KR20230150328A - 뉴클레오시드 포스포르아미다이트에 대한 n-엑소환형 아미노 환형 탄화수소 보호기를 신속하게 탈보호하는 방법 - Google Patents
뉴클레오시드 포스포르아미다이트에 대한 n-엑소환형 아미노 환형 탄화수소 보호기를 신속하게 탈보호하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 핵산을 형성하기에 유용한 화합물에 관한 것이다:
[화학식 I]
.
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로부터 선택된다. R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 제거가능한 하이드록실-보호기로부터 선택된다. Q는 헤테로환형 염기이다. R4는 환형 탄화수소이다. 본 발명은 또한 생성된 화합물 및 핵산 생성물로부터 핵산을 형성하는 방법에 관한 것이다.
[화학식 I]
.
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로부터 선택된다. R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 제거가능한 하이드록실-보호기로부터 선택된다. Q는 헤테로환형 염기이다. R4는 환형 탄화수소이다. 본 발명은 또한 생성된 화합물 및 핵산 생성물로부터 핵산을 형성하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2021년 2월 27일자 출원된 미국 가출원 제63/154,691호를 우선권 주장한다. 상기 출원의 내용은 이의 전문이 참조로 본원에 혼입된다.
기술분야
본 개시내용은 엑소환형(exocyclic) 아미노 헤테로사이클 보호기를 갖는 뉴클레오시드 단량체를 제공한다. 구체적인 해당 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기는 사이클로알칸프로판오일 기 또는 하이드로신나모일 기를 포함한다. 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기를 포함하는 핵산, 및 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기를 사용하여 핵산을 합성하는 방법이 또한 개시된다.
이어지는 배경기술에 대한 논의에서, 특정 구조 및/또는 방법에 대한 참조가 이루어진다. 그러나, 하기 참조는 이러한 구조 및/또는 방법이 선행기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명자들은 이러한 구조 및/또는 방법이 선행기술에 해당하지 않음을 입증할 권리를 명시적으로 보유한다.
RNA의 화학적 합성은 DNA의 화학적 합성보다 훨씬 더 어려운 작업인데, 이는 화학적 합성 동안 리보스의 2'-하이드록실 기가 보호되어야 하기 때문이다. 보호된 2'-하이드록실이 뉴클레오티드간(internucleotide) 포스페이트에 근접하면 뉴클레오티드간 연결의 형성과 일단 올리고리보뉴클레오티드가 합성되는 경우 2'-보호기의 제거 측면 둘 다에서 문제가 발생한다. 또한, RNA의 뉴클레오티드간 결합은 DNA보다 훨씬 덜 안정적이다.
올리고 탈보호는 고체 지지체로부터의 화학적으로 합성된 올리고의 절단(cleavage)과 포스페이트 백본 및 핵염기로부터의 보호기의 제거를 포함한다. 이러한 과정의 목표는 상기 과정에서 손상 없이 완전히 탈보호된 올리고를 유리하는 것이다. 모든 탈보호 프로토콜이 DNA와 RNA를 손상시킬 수 있는 기본 조건을 필요로 하기 때문에, 합성 중에 올리고를 완전히 보호하면서 보다 순한 염기와 보다 짧은 탈보호 시간을 사용할 수 있는 보호기를 사용하는 것이 이롭다. 탈보호 동안 생성된 주요 불순물은 rU 탈피리미딘화(depyrimidination) 및 포스포다이에스터 결합의 가수분해이다.
RNA 합성에 대한 전형적인 접근법은 5'-하이드록실 기가 산-불안정성 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT) 보호기에 의해 보호된 리보뉴클레오시드 단량체를 활용하였고, 이는 단량체를 성장하는 올리고리보뉴클레오티드에 결합한 후 산성 조건 하에 제거될 수 있다. 산 탈보호 단계 동안 뉴클레오티드간 결합의 이성질체화 및 절단을 방지하기 위해 다양한 산-안정성 보호기가 2'-하이드록실 상에 위치되었다. 이러한 산-안정성 보호기 중 가장 인기 있는 것은 TBDMS로 공지된 tert-부틸-다이메틸실릴 기인 것 같다(Ogilvie et al., 1979). 2'-보호기로서 TBDMS의 사용은 RNA 화학 합성을 위한 이전의 소규모 시장을 매우 오랫동안 지배하였다(Usman et al., 1987; Ogilvie et al., 1988).
최근에, 2'-O-티오모폴린-4-카보티오에이트(TC) 기가 대체 RNA 2'-하이드록실 보호 화학물질로 도입되었다. 2'-TC와 핵염기 보호를 둘 다 동시에 제거하는 간단한 1-단계 탈보호 방법을 사용한다. 현재 사용되는 엑소환형 아민 핵염기 보호는 이소부티릴(iBu)이다. 합성 후, 올리고뉴클레오티드를 실온에서 5시간 동안 또는 40℃에서 1시간 동안 무수 에틸렌다이아민(EDA)에 노출시키는 것이 이 1-단계 합성-후 전반적인 탈보호(즉, 동시에 핵염기, 인 및 2'-하이드록실 탈보호)에 사용되지만, 이소부티릴 기를 제거하는 데 필요한 시간으로 인해 합성되는 RNA의 길이에 따라 검출가능한 양의 rU 탈피리미딘화를 초래한다. 따라서, 이러한 탈보호 계획의 제한 인자는 모든 핵염기 엑소환형 아민 이소부티릴 기의 완전한 제거이다. 다른 모든 보호기는 탈보호에 필요한 최소 시간을 정의하는 TC보다 불안정하다. 따라서, 이소부티릴보다 더 불안정한 보호기를 찾고자 하는 요구가 있다.
이소부티릴과 TC보다 더 불안정한 엑소환형 아민 보호기를 찾기 위한 일부 시도가 있었지만, 용해도 문제 및 관련 2' 내지 3' TC 이성질체화로 인한 2'-TC 아미다이트로서 상응하는 리보뉴클레오티드 단량체(특히 rG)의 합성에 어려움이 있었다. 따라서, 적합하게 소수성인 구아닌 및 시토신과 같은 핵염기 엑소환형 아민의 보다 불안정한 보호기를 갖는 화합물에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시내용은 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기를 갖는 뉴클레오시드 단량체를 제공한다. 구체적인 해당 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기는 사이클로알칸프로판오일 기 또는 하이드로신나모일 기를 포함한다. 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기를 포함하는 핵산, 및 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기를 사용하여 핵산을 합성하는 방법이 또한 개시된다.
한 양상은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이다.
화학식 I로 표시되는 화합물의 실시양태에서, R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 또는 하이드록시-제거가능한 보호기이다. O-C1-6 알킬 기의 예는 O-CH3이다. 제거가능한 보호기의 예는 O-티오카본(thiocarbon) 보호기이다. 티오카본 보호기의 예는, 비제한적으로, 티오카본에이트, 티오노카본에이트 및 티오노카밤에이트를 포함한다. 이러한 화합물의 실시양태는 하기 구조의 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
물결 선은 뉴클레오티드의 2' 탄소 상의 산소에 대한 티오노카밤에이트 기의 부착 지점을 나타낸다. 특정 실시양태에서, O-티오카본 보호기는 TC이다:
화학식 I의 화합물의 실시양태에서, Q로 표시되는 헤테로환형 염기는 자연적으로 발생하는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예컨대, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 및 변형된(modified) 퓨린 및 피리미딘 염기, 및, 예컨대 본원에 인용된 바와 같은 통상적인 유사체로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Q는 G 및 C로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, Q는 G이다.
일부 실시양태에서, 헤테로사이클은 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린으로부터 선택된다.
화합물의 특정 실시양태에서, 화합물은 헤테로사이클 염기로서 구아닌을 포함하고, 하기 화학식 Ia의 구조를 갖는다:
[화학식 Ia]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 환형 탄화수소이다.
다른 특정 실시양태에서, 화합물은 헤테로사이클 염기로서 시토신을 포함하고, 하기 화학식 Ib의 구조를 갖는다:
[화학식 Ib]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 환형 탄화수소이다.
화학식 I, Ia 또는 Ib로 표시되는 화합물의 실시양태에서, 환형 탄화수소는 3 내지 10개의 탄소 원자, 또는 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 페닐이다. 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 사이클로펜틸이다.
화학식 I, Ia 또는 Ib로 표시되는 화합물의 실시양태에서, R1 또는 R2는 각각 H, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로부터 선택된다. 전형적으로, 보호기는 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT)이고, 포스포르아미다이트 기는 2-시아노에틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트 또는 메틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트이다.
다른 양상은 5'(또는 3') 비보호된 하이드록실을 포함하는 뉴클레오시드 잔기를 하기 화학식 I의 구조를 갖는 보호된 뉴클레오티드 단량체와, 보호된 뉴클레오티드 단량체의 포스포르아미다이트 기를 상기 뉴클레오시드 잔기의 비보호된 하이드록실 기에 공유 결합하여 뉴클레오티드간 결합을 생성하기에 충분한 조건 하에, 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산을 합성하는 방법을 포함한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 또는 O-티오카본 보호기이고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 뉴클레오티드간 결합을 산화제에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 2'-하이드록실 보호기를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 뉴클레오시드 잔기는 고체 지지체에 공유 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 핵산을 상기 고체 지지체로부터 절단하여 유리 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
O-티오카본 보호기의 예는, 비제한적으로, 티오카본에이트, 티오노카본에이트 및 티오노카밤에이트를 포함한다. 이러한 화합물의 실시양태는 하기 구조의 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
물결 선은 뉴클레오티드의 2' 탄소 상의 산소에 대한 티오노카밤에이트 기의 부착 지점을 나타낸다. 특정 실시양태에서, O-티오카본 보호기는 TC이다:
상기 방법의 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 기 R1 또는 R2는 각각 보호기 및 포스포르아미다이트 기로부터 선택된다. 전형적으로, 보호기는 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT)이고, 포스포르아미다이트 기는 2-시아노에틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트 또는 메틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트이다.
화학식 I의 화합물의 실시양태에서, Q로 표시되는 헤테로환형 염기는 자연적으로 발생하는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예컨대, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 또는 변형된 퓨린 및 피리미딘 염기, 및 예컨대 본원에 인용된 바와 같은 통상적인 유사체로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Q는 G 및 C로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 Q는 G이다.
일부 실시양태에서, 헤테로사이클은 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린으로부터 선택된다.
화학식 I로 표시되는 화합물의 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 3 내지 10개의 탄소 원자, 또는 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 페닐이다. 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 사이클로펜틸이다.
다른 양상은 하기 화학식 VIII의 구조를 포함하는 핵산을 포함한다:
[화학식 VIII]
상기 식에서,
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로부터 선택되고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이고;
R5는 수소, 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m은 1 이상의 정수이다.
핵산 화합물의 실시양태에서, R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 또는 하이드록실-제거가능한 보호기이다. O-C1-6 알킬 기의 예는 O-CH3이다. 하이드록실-제거가능한 보호기의 예는 티오카본 보호기이다. O-티오카본 보호기의 예는, 비제한적으로, 티오카본에이트, 티오노카본에이트 및 티오노카밤에이트를 포함한다. 이러한 화합물의 실시양태는 하기 구조의 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
물결 선은 뉴클레오티드의 2' 탄소 상의 산소에 대한 티오노카밤에이트 기의 부착 지점을 나타낸다. 특정 실시양태에서, O-티오카본 보호기는 TC이다:
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핵산 화합물의 실시양태에서, Q로 표시되는 헤테로환형 염기는 자연적으로 발생하는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예컨대 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 또는 변형된 퓨린 및 피리미딘 염기, 및, 예컨대 본원에 인용된 바와 같은 통상적인 유사체로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Q는 G 및 C로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, Q는 G이다.
일부 실시양태에서, 헤테로사이클은 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린으로부터 선택된다.
핵산 화합물의 특정 실시양태에서, R4로 표시되는 환형 탄화수소는 3 내지 10개의 탄소 원자, 또는 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 페닐이다. 특정 실시양태에서, 환형 탄화수소는 사이클로펜틸이다.
핵산 화합물의 특정 실시양태에서, R5는 수소, 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, R5는 수소, 하이드로카빌, 및 치환된 하이드로카빌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, R5는 메틸 및 2-시아노에틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 전술한 특징 및 다른 특징과 본 발명의 장점은 첨부된 도면에 도시된 바와 같이 특정 실시양태의 하기 상세한 설명에 비추어 더욱 명백해질 것이다. 이해되는 바와 같이, 본 발명은 모두 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면과 설명은 사실상 예시적인 것으로 간주되어야 하고, 제한적인 것으로 간주되어서는 안 된다.
도 1은 N2-하이드로신나모일 구아노신 rG(hcin) 또는 N2-이소부티릴 구아노신 rG(ibu) 단량체로 합성된 100mer RNA 탈보호 생성물의 질량 프로파일을 나타내는 ESI 질량 스펙트럼 스캔 오버레이(overlay)이다. 탈보호 반응은 순수한 EDA에 의해 실온에서 rG(hcin)-RNA에 대해 1시간 45분 동안 또는 40℃에서 1시간 동안 rG(hcin)-RNA 및 rG(ibu)-RNA에 대해 수행된다. 질량 스펙트럼 스캔의 오버레이는 실온에서의 하이드로신나모일 제거가 매우 명백하고, 탈피리미딘화 부산물을 감소시킴을 나타낸다.
도 2는 100mer rG(hcin)-RNA 및 rG(ibu)-RNA로부터의 탈보호 생성물을 나타내는 UV-HPLC 크로마토그램 시리즈이다. RNA 탈보호 반응은 순수한 EDA에 의해 실온에서 1시간 45분 동안 또는 40℃에서 1시간 동안 수행되었다.
도 3은 5개의 rG(cpp) 또는 rG(iBu)를 함유하는 짧은 RNA 서열(20mer)의 탈보호 시간적 처리의 UV-HPLC 크로마토그램 시리즈이다. RNA는 순수한 EDA에 의해 40℃에서 소정 범위의 지속시간(30 내지 75분) 동안 탈보호되었다. FLP는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 4는 rG(cpp) 또는 rG(iBu) 단량체에 의해 합성된 100mer RNA의 질량 프로파일을 나타내는 2개의 ESI 질량 스펙트럼 스캔 오버레이의 도면이다. 100mer RNA는 순수한 EDA에 의해 40℃에서 소정 범위의 지속시간(rG(cpp)-RNA의 경우 30 내지 90분 및 rG(ibu)-RNA의 경우 60 내지 150분) 동안 탈보호된다. rG(cpp)-RNA 및 rG(ibu)-RNA의 완전한 탈보호는 각각 75분 및 120분에서 달성되었다. FLP는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 5는 순수한 EDA에 의해 40℃에서 각각 60분 및 150분 동안 탈보호된 100mer rG(cpp)-RNA 및 100mer rG(ibu)-RNA의 UV-HPLC 크로마토그램 오버레이이다. 오버레잉(overlaying)된 크로마토그램의 확대 보기(zoomed-in view)는 이러한 2개의 탈보호 반응(각각 긴 탈보호 시간의 부정적인 효과 및 수득된 % FLP에 대한 이의 영향을 강조함)에서 수득된 쇼트머(shortmer) 부산물의 양에서 유의한 차이를 나타낸다.
도 6은 40℃에서 각각 60분 및 150분 동안 순수한 EDA에 의해 수득된 100mer RNA 탈보호 생성물(rG(cpp)-RNA 및 100mer rG(ibu)-RNA)의 질량 프로파일을 나타내는 ESI 질량 스펙트럼 스캔 오버레이이다. 오버레이는 두 경우에 수득된 탈피리미딘화 불순물의 양에서의 유의한 차이를 강조한다.
도 2는 100mer rG(hcin)-RNA 및 rG(ibu)-RNA로부터의 탈보호 생성물을 나타내는 UV-HPLC 크로마토그램 시리즈이다. RNA 탈보호 반응은 순수한 EDA에 의해 실온에서 1시간 45분 동안 또는 40℃에서 1시간 동안 수행되었다.
도 3은 5개의 rG(cpp) 또는 rG(iBu)를 함유하는 짧은 RNA 서열(20mer)의 탈보호 시간적 처리의 UV-HPLC 크로마토그램 시리즈이다. RNA는 순수한 EDA에 의해 40℃에서 소정 범위의 지속시간(30 내지 75분) 동안 탈보호되었다. FLP는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 4는 rG(cpp) 또는 rG(iBu) 단량체에 의해 합성된 100mer RNA의 질량 프로파일을 나타내는 2개의 ESI 질량 스펙트럼 스캔 오버레이의 도면이다. 100mer RNA는 순수한 EDA에 의해 40℃에서 소정 범위의 지속시간(rG(cpp)-RNA의 경우 30 내지 90분 및 rG(ibu)-RNA의 경우 60 내지 150분) 동안 탈보호된다. rG(cpp)-RNA 및 rG(ibu)-RNA의 완전한 탈보호는 각각 75분 및 120분에서 달성되었다. FLP는 "전장 생성물"을 의미한다.
도 5는 순수한 EDA에 의해 40℃에서 각각 60분 및 150분 동안 탈보호된 100mer rG(cpp)-RNA 및 100mer rG(ibu)-RNA의 UV-HPLC 크로마토그램 오버레이이다. 오버레잉(overlaying)된 크로마토그램의 확대 보기(zoomed-in view)는 이러한 2개의 탈보호 반응(각각 긴 탈보호 시간의 부정적인 효과 및 수득된 % FLP에 대한 이의 영향을 강조함)에서 수득된 쇼트머(shortmer) 부산물의 양에서 유의한 차이를 나타낸다.
도 6은 40℃에서 각각 60분 및 150분 동안 순수한 EDA에 의해 수득된 100mer RNA 탈보호 생성물(rG(cpp)-RNA 및 100mer rG(ibu)-RNA)의 질량 프로파일을 나타내는 ESI 질량 스펙트럼 스캔 오버레이이다. 오버레이는 두 경우에 수득된 탈피리미딘화 불순물의 양에서의 유의한 차이를 강조한다.
정의
본 발명을 더욱 상세히 기술하기 전에, 본원에 사용된 용어는 달리 지시되지 않는 한 다음과 같이 정의된다.
"뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 모이어티"는, 포스페이트 기, 당 기 및 헤테로환형 염기를 포함하는 핵산(DNA 또는 RNA 또는 이들의 유사체 중 어느 하나)의 하위-단위뿐만 아니라 이러한 하위-단위의 유사체를 지칭한다. 다른 기(예를 들어, 보호기)가 뉴클레오티드의 임의의 성분에 부착될 수 있다.
"뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 모이어티"는 당 기 및 헤테로환형 염기를 포함하는 핵산의 하위-단위뿐만 아니라 이러한 하위-단위의 유사체를 지칭한다. 다른 기(예를 들어, 보호기)가 뉴클레오시드의 임의의 성분에 부착될 수 있다.
"뉴클레오시드 잔기"는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트에서와 같이, 더 큰 분자의 일부로서 당 기 및 질소-함유 염기(뉴클레오시드)를 갖는 분자를 지칭한다.
"뉴클레오티드 단량체"는 더 큰 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드 쇄에 혼입되지 않고, 단일 뉴클레오티드 하위-단위에 상응하는 분자를 지칭하고; 뉴클레오티드 단량체는 또한, 이러한 기가 뉴클레오티드 단량체의 의도된 용도에 필요한 경우, 활성화기 또는 보호기를 가질 수 있다.
용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는, 공지된 퓨린 및 피리미딘 염기를 함유하는 잔기, 예를 들어 아데닌(A), 티민(T), 사이토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U)뿐만 아니라, 변형된 다른 헤테로환형 염기를 함유하는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 변형은, 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보스 또는 다른 헤테로환을 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어 다이아미노퓨린 및 이의 유도체, 이노신 및 이의 유도체, 알킬화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 티올화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함하거나, 보호기, 예를 들어 아세틸, 다이플루오로아세틸, 트라이플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일, 9-플루오레닐메톡시카보닐, 페녹시아세틸, 다이메틸폼아미딘, 다이부틸폼아미딘, N,N-다이페닐 카밤에이트 등의 첨가를 포함한다. 퓨린 또는 피리미딘은 또한 전술된 것들의 유사체일 수 있고; 적당한 유사체는 당업자에게 공지되어 있고, 관련 출전 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적인 유사체는, 비제한적으로, 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-다이메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오사이토신, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, 5-에틸사이토신, 4-아세틸사이토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-다이메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다.
또한, 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는, 통상적인 리보스 및 데옥시리보스 당뿐만 아니라 다른 당도 포함하는 모이어티를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 또한, 당 모이어티에서의 변형을 포함하거나(예를 들어, 하나 이상의 하이드록실 기가 할로겐 원자 또는 지방족 기로 치환됨), 에터, 아민 등으로 작용화된다. "유사체"는, 문헌에서 모방체, 유도체, 유사한 구조를 갖는 것 등으로 인식되어 있는 구조적 특징부를 갖는 분자를 지칭하고, 예를 들어 비-천연(일반적으로 자연에 존재하지 않음) 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드 모방체, 예를 들어 2% 변형된 뉴클레오시드, 펩티드 핵산, 올리고머 뉴클레오시드 포스폰에이트를 혼입한 폴리뉴클레오티드, 및 보호기 또는 연결기와 같이 부가된 치환기를 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오티드간 결합" 또는 "뉴클레오티드 결합"은, 2개의 뉴클레오시드 모이어티 사이의 화학적 연결기, 예컨대 자연에서 발견되는 핵산 내의 포스포다이에스터 연결기, 또는 핵산 및 핵산 유사체의 합성 분야에 널리 공지된 연결기를 지칭한다. 뉴클레오티드간 결합은 포스포 또는 포스파이트 기를 포함할 수 있고, 포스포 또는 포스파이트 기의 하나 이상의 산소 원자가 치환기로 변형되거나 다른 원자(예컨대, 황 원자, 또는 모노- 또는 다이-알킬 아미노 기의 질소 원자)로 대체된 연결기를 포함할 수 있다.
"기"는 치환된 및 비치환된 형태를 둘 다 포함한다. 해당 치환기는 하나 이상의 저급 알킬, 아미노, 이미노, 아미도, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 티오, 알킬티오, 아릴티오, 아릴 또는 알킬; 아릴, 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 아미노, 아미도, 설포닐, 티오, 머캡토, 이미노, 할로, 시아노, 니트로, 니트로소, 아지도, 카복시, 설파이드, 설폰, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시 및 보론일을 포함하거나, 시아노, 니트로, 할로겐, 하이드록실, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 포스폰에이트 등과 같은 비-하이드로카빌 치환기로 하나 이상의 이용가능한 탄소 원자 상에서 임의적으로 치환된다. 임의의 치환기는 반응 수율에 실질적으로 부정적인 영향을 주지 않도록(예를 들어, 특정 치환기 또는 치환기 조합 없이 달리 수득된 수율의 20%(10%, 5% 또는 1%) 초과만큼 낮추지 않도록) 선택된다. 또한, 치환기는 존재하는 다른 기와 화학적으로 상용성이고 당업자에게 공지된 부반응을 회피하도록 선택된다. 예를 들어, 알코올은, 알코올의 하이드록사이드 및 리튬 기가 비-상용성이고 서로 반응할 것이므로, 리튬 기로 치환되지 않을 것이다. 이러한 개시내용의 임의의 기의 경우, 각각의 치환기는 40, 35, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 이하의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 전반적으로 임의의 기에 대한 모든 치환기에서 탄소 원자의 총수는, 특정 실시양태에서, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 이하이다.
용어 "헤테로환", "헤테로환형", "헤테로환형 기" 또는 "헤테로사이클로"는, 방향족("헤테로아릴") 또는 비-방향족(예를 들어, 3 내지 13원 일환형, 7 내지 17원 이환형 또는 10 내지 20원 삼환형 고리 시스템)을 비롯한 하나 이상의 탄소 원자-함유 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는, 전체적으로 포화되거나 부분적 또는 완전하게 불포화된 환형 기를 지칭한다. 헤테로원자를 함유하는 헤테로환형 기의 각각의 고리는 질소 원자, 산소 원자 및/또는 황 원자 중에서 선택된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 헤테로원자를 갖되, 상기 질소 및 황 헤테로원자가 임의적으로 산화되고, 질소 헤테로원자가 임의적으로 4급화될 수 있는, 헤테로원자를 가질 수 있다. 헤테로환형 기는 고리 또는 고리계의 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 있다. 다중 고리 헤테로환 중 고리는 하나 이상의 스피로 결합을 통해 융합, 가교화 및/또는 연결될 수도 있다. 질소-함유 염기는 헤테로환의 예이다. 다른 예는 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피롤리디닐을 포함한다.
용어 "치환된 헤테로사이클", "치환된 헤테로환형", "치환된 헤테로환형 기" 및 "치환된 헤테로사이클로"는 바람직하게는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 옥소, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클로, 치환된 헤테로사이클로, 카보사이클로(임의적으로 치환된), 할로, 하이드록시, 알콕시(임의적으로 치환된), 아릴옥시(임의적으로 치환된), 알칸오일(임의적으로 치환된), 아로일(임의적으로 치환된), 알킬에스터(임의적으로 치환된), 아릴에스터(임의적으로 치환된), 시아노, 니트로, 아미도, 아미노, 치환된 아미노, 락탐, 우레아, 우레탄, 설포닐 등으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 헤테로사이클, 헤테로환형 및 헤테로사이클로 기를 지칭하고, 임의적으로 치환기의 하나 이상의 쌍은 이들이 결합된 원자와 함께 3 내지 7원 고리를 형성한다.
용어 "전자-당김(electron-withdrawing) 기"는, 이웃 원자로부터 원자가(valence) 전자를 당기는 경향이 있는 잔기를 지칭한다(즉, 상기 치환기는 이웃 원자에 비해 음전성(electronegative)이다). 전자-당김능의 수준을 정량화하는 것은 해머트 시그마 상수(Hammett sigma constant)에 의해 제공된다. 이 공지된 상수는 다수의 문헌, 예를 들어 문헌[March, Advanced Organic Chemistry 251-59, McGraw Hill Book Company, New York, (1977)]에 개시되어 있다. 전자-당김 기는 니트로, 아실, 폼일, 설포닐, 트라이플루오로메틸, 시아노, 클로라이드 등을 포함한다.
용어 "전자-공여 기"는, 이웃 원자에 원자가 전자를 제공하는 경향을 갖는 잔기를 지칭한다(즉, 이러한 치환기는 이웃 원자에 비해 덜 음전성이다). 전자-공여 기는 아미노, 메톡시, 알킬(선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있는 C1-6 알킬), C4-9 사이클로알킬 등을 포함한다.
본원에서 "보호기"는, 분자의 일부가 특이적인 화학 반응을 겪는 것을 억제하지만, 상기 반응의 종결 후에 분자로부터 제거가능한 종을 지칭한다. "보호기"란, 통상적인 화학적 의미에서는, 문헌[Greene, et al., "Protective Groups in Organic Synthesis," John Wiley and Sons, Second Edition, 1991]에서 교시하는 바와 같이, 요구되는 반응의 특정 조건 하에 작용기를 가역적으로 비-반응성이도록 하는 기로서 사용된다. 목적하는 반응 후에, 보호기는 제거되어 보호된 작용기를 탈보호할 수 있다. 모든 보호기는 합성될 분자의 실질적인 부분을 분해시키지 않는 조건 하에 제거가능해야만 한다(즉, 불안정성이어야만 한다). 보호기와는 대조적으로, "캡핑 기"는 분자의 분절에 영구적으로 결합되어, 상기 분절의 임의의 추가의 화학적 변형을 억제한다. 보호기에 의해 보호된 작용기는 보호기로서 지칭되는 것의 일부이거나 일부가 아닐 수도 있음에 주목해야만 한다.
"하이드록실 보호기" 또는 "O-보호기"는, 보호된 기가 하이드록실인 보호기를 지칭한다. "반응성-부위 하이드록실"은 3'-5' 폴리뉴클레오티드 합성 동안의 말단 5'-하이드록실, 또는 5'-3' 폴리뉴클레오티드 합성 동안의 3'-하이드록실이다. "자유 반응성-부위 하이드록실"은, 폴리뉴클레오티드 합성 동안 반응하여 뉴클레오티드간 결합(예를 들어, 포스포르아미다이트 작용기)을 형성하기에 용이한 반응성-부위 하이드록실이다.
"티오카본 보호기"는 독립적으로 수소, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼에 연결된 산소, 황 또는 질소에 추가적으로 연결된 카보닐 또는 티오노카보닐 모이어티를 통해 연결된 보호기를 지칭하되, 티오카본 보호기가 질소를 통해 라디칼에 연결될 때, 라디칼은 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 추가적으로 선택될 수 있다.
용어 "동시에 탈보호하는"은 동일한 공정에서 상이한 보호기를 제거하는 것을 목적으로 하고 동시에 또는 실질적으로 동시에 수행되는 과정을 지칭한다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 상이한 보호기의 탈보호가 정확히 동시에 발생하거나 동일한 속도 또는 동일한 동역학으로 발생함을 의미하지는 않는다.
"포스포" 기는 포스포다이에스터, 포스포트라이에스터 및 H-포스폰에이트 기를 포함한다. 포스포 또는 포스파이트 기의 경우에, 치환된 5원 퓨릴 고리 이외의 화학적 모이어티는 퓨릴 고리와 P 원자 사이를 연결하는 포스포 또는 포스파이트 기의 O에 부착될 수 있다.
용어 "포스포르아미다이트 기"는 -P-(OR13)(NR14R15)의 구조를 포함하는 기를 지칭하고, 이때 각각의 R13, R14 및 R15는 독립적으로 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 일부 실시양태에서, R13, R14 및 R15는 저급 알킬, 저급 아릴, 및 치환된 저급 알킬 및 저급 아릴(바람직하게는 18, 16, 14, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 탄소를 함유하는 구조로 치환됨)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, R13은 2-시아노에틸 또는 메틸이고, R14 및 R15 중 하나 또는 둘 다는 이소프로필이다. R14 및 R15는 임의적으로 환형으로 연결될 수 있다.
본원에서 용어 "알킬"은, 달리 특정되지 않는 한, 1 내지 24개, 전형적으로 1 내지 12개의 탄소 원자의 포화된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 기를 지칭하고, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-다이메틸부틸 및 2,3-다이메틸부틸을 지칭한다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 기를 의도하고, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-다이메틸부틸 및 2,3-다이메틸부틸을 포함한다. 용어 "사이클로알킬"은 환형 알킬 기, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 지칭한다.
또한, 용어 "알킬"은 "변형된 알킬"을 포함하고, 이는 1 내지 24개의 탄소 원자를 갖고, 에터-, 티오-, 아미노-, 포스포-, 옥소-, 에스터- 및 아미도-로부터 선택되는 하나 이상의 연결기와 같은 추가적인 기를 추가로 갖고/거나, 저급 알킬, 아릴, 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 아미노, 설포닐, 티오, 머캡토, 이미노, 할로, 시아노, 니트로, 니트로소, 아자이드, 카복시, 설파이드, 설폰, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시 및 보론일을 비롯한 하나 이상의 추가적인 기로 치환되는 알킬 기를 지칭한다. 유사하게, 용어 "저급 알킬"은 "변형된 저급 알킬"을 포함하고, 이는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고, 에터-, 티오-, 포스포-, 케토-, 에스터- 및 아미도-로부터 선택되는 하나 이상의 연결기와 같은 추가적인 기를 추가로 갖고/거나, 저급 알킬; 아릴, 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 아미노, 설포닐, 티오, 머캡토, 이미노, 할로, 시아노, 니트로, 니트로소, 아자이드, 카복시, 설파이드, 설폰, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시 및 보론일을 비롯한 하나 이상의 기로 치환되는 기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "알콕시"는 치환기 -O-R을 지칭하고, 이때 R은 상기 정의된 알킬이다. 용어 "저급 알콕시"는 R이 저급 알킬인 상기 기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "티오알킬"은 R이 상기 정의된 알킬인 치환기 -S-R을 지칭한다.
본원에서 용어 "알켄일"은, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 2 내지 24개의 탄소 원자, 전형적으로 2 내지 12개의 탄소 원자의 분지형, 비분지형 또는 환형(예를 들어, C5 및 C6의 경우) 탄화수소 기, 예를 들어, 에텐일, 비닐, 알릴, 옥텐일, 데센일 등을 지칭한다. 용어 "저급 알켄일"은 2 내지 8의 탄소 원자의 알켄일 기를 의미하고, 구체적으로 비닐 및 알릴을 포함한다. 용어 "사이클로알켄일"은 환형 알켄일 기를 지칭한다.
본원에서 용어 "알킨일"은, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 2 내지 24개, 전형적으로 2 내지 12개의 탄소 원자의 분지형 또는 비분지형 탄화수소 기, 예를 들어 아세틸렌일, 에틴일, n-프로핀일, 이소프로핀일, n-부틴일, 이소부틴일, t-부틴일, 옥틴일, 데신일 등을 지칭한다. 용어 "저급 알킨일"은 2 내지 8개의 탄소 원자의 알킨일 기를 의미하고, 예를 들어 아세틸렌일 및 프로핀일을 포함하고, 용어 "사이클로알킨일"은 환형 알킨일 기를 지칭한다.
용어 "하이드로카빌"은 알킬, 알켄일 또는 알킨일을 지칭한다. 용어 "치환된 하이드로카빌"은 일반적으로, 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상에서 수소를 대체하는 치환기를 갖는 하이드로카빌 모이어티를 지칭한다. 상기 치환기는, 예를 들어, 하이드록실, 할로겐, 카보닐(예를 들어, 카복실, 알콕시카보닐, 폼일 또는 아실), 티오카보닐(예를 들어, 티오에스터, 티오아세테이트 또는 티오폼에이트), 알콕실, 포스포릴, 포스폰에이트, 포스핀에이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설폰에이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로환형, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티일 수 있다. 당업자는, 탄화수소 쇄에서 치환된 잔기가, 적당한 경우, 그 자체로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환기는, 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스폰에이트 및 포스핀에이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설폰에이트 포함), 및 실릴 기뿐만 아니라, 에터, 알킬티오, 카보닐(케톤, 알데하이드, 카복실레이트 및 에스터 포함), -CN 등의 치환된 형태 및 비치환된 형태를 포함할 수 있다. 사이클로알킬은 알킬, 알켄일, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카보닐-치환된 알킬, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "알콕시"는, 산소에 연결된 알킬 기를 의미하고, 구조식 R-O-(이때, R은 알킬 기임)로 표현될 수 있다. 그 예는 메톡시 기 CH3O-이다.
용어 "MOE"는 메틸옥시에틸 또는 메틸옥시에틸렌을 의미한다. MOE 기를 갖는 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드로 통상적으로 지칭되고, 이때 뉴클레오시드(또는 뉴클레오티드)의 2' 탄소는 O-CH2CH2O-CH3 기에 연결된다.
용어 "아릴"은, 0 내지 4개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5원, 6원 및 7원 단일 또는 다중 고리 방향족 기, 예를 들어 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트라이아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등을 지칭한다. 고리 구조 내의 헤테로원자를 갖는 아릴 기는 또한 "아릴 헤테로환" 또는 "헤테로방향족"으로 지칭될 수 있다. 용어 "아릴"은 또한, 2개 이상의 환형 고리를 갖고 2개 이상의 탄소가 인접 고리와 공통이고(이러한 고리를 "융합된 고리"로 지칭함) 고리 중 하나 이상이 방향족인(예를 들어, 나머지 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴 및/또는 헤테로환일 수 있음) 다환형 고리 시스템을 포함한다. "저급 아릴"은 18개 이하, 예를 들어 14개 이하, 12개 이하, 10개 이하, 8개 이하, 또는 6개 이하의 탄소를 함유한다.
방향족 고리는, 하나 이상의 고리 위치에서, 치환된 하이드로카빌에 대해 전술된 바와 같은 치환기(예를 들어, 할로겐, 아자이드, 알킬, 아르알킬, 알켄일, 알키닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 알콕실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스폰에이트, 포스핀에이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 에터, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스터, 헤테로환형, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, -CN 등)로 치환될 수 있다.
용어 "할로겐" 및 "할로"는 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)를 지칭한다.
본원에서 "연결기"는, 2개의 다른 잔기에 결합된 제1 잔기를 지칭하되, 2개의 다른 잔기는 제1 잔기를 통해 연결된다. 전형적인 연결기로는, 에터(-O-), 옥소(-C(O)-), 아미노(-NH-), 아미도(-N-C(O)-), 티오(-S-), 포스포(-P-), 에스터(-0-C(O)-)를 포함한다.
"작용화된"은, 물질에 특이적 잔기가 결합되도록(예를 들어, 물질 또는 기재가 특이적 잔기를 갖도록 변형됨) 상기 물질을 개질하는 공정을 지칭하고, 이렇게 변형된 물질(예를 들어, 분자 또는 지지체)은 작용화된 물질(예를 들어, 작용화된 분자 또는 작용화된 지지체)로서 지칭된다.
화학 구조, 기 또는 잔기를 기술하기 위해서 사용된 용어 "치환된"은, 하나 이상의 치환기를 포함하는 구조, 기 또는 잔기를 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우, 제1 기가 제2 기로 "치환된" 경우, 제2 기는 제1 기에 부착되어, 이로서 제1 기의 잔기(전형적으로 수소)가 제2 기로 대체된다.
"치환기"는, 화학 구조에서 다른 기를 대체하는 기를 지칭한다. 전형적인 치환기는 수소 이외의 원자(예를 들어, 할로겐), 작용기(예를 들어, 비제한적으로, 아미노, 설프하이드릴, 카보닐, 하이드록실, 알콕시, 카복실, 실릴, 실릴옥시, 포스페이트 등), 하이드로카빌 기, 및 하나 이상의 헤테로원자로 치환된 하이드로카빌 기를 포함한다. 예시적인 치환기는 알킬, 저급 알킬, 아릴, 아르알킬, 저급 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 티오, 머캅토, 아미노, 이미노, 할로, 시아노, 니트로, 니트로소, 아지드, 카복시, 설파이드, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 보론일 및 변형된 저급 알킬을 포함한다.
하이픈 또는 대시는 부착을 나타내기 위해 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 지점에서 사용되고, 예를 들어 2개의 명명된 기가 본문에서 대시에 바로 인접한 경우, 이는 2개의 명명된 기가 서로 연결되어 있음을 나타낸다. 유사하게, 명명된 기가 표시된 본문에서 각각의 명명된 기 사이에 대시가 있는 일련의 명명된 기는 제시된 순서대로 서로 부착되어 있음을 나타낸다. 또한, 본문에서 대시에 인접한 단일 명명된 기는 명명된 기가 전형적으로 명명되지 않은 일부 다른 기에 부착되어 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대시로 표시된 부착은, 예를 들어 인접한 명명된 기 사이의 공유 결합일 수 있다. 명세서 전반에 걸쳐 다양한 지점에서, 기는 인접한 대시를 포함하거나 포함하지 않고 본문에 제시될 수 있고(예컨대, 아미도 또는 아미도-, 추가로, 예를 들어 알킬 또는 알킬-, 더욱 추가로 Lnk, Lnk- 또는 -Lnk-), 이때 문맥은 기가 다른 기에 결합되도록 의도되었거나 결합될 가능성이 있음을 나타내고; 이러한 경우, 기의 아이덴티티(identity)는 기 명칭으로 표시된다(본문에 인접한 대시가 있는지 여부). 문맥이 나타내는 경우, 단일 기가 1개 초과의 다른 기에 부착될 수 있다(예컨대, 연결하는 기와 같이 연결기가 의도된 경우).
점선(dashed line)(예컨대, - - - - - - )은 명명되지 않은 일부 다른 기에 대한 부착을 나타내기 위해 명명된 기에 인접하게 명세서 전반에 걸쳐 사용된다.
"임의적인" 또는 "임의적으로"는 순차로 기술된 상황이 일어날 수도 일어나지 않을 수도 있음을 의미하는 것으로, 이는 위 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "임의적으로 치환된"이란 문구는, 비-수소 치환기가 있거나 없을 수도 있음을 의미하는 것으로, 따라서 이는 비-수소 치환기가 존재하는 구조 및 비-수소 치환기가 존재하지 않는 구조를 포함한다. 본원의 여러 곳에서, 모이어티는 0번 이상 존재하는 것으로 기술될 수 있고(즉, 이는, 상기 모이어티가 임의적이라는 것과 같음), 또한 상기 모이어티가 존재하는 실시양태 및 상기 모이어티가 존재하지 않는 실시양태를 포함한다. 상기 임의적인 모이어티가 존재하지 않는(구조 내에 0번 존재하는) 경우, 상기 임의적인 모이어티에 의해 연결되게 기재된 인접 기는 서로 직접적으로 연결된다. 유사하게, 모이어티는 (1) 2개의 인접 기를 연결하는 기, 또는 (2) 2개의 인접 기를 연결하는 결합으로 기술될 수 있고; 이것은 상기 모이어티가 임의적이라는 것과 같고, 또한 상기 모이어티가 존재하는 실시양태 및 상기 모이어티가 존재하지 않는 실시양태를 포함한다. 상기 임의적인 모이어티가 존재하지 않는(구조 내에 0번 존재하는) 경우, 상기 임의적인 모이어티에 의해 연결되게 기재된 인접 기는 서로 직접적으로 연결된다.
"결합된"은 본원에서 직접 또는 간접 부착을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 화학 구조의 맥락에서, "결합된"(또는 "결합되는")은 2개의 모이어티를 직접 결합시키거나 2개의 모이어티를 간접적으로 결합시키는(예를 들어, 연결하는 기 또는 분자의 임의의 다른 개재 부분을 통해) 화학 결합의 존재를 지칭할 수 있다. 상기 화학 결합은 공유 결합, 이온 결합, 배위 착물, 수소 결합, 반데르발스(van der Waals) 상호작용 또는 소수성 스태킹(stacking)일 수 있거나, 다중 유형의 화학 결합의 특성을 나타낼 수 있다. 특정 경우에, "결합된"은 부착이 직접적인 실시양태 및 또한 부착이 간접적인 실시양태를 포함한다. 자유로운 모이어티의 맥락에서 사용되는 "유리"는 모이어티가 일부인 용액의 다른 성분과 반응하거나 접촉하도록 모이어티가 이용가능함을 나타낸다.
용어 "평가"는 임의의 형태의 측정을 포함하고, 요소의 존재 여부를 결정하는 것을 포함한다. 용어 "결정", "측정", "사정", "평가" 및 "검정"은 상호교환적으로 사용되고, 정량적 및/또는 정성적 측정을 포함할 수 있다. 평가는 상대적이거나 절대적일 수 있다. "존재 평가"는 존재하는 것의 양의 결정 및/또는 존재 여부의 결정을 포함한다.
"단리된" 또는 "정제된"은 일반적으로, 성분(화합물, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 염색체 등)이 (용매를 제외한) 샘플의 상당 부분을 차지하도록 하는(이때, 상기 성분은 자연적 또는 비-단리된 상태에서 전형적으로 발견되는 것보다 더 많이 존재함) 상기 성분의 단리를 지칭한다. 전형적으로, 상기 샘플의 상당 부분은 (용매를 제외한) 상기 샘플의 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상을 차지한다. 예를 들어, 단리된 RNA 샘플은 전형적으로 전체 약 5% 이상의 RNA를 포함할 것이고, 이때 %는 (용매를 제외한) 상기 샘플에서의 총 RNA + 다른 성분들의 질량(예컨대, μg)의 합으로 나눈 상기 샘플에서의 총 RNA 질량(예컨대, μg)으로 본원에서 계산된다. 관심사인 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 정제 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 겔 전기영동, 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 유동 분급(flow sorting) 및 밀도에 따른 침강이 포함된다. 전형적인 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 성분은 단리된 형태로 존재하고, 더욱 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되기 전에 3개가 모두 단리된 형태로 수득되고; 더욱 전형적으로, 3개 모두는 본 발명의 방법에 사용하기 전에 단리된 형태로 수득된다.
용어 "소정"은 이의 아이덴티티가 이의 사용 전에 공지된 요소를 지칭한다. 예를 들어, "소정 서열"은 이의 아이덴티티가 상기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 사용 또는 합성 전에 공지된 서열이다. 요소는 명칭, 서열, 분자량, 이의 기능 또는 임의의 다른 속성 또는 식별자(identifier)에 의해 공지될 수 있다.
본원에 사용된 "업스트림"은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA 분자에 따른 5' 방향을 지칭한다. "다운스트림"은 폴리뉴클레오티드에 따른 3' 방향을 지칭한다. "3'-" 및 "5'-"는 당업계에 공지된 이의 통상적인 의미를 갖는다.
특정 실시양태의 상세한 설명
본 발명을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정 실시양태로 제한되지 않고, 물론 변할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범주가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이고, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에서 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재된 값, 및 언급된 해당 범위의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
특정 범위는 용어 "약"이 선행하는 수치 값과 함께 본원에 제시된다. 용어 "약"은 용어가 선행하는 정확한 숫자뿐만 아니라 용어가 선행하는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자에 대한 문자적 지원을 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 어떤 숫자가 구체적으로 언급된 숫자에 가깝거나 대략적인지 여부를 결정할 때, 가깝거나 근접한 언급되지 않은 숫자는 그것이 제시된 맥락에서 구체적으로 언급된 숫자와 실질적인 등가물을 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이하, 대표적인 예시 방법 및 물질이 기술된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태가 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의한다. 청구범위는 임의의 임의적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 추가로 주목한다. 이와 같이, 이러한 언급은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "오직", "단지" 등과 같은 배타적인 용어를 사용하기 위한 선행 근거 역할을 하기 위한 것이다.
일부 화학 구조를 그릴 때 통상적인 바와 같이, 일부 하이드리도 기는 명확성을 위해 도시된 구조에서 생략되었지만, 예를 들어, 도시된 구조에서 원자가 결합을 완전히 채우기 위해 필요한 경우, 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용을 읽을 때, 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 각각의 개별적인 실시양태는, 본 발명의 범주 또는 사상으로부터 벗어남이 없이, 임의의 다른 여러 실시양태의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호된 뉴클레오시드 단량체
상기 요약된 바와 같이, 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기를 갖는 단량체가 본원에 개시된다. 특정 실시양태에서, 엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호기는 말단 환형 탄화수소를 갖는 프로판오일이다.
실시양태는 하기 화학식 I로 기술된 뉴클레오시드 단량체를 포함한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 단량체는 하기 화학식 Ia로 기술된다:
[화학식 Ia]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 환형 탄화수소이다.
다른 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 단량체는 하기 화학식 Ib로 기술된다:
[화학식 Ib]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 환형 탄화수소이다.
각각의 상기 실시양태에서, 말단 환형 탄화수소는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일 또는 아릴일 수 있다. 특정 실시양태에서, 보호기는 사이클로알킬프로판오일 또는 아릴프로판오일이다. 특정 실시양태에서, 사이클로알킬프로판오일 또는 아릴프로판오일 모이어티의 알킬 또는 아릴 부분은 3 내지 10개의 탄소 원자, 또는 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 실시양태에서, 보호기는 사이클로펜틸프로판오일(cpp), 사이클로헥실프로판오일 또는 하이드로신나모일(hyn)이다. 다른 특정 실시양태에서, 보호기는 사이클로펜틸프로판오일(cpp)이다.
화학식 I, Ia 또는 Ib로 표시되는 화합물의 실시양태에서, R1 또는 R2는 각각 H, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로부터 선택된다. 전형적으로, 보호기는 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT)이고, 포스포르아미다이트 기는 2-시아노에틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트 또는 메틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트이다.
화학식 I, Ia 또는 Ib로 표시되는 화합물의 특정 실시양태에서, R3은 하이드록실-제거가능한 보호기이다. 제거가능한 보호기의 예는 O-티오카본 보호기이다. O-티오카본 보호기의 예는, 비제한적으로, 티오카본에이트, 티오노카본에이트 및 티오노카밤에이트를 포함한다. 이러한 화합물의 실시양태는 하기 구조의 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
물결 선은 뉴클레오티드의 2' 탄소 상의 산소에 대한 티오노카밤에이트 기의 부착 지점을 나타낸다. 특정 실시양태에서, O-티오카본 보호기는 TC이다:
화학식 I, Ia 또는 Ib의 화합물의 실시양태에서, Q로 표시되는 헤테로환형 염기는 자연적으로 발생하는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예컨대 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 또는 변형된 퓨린 및 피리미딘 염기, 및, 예컨대 본원에 인용된 바와 같은 통상적인 유사체로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Q는 G 및 C로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, Q는 G이다.
일부 실시양태에서, 헤테로사이클은 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린으로부터 선택된다.
엑소환형 아미노 헤테로사이클 보호된 뉴클레오시드 단량체의 합성
보호된 헤테로사이클 염기를 갖는 뉴클레오시드 단량체는 임의의 적절한 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 보호된 뉴클레오시드 단량체는 하기 화학식 II에 제시된 구조를 갖는 뉴클레오시드 단량체가, 화학식 I의 구조의 보호된 뉴클레오시드 단량체를 생성하기에 충분한 조건 하에 화학식 R4-C2H4CO-LG(이때, R4는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일 및 아릴로부터 선택되고, LG는 이탈기, 예컨대 할로 기임)를 갖는 화합물과 접촉되는, 프로토콜을 사용하여 생성된다:
[화학식 II]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소 및 보호기로부터 선택되고;
R3은 H, OH, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3이 O-보호기인 경우, R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있고;
Q는 헤테로환형 염기이다.
LG에 적합한 이탈기 또는 활성화기의 예는, 비제한적으로, 이미다졸, 클로로, p-니트로페녹시, 펜타플루오로 페녹시, O-석신이미딜, 트라이클로로메틸, 브로모 및 요오도를 포함한다.
본 발명의 N-3-(사이클로알킬)프로판오일 뉴클레오시드 유도체는 Jones 일시 실릴화 프로토콜[Organic Letters, 2004 Vol. 6 No. 15; 2555-2557]로부터 변형된 과정을 사용하여 제조되었다. 뉴클레오시드는 먼저 O6 및 N2-구아닌 위치(또는 N4-시토신 또는 N6-아데닌 위치) 및 리보스의 2', 3' 및 5' 하이드록실 위치 상에서 트라이메틸실릴 클로라이드로 일시적으로 실릴화되고, 제2 단계에서, 원하는 아실 클로라이드와 반응하여 뉴클레오시드의 헤테로사이클의 N-3-(사이클로알킬)프로판오일-보호된 각각의 아미노 위치를 수득한다(예를 들어, 화합물 1A, 1B, 1C에 도시됨).
특정 실시양태에서, 하기 설명된 바와 같이, 상응하는 포스포르아미다이트 단량체의 합성이, 합성 하의 조성물의 2'-OH 부위에 보호기를 국소화시키기 위한, 즉 위치선택성을 제공하기 위한 Markiewicz 1,1,3,3-테트라이소프로필다이실록산(TIPS) 시약을 사용하여 이어진다. 2'-하이드록실 보호기에 대한 위치특이적 도입은 5' 및 3'-하이드록실 기의 보호를 통해, 예컨대 하기 화학식 III의 구조에 제시된 Markiewicz 1,1,3,3-테트라이소프로필다이실릴옥산 보호기의 사용을 통해(Markiewicz W. T., J. Chem. Research (S), 1979, 24-25) 수행된다:
[화학식 III]
상기 식에서,
R4는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일 및 아릴로부터 선택된다.
일부 실시양태는 2'-티오노카밤에이트의 합성을 수반하고, 화학식 III의 3',5'-다이실록산 보호된 뉴클레오시드는 촉매량의 4-(다이메틸)아미노피리딘(DMAP)의 존재 하에 아세토니트릴 중 1,1'-티오카보닐다이이미다졸과 반응될 수 있다. 전술한 반응은 화학식 IV의 구조를 갖는 이미다졸 티오노카밤에이트로의 보호된 뉴클레오시드의 정량적인, 예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 99.9% 이상의 전환을 야기할 수 있고, 결정질 생성물을 제공할 수 있다:
[화학식 IV]
상기 식에서,
R4는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일 및 아릴로부터 선택된다.
화학식 IV의 화합물과 아세토니트릴 중 1.1 당량의 암모니아, 1차 또는 2차 아민(촉매량의 4-(다이메틸)아미노피리딘을 가짐)의 반응이 본원에 개시되고; 상기 반응은 2'-티오노카밤에이트 유도체로의 정량적인 또는 거의 정량적인 전환, 예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 전환을 야기한다. 아닐린 또는 다른 약한 친핵체의 경우, 1 당량의 4-(다이메틸)아미노피리딘(DMAP)은 상응하는 티오노카밤에이트 유도체로의 완전한 전환을 달성하는 데 사용될 수 있다. 입체적으로 강제된 약한 친핵체, 예컨대 다이시아노에틸아민의 경우, 상기 반응은 아세토니트릴 중에서의 환류 조건을 밤새 1 당량의 4-(다이메틸)아미노피리딘과 함께 사용할 수 있고, 생성된 생성물은 70% 수율로 단리될 수 있다. 화학식 V에 제시된 2'-O-(1,1-다이옥소-1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트) 뉴클레오시드(2'-O-TC 뉴클레오시드로 공지됨)를 합성하는 데 사용되는 티오모폴린 1,1-다이옥사이드의 경우, 아민의 첨가는 2'-이미다졸 티오노카밤에이트 중간체(화학식 IV)를 수득한 직후에 이의 단리 없이 수행될 수 있다:
[화학식 V]
상기 식에서,
R4는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일 및 아릴로부터 선택된다.
화학식 V의 2'-티오노카밤에이트 화합물의 실시양태는 하기 2'- 보호기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
물결 선은 뉴클레오시드의 2' 탄소 상의 산소에 대한 티오노카밤에이트 기의 부착 지점을 나타낸다.
5'(또는 3')-하이드록실의 보호, 및 이어서 3'(또는 5') 포스피틸화가 또한 본원에 개시된다. 3',5'-테트라이소프로필다이실록산-2'-티오노카밤에이트 보호된 뉴클레오시드(화학식 V)는 먼저 3',5'-테트라이소프로필다이실록산 보호기를 15 내지 40 당량의 HF/피리딘으로 제거하여 2'-티오노카밤에이트-리보뉴클레오시드 중간체를 생성함으로써, 3개의 추가 합성 단계에서 활성 RNA 합성 단량체로 전환될 수 있다. 이어서, 이러한 중간체는 5 내지 10 당량의 콜리딘 또는 N-메틸이미다졸(NMI)과 함께 4,4'-다이메톡시트라이틸 클로라이드(DMTrCl)와 반응하여 5'-O-다이메톡시트라이틸(DMT)-2'-티오노카밤에이트-리보뉴클레오시드 유도체를 생성할 수 있고; 이어서 상기 생성물은 포스피틸화제, 예컨대 클로로(다이이소프로필아미노)-2-시아노에톡시포스핀(NC-CH2-CH2-O-P(Cl)-N(iPr)2), 또는 비스(다이이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(NC-CH2-CH2-O-P-[N(iPr)2]2), 또는 클로로(다이이소프로필아미노)메톡시포스핀(CH3-O-P(Cl)-N(iPr)2), 또는 비스(다이이소프로필아미노)메톡시포스핀(CH3-O-P-[N(iPr)2]2)과 반응하여 화학식 VI의 5'-O-DMT-2'-티오노카밤에이트-리보뉴클레오시드-3'-O-메틸(- 또는 2-시아노에틸)(N,N 다이이소프로필)포스포르아미다이트 화합물을 생성할 수 있다:
[화학식 VI]
상기 식에서,
R4는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일 또는 아릴이고, R5는 2-시아노에틸 및 메틸로부터 선택된다.
5' → 3' 올리고뉴클레오티드 합성이 요구되는 일부 실시양태에서, 전술한 방법의 변형이 3'-O-DMT-2'-티오노카밤에이트-리보뉴클레오시드-5'-O-메틸(- 또는 2-시아노에틸)(N,N-다이이소프로필)포스포르아미다이트를 제조하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 하기 단계에 의해: a. TIPS에 의한 보호; b. 2'-티오노카밤에이트 형성; c. TIPS의 제거; d. 5'-OH의 포스피틸화; e. 3'-OH의 트라이틸화; 또는 a. TIPS에 의한 보호; b. 2'-티오노카밤에이트 형성; c. TIPS의 제거; d. TBDMS에 의한 5'-OH의 보호; e. 3'-OH의 트라이틸화; f. TBDMS의 제거; g. 5'-OH 포스피틸화).
2'-티오노카밤에이트 보호기를 갖는 단량체를 사용하는 핵산 합성
일부 실시양태에서, 올리고리보뉴클레오티드의 고체 상 합성은 DNA 합성과 동일한 사이클을 따른다. 고체 지지체, 전형적으로 부착된 뉴클레오시드를 갖는 Controlled Pore Glass(CPG)는 뉴클레오시드의 5'-하이드록실 상에서 보호기가 제거된다. 인커밍(incoming) 포스포르아미다이트는 활성화제의 존재 하에 성장하는 쇄에 커플링된다. 임의의 미반응된 5'-하이드록실은 캡핑되고, 이어서 커플링 반응에서 생성된 포스파이트 트라이에스터 뉴클레오티드간 연결기는 산화되어 원하는 포스페이트 트라이에스터 연결기를 제공한다. 이어서, 상기 방법은 원하는 길이의 올리고머가 생성될 때까지 반복된다. 사용된 실제 시약은 5'- 및 2'-보호기에 따라 변할 수 있다. 다른 부수적인 시약이 또한 상이하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 2'-티오노카밤에이트 뉴클레오티드 단량체는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산을 합성하는 데 사용될 수 있다. 합성은 3' → 5' 또는 5' → 3'의 방향으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 3' → 5' 방향으로, 5'-OH를 갖는 제1 뉴클레오시드 단량체는 활성화제의 존재 하에(예를 들어, 테트라졸 또는 S-에틸티오-테트라졸) 3'-포스포르아미다이트 및 5'-O-보호기를 갖는 뉴클레오티드 단량체(전형적으로 DMT)와 커플링된다. 제1 뉴클레오시드 단량체는 임의적으로 고체 지지체에, 예를 들어 3'-하이드록실 상의 석신이미딜 링커를 통해 결합된다. 다르게는, 합성은 용액 중에서 수행될 수 있다. 5'-OH 및 3'-포스포르아미다이트가 축합되어 포스파이트 트라이에스터 연결기를 형성하고 다이뉴클레오티드를 생성하는 커플링 단계 후에, 제1 뉴클레오시드 단량체의 미반응된 5'-하이드록실은 산화 전 및/또는 후에 임의적으로 아세트산 무수물 용액으로 캡핑될 수 있다. 산화 중에, 포스파이트 트라이에스터 연결기는 요오드를 함유하는 용액으로 산화되어 포스페이트 트라이에스터를 수득하거나, 포스포로티오에이트 연결기가 요구되는 경우, 황화제로 산화된다. 이어서, 5'-DMT 보호기는 무수 산 용액; 예를 들어, 메틸렌 클로라이드 중 3%의 트라이클로로아세트산(TCA) 또는 톨루엔 중 5 내지 10% 다이클로로아세트산(DCA)으로 제거(탈보호)된다. 이어서, 새로이 형성된 다이뉴클레오티드는 언제든지 3'-포스포르아미다이트 및 5'-DMT 보호기를 갖는 다른 뉴클레오티드 단량체와 커플링된다. 이러한 단계는 핵산이 원하는 길이 및/또는 서열에 도달할 때까지 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 VII의 구조에서와 같이 3'-H-포스폰에이트를 갖는 2'-티오노카밤에이트 뉴클레오티드 단량체가 사용되어 하나 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산을 합성할 수 있고; 이때 R1은 하이드록실 보호기이고, Q는 헤테로환형 염기이고, R3은 티오노카밤에이트 보호기이고, R4는 환형 탄화수소이다:
[화학식 VII]
예를 들어, 3' → 5' 방향으로, 5'-OH를 갖는 제1 뉴클레오시드 단량체는 활성화제(예를 들어, 아다만탄 카보닐 클로라이드)의 존재 하에 3'-H-포스폰에이트, 2'-O-보호기(전형적으로 TC) 및 5'-O-보호기(전형적으로 DMT)를 갖는 뉴클레오티드 단량체와 커플링된다. 제1 뉴클레오시드 단량체는, 예를 들어 3'-하이드록실 상의 석신이미딜 링커를 통해, 임의적으로 고체 지지체에 결합된다. 다르게는, 합성은 용액 중에서 수행될 수 있다. 5'-OH 및 3'-H-포스폰에이트가 축합되어 H-포스폰에이트 연결기를 형성하고 다이뉴클레오티드를 생성하는 커플링 단계 후, 제1 뉴클레오시드 단량체의 미반응된 5'-하이드록실 기는 캡핑제로 캡핑된다(예컨대, 비제한적으로, 아다만탄 카보닐 클로라이드의 존재 하의 이소프로필 포스파이트). 이어서, 5'-DMT 보호기는 무수 산 용액; 예를 들어, 메틸렌 클로라이드 중 3%의 트라이클로로아세트산(TCA), 또는 톨루엔 중 5 내지 10% 다이클로로아세트산(DCA)으로 제거(탈보호)된다. 이어서, 새로이 형성된 다이뉴클레오티드는 언제든지 3'-H-포스폰에이트, 2'-O-보호기 및 5'-O-DMT 보호기를 갖는 다른 뉴클레오티드 단량체와 커플링된다. 이러한 단계는 핵산이 원하는 길이 및/또는 서열에 도달할 때까지 반복될 수 있다. 이어서, 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함하는 완전히 보호된 올리고뉴클레오티드는 요오드 및 N-메틸모폴린을 포함하는 산화 용액과 반응되어 H-포스폰에이트 연결기를 모두 동시에 포스포다이에스터 연결기로 산화시키거나, 황화 시약을 포함하는 용액과 반응하여 포스포로티오에이트 연결기를 모두 동시에 생성한다.
일부 실시양태에서, 2'-하이드록실 상의 티오노카밤에이트 보호는, TC 화학반응의 용이함 및 효능 및 이러한 보호기의 제거의 용이함에 기인하여, RNA의 긴 서열의 합성을 가능하게 한다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에 의해 합성된 핵산은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 200 또는 500개 이상의 뉴클레오티드 길이만큼 길 수 있다. 또한, 일부 실시양태에 따라 합성된 핵산은 다른 핵산과 조합되어 더 긴 핵산을 형성할 수 있다. 예를 들어, 70개의 염기의 핵산은, 화학적 결찰, 또는 비-천연 뉴클레오티드간 연결기를 생성하는 다른 화학적 반응, 예를 들어 2개 이상의 핵산을 연결하거나 비-올리고뉴클레오티드 모이어티, 예를 들어 비제한적으로, 지질, 펩티드, 콜레스테롤, 비타민, PEG, 올리고뉴클레오티드에 대한 염료를 접합하기 위한 공지된 클릭(click) 화학반응 또는 스쿠아레이트(squarate) 화학반응의 사용에 의해, 70개 염기의 다른 핵산과 커플링될 수 있다. 다른 예로서, 2개의 핵산은 RNA 리가제와 결찰될 수 있고, 이때 2'-보호기는 결찰 전에 제거될 수 있다.
본원에 기술된 합성 방법은, 화학적 개체가 결합될 수 있는 표면을 갖는 고형 지지체 상에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 합성되는 복수개의 올리고뉴클레오티드가, 동일한 고형 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되어, 배열의 부분을 형성할 수 있다. "배열"은, 각각의 서열의 위치가 공지되도록, 공간적으로 정의되고 물리적으로 어드레싱가능(addressable)하게 각각 배열된 공지된 단량체성 서열의 개별적 분자들의 집합이다. 배열 상에 포함될 수 있는 분자 또는 "특징부"의 개수는 대개, 기재의 표면적, 특징부의 크기 및 특징부들 간의 간격으로 결정될 것이고, 이때 배열 표면은, 비-특징부 영역으로 나타내어지는 국부 배경 영역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 배열은 수십만 이상까지의 특징부/cm2, 예컨대 2,500 내지 200,000개의 특징부/cm2의 밀도를 가질 수 있다. 상기 특징부는 기재에 공유 결합되거나 공유 결합되지 않을 수 있다. 상호교환적으로 사용되는 "배열" 또는 "화학적 배열"은, 특정 화학적 모이어티(예를 들어, 리간드, 예를 들어 생고분자(biopolymer), 예컨대 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열(핵산), 폴리펩티드(예컨대, 단백질), 탄수화물, 지질 등)를 갖는 어드레싱가능한 영역들의 임의의 1차원, 2차원 또는 실질적으로 2차원(뿐만 아니라 3차원) 배열을 포함한다. 배열은, 배열 상의 특정한 소정 위치(즉, "어드레스(address)")에서의 영역(즉, 배열의 "특징부" 또는 "스팟" 또는 "웰")이 특정 표적 또는 표적의 부류를 감지하도록(그러나, 특징부는 상기 특징부의 비-표적을 부수적으로 감지할 수 있음), 상이한 모이어티들(예컨대, 상이한 폴리뉴클레오티드 서열)의 복수개의 영역을 포함하는 경우 "어드레싱가능하다". 배열 특징부는 전형적으로 개재 공간에 의해 분리되지만, 그렇지 않아도 된다. 배열의 경우에서, "표적"은, 다양한 영역에서 기재에 결합되는 프로브("표적 프로브")에 의해 검출되는, 이동 상(전형적으로, 유체) 중의 모이어티로서 언급될 것이다. 그러나, "표적" 또는 "프로브" 중 하나는, 나머지 하나에 의해 평가되는 것일 수 있다(따라서, 이들 중 하나는, 나머지 하나와 결합함으로서 평가되는 분석물(예컨대, 폴리뉴클레오티드)의 미공지 혼합물일 수 있음).
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드의 배열은 비드의 2 또는 3-차원 배열을 포함할 수 있다. 특정한 경우, 비드는 2개의 부분, 즉 표적에 결합하는 제1 부분 및 올리고뉴클레오티드를 식별하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제2 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 다른 경우, 비드는 올리고뉴클레오티드에 대한 광학적 어드레스를 제공함으로써, 결정될 올리고뉴클레오티드의 식별을 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 배열은 Illumina BeadChip과 같은 3-차원 멀티웰(multiwell) 배열의 형태일 수 있다. BeadChip 기술의 한 실시양태는 실리카 비드로의 올리고뉴클레오티드의 부착이다. 이어서, 비드는 기판(예컨대, 유리 슬라이드)의 웰에 무작위로 침착된다. 생성된 배열은 어떤 올리고뉴클레오티드-비드 조합이 어느 웰에 있는지 결정하기 위해 해독(decoding)된다. 해독된 배열은 유전자 발현 분석 및 유전자형 분석(genotyping)을 비롯한 다수의 적용례에 사용될 수 있다. 유전자 발현 분석은, 예를 들어 2개의 분절을 갖는 50 내지 200개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 한 단부에 있는 50 내지 150개의 염기 분절은 표지된 표적 서열에 혼성화하도록 고안될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 다른 단부는 어드레스 역할을 할 수 있다. 어드레스는 배열에 배치된 후 올리고뉴클레오티드를 명확하게 식별할 수 있는 고유한 서열이다. 비드 배열은, 예를 들어 1,000 내지 1,000,000개 이상의 독특한 올리고뉴클레오티드를 가질 수 있다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 표준 기술을 사용하여 대규모 배치로 합성될 수 있다. 이어서, 올리고뉴클레오티드는 실리카 비드, 예를 들어 1 내지 5 μm 비드의 표면에 부착될 수 있다. 각각의 비드는 한 가지 유형의 올리고뉴클레오티드만 부착되어 있을 수 있지만, 수십만 개의 올리고뉴클레오티드 카피(copy)가 있다. 표면(예를 들어, 유리 슬라이드) 상의 웰의 벌집 패턴을 생성하기 위해 표준 리소그래피(lithographic) 기술이 사용될 수 있다. 각각의 웰은 비드를 보유할 수 있다. 소정 배열에 대한 비드는 동등한 양으로 혼합되고 슬라이드 표면에 침착되어 무작위 분포로 웰을 차지할 수 있다. 각각의 비드는, 예를 들어 배열 내에서 약 20개의 인스턴스(instance)로 표시될 수 있다. 각각의 비드의 아이덴티티는 어드레스 서열을 사용하여 해독함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 독특한 배열 레이아웃 파일(array layout file)이 각각의 배열과 연관되고 배열을 스캔하는 동안 데이터를 해독하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 일부 방법의 효율성 및 용이성으로 인해, 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 합성을 소규모로 또는 대규모로 수행할 수 있다. 따라서, (하나의 용기 내에서) 특정 방법의 1회의 완전한 수행으로 제조된 올리고뉴클레오티드의 양은 1 μg 미만, 또는 수 μg, 수십 μg, 수백 μg, 또는 심지어 수 kg일 수 있다.
이와 같이, 본원에 기술된 일부 실시양태는 비보호된 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오티드 잔기 또는 뉴클레오시드 단량체; 및 2'-티오노카밤에이트 보호기를 갖는 뉴클레오티드 단량체를 제공하는 단계; 및 뉴클레오티드 잔기 또는 뉴클레오시드 단량체를 2'-티오노카밤에이트 보호된 뉴클레오티드 단량체와 2'-티오노카밤에이트 보호된 뉴클레오티드 단량체를 상기 뉴클레오티드 잔기 또는 뉴클레오시드 단량체에 공유 결합하기에 충분한 조건 하에 접촉시켜 핵산을 생성하는 단계를 포함하는, 핵산을 합성하는 방법을 포함한다. 본원의 일부 실시양태는 합성 프로토콜의 단일 단량체 첨가 단계를 기술하고, 이때 상기 방법은 원하는 길이 및 서열의 중합체를 생성하기 위해 요구되는 추가 단량체로 반복될 수 있다. 임의적인 캡핑 단계는, 예를 들어, 산화 단계 전 및/또는 후에 수행될 수 있고, 이때 제1 뉴클레오티드 잔기 또는 뉴클레오시드 단량체의 미반응된 하이드록실이, 예를 들어 아세트산 무수물 용액에 의해 캡핑될 수 있다. 이러한 추가 단량체는 2'-티오노카밤에이트 보호된 단량체 또는 보호된 2'-데옥시-단량체 또는 비-천연 보호된 단량체, 즉 변형된 단량체(예를 들어, 2'-플루오로 2'-O-메틸, 2'-메틸옥시에틸(2'-MOE), 2'-잠금(Locked) 핵산(2'-LNA) 등; 이때, 변형은 변형된 뉴클레오티드의 정의에 기술된 바와 같이, 염기를 비롯한 뉴클레오티드 구조 상의 임의의 위치일 수 있음)일 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 이러한 혼입은 다양한 변형된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
RNA 탈보호
RNA는 유기 용매 중 아민을 사용하여 2'-탈보호될 수 있다. RNA의 분해를 위한 염기 촉매화된 기전은 환화 및 절단 반응이 유의한 속도로 발생할 수 있도록 하는 충분한 정도로 하이드록실을 탈양성자화시키는 염기의 능력에 의존한다. 사용될 수 있는 아민의 예는 에틸렌 다이아민(EDA)이다.
RNA를 유기 용매 중 아민 염기의 용액에 노출시키는 것은 엑소환형 아민 보호기 및 2'-하이드록실 보호기 둘 다의 RNA의 탈보호를 수행할 수 있다. 엑소환형 아민 및 2'-하이드록실의 탈보호는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 아민 및 하이드록실의 바람직한 pKa 차이를 유의하게 변화시키기에 충분한 물을 상기 용액이 함유하지 않는 한, 보호기의 적절한 선택에 의해, RNA의 분해는 탈보호의 속도에 비해 매우 느릴 것이다. EDA를 비롯한 아민 염기에 대한 RNA의 노출은 또한 인 모이어티 상의 2-시아노에틸 기의 탈보호 및 RNA를 고체 지지체에 부착하는 석신이미딜 링커의 절단, 및 이에 따라 고체 지지체로부터의 RNA의 방출을 수행할 수 있다.
다른 실시양태에서, 적절한 유기 용매 또는 기체 상에서 아민 염기의 용액을 전달하는 것에 대한 중요한 이점은 RNA를 고체 지지체의 표면에 공유 부착시키는 링커가 암모니아와 같은 염기에 의해 절단될 수 있지만, RNA 자체는 수지에서 이동하지 않는다는 점이다. 많은 유기 용매, 예를 들어 이소프로판올 및 아세토니트릴에서, RNA는 눈에 띄게 가용성이 아니고/거나 고체 지지체에 흡착되거나 연관된 상태로 남을 것이다. 이는 물 또는 DMSO 중 아민 용액으로 고체 지지체를 처리하여, 링커를 절단하고 이어서 RNA를 물 또는 DMSO 용액으로 용해시키는 것과는 대조적이다.
한 실시양태에서, 티오노카본에이트 및 티오노카밤에이트는 원하는 RNA의 파괴를 초래하지 않는 아민에 의해 합성 RNA의 2'-하이드록실로부터 절단될 수 있다.
1,2-다이아미노 화합물과의 반응
예컨대, 에틸렌 다이아민(EDA)과 같은 1,2-다이아미노 작용기를 함유하는 화합물은 2'-O-(1,1-다이옥소-1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트) 보호된 RNA와 반응하여 원하는 완전히 탈보호된 생성물(하기)을 제공한다:
예를 들어, 100mer RNA 올리고머는 화학식 VI에 따른 하이드로신나모일 모이어티에 의해 N2 엑소환형 아미노 기 상에서 보호된 riboG 단량체(rG(hyn))를 사용하여 합성되었고, 이때 R4는 페닐이고, Q는 구아닌이고, R3은 티오모폴린-4-카보티오에이트(TC 기), 보호기이다. RNA 올리고머의 탈보호에 대한 시간-처리(time-course)는 실온에서 1,2-에틸렌 다이아민(EDA) 처리에 의해 실행되어 탈보호 특징을 결정한다. 시점(time point)을 5시간까지 15분마다 취하였다.
어떠한 검출가능한 하이드로신나모일 구아닌 보호된 올리고도 질량 스펙트럼에 의해 관찰되지 않았다. 따라서, 하이드로신나모일이 적절히 불안정함을 나타낸다. 또한, 어떠한 이상한 불순물도 관찰되지 않았고, 이는 하이드로신나모일이 올리고 합성 동안 안정하게 보호함을 나타낸다. TC 기의 탈보호는 1.75시간에서 완료되었고, rU 탈피리미딘화는 이소부티릴 탈보호 요건에 비해 50% 초과만큼 감소되었다. 100mer rG(hcin)-RNA에 대한 시간적 처리의 결과는 도 1에 제시된다. 실험은 40℃에서 반복되었고, 탈보호가 고온에서 절반으로 유사하게 절단될 수 있음을 나타낸다. 고온에서의 시간적 처리의 결과는 도 2에 제시되고, rG(ibu)에 의해 제조된 대조군 100mer RNA와 비교된다.
혼합된 서열 RNA(20개 뉴클레오티드 및 100개 뉴클레오티드 길이)의 화학적 합성은 고체 지지체, 제어된 공극 유리 상에서 문헌[Dellinger, et. al. J. Am. Chem. Soc . 2011, 133, 30, 11540-11556]에 기술된 방법을 사용하여 달성되었다. 각각의 RNA 100mer는 4개의 표준 2'-TC RNA 단량체(N2-이소부티릴 rG(ibu), N6-벤조일 아데노신(rA(bz)), 우리딘 잔기(rU) 및 N4-아세틸 시티딘(rC(ac))), 또는 3개의 표준 2'-TC RNA 단량체 rA(bz), rC(ac), rU, 및 본원에 개시된 비-표준 2'-TC rG 포스포르아미다이트(화학식 VI), 즉 N2-하이드로신나모일 rG(rG(hyn)으로 약칭됨), 또는 N2-[3-(사이클로펜틸)프로판오일] rG(rG(cpp))를 함유하였다. 이어서, 다양한 합성된 RNA는 탈보호되고, 에틸렌 다이아민 또는 혼합물을 생성된 고체 지지체에 직접 첨가하고, 상이한 시간(30분 내지 6시간) 동안 유지함으로써, 유기 용매(예컨대, 톨루엔) 중에서 순수한 에틸렌 다이아민 또는 에틸렌 다이아민의 혼합물(80 내지 90%)을 사용하여 20℃(실온) 또는 더 높은 온도(30 내지 50℃)의 상이한 조건에서 절단된다. 에틸렌 다이아민을 제어된 공극 유리로부터 무수 아세토니트릴에 의해 세척하고, 이어서 0.1 M 나트륨 아세테이트 용액, pH 7.0을 10% 아세토니트릴과 함께 사용하여 조질 RNA 생성물을 용리함으로써, 반응이 중단된다. RNA 생성물은 Agilent 6545 4중극 비행시간계측식(time-of-flight) 액체 크로마토그램, 질량 분광계를 사용하여 분석되었다. 시간적 처리 및 비교 연구를 수행하여 다양한 조건 하에 상이한 RNA 생성물의 탈보호의 완료를 평가하고 이의 불순물 프로파일을 비교하였다. N2-엑소환형 아미노 구아노신 잔기로부터의 각각의 보호기의 제거의 속도는 부분적으로 탈보호된 올리고뉴클레오티드의 추출된 질량 스펙트럼을 검사함으로써 평가되었고, 예측된 반감기 시간(T1/2)으로서 보고되었다(도 3 및 4). 상이한 N2-보호된 rG 2'-TC 단량체로 합성된 다양한 RNA의 생성물의 탈보호의 비교는, rG(hyn) 및 rG(cpp) 둘 다가 표준 rG(ibu) 단량체를 사용할 때의 2.5시간으로부터 비-표준 2'-TC rG 단량체 rG(cpp)를 사용할 때의 75분 시간까지 100-mer RNA의 완전한 탈보호 시간을 유의하게 단축시켰음을 나타낸다. 또한, 신규한 rG(cpp) 단량체로 합성된 100-mer RNA 올리고뉴클레오티드에 대해 수득된 더 짧은 탈보호 시간은, 쇼트머 단편 불순물의 양을 유의하게 감소시켜 도 5에 도시된 바와 같은 전장 생성물의 유의하게 더 높은 백분율을 생성한다. 추가적으로, 비-표준 단량체 rG(cpp)에 의해 제조된 RNA 생성물의 크로마토그램 상에 나타난 불순물 프로파일은 표준 rG(ibu) RNA 생성물에 의해 수득된 불순물 프로파일과 비교되는 탈피리미딘화 부산물의 50% 이하의 감소를 나타낸다(도 6).
핵산 생성물
상기 개시된 방법의 핵산 생성물이 또한 개시된다. 핵산 생성물, 예컨대 리보뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 또는 RNA는, 특정 실시양태에서 2 내지 200개 이상의 단량체 단위 길이, 예컨대 2 내지 100개 이상의 단량체 단위 길이, 예컨대 2 내지 50개 이상의 단량체 단위 길이의 범위로 크기가 변할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생성물 핵산의 크기는 2 내지 25개의 단량체 단위 길이, 예를 들어, 15 내지 25개의 단량체 단위 길이, 예컨대 17 내지 23개의 단량체 단위 길이, 예컨대 19, 20, 21 또는 22개의 단량체 단위 길이의 범위이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 생성물은 하기 화학식 VIII의 구조를 갖는다:
[화학식 VIII]
상기 식에서,
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 또는 O-티오카본 보호기이고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이고;
R5는 수소, 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m은 1 이상의 정수이다.
각각의 R3, Q 및 R4는 독립적으로 화학식 I의 구조를 갖는 화합물에 대하여 전술한 임의의 변이일 수 있다. R5는 전형적으로 2-시아노에틸 또는 메틸 기이다.
비록 바람직한 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 구체적으로 기술되지 않은 첨가, 삭제, 변형 및 치환이 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 수행될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예
N
2
-(3-사이클로알킬)프로판오일-구아노신 유도체(1A, 1B, 1C)의 합성:
하기 유도체를 합성하기 위하여, N2-[(3-사이클로펜틸)프로판오일]-구아노신(1A), N2-[(3-사이클로헥실)프로판오일]-구아노신(1B), N2-[하이드로신나모일-구아노신(1C), 하기 아실 클로라이드 시약 3-(사이클로펜틸)프로판오일 클로라이드(A), 3-(사이클로헥실)프로판오일 클로라이드(B) 및 하이드로신나모일 클로라이드(C)를 하기 상술된 반응에 각각 사용하였다.
구아노신 수화물(1.5 g, 5 mmol)을 500 mL 환저 플라스크에 위치시키고, 25 mL 분획의 무수 피리딘을 사용하는 공비 증발(azeotropic evaporation)에 의해 3회 건조하였다. 잔여물을 25 mL 무수 피리딘 및 무수 다이클로로메탄(100 mL)에 아르곤 대기 하에 재현탁하였다. 혼합물을 빙욕/수욕에서 냉각시키고, 자기 교반 막대를 사용하여 교반하였다. 트라이메틸실릴 클로라이드(TMSCl, 5.7 mL, 45 mmol, 9 당량)를 2분에 걸쳐 적가하였다. 플라스크를 빙욕으로부터 제거하고, 실온까지 가온하고, 이어서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, 뉴클레오시드를 완전히 용해시켜 투명한 무색 액체를 생성하였다. 플라스크를 빙/수욕에 다시 냉각하고, 상응하는 아실 클로라이드(A,B,C)(5.5 mmol, 1.1 당량)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 과량의 산 클로라이드는 메탄올(20 mL)의 첨가에 의해 중화시키고, 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 메탄올 및 다이클로로메탄을 진공 하에 회전 증발기 상에서 제거하여, 피리딘 중 점성 오일로서 잔여물을 남겼다. 200 mL의 물을 상기 용액에 첨가하고, 플라스크에 Fredrick 환류 축합기 및 가열 맨틀을 피팅(fitting)하였다. 반응 혼합물을 가열 환류하고, 1시간 동안 환류하였다. 가열 맨틀을 제거하고, 용액을 실온까지 냉각하여 백색 침전물을 생성하였다. 침전물을 여과하고, 진공 하에 건조하여 응집체 백색 분말을 수득하였다. 각각의 경우에, 분말을 1H NMR, 13C NMR 및 질량 분광법에 의해 분석하여, 원하는 N2-(3-사이클로알킬)프로판오일 보호된 구아노신 유도체(1A, 1B, 1C)의 거의 정량적인 수율을 수득하였다.
3',5'-테트라이소프로필다이실록산-N
2
-(3-사이클로알킬)프로판오일-구아노신 유도체(2A, 2B, 2C)의 합성
하기 기술된 일반적인 실험적 프로토콜에 따라 화합물 1A, 1B, 1C를 출발 물질로서 각각 사용하여 하기 생성물 N2-(3-사이클로펜틸)프로판오일-3',5'-테트라이소프로필다이실록산 구아노신(2A), N2-(3-사이클로헥실)프로판오일-3',5'-테트라이소프로필다이실록산-구아노신(2B), N2-하이드로신나모일-3',5'-테트라이소프로필다이실록산 구아노신(2C)을 합성하였다.
200 mL의 무수 피리딘으로 회전 증발기를 사용하여 N2-보호된-구아노신 16.1 g(39.5 mmol)(1 당량)을 공비 증발에 의해 3회 건조하였다. 이어서, 생성된 백색 분말을 400 mL의 무수 피리딘에 용해시키고, 빙/수욕을 사용하여 0℃까지 냉각하였다. 이러한 냉각된 용액에 1,3-다이클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필-다이실록산 12.6 mL(39.5 mmol)(1 당량)를 교반 하에 적가하였다. 첨가를 완료한 후, 빙욕을 제거하고, 반응 생성물을 실온까지 가온하였다. 반응의 정도를 TLC(메틸렌 클로라이드 중 5% 메탄올)에 의해 모니터링하였다. 모든 경우에, 2시간 후, TLC는 모든 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 회전 증발기 상에서 오일로 증발시켰다. 잔여 피리딘을 200 mL의 무수 톨루엔으로 3회 공비 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 다이클로로메탄(400 mL)에 용해시키고, 분별 깔대기로 옮겼다. 다이클로로메탄 용액을 나트륨 바이카본에이트의 300 mL의 포화 용액 및 이어서 300 mL의 물로 추출하고, 이어서 다이클로로메탄을 염수로 추출하였다. 메틸렌 클로라이드 층을 분리하고, 무수 나트륨 설페이트 상에서 건조하였다. 메틸렌 클로라이드를 회전 증발기 상에서의 증발에 의해 제거하고, 잔여물을 가열하면서 용해시켜 무수 아세토니트릴 중에서 환류하였다. 생성물을 실온까지 냉각하고, 이어서 -20℃에서 밤새 냉동기에 위치시켜, 백색 결정질 고체를 형성하였고, 여과에 의해 단리하고, 진공 하에 건조하여, 66 내지 88%의 수율을 수득하였다. 각각의 경우에, 결정화된 생성물을 1H NMR, 13C NMR 및 질량 분광법에 의해 분석하여 고 순도의 N2-보호된-3',5'-테트라이소프로필-다이실록산 구아노신(2A, 2B, 2C) 생성물을 수득하였다.
3',5'-O-(테트라이소프로필다이실록산-1,3-다이일)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트) N
2
-
[3-(사이클로알킬)프로판오일]-구아노신 화합물(3A, 3B, 3C)의 합성
하기 기술된 일반적인 실험 프로토콜에 따라 각각의 화합물 2A, 2B, 2C를 출발 물질로서 사용하여 하기 생성물 N2-[3-(사이클로펜틸)프로판오일]-2'-O-TC 구아노신(3A), N2-[3-(사이클로헥실)프로판오일]-2'-O-TC 구아노신(3B), N2-하이드로신나모일-2'-O-TC 구아노신(3C)을 합성하였다.
N2-보호된-3',5'-테트라이소프로필다이실록산-구아노신(100 mmol)을 DCM(200 mL, 0.5 M)에 용해시키고, 1,1'-티오카보닐다이이미다졸(1.05 당량, 18.7 g, 105 mmol)을 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴(100 mL) 및 티오모폴린-1,1-다이옥사이드(14.87 g, 110 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 용액이 투명해질 때까지 약 50℃까지 가열하고, 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 생성된 생성물을 반응 혼합물로부터 결정화시켰다. 결정을 여과에 의해 수집하고, 이어서 아세토니트릴로부터 재결정화시켰다. 각각의 경우에, 결정화된 생성물을 1H NMR, 13C NMR 및 질량 분광법에 의해 분석하여, 고 순도 3',5'-O-(테트라이소프로필다이실록산-1,3-다이일)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-보호된-구아노신 유도체(3A, 3B, 3C)를 수득하였다.
3',5'-O-(테트라이소프로필다이실록산-1,3-다이일) 보호기(화합물 4A, 4B, 4C)의 제거
상기 수득된 3',5'-O-(테트라이소프로필다이실록산-1,3-다이일)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-(3-사이클로알킬)프로판오일-구아노신 화합물(3A, 3B, 3C)을 각각 HF/피리딘으로 처리하여 TIPS 보호기를 제거하고, 2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-[3-(사이클로펜틸)프로판오일] 구아노신(4A), 2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-[3-(사이클로헥실)프로판오일] 구아노신(4B) 및 2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-하이드로신나모일 구아노신(4C)을 하기 일반적인 과정에 따라 각각 수득하였다.
3',5'-O-(테트라이소프로필다이실록산-1,3-다이일)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-보호된-구아노신(100 mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란(2-MTHF)(300 mL, 0.33 M) 및 피리딘(48.65 mL, 604 mmol)에 현탁하였다. 반응 생성물을 0℃까지 냉각하고, 수소 플루오라이드 피리딘(HFxPy)(31.37 mL, 1,208 mmol)을 교반 하에 첨가하였다. HF 용액을 첨가한 후, 빙욕을 제거하고, 반응 생성물을 실온까지 가온하였다. 반응 용액을 상온에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 추가 2-MTHF(200 mL)를 첨가하고, 상기 용액을 물(350 mL)로 추출하였다. 수성 층을 2-MTHF(2 x 250 mL)로 역 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 증발시키고, 실온에서 진공 펌프 상에서 여과하고, 모든 경우에 약 70%의 수율을 수득하였다.
5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ
6
-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N
2
-[3-(사이클로알킬)프로판오일]-구아노신 유도체(5A, 5B, 5C)의 합성
화합물 5A, 5B, 5C를 이들의 각각의 전구체 4A, 4B 및 4C로부터 출발하여 하기 기술된 일반적인 절차에 따라 합성하였다. 2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-보호된-구아노신(4A, 4B, 4C, 70 mmol)을 2-MTHF/DCM(1,400 mL, 0.05 M)에 현탁하고, 30분 동안 교반하고, 이어서 N-메틸 모폴린(NMM)(8.47 mL, 77 mmol) 및 4,4'-다이메톡시트라이틸 클로라이드(26.09 g, 77 mmol)를 교반하면서 작은 분획으로 첨가하였다. 반응을 40분 내에 완료시켰다. 이어서, 생성물(5A, 5B, 5C)을, 단리 없이, 직접적으로 포스피틸화시켜 하기 기술된 바와 같이 2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)-N2-보호된-구아노신-3'-O-(β-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필-포스포르아미다이트를 생성하였다.
5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ
6
-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N
2
-[3-(사이클로알킬)프로판오일]-구아노신 3'-O-(2-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필-포스포르아미다이트 유도체(6A, 6B, 6C)의 합성
N-메틸모폴린(10 mL, 91 mmol)을 화합물 5A, 5B 또는 5C를 함유하는 종래 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 2-시아노에틸 N,N-다이이소프로필클로로포스포르아미다이트(18.74 mL, 84 mmol)를 첨가하고, 이어서 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. DCM(150 mL)을 첨가하고, 혼합물을 포화 NaHCO3(500 mL)으로 추출하였다. 유기 상을 무수 나트륨 설페이트 상에서 건조하고, 이어서 회전 증발기 상에서 증발시켜 점성 오일을 생성하였다. 오일은 최소 부피의 다이클로로메탄에 용해시키고, 헥산(400 mL)을 함유하는 2-L Kjeldahl 플라스크에 교반 하에 적가하여 응집성(flocculent) 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 -20℃ 냉동기에 밤새 위치시켜 플라스크의 바닥 상에 케이크로 침강시켰다. 용매를 경사분리하고, 조질 생성물을 무수 DCM에 즉시 용해시키고, 트라이에틸아민(300 g 실리카 겔)으로 사전-중화된 실리카 겔 컬럼에 로딩하였다. 이어서, 조질 생성물을 컬럼의 상부 상에 조심스럽게 도입하고, 아세톤; 20%(1 L), 25%(2 L), 30%(2 L), 40%(4 L) 및 45%(2 L) 아세톤/헥산으로 용리하였다. TLC 또는 HPLC를 사용하여 생성물 분획을 분석하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 회전 증발기 상에서 증발 건조하여 65 내지 75%의 전체 수율을 갖는 백색 포말을 생성하였다. 1H NMR, 13C NMR 및 질량 분광법에 의해 생성물을 분석하고, 순도는 31P NMR 및 HPLC를 사용하여 측정하였다. 모든 생성물 5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)- 2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-[3-(사이클로펜틸)프로판오일]-구아노신 3'-O-(2-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필-포스포르아미다이트(6A, rG(cpp)), 5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-[3-(사이클로헥실)프로판오일]-구아노신 3'-O-(2-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필-포스포르아미다이트(6B), 5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)-2'-O-(1,1-다이옥소1λ6-티오모폴린-4-카보티오에이트)-N2-하이드로신나모일-구아노신 3'-O-(2-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필-포스포르아미다이트(6C, rG(hyn))는 두 방법에 의해 95% 이상의 순도를 제공하였다.
올리고뉴클레오티드 합성 AND 탈보호
20-mer RNA 올리고뉴클레오티드 및 100-mer RNA 올리고뉴클레오티드는 Biolytic Lab Performance Inc로부터 Dr. Oligo 48 합성기를 사용하여 Prime Synthesis(LGC)로부터의 2000A CPG 지지체 상에서 TC Chemistry를 사용하여 합성하였다. 표준 2'-TC RNA 포스포르아미다이트(rA(bz), rG(ib), rC(ac) 및 rU)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. rG(cpp) 2'-O-TC-3'-O-[(2-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필]포스포르아미다이트(화합물 6A) 및 rG(hcin) 2'-O-TC-3'-O-[(2-시아노에틸)-N,N-다이이소프로필]포스포르아미다이트(6C)를 본원에 기술된 바와 같이 합성하였다. 모든 다른 표준 RNA 합성 시약을 Glen Research and Honeywell로부터 구입하였다. 혼합된 서열 RNA(20 및 100개 뉴클레오티드 길이)의 화학적 합성은 문헌[Dellinger, et. al. J. Am. Chem. Soc . 2011, 133, 30, 11540-11556]에 기술된 방법을 사용하여 달성되었다. 각각의 RNA(20 및 100mer)는 4개의 RNA 단량체 구아노신 잔기, 아데노신 잔기, 우리딘 잔기 및 시티딘 잔기를 함유하였고, 에틸렌 다이아민을 생성된 고체 지지체에 직접 첨가함으로써, 순수한 에틸렌 다이아민을 사용하는 20℃(실온) 또는 더 높은 온도(30 내지 50℃)에서의 상이한 조건에서 탈보호되었다. 시간적 처리(30분 내지 6시간 초과)를 수행하여 N2-엑소환형 아민 탈보호의 완료를 평가하였다. 제어된 공극 유리로부터의 에틸렌 다이아민을 무수 아세토니트릴로 세척함으로써 반응을 중단시키고, 이어서 조질 RNA 생성물은 0.1 M 나트륨 아세테이트 용액(pH 7.0)을 10% 아세토니트릴과 함께 사용하여 용리하였다. Agilent 6545 4중극 비행시간계측식 액체 크로마토그램, 질량 분석계를 사용하여 RNA 생성물을 분석하였다. RNA 생성물의 탈보호에 사용된 시간적 처리 및 다양한 조건을 수행하여 rG(ibu), rG(cpp) 및 rG(hyn)로 제조된 RNA 생성물의 탈보호의 용이함, 완료를 비교하고 이의 불순물 프로파일을 비교하였다.
Claims (20)
- 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물:
[화학식 I]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이다. - 제1항에 있어서,
하기 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물:
[화학식 Ia]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 환형 탄화수소이다. - 제2항에 있어서,
환형 탄화수소가 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는, 화합물. - 제3항에 있어서,
환형 탄화수소가 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 및 R2가 각각 독립적으로 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT) 및 2-시아노에틸-(N,N-다이이소프로필아미노)-포스포르아미다이트로부터 선택되는, 화합물. - 제4항에 있어서,
환형 탄화수소가 사이클로펜틸이고, R3이 O-TC인, 화합물:
O-TC. - 제1항에 있어서,
하기 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물:
[화학식 Ib]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 환형 탄화수소이다. - 제6항에 있어서,
환형 탄화수소가 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는, 화합물. - 제7항에 있어서,
환형 탄화수소가 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1 및 R2가 각각 독립적으로 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT) 및 2-시아노에틸-(N,N-다이이소프로필아미노)-포스포르아미다이트로부터 선택되는, 화합물. - 제8항에 있어서,
환형 탄화수소가 사이클로펜틸이고, R3이 O-TC인, 화합물:
O-TC.
- 5'(또는 3') 비보호된 하이드록실을 포함하는 뉴클레오시드 잔기를 하기 화학식 I의 구조를 갖는 보호된 뉴클레오티드 단량체와, 보호된 뉴클레오티드 단량체의 포스포르아미다이트 기를 상기 뉴클레오시드 잔기의 상기 비보호된 하이드록실 기에 공유 결합하고 뉴클레오티드간 결합을 생성하기에 충분한 조건 하에, 접촉시키는 단계
를 포함하는 방법:
[화학식 I]
상기 식에서,
각각의 R1 또는 R2는 독립적으로 보호기 및 포스포르아미다이트 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 또는 O-티오카본(thiocarbon) 보호기이고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이다. - 제10항에 있어서,
뉴클레오티드간 결합을 산화제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제10항에 있어서,
O-티오카본 보호기를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제10항에 있어서,
뉴클레오시드 잔기가 고체 지지체에 공유 결합되는, 방법. - 제13항에 있어서,
핵산을 고체 지지체로부터 절단(cleaving)하여 유리 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제10항에 있어서,
O-티오카본 보호기가 하기 구조들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
.
- 제15항에 있어서,
O-티오카본 보호기가이고, 각각의 R1 또는 R2가 독립적으로 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT) 및 2-시아노에틸-(N,N-다이이소프로필아민)-포스포르아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제16항에 있어서,
Q가 G 또는 C이고, 환형 탄화수소가 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제17항에 있어서,
Q가 G이고, 환형 탄화수소가 사이클로펜틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 하기 화학식 VIII의 구조를 포함하는 보호된 핵산:
[화학식 VIII]
상기 식에서,
R3은 H, F, O-C1-6 알킬, O-MOE 및 하이드록실-제거가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 헤테로환형 염기이고;
R4는 환형 탄화수소이고;
R5는 수소, 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m은 1 이상의 정수이다. - 제19항에 있어서,
Q가 G이고, 하이드록실-제거가능한 보호기가이고, R4가 사이클로펜틸이고, R5가 2-시아노에틸 또는 메틸인, 보호된 핵산.
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