KR20020013503A

KR20020013503A - Ｔ 세포 수용체 Ｖβ-Ｄβ-Ｊβ서열 및 그 검출방법

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Publication number: KR20020013503A
Application number: KR1020017010708A
Authority: KR
Inventors: 징우 지이. 짱
Original assignee: 크로커 사무엘 에스; 베일러 칼리지 오브 메디신
Priority date: 1999-02-23
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2002-02-20
Also published as: RU2251552C2; HK1044965A1; PL364917A1; JP2007308502A; KR100479648B1; JP2003504005A; CA2362099A1; CN1355852A; AU4251200A; DE60045188D1; US6303314B1; EP1159457A4; AU2004220763A1; NZ513630A; WO2000050641A1; EP1159457A1; AU774952B2; HUP0202574A2; ATE486956T1; EP1159457B1

Abstract

한 구체예에 있어서, 본 발명은 5′-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3′또는 여기에 상보적인 핵산의 또는 그로부터 유래되는 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하지 않고 Vβ13.1 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 핵산과 함께 사용될 수 있으며, 상기 올리고뉴클레오티드 및 핵산의 서열은 Vβ13.1 유전자 쌍의 동일한 가닥상에서 발견되지는 않아, Vβ13.1 유전자의 일부분을 증폭한다. 또한, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 Vβ13.1 T 세포의 T 세포 수용체 내에서 발견된 LGRAGLTY 모티프를 검출하는 방법에 있어서 표지부위와 함께 사용될 수 있다. 이 모티프는 다발성 경화증(multiple sclerosis:MS)과 같은 자가면역 질병과 연관된다. 일단 이 모티프가 진단되면, 상기 자기면역 질병은 치료될 수 있거나 그 진전이 모니터링될 수 있다. 상기 자가면역 질병은 LGRAGLTY 모티프를 포함하는 펩티드를 주입하므로써 치료될 수 있다.

Description

Ｔ 세포 수용체 Ｖβ-Ｄβ-Ｊβ서열 및 그 검출방법{T CELL RECEPTOR Vβ-Dβ-Jβ SEQUENCE AND METHODS FOR ITS DETECTION}

인간과 다른 포유동물에 있어서, T 세포 수용체는 T 세포 상에서 발견된다. T 세포 수용체는 알파 및 베타 체인을 포함하고, 여기서 베타 체인은 N말단으로부터 C말단순으로 다음의 영역: Vβ-Dβ-Jβ-Cβ를 포함한다. T 세포 수용체는 Vβ-Dβ-Jβ 영역 내에서 자연적으로 변이한다.

항원이 항원제공세포(antigen-presenting cell: APC)에 의하여 T 세포상에 제공될 때, 그 항원을 인지하게 되는 가변영역(Vβ-Dβ-Jβ를 포함한다)을 가진 T 세포 수용체는 상기 APC 상의 항원에 결합한다. 다음으로 T 세포 수용체를 가진 T 세포는 활성화(클론 확장: clonal expansion) 된다.

많은 자가면역 질병의 발병론은 개체에 의하여 정상적으로 제공된 항원에 대한 자가면역 T 세포 반응에 있는 것으로 생각되고 있다. 그러한 질병의 한 예로 다발성 경화증(MS)이 있으며, 이는 미엘린 항원, 특히 미엘린 염기성 단백질(MBP)에 대한 T 세포 반응으로 발병하는 것으로 일반적으로 여겨지고 있다. MBP-반응성 T 세포는 체내(in vivo)에서 활성화되며, 대조군 개체와는 달리 MS 환자의 혈액 및 뇌척수액에 높은 전구체 빈도로 존재하는 것이 밝혀졌다. 이들 MBP-반응성 T 세포는 예컨대, IL-2, TNF 및 감마-인터페론과 같은 Th1 사이토카인을 만든다. 이들 Th1 사이토카인은 염증세포의 중추신경계로의 이동을 촉진하여 MS의 미엘린-파괴성 염증반응을 악화시킨다.

많은 조절기작들이 MS의 치료에 이용될 수 있다. 그러한 것들 중의 하나는 하나 이상의 세포외부 도메인을 가진 한정된 수의 T 세포 막-연계 펩티드로 면역접종하는 것이다. 반덴바르크(Vandenbark)는 미국 특허 제5,614,192호에서, T 세포 수용체의 제2 상보성결정영역(complementarity determining region: CDR2)의 적어도 일부분을 포함하는 15 내지 30 아미노산으로 된 면역원성 T 세포 수용체 펩티드를 사용하는 자가면역 질병 치료법을 개시하였다. 장(Zhang)에 의하여 함께 출원 중인 미국특허 출원(60/099,102)에는 면역원성 T 세포 활성화 마커 펩티드와 조합된 면역원성 T 세포 수용체 펩티드를 사용하는 자가면역 질병 치료가 개시되어 있다.

T 세포 수용체 펩티드로 면역접종하는 것이 개선될 수 있는 한 분야는, 공통의 모티프가 만약 있다면, 이들이 MS와 같은 자가면역 질병을 앓는 환자의 T 세포 수용체에서 발견된다는 것을 결정하는 것이다. 그러한 모티프가 발견된다면, 환자는 치료를 촉진하기 위하여, 그 모티프와 동일한 펩티드로 면역접종될 수 있다.

그러므로, 자가면역 질병을 앓고 있는 환자의 T 세포 수용체에서 발견되는 공통 모티프의 아미노산 서열을 확보하는 것이 바람직하다. PCR과 같은 통상의 방법에 의하여 환자 시료에서 그러한 모티프를 쉽게 검출할 수 있는 것이 또한 바람직하다. 더욱이, 그 자가면역 질병을 앓는 환자를 치료하기 위하여 상기 검출된 모티프와 동일한 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 Vβ13.1 T 세포의 서브세트의 T 세포 수용체에서 발견된 그러한 공통 모티프, 아미노산 서열 Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3)인 "LGRAGLTY 모티프" 및 PCR에 의한 그의 쉬운 검출법이 개시되어 있다. 이 모티프는 아미노산 MBP의 83-99 아미노산(이하 "MBP83-99"라 한다)을 인지하는 일부 T 세포의 T 세포 수용체에서 발견되었다. Vβ13.1 T 세포의 이 서브세트의 콘택스트(context) 내의 상기 모티프는 이하 "Vβ13.1-LGRAGLTY"라 한다. 상기 모티프와 동일한 펩티드가 Vβ13.1-LGRAGLTY가 연계된 자가면역 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 환자를 면역접종하는 하는데 사용될 수 있다. 그러한 자가면역 질병 중의 하나는 MS이다.

미국정부는 미국립보건원으로부터 허가번호 NS36140에 따라 본 발명의 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS)과 같은 자가면역 질병의 치료분야와 일반적으로 관련된다. 더욱 구체적으로는, 일부 MS 환자에게서 발견된 T 세포 수용체 서열 및 그 검출방법에 관한 것이다.

다음의 도면은 본 명세서의 일부분을 구성하며, 본 발명의 특정 양상을 보다 잘 설명하기 위하여 포함된 것이다. 본 명세서에 제공된 특정 구체예에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면을 하나 이상 참조하므로써, 본 발명을 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.

도1은 PBMC-유래 PCR 산물의 크로닝 및 서열화(sequencing)의 실험과정을 나타낸 것이다. PBMC 표본으로부터 유래한 cDNA는 LGRAGLTY 모티프의 발현에 대하여 양성인 4개의 PBMC 표본으로부터 유래한 5′Vβ13.1 프라이머 및 3′Jβ프라이머에 의하여 증폭되었고, TA 클로닝 벡터 pCR2.1에 연결되어,E.coli내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA는 M13 프라이머 및 상기 LGRAGLTY-특이적 프라이머에 의하여 탐색되었다. PCR에 의하여 가시적 증폭을 나타낸 양성 플라스미드는 Vβ13.1 프라이머로 VβDβJβ서열의 염기서열을 결정하였다.

도2는 두 MBP83-99 T 세포 클론의 알라닌 하나가 치환된 유사(analog) 펩티드에 대한 반응성 양상을 나타낸 것이다. 동일한 Vβ13.1 재배열(MS7-E2.6 및 MS27-C3.1) 및 비슷한 Vα-Jα 접합부(juntional) 서열(MS7-E2.6 및 MS7-E3.1)을 나타내는 두 쌍의 MBP83-99 T 세포 클론이, [³H]-티미딘 결합 검정으로 알라닌 치환된 펩티드의 패널에 대한 반응성에 대하여 조사되었다. DRB1*1501을 발현하는 생쥐 섬유아세포주가 항원제공세포의 원천으로서 사용되었다. 각 유사 펩티드에 대한 클론의 증식 반응은 72시간 후 측정되었으며, 그 결과는 삽입된 CPM으로 제공되었다. 빗금친 상자는 유사 펩티드에 대한 T 세포 클론의 증식이 >50% 감소한 것을 나타낸다.

도3은 CDR3 올리고뉴클레오티드의 특이성에 대한 원래(original) T 세포 클론 및 관계 없는 T 세포 클론과의 교차시험을 나타낸 것이다. TCR VDJ 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드의 세트가 원래 MBP83-99 T 세포 클론, 또한, 동일 및 다른 개체에서 유래된 관계없는 MBP83-99 T 세포 클론에 존재하는 알려진 목표 DNA 서열을 검출하는 특이성에 대하여 조사되었다. 정방향(forward) 프라이머로서 CDR3-특이적 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머로서 3′-Cβ 프라이머를 사용한 PCR을 행하였다. 짙은 박스표시는 원래 T 세포 클론 또는 상기 CDR3 서열을 공유하는 T 세포 클론에 존재하는 DNA 서열의 양성 검출을 나타낸다. 모든 프라이머는 또한 관련없는 CDR3 서열(빗금친 박스표시)을 가진 임의로 선택된 T 세포 클론의 DNA 산물에 그들이 결합하는지에 대하여 조사되었다.

도4는 MS 환자에게서 유래하는 임의로 선택된 PBMC 표본 내의 모티프 Vβ13.1-LGRAGLTY에 상보적인 목표 DNA 서열의 검출을 나타낸 것이다. 임의로 선택된 MS 환자(n=48)로부터 유래한 PBMC 표본으로부터 제조된 cDNA는 5′-Vβ13.1 특이적 프라이머 및 3′-Cβ 프라이머를 사용한 RT-PCR로 먼저 증폭되었다. 다음으로, 증폭된 PCR 산물은 상기 LGRAGLTY 모티프에 특이적인 디그옥시제닌-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브와 뒤이어 혼성화되었다. 원래의 MBP83-99 클론(MS7-E2.6) 및 관계없는 T 세포 클론(MS32-B9.8)이 각각, 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. MS-7 및 MS-27이 원래 PBMC 표본이고, 이로부터 클론 MS7-E2.6(표1의 MS-7) 및 클론 MS27-C3.1(표1의 MS-27)이 유래되었다. 별표는 DRB1*1501의 양성 발현을 나타낸다.

도5는 정상 피검체로부터 유래한 임의로 선택된 PBMC 표본 내의 Vβ13.1-LGRAGLTY 모티프의 검출을 나타낸 것이다. 20개의 정상 피검체(NS)로부터 얻어진 PBMC 표본은 도4 설명란에 기술한 것과 같은 조건에서 분석되었다. 원래 클론(MS7-E2.6) 및 관계없는 T 세포 클론(MS32-B9.8)이 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용되었다. 별표는 DRB1*1501의 양성 발현을 나타낸다.

도6은 MS 환자 및 정상 피검체로부터 유래한 PBMC 표본 내의 LGRAGLTY 모티프 발현의 반-정량적 비교를 나타낸 것이다. 모티프 Vβ13.1-LGRAGLTY의 발현은 MS 및 정상인의 PBMC로부터 유래한 각 cDNA에서 Cβ발현에 대한 상대적인 반-정량적 PCR에 의하여 분석되었다. 상기 상대적 발현 수준은 (LGRAGLTY 모티프의 발현/Cβ의 발현)×100%로 계산되었다.

도7은 MS 환자로부터 유래한 단기 MBP83-99 T 세포주 내의 Vβ13.1-LGRAGLTY 모티프의 검출을 나타낸 것이다. 독립된 단기 MBP83-99 T 세포주의 패널이 MBP의 합성 83-99 펩티드를 사용하여 5명의 MS 환자로부터 만들어졌다. 이들 모든 T 세포주는 그들이 MBP83-99 펩티드에 대하여 특이적 반응성을 가지는지에 대하여 확인되었다(MBP83-99에 대응한 CPM/대조군 CPM > 5). cDNA 산물은 PCR에서 5′-Vβ13.1 특이적 프라이머 및 3′-Cβ 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 뒤이어 서던 블롯 분석에서 Vβ13.1-LGRAGLTY 모티프에 해당하는 디그옥시제닌-표지 올리고뉴클레오티드 프로브로 혼성화되었다. 원래 MBP83-99 클론(MS7-E2.6) 및 관계없는 T 세포 클론(MS32-B9.8)으로부터 유래한 cDNA 산물은 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다.

한 구체예에서, 본 발명은 서열번호1 또는 여기에 상보적인 또는 그로부터 유래된 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다.

일련의 구체예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 Vβ13.1-LGRAGLTY T 세포에서 발견된 핵산서열의 증폭 또는 검출에 사용될 수 있다. 그러한 구체예의 한 서브시리즈에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 프라이머 쌍으로 사용되고, 상기 프라이머 쌍은 다음을 포함하거나 그로부터 유래되는 것이다:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드로된 제1 프라이머; 및

(b) (a)의 상기 서열을 포함하지 않고, T 세포 수용체 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자(서열번호2)의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견될 수 있는, 길이 약 15 및 30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드인 제2 프라이머로서,

상기 (a) 및 (b)의 서열은 T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는다.

바람직하기로는, 상기 제1 프라이머는 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다.

그러한 구체예의 또 다른 서브시리즈에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프로브로서 사용되며, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음을 포함한다:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드; 및

(b) 표지부위.

바람직하기로는, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 가장 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다. 상기 표지부위는 바람직하기로는³²P 또는 디그옥시제닌(digoxigenin)으로부터 선택되는 것이다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 LGRAGLTY 모티프를 발현하는 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다:

(i) MBP83-99 Vβ13.1 T 세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;

(ii) 상기 핵산 시료를, Vβ13.1 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는 하기 (a) 및 (b)의 서열로부터 선택되거나 유래된 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적이거나 그로부터 유래된 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머; 및

(b) (a)의 상기 서열을 포함하지 않고, Vβ13.1 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역(서열번호2)에서 발견되는 길이 약 15 및 30 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2프라이머;

(iii) LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 검출하는 단계.

바람직하기로는, 상기 제1 프라이머는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 가장 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다.

또한, 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 자가면역 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다:

다음을 포함하는 인간의 자가면역 질병을 치료하는 방법:

(a) 인간으로부터 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 얻는 단계;

(b) 상기한 방법에 의하여 상기 LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 검출하는 단계; 및 만약 핵산이 검출된다면,

(c) Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3) 펩티드를 상기 인간에 주입하는 단계.

또 하나의 구체예에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 자가면역 질병을 모니터링하는 방법에 관한 것이다:

(a) 인간으로부터 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 얻는 단계;

(c) 상기 핵산을 정량하는 단계.

본 발명의 이해를 돕기 위하여, 아래 몇가지 용어를 정의하였다.

"PCR"은 미국특허 제4,683,202호(1987년 7월 28일 멀린스에게 특허부여됨)(본 명세서에 참고문헌으로 포함되어진다)에 일반적으로 개시된 바와 같은, 중합효소연쇄반응을 의미한다. PCR은 선택된 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머가 중합제(폴리머라제와 같은) 및 4개의 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 핵산 주형에 혼성화되고, 확장 산물이 그 프라이머로부터 형성되는 증폭 기법이다. 이들 산물은 그 후 변성되어 추후 검출을 촉진시키기 위하여 기존 핵산의 수와 양을 증폭시키는 주기(cycling) 반응에서 주형으로 사용된다. 다양한 PCR 기법이 이용될 수 있으며, 본 발명에 따른 방법과도 함께 사용될 수 있을 것이다.

"프라이머"는 주형 분자 상의 특정 DNA 서열에 상보적인 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 천연 또는 합성의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

"유래한 프라이머 또는 프로브(primer(s) or probe(s) derived from)"이라는 용어의 문맥에서 "유래한(derived from)"은, 상기 프라이머 또는 프로브는 목록화된 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않고, 목록화된 서열에 대한 변이가 상기 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열, 즉, Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3)을 코드하는 T 세포 수용체 DNA의 검출에서 프라이머로서 작용할 수 있는 능력을 보유하는 정도로 뉴클레오티드 부가, 결실 또는 치환을 포함한 상기 목록화된 뉴클레오티드 서열에 있어서의 변이를 또한 포함한다.

"면역원성(immunogenic)"이란, 펩티드를 기술하기 위하여 사용되는 경우, 그 펩티드는 T 세포 매개성, 항체 또는 둘다의 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 의미한다. "항원성(antigenic)"이란 항체에 의하여 유리형 및 항원-특이적 T 세포의 경우에는 MHC 분자의 콘택스트(context)로 인지될 수 있는 것을 의미한다.

"면역-관련 질병"이란 면역계가 질병의 발병론에 관련되는 질병을 의미한다. 본 발명에 의하여 고려되는 자가면역 질병에는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 전신성 홍반성(全身性紅斑性)루푸스(systemic lupus erythematosus), 자가면역 갑상선염(autoimmune thyroiditis(Hashimoto's thyroiditis)), 그레이브스병(Graves' disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 자가면역 포도막망막염(autoimmune uveoretinitis), 다발성근염(多發性筋炎)(polymyositis) 및 특정 형태의 당뇨병(diabetes)이 포함된다. 본 개시의 관점에서, 당업자라면 본 발명의 조성물 및 방법에 의하여 치료할 수 있는 다른 자가면역 질병을 쉽게 인식할 수 있다. "T 세포 매개성 질병"이란 개체에서 정상적으로 발견되는 펩티드를 인지하는 T 세포의 결과로서 개체에서 일어나는 질병을 의미한다.

"치료(treatment)" 또는 "치료하는 것(treating)"이란 질병으로부터 동물의 보호에 관한 것인 경우, 질병을 예방, 억압(suppressing) 또는 억제(repressing)하는 것을 의미한다. 질병을 예방하는 것이란 질병이 유도되기 전에 본 발명의 조성물을 동물에 주입하는 것과 관련된다. 질병을 억압하는 것이란 질병의 유도 후, 그러나 그 임상적 출현 전에 본 발명의 조성물을 동물에 주입하는 것과 관련된다. 질병을 억제하는 것이란 질병의 임상적 출현 후에 본 발명의 조성물을 동물에 주입하는 것과 관련된다. 인간의 치료에 있어서, 질병 유도의 과정에서 본 발명의 조성물이 언제 주입되어야 될지를 항상 알 수 있는 것은 아니다라는 것을 이해할 수 있을 것이다.

한 양상에서, 본 발명은 다음 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 관한 것이다:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드인 제1 프라이머; 및

(b) (a)의 상기 서열을 포함하지 않고, Vβ13.1 T 세포 내의 T 세포 수용체 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는, 길이 약 15 및 30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드인 제2 프라이머로서,

바람직하기로는, 상기 제1 프라이머는 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다. 가장 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 상기 프라이머는 인간 Vβ13.1 T 세포의 T 세포 수용체를 코드하는 유전자의 단편, 아미노산 모티프 Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3)을 포함하는 단편을 증폭하기 위하여 고안된 것이다. LGRAGLTY 모티프를 포함한 T 세포 수용체를 코드하는 Vβ13.1 T 세포로부터 유래한 유전자의 서열은 GenBank, 허가번호 AF117132로 제출되었다. LGRAGLTY 모티프를 포함한 T 세포 수용체를 코드하는 Vβ13.1 T 세포로부터 유래한 유전자는 서열번호2로서 본 명세서에 제공되었다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, Vβ13.1 T 세포로부터 유래한 T 세포 수용체 유전자의 약 400bp의 단편은 CDR3 영역에 있고, 제2 프라이머는 Cβ 영역에 있다. T 세포 수용체 유전자의 Vβ-Dβ-Jβ 영역은 CDR3 및 Cβ사이에 포함되어 있을 것이다. 한 바람직한 구체예에 있어서, 상기 프라이머는 상기한 프라이머 쌍이다.

본 발명에 따른 프라이머에는 또한 프라이머 (a)-(b)로부터 유래된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 상기한 바와 같이 Vβ13.1 T 세포 유래의 T 세포 수용체 유전자의 Vβ-Dβ-Jβ의 거의 동일한 CDR3 또는 Cβ영역에 선택적으로 어닐할 수 있는 능력을 가지거나 포함한다면, 프라이머 (a) 또는 (b)로부터 어떠한 서열도 유래될 수 있다. 더욱 구체적으로는, Vβ13.1 T 세포 유래의 T 세포 수용체 유전자의Vβ-Dβ-Jβ영역의 확인된 영역에 대한 선택성을 보유하는 한, 길이 또는 서열 중 하나 이상의 위치에서의 핵산의 종류에 의하여 프라이머 (a) 또는 (b)와 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 가진 올리고뉴클레오티드이고, 상기 15개의 뉴클레오티드는 프라이머 (a) 또는 (b)의 서열로부터 선택되거나 유래된 일련의 15개의 연속적 핵산과 동일하다. 상기 프라이머는 또한, 프라이머 (a) 또는 (b)의 어느 것으로부터 선택되거나 유래된 서열을 가진 절편을 포함하는 약 30 뉴클레오티드 이하의 어떠한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머 내의 뉴클레오티드 수는 선택성을 유지할 수 있을 만큼 많아야 하고, 효율성 및 프라이머 합성 및 PCR 과정에서의 조작성을 유지할 수 있을 만큼 작아야 한다. 상기 프라이머에는, 프라이머 (a)-(b)의 서열에 대한 변이가 Vβ13.1-LGRAGLTY의 검출에서 프라이머로서 작용할 수 있는 능력을 유지시키는 정도로 뉴클레오티드 결실, 부가 또는 치환을 포함하는 변이를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 Vβ13.1-LGRAGLTY 검출방법은 시료 중의 Vβ13.1-LGRAGLTY의 존재를 검출하는 과정에 상기한 프라이머의 쌍을 사용한다. Vβ13.1-LGRAGLTY의 존재에 대하여 시험되어질 시료는 핵산, 바람직하기로는 DNA이다. 상기 DNA는 게놈 DNA, cDNA, PCR에 의하여 미리 증폭된 DNA, 또는 다른 어떠한 형태의 DNA일 수 있다. 상기 시료는 T 세포 수용체 β체인 유전자를 발현하는 어떠한 동물 또는 인체 조직으로부터 직접 또는 간접적으로 분리될 수 있다. 바람직한 체조직은 말단혈액단핵세포(PBMC)이다. 상기 시료가 게놈 DNA인 경우, 체조직으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 상기 시료가 cDNA이면, 체조직으로부터 직접적으로 분리된 mRNA의역전사에 의하여 간접적으로 분리된다. 상기 시료가 PCR에 의하여 이미 증폭된 DNA이면, 게놈 DNA, cDNA, 또는 다른 어떠한 형태의 DNA의 증폭에 의하여 분리된다.

바람직한 구체예에 있어서, Vβ13.1 T 세포 유래의 T 세포 수용체 유전자의 일부분, LGRAGLTY 모티프를 코드하는 서열을 포함하는 일부분은 Vβ13.1-LGRAGLTY(5′-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3′(서열번호1))의 존재를 검출할 수 있는 능력을 증진시키기 위하여 증폭된다. 상기 증폭은 시료 중의 상기 일부분의 민감하고, 선택적이며 빠른 증폭을 제공하는 어떠한 특정 PCR 기법 또는 장비를 사용한, PCR를 통하여 행하여질 수 있다.

예를 들면, 상기 PCR은 다음 성분을 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 과정을 따를 수 있다: 5㎕ 10×PCR 버퍼II(100mM Tris-HCl, pH8.3, 500mM KCl), 3㎕ 25mM MgCl₂, 1㎕ 10mM dNTP mix, 0.3㎕ Taq polymerase(5U/㎕)(AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, Norwalk, CT), 프라이머 A 30pmol, 프라이머 B 30pmol. 본 명세서에 개시된 관점에서, 숙련자라면 Vβ13.1 T 세포 유래의 T 세포 수용체 유전자의 일부분을 PCR 증폭할 목적으로 적절한 프라이머 A 및 B를 선택할 수 있을 것이다. 상기 혼합물은 시료 DNA 1㎕의 증폭용으로 적당하다. 이하에서는, 증폭될 DNA는 "주형"이라 한다.

일단 시료 DNA가 상기 반응 혼합물에 첨가되면, PCR 반응은 95℃에서 1분(변성), 56℃에서 20초(어닐링) 및 72℃에서 40초(확장)의 증폭 프로파일로 총 35회 실시될 수 있다.

PCR 반응에 있어서, 상기 주형은 열 변성되고, 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 증폭되어질 핵산 서열의 영역에 결합한다. 열 안정성 DNA 폴리머라제가 반응 혼합물 중에 포함되어 있다. 상기 폴리머라제는 적절한 상보적 뉴클레오티드를 첨가함으로써 상보적 DNA에 어닐된 프라이머를 확장시킨다. 바람직한 폴리머라제는 적어도 95℃의 온도에서 안정한 특성을 가지고, 가공성(processivity)이 50∼60이고 확장속도가 분당 50뉴클레오티드 보다 크다.

일반적인 PCR 증폭 반응에는 약 40 PCR 회수가 사용된다. 그러나, 어떤 PCR 반응에서는 적게는 15 내지 20회로, 또는 많게는 50회로 조작할 수 있을 것이다. 각 회는 주형이 약 95℃이상의 온도로 가열되는 융해 단계(melting step)로 구성된다.

다음으로, PCR 반응의 온도는 프라이머를 주형에 어닐시키기 위하여 냉각된다. 이 어닐 단계에서, 반응온도는 약 55℃ 내지 72℃에서 약 20초 동안 조정된다. 특정한 반응에 따라 더 길거나 짧은 시간이 적용될 수 있다.

다음으로, PCR 반응의 온도는 폴리머라제에 의하여 프라이머의 최대 확장이 일어나도록 가열된다. 이 확장단계에 있어서, 반응온도는 70℃ 내지 75℃에서 약 40초 동안 조정된다. 특정한 반응에 따라 더 높거나 낮은 온도 및/또는 더 길거나 짧은 시간이 적용될 수 있다.

더욱이, 제1회가 시작되기 전에, 반응 혼합물을 약 5 내지 15분의 기간 동안 시작 변성(initial denaturation)을 시킬 수 있다. 비슷하게, 최종회가 끝난 후에,반응 혼합물을 약 5 내지 10분의 기간 동안 최종 확장을 시킬 수 있다.

증폭은 2단계 PCR을 사용하여 행할 수 있다. 이 기법에서, 첫 번째 PCR 증폭 반응은 관심있는 영역 보다 크고, 그 영역을 포함하는 최초 영역을 증폭하기 위하여 실시된다. 다음으로, 두 번째 PCR 증폭 반응은, 주형으로서 첫 번째 영역을 사용하여, 관심있는 영역을 증폭하기 위하여 실시된다. 첫 번째 PCR 반응의 프라이머 중 어느 하나가 두 번째 PCR 반응에 사용될 수 있으면, 상기 두 번째 PCR은 "반-둥지(semi-nested)"형이다. 첫 번째 PCR 반응의 프라이머 중 어느 것도 두 번째 PCR 반응에 사용될 수 없으면, 상기 두 번째 PCR은 "둥지(nested)"형이다.

본 발명의 방법을 실시하는 바람직한 방법으로서, Vβ13.1-LGRAGLTY 모티프는 2단계 PCR로 증폭된다. 첫 번째 PCR 반응에서, 시료는 T 세포 수용체 유전자의 Vβ 영역에 어닐하는 첫 번째 프라이머와 T 세포 수용체 유전자의 Cβ영역에 어닐하는 두 번째 프라이머를 사용하고, 상기한 반응 혼합물 및 반응 프로파일을 사용하여 증폭된다. 첫 번째 PCR 반응은 약 600bp이고, Vβ로부터 Vβ-Dβ-Jβ 접합부를 거쳐 Cβ까지 확장하는 제1 영역을 증폭한다. 두 번째 PCR 반응은 둥지 또는 반-둥지형이다; 제1 영역의 일부분이 프라이머 (a)-(b)를 사용하여 부분적으로 증폭된다. 두 번째 PCR 반응은 관심있는 영역을 증폭시킨다.

시료 중의 Vβ13.1-LGRAGLTY를 코드하는 어떠한 DNA를 증폭시킨 후, 상기 증폭 산물은 검출되어진다. 이 검출(detection)은 많은 과정에 의하여 행하여질 수 있다. 예를 들면, 증폭산물의 분액이 전기영동겔 상에 로드되고, 여기에 DNA분자를 크기에 의하여 분리시키기 위하여 전기장을 적용시킬 수 있다. 또 다른 방법에서는, 상기 증폭 산물의 분액이 SYBR 그린, 에티디움 브로마이드 또는 다른 DNA에 결합하여 검출가능한 신호를 내는 분자로 염색된 겔 상에 로드된다. 예를 들면, 이티디움 브로마이드는 DNA에 결합하고 자외선에 조사되면 가시광선을 발한다. 대안으로, 건조된 겔에는 증폭된 주형의 서열의 일부분에 상보적인 방사능- 또는 화학적으로-표지된 올리고뉴클레오티드(이하에서는 "올리고뉴클레오티드 프로브"라 한다)를 포함하고, 이로부터 겔을 필름에 노출시켜 오토라디오그래프가 얻어진다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브에 관한 것이다:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드; 및

(b) 표지부위.

바람직하기로는, "(a)"는 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다. 바람직하기로는, 상기 표지부위는³²P 또는 디그옥시제닌(digoxigenin)으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 프라이머를 사용하여 만들어진 증폭산물의 검출용으로 유용한 일반적인 방사능표지된 올리고뉴클레오티드는 Vβ-Dβ-Jβ 영역으로부터 얻어진다. Vβ13.1-LGRAGLTY 영역이 LGRAGLTY 모티프를 코드하는 서열에 해당하는 프라이머가 사용되는 상기한 2단계 반-둥지형 PCR에 의하여 증폭된다면, 증폭된 Vβ13.1-LGRAGLTY 영역 중의 어느 한 가닥의 일부분과 상보적인 약 10 뉴클레오티드 이상의, 바람직하기로는 약 18 뉴클레오티드 이상의, 어떠한 올리고뉴클레오티드라도 사용될 수 있다. 더 바람직하기로는, 올리고뉴클레오티드 5′-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3′(서열번호1) 또는 여기에 상보적인 핵산 서열이 프로브로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 제1프라이머(a)를 포함하는 시험 키트를 포함한다.

한 바람직한 구체예에서, 상기 시험 키트는 (a) 서열을 포함하지 않고 T 세포의 Vβ13.1 T 세포 수용체 유전자의 Vβ 내지 Jβ 영역 내에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 핵산인 제2프라이머(b)를 더 포함하고,

상기 (a) 및 (b)의 서열은 T 세포 수용체 유전자의 같은 가닥 상에서 발견되지는 않는다.

보다 바람직하기로는, 상기 제1프라이머는 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다. 가장 바람직하기로는, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드이다.

이 구체예에 있어서, 상기한 PCR 기법에 의한 Vβ13.1-LGRAGLTY DNA의 증폭에 유용한 적어도 한가지 시약을 더 포함한다. 상기 키트에 포함될 수 있는 예시적인 시약으로는, 버퍼, 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트,Taq폴리머라제와 같은 열안정성 DNA 폴리머라제, 양성 대조군용 Vβ13.1-LGRAGLTY DNA 및 음성 대조군용 비-Vβ13.1-LGRAGLTY DNA가 포함될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 시험 키트에 포함되어질 수 있는 다른 시약들은 당업자에게 알려져 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 시험 키트는 표지부위를 더 포함한다. 바람직하기로는, 상기 표지부위는³²P 또는 디그옥시제닌(digoxigenin)이다.

본 발명은 또한 자가면역 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 질병은, 적어도 일부의 환자에 대하여, LGRAGLTY를 포함하는 T 세포 수용체가 Vβ13.1 T 세포 상에서 발견되는 질병이다. 다른 형태의 T 세포, 및/또는 LGRAGLTY 모티프를 포함하는 T 세포 수용체가 결여된 Vβ13.1 T 세포가 환자에 의하여 제공될 수 있다.

상기 자가면역 질병을 치료하는 방법은 다음을 포함한다:

(a) 인간으로부터 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 얻는 단계;

(b) 상기한 방법에 의하여 상기 LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 T 세포 내에서 검출하는 단계; 및 만약 핵산이 검출된다면,

상기 자가면역 질병은 LGRAGLTY 모티프를 포함하는 T 세포 수용체가 Vβ13.1T 세포 상에서 발견되는 어떠한 자가면역 질병이라도 될 수 있다. 본 발명에 의하여 고려된 자가면역 질병에는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 전신성 홍반성(全身性紅斑性)루푸스(systemic lupus erythematosus), 자가면역 갑상선염(autoimmune thyroiditis(Hashimoto's thyroiditis)), 그레이브스병(Graves' disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 자가면역 포도막망막염(autoimmune uveoretinitis), 다발성근염(多發性筋炎)(polymyositis) 및 특정 형태의 당뇨병(diabetes)이 포함된다. 바람직한 자가면역 질병은 다발성 경화증(MS)이다.

LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산이 상기한 방법에 의하여 검출된다면, 자가면역 질병은 Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3)을 포함하는 펩티드를 주입하므로써 치료될 수 있다. 상기 펩티드는 단독으로, 또는 T 세포 활성화 마커 펩티드와 조합으로 주입될 수 있다. 바람직하기로는, 상기 펩티드가, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 장(Zhang)의 미국 특허출원 60/099,102호에 개시된 바에 의하면, T 세포 활성화 마커 펩티드와 조합으로 주입되는 것이다. 상기 펩티드의 주입에 의하여 면역원성 반응이 일어나며, 이 경우 상기 환자는 Vβ13.1 T 세포 상에서 발견된 T 세포 수용체의 LGRAGLTY 모티프를 인지하고 결합하는 항체 및 T 세포 수용체를 만들게 된다.

Vβ13.1-LGRAGLTY는 MS를 앓고 있는 환자 및 그 질병을 앓고 있지 않는 정상인 모두에 존재할 수 있기 때문에, Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3)펩티드는 MS 환자 및 정상인 모두에 주입될 수 있는 것으로 생각된다.

또 다른 구체예에 있어서, LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산이 상기한 방법에 의하여 검출된다면, 자가면역 질병은 상기 핵산을 정량하므로써 모니터될 수 있다. PBMC와 같은 시료에 존재하는 핵산의 양이 많으면 많을수록, Vβ13.1 T 세포의 수는 더 많고, 자가면역 질병 증상이 혹독할 가능성은 더 크다. 또한, 증가된 Vβ13.1 T 세포 수준을 제공하는 것과 증상의 출현 사이의 시간에 따라, 임상의사는 증상이 출현하기 전에 증상의 혹독함을 최소화시키기 위한 치료를 적용하기 위한 기회 및/또는 질병을 치료하기 위한 기회를 가질 수 있게 된다.

다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위한 것이다. 다음의 실시예들에 개시된 기법들은 본 발명의 실시에 있어서 잘 기능하도록 하기 위하여 본 발명자들에 의하여 발견된 기법을 나타내는 것으로 당업자들에 의해 평가되어져야 하며, 따라서 그 실시를 위한 바람직한 방법을 구성하는 것으로 고려되어져야 한다. 그러나, 본 발명의 개시의 관점에서, 당업자는 개시된 특정한 구체예에 대하여 많은 변형을 가하더라도, 여전히 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것은 평가되어야 한다.

실시예1

T 세포 수용체 Vβ-Dβ-Jβ DNA 서열 및 다른 MS 환자로부터 유래한MBP83-99 특정 T 세포 클론들 사이에 공유된 서열 모티프

20개의 CD4+ 독립 T 세포 클론의 패널이 7명의 MS 환자로부터 얻어졌다. 모든 T 세포 클론들은 항원제공세포로서 DRB1*1501로 형질도입된 생쥐 섬유아세포(L 세포)를 사용하므로써 결정된 HLA-DR2의 콘택스트(context) 중의 미엘린 염기성 단백질(MBP83-99)의 83-99 펩티드를 인지하였다. T 세포 클론들은 Vα- 및 Vβ-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 역전사체 PCR(RT-PCR)로 TCR V 유전자 재배열에 관한 특징을 밝혔으며, 뒤이어 Vα-Jα 및 Vβ-Dβ-Jβ 접합 영역에 대하여 서열을 결정하였다. 접합 영역의 서열은 표1 및 표2에 나타내었다.

표1은 Vα 유전자 패밀리에 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 패널(사용된 독특한 프라이머의 서열은 각 클론에 해당하는 DNA 서열에 밑줄을 그어 표시하였다)을 사용한 역전사체 PCR에 의하여 Vα유전자 용도에 따라 특징지워진 20개의 독립된 MBP83-99 특이적 T 세포 클론의 패널을 가지고 행한 분석의 결과를 요약한 것이다. 각 클론들의 "Vα", "n", "Jα" 및 "Cα" 부분의 아미노산 서열은 다음과 같이 표1에 나타내었다: "n"은 밑줄로 표시하였고, "Vα" 및 "Jα" 서열은 "n" 서열의 각 측면에 볼드체로 나타내었고, "Cα" 서열은 밑줄이 없는 정상 폰트로 나타내었다. 상기 증폭된 PCR 산물을 디그옥시제닌-표지된 CαcDNA 프로브와 혼성화시켰으며, 뒤이어 DNA 서열을 분석하였다.

표2는 20개의 독립된 MBP83-99 특이적 T 세포 클론들의 패널을 분석한 결과를 요약한 것이다. 상기 클론들은 26개의 Vβ유전자 패밀리에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트(각 클론에 대한 특이적 프라이머 서열은 해당 DNA에 밑줄을 그어 나타내었다)를 사용한 역전사체 PCR에 의하여 Vβ유전자 용도에 대하여 분석되었다. 각 클론의 "Vβ", "D", "Jβ" 및 "Cβ" 부분은 다음과 같이 표2에 나타내었다: "D"부분은 밑줄로 나타내고, "Vβ" 및 "Jβ" 서열은 "D" 서열의 각 측면에 볼드체로 나타내었고, 나머지 서열 "Cβ"는 정상 폰트(밑줄 또는 볼드체로 나타내지 않은)이다. 증폭된 PCR 산물을 디그옥시제닌-표지된 CβcDNA 프로브와 혼성화시켰으며, 뒤이어 DNA 서열을 분석하였다.

Vα 및 Vβ 재배열은 개개의 MBP83-99 T 세포 클론간에 다르더라도, 많은 이들 독립된 T 세포 클론들이 동일한 Vα-Jα및 Vβ-Dβ-Jβ 접합 영역 서열을 가진 동일한 Vα 및 Vβ체인을 공유하는 주어진 개체로부터 유래하였다. 이러한 사실은 이전에 보고된 바(Vandevyver 1995, Wucherpfennign 1994)와 같이 주어진 MS 환자 에서의 MBP83-99 특이적 T 세포의 체내(in vivo) 클론 확장(clonal expansion)과 일치한다.

흥미로운 것으로, 표1 및 표2에 표시한 바와 같이, 독립된 T 세포 클론(클론 E2.6)은 다른 환자(MS-2)로부터 얻어진 4 T 세포 클론(클론 C3.1, D7.16 및 F3.4) 중 3개와 동일한 Vβ13.1 및 Vα17을 공유하는 한 환자(MS-1)로부터 유래하였다. 이들 T 세포 클론들 중 Vβ13.1은 Vβ-Dβ-Jβ 접합 영역 내의 동일 DNA 서열을 공유한다.

표1: MBP83-99 펩티드에 특이적인 TCR Vα 유전자

표2: MBP83-99 펩티드에 특이적인 TCR Vβ 유전자

실시예2

Vβ-Dβ-Jβ-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 원래의 MBP83-99 T 세포를 포함하는 PBMC 뿐만 아니라 원래의 MBP83-99 T 세포 클론에 존재하는 해당DNA 서열을 검출하는데 아주 특이적이며 민감하다.

14개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 독립된 MBP83-99 T 세포 클론의 Vβ-Dβ-Jβ 접합 영역 내의 DNA 서열에 따라 합성되었고, 뒤이어 RT-PCR에 있어서의 그 특이성에 대하여 검사되었다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열은 표3에 나타내었다.

표3. Vβ-Dβ-Jβ-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열

이들 Vβ-Dβ-Jβ-특이적 프라이머들은 원래의 MBP83-99 T 세포 클론에 존재하는 DNA 서열에 배타적으로 결합하고, 관계없는 MBP83-99 T 세포 클론으로부터 유래한 서열에는 결합하지 않았으며(도2), 이는 그들이 원래의 Vβ-Dβ-Jβ DNA 서열에 대하여 높은 특이성이 있음을 암시한다. 유일한 예외는 클론 MS1-E2.6 및 클론 MS2-C3.1로 나타내었으며, 여기서 동일한 프라이머가 두 T 세포 클론에 의하여 공유되는 Vβ-Dβ-Jβ 접합 DNA 서열에 결합하였다.

Vβ-Dβ-Jβ 올리고뉴클레오티드 프라이머의 특이성 및 PCR 검출 시스템의 높은 민감도가 주어진다면, 5′Vβ 프라이머 및 Vβ-Dβ-Jβ-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 이 2단계 PCR 검출 시스템이, MBP83-99 T 세포 클론이 유래한 말단혈액단핵세포(PBMC) 표본에 존재하는 해당 Vβ-Dβ-Jβ DNA 서열을 검출하는데 사용될 수 있을지에 대하여 살펴보았다. 두개의 별개 실험결과는 원래 PBMC 표본에서 Vβ-Dβ-Jβ 서열의 양성 검출을 보였다. 따라서, 이러한 사실들은 Vβ-Dβ-Jβ 서열이 지문으로서의 역할을 한 PCR 검출 시스템은 동일한 DNA 서열을 탐침하므로써 말단혈액단핵세포에 존재하는 MBP83-99 T 세포를 추적하는데 특이적이고 민감하다는 것을 입증하는 것이다.

실시예3

다른 MS 환자 및 건강인으로부터 유래한 PBMC 표본 중의 공통의 Vβ-Dβ-Jβ DNA 서열의 검출

다음으로, MBP83-99 T 세포 클론의 Vβ-Dβ-Jβ 접합 영역에 해당하는 DNA 서열이 MS 환자 및 건강인의 그룹으로부터 무작위로 선택된 PBMC 표본에서 검출될 수 있을 지에 대하여 조사하였다. 해당 Vβ 패밀리(첫 번째 PCR에서)에 특이적인 프라이머 및 Vβ-Dβ-Jβ 서열에 특이적인 프라이머(두 번째 반-둥지 PCR)를 사용한 동일한 PCR 증폭 시스템이 채용되었다. 이는 혼성화를 행하기 위하여 해당 Vβ-Dβ-Jβ 프로브를 사용한 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)과 조합되었다. 2단계 PCR 검출 시스템의 특정한 요건 및 Vβ-Dβ-Jβ 프라이머 및 프로브의 특이성이 만족된다면, 확인된 DNA 서열은 특정 TCR Vβ 체인으로부터 유래하여, 관심있는 Vβ-Dβ-Jβ 서열과 동일하거나 비슷하다는 것을 나타낼 것이다.

결과에 의하면, 단지 하나의 Vβ-Dβ-Jβ 올리고뉴클레오티드 프라이머(MS1-E2.6, Vβ13.1-LGRAGLTY)만이 다른 MS 환자로부터 얻어진 48개의 PBMC 표본 중 15개(31%)에서 상보적 TCR Vβ13.1 DNA 서열을 검출하였다. 따라서, 이러한 사실은 이들 MS 환자에 Vβ13.1-LGRAGLTY를 발현하는 MBP83-99 T 세포가 존재한다는 것을 나타낸다. 비슷한 실험 조건에서, 동일한 프라이머가 또한 건강인으로부터 유래한 20개의 PBMC 표본 중 5개(25%)에서 해당 DNA를 검출하였다. 나머지 13개의 Vβ-Dβ-Jβ 프라이머는 동일한 PBMC 표본 패널에서 어떠한 서열 신호(signal)도 확인하지 못했다. 상기 결과는 3개의 별개 실험에서 재현성이 있었다. 증폭을 위한 첫 번째 PCR에서 Vβ13.1-특이적 프라이머가 사용되었기 때문에 확인된 DNA 산물은 Vβ13.1을 발현하는 T 세포로부터 유래한 E2.6 프라이머에 의하여 증폭되었다.

더욱이, 상기 확인된 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열은, 그 PBMC 표본이 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열을 포함하는 것으로 나타난 5명의 MS 환자(MS-35, MS-36 및 MS-39)로부터 만들어진 24개의 단기 MBP83-99 T 세포주 중 13개(54%)에서 또한 증폭되었다. 따라서, 상기 결과에 의하여 Vβ13.1-LGRAGLTY DNA 서열이 MBP83-99를 인지하는 T 세포로부터 유래한 PBMC 표본에서 검출된다는 것이 확인되었다. 이러한 사실은 또한 Vβ13.1-LGRAGLTY DNA 서열을 발현하는 MBP83-99 T 세포가 일부 MS 환자에게서 발견되는 MBP83-99 T 세포주의 전부 또는 대부분을 나타낸다는 것을 암시하고 있다.

Vβ-Dβ-Jβ 서열이 지문으로 사용된 조합된 PCR-DNA 혼성화 검출 시스템은, 동일한 Vβ-Dβ-Jβ 접합 서열을 검출하므로써 항원-특이적 T 세포를 추적하는데 강력한 도구를 제공하였다. 상기 검출 시스템의 높은 특이성 및 민감도로 인하여 말단혈액 T 세포 내의 특이적 Vβ-Dβ-Jβ 서열을 확인할 수 있게 되었다. 본 연구에 의하여 면역우성인 MBP의 83-99 펩티드를 인지하고, 동일한 Vβ-Dβ-Jβ 서열을 균일하게 발현하는 Vβ13.1 T 세포의 공통의 서브세트가 MS 환자의 약 30%에 존재한다는 것이 입증되었다. 이러한 결론은 본 명세서에 기재된 단계적 실험에 근거한 것이다. 먼저, 동일한 DNA 서열(Vβ13.1-LGRAGLTY)이 다른 MS 환자로부터 유래한 독립된 MBP83-99 T 세포 클론 중에서 발견되었다. 두 번째, 상기 서열은 다른 MS 환자로부터 유래한 PBMC 표본의 TCR Vβ13.1로부터 증폭된 cDNA 산물에서 확인되었다. 세 번째, 상기 DNA 서열은 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열을 포함하는 것으로 나타난 PBMC 표본으로부터 만들어진 단기 독립된 MBP83-99 T 세포에서 검출되었다. Vβ13.1-LGRAGLTY 서열을 발현하는 MBP83-99 T 세포는 일부 MS 환자로부터 만들어진 MBP83-99 T 세포주의 전부 또는 대부분을 나타내는 것처럼 보인다. 마지막으로, PBMC 표본에 있어서 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열의 존재는 재조합 DNA 클로닝 및 직접적 DNA 서열결정에 의하여 확인되었다.

더욱이, 공통의 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열을 발현하는 MBP83-99 세포가 일부 건강인에게서도 또한 존재한다는 사실은 놀라운 것이다. 지금까지 보고된 연구에 의하면, 면역우성인 83-99 펩티드를 인지하는 T 세포를 포함한, MBP-반응성 T 세포는 일부 건강인에게서도 또한 존재한다는 것을 나타내고 있다(Zhang 1994, Ota 1990).그러나, 이들 T 세포는 건강인에서와는 달리(Zhang 1994), MS 환자에게서는 체내(in vivo) 활성화 및 클론 확장을 한다는 기능적 차이가 있다.

공통의 Vβ-Dβ-Jβ 서열을 공유하는 이들 Vβ13.1 MBP83-99 T 세포는 일부 MS 환자에게서 발견된 MBP83-99 T 세포의 중요한 일부분을 나타내는 것일 수 있다. 이러한 가능성은, 2회의 자극주기 후 MS 환자로부터 만들어진 단기 MBP83-99 T 세포주의 40%에 Vβ13.1-LGRAGLTY 서열이 존재한다는 관찰에 의하여 지지된다.

확인된 공통의 Vβ-Dβ-Jβ 서열은, 질병과 연관될 가능성이 있는 체내 클론 확장 및 체내 활성을 모니터할 목적으로 큰 MS 환자 그룹의 혈액 및 뇌척수액 중의 MBP83-99 T 세포의 공통의 서브세트를 검출하기 위한 정량적 PCR 검출 시스템에 있어서, 특이적 마커로서 사용될 수 있다. MBP-반응성 T 세포의 시험관 내(in vitro) 선발 및 확장이 세포 배양액 내에 내재하는 다양한 저해 인자에 의하여 종종 방해되었기 때문에, 이 방법은 종래의 세포 배양-기초 검정(assay)보다 우수하다. 이러한 사실은 MBP-반응성 T 세포의 빈도가 MBP-반응성 T 세포를 정량하기 위하여 직접적 체외(ex vivo) 분석법이 채용되는 경우, MS 환자에게서 놀라울 정도로 높다는 것이 발견된 최근의 연구와 일치한다(JEM 1997의 최신 저자로서 Hafler).

더욱이, TCR에 해당하는 합성 펩티드는 MS 환자에게서 MBP-반응성 T 세포에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타났다(Chou 등, J.I.). 그러므로, 공통의 CDR3 서열을 포함하는 TCR 펩티드는, MBP83-99 T 세포가 공통의 CDR3 서열 모티프를 가지고 있는 환자 그룹 내의 MBP-반응성 T 세포의 특정한 서브세트를 억제하기 위한 항-이디오타입 T 세포를 유도하는데 있어서, 아주 큰 잠재력이 될 수 있다. 그러한 공통의 CDR3 펩티드로 면역접종하는 것은 MS 환자의 잠재적 치료 과정으로서 CDR2 펩티드나 개인간-독립적인 CDR3 펩티드에 비하여 유리할 것이다(Vandenbark 1996).

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법들은 본 발명의 개시의 관점에서 과도한 실험을 행할 필요없이 만들어지고 실시될 수 있다. 비록 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구체예의 관점에서 기술되었더라도, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 본 명세서에 기재된 상기 조성물 및/또는 방법 및 상기 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형을 가할 수 있다는 것은 당업자에게 분명하다. 더욱 구체적으로는, 동일 또는 비슷한 결과를 얻으면서, 화학적으로 및 생리학적으로 관련이 있는 어떤 약제(agent)가 본 명세서에 기재된 약제를 대신하여 사용될 수 있다는 것은 명확하다. 당업자에게 분명한 모든 그러한 비슷한 치환 및 변형들은 첨부한 청구의 범위에 의하여 정의된 본 발명의 정신, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.

Claims

서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는 하기 제1 및 제2프라이머의 서열을 포함하는 프라이머 쌍:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제1 프라이머; 및

(b) (a)의 상기 서열을 포함하지 않고 T 세포 수용체 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 핵산을 포함하는 제2 프라이머.
제4항에 있어서, 상기 Vβ13.1 유전자 서열은 서열번호2인 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
다음을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드; 및

(b) 표지부위.
제6항에 있어서, 상기 표지부위는³²P 또는 디그옥시제닌(digoxigenin)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
다음을 포함하는 T 세포 수용체 LGRAGLTY 모티프를 발현하는 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 검출하는 방법:

(a) MBP83-99 Vβ13.1 T 세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;

(b) 상기 핵산 시료를, T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는 하기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열로부터 선택되거나 유도된 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;

(i) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제1 올리고뉴클레오티드; 및

(ii) 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 서열을 포함하지 않고 T 세포 수용체 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제2 올리고뉴클레오티드.

(c) LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 검출하는 단계.
제8항에 있어서, Vβ13.1 유전자 서열은 서열번호2인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 핵산 시료의 단편은 폴리머라제연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭된 것임을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 검출단계는 다음을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브로 탐침하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; 및

(b) 표지부위.
제10항에 있어서, 상기 검출단계는 오토라디오그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하고, 길이가 약 15∼30 뉴클레오티드인 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 시험 키트.
제13항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 서열을 포함하지 않고 T 세포 수용체 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제2 올리고뉴클레오티드를 더 포함하며, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열은 T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
제14항에 있어서, 상기 Vβ13.1 유전자 서열은 서열번호2인 것을 특징으로 하는 시험 키트.
제13항에 있어서,³²P 또는 디그옥시제닌(digoxigenin)으로부터 선택되는 표지부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
다음을 포함하는 인간의 자가면역 질병을 치료하는 방법:

(a) 인간으로부터 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 얻는 단계;

(b) MBP83-99 Vβ13.1 T 세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;

(c) 상기 핵산 시료를, T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는 하기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열로부터 선택되거나 유도된 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;

(i) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제1 올리고뉴클레오티드; 및

(ii) 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 서열을 포함하지 않고 T 세포 수용체 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제2 올리고뉴클레오티드.

(d) 상기 LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 검출하는 단계; 및 만약 핵산이 검출된다면,

(e) Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호3) 펩티드를 상기 인간에 주입하는 단계.
제17항에 있어서, 상기 Vβ13.1 유전자 서열은 서열번호2인 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 주입단계는 T 세포 활성화 마커 펩티드를 주입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음을 포함하는 자기면역 질병을 모니터링하는 방법:

(A) 인간으로부터 MBP83-99 Vβ13.1 T 세포를 얻는 단계;

(B) 다음에 의하여 LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 검출하는 단계;

(i) MBP83-99 Vβ13.1 T 세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;

(ii) 상기 핵산 시료를, T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지는 않는 하기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열로부터 선택되거나 유도된 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;

(a) 서열번호1 또는 여기에 상보적인 핵산의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는, 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제1 올리고뉴클레오티드; 및

(b) 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 서열을 포함하지 않고 T 세포 수용체 T 세포 내의 Vβ13.1 유전자의 Vβ내지 Jβ영역에서 발견되는 길이 약 15∼30 뉴클레오티드인 제2 올리고뉴클레오티드; 및

(iii) 상기 LGRAGLTY 모티프를 코드하는 핵산의 존재를 검출하는 단계; 및, 만약 핵산이 검출된다면,

(C) 상기 핵산의 양을 정량하는 단계.
제20항에 있어서, 상기 Vβ13.1 유전자 서열은 서열번호2인 것을 특징으로 하는 방법.