KR20020079755A - 감염 치료를 위하여 감독된 미생물 - Google Patents

Abstract

이중 돌연변이 살모넬라 미생물은 면역 반응을 유도하는 미생물의 효과를 유지하면서 미생물의 반응성을 예방하는 것을 돕는다. 다양한 돌연변이의 특정 조합은 유익하다.

Description

감염 치료를 위하여 감독된 미생물{ATTENUATED MICROORGANISMS FOR THE TREATMENT OF INFECTION}

살아 있는 감독된 미생물이 매우 효과적인 백신이라는 것은 충분히 입증되어 있다; 이러한 백신에 의해 유도된 면역 반응은 비-복제 면역원에 의해 생성된 것들보다 종종 더욱 강하고 지속 기간이 길어진다. 이것에 관한 하나의 설명으로 살아 있는 감독된 균주는 숙주에 제한된 감염 및 자연 감염의 초기 단계에서의 모방자로 성립할 수 있다. 더구나, 죽어 있는 조제물과 다르게, 살아 있는 백신은 마크로파지와 같이, 항원-발현 세포에서 복제할 수 있는 능력과 연결될 수 있는 유력한 세포-중재 반응을 유도할 수 있다.

동물 및 사람에게서 살모넬라증의 예방을 위한 안전하고 효과적인 백신으로서 살아 있는 감독된 살모넬라 백신의 이용에 관한 역사는 오래되었다. 실제로, 살아 있는 감독된 경구용 장티푸스 백신, Ty21a(Vivotif, Swiss Serum Vaccine Institute사 제품)은 장티푸스의 예방을 위한 매우 성공적인 백신임이 증명되었고, 미국과 유럽을 포함한 많은 국가에서 인가를 받았다.

하지만, 화학적 돌연변이 기술을 이용하여 이 균주의 감독화를 이루었고 이 균주의 감독화의 원리를 완전히 이해하지는 못한다. 이러한 이유때문에, 백신은 1회 투여량의 개수(일반적으로 4개) 및 1회 투여량마다에서 주어져야만 하는 살아 있는 유기체의 수의 관점에서는 이상적이지 않다.

살모넬라 병인에 관한 증가된 지식과 연관된 현대 분자생물학 기술은 여러 유전자가 생체내에서 유기체의 성장 및 생존을 위하여 필수적인 몇몇 유전자의 동정을 이끌어 내었다. 이것은 독성을 포함하는 것으로 알려진 선택된 유전자에 규정된 비-복귀 돌연변이체를 도입하는 것에 의해 '합리적으로' 감독될 수 있는 미래의 백신 균주의 개념를 이끄는, 감독화를 위한 새로운 유전자 표적을 제공한다. 이것은 특히, 면역원성 및 그것에 의한 주어지는 1회 투여량의 개수의 관점에서, 향상된 백신의 개발을 촉진할 것이다.

살모넬라의 많은 감독된 균주가 현재까지 알려져 있더라도, 사람에게 이용가능한 잠재성있는 백신 후보물질로서의 자격을 가진 것은 거의 없다. 이것은 활성화될 수 있는 살모넬라 미생물의 가능성을 가진 백신의 면역원성을 조절할 필요성에 부분적으로 기인할 것이다.

적합한 백신 후보물질을 생성할, 감독화를 위한 적절한 목표의 선택은 수월하지 않을 것이고, 쉽게 예상할 수 없다는 점은 분명하다. 적절한 백신으로서 감독된 균주의 적합성에 많은 인자가 영향을 줄 것이고, 적합한 균주를 동정하기 위하여 많은 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 백신 후보물질로서 시험받은 많은 감독된 균주는 환자에게 백신증(vaccinemia) 또는 농양을 이르게 한다.

그러므로, 미생물 균주의 활성 형태로 복귀할 가능성이 감소된, 높은 등급의 면역원성을 가지는 백신의 개발이 바람직하다.

본 발명은 박테리아 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물에 이용될 수 있는 감독(減毒)된 미생물에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 살모넬라 미생물에 도입된 감독되는 돌연변이의 몇몇의 조합이 높은 등급의 면역원성 및 미생물이 활성 형태로 복귀할 낮은 위험도를 가지는 백신을 생산할 수 있다는 연구 결과를 기초로 한다. 생성된 백신 균주는 우수한 부작용 프로필을 나타낸다.

본 발명의 첫번째 관점에서는, 살모넬라 미생물은 Spi2 병원성 세포군안에 위치한 유전자의 발현을 파괴하는 감독된 돌연변이, 및clpP, ompR, sifA, sseC또는ssaB유전자 중 어느 하나의 발현을 파괴하는 다른 돌연변이를 가진다.

본 발명의 두번째 관점에서는, 살모넬라 미생물은aro유전자의 발현을 파괴하는 감독된 돌연변이, 및clpP또는sifA유전자 중 어느 하나의 발현를 파괴하는 다른 돌연변이를 가진다.

살모넬라 미생물은 예를 들어, 장티푸스의 치료를 위한 것과 같은, 박테리아 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 정맥 주사 또는 경구용 약제의 제조에 이용될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 미생물과 백신 조성물은 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.

당업자들은 과도한 실험없이 특정한 살모넬라 미생물 및 적절한 돌연변이를선택할 수 있다. 바람직한 미생물은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)이다.

돌연변이의 첫번째 세트는 살모넬라 병원성 세포군 2(Spi2)의 영역 안에 위치한 유전자에서의 첫번째 돌연변이를 포함한다; 이 영역은 WO-A-9617951에 개시되어 있다.

Spi2는 살모넬라 염색체에 위치한 두 개의 전형적인 병원성 세포군 중 하나이다. Spi2는 Spi2 코드화된 독성-관련 단백질들(소위 작용인자 단백질)을 살모넬라 세균 외부로 및 잠재적으로 직접 매크로파지같은 표적 숙주 세포로 운송하는 것을 포함하는 Ⅲ형 분비계를 코드화하는 여러 유전자들을 포함한다. Spi2(기관 유전자)의 일부는 Ⅲ형 계의 분비기관을 코드화한다. Spi2는 세계에서 여러 다른 그룹에 의해 현재 기록된 결과인, 마우스에서의 살모넬라의 병인 및 독성에 절대적인 핵심이다. 경구, 정맥내 및 복막내 투여 경로에 의해 항원 투여된 마우스에서S.typhimuriumSpi2 돌연변이체를 고도로 감독한다.

바람직한 구현예에서, Spi2내에서의 유전자는 기관 유전자이다. Spi2에 위치한 기관 유전자는 현재 잘 특성화되어 진다; 예를 들어 Hensel et al,Molecular Microbiology(1997); 24(1): 155-167을 참조. 본 발명에 사용하기에 적합한 유전자들에는ssaV, ssaJ, ssaK, ssaL, ssaM, ssaO, ssaP, ssaQ, ssaR, ssaS, ssaT, ssaU및ssaH유전자들이 포함된다.

Spi2 영역내에서의 돌연변이는 반드시 기능을 파괴하기 위해 유전자 내에 있어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 상류 조절 영역내의 돌연변이도 유전자 발현을파괴할 수 있고, 이로서 감독을 일으킨다. 유전자간 영역내의 돌연변이 또한 유전자 기능을 파괴하는데 충분하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, Spi2 유전자는ssaV이고, 다른 돌연변이는clpP, ompR, sifA또는sseC중 하나를 파괴한다. 별개의 바람직한 구현예에서, 돌연변이는ssaT를 파괴하고 다른 유전자는ssaB를 파괴한다.

clpP유전자는 Giffordet al., Gen. Microbiol., 1993;139:913-920에 개시되어 있다. 코드화된 단백질은 스트레스-반응 단백질 분해 효소이다.

ompR유전자는 Chatfieldet al., Infection and Immunity, 1991;59(1):449-452에 개시되어 있다. 코드화된 단백질은 전체적인 조절 기능을 가진 두-구성 성분 계(OmpR-EnvZ) 중 하나의 구성 성분이고, 그리고 또한 Spi2에서 두-구성 성분 계ssrA-ssrB를 위한 조절자이기도 하다(Leeet al., J. Bacteriol., 2000;182(3):771 -781).

sseC유전자는 Medinaet al., Infection and Immunity, 1999;67(3):1093-1099에 개시되어 있다. 코드화된 생산물의 기능은 알려져 있지 않다.

ssaB 유전자는 Hensel, Molecular Microbiology, 2000;36(5):1015-1023에 개시되어 있다. 코드화된 생산물은 Spi2을 위한 알려진 기질 단백질 중 하나이고, 마크로파지에서 정상 엔도솜의 운반과 상호 작용한다.

돌연변이의 두번째 개별 세트는aro유전자를 파괴하는 첫번째 돌연변이를 포함한다.aro유전자는 포유류내에는 존재하지 않고 살모넬라내에 존재하는 생합성 경로에 필수적이기 때문에, "영양요구성 돌연변이"라고 칭하여진다. 그러므로,돌연변이체들은 돌연변이의 효과를 우회하기 위해 치료된 환자내에서 발견되는 신진대사 산물에 의존할 수 없다. 영양요구성 돌연변이에 대한 적합한 유전자들에는aroA, aroC, aroD및aroE가 포함된다. 바람직한 구현예에서는aroC가 파괴된다.

두번째 돌연변이는clpP또는sifA유전자 중 어느 하나를 파괴한다.clpP는 상기에 개시되어 있다.sifA유전자는 Steinet al., Mol. Microbiol., 1996;20(1) :151-164 및 Beuzonet al., EMBO J., 2000;19(13):3235-3249에 개시되었다.sifA유전자 생산물은 리소좀의 글리코단백질-함유 구조의 상피 세포에서의 생산을 포함한다.

공지된 어느 기술을 이용하여 미생물 속으로 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하기는, 상기 돌연변이는 핵산의 절단에 의해 야기되는 유전자의 파괴인, 결손 돌연변이다. 대체 가능하게, 핵산의 삽입에 의해 또는 점돌연변이에 의해 돌연변이를 도입할 수 있다. 특정 영역으로 돌연변이를 도입하는 방법은 당업자에 의해 명백해질 것이다.

예를 들어, PCR 및 높은 충실도의 폴리머라제를 이용하여 목표 유전자에 인접 DNA를 더하여 일차 증폭에 의하여 유전자 결손이 일어날 수 있다. 그리고 나서 적합한 클로닝 백터(cloning vector)로 증폭된 생성물을 배양할 수 있다. 초기 구조물을 생성하기 위해, 역PCR에서 이용할 때 유전자를 결손하도록 PCR 프라이머(primer)를 고안할 수 있다. 상기 PCR 프라이머는 새로운 제한부위를 도입하는Xbal부위를 함유할 수 있고 그리하여 유전자 결손을 위한 마커를 제공할 수 있다. 그런 다음, 살모넬라 염색체로 이동을 위한 자멸 벡터로 결손 구조물을 이동할 수 있다. 이 구조물을 원하는 균주 또는 플라스미드에서 실행된 항생 물질 저항 마커를 이용하여 선택된 상동 부위(부분이배체)에서 염색체로 통합된 플라스미드를 함유하는 재조합형으로 전기영동 또는 연계할 수 있다. 자멸 벡터는 또한 자당의 존재 하에서 대부분의 그램-음성의 박테리아에 독성을 가지는, 효소 레번 자당을 코드화하는sacB유전자를 포함할 수도 있다. 그러므로 자당 선택은 두번째 재조합이 발생하여 염색체로부터 플라스미드를 손실하는 결과를 가지는 콜로니를 유리시키도록 이용할 수 있다. 이 두번째 재조합은 두 가지의 결과, 야생형 대립유전자의 재생 또는 결손 돌연변이의 생성을 나타낼 수 있다. 그리고 나서, 콜로니-PCR 및 서던 블라트 분석에 의해 확인된 결손에 의해 결손 돌연변이를 함유하는 콜로니를 동정할 수 있다.

두 돌연변이에 추가하여, 살모넬라 미생물은 또한 이종성 항원을 포함할 수 있다. 따라서 이 감독된 미생물은 다른 박테리아 또는 바이러스 감염에 대한 항원을 투여하기 위한 전달체로서 작용할 수 있다. 이런 방식에 사용하기에 적합한 항원은 당업자들에게 명백할 것이고 다음을 포함한다:

병원성 E.coli 항원 즉, ETEC

A형, B형 및 C형 간염 항원

라임(lime) 병 항원

비브리오 콜레라 항원

헬리코박터 항원

단순 포진 바이러스 항원

인간 유두종 바이러스 항원

이 시스템은 또한 환자들, 예를 들어 간염에 감염된 환자들의 치료를 위한 치료학적 단백질, 펩티드, 핵산을 전달하는 잠재력을 가지고 있다. 돌연변이 미생물에 의해 전달될 수 있는 적합한 치료학적 단백질의 예로 사이토킨이 있다. 백신 조성물을 이용한 이종성 항원 또는 치료학적 단백질의 전달을 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 미생물을 사용하여 제조된 백신들은 인간 환자의 감염의 치료 그리고 수의학적 감염의 치료에 적용된다.

이중 돌연변이는 안전한 백신 후보를 제공하기 위해 미생물을 감독하는 효과적인 수단을 제공한다.

백신 조성물들은 심지어 면역절충된(immunocompromised) 환자에게도 효과적인 단백질을 제공하고, 중요하게도 비장 농양을 진전시킬 위험이 낮다. 비장 농양은 단일 돌연변이에 기초한 백신을 사용하여 확인되어 왔고, 따라서 본 조성물은 환자들에게 실질적인 이득을 제공할 수 있다.

백신 조성물을 제제화하기 위해서, 돌연변이체 미생물은 적합한 약학적으로 수용가능한 보조제, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물로 존재할 수 있다. 적합한 제제화는 당업자들에게 명백할 것이다. 제제화는 적합한 투여 수단을 위해 개발될 수 있다. 바람직한 투여는 경구 또는 정맥내 경로를 통한 것이고, 백신들은 감독된 생 살모넬라 미생물들이다. 제제화에서 존재하도록 요구되는 미생물의 수는 당업자에 의해 결정되고 최적화될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 환자는 단일 투약단위로 대략 10⁷- 10¹⁰CFUs, 바람직하게는 약 10⁸- 10⁹CFUs로 투여될 수 있다.

Claims (14)

1. Spi2 병원성 세포군내에 위치한 유전자의 발현을 파괴하는 감독된 돌연변이, 및clpP, ompR, sifA, sseC및ssaB유전자 중 어느 하나의 발현을 파괴하는 다른 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물.
2. aro 유전자의 발현을 파괴하는 감독된 돌연변이, 및clpP및sifA유전자 중 어느 하나의 발현를 파괴하는 다른 돌연변이를 가지는 살모넬라 미생물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 aro 유전자는aroC인 미생물.
4. 제 1항에 있어서, Spi2 유전자는ssaV이고, 다른 돌연변이는clpP, ompR, sifA또는sseC를 파괴하는 것인 미생물.
5. 제 1항에 있어서, Spi2 유전자는ssaT이고, 다른 돌연변이는ssaB을 파괴하는 것인 미생물.
6. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 이종성 항원 또는 치료학적 단백질을 포함하는 미생물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 항원이 A형, B형, 또는 C형 간염 항원인 미생물.
8. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 살모넬라 티피(typhi) Ty2인 미생물.
9. 치료에서 이용하기 위한, 상기 항들 중 어느 한 항에 따른 미생물.
10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 의한 미생물, 보조제 및 생리학적으로 수용가능한 희석제를 포함하는 백신 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 1회 투여량 단위당 10⁷-10¹⁰CFUs의 미생물을 포함하는 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 1회 투여량 단위당 10⁸-10⁹CFUs의 미생물을 포함하는 조성물.
13. 전신성 세균 감염의 치료를 위한 약제의 제조에서, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 미생물의 용도.
14. 제 13항에 있어서, 상기 감염이 장티푸스인 용도.