KR20020044739A - 느릅나무과로부터 분리한 신규한 화합물 및 그 제조방법 - Google Patents

느릅나무과로부터 분리한 신규한 화합물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 느릅나무과(Ulmaceae)로부터 분리한 신규한 화합물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 느릅나무과에 속하는 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)근피의 메탄올 추출물을 n-헥산 및 클로로포름을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피, ODS컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 TLC 및 HPLC으로 정제하여 인체 암세포에 대하여 강한 세포독성이 있는 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)계 화합물을 획득하고, 그 물리화학적 특성 및 구조를 분석한 후 인체 부위별 암세포들에 대한 세포독성, 항균활성, 항염증 활성, 지질 과산화 억제 활성을 측정한 결과, 항암활성, 항균활성, 항염증 활성 및 지질 과산화 억제활성이 있는 신규한 화합물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

느릅나무과로부터 분리한 신규한 화합물 및 그 제조방법{Novel chemical compound isolated from Ulmaceae and process for preparation thereof}
본 발명은 느릅나무과(Ulmaceae)로부터 분리한 신규한 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch) 근피의 메탄올 추출물로부터 신규한 화합물을 분리하고 그 물리화학적 특성 및 구조를 분석한 후 그 물질의 암세포에 대한 세포독성, 항균활성, 항염증 활성, 지질과산화 억제활성을 조사함으로써 획득한 신규한 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)계 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)는 느릅나무과에 속하는 낙엽 활엽 교목으로서 우리나라를 비롯하여 중국, 일본에 분포하며 수고 15cm, 직경 70cm에 이른다. 잎은 긴 타원형으로 끝이 뾰족하고 톱니가 있으며, 열매에 털이 있는 특징이 있다. 우리나라에 서식하는 동속식물로서는 참느릅나무, 비술나무, 왕느릅나무, 큰잎느릅나무, 난티나무, 혹느릅나무, 느릅나무, 민느릅나무, 둥근참느릅나무, 좀참느릅나무등이 있다. 이 식물의 약효에 대한 연구로는 수피의 용매 추출물에서 진통작용, 항부종작용, 백혈구 유도 억제 작용 및 항균활성이 있음을 보고한 홍등의 연구가 있다(Hong et al., 1990). 그러나 그 성분에 관한 연구로는 근피로부터 플라보노이드(flavonoid)인 (+)-카테친(catechin)과 그 배당체로서 (+)-카테친-5-O-β-D-아피오퓨라노사이드(apiofuranoside), 수피로부터 프리에델린(friedelin), 에피프리에델린(epifriedelin), 타락세롤(taraxerol)등 3종의 트리터페노이드(triter penoid)가 분리, 보고 되었을 뿐이다.
한편, 느릅나무과 식물들에서 분리된 성분들로는 7-하이드록시-카달렌, 터페노이드(terpenoid) 화합물인 lacinilene A, B, D가 난티나무로부터 분리된 바 있다(Suzuki et al, 1971., Nagaoka et al, 1972., Nishikawa et al., Yasuda et al , 1972.). 참느릅나무로부터는 7-하이드록시카다레날, 싸이토스테롤, 리그난 등을 비롯하여 카달레닉 세스퀴터펜(cadalenic sesquiterpene) 및 카라메닉 세스퀴터펜(calamenic sesquiterpene)등 다양한 화합물들이 분리되었다(Fracheboud et al, 1968., Tanaka et al, 1966.). 또한 U. glabra로부터는 페놀화합물들인 3-하이드록시-8-메틸-이소프로필-5-메틸-2-나프쓰-알데하이드와 그 유도체들이 분리되었다 (Lindgren, 1968., Krishnamoorthy, 1971.). Row등은 참느릅나무와 비술나무등 13종의 느릅나무과 식물들의 리그난, 스테롤 함량을 조사하여 이들 식물들의 화학적 분류한 결과 U.rubra, U.americana U. pumila등에서 (-)-7-하이드록시-카라멘과 (-)-7-하이드록시 카라메날이 공통적으로 발견됨을 밝혔다(Rowe et al., 1972). 그러나 느릅나무과 식물에 대한 이상과 같은 연구들에도 불구하고 그 성분들의 생리활성에 대한 연구는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 상기 기재한 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)의 근피로부터 신규 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)계 화합물을 분리해 내고 물리화학적 특성, 화학구조 및 생물활성등을 규명한 결과, 이들 화합물이 항암활성, 항균활성, 항염증 활성 및 지질 과산화 억제활성을 나타냄을 밝혀 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)의 메탄올 추출물로부터 항암활성, 항균활성, 항염증 활성 및 지질과산화 억제활성이 우수한 신규한 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)계 화합물을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)화합물의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch) 근피에 메탄올을 가하여 추출물을 얻고, 상기추출물에 n-헥산 및 클로로포름을 용매로 하여 추출분획을 얻고 각각 추출물의 분획들을 각각 순차적인 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피, ODS 컬럼 크로마토그래피 및 실리카겔 TLC등을 통하여 분리한 후 최종적으로 HPLC를 거쳐 활성물질을 정제하여 본 발명 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)계 화합물인 다비디아논 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J의 10가지 화합물을 얻고 각각의 용해성, 융점, 고유 광회전도 UV-visible 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼, 핵자기공명 스펙트럼측정 등을 통하여 상기 10종의 성분을 분리, 정제하고 구조를 규명하여 상기 10종의 화합물은 다비디아논 A; 6-디메톡시메틸-3,9-디메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온(6-dimethoxy methyl-3,9-dimethylnaphtho(1,8-bc)pyran-7,8-dione), 다비디아논 B; 6-메톡시카보릴-3,9-디메틸나프토(1,8-bc)-7,8-디온(6-methoxycarbonyl -3,9-dimethylnaphtho (1,8-bc)pyran-7,8-dione), 다비디아논 C; 3-하이드로메틸-6,9-디메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온(3-hydroxymethyl-6,9-dimethylnaphtho (1,8-bc)pyran-7,8-dione) , 다비디아논 D; 6-메톡시메틸-3,9-디메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온(6-methoxy methyl-3,9-dimethylnaphtho(1,8-bc)pyran-7,8-dione), 다비디아노 E; 2,3-디하이드로-6-하이드로메틸-3,9-디메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온(2,3-dihydro-6-hyd roxymethyl-3,9-dimethylnaphtho-(1,8-bc)pyran-7,8-dione), 다비디아논 F; 2(H)-5-하이드로메틸-2,2,8-트리메틸나프토(1,8-bc)퓨란-6,7-디온(2(H)-5-hydroxymethyl -2,2,8-trimethylnaphtho(1,8-bc)furan-6,7-dione), 다비디아논 G; 3,6 ,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온(3,6,9-trimethylnaphtho(1,8-bc)pyran-7,8-dione), 다비디아논 H; 2,3-디하이드로-3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온 (2,3-dihydro-3,6,9-trimethylnaphtho(1,8-bc)pyran-7,8-dione), 다비디아논I; 2-3-디하이드로-3-하이드록시-3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온 (2,3-dihydro-3-hydroxy-3,6,9-trimethylnaphtho(1,8-bc)-pyran-7,8-dione), 다비디아논 J; 2,3-디하이드로-4-하이드로식-3,6,9-트리메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온(2,3- dihydro -4-hydroxy-3,6,9-trimethylnaphtho-(1,8-bc)pyran-7,8-dione)로 동정하고, 상기 다비디아논계 화합물의 인체 암세포에 대한 세포독성, 항균활성, 항염증 활성 및 지질 과산화 억제활성을 측정함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
도 1은 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)의 근피로부터 본 발명 10종의 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)화합물인 다비디아논(davidianone)A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J를 분리하는 과정의 모식도이다.
도 2a은 본 발명 화합물 다비디아논 A의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 2b은 본 발명 화합물 다비디아논 A의 화학구조를 규명하기 위하여13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 3a는 본 발명 화합물 다비디아논 A의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 3b는 본 발명 화합물 다비디아논 A의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 4a는 본 발명 화합물 다비디아논 B의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 4a는 본 발명 화합물 다비디아논 B의 화학구조를 규명하기 위하여 FG-HMQC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 5a는 본 발명 화합물 다비디아논 B의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 5b는 본 발명 화합물 다비디아논 B의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 6a은 본 발명 화합물 다비디아논 C의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 6b은 본 발명 화합물 다비디아논 C의 화학구조를 규명하기 위하여13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 7a는 본 발명 화합물 다비디아논 C의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 7b는 본 발명 화합물 다비디아논 C의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 8a은 본 발명 화합물 다비디아논 D의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 8b은 본 발명 화합물 다비디아논 D의 화학구조를 규명하기 위하여13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 9a는 본 발명 화합물 다비디아논 D의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 9b는 본 발명 화합물 다비디아논 D의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 10a은 본 발명 화합물 다비디아논 E와 F의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 10b은 본 발명 화합물 다비디아논 E와 F의 화학구조를 규명하기 위하여 FG-HMQC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 11a는 본 발명 화합물 다비디아논 E와 F의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 11b는 본 발명 화합물 다비디아논 E(a)와 F(b)의 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 12a은 본 발명 화합물 다비디아논 G의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 12b은 본 발명 화합물 다비디아논 G의 화학구조를 규명하기 위하여13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 13a는 본 발명 화합물 다비디아논 G의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 13b는 본 발명 화합물 다비디아논 G의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 14a은 본 발명 화합물 다비디아논 H의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 14b은 본 발명 화합물 다비디아논 H의 화학구조를 규명하기 위하여13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 15a는 본 발명 화합물 다비디아논 H의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 15b는 본 발명 화합물 다비디아논 H의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 16a은 본 발명 화합물 다비디아논 I의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 16b은 본 발명 화합물 다비디아논 I의 화학구조를 규명하기 위하여13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 17a는 본 발명 화합물 다비디아논 I의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 17b는 본 발명 화합물 다비디아논 I의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
도 18a은 본 발명 화합물 다비디아논 J의 화학구조를 규명하기 위하여1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 18b은 본 발명 화합물 다비디아논 J의 화학구조를 규명하기 위하여113C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 19a은 본 발명 화합물 다비디아논 J의 완전한 화학구조를 규명하기 위한 FG-HMBC 스펙트럼을 측정한 결과이다.
도 19b은 본 발명 화합물 다비디아논 J의 완전한 화학구조를 규명하기 위한FG-HMBC 스펙트럼 해석 결과 나타난1H-13C long range correlation을 나타낸 결과이다.
본 발명은 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch) 근피를 메탄올에 침지시켜 2회반복추출하고 감압농축시키고 n-헥산, 클로로포름으로 분획하여 조추출물을 제조하는 단계; 상기 단계의 클로로포름 조추출물을 실리카겔 컬럼과 TLC 크로마토그래피하여 Rf치가 유사한 것들을 모아 8개의 소분획을 얻고 이중에서 인체 암세포에 대한 독성 및 항균활성을 나타내는 세분획(I,Ⅱ,Ⅲ)을 얻는 단계; 상기 각 분획들을 각각 순차적인 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스(Sephadex)LH-20 컬럼 크로마토그래피, ODS(Octadodesylsilane)컬럼 크로마토그래피 및 실리카겔 TLC등을 통하여 분리한 후 최종적으로 HPLC를 이용하여 본 발명 화합물 다비디아논 A, B, C, D, E, F, G, I 및 J를 정제하는 단계; 상기 n-헥산 조추출물로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, ODS컬럼 크로마토그래피, HPLC를 거쳐 다비디아노 H를 정제하는 단계: 상기 정제된 다비디아논 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 화합물을 용해성, 융점, 고유 광회전도 UV-visible 스펙트럼, 적외선 스펙트럼, 질량스펙트럼, 핵자기 공명 스펙트럼을 통하여 구조와 분자식을 결정하는 단계; 상기 본 발명 화합물질 다비디아논 A, C, G, H, I, J의 인체 암세포, 섬유아세포(fibroblast) 및 간세포에서의 세포독성을 측정하는 단계; 상기 화합물을 한천배지희석 방법에 의거하여 항균활성을 측정하는 단계; 혈소판 응집 억제 작용 측정방법을 이용하여 항염증 활성을 측정하는 단계 및 쥐의 간에서 분리한 마이크로좀을 지질원으로 하여 지질 과사화 억제 활성의 측정하는 단계로 구성된다.
본 발명의 실험재료인 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)의 근피는 1998년 5월 경남 양산군 소재 원효산에서 채취하여 사용하였다.
상기 단계에서 세포독성 시험에 사용된 암세포주는 미국 국립암연구소에서 분양 받은 후 한국 과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자원센터에서 관리, 유지되고 있는 인체 암세포주들을 사용하였다.
상기 단계에서 항균활성 검정에 사용된 검정균은 한국 과학기술 연구원 부설 생명 공학 연구소의 유전자원센터로부터 분양 받아 사용하였다.
본 발명의 화합물은 당느릅나무 함유 성분의 분리 및 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.
본 발명 화합물은 당느릅나무 또는 그의 동속식물인 참느릅나무, 비술나무, 왕느릅나무, 큰잎느릅나무, 난티나무, 혹느릅나무, 느릅나무, 민느릅나무, 둥근참느릅나무, 좀참느릅나무에서 분리 추출하여 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 당느릅나무로부터 신규한 화합물 제조
당느릅나무 근피로부터 10종의 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)화합물의 분리 및 정제 과정을 도 1에 나타내었다. 즉, 음건하여 세절한 당느릅나무의 근피 4kg을 80% 메탄올 30L에 2일간씩 침지시켜 2회 반복 추출하고 감압 농축하여 메탄올 추출물 185g을 얻었다. 이것을 증류수 5L에 현탁하고 n-헥산 10L를 가한 후분액깔대기를 사용하여 수회 추출하여 헥산 추출물 8.7㎏을 얻었으며, 나머지 수층을 다시 클로로포름으로 추출하여 6.4g의 클로로포름 추출물을 얻었다. 상기 클로로포름 추출물 6.4g을 실리카겔 컬럼상에서 CHCl3-MeOH(500:1)의 혼합 용매로부터 메탄올 비율을 증가하면서 용출시킨 후 활성분획은 다시 실리카겔 박층 크로마토 그래피(TLC)에서 Rf치가 유사한 것들을 모아 8개의 소분획으로 나누었으며, 이중에서 인체 암세포에 대한 독성 및 항균활성을 나타내는 세 분획(분획Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)을 얻었다. 상기 분획Ⅰ을 실리카겔(Merck 60,70 - 230 mesh)컬럼 크로마토그래피를 실시하여 CHCl3-MeOH(100:1)로 용출시켜 얻은 조시료를 CHCl3-MeOH(1:1)용매로 포화된 세파덱스 LH-20(Pharmacia, 25-100㎛)컬럼을 통과시켜 365㎚의 장파장 자외선 하에서 형광을 나타내는 물질과 TLC상에서 보라색을 나타내는 물질이 혼합된 시료 260㎎을 분획하였다. 이것을 CHCl3-MeOH(1:1)에 녹여 ODS(YMC Co 60-230/70㎛) 수지와 혼합한 후 건조시켜 분말로 만든 다음 40% 메탄올로 평형화된 ODS컬럼에 얹어 40% 메탄올 및 60% 메탄올로 각각 용출시켰다. 이중 60% 메탄올 분획(176㎎)을 실리카겔 TLC를 행하였다. 이때 CHCl3-MeOH(60:1)을 전개 용매로 하여 Rf치가 큰 순서대로 밴드Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ를 각각 분리하였다. 이들 4개 band를 75%(밴드Ⅰ), 65%(밴드Ⅱ), 70%(밴드Ⅲ) 및 80% 메탄올(밴드Ⅳ)을 용매로 하여 각각 HPLC를 실시하여 밴드 Ⅰ으로부터 다비디아논 G(96.3㎎)를, 밴드 Ⅱ로부터 다비디아논 B(1.9㎎)를, 밴드 Ⅲ로부터 다비디아논 A(96.3㎎)를, 그리고 밴드 Ⅳ로부터는 다비디아논 D를 각각 분리하였다.
분획 Ⅱ(114㎎)를 실리카겔 (Merck 60,70-230 mesh)컬럼상에서 CHCl3-MeOH 60:1로부터 5:1까지 메탄올의 비율을 증가시키면서 용출하였다. CHCl3-MeOH(20:1)에서 용출된 분획을 모아 감압 농축한 다음, 세파덱스(Sephadex) LH-20(Pharmacia, 25∼100㎛)컬럼 크로마토그래피하여 38mg의 조시료를 얻었다. 이것을 CHCl3-MeOH (30:1)을 전개용매로 한 실리카겔 TLC 실시하여 Rf 0.35의 band를 분리하였으며, 마지막으로 HPLC(58% MeOH, 7㎖/min)를 실시하여 전개시간(retenction time) 26.2분에서 다비디아논 E, 다비디아논 F의 혼합물 2.3㎎을, 전개시간 27.5분에서 14.5㎎의 다비디아논 I를 각각 분리하였다. 한편, NMR분석후 다비디아논 E와 F의 혼합물로부터 각각 0.6 및 0.2㎎을 순수 분리하여 이들의 물리화학적 특성조사에 사용하였다.
분획 Ⅲ(160㎎)을 세파덱스 LH-20컬럼을 통과시켜 얻은 분획들 중 보라색을 띠는 분획과 짙은 갈색을 나타내는 두 분획을 취하여 전자를 CHCl3-MeOH(25:1)을 전개용매로한 실리카겔 TLC로 Rf 0.34의 밴드로 분리한 다음 HPLC(65% MeOH, 7㎖/min)를 실시하여 다비디아논 C 12.2㎎을 분리하였다. 한편 상기의 짙은 갈색 분획은 CHCl3-MeOH(20:1)을 전개용매로 한 실리카겔 TLC를 행하여 Rf 0.33의 band를 분리한 다음 HPLC(58% MeOH, 7㎖/min)를 실시하여 10.3㎎의 다비디아논 J를 분리하였다.
한편, n-헥산 추출물 8.5g은 15g의 실리카겔과 혼합하여 분말로 만든 다음실리카겔 컬럼상에서 n-hexane-EtOAc 50:1로부터 1:1 까지 에틸아세테이드의 비율을 증가시키면서 용출시켰다. n-hexane-EtOAc (25:1)에서 용출된 유액상태의 조시료를 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 CHCl3-MeOH 혼합용매로 500:1에서 10:1까지 용출시킨 다음, CHCl3-MeOH(150:1)의 용매에서 용출된 활성분획을 1.1g 얻었다. 이것을 다시 클로로포름에 녹인 후 4g의 ODS 수지와 혼합한 후 건조시켜 분말로 만든 다음 40% 메탄올로 평형화시킨 ODS(YMC Co. 60-230/70㎛)컬럼에 얹어 40% 메탄올 및 60% 메탄올로 각각 용출시켜 60% 메탄올에 용출된 황적색 분획 286㎎을 모았다. 이것을 HPLC(70% methanol,7ml/ min/RT 16.7 min)를 하여 순수한 다비디아논 H 96.3㎎ 분리하였다.
실시예 2: 본 발명 다비디아논 A, B, C, D 및 G 화합물의 물리화학적 특성
상기 실시예 1에서 얻은 본 발명 화합물 다비디아논 A, B, C, D 및 G의 물리화학적 특성을 조사하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.
다비디아논 A는 클로로포름, 메탄올, DMSO 등에는 잘 녹으나 n-헥산, 에틸아세테이트 및 물에는 녹지 않으며, 융점은 187℃였다. 분자식은 HREI-MS (실측치: 300.0994, 계산치:300.0997) 및1H,13C-NMR 스펙트럼의 분석결과 C17H16O5로 결정되었다. IR 스펙트럼에서는 상기의 공통적인 흡수 band 외에는 알칸의 C-H stretching에 의한 것으로 사료된 2,923 및 2,852cm-1의 흡수 band가 관찰되었을뿐 특징적인 흡수 밴드는 관찰되지 않았다. HREI-MS 스펙트럼에서는 m/z 200{M+], 285[M-Me]+, 272[M-CO]+,241[M-CO-MeO]+등의 fragment ion 피이크들이 관찰되어 카르보닐 및 메톡시(methoxy)기의 존재를 추정하였다.
다비디아논 B는 용해성은 다비디아논 A와 유사하였으며, 융점은 다른 다비다아논 화합물들에 비하여 다소 높은 203℃였다. 분자식은 HREI-MS결과 (실측치: 284.0686, 계산치:284.0685) 및1H-,13C-NMR스펙트럼의 분석에 의하여 C16H12O5로 결정되었다. 한편, IR(KBr)스펙트럼에서는 상기의 공통적인 흡수 band 외에 1737cm-1에서 에스테르결합을 이루는 C=O의 stretching에 의한 것으로 추정되는 강한 흡수 밴드가 특징적으로 관찰되었다. HREI-MS 스펙트럼에서는 m/z 286 [m+2]+, 284[M+], 256 [M-CO]+,254[M-2Me]+, 253[M-MeO]+, 241[M-CO-Me], 226[MO-CO-2Me], 213[M-2CO-Me]+, 197[M-2Co-MeO]+, 196[M-2CO-MeO-H]+의 fragment ion 피이크들이 관찰되었다. 따라서 본 화합물에는 퀴논(quinone)의 카르보닐기 이외에 에스테르 결합을 이루는 카르보닐기와 메톡시(methoxy)기가 존재하는 것으로 추정하였다.
다비디아논 C는 DMSO에는 잘 녹으나 n-헥산, 클로로포름, 메탄올 에틸아세테이트 및 물 등에는 녹지 않는 융점 248℃의 화합물이었다. 질량수는 EI-MS에 의하여 256 [M]+로 결정되었으며, 분자식은 HREI-MS의 결과 (실측치:256.0751,계산치:256.0736) 및1H-,13C-NMR 스펙트럼의 분석에 의하여 C15H14O3로 밝혀졌다. IR 스펙트럼에서는 전술한 공통적인 흡수밴드외에 O-H stretching에서 유래한 3380 cm-1의 강한 흡수 밴드 및 HREI-MS 스펙트럼에서 [M-CO-OH]+의 fragment ion으로 추정되는 211 피이크의 출현으로부터 수산기의 존재를 확인하였으며, 이러한 수산기는 알칼리 조건하에서 UV-visible 스펙트럼의 불변으로 미루어 적어도 페놀성은 아닐것으로 추정하였다. 그리고 HREI-MS 스펙트럼상에서 관찰된 각 피이크들은 m/z 258[M+2]+, 256[M+], 228[M-CO]+,211[M-CO-OH]+의 fragment ion들로 추정되었다.
다비디아논 D 또한 다비디아논 A와 유사한 용해성을 갖는 융점 143℃, 질량수 270의 화합물로서 분자식은 HREI-MS결과(실측치:270.0905, 계산치:270.0892) 및 NMR 분석에 의하여 C16H14O4로 밝혀졌다. IR스펙트럼은 다비디아논 A와 같이 이들 화합물에서 공통적으로 나타나는 흡수 band 이외에는 다른 특징적인 것은 관찰되지 않았다. 한편, HREI-MS 스펙트럼에서는 m/z 272 [M+2]+, 270[M+], 255 [M-Me]+, 240[M-2Me]+, 239[M-MeO]+, 212[M-CO-2Me]+, 211[M-CO-Me0]+, 199[M-2CO-Me]+등의 fragment ion 피이크들이 관찰됨으로써 본 화합물 역시 카르보닐기와 메톡시(methoxy)기를 포함하고 있음을 추정케 하였다.
다비디아논 G는 융점 215℃, 분자식은 C15H12O3(HREI-MS ; 실측치:240.0075, 계산치:240.0786)으로 결정되었다. 한편, IR 스펙트럼에서는 다른 화합물들과 공통적으로 나타나는 1683, 1629, 1600 및 1577cm-1D의 강한 흡수 band 와 2900 ㎝-1대의 알칸 C-H stretching이 관찰되었을 뿐 다른 특징적인 흡수 band는 나타나지 않았다. HREI-MS 스펙트럼에서는 m/z 242 [M+2]+, 240 [M+], 212 [M-CO]+,195 [M-CO-Me-2H]+, 169[M-CO-CO-Me]+, 141[M-99]+의 fragment ion들이 관찰되었다.
이상의 5개 화합물들의 물리 화학적 특성을 종합해 보면 이들은 거의 일치하는 UV-visible 스펙트럼을 보임으로써 동일한 발색단을 갖는 o-나프토퀴논(o-naphthoquinone)화합물들로서, 분자량이 가장 작은 다비디아논 G에 비하여 다비디아논 A에는 산소원자하나가 더 존재하며 이것은 수산기로 존재하는 것으로 추정되었다. 그리고 다비디아논 B는 탄소 1원자 및 산소 2원자에 해당되는 질량수 60이 더 크며 메톡시(methoxy)기를 포함하고 있는 화합물, 다비디아논 D 또한 메톡시(methoxy)기를 포함하고 있으면서 탄소 및 산소 각 1원자, 수소 2원자씩이 더 존재하는 화합물로 각각 추정되었다.
본 발명 다비디아논 A, B, C, D 및 G의 물리화학적 특성
다비디아논 A 다비디아논 B 다비디아논 C 다비디아논 D 다비디아논 G
외관 보라색 침삼 보라색 침상 보라색 침삼 보라색 침상 보라색 침상
녹는점 187 ℃ 203 ℃ 248 ℃ 143 ℃ 215 ℃
EIMS(m/z) 300 (M+) 284 (M+) 256 (M+) 270 (M+) 240 (M+)
HREIMSfoundcald 300.0994300.0997 284.0686284.0685 256.0751251.0736 270.0905270.0892 240.0775240.0786
분자식 C17H1605 C16H1205 C15H12O4 C16H1404 C15H1203
UVλ maxMeOHnm(logξ) 234(4.16),255(sh)336(3.54),570(3.54) 232(4.07), 255(sh)344(3.18)570(3.06) 232(4.48)255(sh)336(3.58)548(3.61) 234(4.42)255(sh)330(3.54)553(3.53) 234(4.48)255(sh)336(3.60)558(3.64)
IR ｖ㎝-1 2923, 2852,1737, 1689,1635, 1604,1583, 1321,1259, 1189,1155, 1124,1097, 1045 2956, 2923,2852, 1737,1695, 1627,1604, 1577,1380, 1366,1292, 1228,1191, 1147 3380, 1681,1623, 1597,1565, 1380,1330, 1243,1191,1160 2921, 28521684, 1628,1600, 1577,1249, 1207,1189, 1155,1124 2954, 2921,2852, 1683,1629, 1600,1577, 1376,1330, 1245,1189, 1160,
용해도용매불용매 CHCl3,메탄올,DMSOn-헥산,EtOAc,물 CHCl3, 메탄올,DMSOn-헥산,EtOAc,물 DMSOn-헥산,CHCl3 ,MeOH,EtOAc,물 CHCl3,메탄올,DMSOn-헥산,EtOAc,물 CHCl3,메탄올,DMSOn-헥산,EtOAc,물
실시예 3: 본 발명 다비디아논 E, F, H, I 및 J 화합물의 물리화학적 특성
상기 실시예 1에서 얻은 본 발명 화합물 다비디아논 E, F, H, I 및 J의 물리화학적 특성을 조사하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
다비디아논 E 와 F는 조사된 물리화학적 성질들이 서로 거의 일치하였다. 즉 이들은 각각 융점 148℃ 및 150℃의 오렌지색 침상으로서, IR 스펙트럼은 다비디아논 화합물들의 공통적 흡수 밴드와 함께 나타난 3,470 ㎝-1부근의 O-H의stretching band 등을 포함하여 거의 일치하였다. 다비디아논 E의 HREI-MS 분석 결과 (실측치:258.0682, 계산치: 258.0892) 질량수 및 분자식은 258과 C15H14O4이었다. 다비디아논 E의 HREI-MS 스펙트럼 및 다비디아논 F의 저분해능 EI-MS에서는 m/z 258[M+], 243 [M-Me]+, 230 [M-CO]+, 215[M-CO-Me]+, 201[M-2CO-H]+, 187[M-2CO-Me]+등의 fragment ion들이 관찰되었다.
다비디아논 H 또한 융점 148℃의 오렌지색 침상으로서, 분자식은 HREI-MS(실측치:242.0993, 계산치:242.0943) 및 NMR분석결과, C15H14O3로 결정되었다. 메탄올 상에서 측정한 고유 광회전도는 ([α]D 22)는 +72.4°로서 광학 활성을 보여 분자내 chiral center의 존재를 시사하였다. UV-visible스펙트럼은 다비디아논 E,F 및 H와 유사하였으나, IR 스펙트럼에서는 이들과는 달리 수산기의 존재를 시사하는 특징은 나타나지 않았으며, 용해성에 있어서도 클로로포름에 잘 용해됨으로써 이들에 비해 비극성이었다. 한편 HREI-MS 스펙트럼상의 각 피이크들은 244[M+2]+, 242 [M]+, 214 [M-CO]+, 199[M-CO-Me]+, 186[M-CO-CO]+, 171[M-CO-CO-Me]+fragment ion들로 해석하였다.
다비디아논 I는 융점 215℃의 화합물로서 그 물리화학적 특성은 다비디아논 E 및 F와 거의 일치하였다. 즉, 분자식은 이들과 동일한 C15H14O4였으며, IR 스펙트럼에서도 특징적인 차이를 발견할 수 없었다. 따라서 본 화합물도 다비디아논 E 및F와 구조 이성질체일 것으로 추정하였다. HREI-MS 스펙트럼상의 각 피이크들은 m/z 258[M]+, 243 [M-Me]+, 230 [M-CO]+, 212[M-CO-H20]+, 201[M-2CO-H]+, 187[M-2CO-Me]+로 해석되었다.
다비디아논 J는 융점 162℃의 진한 갈색 편상으로서 질량수, 분자식, IR 스펙트럼 및 용해성 등의 여러 가지 물리화학적 특성이 다비디아논 E, F 및 I와 유사하였으나 상이한 UV-visible 및 알카리에 의한 bathochromic shift로 미루어 본 화합물에 존재하는 수산기는 발색단에 결합된 페놀성인 것으로 추정되었다. EIMS 스펙트럼상에서는 m/z 260[M+2]+, 258[M]+, 243[M-CO]+, 230[M-CO]+, 215[M-CO-Me]+, 202[M-2CO]+, 187[M-2CO-Me]+등의 이온 절편(fragment ion)이 관찰되었다.
이상의 물리화학적 특성들을 종합한 결과 본 항에서 기술된 5종의 화합물들은 모두 o-나프토퀴논(o-naphthoquinone)화합물의 특징을 보였으며, 다비디아논 E, F, I 및 J는 분자식이 C15H14O4로서 다비디아논 H(C15H14O4,MW=242)에 비하여 수산기로 존재하는 것으로 추정되는 산소 1원자가 더 많은 구조 이성질체로 해석되었다.
본 발명 다비디아논 E, F, H, I 및 J의 물리화학적 특성
다비디아논 E 다비디아논 F 다비디아논 H 다비디아논 I 다비디아논 J
외관 오렌지색침상 오렌지색침상 오렌지색침상 오렌지색침상 진한갈색편광
녹는점 148 ℃ 150 ℃ 148 ℃ 215 ℃ 162 ℃
[α]22(MeOH) +72.4°(c 1.24) +111.4°(c 0.43) +136.5(c 0.24)
EIMS(m/z) 258 (M+) 258 (M+) 242 (M+) 258 (M+) 258 (M+)
HREIMSfoundcald 258.0862258.0892 242.0933242.0943 258.0902258.0892
분자식 C15H1404 C15H1404 C15H14O3 C15H1404 C15H1404
UVλ maxMeOHnm(logξ) 220(3.82),265(4.08),374(2.91),448(3.00) 220(3.86),265(4.13),373(2.95),448(3.01) 220(3.87),264(4.15),370(2.99),448(3.03) 220(3.85),265(4.10),373(2.96),448(3.01) 220(3.95),274(3.91),298(3.64),389(3.48)
IR ｖ㎝-1 3471, 2570,1681, 1635,1610, 1579,1434, 1380,1305, 1282,1238, 1176 3470, 2570,1679, 1635,1610, 1580,1434, 1379,1305, 1283,1235, 1176. 2965, 2926,2855, 1690,1640, 1610,1584 3436, 2962,2927, 2854,1685, 1629,1610, 1575 3430, 2927,2869, 1691,1662, 1639,1610, 1583
용해도용매불용매 메탄올,DMSOn-헥산,EtOAc,CHCl3,물 메탄올,DMSOn-헥산,EtOAc, CHCl3,물 CHCl3DMSO메탄올n-헥산,EtOAc,물 MeOH,DMSOn-헥산,CHCl3,EtOAc,물 MeOH,DMSOn-헥산,CHCl3,EtOAc,물
실시예 4 : 본 발명 화합물 다비디아논 A의 화학구조
화합물 다비디아논 A의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,13C NMR, DEPT, FG-HMQC 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과, 다비디아논 A의1H NMR스펙트럼(도 2a)에서는 4개의 methine프로톤(7.61, 7.98, 7.09 및 6.15ppm) 및 2개의 메틸 프로톤(1.97 및 2.12ppm) 시그널과 함께 3.53ppm에서 중첩된 2개의 메톡시(methoxy) 시그널 등을 비롯하여 총 16개의 프로톤의 존재가 확인되었다. 7.61ppm 과 7.98ppm의 두 방향족 이중선 메틴 (doublet methine) 프로톤들은 그들의 결합상수(coupling constant)(J=8.3 Hz)로부터ortho결합을 하고 있음을 알 수 있었다. 1.97ppm의 단선(singlet) 메틸(프로톤은 chemical shift로부터 올레핀성 탄소 또는 방향족 고리에 결합되어 있는 것으로 해석되었다. 한편, 저자장영역인 7.09ppm 올레핀성 메틴(methine) 프로톤은 2.12ppm의 메틸 프로톤과 알릴기 결합(allylic coupling)(J=1.2 Hz)을 하여 doublet로 나타남으로써 -C(CH3)=CH-O-의 부분구조가 존재함을 시사하였다. 그외에 6.15ppm의 coupling을 하지 않는 1개의 단선 메틴(singelt methine) 프로톤이 관찰되었는데, 그 chemical shift로 미루어 3.53ppm의 중첩된 2개의 메톡시 프로톤과 함께 아세탈을 이루고 있을 것으로 추정하였다.
13C-NMR 스펙트럼(도 2b)에서는 총 16개의 시그널들이 관측되었으나,1H-NMT의 적분치로 볼 때 56.5ppm 에는 2개의 메톡시 탄소에서 유래하는 시그널이 중첩되어 있는 것으로 판단되어 총 탄소수는 17개로 결정되었으며, 이는 HR-EIMS에서 얻어진 분자식을 뒷받침하였다. 179.0 및 181.7ppm의 탄소 시그널은 chemical shift 로부터 카르보닐기 탄소로 해석되었으며 전술한 화합물의 물리 화학적특성에서 추정하였던 o-나프토퀴논(o-napthoquinone)의 구조 중ortho-quinone단위를 구성하는 것으로 사료되었다.
DEPT 스펙트럼을 분석한 결과 이들 탄소들 중 129.1, 130.7ppm 및 101.5ppm은 메틴(methine) 탄소, 7.7, 12.9, 56.5ppm은 메틸 탄소임이 확인되었으며, 특히 56.5ppm 및 101.5ppm의 탄소 시그널은 그들의 chemical shift로부터 각각 메톡시(methoxy) 및 아세탈 구조에서 유래하는 것으로 추정되었다. 한편, 161.8ppm의 저자장에서 관측된 탄소는 산소와 직결합한 sp24급탄소로 추정되었다.
FG-HMQC 스펙트럼을 분석한 결과, 56.5ppm은 메톡시(methoxy) 탄소, 101.5 ppm은 6.15ppm의 메틴(methine) 프로톤과 결합한 아세탈의 구조를 갖는 탄소임이 확인되었다. 메틸 프로톤들인 1.97ppm과 2.12ppm은 각각 7.7ppm과 12.9ppm의 메틸 탄소와 결합되어 있으며, 129.1ppm 및 130.7ppm의 메틴(methine) 탄소는 각각 7.61ppm 및 7.98ppm의 방향족 프로톤과 결합하고 있음을 알았다.
다비디아논 A 화합물의 완전한 화학구조 결정은 FG-HMBC 스펙트럼(도 3a)의 분석을 통하여 결정되었으며,그 해석 결과인1H-13C long-range correlation을 도 3b에 나타내었다. 9-Me의 메틸 프로톤(1.97ppm)으로부터 sp24급탄소들인 C-8(179.0ppm), C-9(113.5ppm), 및 C-9a(161.8 ppm)에 long-range coupling이 관찰되었다. 이들 탄소의 chemical shift로부터 C-8은 카르보닐기 탄소, C-9a는 산소와 결합한 sp24급탄소임이13C-NMR에서 이미 해석되었다. 또한, C-2(141.4ppm)의 메틴(methine) 프로톤(7.09ppm)으로부터 C-9a에 C-H long-range coupling이 관찰되어 C-9a와 C-2사이에 산소가 위치하는 에테르결합이 입증되었다. 3-Me 의 메틸 프로톤(2.12 ppm)으로부터 C-3a (131.3ppm)에, 그리고 C-4(129.1 ppm)의 방향족 메틴 프로톤(7.61ppm)으로부터는 각각 C-3 (112.2ppm)와 C-9b(124.2ppm)에 long-range coupling이 관찰되어 C-3a와 C-4 및 C-9b의 결합 위치가 결정되었다. 또한, C-4의 방향족 프로톤은 C-6의 방향족 프로톤은 C-6과도 coupling을 보임으로써 C-6의 결합위치가 결정되었다. 그리고 C-4의 프로톤과orthocoupling을 하는 C-5(130.7ppm)의 방향족 프로톤(7.98ppm)과는 C-6(101.5 ppm)의 메틴(methine) 탄소 및 C-6a(126.3ppm)의 4급탄소와 각각 long-range coupling을 함으로써 C-5의 meta 위치에 6.15ppm의 아세탈을 구성하는 메틴이 결합되어 있는 것을 알 수 있었다. 그리고, 이 6.15ppm의 프로톤은 다시 C-5(130.7ppm) 및 C-6a(126.2ppm)와 long-range coupling을 나타냄으로써 C-6a의 귀속이 결정되었다. 또한 6.15ppm의 메틴(methine) 프로톤으로부터는 C-6″과 C-6″′(56.5ppm)의 메톡시(methoxy) 탄소와의 coupling도 관찰되었으며, 역으로 메톡시(methoxy) 프로톤과 C-6′의 메틴(methine) 탄소와 각각 long-range coupling을 함으로써 메톡시(methoxy)기의 결합 위치가 결정되었다.
본 화합물은 비교적 작은 분자량을 갖는 화합물에 속하나 그에 비하여 4급탄소가 많은 관계로 FG-HMBC스펙트럼의 해석으로부터 완전한 구조를 결정하기는 어려웠다. 즉, 퀴논 고리를 이루고 있는 C-7과 C-8, C-9b와 C-9a, 및 C-6a등의 4급탄소들간의 결합은 FG-HMBC기법으로 직접 입증될 수는 없다. 그러나 C-7(182.2ppm)과 C-8(180.2ppm)의 카르보닐기 탄소는 여러가지 물리화학적 특성으로부터o-퀴논(o-quinone)을 이루고 있는 것으로 추정되었을 뿐만 아니라, C-8만이 1.97ppm의 메틸프로톤과 long-range coupling를 나타냄으로써 서로 직접 결합된o-퀴논을 형성하고 있음을 알 수 있었다. 또한 제거의 과정에 의하여 C-9a와 C-9b와 C-6a가 각각 연결되어 있음을 알 수 있었다. 한편, 6.15ppm의 메틴(methine) 프로톤을 irradiaion하여 측정한 NOEDF스펙트럼에서는 3.53ppm의 메톡시(met 매우 근접해 있음을 알 수 있었다.
이상의 구조 해석 결과, 다비디아논 A의 구조는 하기 일반식[Ⅰ]에 나타낸 바와 같이 6-디메톡시메틸-3,9-디메틸-나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온으로 최종 결정되었으며, 신규 화합물임이 확인되었다.
……[Ⅰ]
실시예 5 : 본 발명 화합물 다비디아논 B의 화학구조
화합물 다비디아논 B의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR, FG-HMQC 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과,1H-NMR(도 4a) 스펙트럼에서는 다비디아논 A의 헤테로싸이크릭 고리(heterocyclic ring)에 결합되어 있는 프로톤들과 동일한 chemical shift 및 스핀 결합형식을 갖는 메틸 프로톤(2.11ppm) 및 메틴 프로톤(7.09ppm)과 함께ortho-coupling하고 있는 두 방향족 메틴 프로톤(7.52ppm, 7.58ppm)이 관찰되었다. 그러나 다비디아논 A와는 달리 6.15ppm의 메틴(methine) 프로톤이 관찰되지 않았으며, 3.96ppm에서 1개 메톡시(methoxy) 프로톤만이 관측되었다. 따라서 본 화합물은 다비디아논 A와 동일한 헤테로싸이크릭 고리(heterocyclic ring)을 가지 화합물로서 그 구조가 서로 매우 유사한 것으로 추정되었다.
다비디아논 B는 본 식물의 미량 성분으로서 그 정제된 양(1.9㎎)이 적어 통상적인13C-NMR측정 방법으로는 탄소 시그널의 관찰이 어려워 field gradient 2차원 NMR을 이용하여 S/N을 증가시키고 감도를 높이는 기법을 이용하여 각 탄소를 규명하였다. 즉, FG-HMQC 스펙트럼의 각 교차 피이클로부터 프로톤과 직결합된 탄소들을, 그리고 FG-HMBC스펙트럼의 long-range coupling을 하는 각 교차 피이크들로부터는 4급탄소 및 그들의 결합 위치를 구명할 수 있었다.
FG-HMQC 스펙트럼(도 4b)의 분석 결과는 다비디아논 A와 매우 유사하였다. 즉, 1.97 및 2.11ppm의 methyl 프로톤은 각각 7.6 및 12.8ppm의 탄소와, 7.09ppm의 메틴 프로톤은 141.9ppm의 탄소와 결합하고 있으며, 3.96ppm의 메톡시 프로톤 또한 53.4ppm의 탄소와의 결합하고 있음이 확인되었다. 또한 7.52 및 7.58ppm의 두 방향족 프로톤도 다비디아논 A와 같은 128.9 및 130.3ppm의 탄소와의 결합이 관측됨으로써 프로톤과 직접 결합하고 있는 모든 탄소들이 규명되었다.
FG-HMBC 스펙트럼(도 5a) 및 그 해석 결과 나타난1H-13C long-range correlation을 도 5b에 나타내었다. 2.11ppm의 이중선(doublet) 메틸 프로톤으로부터 117.7(C-3), 132.1(C-3a) 및 141.9ppm(C-2)의 탄소에, 그리고 7.09ppm의 메틴 프로톤은 161.0ppm(C-9a)에 각각 long-range coupling을 나타냄으로써 헤테로싸이클릭 고리(heterocyclic ring)을 구성하는 탄소들이 확인되었으며, 이들의 결합 위치도 결정되었다. 그리고o-coupling을 하는 두 방향족 프로톤 중 7.58ppm의 프로톤은 다비디아논 A에서와 같이 111.7(C-3), 124.0(C-9b)와 함께 4급탄소인 C-6의 137.0ppm과 coupling을 나타내었으며, 7.52ppm 프로톤은 C-6'(168.6ppm)의 에스테르 결합을 형성하는 카르보닐기 탄소 및 C-6과 coupling을 함으로써 이들 탄소의 귀속이 결정되었다. 한편, 1.97ppm의 메틸 프로톤으로부터도 178.0ppm(C-8)의 카르보닐기 탄소 및 sp24급탄소인 114.3ppm(C-9) 및 161.0ppm(C-9a)과의 long-range coupling이 관찰되었다. 이상으로 총 15개의 탄소가 확인되고 그 결합 위치가 밝혀졌다. 그러나 본 FG-HMBC스펙트럼으로부터는 C-7의 카르보닐기 탄소와의 long-range coupling이 관찰되지 않음으로써 그의 존재를 본 스펙트럼에 의하여 입증할 수는 없었으나, 스펙트럼 측정시 pulse interval을 통상적인 60ms에서 120ms로 늘려 측정한 FG-HMBC스펙트럼에서 5-C의 방향족 프로톤(7.52ppm)으로부터 C-7의 카르보닐 탄소(179.0ppm)에 4-bond long-range correlation이 관측됨으로써 C-7의 chemical shift 및 그 결합위치가 규명되었다.
이상으로 다비디아논 B는 분자식 C16H12O5로 구조는 하기 일반식[Ⅱ]에 나타낸 바와 같이 6-메톡시카보릴-3,9-디메틸나프토(1,8-BC)-7,8-디온으로 결정되었다. 본 화합물은 다비디아논 A의 2개의 메톡시(methoxy) 중 하나가 탈메틸화 (demethyla-tion)된 화합물로서, 역시 신규 화합물로 판명되었다.
……[Ⅱ]
실시예 6 : 본 발명 화합물 다비디 아논 C 의 화학구조
화합물 다비디아논 C의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,1C NMR, FG-HMQC및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과,1H-NMR스펙트럼(도 6a)을 해석한 결과 상기 두 화합물에서와 같은ortho-coupling을 하는 방향족 프로톤(7.70ppm, 7.73ppm), 메틴 프로톤(7.28ppm), 및 두 개의 메틸 프로톤(2.00ppm, 2.78ppm)이 관측되었다. 그러나 헤테로싸이클릭 고리(heterocyclic ring)에 결합되어 있는 메틸프로톤이 나타나지 않은 반면 메틸렌의 두 프로톤이 각각 4.65ppm에서 doublet으로 관측되었다. 한편, 본 다비디아논 C에서 메톡시 프로톤이 관찰되지 않은 대신 2.78ppm에서 메틸 프로톤이 새롭게 관측되었으며, 매우 강하게 deshielding 되어 저자장에서 나타난 것으로 미루어 퀴논(quinone)의 카르보닐기에 대해peri위치에 존재하는 것으로 추정되었다.
13C-NMR스펙트럼(도 6b)에서는 총 15개의 탄소 시그널들이 관측되었다. 두 개씩의 카르보닐 탄소(182.5 및 178.7ppm) 및 방향족 탄소 (130.4ppm 및 137.6ppm)를 비롯하여 7.7ppm의 메틸 탄소와 함께 다비디아논 A의 탄소들과 chemical shift가 유사한 4급 탄소들이 관찰되었다. 한편, 58.3ppm의 탄소는 그 chemical shift로 미루어 물리화학적 특성으로부터 그 존재가 추정되었던 수산기가 결합되어 있는 메틸렌(methylene)탄소로 해석됨으로써 본 화합물의 헤테로싸이클릭 고리는 C(CH2OH)=CH-O- 로 구성되어 있는 것으로 추정되었다. 그리고 23.4ppm에서 새로이 관측된 2.78ppm의 메틸 프로톤이 결합되어 있는 것으로 해석되었다. 이상의1H 및13C-NMR 분석결과, 본 화합물의 구조는 다비디아논 A의 cyclic고리에 결합된 메틸기가 수산화(hydroxylation)되어 있으며, 새로이 관찰된 메틸기가 아세탈 moiety 대신 결합되어 있는 것으로 추정되었다.
본 화합물은 메탄올 또는 클로로포름에는 잘 녹지 않았기 때문에 HMQC 및 HMBC 스펙트럼은 CDCl3-CD3OD(3:2)를 용매로 하여 측정하였다. 따라서 이들 2차원 NMR에서 관측된 각 프로톤 및 탄소 시그널들의 chemical shift는 CDCl3를 용매로 하여 측정한1H 및13C-NMR스펙트럼의 시그널들과 약간의 차이가 있었으나 이들의 구별이 가능하였다. 여기서는 각 시그널들의 chemical shift를 1차원 NMR시그널들의 chemical shift에 준하여 분석하였다.
HMQC스펙트럼에서 관찰된 프로톤과 탄소의 직결합은1H 및13C-NMR에서 해석에서 추정되었던 바와 같았다. 즉, 58.3ppm의 탄소는 4.65ppm의 메틸렌 프로톤과 결합되어 있는 메틸렌 탄소로서 그 chemical shift로 미루어 수산기가 결합되어 있는 것 임을 알 수 있었다. 한편, 2.78ppm의 저자장의 methyl 프로톤은 23.4ppm의 메틸 탄소와 직결합을 이루고 있음이 확인되었다, 그 외의 프로톤들이 2.00ppm의 메틸 프로톤, 7.28ppm 의 메틴 프로톤 및 7.70ppm과 7.73ppm의 두 방향족 프로톤들은 다비디아논 A 및 다비디아논 B에서와 유사한 7.7ppm, 143.1ppm, 136.6ppm, 및 130.4ppm과 각각 직결합하고 있음을 알 수 있었다.
HMBC 스펙트럼(도 7a) 및 그 해석결과 나타난1H -13C long-range correla tion을 도 7b에 나타내었다. C- 5(137.6ppm)의 방향족 프로톤(7.70ppm)은 C-6'(23.4ppm)의 메틸 탄소 및 126.5ppm의 4급 탄소(C-6a)에, 그리고 C-6'의 메틸 프로톤(2.78ppm)은 다시 C-7의 카르보닐기 탄소(182.5ppm)에 각각 long-range coupling을 함으로써 앞에서 추정되었던 바와 같이 C-6'의 메틸기는 카르보닐기 탄소에 대하여peri위치에 존재하고 있음이 입증되었다. 한편 58.3ppm(C-3CH2OH)에 결합된 하이드록시메틸의 두 메틸렌 프로톤(4.65ppm)으로부터 117.5ppm (C-3), 129.1ppm (C-3a) 및 143.1 ppm(C-2)에 2-bond 또는 3-bond의 long-range coupling이 관찰됨으로써, 본 하이드록시 메틸기는 C-3에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 이외의 메틴(7.28ppm) 및 메틸(2.00ppm) 프로톤들과 탄소의 long-range coupling은 다비디아논 A 및 B에서와 일치하였다.
이상의 NMR 분석결과, 다비디아논 C의 구조는 하기 일반식[Ⅲ]에 나타낸 바와 같이 3-하이드로메틸-6,9-디메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온으로 그 구조가 결정되었으며, 신규화합물로 밝혀졌다.
……[Ⅲ]
실시예 7 : 본 발명 화합물 다비디아논 D 의 화학구조
화합물 다비디아논 D의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,13C NMR, FG-HMBC 및 NOEDF 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과,1H-NMR 스펙트럼(도 8a)에서도 다비디아논 A의 헤테로싸이클릭 고리에 결합된 프로톤들과 같은 메틸 (2.15ppm) 및 methine 프로톤 (7.12ppm)과 함께, 나프토퀴논 고리(naphthoquinone ring)상의 메틸 프로톤 (1.99 ppm)과ortho-coupling을 하는 두 방향족 프로톤(7.63ppm, 8.01ppm)이 관측되었다. 그러나 다비디아논 A와는 달리 3.55ppm의 메톡시 프로톤 시그널은 그 적분치로부터 하나의 메톡시기만이 존재함을 알 수 있었으며, 4.93ppm의 메틸렌 프로톤은 coupling을 하지 않는 singlet로 관측되었다. 두 카르보닐기 탄소(181.7, 177.5 ppm)와 방향족 탄소(129.4, 130.4 ppm)등을 비롯하여13C-NMR(도 8b) 및 FG-HMQC 스펙트럼상에서 관측된 거의 모든 탄소들의 chemical shift 및 프로톤과 탄소의 직결합은 다비디아논 A와 매우 유사하였다. 한편, chemical shift로 미루어 메톡시 기가 결합되어 있는 것으로 판단되는 72.7ppm의 메틸렌 탄소가 다비디아논 A의 아세탈을 구성하는 메틴 탄소(101.5ppm)에 비하여 고자장에서 관측된 점으로 미루어 메톡시 하나만이 결합되어 있을 것으로 사료되었다. 따라서 본 화합물은 다비디아논 A의 C-6'에 결합된 두 메톡시(methoxy)기 중 하나가 결여된 구조를 갖는 것으로 추정되었다.
FG-HMBC스펙트럼(도 9a) 및 그 해석 결과, 다비디아논 D의1H -13C long-range correlation은 도 9b 에 나타낸 바와 같이 다비디아논 A에서와 거의 일치하였다. 본 화합물에서는 특히 C-6'의 메틸렌 프로톤으로부터 C-7의 카르보닐기 탄소에 4-bond long-range coupling이 나타남으로써 C-7의 결합 위치가 입증되었다. 통상적으로 HMBC는 2-bond 혹은 3-bond의1H-13C long-range coupling을 관측할 수 있는 기법이나, 본 연구에서는 field gradient를 사용하여 noise를 제거함으로써 S/N(signal-noise ratio)을 향상시킨 FG-HMBC기법을 이용하였으므로 이와 같은 4-bond1H-13C long-range coupling의 관찰이 가능하였다.
한편, NOEDF스펙트럼에서 4.93ppm의 메틸렌 프로톤이 3.55ppm의 methoxy 프로톤 및 8.01ppm의 방향족 프로톤과의 NOE를 나타냄으로써 이들 프로톤들이 공간에서 근접해 위치하는 것을 알 수 있었다.
이상으로 다비디아논 D의구조는 하기 일반식[Ⅳ]에 나타낸 바와 같이
다비디아논 D ; 6-메톡시메틸-3,9-디메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온으로 구조가 결정되었으며, 신규화합물로 밝혀졌다.
……[Ⅳ]
실시예 8 : 본 발명 화합물 다비디아논 E 및 F의 화학구조
화합물 다비디아논 B의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR, FG-DQF COSY, FG-HMQC, NOEDF 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과,1H-NMR 스펙트럼(도 10a)상의 각 시그널의 적분 값으로부터 두 화합물이 약 3:1의 비율로 혼합되어 있음을 알 수 있었으며, 이들 중 주성분을 다비디아논 E, 부성분을 다비디아논 F라고 명명하였다. 각 화합물의 프로톤 1개에 해당되는 7.66ppm과 7.72ppm의 방향족 프로톤 시그널의 적분 값을 비교한 결과, 각각 1.00 및 0.30 이었으며 이를 기준으로 각 프로톤에서 시그널들을 분석하였다. 그 결과 1.38(3H), 3.18(1H), 4.23(1H), 4.41(1H), 4.98(2H) 및 7.66ppm (1H)은 다비디아논 E의 프로톤에서 유래된 것임을 알 수 있었으며, 1.77(6H), 5.06(2H)과 7.72ppm (1H)은 다비디아논 F의 프로톤 시그널임을 알 수 있었다. 나머지 시그널들은 두 화합물의 프로톤 시그널들이 중첩되거나 근접해 나타난 것으로 판명되었다. 즉, 1.9ppm 부근의 적분값 4.35의 메틸 프로톤 시그널과 7.9ppm 부근의 적분치 1.4의 방향족 프로톤 시그널은 각각 다비디아논 E (1.91ppm, 7.92ppm)와 다비디아논F(1.89ppm, 7.91ppm)의 시그널들이 근접해 나타난 것임을 알 수 있었다.
다비디아논 E의 프로톤 시그널들을 분석한 결과, 전술한 모든 화합물들에서 공통적으로 나타났던 1.91ppm의 단선(singlet) 메틸 프로톤 시그널과 함께 7.66ppm 및 7.92ppm의 doublet 방향족 프로톤 시그널이 관측됨으로써 이들과 비슷한 나프토퀴논 고리 구조를 갖는 화합물로 추정되었다. 그리고 4.18ppm의 singlet로부터는 coupling을 하지 않는 메틸렌 프로톤의 존재를 알 수 있었다.
한편 3.10(m), 4.23(dd), 및 4.41ppm(dd)은 메틴 프로톤 시그널로서 각각 X, A, B의 ABX system의 coupling을 이루고 있으며, A와 B 프로톤은 서로간에 JAB=10.7 Hz의 geminal coupling을 하고 있는 메틸렌 프로톤임을 알 수 있었다. 또한, 이들은 3.10ppm의 프로톤과는 각각 5.1 Hz(JXA) 및 3.9 Hz(JXB)의 coupling constant로서 coupling하고 있었다. 그리고 1.38ppm의 이중(doublet) 메틸 프로톤은 3.10ppm의 메틴(methine)프로톤과 6.8Hz의 결합상수(coupling constant)로 coupling을 하는 이차(secondarty) 메틸 탄소로 해석됨으로써, 이들은 H3C-CH-CH2-O-의 부분 구조를 형성하고 있음을 알 수 있었다. 또한 FG-DQF COSY실험에 의하여 이들 각 프로톤들의 coupling을 조사한 결과, 메틴 프로톤은 메틸 프로톤 및 각 메틸렌 프로톤들과 coupling을 하고 있음이 확인되었다.
다비디아논 F에서는 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리를 구성하는 것으로 추정되었던 3.10, 1.38, 4.23 및 4.41ppm의 프로톤이 관찰되지 않은 반면 1.77ppm에서 중첩되어 나타난 2개의 메틸 프로톤이 관측되었다. 나머지 프로톤 시그널들은다비디아논 E와 유사하였다. 따라서 본 화합물은 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리(heterocyclic ring) 부위만이 변형된 구조를 갖는 것으로 추정되었다.
본 화합물들을 구성하는 탄소의 규명 및 그들의 결합을 통한 전체 구조의 결정은 다비디아논 B에서와 같이 HMQC와 HMBC스펙트럼의 분석에 의하여 수행되었다. HMQC 스펙트럼(도 10b)에서 다비디아논 E에 귀속되는 각 프로톤과 탄소의 결합의 1.37ppm의 이중선(doublet) 메틸 프로톤은 17.5ppm의 탄소에, 3.10ppm의 메틴 프로톤은 31.3ppm의 탄소에, 그리고 4.23 및 4.41ppm의 메틸렌 프로톤은 71.4 ppm의 탄소에 각각 결합되어 있음으로써 헤테로싸이클릭 고리(heterocyclic ring)을 형성하는 H3C-CH-CH2-O-의 부분구조가 확인되었다. 한편, 63.5ppm의 탄소에는 4.98ppm의 메틸렌 프로톤이 결합되어 있으며, chemical shift로 미루어 수산기가 결합되어 있는 탄소로 해석되었다. 나머지 방향족 프로톤 및 1.91ppm의 methyl 프로톤과 탄소의 결합은 전술한 화합물들과 거의 일치하였다. 다비디아논 F에서는 1.77ppm의 중첩된 두 메틸 프로톤이 27.1 ppm의 탄소와 결합되어 있음으로서 본 탄소 역시 두 개의 메틸 탄소가 중첩되어 있음을 알 수 있었다. 한편 7.72 및 7.91ppm의 두 방향족 프로톤은 각각 128.4, 131.3ppm의 탄소와, 5.06ppm의 메틴(methine) 프로톤은 62.3ppm과 그리고 7.7ppm의 메틸 프로톤은 109.2ppm과 결합함으로서 이들 탄소가 규명되었으며, 그 결과는 다비디아논 E에서와 유사하였다.
다비디아논 E 및 F의 FG-HMBC(도 11a)에 및 그 해석결과 나타난 각1H-13C long-range correlation을 도 11b에 나타내었다. 다비디아논 E에서는 1.91ppm의 메틸 프로톤으로부터 181.0ppm(C-8), 116.5ppm (C-9) 및 165.5ppm(C-9a)에의 long-range coupling이 관찰됨으로써 전술한 화합물의 퀴논 고리에서 관찰된 탄소들과 그 chemical shift 및 결합이 일치하였다. 특히, 본 스펙트럼에서는 1.91ppm의 메틸 프로톤과 C-9b (127.6ppm)와의 long-range coupling이 확인됨으로써 C-9b의 결합위치가 확정되었다. C-3(73.0ppm)에 결합된 메틸렌 프로톤(4.23, 4.41ppm)으로부터 C-9a에 long-range coupling이 관찰되어 C-9a와 C-3사이에 산소가 위치하는 에테르결합이 입증되었다. 또한, 139.5ppm의 C-3a와 1.38ppm의 이중(doublet) 메틸 프로톤 및 3.18ppm의 메틴 프로톤이 각각 3-bond 및 2-bond1H-13C long-range coupling을 하는 동시에 C-5의 방향족 프로톤 (7.92ppm)과도 coupling을 함으로써 본 화합물의 헤테로싸이클릭 고리와 나프토퀴논 고리(heterocyclic ring와 naphthoquinone ring)와의 결합이 규명되었다. 그리고 다비디아논 G에서와 같이 7.92ppm의 방향족 프로톤은 63.5ppm의 메틸렌 탄소 (C-6') 및 126.1ppm의 4급탄소 (C-6a)와, C-6'의 메틸 프로톤은 다시 C-7(183.2ppm)의 카르보닐기 탄소에 long-range coupling을 나타냄으로써 각각의 탄소의 규명 및 결합위치가 결정되었다. 마지막으로 C-9b(127.6ppm)는 C-4의 방향족 프로톤 (7.66ppm)과의 long-range-coupling으로부터 결정되었다.
한편, 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리에 존재하는 chiral center(C-3)의 입체구조는 NOEDF스펙트럼의 분석 및 메틴 프로톤 (3.10ppm)과 메틸렌 프로톤들 (4.23,4.41ppm)간의 결합상수로부터 karplus 방정식에 의거하여 결정하였다. 즉,chiral탄소에 결합된 메틴 프로톤(Hx)은 4.23ppm(Ha) 및 4.41ppm(Hb)의 두 프로톤과 각각 Jxa= 5.1 Hz 및 Jxb= 3.9 Hz 의 coupling constant로 스핀 결합을 하고 있으며, 이것으로부터 karplus 방정식 JHH'=8.5cos2θ-2.8 에 의하여 이면각(dihedral angle)을 산출한 결과 각각 약 40°(ΦHxHa) 및 약 50°(ΦHxHb)임을 알 수 있었다. 또한 NOEDF 스펙트럼상에서 두 메틸렌 프로톤중에 4.23ppm의 프로톤(Ha)만이 1.37ppm의 메틸 프로톤과 NOE를 나타냄으로써 이들이 공간상에서 근접해 있는 구조임이 확인되었다. 따라서 이상의 해석 결과로부터 chiral 탄소상의 메틸기는 그 결합 각도가 약 60°인 quasi axial인 것으로 판명되었으며, chiral 탄소인 C-3의 입체구조는 R-type로 결정되었다. 한편, 본 화합물의 구조를 Insingt Ⅱ program을 이용하여 최소 에너지 상태의 분자를 computer 모델링한 결과 chiral 탄소상의 메틸기가 quasi axial임을 보여주는 입체구조를 나타내었다.
이상으로 다비디아논 E의 각 탄소 및 이들의 결합 위치, 그리고 chiral center의 입체구조가 모두 규명되었으며, 그 구조는 하기 일반식[Ⅴ]에 나타낸 바와같이 2,3-디하이드로-6-하이드로메틸-3,9-디메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온 으로 결정되었다. 본 화합물 또한 신규 화합물로 판명되었다.
……[Ⅴ]
다비디아논 F에 소속되는 각 HMBC 시그널들에서는 동일한 탄소에 결합되어 있는 것으로 해석된 1.77ppm의 두 메틸 프로톤은 C-2(98.2ppm)에 2-bond, C-3a(147.1ppm)에 3-bond의 long-range coupling을 나타내었으며, 또한 C-5(131.1ppm)의 방향족 프로톤 (7.91ppm)으로부터도 C-3a (147.1ppm)에 3중결합(3-bond coupling) 함으로써 두 메틸기는 C-2(98.2ppm)에 결합되어 있으며 C-2는 다시 C-3a와 결합함을 알 수 있었다. 한편, 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리상의 산소와 직접 결합하는 73.0ppm의 탄소는 관찰되지 않았으나, C-2(98.2ppm)의 chemical shift로 미루어 이 탄소가 산소와 직접 결합하여 에테르결합을 이루는 5 membered heterocyclic ring을 구성하는 것으로 결론지었다. 다만, FG-HMBC 스펙트럼상에서 C-2와 C-9a의 결합을 입증할 수는 없었으나 본 화합물의 여러 가지 물리화학적 특성 등으로 미루어 이들이 직접 결합하고 있는 본 구조가 타당하다고 판단하였다. 그 외의 각 탄소들은 표 3에 나타낸 바와 같이 모두 규명되었으며, 이들의 결합은 다비디아논 E에서와 동일하였다.
이상의 NMR 스펙트럼의 해석 및 물리화학적 특성을 종합한 결과 다비디아논 F는 분자식 C15H14O4의 구조는 하기 위반식[Ⅵ]에 나타낸 바와 같이 2(H)-5-하이드로메틸-2,2,8-트리메틸나프토(1,8-bc)퓨란-6,7-디온으로 결정되었으며, 본 화합물 역시 신규 화합물로 확인되었다.
……[Ⅵ]
실시예 9 : 본 발명 화합물 다비디아논 G 의 화학구조
화합물 다비디아논 G의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,1C NMR,13C-1H COSY 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과,1H-NMR스펙트럼(도 12a)에서는 다비디아논 C의 나프토퀴논 고리 (naphthoquinone ring)에 결합된 프로톤, 그리고 다비디아논 A의 헤테로싸이클릭 고리(heterocyclic ring)에 결합된 프로톤들과 동일한 chemical shift 및 스핀 결합 형식을 갖는 프로톤 시그널들이 관측되었다. 즉,o-coupled 방향족 프로톤 (7.41ppm, 7.47ppm)과 2개의 singlet 메틸 프로톤(1.97ppm, 2.70ppm)의 존재로부터 다비디아논 C와 동일한 naphthoquinone ring 구조가 추정되었으며, 알릴기 결합 (allylic coupling)을 하는 이중(double)t 메틸l(2.11ppm) 및 메틴 프로톤 (7.09ppm)으로부터는 다비디아논 A와 동일한 헤테로싸이클릭 고리(heterocyclicring )구조의 존재가 추정되었다.
13C-NMR (도 12b)및 DEPT 스펙트럼상에서 총 15개의 탄소가 관측되었다.1H-NMR에서 해석되었던 바와 같이 다비디아논 C의 나프토퀴논 고리를 구성하는 탄소 및 다비디아논 A의 헤테로싸이클릭 고리를 구성하는 탄소와 유사한 chemical shift를 갖는 탄소들만이 관측됨으로써 전술한1H-NMR 해석결과를 뒷받침하였다.
13C-1H COSY스펙트럼의 해석결과, 2.11ppm의 메틸 프로톤이 12.6ppm의 탄소와 직접 결합되어 있음이 확인되었으며, 나머지 5개의 프로톤 시그널들과 탄소 시그널간의 상관관계는 다비디아논 C와 일치하였다.
HMBC(도 13a)를 통한1H-13C long-range correlation을 조사한 결과는 도 13b에 나타내었으며 헤테로싸이클릭 고리를 구성하는 탄소들 (C-9a, C-9b, C-3a, C-2 및 C-3)의 결합은 다비디아논 C와 일치하였다.
이상의 분석결과, 다비디아논 G는 분자량 240, 분자식 C15H12O3로 하기 일반식 [Ⅶ]과 같이 3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온인 세스퀴터펜 퀴논 (sequiterpene quinone)계 화합물로 결정되었다.
……[Ⅶ]
실시예 10 : 본 발명 화합물 다비디아논 H 의 화학구조
화합물 다비디아논 H의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,1C NMR,13C-1H COSY 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
실험결과, 본 화합물의1H-NMR스펙트럼(도 14a)에서는 다비디아논 G의 나프토퀴논 고리상에서 관찰되었던orthocoupling(7.8Hz)을 하고 있는 7.35ppm과 7.25ppm의 두 방향족 프로톤, 2.63ppm의 저자장 shift된 singlet 방향족 메틸 프로톤 및 1.94ppm의 singlet 방향족 메틸 프로톤등이 거의 일치되어 나타남으로써, 다비디아논 G와 동일한 나프토퀴논 고리 구조를 이루고 있는 것으로 추정되었다. 그러나 3.10ppm(m), 4.23ppm(dd) 및 4.41ppm(dd)의 methine 프로톤 및 메틸 프로톤(1.37 ppm)들은 전술한 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리에 결합되어 있는 프로톤들과 일치하는 chemical shift 및 결합상수(coupling constant)를 나타냄으로써, 본 화합물은 다비디아논 E와 동일한 부분구조인 H3C-CH-CH2-O-가 헤테로싸이클릭 고리를 형성하고 있는 것으로 해석되었다.
13C-NMR스펙트럼(도 14b)에서는 총 15개의 탄소 시그널들이 관측되었으며,DEPT 스펙트럼으로부터는 3개의 메틸(7.8ppm, 17.5ppm, 22.5ppm), 1개의 메틸렌 (71.4ppm) 및 3개의 메틴 (31.3ppm, 132.6ppm, 134.9ppm) 탄소의 존재를 확인하였다. 본 화합물에서도 퀴논의 카르보닐기 탄소들이 182.2ppm 및 180.2ppm에서 관측되었을 뿐만 아니라, 7.8ppm의 quinone ring 에 결합된 methyl 탄소와 퀴논(quinone)의 C=0의peri위치에 결합된 메틸 탄소도 22.5ppm에서 각각 관찰되었다. 또한 116.8ppm등 나머지 6개의 4급탄소들은 다비디아논 A에서 나프토퀴논 고리구조를 이루었던 탄소와 거의 일치하는 chemical shift를 보였다. 따라서 본 화합물은1H-NMR 해석에서 추정했던 바와 같이 다비디아논 A의 나프토퀴논 고리와 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리가 혼합된 구조를 이루고 있는 것으로 해석되었다.
프로톤과 탄소간의 직결합을 알기 위하여13C-1H COSY 스펙트럼을 분석한 결과, 1.37ppm 및 1.94ppm의 두 메틸 프로톤은 17.5ppm 및 7.8ppm의 메틸 탄소와, 3.10 ppm의 메틴 프로톤은 31.3ppm의 탄소와, 그리고 4.23ppm 및 4.41ppm의 메틸렌 프로톤은 71.4ppm의 탄소와 각각 직결하고 있음이 밝혀졌으며, 이는 다비디아논 E와 일치하였다. 그러나 그 외의 프로톤과 탄소간의 직결합은 다비디아논 G와 유사하게 두 방향족 프로톤 중 7.25ppm의 프로톤은 고자장의 방향족 탄소(132.6ppm)에, 7.35ppm의 프로톤 저자장의 방향족탄소(134.9ppm)에 각각 결합되어 있으며, 또한 2.63ppm의 저자장 shift된 메틸 프로톤 역시 22.5ppm의 탄소와 결합하고 있음을 알았다.
FG-HMBC 스펙트럼(도 15a)에서 관찰된 각 상관관계(correlation)을 도 15b에서 나타내었다. 각 프로톤과 탄소들 간의 long-range coupling은 전술한1H 및13C-NMR 스펙트럼의 해석 결과와 같이 다비디아논 G의 나프토퀴논 고리와 다비디아논 E의 헤테로싸이클릭 고리에서 관찰된 것과 일치함으로써 다비디아논 H는 두 ring 구조의 조합으로 이루어져 있음을 알았다.
한편, 헤테로싸이클릭 고리상의 각 프로톤들 간의 스핀 결합 및 이들의 결합상수(coupling constant) 또한 다비디아논 E에서와 일치함으로써 본 화합물의 chiral center의 입체구조 역시 메틸기가 quasi axial로 결합된 구조인 것으로 판명되었다.
이상의 분석결과, 다비디아논 H는 하기 일반식 [Ⅷ] 에 나타낸 바와 같이 2,3-디하이드로-3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온으로 결정되었다
……[Ⅷ]
실시예 11 : 본 발명 화합물 다비디아논 I 의 화학구조
화합물 다비디아논 I의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR, 화합물 다비디아논 G의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,1C NMR, 1-D NMR 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 다비디아논 I는 그 물리화학적 특성으로부터 다비디아논 E 및 F와 동일한 분자식 및 분자량 (C15H1404,MW=258)을 갖는 구조 이성질체 추정되었다.
실험결과,1H-NMR스펙트럼(도 16a)에서는 전술한 다비디아논 A 및 H의 나프토퀴논 고리에 결합된 프로톤들과 동일한 chemical shift 및 스핀 결합을 보이는 시그널들이 관찰됨으로써 본 화합물은 이들과 같거나 유사한 나프토퀴논 고리구조를 형성하고 있을 것으로 추정되었다. 즉,ortho-coupling을 이루고 있는 2개의 방향족 프로톤 (7.44ppm, 7.82ppm), 퀴논 고리상의 메틸 프로톤 (1.92ppm)과 함께 저자장으로 shift된 2.63ppm의 methyl 프로톤이 관찰되었다. 한편 heterocyclic ring을 형성하고 있는 프로톤들로 해석되는 4.24ppm 및 4.30ppm의 메틴 프로톤들은 다비디아논 E 및 H에서와는 달리 본 화합물에서는 geminal coupling (J=10.7 Hz)에 의한 doublet이었고, 이들과 coupling을 하였던 3.10ppm(m)에서의 메틸 프로톤은 관찰되지 않았다. 그리고 1.56ppm의 메틴 프로톤이 singlet로 나타난 점으로 미루어 본 화합물은 헤테로싸이클릭 고리의 chiral 탄소에 결합된 메틴의 수소가 수산기로 치환된 구조를 이루고 있는 것으로 추측되었다.
13C-NMR(도 16b) 및 DEPT스펙트럼에서는 3개의 메틸 탄소(7.8ppm, 22.8ppm, 26.0ppm) 1개의 메틸렌 탄소(76.0ppm) 및 2개의 메틴 탄소 (136.7ppm, 131.7ppm)등 총 15개의 탄소가 확인되었다. 다비디아논 H와 비교했을 때 C-3(31.3ppm)만이 본 화합물에서 수산기와 결합된 탄소의 특징적인 chemical shift 인 67.1ppm으로 크게 변하여 나타났을 뿐 나머지 탄소 시그널들은 헤테로싸이클릭 고리에 결합된 메틸탄소가 26.0ppm의 저자장에서 관측된 것 이외에는 다비디아논 H에서의 경우와 거의 일치함으로써1H-NMR에서 추정되었던 구조를 뒷받침하였다.
1-D NMR 분석에 의하여 상기와 같이 그 구조가 추정된 다비디아논 I의 프로톤과 탄소의 direct correlation은 FG-HMQC 스펙트럼상에서 7.44ppm 및 7.82ppm의 두 방향족 프로톤은 각각 131.7ppm 및 136.7ppm의 탄소와 1.56ppm, 1.92ppm 2.63ppm의 메틸 프로톤들은 각각 26.0ppm, 7.8ppm, 22.8ppm의 탄소와 각각 결합함을 알 수 있었다. 그리고 76.Oppm의 탄소는 4.24ppm 및 4.30ppm의 두 프로톤이 직결합한 메틸렌 탄소임이 확인되었다.
FG-HMBC스펙트럼(도 17a)을 통한1H-13C long-range coupling을 조사한 결과를 도 17b에 나타내었다. 즉, 본 화합물의 나프토퀴논 고리을 구성하는 프로톤 (1.92ppm, 7.44ppm, 7.82ppm)과 탄소들간의 long-range coupling은 다비디아논 H에서와 일치하였다. 한편, 헤테로싸이클릭 고리를 구성하는 메틸(1.56ppm) 및 메틸렌 (4.24ppm, 4.30ppm) 프로톤들과 탄소들 간의 long-range coupling 역시 다비디아논 H 와 유사한 correlation을 나타내었다. 즉, C-3Me(26.0ppm)의 메틸 프로톤 (1.56ppm)으로부터 C-3a(140.9ppm)에, C-4(136.7ppm)의 방향족 프로톤 (7.82ppm)으로부터 C-3(67.1ppm)에 각각의 long-range coupling이 관찰됨으로써 C-3a와 C-3의 결합위치가 결정되었으며, 4.24ppm 및 4.30ppm의 메틸렌 프로톤으로부터 역시 C-3a에 각 long-range coupling이 관찰되었다. 한편, C-3 (67.1ppm)에는 chemical shift로 미루어 수산기가 결합되어 있는 것을 알 수 있었다.
이상의 다비디아논 I 의 물리화학적 특성 및 NMR스펙트럼의 해석결과, 본 화합물은 그 구조가 하기 일반식 [Ⅸ] 에 나타낸 바와 같이 2-3-디하이드로-3-하이드록시-3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온으로 판명되었다,
……[Ⅸ]
실시예 12 : 본 발명 화합물 다비디아논 J 의 화학구조
화합물 다비디아논 J의 화학구조를 규명하기 위하여1H NMR,1C NMR, DEPT FG-HMQC 및 FG-HMBC 스펙트럼을 측정하였다.
1H-NMR스펙트럼(도 18a)에서는 상기한 모든 다비디아논들에서 공통적으로 나타났던orthocoupling된 2개의 doublet 방향족 프로톤 대신 1개의 singlet방향족 프로톤만이 6.33ppm에서 관찰됨으로써 앞서 추정되었던 페놀성 수산기가 사라진 방향족 프로톤 대신 결합되어 있을 것으로 추정되었다. 한편 각각 3개씩의 메틸 프로톤 (1.24ppm, 1.84ppm, 2.48pm), 메틴 프로톤(3.31ppm)과 메틸렌 프로톤(4.28ppm, 4.40ppm)의 chemical shift 및 스핀결합 양식은 다비디아논 H와 거의 일치함으로써 본 화합물은 다비디아논 H와 일치하는 헤테로싸이클릭 고리를 가지고 있는 것으로해석되었다.
13C-NMR (도 18b) 및 DEPT 스펙트럼에서는 다비디아논 H에서와 마찬가지로 3개의 메틸 탄소(7.9ppm, 17.4ppm, 23.7ppm). 1개의 메틸렌 탄소 (73.8ppm)을 비롯하여 2개의 카르보닐기 탄소 (183.2, 180.2 ppm)등이 관찰되었다. 또한, 다비디아논 H에서 헤테로싸이클릭 고리를 구성하는 탄소들과 유산한 chemical shift를 갖는 시그널들 (17.4, 27.5, 73.8ppm)이 관찰됨으로써1H-NMR스펙트럼의 해석에서 추정되었던 바와 같이 다비디아논 H와 동일한 헤테로싸이클릭 고리구조를 형성하고 있는 것으로 해석되었다. 한편, 121.8ppm에서 관찰된 방향족 프로톤이 결합된 것으로 추정되는 탄소는 고자장 shift된 것으로 미루어 OH에 의한 β-effect를 받는 것으로 해석되었으며, 156.0ppm의 탄소는 그 chemical shift로 미루어 OH가 결합된 방향족 탄소로 판단되었다.
다비디아논 J의 FG-HMQC 및 FG-HMBC 스펙트럼의 측정은 그 감도를 높이는 방법으로서 offset 측정 기법을 이용하였다. 즉, 통상적으로 NMR의 감도는 측정시 여러 가지 측정 계수들에 의해 조정이 가능하며, 특히 그 분해능은 data checking point의 수에 크게 영향을 받는다. 따라서 탄소의 0-90ppm의 측정영역을 90-190ppm 측정 영역에 중첩시킴으로써 단의측정 영역당 date checking point 수를 배가시키는 offset 측정 기법을 이용하여 스펙트럼의 분해능을 향상시켰으며, FG-HMQC 및 FG-HMBC 스펙트럼상에서는 탄소의 0-90ppm 영역에서 관찰된13C-1H coupling 시그널들이 100-190ppm 이 영역에 중첩되어 관찰되었다. 따라서, FG-HMQC스펙트럼에서 관찰된 1.85ppm 의 메틸 프로톤과 직결합하는 107.9ppm에서 관찰되는 탄소는 실제로는 7.9ppm의 메틸 탄소인 것으로 해석되었다. 본 화합물은 그 구조가 전술한 다비디아논 H와 유사한 것으로 추정되었기에 FG-HMQC 스펙트럼상의 각 시그널들을13C-NMR스펙트럼과 비교하며 규명할 수 있었다.
이상과 같은 기법을 이용하여 분석한 FG-HMQC스펙트럼상에서 관찰된 프로톤과 탄소의 직결합은 6.58ppm의 ??향족 프로톤과 121.8ppm의 탄소가 서로 결합된 것 외에는 다비디아논 H와 그 결과가 동일하였다.
FG-HMBC 스펙터럼(도 19a) 및 그 해석 결과인 각13C-1H long-range correla tion을 도 19b에 나타내었다. 관찰된 모든 long-range correlation은 다비디아논 H와 동일하였다. 다만1H 및13C-NMR스펙트럼으로부터 C-4(156.Oppm)에 결합된 것으로 해석되었던 OH로부터 C-9b의 결합위치를 규명할 수는 없었으나, long-range coupling이 관찰되지 않은 129.4ppm의 4급탄소를 그 chemical shift로 미루어 C-9b인 것으로 판정하였다. 한편 NOEDF스펙트럼에서 C-5에 결합된 6.33ppm의 방향족 프로톤을 irradiation하였을 때 2.48ppm의 C-6'의 메틸 프로톤이 NOE difference를 나타냄으로써 이들이 공간상에서 근접해 있는 구조임이 확인됨으로써, C-5의 결합위치가 재확인되었다. 한편 다비디아논 J의 헤테로싸이클릭 고리의 입체구조는 각 프로톤간의 결합상수가 다비디아논 H 동일함으로써 chiral 탄소의 입체구조 또한 동일하게 메틸기는 quasi axial인 것으로 해석되었다.
……[Ⅹ]
이상의 구조분석결과, 하기 일반식 [Ⅹ] 에 나타낸 바와 같이 다비디아논 J는 2,3-디하이드로-4-하이드로식-3,6,9-트리메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온으로 그 구조가 결정되었다.
이상으로 상기와 같이 당느릅나무의 근피로부터 분리된 상기 화합물들의 완전한 구조의 결정은1H NMR,13C NMR, DEPT, COSY, FG-DQF, COSY, FG-HMQC, FG-HMBC, 및 NOEDF 등의 다양한 1차원 및 2차원 NMR스펙트럼의 분석에 의하여 수행되었으며, NMR 스펙트럼의 분석 결과 결정된 각 화합물들의 탄소와 프로톤의 chemical shift 및 그 결합의 상관관계를 표 3과 표 4에 나타내었다.
본 발명 다비디아논 A, B, C, D 및 G의1H- 및13C-NMR의 스펙트럼 분석결과
탄소no. 다비디아논 A 다비디아논 B 다비디아논 C 다비디아논 D 다비디아논 G
δC δH δC δH δC δH δC δH δC δH
2 141.1 7.09(1H,d,1.2) 141,9 7.09(1H,d,1.5) 143.1 7.28(1H,s) 140.8 7.12(1H,d,1.5) 140.4 7.08(1H,d,1.2)
3 112.2 111.7 117.5 112.2 112.1
3a 131.3 132.1 129.1 129.8 129.5
4 129.1 7.61(1H,d,8.3) 128.9 7.58(1H,d,8.3) 130.4 7.73(1H,d,8.4) 129.0 7.63(1H,d,8.3) 128.4 7.47(1H,d,8.3)
5 130.7 7.98(1H,d,8.3) 130.3 7.52(1H,d,8.3) 137.6 7.70(1H,d,8.4) 130.4 8.01(1H,d,8.3) 136.4 7.41(1H,d,8.3)
6 144.6 137.0 148.0 147.8 146.6
6a 126.2 125.3 126.5 124.5 126.3
7 181.7 179.0 182.5 181.7 182.0
8 179.0 178.0 178.7 177.5 178.0
9 113.5 114.3 113.8 113.5 113.4
9a 161.8 161.0 163.7 161.8 161.7
9b 124.2 124.2 124.1 123.9 124.0
3-CH3 12.9 2.12(3H,d,1.2) 12.8 2.11(3H,d,1.5) 12.9 2.15(3H,d,1.5) 12.6 2.11(3H,d,1.2)
3-CH2 58.3 4.65(2H,d,4.5)
6-CH3 23.4 2.78(3H,s) 23.2 2.70(3H,s)
9-CH3 7.7 1.97(3H,s) 7.6 1.97(3H,s) 7.7 2.00(3H,s) 7.7 1.99(3H,s) 7.7 1.97(3H,s)
6' 101.5 6.15(1H,s) 168.6 72.7 4.93(2H,s)
6'' 56.5 3.53(3H,s) 53.4 3.96(3H,s) 59.1 3.55(3H,s)
6''' 56.5 3.53(3H,s)
본 발명 다비디아논 E, F, H, I 및 J의1H- 및13C-NMR의 스펙트럼 분석결과
탄소no. 다비디아논 E 다비디아논 F 다비디아논 H 다비디아논 I 다비디아논 J
δC δH δC δH δC δH δC δH δC δH
2 73.0 4.23(1H,dd,10.7,5.1)4.41(1H,dd,10.7,3.9) 98.2 71.4 4.23(1H,dd,10.7,5.1)4.41(1H,dd,10.7,3.9) 76.0 4.24(1H,d,10.8)4.41(1H,d,10.8) 73.8 4.28(1H,dd,10.3,3.5)4.40(1H,brd,10.3)
3 32.5 3.10(1H,m) 128.4 7.72(1H,d,8.3) 31.3 3.10(1H,m) 67.1 27.5 3.21(1H,s)
3a(2a) 139.5 147.1 136.9 140.9 118.9
4 134.9 7.66(1H,d,8.3) 131.3 7.91(1H,d,8.3) 132.6 7.35(1H,d,7.8) 136.7 7.82(1H,d,7.8) 156.0
5 130.4 7.92(1H,d,8.3) 148.1 134.9 7.25(1H,d,7.8) 131.7 7.44(1H,d,7.8) 121.8 6.33(1H,s)
6 148.1 180.6 142.8 144.9 148.3
6a(5a) 126.1 123.9 127.3 127.9 129.2
7 183.2 181.0 182.2 182.9 183.2
8 181.0 109.2 180.2 181.2 180.2
9 116.5 116.8 117.4 114.8
9a(8a) 165.5 170.3 162.4 164.8 165.6
9b(8b) 127.6 134.6 126.8 127.1 129.4
3-CH3(2-CH3) 17.8 1.38(3H,d,6.8) 27.1 1.77(3H,s) 17.5 1.37(3H,d,6.8) 26.0 1.56(3H,s) 17.4 1.24(3H,d,7.3)
6-CH3 22.5 2.63(3H,s) 22.8 2.63(3H,s) 23.8 2.48(3H,s)
6-CH2(5-CH3) 63.5 4.98(2H,s) 62.3 5.06(3H,s)
9-CH3(8-CH3) 7.7 1.97(3H,s) 7.7 1.89(3H,s) 7.8 1.94(3H,s) 7.8 1.92(3H,s) 7.9 1.85(3H,s)
실시예 13 : 본 발명 다비디아논 A, C, G, H, I 및 J 화합물의 인체 암세포 및 정상세포에 대한 세포독성조사
상기 분리, 정제된 각 화합물들 중 극미량 성분의 화합물들을 제외한 다비디아논 A,C,G,H,I 및 J등 6종의 화합물들의 각종 인체부위별 암세포들에 대한 세포독성을 SRB법으로 조사하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.
인체 암세포에 대한 화합물의 세포독성은 배양된 인체 유해 암세포에 시료를 처리한 후 생존 세포의 단백질을 정량하여 이를 세포독성의 지표로 삼는 SRB(sulforhodamibe B)방법으로 측정하였고, 간세포는 딕킨스등이 제안한 collage nase perfusion방법에 준하여 쥐로부터 분리하여 일차배양한 후 간세포의 DNA 합성에 시료가 미치는 영향을 조사하였다. 간세포의 DNA 합성 능력은 DNA 합성시3H-티미딘이 incorporation되는 양을 리퀴드 실틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)로 측정하였다.
다비디아논 J를 제외한 5종의 화합물들은 전립선암 세포인 PC-3세포 이외의 거의 모든 인체 암세포들에 대하여 3㎍/㎖ 이하의 ED50를 보이는 강한 세포독성을 나타내었다. 특히 다비디아논 A,C 및 H는 세포독성을 나타내는 암세포들에 대하여 1.0 ㎍/㎖ 정도의 ED50를 보임으로써 표준품을 함께 비교 조사한 안트라퀴논 (anthraquinone)계 항암제인 아드리아마이신(adriamycin)의 0.3㎍/㎖ 비교 했을 때 약 1/3 정도로서, 강한 세포독성을 가짐을 알 수 있었다. 각 화합물들은 암세포들에 대하여 선별적인 세포독성을 갖는 선택성을 나타내지는 않았으나, 아드리아마이신 내성 유방암 세포인 MCF-7/ADR에 대하여 아드리아마이신이 거의 독성을 보이지 않는 반면, 이들은 다른 암세포들에 비하여 오히려 더 높은 세포독성을 나타내는 특성을 보였다. 한편, 쥐의 정상 섬유아세포인 NIH3T3에 대한 세포독성에 있어서는 화합물들의 구조와 세포 독성간에 구별되어지는 특이성이 관찰되었다. 즉, 나프토퀴논 고리(naphthoquinone ring)외에 제 3의 환인 헤테로싸이클릭 고리 (hetero cyclic ring)이 불포화된 화합물들인 다비디아논 A,C 및 G는 NIH3T3 세포에 대하여 아드리아마이신과 같이 암세포들에 대한 것과 비슷한 수준의 세포독성을 나타냄으로써 암세포와 정상세포에 대한 선택성을 보이지 않았다. 그러나 완전 포화된 헤테로싸이클릭 고리구조를 가짐으로써 chiral 탄소를 내포하고 있는 화합물들인 다비디아논 H와 I는 암세포들에 대한 강한 세포독성에 비하여 NIH3T3세포에 대해서는 10.0㎍/ml 이상의 ED50를 보임으로써 10배 이상의 낮은 세포독성을 나타내었다. 따라서 이 두 화합물은 암세포에만 특이적으로 강한 세포독성을 나타냄으로써 항암제인 아드리아마이신에 비하여 매우 우수한 선택성을 가지는 것으로 판단되었다. 그러나 다비디아논 J는 구조의 유사성에도 불구하고 다른 다비디아논들과는 달리 암세포 및 NIH3T3 세포모두에 세포독성을 거의 나타내지 않았다. 한편 다비디아논계 화합물들은 위암 세포주에도 강한 항암활성을 나타내고 있어 본 화합물들이 위암에 대한 치료제로 응용이 가능할 것으로 판단되었다.
한편, 쥐로부터 분리한 정상 간세포를 일차배양을 행하면서 다비디아논 화합물들의 간세포에 대한 세포독성의 지표로서 DNA 합성시 incorporation 되는3H-티미딘의 양을 측정한 결과를 표 5에 나타내었다. 쥐의 정상 간세포에 대해서도 아드리아마이신은 세포독성을 나타내어 incorporation 된3H-티미딘의 양이 대조구에 비하여 70% 정도 감소되었으나, 다비디아논 화합물들에 있어서는 다비디아논 C 및 G에서 약 30%의 세포독성이 관찰되었을 뿐, 그 밖의 화합물들에서는 세포독성이 거의 관찰되지 않았다.
본 발명 화합물의 정상섬유아세포(fibroblast)와 암세포라인에 대한 세포독성실험
Cell line ED50(㎍/㎖)
Dav A Dav C Dav G Dac H Dav I Dav J ADR
혈액암 (Leukemia)
Molt-4F >10.0 0.2 1.3 0.4 1.9 >10.0 0.04
K562 <0.1 <0.1 0.6 <0.1 0.4 8.9 0.28
RPMI8266 0.2 0.2 2.6 <0.1 0.7 >10.0 0.13
신장암 (Renal)
ACHN 0.7 1.0 0.7 1.0 2.7 >10.0 0.35
UO-31 1.4 2.8 6.0 1.0 2.9 >10.0 0.38
중추신경계암(CNS)
SF539 1.0 1.0 2.8 1.0 1.1 >10.0 0.05
피부암 (Skin)
G361 0.5 0.5 1.8 0.5 1.0 >10.0 0.08
UACC62 1.2 0.9 2.4 1.0 1.1 >10.0 0.10
전립선암 (Prostate)
PC-3 7.9 >10.0 >10.0 >10.0 >10.0 >10.0 0.43
폐암 (Lung)
A549 1.1 2.5 3.0 1.8 4.2 >10.0 0.36
NCI-H266 1.2 1.0 2.2 1.0 1.8 >10.0 0.07
자궁암 (Ovary)
OVCAR-4 0.3 1.4 2.4 2.1 1.5 >10.0 0.33
대장암 (Colon)
HCT15 1.1 2.5 4.3 1.0 4.6 >10.0 0.42
KM12 <0.1 3.9 1.6 3.3 2.9 >10.0 0.16
Colo#205 0.7 0.7 0.6 1.1 3.0 8.6 0.29
유방암 (Breast)
MCF-7 0.5 1.2 3.1 1.0 2.0 >10.0 0.39
MCF-7/ADR 0.2 0.6 <0.1 0.5 <0.1 >10.0 >10.0
위암 (Stomach)
KATO-III 0.3 1.0 2.2 1.0 1.0 >10.0 0.20
TMK-1 0.2 0.5 0.2 0.6 0.5 >10.0 0.50
정상 섬유아세포
NIH3T3 1.0 2.0 2.3 >10.0 >10.0 >10.0 0.10
실시예 14 : 본 발명 다비디아논계 A, C, G, H, I 및 J 화합물의 항균활성
화합물의 항균활성은 한천배지 희석방법에 의거하여 최저 생육 저해 농도를 측정하였다. 각 검정균을 각각의 배양용 배지에서 전 배양한 후 시료의 농도를 달리한 뮬러 힌트 아가 배지에는 세균을, 그리고 감자 녹말 아가 배지에는 곰팡이를각각 접종한 다음 배양하여 항균활성을 관찰하였으며, 각 검정균의 생육을 완전히 저해하는 시료의 최저 농도를 최저생육농도(MIC)로 하였다.
다비디아논 화합물들의 항균활성을 한천배지 희석방법으로 조사한 결과는 표 6에 나타내었다. 그 결과 세포독성을 나타내지 않았던 다비디아논 J를 제외한 다비디아논 A, C, G, H 및 I는 본 연구에 사용된 그람양성 및 그람음성세균들에는 10㎍/㎖이하의 최저 생육저해농도(MIC)를 갖는 항균활성을 나타내었다. 특히 위의 염증을 유발하는 원인균으로 알려져 있는 헤리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균에 강한 항균활성을 나타내고 있음이 본 발명에서 처음으로 밝혀졌으며 이는 본 화합물들이 위장염의 치료제로 사용할 수 있음을 나타낸다고 하겠다. 그러나 효모 및 곰팡이들에 대한 MIC는 10㎍/㎖ 이상으로서, 이들에 대한 항균활성은 낮았다.
본 발명 화합물의 항균활성
미 생 물 최저 생육 저해 농도(㎍/㎖)
Dav.A Dav. C Dav. G Dav. H Dav. I Dav. J
S.aureus 209 7 7 3 5 3 15
S.aureus R-209 15 10 10 7 5 25
E.coli BE 1186 5 7 5 3 10 20
S. typhymurium SL 1102 10 15 15 10 10 20
C.albicans 12 15 15 12 15 25
A.fumigatus 7 10 10 10 15 >20
C.neoformans 20 15 >20 10 >20 >20
M.gypseum 15 15 >20 15 15 20
F.oxysporium 20 15 15 >20 20 >20
H.pylori 3 5 7 5 5 10
실시예 15 : 본 발명 다비디아논계 A, C, G, H, I 및 J 화합물의 항염증 활성
화합물의 항염증 활성은 하기와 같은 혈소판 응집 억제작용 측정방법을 이용하여 측정하였다. 흰쥐의 혈액으로부터 혈소판을 분리하여 1mL당 3×108개의 농도가 되도록 조절한 후 이것을 혈소판 응집 측정용 용기에 넣고 37℃에서 1분간 배양하였다. 여기에 분리 정제한 각각의 화합물을 희석하여 가한 후 3분 후에 트롬빈 용액을 넣고 혈소판 응집 측정기를 이용하여 혈소판 응집 억제 작용을 측정하였다. 실험결과, 표 7에서 보는 바와 같이 모든 다비디아논계 화합물이 혈소판 응집을 현저하게 억제시키므로 항염증 활성을 나타내었다.
혈소판 응집 억제 작용 측정방법에 의한 항염증 효과
Dav.A Dav. C Dav. G Dav. H Dav. I Dav. J
화합물의 농도(㎍/mL) 1.25 5 1.25 5 1.25 5 1.25 5 1.25 5 1.25 5
혈소판 응집억제도(%) 42.2 53 45 56 43.3 55.2 44 58.2 42.7 52.1 53.1 54.1
실시예 16 : 본 발명 다비디아논계 A, C, G, H, I 및 J 화합물의 지질 과산화 억제 활성
마이크로좀은 쥐의 간으로부터 Hogeboom의 방법에 따라 차등 원심분리법으로 분리하였으며, 분리된 마이크로좀을 지질원으로 하여 Ohkawa등의 방법에 따라 비효소적 방법인 Fe2+/아스코배이트(ascorbate)반응계를 이용하여 지질 과산화 억제활성을 측정하였다. 즉 Fe2+/아스코배이트 반응계에 의하여 최종 생성된 하이드록시 라디칼(˙OH)에 의한 마이크로좀의 지질 과산화 결과로서 생성된 MDA(malonedi aldehydehyde)를 thiocarbituric acid(sigma)를 이용한 분광학적 방법으로 정량하였다. 이때 시료 첨가에 의한 MDA 생성의 감소 정도를 지질 과산화 억제 활성 지표로 하여 α-토코페롤(Sigma)와 비교하였다.
Fe2+/아스코배이트 반응계에 의하여 최종 생성된 하이드록시 라디칼에 의한 마이크로좀의 지질 과산화반응의 억제에 대한 다비디아논 화합물들의 활성을 조사하여 그 결과를 표 8에 나타내었다. 다비디아논 A,C,D,G 및 H의 IC50는 각각 0.8, 0.12, 1.4, 0.03 및 0.04㎍/㎖로서 강한 지질 과산화 억제활성을 나타내었다. 특히 다비디아논 G 및 H는 양성대조구인 α-토코페롤의 0.1 ㎍/㎖에 비하여 3배 정도의 지질 과산화 억제활성이 강하였다. 그러나 각각 헤테로싸이클릭 고리 또는 나프토퀴논 고리에 직접 결합된 수산기를 내포하고 있는 다비디아논 I 및 J 는 대조적으로 낮은 지질 과산화 억제활성을 나타내었다. 따라서 Fe2+/아스코배이트 반응계에 의하여 생성된 슈퍼옥사이드(superoxide) 라티칼 및 이것으로부터 최종 생성된 하이드록시 라디칼이 이들 다비디아논 화합물들의 환원형인 하이드록시 퀴논 (hydroxyquinone)형에 의하여 소거됨으로써 궁극적으로 지질 과산화 억제 활성을 나타낸 것으로 해석되었다.
본 발명 화합물의 지질 과산화 억제 활성
IC50 (㎍/㎖)
다비디아논 A 0.8
다비디아논 B 6.9
다비디아논 C 0,12
다비디아논 D 1.4
다비디아논 G 0.03
다비디아논 H 0.04
다비디아논 I 19.8
다비디아논 J 11.7
α-토코페롤 0.1
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 당느릅나무(Ulmus davidianaPlanch)의 근피로부터 인체 암세포에 대하여 강한 세포독성을 나타내는 화합물을 메탄올 추출하여 분리, 정제한 결과 n-헥산 및 클로로포름 용매 추출 분획으로부터 10종의 신규한 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)화합물을 얻었으며, 상기 화합물들은 항암활성, 항균활성, 항염증 활성 및 지질 과산화 억제 활성이 우수한 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. 당느릅나무 또는 동속식물로부터 메탄올 추출한 추출물을 n-헥산 또는 클로로포름으로 용매 추출 분획하고 정제함을 특징으로 하는 느릅나무과로부터 분리한 화합물 제조방법.
  2. 제 1항의 방법에 의해 제조된 느릅나무과의 조추출물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 위염 또는 위암치료용 조성물.
  3. 제 1항의 방법에 의해 제조된 조추출물을 유효성분으로 함을 특징으로 하는 건강식품용 조성물.
  4. 제 1항의 기재의 방법에 의해 제조되고 항암활성, 항균활성, 항염증 활성 및 지질 과산화 억제 활성 있는 느릅나무과로부터 분리한 세스퀴터펜 퀴논 (sesquiterpene quinone)화합물.
  5. 제 4항 기재의 세스퀴터펜 퀴논 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 위염 또는 위암치료제 조성물.
  6. 제 4항 기재의 세스퀴터펜 퀴논 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 함을 특징으로 하는 건강식품용 조성물.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 세스퀴터펜 퀴논(sesquiterpene quinone)화합물은 하기 일반식 (Ⅰ)내지(Ⅹ)으로 표시되는 다비디아논 A; 6-디메톡시메틸-3,9-디메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온, 다비디아논 B; 6-메톡시카보릴-3,9- 디메틸나프토 (1,8-bc)-7,8-디온, 다비디아논 C; 3-하이드로메틸-6,9-디메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온, 다비디아논 D; 6-메톡시메틸-3,9-디메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온, 다비디아노 E; 2,3-디하이드로-6-하이드로메틸-3,9-디메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8 -디온, 다비디아논 F; 2(H)-5-하이드로메틸-2,2,8-트리메틸나프토(1,8-bc)퓨란-6,7 -디온, 다비디아논 G; 3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온, 다비디아논 H; 2,3-디하이드로-3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온, 다비디아논 I; 2-3-디하이드로-3-하이드록시-3,6,9-트리메틸나프토(1,8-bc)피란-7,8-디온, 다비디아논 J;2,3-디하이드로-4-하이드로식-3,6,9-트리메틸나프토-(1,8-bc)피란-7,8-디온.
    ……[Ⅰ]
    ……[Ⅱ]
    ……[Ⅲ]
    ……[Ⅳ]
    ……[Ⅴ]
    ……[Ⅵ]
    ……[Ⅶ]
    ……[Ⅷ]
    ……[Ⅸ]
    ……[Ⅹ]
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