KR20020048801A - 담배 유래의 Ｔｓｉｐ1 유전자 도입 형질전환균주 및 그를이용한 식물병 저항성 향상 담배 변종 식물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 담배 유래의Tsip1유전자 도입 형질전환균주 및 그를 이용한 식물병 저항성 향상 유전자변형 담배 변종 식물에 관한 것으로, 저항성 유전자 전사 활성화 기능이 있는 담배 유래Tsi1단백질과 상호결합하는Tsip1유전자를 담배로부터 분리한 후 벡터에 삽입하여 구축한 재조합 벡터를 다시 아그로박테리움 균주에 도입하여 제조한 본 발명 형질전환균주를 담배에 접종하여 재분화시킨 결과, 담배 식물체내에서Tsip1유전자가 발현됨으로써 결과적으로 병 생성-관련 저항성PR계 유전자의 발현을 유도하여, 식물병원균 및 환경적 스트레스에 대한 저항성이 향상된 담배 변종 식물체를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

담배 유래의 Ｔｓｉｐ1 유전자 도입 형질전환균주 및 그를 이용한 식물병 저항성 향상 담배 변종 식물 {Novel recombinant bacterial strain introduced with tobacco Tsip1 gene and pathogen-resistant transgenic tobacco using thereof}

본 발명은 담배 유래의Tsip1유전자 도입 형질전환균주 및 그를 이용한 식물병 저항성 향상 담배 변종 식물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 전사 활성화 기능이 있는 담배 유래의Tsi1단백질과 결합하는Tsip1의 유전자를 식물체 발현 벡터에 삽입하고 그를 다시 아그로박테리움에 도입하여 제조한 형질전환균주를 담배에 접종하고 재분화시켜 획득한 식물병원균 및 환경적 스트레스에 대한저항성이 향상된 유전자변형 담배 변종 식물체에 관한 것이다.

유해한 해충 및 병원균에 의한 농작물의 침해로 인한 식량난으로 인류는 생존까지도 위협받고 있다. 이러한 문제를 해결하고 나날이 진화되어 새롭게 등장하고 있는 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위한 다양한 방제법 중 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 유해 병원균뿐만 아니라 주변 생태계 생물까지도 살상함으로써 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 산성화시키는 등의 폐해가 있었다. 그에 따라 농약 살포 등의 화학적 방제수단뿐만 아니라 식물의 환경 및 조건을 고려하여 물리적, 생물학적 방제법을 적용하여 저항성을 보유하는 식물 품종의 개발 및 육종에 의한 재배가 요구되어지고 있다.

이에 따라, 다양한 작물-병원균 상호작용을 응용한 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 진행되어 왔다. 집중적으로 연구되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표 사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다. 담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오랫동안 향신료, 양념 등으로 사용되어져 벼, 배추와 함께 우리나라 국민의 식단을 이루는 주된 작물 중의 하나이다. 고추 재배 중에 보고된 우리나라에서의 병 발생은 바이러스병, 세균병, 및 진균병에 대해 나타나 있으며, 고추의 주요한 병으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병, 세균에 의한 세균성 점무늬병 등이 보고되어 왔다. 이러한 현실에도 고추식물의 병 저항성 기작을 포함한 방어반응 및 환경적인 스트레스에 대한 반응에 대한 연구는 미비한 실정이다.

식물체는 생물적 또는 비생물적 스트레스에 대하여 빠른 방어 반응 또는 다양한 시그널 변환 반응을 보인다 (Yanget al., 1997). 그 시그널 변환 반응의 주요 타겟은 수많은 유전자의 전사 활성을 유도하는 핵이고, 결과적으로 다양한 방어 단백질을 합성하고 이차적으로는 생체 보호작용을 유도하는 것이다.

담배의 cDNA 라이브러리로부터 EREBP/AP2 타입의 DNA-결합 단백질을 코딩하는Tsi1을 분리하였는데,Tsi1은 애기장대풀 (Arabidopsis)의rd29유전자 및 ABA-비의존적 경로 (ABA-independent pathway)와 관계있는 것으로 보여지는 TACCGACAT 서열을 포함하는 DRE box 및 GCC box에 대하여 특이적 결합 활성이 있는 것으로 알려져 있다 (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozazki, 1994). 프로모터의 분석을 통하여 DRE 서열은 탈수, 냉해 및 고염도 스트레스-반응 유전자의 발현을 조절하는데 필수적이라는 것을 알 수 있었다.PR-1, β-1,3-글루칸가수분해효소 (β-1,3-glucanase), 키틴가수분해효소 (chitinase) 및 오스모틴 [osmotin (PR-5)] 유전자를 포함하는 많은 식물체 저항성 유전자의 프로모터에서 5'-AGCCGCC-3'의 cis-acting element를 발견할 수 있는데, 이 중 GCC box는 기본적인PR단백질 유전자의 프로모터에서는 발견되지만, 과일의 숙성이나 노화와 같은 기타 에틸렌 반응 관련 에틸렌 조절 유전자의 프로모터에서는 발견되지 않는다 (Coupe and Deikman, 1997; Raghothamaet al., 1991).

에틸렌-반응성 GCC box 유사 서열과 상호 결합하는 DNA-결합 단백질은 EREBP/AP2-도메인 전사 인자군에 속하는데, 이 단백질들은 꽃의 발달에 있어 중요한 단계를 조절하는 애기장대풀 유래 APETALA2 단백질에서 처음으로 분리된 EREBP/AP2-도메인의 존재로 인하여 밝혀졌다. 이러한 EREBP/AP2-도메인군의 단백질들은 스트레스-반응 유전자의 발현과 관계가 있다.

Jaglo Ottosen등은 효모내 두 단백질간 상호작용 검정 스크리닝 (yeast two-hybrid screening)을 통하여 하나의 EREBP/AP2-도메인을 포함하고 있는 세 개의 Pti4, 5, 6 Pto-결합 토마토 단백질을 분리하였다. Pto는 AvrPto를 생산하는Pseudomonasavirulence 유전자의 인식에 관여하는 수용체 키나아제 (receptor kinase)이다. 따라서, 상기 Pti4, 5, 6은 토마토에서의 방어반응 유도를 활성화시킨다고 할 수 있다. CBF1/DREB1군이 애기장대풀의 냉해-반응 유전자의 발현에 있어 중심적인 역할을 수행하는 데 비하여 DREB2A 및 DREB2B 등의 다른 EREBP/AP2-도메인 단백질군은 가뭄-반응 유전자의 발현과 관계가 있다고 밝혀졌다 (Jaglo Ottosenet al., 1998; Liuet al.,1998).

몇몇의 전사인자가 차별적 시그널링 경로에서 타겟으로 작용한다는 것은 일반적인 주지의 사실이다. 예를 들면, 일반적으로 연구되어져 온 동물의 전사인자 CREB (cAMP response element-binding protein)는 수많은 차별적 시그널링 경로에서 단백질 키나아제에 의해 인산화되어 활성화된다 (Hill and Treisman, 1995). 또한, 몇몇의 전사인자는 핵 국지성, 전사 활성화, DNA-결합 활성화 또는 다른 단백질과의 결합을 위한 인산화와 같은 전사 이후의 변형 과정 (post-transcriptional modification)이 필요하다 (Hill and Treisman, 1995). 더 나아가, 전사인자의 cross-coupling은 다양한 시그널링 반응 과정을 매개하는 데 있어 중요한 역할을 수행한다. 동물에서 예를 들면, 스테로이드 수용체군 또는 Jun/Fos 단백질의 전사활성을 변화시키는 데 있어 cross-coupling은 매우 중요하다.

본 발명자들은Tsi1의 이중 기능적 DNA 결합 활성을 조사하기 위하여, 효모 내 두 단백질간 상호결합을 이용하여 신규한Tsi1상호결합 단백질Tsip1(Tsi1-결합 단백질; T si1-interactingprotein1)을 분리하고 그를 암호화하는 cDNA를 획득하였다. 효모내 두 단백질간 상호작용 검정 시스템은 단백질-단백질 결합을 조사하기 위한 체제인데, 물리적으로는 분리되었으면서도 기능적으로는 결합하여 작용하는 도메인으로 구성된 진핵생물의 trans-acting 전사인자의 특성을 이용한 것이다 (Fields and Sternglanz, 1994; Chienet al., 1991). GAL4 시스템에서, DNA 결합 단백질 또는 활성화 도메인은 서로 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되거나 또는 두 개의 분리된 벡터로 클론된다. 또한, 본 발명에서Tsip1유전자의 발현은PR2,PR3,PR5및SAR8.2와 같은 저항성PR계 유전자의 발현을 유도하고 결과적으로 화학물질이나 병원체에 대한 저항성을 향상시킨다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 화학물질 또는 병원체 감염에 대한 시그널 변환경로에서Tsip1이 양성의 전이 활성 인자 (positive trans-acting factor)로 작용한다는 것을 의미하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물병 저항성의 발현을 유도하는 담배 유래의Tsip1유전자를 삽입하여 구축한 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciencesLBA4404) 균주에 도입함으로써Tsip1유전자가 균주내에서 발현되는 형질전환균주를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환균주를 담배 식물체에 접종함으로써 뛰어난 생물적 또는 환경적스트레스 저항성을 보이는 담배 변종 식물체를 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 스트레스 물질을 처리한 담배 (Nicotiana tabacumcv. Samsun NN andNicotiana tabacumcv. Xanthi)로부터 전사 활성화 기능을 갖는Tsi1을 획득한 후Tsi1cDNA 돌연변이체를 얻고, 상기 담배의 cDNA와 pACT2 활성화 도메인 발현 벡터를 이용하여 제작한 라이브러리를 pAS2-1/Tsi1△C1 결합 도메인 융합 벡터를 사용하여 스크리닝 한 후E. coli에 도입하여 증식한 pACT2 융합 플라스미드를 분리하여 본 발명Tsip1유전자를 획득하고, 분리한Tsip1을 단계적으로 pBluescript SK(-) 및 pMBP2 벡터에 삽입하여 구축한 재조합 벡터를Agrobacterium tumefaciences균주 (LBA4404)에 도입하여 제조한 형질전환균주를 담배에 접종하여 저항성이 향상된 본 발명 담배 변종식물체를 획득하고Tsip1유전자 발현 여부를 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 효모에서의 전사 활성 분석에서 사용된Tsi1결실 돌연변이체의 구조도이다.Tsi1및Tsi1돌연변이체를 GAL4 DNA-결합 도메인 발현 벡터인 pAS2-1에 삽입시키고lacZ리포터 유전자의 전사를 활성화시키는 각 번역 산물의 능력을 β-갈락토시데이즈 분석법 (β-galactosidase assay)으로 조사하였다. 회색 박스는 EREBP/AP2 DNA-결합 모티프를 나타낸다. β-갈락토시데이즈 활성화 능력이 있는 파란색 콜로니를 '+'로, β-갈락토시데이즈 활성이 없는 붉은 콜로니를 '-'로 나타내었다.

도 2는 담배 cDNA 라이브러리의 효모 내 두 단백질간 상호작용 검정 스크리닝 결과이다.

도 3은 담배Tsip1cDNA 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.

도 4는 효모에서의Tsi1-Tsip1특이적 결합 및Tsi1결실 돌연변이 유도체를 GAL4 DNA-결합 도메인 융합 벡터 및 GAL4 활성화 도메인 융합 벡터에 도입한 후 효모 (Saccharomyces cerevisiaeY190) 세포를 형질전환시키고 그 세포를 Leu^-, Trp^-, His^--선택적 조건에서 배양한 후 단백질-단백질 결합 능력을 알아보기 위해 colony lift-filter assay를 수행한 결과이다.

도 5는 본 발명Tsip1단백질과 GST, GST-Tsi1및 GST-Tsi1△C2와의 결합 특성을in vitro에서 분석한 결과이다.

도 6은 염 (NaCl)의 처리에 의한Tsip1유전자 발현 유도 결과를 나타낸다. 200mM의 NaCl 및 증류수 (H₂O)를 처리한 담배 잎으로부터 추출한 RNA 20㎍을 로딩한 것이다.

도 7은 살리실산, 지베렐린산, 엡시식산 및 에테폰 (ethephone)의 처리에 의한Tsip1유전자 발현 유도 결과이다. 1mM 에테폰, 100μM 엡시식산 (ABA), 100μM 지베렐린산 (GA) 및 1mM 살리실산 (SA)을 각 시간대별로 처리한 담배잎으로부터 추출한 RNA 각 20㎍을 로딩한 것이다.

도 8은Tsip1유전자의 조직 특이적 발현을 나타낸다. 꽃 (F), 뿌리 (R), 잎 (L), 줄기 (St)로부터 추출한 총 RNA를 각각 20㎍씩 로딩한 후 에티디움 브로마이드 (EtBr)로 염색하였다.

도 9는 담배의 genomic DNA를EcoRⅠ (E),HindⅢ (H),BamHⅠ (B) 및XbaⅠ (Xb)으로 절단한 후 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하고 나이트란막 (Hybond-N⁺membrane)으로 전이시킨 후,³²P로 표지한 탐침을 사용하여 그 블럿으로부터Tsip1ORF을 분리한 genomic DNA 젤 분석 결과이다.

도 10은 본 발명Tsip1유전자의 비생물적 스트레스 환경에서의 발현 패턴 및Tsip1의 발현 유도에 의한rd29및PR-1유전자의 발현 유도를 알아보기 위하여 담배 잎에 H₂O (H), NaCl (Na), 건조 (D), 상처 (W), 엡시식산 (A), 살리실산 (S), 에테폰 (E) 및 메틸 자스모닉산 (MeJA)을 처리한 후 그 RNA 블럿을Tsip1의 3' 말단 특이적 탐침과 융합시킨 결과를 나타낸다.

도 11은 본 발명Tsip1유전자를 pMBP2 벡터에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸다.

도 12는 본 발명 유전자 변형 담배 변종식물 T₀의 PCR 분석을 통한 유전자 스크리닝 결과이다.

본 발명은 담배 (Nicotiana tabacumcv. Samsun NN andNicotiana tabacumcv. Xanthi)의 잎에 ABA (abscisic acid), SA, 에테폰 (ethephon), 지베렐린 산 (gibberellic acid) 및 염(salt; NaCl)을 처리하는 단계;Tsi1cDNA의 돌연변이를 획득하고 결실 폴리펩타이드 코딩 부위를 효모의 GAL4 DNA-결합 도메인을 갖는 벡터 pAS2-1 및 효모 Y190로 도입한 후 선별함으로써Tsi1의 전사활성부위를 확인하고 결정하는 단계;Tsi1과 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 상기 담배의 cDNA와 pACT2 활성화 도메인 발현 벡터를 이용하여 제작한 라이브러리를 pAS2-1/Tsi1△C1 결합 도메인 융합 벡터를 사용하여 스크리닝한 후 효모 균주로 도입하고 선별한 후 다시E. coli에 도입하여 증식한 pACT2 융합 플라스미드를 분리함으로써 본 발명Tsip1유전자를 획득하는 단계; 전장의Tsip1cDNA 클론을 획득하기 위하여 상기Tsip1절편을 탐침으로 하여 Southern blot을 수행하고 그 염기서열을 분석하는 단계;Tsip1-Tsi1결합 특이성을 조사하기 위하여,Tsip1-융합 플라스미드 및Tsi1-결실-융합 플라스미드를 함께 도입한 효모 세포로 두 단백질간 상호작용 실험을 수행하는 단계; 비생물적 스트레스 물질에 의한Tsip1유전자의 발현 패턴 및 각 조직별 발현 패턴을 확인하는 단계;Tsip1유전자의 발현과 병원균의 침입에 대하여 특징적으로 전사되는rd29및PR-1유전자 발현 유도를 확인하는 단계; pBluescript SK(-) 벡터에 삽입된Tsip1cDNA를 다시 pMBP2의 폴리링커 부위로 삽입시켜 재조합 벡터를 구축하는 단계; 상기Tsip1유전자가 삽입된 재조합 벡터를Agrobacterium tumefaciencesLBA4404에 도입시켜 본 발명 형질전환균주를 제조하고 그 중 카나마이신 저항성 균주를 선별하여 형질전환균주를 획득하는 단계; 저항성을 획득한 상기 형질전환균주를 담배에 접종하고 그 신초를 재분화시키고 뿌리를 유도하여 저항성이 향상된 본 발명 담배 변종 식물체를 획득하고Tsip1유전자 발현 여부를 확인하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 과정을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만본 발명의 권리범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : Tsi1 를 이용한 Tsip1 유전자의 분리 및 특성 조사

제1단계. 담배의 준비 및 화학물질의 처리

담배 (Nicotiana tabacumcv. Samsun NN andNicotiana tabacumcv. Xanthi)를 밝은 곳에서 16시간동안, 암실에서 8시간동안 생장 배양기에서 생장시키고 종자 발아 후 7주간 관찰 및 처리하였다. ABA (abscisic acid), SA, 에테폰 (ethephon), 지베렐린산 (gibberellic acid) 및 염 (salt)의 처리를 위하여 100 M ABA, 2 mM SA, 1 mM 에테폰, 100 M 메틸 자스모닉산 또는 200 mM NaCl로 채워진 팔콘 튜브 (Falcon tube)에 상기 담배의 잎을 다양한 시간 간격으로 치상하고 액체 질소에서 냉각시켰다.

제2단계. Tsi1 유전자의 분리 및 특성 조사

Tsi1cDNA의 다양한 제한 부위를 이용하거나 또는 PCR에 의하여Tsi1의 결실 돌연변이 유전자를 획득하였다.

플라스미드 pTsi1△C1와 pTsi1△C3는 13 및 124개의 카르복실 종결부위 아미노산이 결실된Tsi1단백질을 코딩한다. 그것들을 pTsi1의 제한 부위, 즉 pTsi1△C1의EcoRI 및 pTsi1△C3의SmaI을 이용하여 제작하였다. 상기 2개의 제한 부위는 또한 127 및 236개의 카르복실 종결부위가 결실된Tsi1단백질을 코딩하는 pTsi1△N1 및 pTsi1△N3 플라스미드를 제작하는 데에도 이용되었다.

Tsi1결실 유도체인 pTsi1△C2 및 pTsi1△N2을 하기의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR을 실시함으로써 제작하였다.

p Tsi1△ C2 및 p Tsi1△ N2의 제작를 위한 PCR에 사용된 프라이머

△C2-(5'-CAAGCTTCCGTTAATACTTTCGG-3')

△N2-(5'-CGGATCCTATTAACGGCGGATATAAC-3')

함께 사용된 일반적인 프라이머는 다음과 같다.

T7-(5'-AATACGACTCACTATAG-3')

T3-(5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3')

결실 폴리펩타이드 암호화 부위를 효모의 GAL4 DNA-결합 도메인을 가지는 벡터인 pAS2-1으로 삽입시켰다. 상기의 재조합 플라스미드를 manufacturer's (Clontech, Palo Alto, CA, USA) instruction에서 제공하는 효모 Y190 균주 [Saccaromyces cerevisiaestrain Y190 (MAT, HIS3, lacZ, trp1, leu2, cyh ^r 2)]로 도입시켰다. 상기 형질전환체를 Trp^-synthetic dropout (SD) 배지에 도말한 후 30℃에서 3일간 배양하여 선별하였다. 각 번역 산물의 전사 활성화 능력을 알아보기 위해 X-gal를 기질로 사용하여 colony-lift assay를 실시하였다.

Tsi1단백질 서열은 핵 국지성 시그널로서 기능하는 N-종결 아미노산 잔기 지역을 포함하고 있으며 전사를 위한 활성화 도메인으로 기능하는 산성의 C-종결 지역을 포함하고 있다. 효모의 GAL4 단백질, 포유류의 글루코코르티코이드 수용체 (glucocorticoid receptor) 및 옥수수의 비비포러스-1 단백질 (Viviporous-1protein)과 같은 많은 전사 인자들은 전사 활성화 기능의 산성 부위를 포함하고 있다 (McCartyet al., 1991). 효모 균주 Y190에서Tsi1유전자가 미끼로 발현되면 리포터 유전자의 강한 자가활성이 유도되는데, 이것은Tsi1이 기능적 전사 활성화 도메인을 포함하고 있다는 것을 제시하는 것이다. 이러한 원상태의Tsi1과는 대조적으로,Tsi1△C1,Tsi1△C2 및Tsi1△C3과 같은 돌연변이체들은 완벽한 β-갈락토시데이즈 활성의 결핍을 나타내었다 (도 1). 이러한 결과는Tsi1의 C-종결부위 13개 아미노산이Tsi1의 잠재적인 전사활성자의 기능을 수행한다는 것을 의미하는 것이다. 이로서 전사 활성화 기능을 갖는 부위를Tsi1에서 확인할 수 있었다.

제3단계. 효모 내 두 단백질간 상호작용 검정 스크리닝에 의한 Tsip1 의 분리

Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA)로부터 The MatchMaker II GAL4 이배체 시스템 (two-hybrid system)을 구입하여 사용하였다. 상기 담배잎으로부터 추출한 RNA와 pACT2 활성 도메인 발현 벡터를 이용하여 제작한 cDNA 라이브러리를 pAS2-1/Tsi1△C1 결합 도메인 융합 벡터 (binding domain fusion vector)를 사용하여 스크리닝한 후, 상기 두 개의 융합 벡터 (fusion vector)를 효모 Y190 균주 (Saccharomyces cerevisiaeY190;MATa,HIS3,lacZ,trp1,leu2,cyh ^r 2) 또는 HF7c (MATa,HIS3,lacZ,trp1,leu2)로 함께 도입시켰다. 상기 형질전환된 효모 중 잘못된 형질전환체를 제거하기 위하여 3-아미노-1,2,4-트리아졸 (3-amino-1,2,4 -triazole) 50 mM (Y190), 5 mM (HF7c)을 Leu^-, Trp^-, His^-의 minimal syntheticdropout (SD) 배지에 첨가하여 30℃에서 8-12일간 생장시킨 후 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시데이즈 (X-gal)를 기질로 하여 β-갈락토시데이즈 활성을 관찰하기 위한 colony-lift assay를 실시하였다. 양성의 콜로니 (Leu⁺, Trp⁺, His⁺)를 선별한 후 재-형질전환 (re-transformation)법으로 선별하였다. Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech)을 사용하여 각각의 Leu⁺, Trp⁺, His⁺, LacZ⁺형질전환체로부터 플라스미드를 추출한 후 전기 천공법으로E. coliXL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 도입시키고 배양시킨 후 증식한 상기 pACT2 융합 플라스미드를 분리하였다.

효모의 GAL4 활성화 도메인 발현 벡터에 담배잎 추출 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작하였다.Tsi1결합 단백질을 분리하기 위하여, 결실 돌연변이Tsi1△C1를 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 이것은Tsi1△C1이 효모에서 전사 활성화 특성의 결핍을 보이기 때문이다. 2×10⁵개의 세포를 스크리닝한 결과, Leu과 His이 결핍된 플레이트에서 49개의 콜로니를 획득할 수 있었으며 이러한 결과는 형질전환체가 GAL4 DNA 결합 및 활성화 도메인을 코딩하는 두 개의 분리된 융합 벡터를 포함하고 있음을 말해주는 것이다. 도 2에서와 같이, 상기 콜로니들을 재-형질전환시켜 colony-lift filter assay를 수행한 결과, 단독 콜로니를 제외한 대부분의 콜로니들이 β-갈락토시데이즈 활성능력을 상실하였음을 알 수 있었다. 여기서 푸른색 점은 β-갈락토시데이즈 활성이 있는 콜로니, 붉은 점은 β-갈락토시다제 활성이 없는 콜로니를 표시한다. pACT2 (GAL4 활성화 도메인 벡터)의 발현 라이브러리는 pAS2-1 (GAL4 DNA-결합 도메인 벡터)에 융합한Tsi1△C1과 함께 발현된다. 그 cDNA insert를 GAL4 활성화 도메인 벡터에 융합하고 효모 내 두 단백질간 상호작용 분석에 사용하였을 때, 이 최종 클론체는 강한 β-갈락토시데이즈 활성화 능력을 보였다 (도 2). 이러한 결과를 확인하기 위하여, 그 어떤 염기와도 융합되지 않은 GAL4 DNA-결합 도메인 코딩 플라스미드를 다른 플라스미드에 도입하여 재-형질전환시킨 결과, 그 플라스미드는 β-갈락토시데이즈 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 분리된 클론의 cDNA insert는Tsi1과 결합한 단백질의 번역 산물을 코딩한다고 볼 수 있다. 부분적으로 연속적인 ORF (open reading frame)을 포함하는 534개의 뉴클레오티드 insert인 이 유전자를Tsip1(Tsi1결합 단백질; T si1-interactingprotein1)라 명명하였다.

제4단계. 담배의 cDNA 라이브러리 스크리닝을 통한 Tsip1 의 분리 및 DNA 염기서열의 분석

전장의Tsip1cDNA 클론을 획득하기 위하여 Southern blot을 수행하였다.

화학물질 및 염을 처리하거나 균체를 접종한 상기 담배 잎의 총 RNA로부터 담배의 cDNA 라이브러리를 제작한 후, 효모 내 두 단백질간 상호작용 검정 스크리닝법으로 획득된 상기 실시예 2의 534bp의Tsip1cDNA 절편을³²P로 표지한 탐침를 사용하여 cDNA 라이브러리로부터 대략 5×10⁴개의 클론을 스크리닝하였다. 공지된 프로토콜 (Church and Gilbert, 1984)에 따라 혼성화반응 (hybridization)을 수행한 후, 그 막을 상온에서 10분동안 2X SSC로 2회 세척하고 상온에서 10분 동안, 65℃에서 5분 동안 0.1% SDS를 포함하는 0.1X SSC에서 세척하였다. 그 막을 건조시킨 후, 그 필터를 감광스크린과 함께 -70℃에서 48시간동안 X-선에 노출시켰다.

그 결과, 양성으로 나타난 cDNA 클론 중 가장 크기가 큰 클론을 막으로부터 분리한 후, helper phage와 함께 절단하여 pBluescript SK(-) 페이즈미드 벡터 (phagemid vector; Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 서브클로닝하였다. 그 cDNA의 염기서열을 sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech, UK)을 사용하여 다이디옥시 체인 종결 방법 (dideoxy chain termination method; Sangeret al., 1977)으로 결정하였다. DNA 서열 정보를 DNASTAR 및 벡터 NTI 분석 프로그램을 사용하여 분석하였다. 데이터베이스 조사는 NCBI BLAST search program으로 수행하였다.

도 3에서와 같이,Tsip1cDNA의 총 길이는 758bp이며 154 a.a의 ORF을 포함하고 있다. 상동성 (homology) 테스트를 통하여,Tsip1에서 결실된 아미노산 서열이 아라비돕시스의 단백질 (GenBank accession number AC006585)과 매우 유사하다는 것을 알 수 있었다.

제6단계. Tsi1 - Tsip1 의 결합 특이성 조사

Tsip1-Tsi1결합 특이성을 조사하기 위하여,Tsip1-융합 플라스미드 및Tsi1-결실-융합 플라스미드를 함께 도입한 효모 세포로 두 단백질간 상호작용 검정 실험을 수행하였다.Tsip1(pAD-Tsip1)과 융합한 GAL4 활성화 도메인을 암호화하는 플라스미드와,Tsi1삭제물들 (pBD-Tsi1△C1, pBD-Tsi1△C2 또는 pBD-Tsi1△C3)과융합한 GAL4 DNA-결합 도메인을 암호화하는 플라스미드를 함께 도입하였을 때 단지 pBD-Tsi1△C1만이 전사 활성화 능력을 나타내었다 (도 4). 이러한 결과는 상기 결합이 pBD-Tsi1△C1의 삭제된 13개의 C-종결부위에 의해서는 영향을 받지 않으나, DNA 결합 부위 및 카르복실 종결 부위가 부분적으로 결실된 pBD-Tsi1에 의해서는 영향을 받는다는 것을 의미하는 것이다 (Ohme-Takagi and Shinshi, 1995). 이러한 결과는 또한 pAD-Tsip1및 pBD-Tsi1의 동시 존재하에서lacZ리포터 유전자 (reporter gene)가 활성화된다는 것을 의미하는 것이다. 도 5에서 나타낸 바와 같이,in vitro에서 번역된Tsip1은 GST-Tsi1과 결합하는 반면, GST 대조구 단백질 및 GST-Tsi1-△C2와는 결합하지 않았다. GST와Tsip1의 비특이적 결합은 1% 미만이었으며, 재조합Tsip1단백질은in vivo에서 얻어진 결과와 같이 단지Tsi1과만 결합하였다.

AP2/EREBP DNA 결합 도메인 지역은 양족 친매성 (amphipathic helix)의 나선형을 형성하는데 이 나선은 단백질-단백질 결합에 있어 단백질 결합을 촉진하는 중요한 역할을 수행한다. 단백질-단백질 결합에 있어서의 EREBP/AP2 DNA 결합 부위의 연관성은 이전에도 제시되었는데 (Xuet al.,1998; Buttner and Singh, 1997), DNA 결합 도메인만으로도 다른 단백질과 EREBP/AP2 단백질과의 결합이 충분하게 이루어진다는 것이었다. 그러나, 본 발명자들은Tsip1과Tsi1의 결합에는 DNA 결합 도메인 뿐만 아니라Tsi1의 카르복실 종결부위가 요구된다는 것을 밝혔다.

제7단계. Tsip1 유전자의 발현 패턴 및 copy 수 조사

다양한 외부 자극을 가하여Tsip1유전자의 발현 패턴을 조사하였다.Tsi1과 결합할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자인Tsip1의 발현 역시 염처리에 의하여 유도될 수 있었다. 도 6에서와 같이, 3시간동안 NaCl을 처리한 결과Tsip1발현이 유도되었음을 Northern blot analysis를 통하여 알 수 있는데, 처리 후 24시간동안 안정한 상태의 mRNA 수준이 유지되었다.Tsip1의 발현에 대한 다른 자극의 영향을 알아보기 위하여 식물호르몬인 엡시식산 (abscisic acid; ABA), 에틸렌 (ethephon), 지베렐린산 (gibberelic acid; GA) 및 살리실산 (salicylic acid) 등을 담배 잎에 처리하였다. Northern blot analysis로 살펴본 결과, 이 호르몬은 모두Tsip1유전자의 발현을 유도하였다. SA에 의한Tsip1의 발현유도는 처리 후 30분 이내에 빠르게 발현되었으나 GA 및 에테폰에 의한Tsip1의 유도는 처리 후 1시간 이내에 천천히 발현되었다. ABA 처리의 경우는 처리 후 3시간 이내에 매우 낮은 수준으로Tsip1유전자가 발현되었다 (도 7).

이러한 결과는Tsi1유전자의 발현이 고염, 에틸렌 및 SA에 의하여 유도된다는 것과 유사한 결과이며 그 발현 패턴이 매우 비슷하다는 것을 알 수 있다. 이러한 유사성에도 불구하고Tsi1전사체는Tsip1유전자 발현을 유도하는 데 효과적인 ABA 및 GA의 처리에 의하여 축적되지 않는다. 이러한 사실은Tsi1과Tsip1을 암호화하는 유전자가 식물내에서 일반적이지만 독특한 조절장치에 의해 지배된다는 것을 의미하는 것이다. 이것은 또한Tsi1에 의해 암호화되는 전사 활성자의 발현을 유도하는 외부 자극은 그의 파트너인Tsip1의 발현도 유도한다는 것을 의미하는 것이다. 그러나, 시그널 변환의 별개의 경로는Tsip1만 유도할 뿐,Tsi1에 대해서는독립적인 것으로 보인다.

Tsip1유전자의 각 기관별 발현 패턴을 조사하기 위하여, 담배의 각 기관 (꽃, 잎, 줄기 및 뿌리)으로부터 분리한 총 RNA를 전기영동하고 나일론막에 전이 후 전장의Tsip1cDNA탐침과 혼성화반응시킨 결과, 도 8에서와 같이,Tsip1유전자에서 유래한 전사체가 잎, 줄기 및 꽃에서는 다량 검출된 반면, 뿌리에서는 거의 검출되지 않았다. 이러한 결과는Tsip1유전자의 발현이 조직 특이적 (tissue- specific)임을 나타내는 것이다.

담배 게놈에서의Tsip1유전자의 copy수를 조사하기 위하여 Southern blot analysis를 실시하였다. 담배의 genomic DNA를 다양한 제한 효소로 절단, 전기영동, 전이한 후 전체Tsip1암호화 서열을 탐침으로 하여 낮은 접합 조건에서 혼성화반응을 실시하였다. 도 9에서와 같이, 담배 게놈에서Tsip1유전자 밴드 2개가 관찰되었다.

비생물적 스트레스 환경에서의Tsip1유전자의 발현과 병원균의 침입에 대해 특징적으로 전사되는rd29및PR-1유전자의 발현 유도를 검정하였다. 담배 잎에 H₂0, NaCl, 건조, 상처, 엡시식산, 살리실산, 에테폰 및 메틸 자스모닉산을 처리한 후 그 RNA 블럿을Tsip1의 3' 말단 특이적 탐침과 융합시켰다. 도 10에서와 같이,Tsip1유전자의 발현은 물, 염, 상처, 에테폰, 살리실산 및 메틸 자스모네이트의 처리에 의해서 빠르게 유도되었으나, 가뭄이나 엡시식산의 처리와 같은 스트레스하에서는 유도되지 않았다. 특히,Tsip1에 대한rd29및PR-1유전자의 발현수준은물, 염, 상처, 살리실산의 처리에 의해 유도된rd29및PR-1의 발현수준과 매우 유사하였다. 이러한 결과는Tsip1의 발현이rd29및PR-1의 발현을 효과적으로 유도한다는 것을 의미하는 것이다.

실시예 2 : Tsip1 를 삽입하여 구축한 재조합 벡터 및 그를 도입한 형질전환균주의 제조

식물체내에서Tsip1의 전사 활성화 능력을 조사하기 위하여Tsip1cDNA 절편을 아그로박테리움-매개 방법 [Agrobacterium-mediated transformation method]을 이용하여 담배로 도입시켰다. 본 목적을 위하여, CaMV35S 이중 프로모터의 조절 하에서Tsip1cDNA의 전체 서열을 pBluescript SK(-)로 삽입시키고 그 벡터를 다시 이원벡터 (binary vector)인 식물체 발현 벡터 pMBP2의 멀티클로닝 부위로 서브클론하였다. pMBP2 벡터를BamHI로 절단하여Tsip1cDNA를BamHI로 절단한 절편과 접합시킨 후EcoRI로 절단하여 상기 재조합 플라스미드의 orientation을 결정하고 pMBP2-Tsip1으로 명명한 후 그 개열지도를 도 11에 나타내었다. 상기 재조합 벡터 pMBP2-Tsip1을 아그로박테리움 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciencesLBA4404)에 도입시켜 본 발명 형질전환균주를 제조하였다. 상기 형질전환균주중에서 1차 형질전환균주로 카나마이신에 대해 저항성이 있는 균주를 선택하였다. 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 [neomycin phosphotransferase (nptII)] 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과, 상기 형질전환균주의 약 75%가 transgene을 포함하고 있는 양성 균주임을 일 수 있었다.

상기Tsip1유전자가 도입된 본 발명 형질전환균주를 pMBP2-Tsip1/LBA4404라 명명하고 2000년 11월 28일자로 한국종균협회에 기탁번호 KFCC-11235로 기탁하였다.

실시예 3 : 본 발명 담배 변종 식물체의 제조

담배 (Nicotiana tabacumcv. Samsun NN andNicotiana tabacumcv. Xanthi)의 자엽으로부터 근두암종균 (Agrobacterium)을 이용하여 식물체의 재분화를 유도하는 방법으로 담배 변종 식물체를 제조하였다.

제한 효소는 Promega사로부터 구입하고TaqDNA polymerase는 Bioneer에서 구입하였으며 항생제는 Duchefa, 나머지 것들은 전부 Sigma 제품을 사용하였다.

제 1단계. 담배식물의 준비

담배 (Nicotiana tabacumcv. Samsun NN andNicotiana tabacumcv. Xanthi) 종자를 70% 에탄올로 1분간 소독, 멸균증류수로 2번 세척, 2% hydrochloride로 5분간 소독 후 증류수로 3회 세척하여 사용하였다. 소독한 종자를 MS 4.3g/L, 3% 수크로스, 0.4% 파이타젤 (phytagel) 배지에서 발아시켰다. 이 때, 25℃에서 16시간동안 조도 2,000Lux로 광조사하였다. 첫잎이 나기전 11일된 유묘에서 절단한 자엽 이식편 (Cotyledon explant)을 실험에 사용하였다.

제2단계. 상기 자엽의 재분화 및 형질전환균주를 이용한 담배식물의 형질전환

식물 저항성 유도 유전자Tsip1을 pMBP2에 삽입하여 구축한 본 발명 재조합벡터를 아그로박테리움 LBA4404에 도입시켜 제조한 상기 본 발명 형질전환균주를 담배에 접종하여 유전자 변형 담배식물체를 제조하였다.

상기 자엽 이식편을 4주 배양한 결과, 정상적인 신초와 눈이 발생하였으며 이것을 다시 100mL 플라스크 또는 병에 MS 염, 비타민 B₅, 2% 자당, NAA 및 zeatin을 첨가하고 카나마이신은 첨가하지 않은 신초성장배지에 2일간 치상하고 2일간 전배양한 후 상기 본 발명 아그로박테리움 형질전환균주를 접종시켜 2일간 동시배양을 수행하였다. 치상된 신초들을 멸균수로 3회 헹궈 100mg/L의 카나마이신 (kanamycin), 카르베니실린 (carbenicillin), NAA 및 zeatin이 함유된 재분화배지에서 재분화시켰다. 3-4주 후 재분화되어 생겨난 신초를 잘라 근유기배지 (50㎎/L kanamycin, IBA, 비타민, 3% 자당, MS 염 함유)에 이식시켜 뿌리를 유도시켰다. 유도되어 나온 T₀식물체들을 PCR과 Northern Blot analysis를 통해 확인하여Tsip1유전자의 발현을 확인하였다 (도 12). 상기 T₀식물체들을 자가수정시켜 T₁종자를 확보하였으며 역시 T₁을 자가수분시켜 T₂종자를 확보하였다. 이로써 저항성이 향상된 유전자변형 담배 변종 식물체 ntTsip1를 획득하였다.

이상의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 담배로부터 분리한 저항성 유전자 전사 활성화 기능의Tsi1을 이용하여 분리한Tsip1을 식물체 발현 벡터 pMBP2에 삽입하여 구축한 재조합 벡터를 다시 아그로박테리움 균주에 도입하여형질전환시킴으로써 병 생성-관련 단백질 유전자인 저항성PR계통의 발현을 유도하는 전사 활성화 기능의Tsip1유전자가 발현되는 형질전환세균균주를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 상기 형질전환균주를 담배에 접종하고 재분화시켜 유전자변형 담배식물체를 재배한 후 상기 유전자 변형 담배에서의Tsip1유전자 발현 및 그에 따른 저항성 유도를 확인하고 그 종자를 획득함으로써 저항성이 향상된 담배 변종 식물체를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로, 국민기호산업 및 식물종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 담배 (Nicotiana tabacumcv. Samsun NN andNicotiana tabacumcv. Xanthi) 유래의 식물병 저항성 발현 유도 유전자Tsip1을 pMBP2 벡터에 삽입하여 구축함을 특징으로 하는 재조합 벡터 pMBP2-Tsip1.
2. 제 1항 기재의 재조합 벡터 pMBP2-Tsip1을 아그로박테리움 LBA4404 (Agrobacterium tumefacienceLBA4404) 균주에 도입함을 특징으로 하는 식물병 저항성 발현 유도 형질전환세균균주 pMBP2-Tsip1/LBA4404 (KFCC-11235).
3. Tsip1유전자를 포함하고 있는 상기 제 2항 기재의 식물병 저항성 발현 유도 형질전환세균균주 pMBP2-Tsip1/LBA4404를 담배 품종에 도입하여 형질전환시킴을 특징으로 하는 병원균 또는 환경 스트레스 저항성 향상 담배 변종 식물.