사용될 수 있다. 펜플루라민은 자폐증, 월경전 증후군, 계절 감정 장애, 및 주의력 부족 장애과 같은 다른 질병의 치료에 유용할 수 있다. 온단세트론 및 그라니세트론과 같이, 암 화학요법와 관련하여 방사선 유발된 구토의 치료에 그리고 구역질을 개선하는데 일반적인 마취에서 회복되는 동안 발생하는 구토를 위해 사용되는, 위장 장애의 경감과 관련된 리간드가 사용될 수 있다. 다른 리간드는 메토클로프라미드 및 시사프리드를 포함한다. L-트립토판 또는 비선택성 5-HT 작용물질 또는 리탄세린과 같은 5-HT 길항제와 같이, 수면-깨어남 주기의 제어에 사용되는 리간드가 사용될 수 있다(설명을 보려면, Wauquier, A., and Dugovic, C., Ann N. Y. Acad. Sci., (1990), vol. 600, pp. 447-459 참조). 다른 리간드는 엔탄세린, 항고혈압 약물로 사용되는 5-HT2리셉터 길항제를 포함한다.
2.1 단백질 구조 반응성에 관련된 고찰
펩티드와 단백질은 펩티드(아미노)결합의 형성을 통해 함께 중합된 아미노산으로 구성된다. 펩티드-결합 폴리머는 폴리펩티드 구조의 백본을 형성한다. 자연에서 발견되는 20 공통 아미노산이 있는데, 각각은 특정 화학 구조, 수소 결합 능력, 친수성(또는 소수성) 및 반응성의 구별 측쇄를 포함한다. 측쇄는 펩티드 형성에 참여하지 않고 따라서 자유롭게 환경과 상호작용하고 반응한다.
아미노산은 그들의 측쇄의 특성에 의존하는 타입으로 분류될 수 있다. 공유 결합성 접합에 있어서 가장 중요한 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 및 티로신과 같은 접근가능한 이온화성 측쇄를 함유하는 것이다. 메티오닌 및 트립토판은 또한 이온화성 측쇄를 함유하지만, 그들의 소수성 성질 때문에 보통 리셉터의 분자 구조의 내부에 깊게 묻히기 때문에 그들은 쉽게 접근할 수 없다.
아스파르트산과 글루탐산 모두는 이온화 특성을 갖는 카르복실레이트기를 포함한다. 단백질에서의 카르복실레이트기는 아미드 결합 형성제 또는 활성 에스테르 또는 반응성 카르보닐 중간체의 사용을 통해 유도될 수 있다.
리신, 아르기닌 및 히스티딘은 측쇄를 포함하는 이온화성 아민을 갖는다. 전형적으로 측쇄를 함유하는 이들 아민은 단백질의 표면에 노출되고 쉽게 유도될 수 있다. 이들 잔기에서 일어날 수 있는 가장 중요한 반응은 알킬화와 아실화이다.
시스테인은 술프히드릴기를 함유하는 유일한 아미노산이다. 단백질에서 시스테인 기의 가장 중요한 반응은 또다른 시스테인 분자와 디술피드 가교결합의 형성이다. 시스테인 술피드릴과 시스틴 디술피드(시스틴 잔기라고 부름)은 안정된 티오에테르 유도체를 형성하는 알킬화, 상대적으로 불안성 티오에스테르를 형성하는 아실화 및 다수의 산화와 환원 과정을 포함하여 다양한 반응을 겪는다. 시스테인과 시스틴기는 상대적으로 소수성이고 보통 단백질 코어안에서 발견된다. 종종 약물 또는 "드라이버"의 존재없이, 큰 단백질의 술프히드릴기에 접근하기는 어렵다. 그럼에도 불구하고, 그러한 입체 힌드란스는 술프히드릴기에 선택성에 있어서 리딩 모서리를 제공한다. 따라서, 변형 약물을 사용하지 않고, 작용 반응 술프히드릴기에 접근하기 위해서는 여기서 설명된 바와 같은 접합제를 리셉터의 내부 구조 안으로 직접 보내는 그것의 생리학적 리간드 또는 약물을 이용하는 것이다. 술프히드릴기에 표적으로 하는 비가역적 결합 약물은 더 낮은 수준의 비특이성 결합, 임상적 용어로는: 어떠한 다른 작용기보다 " 부작용이 거의 없는" 결합을 가질 것이다.
티로신은 페놀 측쇄를 함유한다. 아미노산은 오직 결핍하여 물에 용해성이고, 페놀기의 이온화 성질은 종종 단백질의 친수성 영역에 -보통 표면이나 표면 근처에서 나타나게 한다. 따라서 시스테인 잔기와는 달리, 티로신 유또는 단백질 구조를 더욱 확장하기 위한 변형 약제에 대한 많은 필요없이 진행한다. 티로신은 아실화에 의한 페놀레이트 음이온을 통해 변형에 대해 특별히 표적화될 수 있다.
요약하면, 단백질 분자는 그들의 측쇄에서 쉽게 유도되는 9이하의 아미노산을 함유할 수 있다. 이들 9 잔기는 변형 반응에 대한 충분한 반응성을 갖는 8개 주요 작용기를 함유한다. 아르기닌의 구아니디닐기, 각각 글루탐산 및 아스파트르산의 γ- 및 β-카르복실기, 시스테인의 술프히드릴기, 히스티딘의 이미다졸일기, 리신의 ε-아미노기, 메티오닌의 티오레테르 부분, 트립토판의 인돌일기 및 티로신의 히드록실기이다. 메티오닌 및 트립토판이 일반적으로 단백질의 내부에 묻히고 그로써 용매에 용해된 접합으로부터 보호되기 때문에, 그들은 온전한 단백질에 있어서 오직 일부 선택된 반응성만을 나타낸다. 다른 이온화기는 통상 단백질의 표면에 노출되거나 변형 약제 또는 "드라이버"의 도움으로 접근할 수 있다. 그들은 따라서 접합을 위한 쉬운 표적이다. 그러나, 표지화에 사용될 수 있는 단백질에 있어서의 다수 반응성 작용 아미노산 측쇄 중에서, 시스테인 잔기의 술프히드릴기는가장 아마도 둘다 약리학적으로 그리고 생물학적으로 중요하다. 대부분의 고분자에서, 표적 고분자의 리간드 결합 부위에 또는 그 부위에 가깝게 위치하는 반응성 술프히드릴기의 적어도 하나의 복제가 있다는 것이 보고되었다. 술피드릴 감소제에 의한 본 반응성 술피드릴 작용기의 분열은 많은 고분자의 기능성에 작용하는 것으로 나타났다.
2.2 접합을 허용하는 리셉터의 부분
술피드릴 부분은 활성 종으로서 티올레이트 이온과 함께, 단백질에서 가장 반응성의 작용기이다. 약 8.6의 pKa를 갖고, 티올의 반응성은 증가하는 pH에 따라, 그것의 pKa를 향해 그 이상으로 증가하는 것으로 예측된다.
모체 리간드를 변형하는 과정에서, 전형적으로 리셉터의 리간드-결합 부위 또는 근처에 위치하는, 이러한 반응성이 높은 술프히드릴기의 존재를 이용하는 것이 유리하다. 약물 또는 생리학적 리간드는 화학적으로 변형되어 어떠한 다른 반응성 작용기보다 티올과 더 빠르게 반응하는 접합제를 포함할 수 있다. 그것의 리셉터와 이 변형된 약물이 결합할 때, 술프히드릴기 직접적인 접합은 그것의 도달가능한 접근 내에 위치하는 어떠한 술프히드릴기를 공격할 것이다; 이는 그 리셉터에 대해 약물의 공유 결합을 유발한다.
술프히드릴기에 더하여, 또한 아미노산 측쇄에 존재하는 다른 반응성 높은 작용기가 있고, 이는 화학적으로 변형될 수 있다. 이들 작용기에 반응성인 접합은 하기에서 논의될 것이다.
2.3. 접합제
2.3.1 술프히드릴기 특이성 접합제
N-말레이미드 유도체. 말레이미드는 특히 다른 친핵성 물질이 양성자화되는 7 미만의 pH에서, 술프히드릴기에 대해 꽤 특이성인 것으로 간주된다. 산성 또는 중성 근처 용액에서, 단순 티올을 갖는 반응 속또는 상응하는 단순 아민을 갖는 것보다 약 100배 더 빠르다. 속도가 pH와 함께 증가하지만, 아미노 기를 갖는 반응은 또한 높은 pH에서 중요해진다. 다른 주요 경쟁 반응은 말레암산에 대한 말레이미드의 가수분해이다. 그러나, pH7에서, 가수분해의 명백한 속또는 20℃에서 0.1M 인산 나트륨염 완충액에 대해 오직 3. 2 x 10-4min-1이고, 이는 너무 느려서 술프히드릴기와의 반응과 상충할 수 없다. 분해의 속또는 오로지 중립 이상의 pH에서만 중요하다. 티올은 말레이미드와 Michael 반응을 하여 독점적으로 이중 결합을 산출한다. 결과 티오에테르 결합은 매우 안정적이고 생리학적 조건하에서 쪼개질 수 없다.
디술피드 시약. 디술피드 교환은 술프히드릴기가 디술피드와 반응할때 발생한다. 대부분 통상적으로 사용되는 디술피드 시약의 일부는 5, 5'-디티오비스- (2-니트로벤조산), 4, 4'-디티오디피리딘, 메틸-3-니트로-2-피리딜 디술피드, 및 메틸-2-피리딜 디술피드이다. 형성된 단백질 디술피드는 2-메르캅토에탄올 또는 디티오테레이톨과 같은 자유 메르캅탄의 존재하에서 쉽게 가역적이다. 단백질 디술피드의 술프히드릴기로의 환원은 단백질이 그것의 기능을 다시 얻도록 해준다. 따라서, 이러한 카테고리의 비가역적 결합 약물은 추가적인 안전 메카니즘을 제공하여 과량 투여, 과도 반응과 같은 다양한 치료학적 복잡한 문제를 반격한다.
2.3.2 아미노기 특이성 접합제
아미노기는 단백질에서 또다른 강한 친핵물질이다. 그러나, 단백질에서 그것의 다량 및 모든존재, 상대적으로 높은 암모늄 이온의 pKa 때문에 아미노기와 반응하는 대부분의 시약이 또한 다른 작용기들과 반응할 수 있다. 따라서, 약물 결합 부위에 중요한 시스테인 잔기가 있으면, 그것은 본 발명에 따르는 변형된 리간드에 대한 이상적인 표적이 될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 많은 안정한 아실화 생성물은 여전히 그리고 오직 아미노기와 함께 형성된다. 가장 통상적인 아민의 반응은 알킬화 및 아실화 반응이다. 리간드 구조로 포함될 수 있는 중요한 알킬화 제의 일부는: α-할로아세틸 화합물(예를 들어, 할로아세테이트, 할로아세트아미드), N-말레이미드 유도체, 아릴 할로겐화물(예를 들어, 디니트로플루오로벤젠, 트리니트로벤젠술포네이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드, 포름알데히드) 및 케톤 (예를 들어, 피리독살 포스페이트)이다. 아실화제는 이것으로 제한되지는 않지만, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르, N-히드록실숙시미딜 에스테르, ρ-니트로페닐 에스테르, 아실 클로라이드, 및 술포닐 클로라이드을 포함한다.
2.3.3.카르복실기 특이성 접합제
카르복실기의 가장 중요한 화학 변형 반응은 카르보디이미드-매개된 과정을 이용한다. 단백질과 함께, 반응의 최적 pH는 약 5이고, 이것은 대부분 생리학적 조건에서 달성하기 어렵다. 이다조아세테이트 에스테르 및 디아조아세트아미드와같은 다른 시약은 또한 카르복실기를 에스테르화하는데 사용될 수 있다. 크라보디이미드와 유사하게, 이들 시약은 약산성 조건하에서 높은 특이성으로 단백질의 카르복실기와 반응한다.
2.3.4 티로신 특이성 접합제
티로신, 히스티딘, 및 단백질의 다른 방향성 잔기는 전자가 풍부하다. 이들 잔기는 방향 고리에서 친전자성 대체를 겪는다. 단백질에서 티로신 및 히스티딘과의 반응에 대해 유용한 친전자는 디아조늄 화합물이다. 리신, 트립토판, 시스테인 및 아르기닌 잔기와 같은 다른 단백질 화합물은 매우 느리게 반응하여, 디아조늄 시약이 선택적인 티로신으로 간주될 수 있다. 디아조늄 이온은 일반적으로 중성 pH에서조차도 안정하지 않고 단백질과의 최대 반응은 전형적으로 알칼리성 pH에서 달성된다. 티로신의 페놀레이트 이온은 또한 아실화제 쪽으로 아미노기와 유사한 반응을 한다. 그러나, 티로실기는 일반적으로 더 낮은 반응성을 갖는 것으로 인식된다. 이것은 페놀레이트 이온이 더 낮은 친핵성을 갖기 때문이 아니라, 티로신 잔기가 보통 단백질에서 묻히기 때문이며, 따라서 일반적으로 그들의 소수성 때문에 반응에 대해 접근불가이다.
2.3.5 아르기닌 특이성 접합제
구아니디닐 부분의 우세한 반응은 1,2-디카르보닐 시약으로 하는 것이다. 통상적으로 사용되는 인접한 디케톤은 글리옥살, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온 및 1,2-클로로헥산디온을 포함한다.
2.3.6. 히스티딘 특이성 접합제
히스티딘의 아미다졸일 부분과 반응하는 많은 알킬화제가 앞에서 언급되었지만, 이들 반응의 속도는 일반적으로 다른 친핵물질보다 떨어진다. α-할로아세테이트와 함께라도, N-카르복시메틸화는 술프히드릴기와 비교하여 일반적으로 느리다. 그러나, 그러한 반응성 α-할로아세테이트기는 친화성 라벨(예를 들어, p-톨루엔술포닐시네클로로메틸케톤)안으로 포함될 때, 특이성 반응은 달성될 수 있다. α-할로아세틸기외에, 다른 알킬화제는 히스티딘을 향해 반응성이 아니다. 아실화제와 함께, 히스티딘은 일반적으로 불안정한 아실화된 생성물을 형성하고 자발적 가수분해를 겪을 수 있다. 히스티딘의 변형에 통상적으로 사용되는 가장 중요한 아실화제는 디에틸피로카르보네이트 또는 에톡시포름 안히드리드이다. 아실화된 이미다졸은 알칼리성 pH 에서 반대가 되고, 히스티딘의 발견을 초래한다. 디아실화는 중성 pH에서 히드록실아민과 함께 매우 빠르게 달성될 수 있다.
2.3.7. 메티오닌 특이성 접합제
메티오닌의 주된 화학적 변형 반응은 알킬화이다. 메티오닌은 종종 단백질의 소수성 내부에 위치하기 때문에, 고도의의 선택성을 제공하는 경향이 있다. 오직 리간드에 커플되는 알킬화 시약만이 이들 매입된 메티오닌 잔기에 접근가능하다.
2.3.8. 트립토판 특이성 접합제
소수성 때문에, 트립토판 잔기는 일반적으로 단백질의 내부에 매입된다. 트립토판 잔기는 N-브로모숙신이미드 및 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드와 함께 변형된다. 별개의 시약, ρ-니트로페닐술페닐 클로라이드는 인돌일 부분의 변형에사용되어 왔다. 반응은 트립토판과 시스테인 잔기에 대해 선택적이다.
2.3.9. 세린 특이성 접합제
디이소프로필플루오로포스페이트, 페닐메틸-술포닐플루오라이드 및 다른 아크릴술포닐 플루오라이드와 같은 많은 반응성 시약이 활성 부위 세린과 반응하는 것으로 발견되었다. 가수분해의 강한 경쟁 반응 때문에, 그러한 시약의 사용에 있어서 보호를 수행해야 한다.
2.4. 본 발명의 변형된 리간드의 설계
변형된 리간드와 리셉터 사이의 공유 결합 형성은 효소에 의해, 활성화제에 의해 또는 그 고유한 접합제에 의해 촉진될 수 있다. 공유 결합은 리셉터의 리간드-결합 부위 또는 그 근처에 위치한 작용기와 함께 바람직하게 형성된다. 이들 카테고리는 고도의 선택성을 확보하므로 이점이 있다.
비가역적 결합 리간드의 설계는 리간드와 리셉터 둘다의 화학적, 생물학적 분자적 특성에 의존한다. 각각의 경우, 리간드의 화학적 구조 위에 도입되는 접합제는 다를 수 있고 특정 구조를 필요로 할 수 있다. 일반적으로, 리간드는 바람직하게 접합제의 부착을 허용하거나, 리간드의 활성에 작용하여 그것의 리셉터에 결합하고 생물학적 활성을 끌어내지 않으면서, 그러한 기를 포함하도록 변형될 수 있는 작용기를 포함한다. 이러한 관점에서 변형된 리간드는 모체 리간드와 동일한 생물학적 활성을 가질 필요는 없다(예들 들어, 일부 신진 대사 또는 이화 작용 단계에 의해 생체내에서 그것이 활성화될 필요는 없을 수 있다.)
접합제의 선택 및 구성을 위해 고려되는 조건 및 요구조건의 일부는 하기와같다.:
1. 접합제, 예를 들어, 아미노, 술피드릴, 카르복실, 그아니디닐, 이미다졸일, 및 다른 아미노산 측쇄의 선택에 요구되는 리셉터의 특정 작용기에 대한 반응 특이성을 결정하라. 선택은 약물 분자가 결합되는 리셉터상의 어떠한 작용기의 이용가능성에 의존할 것이다. 변형된 리간드의 비가역 결합 접합제는 그 작용기에 특이성이어야만 한다.
2. 접합제의 소수성 및 친수성. 소수성 환경에서 리셉터는 리셉터에 도달하도록 소수성 리간드를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 친수성 접합제를 갖는 변형된 리간드는 상응하는 리셉터의 소수성 코어 깊숙이 위치한 작용기에 접근할 수 없을 수 있다.
3.접합제의 분열. 리셉터에 결합된 변형된 리간드를 분리하는 일부의 경우에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 독성 약물(모체 리간드에 해당)이 변형되면, 안정 메카니즘은 과량 투여와 같은 선점유 상황에 설치되어야 한다. 이러한 경우, 복잡화가 일어나면, 분열가능한 접합제의 사용은 접합을 반대로되게 할 수 있을 것이다. 분리될 수 있는 결합의 다수는 이러한 목적을 위해 채용될 수 있다. 이들은 디술피드 결합, 아미딘, 수은 기, 인접 글리콜, 아조, 술폰 에스테르 및 티오에스테르 연결을 포함한다. 이러한 점에서, 접합제 자체는 분리될 수 있고, 또는 스페이서를 통해 접합제가 변형된 리간드에 부착되면, 스페이서는 분리될 수 있다. 이러한 점에서 스페이서는 (N-숙시미딜 3-(2- 피리딜디티오) 프로피오네이트, 숙시미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2- 피리딜디티오) 톨루엔, 3-(2-피리딜디티오) 프로피온일 히드라지드, 디숙시미딜 타르타레이트, N-[4-(p-아지도페닐아조)-벤지올]-3-아미노헥실-N'-옥시숙신이미드 에스테르, 4-4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐-술폰,3-(4-아지도-2-니트로벤조일셀레노) 프로피온산, 2-메틸말레 무수물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
4.접합제의 크기 및 기하학적 형태. 변형된 리간드 상의 접합제의 존재는 리셉터에 대한 그 리간드의 결합을 허용해야만 한다. 리셉터에 대한 변형된 리간드의 결합할때, 접합제는 리셉터 부분에 가깝게 근접하여 접합이 영향받도록 해야 한다. 여기서 정의된 스페이서는 가깝게 근접하는 접합제를 리셉터 부분에 가져가도록 요구될 것이다. 그러한 경우, 스페이서의 길이는 접합제가 리셉터 부분에 인접한 접합-효과적인 위치에 도달하는데 필요한 거리에 의존할 것이다. 분자 모델링과 조합하여, X선 결정법, 핵 자기 공명 등을 사용한 리셉터의 구조적 분석은 접합되는 리셉터 부분을 확인하고 리간드 화학 구조상의 접합제를 선택하고 구성하는데 도움이 될 수 있다. 리셉터 부분은 리셉터의 리간드 결합 부위에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 리셉터 부분은 리셉터의 리간드 결합 부위 바깥에 존재한다. 어떠한 이론으로 제한되지 않고, 변형된 리간드와 결합할 때 리셉터 기능의 분열을 예방할 것같기 때문에 후자는 이점이 있다는 것이 가능하다. 이러한 기반에서, 모체 작용물질은 변형되어 접합 리셉터와 가교결합함으로써 리셉터 기능("리셉터 턴-온")의 연속적인 촉진을 초래할 수 있다. 대안으로서는, 모체 길항제가 변형되어 그것이 접합 리셉터와 가교결합함으로써 리셉터 기능("리셉터 턴-오프")의 연속적인 억제를 초래할 수 있다.
3.조성물
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 여기서 기술된 바와 같은 변형된 리간드를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 치료가 필요한 환자에게 위에서 대략적으로 설명한 것처럼 조성물의 치료에 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는, 치료법 또는 예방법을 특징으로 한다.
투여의 경로에 의존하여, 당업계에서 잘 공지된, 약학적으로 허용되는 다양한 담체가 사용될 수 있다. 이들 담체는 설탕, 전분, 셀롤로스 및 그것의 유도체, 맥아, 젤라틴, 활석, 칼슘 술페이트, 야채 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 포스페이트 완충용액, 유화제, 등장성 살린, 및 피로겐없는 물로부터 선택될 수 있다.
투여의 어떠한 적절한 경로는 본 발명의 조성물을 제공하기 위해 채용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 설하, 입, 정맥내, 관절내, 근육내, 피부내, 피하, 흡입, 안구내, 복막내, 뇌혈관내, 경피 등이 채용될 수 있다.
투여 형태는 정제, 분산제, 현탁액, 주사제, 용액, 시럽, 구내정(트로키), 캡슐, 좌약, 에어로졸, 경피 패치등을 포함한다. 이들 투여 형태는 또한 이러한 목적을 위해 특별히 설계된 제어된 방출 장치 또는 이러한 식으로 추가적으로 작용하도록 변형된 조직 이식편의 다른 형태를 주입하거나 이식하는 것을 포함한다. 변형된 리간드의 제어된 방출은 동일한 것을 예를 들어, 아크릴 수지, 왁스, 더 높은 지방족 알코올, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 그리고 히드록시프로필메틸 셀룰로스와 같은 특정 셀룰로스 유도체로 코팅함으로써 영향받을 수 있다. 추가로, 제어된방출은 다른 폴리머 매트릭스, 리포솜 및/또는 마이크로스피어를 사용하여 영향받을 수 있다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 조성물은 분말 또는 과립 또는 수성 액체, 비수성 액체, 수유 에멀젼 또는 수유 액체 에멀젼중의 용액 또는 현탁액과 같이, 각각 소정량의 하나 이상의 본 발명의 면역성 액체를 함유하는 캡슐, 향가루 또는 정제와 같은 개별 단위로 나타날 수 있다. 그러한 조성물은 어떠한 조제법으로 조제될 수 있지만 모든 방법은 하나 이상의 필요한 성분으로 구성되는 담체와 함께, 상기한 하나 이상의 변형된 리간드를 결합하게 하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 본 발명의 변형된 리간드를 액체 담체와 균일하게 그리고 밀접하게 혼합하고, 그후, 필요하다면, 생성물을 원하는 기준으로 성형함으로써 제조된다.
변형된 리간드는 당업계에서 공지된 바와 같은 약학적으로 허용되는 염의 형태가 될 수 있다.
상기 조성물은 투여 제제와 호환하는 방식으로 그리고 치료에 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 이러한 점에서, 환자에 투여되는 변형된 리간드의 복용량은 치료되는 상태의 개선과 같이, 시간에 걸쳐 환자에게 유익한 반응을 작용하도록 충분해야 한다. 투여되는 변형된 리간드(들)의 양은 나이, 성별, 체중 및 전반적인 건강 상태를 포함하여 치료되는 대상에 의존할 수 있다. 이러한 점에서, 투여를 위한 변형된 리간드(들)의 정확한 양은 의사의 판단에 의존할 것이다. 표적 리셉터와 연관된 상태의 치료 및 예방에서 투여되는 변형된 리간드의 유효량을 결정하는데 있어서, 의사는 상태의 진행을 평가할 수 있다.
어떠한 경우, 당업자들은 본 발명의 변형된 리간드의 적절한 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 그러한 투여량은 본 발명의 변형된 리간드의 나노그람 내지 밀리그람의 정도가 될 수 있다.
4. 표적 리셉터의 검출 및 그것을 함유하는 세포 또는 세포막
본 발명은 또한 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 섹션 2에서 설명된 바와 같이 변형된 리간드와 샘플을 접촉시키고, 여기서 상기 변형된 리간드는 표적 리셉터에 결합하고, 접촉된 샘플에서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 방법을 포함한다. 방법은 샘플을 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드와 접촉시키고, 여기서 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 반응하고, 접촉된 샘플에서 변형된 리간드와 리셉터를 포함하는 복합체의 농도를 측정하고, 샘플에서 리셉터의 농도에 측정된 복합체 농도를 관련시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 또는 세포 막에 있어서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 세포 또는 세포 막을 함유하는 샘플을 상기한 변형된 리간드와 접촉시키고, 여기서 변형된 리간드는 표적 리셉터에 결합하고, 접촉된 샘플에서 변형된 리간드와 세포 또는 세포막을 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명에 의해 세포 또는 세포막에 있어서 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 방법이 포함된다. 방법은 상기한 바와 같은 변형된 리간드와 세포 또는 세포 막을 함유하는 샘플을 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터를 결합시킨다. 변형된 리간드와 세포 또는 세포 막을 포함하는 복합체의 농또는 그후 접촉된 샘플에서 측정되고, 측정된 복합체 농또는 세포 또는 세포 막상에 존재하는 리셉터의 농도에 관련한다.
변형된 리간드는 실제 약물 포켓 또는 리셉터 분자에 대한 약물 결합 영역을 확인하는 도구로서 사용될 수 있다. 그들 표적에 이들 변형된 리간드의 결합이 비가역적이기 때문에, 약자가 상호작용하는 실제 부위는 질량 스펙을 사용하는 펩티드 핑거 프린팅과 같은 다양한 기술을 사용하여 리셉터에서 확인할 수 있다. 이러한 정보는 특정 약물 포켓에 결합하는 분자를 확인하는데 사용될 수 있다.
복합체의 형성을 결정하는 어떠한 적절한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 그것과 결합하는 리포터 분자를 갖는 본 발명에 따르는 변형된 리간드는 (때때로 여기서 "프로브"로 언급한다) 리간드-리셉터 상호작용을 검출하고 또는 정량화하기 위해 당업계에 공지된 어떠한 적절한 분석으로 사용될 수 있다. 이러한 점에서 예를 들어, 섬광 카운팅, 방사선 사진, 플루오로그라피, 플로우 세포계산, UV 스펙트로스코피, 공초점 현미경, 전자 현미경 등을 사용할 수 있다.
리포터 분자는 포함되어 있다면, 접합제와 스페이서를 포함하여 변형된 리간드의 어떠한 적절한 부분과 결합될 수 있다. 바람직하게는 리포터 분자와 변형된 리간드와의 결합이 선택되어 리셉터에 변형된 리간드가 결합되는 것을 방해하지 않도록 한다.
항원-결합 분자와 결합하는 리포터 분자는 하기를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
변형된 리간드에 리포터 분자의 직접적인 부착;
변형된 리간드에 리포터 분자의 간접적 부착; 즉, 병형된 리간드에 이어서 결합하는 또다른 분석 시약에 리포터 분자의 부착 ; 및
변형된 리간드의 이어지는 반응 생성물에 부착.
리포터 분자는 크로모겐, 크로모포르, 촉매, 효소, 플루오로크롬, 화학발광 분자, Europium(Eu34) 과 같은 란타나이드 이온, 방사성 동위원소, 스핀 라벨 및 직접 시각 라벨을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
직접적인 시각 라벨의 경우에, 사용은 콜로이달 금속 또는 비금속 입자, 염료 입자, 효소 또는 기질, 유기 폴리머, 라텍스 입자, 리포솜, 또는 신호 생성 물질을 함유하는 다른 소낭 등으로 이루어질 수 있다.
리포터 분자로서 사용하기에 적합한 다수의 효소가 미국 특허 U. S. 4, 366, 241, U. S. 4, 843, 000, 및 U. S. 4, 849, 338에 개시된다. 본 발명에서 유용한 적절한 효소는 알칼리 포스파타제, 호스래디시 퍼옥시다제, 루시페라제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 라이소자임, 말레이트 디히드로게나제 등을 포함한다. 효소는 단독으로 또는 용액중의 두 번째 효소와 조합하여 사용될 수 있다.
적절한 플루오로크롬은 이것으로 제한되지는 않지만, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), R-Phycoerythrin (RPE), 및 Texas Red을 포함한다. 다른 플루오로크롬의 예는 Dower et al. (International Publication WO 93/06121)에서 논의한 것들을 포함한다. 미국 특허 5, 573, 909 (Singer et ao, 5, 326, 692 (Brinkley et al)에 기술된 플루오로크롬에 대한 참조가 또한 있을 수 있다. 대체예로서, 미국 특허 Nos. 5, 227, 487, 5, 274, 113, 5, 405, 975, 5, 433, 896, 5, 442, 045, 5, 451, 663, 5, 453, 517, 5, 459, 276, 5, 516, 864, 5, 648, 270 및 5, 723, 218.에서 기술된 플루오로크롬에 대한 참조가 있을 수 있다 .
바람직하게는, 리포터 분자는3H,125I,14C,32P,33P, 및35S 과 같은 방사성 동위 원소이다.
5. 응용
치료법.바람직하게는 비가역적 결합 약물을 나타내는 본 발명의 변형된 리간드는 종래의 가역적 결합 약물을 넘어 실질적으로 잇점들을 가진다. 첫째로, 복용량-관련 억제 또는 촉진이 약물이 플라즈마로부터 사라진 후에 오래 지속될 수 있다. 환언하면, 약물 효과가 그것의 플라즈마 제거 반감기로부터 예상되는 것보다 더 오래 지속될 것이다. 둘째로, 더 오래 지속되는 약물 효과 때문에, 이들 비가역적 결합 약물은 적은 횟수로 더 낮은 투여량으로 투여할 수 있다. 이것은 부작용을 최소화하고 약물 자체에 의해거나 또는 그들 대사 산물에 의한 누적 독성 유발을 예방한다. 세번째로, 비가역적 길항제의 그것의 리셉터에 대한 결합이 영구적이기 때문에, 리셉터 반응의 봉쇄는 더이상 경쟁 억제 메카니즘이 아니다. 이비가역적 길항작용은 작용물질이 어떠한 농도에서, 주어진 리셉터에 대한 최대 효과를 생성하는 것을 예방한다. 게다가, 변형된 리간드가 높은 방사성을 나타낸다면, 그것은 특히 접합 리셉터를 갖는 세포를 죽이기 위한 치료법으로 사용되거나 이미지화를 위해 사용될 수 있다.
진단.이 리간드 변형 기술의 또다른 용또는 다양한 복합체 생리학적 과정에 있어서 기능 장애를 완화시키는데 표적을 둘 수 있는 다양한 리셉터 하위집단을 더욱 설명하는 것이다. 보다 중요하게는, 변형된 약물이 우리로 하여금 특정 리셉터가 "결핍된" 유전 물질의 매우 길고, 지루하고 복잡한 촉진을 거치지 않고, 동물 모델을 개발/확인하도록 해준다. 따라서 "실재의" 상황에 있는 다양한 리셉터의 복합체 생리학적 메카니즘 및 기능을 연구하고 분석할 수 있다. 게다가, 또한 다양한 다른 리셉터들이 어떻게 연결되고 각각의 다른 기능으로부터 영향을 받는지 연구할 수 있다. 그러한 동물 모델의 이용가능성은 또한 조사자들로 하여금 관심있는 다중 리셉터 집단을 동시에 차단함으로써 다양한 약물의 치료 산물을 예측하고 밝힐 수 있게 할 것이다. 따라서, 본 발명은 조직.기관 또는 계통에는 물론 세포에 존재하는 다른 리셉터의 윤곽을 그리는데 사용될 수 있다. 그러한 리셉터 프로파일은 신규 약물 표적을 발견하고, 가능한 약물의 부작용을 예상하고 다양한 세포가 서로 어떻게 소통하는지, 그들의 건강의 상태, 및 그들이 특정 외부 자극(예를 들어 약물)에 대해 반응하는지 여부를 결정하는데 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명은 이제 하기의 제한하지 않는 예에 대한 참조와 함께 설명될 것이다.
특정 리간드와 결합한 후에 약리학적 효과를 만드는 세포내 또는 막-결합 단백질이다. 이러한 점에서, 약리학적 리셉터는 리간드-리셉터 복합체를 형성함으로써 리간드 신호를 검출하는 기능 및 (b) 약리학적 효과를 이끄는 신호를 안내하고 번역하는 기능의 두가지 기능을 갖는다.
약물은 리셉터와 상호작용하는 내인성 생리학적 리간드를 대신할 수 있다. 그러한 약물-리셉터 상호작용을 위한 필요상태는 리간드-리셉터 상호작용의 경우에서와 같은, 약물-리셉터 복합체의 형성이다. 리셉터(리셉터-매개된 효과)에 결합한 후에 효과를 촉진하는 생리학적 리간드와 반대로, 약물은 (a)리셉터에 결합한 후에 효과를 촉진하는 작용물질 또는 약물, 및 (b) 리셉터 결합 후에 효과를 촉진하지 않는 길항제 또는 약물로 분류할 수 있다.
분자 상호작용의 몇가지 형태는 이온 결합, 수소 결합 및 반데르발스힘에 의한 소수성 결합을 포함하는 약물-리셉터 결합을 위해 가능하다. 리셉터 상호작용의 대다수가 몇가지 종류의 결합을 동시에 수반한다. 이온 결합은 이들 결합이 가장 큰 또는 가장 긴 범위를 갖기 때문에 약물-리셉터 상호작용의 1차 상태에 있어서 중요하다. 초기 상호작용후에, 쌍극자-쌍극자결합, 수소결합 및 소수성 결합을 포함하여 미세조정이 일어난다. 비록 이들 모든 상호작용은 또한 리셉터의 활성 부위에서 약물 분자를 고정하지만, 그럼에도 불구하고, 상호작용력이 매우 약하기 때문에 결합은 가역적이다. 따라서 플라즈마 약물 농도의 감소가 그것의 리셉터로부터 약물 분자의 분리를 증가시킴에 따라, 어떠한 약물의 약리학적 효과는 플라즈마 상태에 있는 그것의 고유 농도에 의해 종종 영향을 받는다.
몇가지 약제(agent)는 효소를 비가역적으로 또는 가성비가역적으로 억제하는 것으로 알려져있고 억제의 정확한 메카니즘은 프로파일의 억제와 억제의 지속에 있어서의 미묘한 차이를 발생한다.
아세틸콜린에스테라제의 많은 억제제는 이 효소와 공유결합 반응을 하여, 천연 기질 아세틸콜린으로 형성된 아세틸 효소보다 좀더 느리게 탈아실화하는 아실 효소를 형성한다. 아세틸 효소는 기질에서의 활성 부위의 공격에 의해 빠르게 형성한다. 아실기의 효소로의 이동은 테트라헤드랄 중간물을 통해 일어난다. 아세틸 효소는 10μsec의 절반 시간으로 빠르게 가수분해한다. 이들 빠른 아실화와 탈아실화 단계는 초당 효소 분자당 105기질분자의 전환 속도를 발생한다. 사이소스티그민과 네오스티르민과 같은 콜린에스테라제 억제제는 메틸아미노카르바미올과 디메틸아미노카르바미올 효소를 형성하고, 이들은 몇 초의 탈아실화를 위한 반감 시간을 갖는다. 따라서, 효소에 대체 기질을 제공함으로써 아세틸콜린의 촉매 작용이 카르바오일화제를 위한 촉매 사이클 동안에 방해된다. 아세톡시 및 카르밤옥시 에스테르 기질을 위한 각각의 아실화 단계에 대한 반응 상수는 크게 다르지 않다; 따라서 카르밤오일 효소 접합체의 더 긴 잔류 시간은 억제를 지지하는 중요한 인자이다.
몇가지 다른 효소는 억제제의 공유 결합성 부착에 의해 억제되어, 비가역성을 발생한다. 히드라진(페넬진, 이소카르삭지드 대사산물) 및 아세틸렌 약물(파르길린)은 모노아민 옥시다제에 의해 산화하여 반응 중간물이 된다. 이들 중간물은 효소상에서 결합된 플라빈 공동인자를 공격한다. 그러한 약물은 그들의 활성은 그들이 불활성화하는 바로 그 효소에 의한 촉매작용을 필요로 하기 때문에, 제한되어 기질을 자살한다.
따라서 불활성화 과정은 메카니즘 기반이다. 이제 그러한 기질의 많은 예들이 있고, 효소에 의한 그것의 활성화는 효소의 공유결합성 변형 또는 결합된 공동인자의 변형을 일으킨다. 종종 이것은 효소의 기질과의 접합 또는 결합에 의해 발생하고 이어서 이웃하는 기 공격이 일어난다. 자살 기질의 몇가지 표적은 치료학적 중요성을 갖는다. 이들은 항박테리아 설계에서 페니실리나제와 알라닌 라세마제; 안티에필렙틱 약물을 위한 GABA 트랜스아미나제 억제제; 각각 레우코트린 및 프로스타글란딘 생합성을 제어하는 리폭시게나제 및 시클로옥시게나제 억제제; 에스트로겐 호르몬의 형성을 차단하는 아로마타제 억제제; 안티파라시트 약물와 같은 오르니틴 디카르복실라제 억제제; 및 카테폴라민 생합성을 제어하는 도파민 β-히드록실라제 억제제를 포함한다. 많은 자살 기질은 안티메타볼라이트로서 작용하고 잠재적인 종양 성장 억제제이다. 이들 억제의 효과는 내인성 기질의 그것과 비교하여 그들의 상대적인 분리 상수 또는 Km 값에 의존할 뿐만 아니라 자살 기질과 불활성 사건 사이의 반응 경쟁에도 의존한다.
오메프라졸(PRILOSEC)은 임상적인 사용을 위해 출시된 또다른 공지된 비가역적 결합 약물이다. 이 약물은 오직 체강벽 세포의 정점 막에 존재하는 H+, K+ -ATPase 에 결합함으로써 위산 분비를 억제한다. 오메프라졸은 다당증 환자에 특히 유용하고 H2길항제에 의해 잘 조절되지 않는 소화 궤양 질병을 앓는 사람에게 가치가 있을 수 있다. 중성 pH에서, 이 약물은 화학적으로 안정하고, 지질 용해성이고, 억제 활성이 없는 약염기이다. 이 중성 약염기는 혈액으로부터 체강벽 세포에 도달하고 분비 소관으로 확산되어, 거기서 약물은 양성자화하고 따라서 갇힌다. 양성자화된 약물은 재배열하여 술펜산 및 술펜아미드를 형성한다. 술펜아미드는 막-스패닝 H+, K+-ATPase의 세포외(루미날) 도메인에서의 중요 사이트에서 술프히드릴기와 공유결합적 상호작용을 한다. 오레프라졸은 따라서 효과적으로 활성화되는 것이 필요한 약물로 간주되어야만 한다.
그들의 표적에 비가역적으로 결합하는 몇가지 약물의 이용가능성에도 불구하고, 현재 리간드를 비가역적으로 표적 리셉터에 결합하도록 하기 위한 합리적인 설계에 이용가능한 방법이 부족하다.
발명의 개시
본 발명은 적어도 부분적으로, 접합제를 표적 리셉터에 가역적으로 결합하는 모체 리간드에 부착시킴으로써, 여기서 접합제는 표적 리셉터의 부분과 반응하여 접합제와 그 부분 사이에 공유 결합이 형성가능하고, 따라서 이렇게 제조된 변형된 리간드는 표적 리셉터를 비가역적으로 결합할 수 있다는 예상치못한 발견으로부터 발생한다.
따라서, 본 발명의 한가지 양태에서, 모체 리간드를 변형하기 위한 프로세스가 제공되고, 상기 모체 리간드에 표적 리셉터의 부분이 반응하여 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성가능하도록 상기 모체 리간드를 접합제에 부착하는 것을 포함하는 과정을 제공한다.
적절하게는, 접합제는 스페이서를 통해 모체 리간드에 부착된다.
바람직하게는, 스페이서가 접합제에 공유결합으로 부착된다.
스페이서는 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 옥소알킬, 헤테로옥소알킬, 알케닐, 헤테로 알케닐, 아랄킬, 헤테로 아랄킬, 아릴 및 헤테로아릴 라디칼로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적절하게 라디칼이거나 스페이서가되는 기능을 수행하는 어떤 다른 분자 형성이다. 스페이서 암(arm)의 길이는 적절하게 약 0Å와 약 20Å 사이의 범위로부터 선택된다.
바람직하게는, 스페이서는 생리학적 상태하에서 비 가수분해성 라디칼이다.
바람직하게는, 접합제는 술프히드릴기 특이성 접합제, 아미노기 특이성 접합제, 카르복실기 특이성 접합제, 티로신 특이성 접합제, 아르기닌 특이성 접합제, 히드티딘 특이성 접합제, 메티오닌 특이성 접합제, 트립토판 특이성 접합제 및 세린 특이성 접합제로 구성되는 군으로부터 선택된다.
술프히드릴기 특이성 접합제는 제한되지는 않지만, 5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 4, 4'-디티오디피리딘, 메틸-3-니트로-2-피리딜 디술피드, 및 메틸-2-피리딜 디술피드를 포함하는 N-말레이미드, N-말레이미드 유도체 및 디술피드 시약으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
아미노기 특이성 접합제는 제한되지는 않지만, α-하로아세틸 화합물, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤을 포함하는 알킬화제 및 제한되지는 않지만, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르, N-히드록실숙시미딜 에스테르, ρ-니트로페닐 에스테르, 아실 클로라이드, 및 술포닐 클로라이드를 포함하는 아실화제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
카르복실기 특이성 접합제는 제한되지는 않지만, 디아조아세테이트 에스테르 및 디아조아세트아미드를 포함하는 카르보디이미드 및 카르복실기 에스테르화 시약으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
티로신 특이성 접합제는 제한되지는 않지만, 벤지딘 및 비스-디아조화 3,3'-디메틸벤지딘을 포함하는 디아조늄 유도체로부터 선택될 수 있다.
아르기닌 특이성 접합제는 제한되지는 않지만, 글리옥살, 페닐글리옥살, 2-3-부탄디온 및 1, 2-시클로헥산디온을 포함하는 1,2-디카르보닐 시약으로부터 선택될 수 있다.
히스티딘 특이성 접합제는 이것으로 제한되지는 않지만 α-하로아세틸 화합물, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤을 포함하는 알킬화제 및 이것으로 제한되지는 않지만, 디에틸피로카보네이트, 에톡시포름산 무수물, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르, N-히드록실숙시미딜 에스테르, ρ-니트로페닐 에스테르, 아실 클로라이드, 및 술포닐 클로라이드을 포함하는 아실화제로 구성되는 군으로부터 적절하게 선택될 수 있다.
메티오닌 특이성 접합제는 이것으로 제한되지는 않지만 α-하로아세틸 화합물, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤을 포함하는 알킬화제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
트립토판 특이성 접합제는 N-브로모숙신이미드, 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 및 ρ-니트로페닐술페닐 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
세린 특이성 접합제는 디이소프로필플루오로포스페이트 및 이것으로 제한되지는 않지만 페닐메틸-술포닐플루오라이드를 포함하는 아크릴술포닐 플루오라이드로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
모체 리간드는 어떠한 천연 또는 비천연 리간드가 될 수 있지만 바람직하게는 공지된 약물을 포함하는 생물학적으로 활성 리간드이고 천연적으로 발생하거나 후보 화합물을 합성된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 상기에서 대략적으로 설명한 과정에 의해 제조되는 변형된 리간드를 제공한다.
본 발명의 여전히 또다른 양태에서, 하기 일반식을 갖는 변형된 리간드가 제공된다.:
L--R1--A
여기서 L은 모체 리간드이고;
여기서 A는 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성될 수 있도록 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제이고;
R1은 바람직하게는 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 옥소알킬, 헤테로옥소알킬, 알케닐, 헤테로 알케닐, 아랄킬, 헤테로 아랄킬, 아릴 및 헤테로아릴 라디칼로 구성되는 군으로부터 선택되는 비-가수분해성 라디칼을 포함하는 선택적인 스페이서이다.
바람직한 구체예에서, 변형된 리간드는 es 뉴클레오시드 운반체 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드/뉴클레오염기-민감성 단백질과 반응하고, 여기서 상기 변형된 리간드는 하기로 구성되는 일반식을 갖는다.
여기서 A는 N-말레이미드, 2-피리딜디티오, 또는 할로겐 ; X 는 NH, S, 또는 O ; Y 는 H, 할로겐, NH2, 또는 O 이고; Z 는 H, 할로겐, 또는 CH3이고; R1은 생리학적 상태하에서 비-가수분해성 라디칼을 포함하는 스페이서 암이고; R2는 H, β- D-리보오스, β-D-2-데옥시리보오스, 또는 그들의 5'-모노-, 5'-디-, 및 5'-트리-포스페이트이다.
적절하게는, 변형된 리간드는 상기 es 뉴클레오시드 운반체 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드/뉴클레오염기-민감성 단백질을 억제하고 하기의 기로 구성되는 군으로부터 선택되는 일반식을 갖는다.
여기서 R4는 4-[N-메틸]시클로헥산 카르복실레이트, N-[m-벤조에이트], 4-[p-페닐]부티레이트, N-[γ-부티레이트], N-[α-아세테이트], 또는 N-[ε-카프로일레이트]이고 ;
여기서 R4는 4-[N-메틸]시클로헥산 카르복실레이트, N-[m-벤조에이트], 4-[p-페닐]부티레이트, N-[γ-부티레이트], N-[α-아세테이트], 또는 N-[ε-카프로일레이트]이고,
여기서 R5는 4-카르보닐-α-메틸-α-톨루엔, 6-[α-메틸-α-툴로아미도]헥사노에이트, N-[3-프로피오네이트], 또는 6- [3'-프로피오아미도] 헥사노에이트이고;
여기서 R5는 4-카르보닐--메틸-α-톨루엔, 6-[α-메틸-α-툴로아미도]- 헥사노에이트, N-[3-프로피오네이트], 또는 6-[3'-프로피오아미도] 헥사노에이트이다.
또다른 구체예에서 세라토닌 리셉터에 결합하는 변형된 리간드가 사용될 수있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드를 포함하는 조성물에 있다.
본 발명의 더나아간 양태에서, 치료 방법 또는 표적 리셉터와 결합된 상태의 예방을 제공하고, 상기 방법은 위에서 대략적으로 설명한 바와 같이 조성물의 치료에 유효한 투여량을 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 하기를 포함하는, 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. : 상기 샘플을 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드와 접촉시키고, 여기서 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합하고; 상기 접촉된 샘플에서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 존재를 검출한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 하기를 포함하는, 시험 샘플에서 표적 리벳터의 존재를 정량화하는 방법을 제공한다. : 상기 샘플을 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드와 접촉시키고, 여기서 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합하고; 상기 접촉된 샘플에서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 농도를 측정하고; 상기 측정된 복합체 농도를 상기 샘플에서 상기 리셉터의 농도에 연관시킨다.
여전히 또다른 양태에서, 본 발명은 세포 또는 세포 막에 있어서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 하기를 포함하는 방법을 제공한다.: 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 함유하는 샘플을 접촉시킨다. 여기서 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합한다; 상기 접촉된 샘플에서 상기 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 포함하는 복합체의 존재를 검출한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 세포 또는 세포 막에 있어서 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 하기를 포함하는 방법을 제공한다.: 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 함유하는 샘플을 접촉시킨다. 여기서 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합한다; 상기 접촉된 샘플에서 상기 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 포함하는 복합체의 농도를 측정한다.; 상기 측정된 복합체 농도를 상기 세포 또는 세포 막에서의 상기 리셉터의 농도에 연관시킨다.
또다른 양태에서, 본 발명은 공유결합적으로 표적 리셉터에 결합하는 프로브(probe)로 확장하고, 상기 프로브는 그것과 함께 결합된 리포터 분자를 갖는, 위에서 대략적으로 설명한 바와 같은 변형된 리간드를 포함한다.
한가지 구체예에서, 프로브는 위에서 대략적으로 설명한 바와 같은 es 뉴클레오시드 운반체 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드/뉴클레오염기-민감성 단백질과 상호작용하는 변형된 리간드를 포함한다.
이러한 관점에서, 세포는 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유류 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포이다. 대안으로서는, 세포는 식물 세포 또는 미생물 세포가 될 수 있다. 미생물 세포는 이것으로 제한되지는 않지만 박테리아, 바이러스 또는 진균 근원을 포함한다.
본 발명은 또한 특히 연구에 있어서 위에서 대략적으로 설명한 변형된 리간드의 사용과 프로브, 치료 및 그들의 해당 표적 리셉터와 연관되는 상태의 예방을 포함한다.
한가지 구체예에서, 모체 리간드를 변형하고, 상기 모체 리간드를 상기 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제에 부착시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 모체 리간드는 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성되는 리셉터에 결합하는 과정을 제공한다.
한가지 바람직한 구체예에서, 접합제는 표적 리셉터의 부분과 함께 공유 결합 형성을 촉진하고/또는 허용하는 위치에서 리간드에 위치한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 리간드가 결합하는 리셉터는 생물학적 활성과 관련된 활성 부위이다. 리셉터는 예를 들어 세포 표면 리셉터이다. 변형된 리간드의 리셉터로의 결합은 표적 리셉터의 바뀐 활성과 연관된다.
또다른 바람직한 구체예에서, 모체 리간드 및/또는 리셉터는 자연적으로 발생한다. 또다른 구체에에서, 변형된 리간드는 가교결합제가 아니다. 또다른 구체예에서, 변형된 리간드는 선택적으로 포토라벨과 같은 광-반응 기를 포함하지 않는다. 또다른 구체예에서, 리간드가 결합하는 리셉터는 RNA 또는 DNA와 같은 핵산이 아니다. 또다른 구체예에서는, 접합제가 핵산의 부분에 결합하기 않고, 선택적으로 아미노산의 잔기에 결합한다.
한가지 구체에에서, 모체 기간드를 변형하고, 상기 모체 리간드를 상기 모체 리간드가 결합하는 표적 리섭터의 부분과 반응하는 접합제에 부착시키기 위한 과정을 제공하는데, 여기서 상기 모체 리간드는 리섭터에 결합할 때, 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성되고, 모체 리간드는 특별히 뉴클레오시드 운반체와 결합한다.
또다른 구체예에서, 모체 리간드를 변형하고, 상기 모체 리간드를 상기 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 술프히드릴기와 반응하는 술프히드릴기 특정 접합제에 부착시키고, 여기서 상기 모체 리간드가 리셉터에 결합할때, 상기 접합제와 상기 술프히드릴기 사이에 상기 공유 결합이 형성되고, 여기서 모체 리간드는 특히 세로토닌 리셉터와 결합하는 것을 포함하는 과정을 제공한다.
한가지 구체예에서, 하기식을 갖는 변형된 리간드를 제공한다.
(화학식 I)
L--R1--A
여기서 L은 뉴클레오시드 운반체를 포함하는 표적 리셉터와 특별히 결합하는 모체 리간드이고;
여기서 A는 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하여 상기 리간드가 리셉터에 결합할 때 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성가능하게 하는 접합제가고; R1은 선택적인 스페이서이다.
또다른 구체예에서, 일반식을 갖는 변형된 리간드가 제공된다.
(화학식 I)
L--R1--A
여기서 L은 세로토닌 리셉터와 특별히 결합하는 모체 리간드이고;
여기서 A는 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하여 상기 모체 리간드가 리셉터에 결합할 때 상기 접합제와 상기 리셉터의 술프히드릴기 부분 사이에 공유 결합이 형성가능하게 하는 접합제가고; R1은 선택적인 스페이서이다.
여기에서 언급된 모든 특허, 특허 응용, 공보 및 공개된 특허 용도의 개시는 전체적으로 참조에 의해 여기에 포함된다.
실시예 1:
쥐 골수종 SP2/0-Agl4 세포에서의 평형 뉴클레오시드 운반체에 대한 N-에틸말레이미드의 영향
전형적인 N-말레이미드 유도체가 유리하게 술프히드릴기에 특이성인 술피드릴시약으로 사용되었다. 단백질에서의 특정 접근가능 술프히드릴기와 오로지 반응하고, 특이성 억제와 화합물의 변하지 않는 성질에 의해 세포 내로 우수한 침투를 가능하게 한다. N-에틸말레이미드(NEM)은 단백질의 반응성 술프히드릴기와 함께 안정한 티오 에스테르를 형성할 수 있는 가장 작은 발레이미드 시약이다. NEM에 대한 es 및 ei 뉴클레오시드 운반 시스템의 감도가 증명되었다. NEM에 대한 뉴클레오시드 운반 시스템이 일반적인 현상이고 특정 세포나 조직 형태로 제한되지 않는다는 것을 나타내는데 다양한 다른 세포계가 사용되었다.
es 뉴클레오시드 운반 시스템(Paterson et al. (1977), Mol. Pharmacol., vol. 13, pp. 114 ; Gatietal. (1983), Mol. Pharmacol., vol. 23, pp. 146-1520) 의 이전의 연구는 뉴클레오시드의 당 성분이 es 뉴클레오시드 운반체 부위에 대한 뉴클레오시드의 결합에 있어서 중요하다고 제안하였다. 따라서, 본 발명에서는 그 운반체 규제 부위에 대한 신규 프로브를 제공하는 es 뉴클레오시드 운반체에 대한 효과적인 억제의 파괴를 피하기 위해, 연결 부분에 뉴클레오시드의 피리미딘/퓨린 고리가 부착되었다.
본 발명은 뉴클레오시드, 시티딜 4- [N-말레이미도메틸] 시클로헥산-l-카르복실산(CrMCC) 및 그것의 유도체 및 유사체의 신규 군은 인간 세포의 es 뉴클레오시드 운반체 단백질을 비가역적 억제하는 능력을 갖는다는 것을 발견하였다. CrMCC 또는 1-[[4-[(4-아미노-l-β-D-피보푸라노실-2(1H)-피리미디온)카르보닐] 시클로헥실] 메틸]-1H-피롤-2, 5-디온을 합성하는데 사용되는 직접적이고 빠른 합성 경로가 도 3에 나와있다.
NEM에 대한 es 및 ei 뉴클레오시드 운반체 시스템의 감도를 증명하기 위해, 운반 분석 이전에 다양한 포유류 세포계를 1분동안 0내지 30mM의 NEM의 변하는 농도로 처리하였다. 도 1은 쥐 골수종 SP2/0-Agl4 세포에서의3H-우리딘 (최종 농도 50 μM)의 평형 운반(5 흡수 간격에서 측정)이 명백한 이상(biphasic) 방식으로 NEM에 의해 억제되었음을 나타낸다. 약 60~70%의 운반 활성은 0. 15 mM의 IC50값으로 억제되었다. 남아있는 30~40%의 운반 활성은 3mM 이상의 농도에서 점차적으로 NEM에 의해 없어졌다. NEM에 의한 유사한 이상 억제는 또한 인간 HL-60과 인간 MCF-7 세포에서 관찰되었고, 이는 es 및 ei 운반 시스템(Lee et al. (1995), Biochim. Biophys. Acta, vol. 1268, pp. 200-208)을 둘다 갖는다. 오직 es (쥐 EL-4 cells) 또는 ei (래트 Mirris 7777) 운송 시스템만을 갖는 세포들에 대해, NEM 투여량-반응 시험에서의 단일상3H-우리딘 운송 곡선이 관찰되었다. IC50 값은 EL-4 과 Morris 7777에 대해 각각 약 0.1 과 1.5mM이었다. 이들 결과는NEM 투여량-반응 시험에서 관찰된3H-우리딘 운송의 두가지상 곡선은 그들 세포에서 두가지 개별 평형 뉴클레오시드 운송 시스템의 존재의 반영이다. NEM-민감 성분은 es 운송 시스템이고 NEM-둔감 성분은 ei 운송 시스템이다. ei 운반체는, NEM 억제에 덜 민감하지만, 더 높은 농도의 NEM에서 또는 NEM에 연장된 노출에 의해 억제될 수 있다. 이러한 관찰은 효소의 술프히드릴기가 기능 부전의 몇가지 단계를 통해, 비반응성으로부터 자유 및 즉시 반응성에 이르는 범위에서, 그들의 활성에 있어서 상당한 변화를 나타낸다는 일반적인 개념과 일치한다.
es 운송 시스템에 의한 우리딘 유입에서의 감소를 더욱 분명히 하는 것은 이어서 운반 친화력에 영향을 준 담체 단백질에서의 NEM-유발된 화학 변형 때문이고, es 뉴클레오시드 운송 활성의 변화는3H-NBMPR 결합 능력의 변화에 의해 증명될 수 있다는 사실을 확증하기 위해, 1분동안 0. 3 mM NEM으로 또는 이것없이 선처리된 쥐 골수종 SP2/0-Agl4 세포에 대해 세포 막에서의 친화력이 높은3H-NBMPR 결합 부위의 이용가능성을 분석하였다. 도 2는3H-NBMPR 결에 대한 Kd 값(20μM 의 NBTGR의 존재하에서 결정된 비특이성 결합에 대해 보정됨)은 NEM의 처리에 따라 상당히 변화되었다. 1분의 NEM 노출 후에 즉시, 명백한 Kd 값은 미처리 세포에 대해서 0. 16 ± 0. 02 nM인 것과 비교하여, 1. 9 ± 0. 4 nM이었다. 그러나, Bmax 값은 NEM 처리된 세포와 미처리된 세포에 대해 각각 40, 000 ± 2, 600 과 41, 000 ± 1, 000 부위/세포였고 크게 다르지 않았다. 이들 결과는 디술피드릴 결합이 es 운송 시스템의 뉴클레오시드 운송/결합 부위 근처 또는 가깝게 위치하고, 여기서 NEM 과 디술피드릴 결합의 형성이 담체의 운반체 친화력에 영향을 준다는 추가적인 증거를 제공한다. es 운반체 단백질에 대한 중요한 술프히드릴기는 아마도 뉴클레오시드 운송/결합 부위에 또는 가깝게 위치한다는 제안은 30μM의 NBMPR, 딜라제프, 디피리다몰과 10mM의 우리딘은 이 술프히드릴기를 NEM 변형으로부터 보호할 수 없다는데서부터 유도된다(Lee et al. (1995), Biochim. Biophys. Acta, vol. 1268, pp. 200-208). NEM 이 es 운반체 단백질의 억제제로서 효과적이지만, 그것은 독성이고 치료 목적을 위해서는 변형되어야 한다.
실시예2
CrMCC 의 합성 및 특성화
es 운반체 단백질을 선택적으로 비가역적으로 억제하는 전략은 반응기 특이성 공유 결합제(말레이미드)를 드라이버에 부착하여 원하는 표적에 공유 결합제를 운송할 수 있도록 하는 것이다. 가장 적절한 드라이버는 생리학적 리간드 자체(뉴클레오시드)일 것이다. 시티딘, 피리미딘 뉴클레오시드는 그것의 "기능 불활성", 따라서 "비특이성"약물 결합 때문에 다른 생리학적 뉴클레오시드중에서 선택된다. 말레이미드가 시티딘에 연결하는 스페이서 암에 대해서는, 시클로헥산 카르복실산이 파일럿 연구를 위해 선택된다. 이 구성은 NBMPR의 화학 구조(도 5b)와 흡사하다. 게다가, 소수성(시클로헥산에 의해 제공됨)과 같은 다른 잇점 및 안정성(카르복실산에 의해 제공됨)도 또한 고려되고 있다.
CrMCC 또는 1-[[4-[(4-아미노-1-β-D-피보푸라노실-2(1H)-피리미디온) 카르보닐] 시클로헥실] 메틸]-1H-피롤-2,5-디온를 합성하기 위한 직접적이고 빠른 합성 경로가 도 3에 나와있다.
반응에 앞서 N-숙시미딜 4- [N-말레이미도메틸] 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)와 시티딘을 각각 무수 디메틸술폭시드(DMSO)에 용해시켰다. 이들 실온에서 두가지 시약을 혼합하고 빛을 차단하면, 반응을 시작하였다. 혼합물에서의 SMCC : 시티딘의 분자 농도 비는 반응 시스템에서 pH 7. 5-8. 0 와 함께 0.10 M : 0.15M이었다. 4시간안에, CrMCC은 반응 혼합물에서 발견되었고 300nm의 흡수 파장을 사용하여 HPLC (AKTA Purifier, Pharmacia)에서 작동하는 C18역상 칼럼 (Resource RPC, Pharmacia)에 의해 시티닌과 SMCC으로부터 분리할 수 있다. 시티딘은 100% 물에 의해 용출되었고 CrMCC과 SMCC은 1. 5 ml/min의 유속을 갖는 물중의 15% 아세토니트릴에 의해 용출되었다. CrMCC 의 소수성은 시티딘의 그것보다 더 크지만 SMCC 보다는 작다. CrMCC의 형성은 22-24 ℃(도 4)에서 SMCC 와 시티딘 사이의 반응의 48시간 후에 그것의 최대에 가깝게 도달하였다. 피크 아래의 영역은 컴퓨터 프로그램 UNICORN (버전 2.0)을 사용하여 계산하였다.
HPLC 정제된 CrMCC 은 냉동 건조에 의해 용균되었다. 건조기에서 -20℃에서 저장한다면, CrMCC의 활성은 적어도 3달동안 안정하였다. CrMCC의 분자량은 LC-MS(Waters)에 의해 결정되었다. 간략하게, CrMCC은 물중의 20% 아세토니트릴에 의해 3ml/min의 유속에서 C18역상 칼럼 (Resource RPC, Pharmacia) 으로부터 용출되었다. 마이크로매스 질량 분석기의 모세관 전압은 3.0-3.5V으로 세팅하고, 콘 전압은 20V로 세팅하였다. N2가스 유속은 700 L/hr 이고 전자스프레이는 음성이었다. 질량 스펙트럼은 스캔 범위 1-1000 m/z, 풀-스캔 작동하에서 수집되었다. CrMCC의 분자량은 양성자화 분자 이온을 모니터함으로써 결정되었고 예상치 462.5와 유사하였다. 합성된 CrMCC의 순또는 확고하게 95%보다 더 컸다.
CrMCC의 빛 흡수 스펙트럼은 uv-vis 스펙트로포토미터에 의해 측정하였다. 도 5A는 CrMCC의 빛 흡수 스펙트럼에 대해 두가지 λmax가 있다. 그들중 하나는 254 nm에 있고 (시티딘의 λmax과 유사) 다른 하나는 300 nm(SMCC의 λmax과 유사)에 있다. 이렇게 두가지 λmax을 갖는 흡수 프로파일은 NBMPR의 그것과 매우 흡사하다(도 5B). 이는 CrMCC가 그것의 화학 구조에서 피리미딘과 시클로헥산 고리 두가지로 구성된다는 것을 지시한다. NMR을 사용한 계속되는 구조적 연구는 이러한 발견을 확증하였다.
실시예 3
인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라즈마 막에서의 3 H-NBMPR 의 결합에 대한 CrMCC의 영향
3H-CrMCC을 합성하기 위해서, 방사성 시티딘(3H-시티딘)을 사용하였다. 높은 농도의 기질은 CrMCC의 수율을 증가시키기 때문에, 비방사성 시티딘은 SMCC와 반응하기 전에(실시예 2) 100:1의 농도 비에서 방사성3H-시티딘과 미리 혼합하였다.
반응 완충액(0.13M NaCl, 0.02M NaHC03, pH 7.0)중에 현탁된 정제된 HL-60 플라스마 막은 추가적인 30분동안3H-NBMPR(5 nM)에 노출하기 전에, 평가된 농도의 시티딘, SMCC 및 CrMCC으로 5분동안 선처리하였다. 반응은 막 여과법에 의해 종료되었다(Lee & Jarvis (1988), Biochem. J., vol. 249, pp. 557-564). 도 6에 나타난 데이타는 20 μM 의 NBTGR의 존재하에서 결정된 비특이성 결합에 대해 보정되었다. 도 6은 개봉된 플라즈마 막에 대한3H-NBMPR의 특이성이 10 μM 의 IC50을 갖는 CrMCC에 의해 억제되었다는 것을 나타낸다. 이와 대조적으로,3H-NBMPR 결합을 억제하는데 있어서 SMCC 및 시티딘에 대한 IC50값은 각각 100 μM 과 > 1 mM 이었다. CrMCC에 대한 Ki 값은 1μM으로 계산되었다.
3H-NBMPR 의 결합 동역학에 대한 CrMCC의 효과를 분석하기 위해, 정제된 HL-60 플라즈마 막을 먼저 0, 10, 및 50 μM 의 CrMCC 으로 5분동안 선처리하고, 분류된 농도의3H-NBMPR (0.2 내지 8nM)로 추가 30분동안 배양하였다. 결과의 이중 상호 플롯은 도 7에 나타나있다. 도면의 선은 Bmax에 대한 변화된 값을 나타내는 가로축에 교차되었고, 그러나 CrMCC의 존재하에서 Kd에 대해 변화하지 않았다. 나타난 데이타에 대해,3H-NBMPR은 결합의 명백한 Kd 값은 각각 0, 10 및 50 μM의 CrMCC으로 처리된 막에 대해 1. 56 ± 0. 05, 0. 59 ± 0. 01 및 0. 30 + 0. 01 pmol/mg 단백질의 Bmax 값과 함께, 0. 36 ± 0. 04, 0. 31 ± 0. 03 및 0. 39 ± 0. 05 nM 였다. 데이타는 20μM 의 니트로벤질티오구아노신(NBTGR), 비방사성 경쟁 리간드의 존재하에서 비특이성 결합에 대해 보정되었다. 이들 결과는 CrMCC에 의한3H-NBMPR의 비경쟁 억제를 제안하였다. 이것은 비가역 길항작용의 유일한 특징이다.
임상적으로 유용한 어떠한 약물도 그들의 치료 투여량 범위에서 세포 독성이 거의 없거나 전혀 없어야 한다. 10%FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 5 x 104의 초기 세포 밀도에서 로그 성장에 있는 HL-60 세포는 분류된 농도의 CrMCC,시티딘, 및 SMCC(0내지 100μM)에 3일동안 노출되었다. 세포 밀또는 전자 입자 분석기(Sysmex)를 사용하여 계수되었다. 도 8은 3일동안 노출후에 CrMCC 과 시티딘 둘다 100μM 의 고농도에서 HL-60 세포 성장에 영향이 거의 없거나 전혀 없었다는 것을 보여준다. 대조적으로, 모체 화합물중 하나인 SMCC는 세포 성장에 대한 0. 5 μM 미만의 IC50값을 갖는 HL-60 세포에 대해 매우 독성이었다. SMCC의 독성은 세포에 있어서 그것의 모든 접근가능 술프히드릴기와의 비특이성 상호작용에 기인하였다. 거의 없거나 전혀없는, 시티딘에 의한 세포 성장에 대한 억제는 이 뉴클레오시드가 다소 "불활성"인 것으로 예상되고 시험한 농도 범위에서 뉴클레오티드 불균형을 유발하지 않는다.
실시예 4
인간 HL-60 프로리에로시틱 백혈병 플라스마 막에 대한 3H-CrMCC의 결합
방사성 CrMCC (3H-CrMCC)의 이용가능성은 es 뉴클레오시드 운반체에 대한 CrMCC의 생화학 특성을 연구하는 것을 가능하게 한다. 이 실험은 HL-60 세포의 개봉된 플라스마 막에 결합하는3H-CrMCC의 속도를 연구하기 위해 수행되었다. 도 9는 정제된 HL-60 플라스마 막에 대한 3H- CrMCC (30 μM 최종 농도)의 결합이 다소 느리다는 것을 보여준다. HL-60 플라스마 막 단백질의 mg당 12nmol 의 최대 결합 값을 달성하기위해 최소 5분이 필요하다. 이것은 결합이 빠르며 대부분 배양 처음 몇분안에 완성된다고 공지되어 있는 NBMPR, 디피리다몰 및 디라제프와 같은 가역적 길항제의 결합과는 다르다. 도 9에서의 결합 반응은 막 여과 방법에 의해 종료되었고 데이타는 여과 공백에 대해 보정되었다.
개봉된 HL-60 플라스마 막에 대한3H-CrMCC의 결합이 정말로 비가역적이라는 것을 확증하는 것이 중요하다. 정제된 개봉된 HL-60 플라스마 막은 10분동안 30 μM의3H-CrMCC으로 배양하였다. 혼합물을 20배 희석한 후에 희석된 혼합물을 실온에서 다양한 시간 간격동안 두어서 분열이 발생하게 하였다. 도 10은 20배 희석후에 적어도 60분동안 그것의 결합 부위로부터3H-CrMCC의 분열 발생이 거의 없거나 전혀 없다는것을 보여준다. 희석 배지에 존재하는 시티딘의 1mM 조차도 그것의 결합 부위로부터3H-CrMCC를 대신하지 못하였다. 이와 대조적으로, HL-60 플라스마 막에 대한 30 μM 의3H-CrMCC의 결합은 희석할때, 낮고 빠르게 완전히 분해되었다(도 10의 삽입). CrMCC(도7)에 의한3H-NBMPR 결합의 비경쟁 억제와 함께 이러한 발견은 그것의 결합 부위에 대한 CrMCC의 상호작용이 정말로 비가역적이라는 것을 제안하였다. 도 10에 나타난 분열 반응은 막 여과 법에 의해 종료되고 데이타는 필터 공백에 대해 보정되었다.
그것의 결합 부위에 대한3H-CrMCC 결합의 농도 의존성을 결정하기 위해, 정제된 개봉된 HL-60 플라스마 막을 10분동안3H-CrMCC (3 내지 800μM)의 분류된 농도로 배양하고 반응은 막 여과법(도 11)으로 종료시켰다. 데이타는 적어도 두개의 성분, 즉, 높은 친화력 성분(Kd = 23. 8 ± 2. 2 uM) 과 낮은 친화력 성분(도 11의 삽입)으로 분해될 수 있다. 낮은 친화력 성분에 대한 동역학상수는 존재하는 농도 범위의3H-CrMCC로 추정될 수 없다. 또한 이러한 낮은 친화력 성분은 비특이성3H-CrMCC 결합 부위라는 것이 가능하다. 도 11에 나타난 데이타는 필터 공백에 대해 보정되었다.
다양한 pH 조건하에서3H-CrMCC 리셉터 복합체의 안정성을 결정하는 것이 중요하다. 정제된 개봉된 HL-60 플라스마 막을 5분동안 30 μM 의3H-CrMCC으로 배양하였다. 반응 혼합물을 그후 다양한 pH 값(pH 0.85 내지 7.5)의 반응 완충액으로 20배 희석하였다. 분열 반응은 필터 공백에 대해 보정하였다. 도 12는3H-CrMCC-리셉터 복합체는 생리학적 pH에서 매우 안정적라는 것을 보여준다. 그러나, 리간드-리셉터 복합체는 3.5 이하의 pH에서 분해되기 시작하였다.
술피드릴 시약 NEM으로 이전에 행해진 연구에서는 시스테인 잔기가 아마도 es 뉴클레오시드 운반체 단백질의 뉴클레오시드 운송/결합 부위에 매우 가깝지만그 위에 위치하는 것은 아니라고 제안하였다. 따라서, 만일3H-CrMCC가 NEM이 결합하는 동일한 부위에 결합한다면, NEM 반응을 억제하지 못한 기질은 (Lee et al. (1995), Biochim. Biophys. Acta, vol. 1268, pp. 200- 208) 유사하게3H- CrMCC 결합에 대해 영향이 거의 없거나 전혀 없다. 도 13은 1mM의 생리학적 뉴클레오시드(예를 들어, 시티딘, 우리딘, 아데노신 및 이노신) 및 20μM의 es 뉴클레오시드 우송 억제제(예를 들어, NBMPR 및 디피리다몰)은 실제로 HL-60 플라스마 막에 대한3H- CrMCC(30μM 최종 농도)의 결합을 억제하지 못하였다는 것을 보여준다. 대조적으로, 1mM의 NEM은3H- CrMCC의 결합을 억제하는데 0.5mM 의 CrMCC 만큼 효과적이었다. 이러한 발견은 NEM 와 CrMCC가 es 뉴클레오시드 단백질에 대해 동일한 술프히드릴기와 반응했다는 것을 제안한다.
실시예 5
인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라스마 막에 대한 3 H-시티딘 분자의 결합에 대한 다른 술피드릴 반응 공유 암의 효과
시클로헥산 카르복실산 스페이서 암을 통해 시티딘에 연결된 말레이미드, 술프히드릴기 반응 약물은 es 운반체 단백질에 대한3H-NBMPR의 결합을 비가역적으로 억제하는데 효과적이다. 이 실험에서는, 다른 스페이서 암을 통해 동일한 또는 다른 술프히드릴기 반응 약물에 연결된 후에 HL-60 플라스마 막에 대한3H-시티딘 분자의 결합 능력을 비교하고, 비가역성 es 뉴클레오시드 운송 억제제를 만들어내는데 사용되는 스페이서 암의 안정성에 대한 간접적인 지시를 제공한다. 따라서, 3H-시티딘은 화학적으로 변형되어 피리미딘 로기의 6-아미노 위치상으로 다양한 술피드릴 반응 측쇄를 혼합한다.3H-시티딘을 변형하기 위해 사용된 화학물질은 N-숙시미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1- 카르복실레이트 (SMCC)에 더하여, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 (MBS), N-숙시미딜 4-[p-말레이미도페닐] 부티레이트 (SMPB), N-[γ-말레이미도부티릴옥시] 숙신이미드, 4-숙시미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-[2-피리딜티오] 톨루엔 (SMPT), N- 숙시미딜 3- [2-피리딜디티오] 프로피오네이트(SPDP), N-숙시미딜 말레이미도아세테이트 (AMAS), 및 N- [c-말레이미도카프로일옥시]숙신이미드(EMCS )이다. 정제된 HL-60 플라스마 막을 5분동안 화학적으로 변형된 이들3H-시티딘의 100μM으로 배양하였다. 반응은 막 여과 법에 의해 종료되었다. 도 14는 N-α-말레이미도아세톡실산(AMA) 공유결합성 암이 HL-60 플라스마 막에 대한3H-시티딘과 그리고 이어서 3-[2-피리딜디티오] 프로피온산 (PDP)의 높은 비가역성 결합을 촉진한다는 것을 나타낸다. 그러나, N-ε-말레이미도카프로일산 (EMC), m-말레이미도벤조산 (MB), N-γ-말레이미도부티릴산 (GMB) 및 4- [p-말레이미도페닐]부티릴산(MPB)은 N-말레이디모메틸 시클로헥산 카르복실산(MCC)에 비하여 공유결합성 암만큼 똑같이 효과적이었다. 대조적으로, α-메틸-α-[2-피리딜디티오] 톨루엔 카본산 (MPT)이 효과가 가장 작다. 도 14에서 기호 X는 시티딘을 나타낸다.
실시예 6
인간 HL-60 전골수구 백혈병 플라스마 막에서의 3 H-CrMCC 결합의 확인
3H-CrMCC에 의해 표지화된 플라스마 막 단백질을 확인하기 위한 시도를 행하였다.3H-CrMCC(20μM)표지된 SDS에 용해된 인간 HL-60 플라스마 막 단백질을 하기의 조건으로 FPLC (ATKA FPLC, Pharmacia) 상에서 작동되는 C18역상 칼럼(Resource RPC, Pharmacia)위에 로딩하였다 :칼럼 부피 (CV, 3 ml), 시작 완충액 A (물중의0. 05% TFA), 용리제 B (아세토니트릴중의 0.065% TFA), 유속(2 ml/min), 검출 (280 nm), 용출 (3CV중의 0% B, 1 CV중의 0-5% B , 5 CV중의 5% B, 15 CV중의 5- 100% B, 세척 100% B). 도 15는 C18역상 칼럼을 사용하는 FPLC 에 의해 분리된 후에 일반적인 UV(λ-280nm)흡수 프로파일의 HL-60 플라스마 막을 나타낸다. 크로마토그램상의 화살표는 3H-CrMCC (도 16으로 언급)에 의해 표지화된 단백질 피크를 나타낸다. 용리제는 1ml/min으로 수집되었고 방사능은 액체 섬광 계수기에 의해 결정되었다. 도 16은 적어도 세개의 주요 방사능 피크가 분율 숫자 43-44, 49-50, 및 57-59의 크로마토그램에 위치함을 나타낸다. 분율 번호 6에서의 예리한 방사능 피크는3H-CrMCC(즉,3H-시티딘)의 저하 생성물과3H-CrMCC의 막 지질에 대한 비특이성 결합 때문이다.
실시예 7
아데노신 기원의 비가역성 결합의 개발
리드 화합물로서 시티딘을 사용하여 es 운반체 단백질의 비가역 억제제 생성을 성공하는 관점에서, 본 발명은 공유 암을 아데노신(도 17)과 같은 다른 생리학적 뉴클레오시드에 부착시킴으로써 재생산될 수 있다.3H-아디노신은 도 3에 나타낸 일반적인 과정에 따라, 실시예 5에 나열한 화학물질을 사용하여,3H-아디노신은 화학적으로 변형되어 퓨린 고리의 6-아미노 위치 상에 결합된 다양한 술피드릴 반응 공유 암을 포함하였다. HL-60 플라스마 막은 100 μM의 이들 화학적으로 변형된3H-아디노신 유사체로 5분동안 배양하였다. 반응은 막 여과 법에 의해 종료되었다. 도 17은 4-[p-말레이미도페닐] 부티릴산 (MPB) 공유 암이 HL-60 플라스마 막과 이어서 N-α-말레이미도아세트산 (AMA)에 대한3H-아디노신 (100 μM)의 비가역 결합을 가장 높게 촉진한다는 것을 나타낸다. 그러나, 3- [2-피리딜디티오]프로피온산 (PDP), N-E-말레이미도카프로일산 (EMC), m-말레이미도벤조산(MB), 및N-말레이미도메틸 시클로헥산 카르복실산 (MCC)은 동일하게 공유결합성 암보다 더 낮은 효과가 있었다. 대조적으로, N-γ-말레이미도부티릴산 (GMB) 및 메틸-α- [2-피리딜디티오] 톨루엔 카본산 (MPT)은 효과가 가장 적었다.
실시예 8
쥐 뇌 막에 있어서 3 H-5-HT의 결합에 대한 비가역성 상호작용 5-HT 유사체의 억제 효과
A. 화합물 합성
도 19a, 20a, 21a 및 22a(각각 LBT3001 (1-[2-(5-히드록시-1 H-인돌-3-일)-에틸]-피롤-2, 5-디온), LBT3002 (4-(2,5-디옥소-2, 5-디히드로-피롤-1-일)-N- [2- (5-히드록실-1H 인돌-3-일)-에틸]-부티르아미드), LBT3004 (3- (2, 5-디옥소-2, 5-디히드로-피롤-1-일)-N-[2-(5-히드록실-lH-인돌-3-일)-에틸]-프로피온아미드),및 LBT3005 (4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일-메틸)-시클로헥산 카르복실산 [2-(5-히드록시-lH- 인돌-3-일)-에틸]-아미드)의 화학 구조)에 나타낸 화합물은 비가역성 결합 화합물과 같은 효능을 나타내고, 접합제를 포함하는 변형된 5-HT 리셉터 결합 리간드인 변형된 리간드의 예를 제공한다.
LBT3001의 합성을 위한 반응 개략도(도 19b)는 다음과 같다: 5-히드록시트립타민 (212. 7 mg, 1. 0 mmol)를 0℃에서 포화된 이탄산나트륨(25 ml) 용액에 용해하였다. N-에톡시카르보닐이미드 (177. 6 mg, 1. 05 mmol)을 교반하에서 첨가하였다. 30분후에, 냉수욕을 따뜻한 수욕(30 ℃내지 40℃)으로 대체하였다. 반응 용액을 그후 약 1시간동안 따뜻한 수욕에서 교반하였다. 용액을 그후 에틸 아세테이트(3 x 50 ml)으로 추출하였다. 그후 에틸 아세테이트 층을 중성 pH (2 x 20ml) 에 가까워질때까지 탈이온수로 세척하고 그후 염수(20ml)로 세척하였다. 유기층을 그후 무수 MgS04로 건조하였다. 용매를 제거하였다. 플래시 크로마토그래피(헥산 중에 30% 에틸 아세테이트)를 통한 정제로 생성물을 노란색 내지 오렌지 결정(187. 2 mg, 73%)으로 얻었다.
LBT3002의 합성을 위한 반응 개략도(도 20b)는 하기와 같다: 5-히드록시트립타민 히드로염화물 (42. 5 mg, 0. 2 mmol) 및 3-말레이미도부티르산 (40. 3 mg, 0. 22 mmol) 을 1 ml 2-메톡시에틸 에테르 (DME)에 현탁시켰다. 용액에, N-메틸 모르폴린 (NMM, 25 μ1, 0. 22 mmol) 및 1, 3-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 45.4 mg, 0. 22 mmol)을 첨가하였다. 용액을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 성분 용매 용리제(메틸렌 염화물중의 0% to 3% 메탄올)를 사용하여 생성물을 플래시 크로마토그래피로 직접 정제하여 갈색을 띈 오일(40. 7 mg, 60%)을 생성하였다.
LBT3004의 합성에 대한 반응 개략도(도 21b)는 하기와 같다: 5-히드록시트립타민 히드로염화물 (42. 5 mg, 0. 2 mmol) 및 3-말레이미도프로피온산 (37. 2 mg, 0. 22 mmol)을 1 ml 메톡시에틸 에테르 (DME)에 현탁시켰다. 용액에, N-메틸 모르폴린 (NMM, 25 μl, 0. 22 mmol) 및 1, 3-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 45. 4 mg, 0. 22 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성물을 성분 용매 용리제(메틸렌 클로라이드중의 0% 내지 1. 5% to 5% 메탄올)를 사용하여 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 오렌지 결정(46. 0 mg, 70%)을 생성하였다.
LBT3005 (도 22b)의 합성에 대한 반응 개략또는 하기와 같다: 포화된 NaHC03(80 ml) 중의 4-아미노메틸-시클로헥산카르복실산 (2. 83 g, 18. 0 mmol)을 0℃에서 격렬하게 교반하였다. 용액에, N-에톡시카르보닐레이미드 (미세 분쇄된, 3. 05 g, 18. 0 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 첨가가 종료되면 (약 10분), 탈이온수(80ml) 를 첨가하고 혼합물을 실온에서 40분동안 교반하였다. 결과 혼합물을 1M의 HCl로pH 1-2로 가져가고 에틸 아세테이트(3 x 80ml)로 추출하였다. 유기층을 탈이온수(50ml)로 세척하고 그후 염수(20ml)로 세척하였다. 유기상을 황산 마그네슘상에서 건조하고 감압하에서 증발시켜 미정제 생성물을 생성하였다. 플래시 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트:아세트산, 60:39:1)로 정제하여 고체 생성물(2. 69 g, 63%)을 얻었다. 5-히드록시트립타민 히드로염화물 (42. 5 mg, 0. 2 mmol) and 말레이미도메틸-시클로헥산 카르복실산 (52. 2 mg, 0. 22 mmol)을 1 ml 메톡시에틸 에테르(DME)에 현탁시켰다. 용액에, N-메틸 모르폴린 (NMM, 25 μl, 0. 22 mmol) 및 1, 3-디시클로헥실카보디이미드 (DCC, 45. 4 mg, 0. 22 mmol) 을 첨가하였다. 용액을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 직접 정제하여 성분 용매 용리제(에틸 아세테이트:헥산(3:1)에 대한 에틸 아세테이트:헥산(1:1))를 사용하여 밝은 갈색 오일(28. 3 mg, 35. 8%)을 생성하였다.
도 23에 나타낸 것과 같이 다른 5-HT 리셉터 결합 화합물은 도 19b 내지 22b에서 설명한 반응 개략도중의 하나를 사용하여 그들의 표적 부위에 비가역적 결합을 위해 유사하게 변형될 수 있다.
B.분석
도 18은 쥐 뇌 막에 대한 3H-5-HT의 높은 친화력 결합에 대한 다양한 5-HT 유사체의 억제 효과를 나타낸다. 정제된 쥐 뇌 막은 반응 완충액 (0. 13 M NaCl, 0. 02 M NaHCO3, pH 7. 0)을 분류된 농도의 LBT3001 (-), LBT3002 (o), LBT3004 (o), 및 LBT3005 (-)으로 5분동안 선처리하고, 추가적인 30분동안3H-5-HT (5 nM최종 농도)에 노출하였다. 반응은 막 진공 여과법으로 종료하였다. 나타낸 데이타는 1mM의 비방사능 5-HT의 존재하에서 결정된 비특이성 결합에 대해 보정하였다. 결과는 억제제의 부재하에서 결정된 제어 결합에 대해 도시하였다.
도 18은 쥐 뇌 막에 대한3H-5-HT의 결합이 명백한 이상 방식으로 5-HT의 모든 유사체에 의해 억제되었다는 것을 나타낸다.
5-HT와 말레이미드 분자사이에 스페이서 암을 전혀 함유하지 않는 유사체인 LBT3001 (1-[2-(5-히드록시-lH-인돌-3-일)-에틸]-피롤-2, 5-디온),(도 19a)는 각각 약 0. 001 내지 50 μM의 IC50값을 갖는 높고 낮은 친화력 결합 부위에 대한3H-5-HT 의 결합을 효과적으로 억제하였다. 스페이서 암에서 3 탄소 분자를 함유하는 유사체인 LBT3002는 (도 20a) 각각 약 0. 00003 내지 200 μM의 IC50값을 갖는 높고 낮은 친화력 결합 부위에 대한3H-5-HT 의 결합을 억제하였다. 스페이서 암에서 시아노헥산 카르복실 분자를 함유하는 유사체인 LBT3005는 각각 0. 5 내지 300μM의 IC50값을 갖는 높고 낮은 친화력 결합 부위에 대한3H-5-HT 의 결합을 억제하였다. 이들 결과는 설명한 기술을 사용하여 비가역성 결합 약물을 설계할 수 있다는 것을 분명히 지시한다. 추가적으로, 이 기술은 많은 작은 분자들에 응용가능하고 존재하는 분자의 효능을 더욱 개선하는데 적용될 수 있다.
여기에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 응용의 전체적인 개시는 참조로서여기에 포함된다.
명세서 전반에 걸쳐 목적은 어떠한 한가지 구체예 또는 특정한 특징의 모임으로 본 발명을 제한하지 않고, 바람직한 구체예를 설명하는 것이다. 당업자들은 순간의 개시에 비추어, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 예증된 특정 구체예에서 다양한 변형과 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 모든 그러한 변형과 변화는 첨부된 청구항의 범위내에 포함되도록 의도된다.

Claims (70)

  1. 모체 리간드를 변형시키는 방법으로서, 상기 모체 리간드에 상기 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제를 부착하여 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성가능하도록 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 접합제가 스페이서를 통해 모체 리간드에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 스페이서가 공유결합으로 모체 리간드에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 스페이서가 공유결합으로 접합제에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 스페이서는 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 옥소알킬, 헤테로옥소알킬, 알케닐, 헤테로 알케닐, 아랄킬, 헤테로 아랄킬, 아릴 및 헤테로아릴 라디칼로 구성되는 군으로부터 선택되는 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 접합제가 술프히드릴기 특이성 접합제인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 접합제가 아미노기 특이성 접합제, 및 카르복실기 특이성 접합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 접합제가 술프히드릴기 특이성 접합제, 아미노기 특이성 접합제, 카르복실기 특이성 접합제, 티로신 특이성 접합제, 아르기닌 특이성 접합제, 히드티딘 특이성 접합제, 메티오닌 특이성 접합제, 트립토판 특이성 접합제 및 세린 특이성 접합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 술프히드릴기 특이성 접합제는 N-말레이미드 및 N-말레이미드 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, N-말레이미드 유도체는 5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 4, 4'-디티오디피리딘, 메틸-3-니트로-2-피리딜 디술피드 및 메틸-2-피리딜 디술피드를 포함하는 디술피드 시약으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 아미노기 특이성 접합제는 알킬화제 및 아실화제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 알킬화제는 α-할로아세틸 화합물, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 아실화제는 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르, N-히드록실숙시미딜 에스테르, ρ-니트로페닐 에스테르, 아실 클로라이드, 및 술포닐 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 8항에 있어서, 카르복실기 특이성 접합제는 카보디이미드 및 카르복실기 에스테르화 시약으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 카르복실기 에스테르화 시약은 디아조아세테이트 에스테르 및 디아조아세트아미드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 8항에 있어서, 티로신 특이성 접합제는 디아조늄 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 디아조늄 유도체는 벤지딘 및 비스-디아조화 3,3'-디메틸벤지딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 8항에 있어서, 아르기닌 특이성 접합제는 1,2-디카르보닐 시약으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 1,2-디카르보닐 시약은 글리옥살, 페닐글리옥살, 2-3-부탄디온 및 1, 2-시클로헥산디온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 8항에 있어서, 히스티딘 특이성 접합제는 알킬화제와 아실화제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 알킬화제는 α-할로아세틸 화합물, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 아실화제는 디에틸피로카보네이트, 에톡시포름산 무수물, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르, N-히드록실숙시미딜 에스테르, ρ-니트로페닐 에스테르, 아실 클로라이드 및 술포닐 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 8항에 있어서, 메티오닌 특이성 접합제는 알킬화제인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 알킬화제는 α-할로아세틸 화합물, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 8항에 있어서, 트립토판 특이성 접합제는 N-브로모숙신이미드, 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 및 ρ-니트로페닐술페닐 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 8항에 있어서, 세린 특이성 접합제는 디이소프로필플루오로포스페이트 및 아크릴술포닐 플루오라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 세린 특이성 접합제는 페닐메틸-술포닐플루오라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  29. 화학식 I을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
    (화학식 I)
    L--R1--A
    여기서 L은 모체 리간드이고;
    여기서 A는 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성될 수 있도록 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제이고;
    R1은 선택적인 스페이서이다.
  30. 제 29항에 있어서, 스페이서는 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 옥소알킬, 헤테로옥소알킬, 알케닐, 헤테로 알케닐, 아랄킬, 헤테로 아랄킬, 아릴 및 헤테로아릴 라디칼로 구성되는 군으로부터 선택되는 가수분해가능한 라디칼을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  31. 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 표적 리셉터와 관련된 상태의 치료 또는 예방법으로서, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로하는 환자에게 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 28항 또는 제29항의 변형된 리간드를 포함하는 조성물의 치료에 유효한 투여량을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 시험 샘플에 있어서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법으로서,
    -제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드와 상기 샘플을 접촉시키는 단계, 여기서 만일 시험 샘플에 존재한다면 상기 변형된 리간드가 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    -상기 변형된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 시험 샘플에 있어서 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 방법으로서,
    -제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드와 상기 샘플을 접촉시키는 단계, 여기서 만일 시험 샘플에 존재한다면 상기 변형된 리간드가 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    -상기 변형된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    -상기 측정된 복합체 농도를 상기 샘플에서의 상기 리셉터의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 세포 또는 세포막에서의 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법으로서,
    -제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 함유하는 샘플을 접촉시키는 단계, 여기서 만일 상기 세포 또는 세포 막에 존재한다면 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    -상기 접촉된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 세포 또는 세포 막에서의 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 방법으로서,
    -제 18항 또는 제 19항의 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 함유하는 샘플을 접촉시키는 단계, 여기서 만일 상기 세포 또는 세포 막에 존재한다면 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    -상기 접촉된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 세포 또는 세포 막을 포함하는 복합체의 농도를 측정하는 단계;
    -상기 측정된 복합체 농도를 상기 세포 또는 세포 막에 존재하는 상기 리셉터의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 표적 리셉터에 공유결합을 하는 프로브로서, 상기 프로브는 그것과 결합하는 리포터 분자를 갖는 제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
  38. 제 37항에 있어서, 제 30항의 변형된 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는프로브.
  39. 표적 리셉터와 연관된 상태의 연구, 치료 및 예방에 있어서, 제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드 또는 제 37항의 프로브의 사용.
  40. 표적 리셉터 기능의 연구에 있어서 제 28항 또는 제 29항의 변형된 리간드 또는 제 37항의 프로브의 사용.
  41. 모체 리간드를 변형시키는 방법으로서, 상기 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제를 상기 모체 리간드에 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 모체 리간드가 리셉터에 결합할 때 상기 접합제와 상기 부분사이에 공유 결합이 형성되고, 모체 리간드는 특히 뉴클레오시드 운반체와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 접합제가 스페이서를 통해 모체 리간드에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 스페이서는 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 옥소알킬, 헤테로옥소알킬, 알케닐, 헤테로 알케닐, 아랄킬, 헤테로 아랄킬, 아릴 및 헤테로아릴 라디칼로 구성되는 군으로부터 선택되는 기를 포함하는 것을특징으로 하는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 접합제는 술프히드릴기 특이성 접합제, 아미노기 특이성 접합제, 카르복실기 특이성 접합제, 티로신 특이성 접합제, 아르기닌 특이성 접합제, 히드티딘 특이성 접합제, 메티오닌 특이성 접합제, 트립토판 특이성 접합제 및 세린 특이성 접합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 접합제는 N-말레이미드, N-말레이미드 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 술프히드릴기 특이성 접합제인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, N-말레이미드 유도체는 5, 5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 4, 4'-디티오디피리딘, 메틸-3-니트로-2-피리딜 디술피드 및 메틸-2-피리딜 디술피드를 포함하는 디술피드 시약으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 41항에 있어서, 접합제는 알킬화제와 아실화제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 모체 리간드를 변형시키는 방법으로서, 상기 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 술프히드릴기과 반응하는 술프히드릴기 특이성 접합제를 상기 모체 리간드에 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 모체 리간드가 리셉터에 결합할 때 상기 접합제와 상기 술프히드릴기 사이에 공유 결합이 형성되고, 모체 리간드는 특히 세로토닌 운반체와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 41항의 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  50. 제 48항의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  51. 화학식 I을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
    (화학식 I)
    L--R1--A
    여기서 L은 특히 뉴클레오시드 운반체를 포함하는 표적 리셉터와 결합하는 모체 리간드이고;
    여기서 A는 상기 모체 리간드가 리셉터에 결합할때 상기 접합제와 상기 부분 사이에 공유 결합이 형성될 수 있도록, 모체 리간드가 결합하는 표적 리셉터의 부분과 반응하는 접합제이고;
    R1은 선택적인 스페이서이다.
  52. 제 51항에 있어서, 스페이서가 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 옥소알킬, 헤테로옥소알킬, 알케닐, 헤테로 알케닐, 아랄킬, 헤테로 아랄킬, 아릴 및 헤테로아릴 라디칼로 구성되는 군으로부터 선택되는 비-가수분해가능 라디칼을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  53. 제 51항에 있어서, 접합제가 술프히드릴기 특이성 접합제인 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  54. 제 52항에 있어서, 술프히드릴기 특이성 접합제가 N-말레이미드, N-말레이미드 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  55. 제 51항에 있어서, 모체 리간드는 특히 뉴클레오시드 운반체와 결합하는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  56. 제 51항에 있어서, es 뉴클레오시드 운반체 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드/뉴클레오염기-민감성 단백질과 상호작용하고, 여기서 상기 변형된 리간드는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
    (화학식 II)
    (화학식 III)
    여기서 A는 N-말레이미드, 2-피리딜디티오, 또는 할로겐 ;
    X 는 NH, S, 또는 O ;
    Y 는 H, 할로겐, NH2, 또는 O 이고;
    Z 는 H, 할로겐, 또는 CH3이고;
    R1은 바람직하게는 생리학적 상태하에서 비-가수분해성 라디칼을 선택적으로 포함하는 스페이서 암이고;
    R2는 H, β-D-리보오스, β-D-2-데옥시리보오스 또는 그들의 5'-모노-, 5'-디- 및 5'-트리-포스페이트이다.
  57. 제 51항에 있어서, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
    (화학식 IV)
    여기서 R4는 4-[N-메틸]시클로헥산 카르복실레이트, N-[m-벤조에이트], 4-[p-페닐]부티레이트, N-[γ-부티레이트], N-[α-아세테이트], 또는 N-[ε-카프로일레이트]이고 ;
    (화학식 V)
    여기서 R4는 4-[N-메틸]시클로헥산 카르복실레이트, N-[m-벤조에이트], 4-[p-페닐]부티레이트, N-[γ-부티레이트], N-[α-아세테이트], 또는 N-[ε-카프로일레이트]이고,
    (화학식 VI)
    여기서 R5는 4-카르보닐-α-메틸-α-톨루엔, 6-[α-메틸-α-툴로아미도]헥사노에이트, N-[3-프로피오네이트], 또는 6- [3'-프로피오아미도] 헥사노에이트이고;
    여기서 R5는 4-카르보닐--메틸-α-톨루엔, 6-[α-메틸-α-툴로아미도]- 헥사노에이트, N-[3-프로피오네이트], 또는 6-[3'-프로피오아미도] 헥사노에이트이다.
  58. 화학식 I을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
    (화학식 I)
    L--R1--A
    여기서 L은 특히 표적 세로토닌 리셉터와 결합하는 모체 리간드이고;
    여기서 A는 상기 모체 리간드가 리셉터에 결합할때 상기 접합제와 상기 술프히드릴기 사이에 공유 결합이 형성될 수 있도록, 모체 리간드가 결합하는 상기 표적 리셉터의 술프히드릴기와 반응하는 접합제이고;
    R1은 선택적인 스페이서이다.
  59. 제 58항에 있어서, 모체 리간드가 세로토닌 또는 그것의 전구체 또는 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
  60. 제 58항에 있어서, 변형된 리간드가 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 리간드.
    LBT3001 (1-[2-(5-히드록시-1H-인돌-3-일)-에틸]-피롤-2, 5-디온);
    LBT3002 (4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-N-[2-(5-히드록실-1H 인돌-3-일)-에틸]-부티르아미드);
    LBT3004 (3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-N-[2-(5-히드록실-lH-인돌-3-일)-에틸]-프로피온아미드);및
    LBT3005 (4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일-메틸)-시클로헥산 카르복실산 [2-(5-히드록시-lH- 인돌-3-일)-에틸]-아미드)
  61. 제 51항의 변형된 리간드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 제 58항의 변형된 리간드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제 51항의 변형된 리간드와 접촉시키는 단계, 여기서 만일 시험 샘플에 존재한다면 상기 변형된 리간드가 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    상기 접촉된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제 51항의 변형된 리간드와 접촉시키는 단계, 여기서 만일 상기 샘플에 존재한다면 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    상기 접촉된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 농도를 측정하는 단계;
    상기 측정된 복합체 농도를 상기 샘플에서의 상기 리셉터의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제 58항의 변형된 리간드와 접촉시키는 단계, 여기서 만일 시험샘플에 존재한다면 상기 변형된 리간드가 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    상기 접촉된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 시험 샘플에서 표적 리셉터의 존재를 정량화하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제 58항의 변형된 리간드와 접촉시키는 단계, 여기서 만일 상기 샘플에 존재한다면 상기 변형된 리간드는 상기 표적 리셉터와 결합하고;
    상기 접촉된 샘플에 있어서 상기 변형된 리간드와 상기 리셉터를 포함하는 복합체의 농도를 측정하는 단계;
    상기 측정된 복합체 농도를 상기 샘플에서의 상기 리셉터의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 표적 리셉터에 공유 결합하는 프로브으로서, 상기 프로브는 그것과 함께 결합하는 리셉터 분자를 갖는 제 51항의 변형된 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
  68. 표적 리셉터 기능의 연구에 있어서 제 51항의 변형된 리간드 또는 제 67항의 프로브의 사용.
  69. 표적 리셉터에 공유 결합하는 프로브으로서, 상기 프로브는 그것과 함께 결합하는 리셉터 분자를 갖는 제 58항의 변형된 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
  70. 표적 리셉터 기능의 연구에 있어서 제 58항의 변형된 리간드 또는 제 69항의 프로브의 사용.
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