KR20020012611A - 프로모터 - Google Patents

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KR20020012611A
KR20020012611A KR1020017016218A KR20017016218A KR20020012611A KR 20020012611 A KR20020012611 A KR 20020012611A KR 1020017016218 A KR1020017016218 A KR 1020017016218A KR 20017016218 A KR20017016218 A KR 20017016218A KR 20020012611 A KR20020012611 A KR 20020012611A
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KR1020017016218A
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도날드손아이아인알라스데어
라스무쎈토마스브루운
Original Assignee
부쳐-랄슨 에이.
대니스코 에이/에스
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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Abstract

프로모터가 기술되었다. 프로모터는 서열번호 1에 나타난 것에 상응한 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 상동체 또는 유도체로 구성된다.

Description

프로모터{Promoter}
식물 유전자의 발현은 식물의 라이프 사이클(life cycle) 동안 복잡한 패턴 내에서 조절된다. 일부 과정은 유전자 발현의 이러한 조절에 포함된다. 주요한 단계는; 전사의 개시; 전사의 종결; 전사체의 처리; mRNA의 리보솜으로의 운반; 및 번역이다.
발현되는 식물 유전자의 3개의 예는RSus1, RSus2및RSus3으로 명명된 3개의 쌀 슈크로스(sucrose) 합성효소 이소진(isogene)을 보고한 Huang et al (1996 Biosci Biotech Biochem 60(2):233-239)에 나타나 있다. 또한 저자는 그들의 발현의 차별적 조절을 보고하였다. 저자는RSus2및RSus3의 유전자 조직화 패턴이 동일하다고 기술하였다.
유전자 발현을 조절하는 주요 과정 중의 하나는 전사의 개시이다. 전사는 일부 전사 인자와 함께 RNA 중합효소가 프로모터 구역에 결합함으로서 개시된다. 프로모터 내의 특이적 조절 DNA 서열(cis-요소)은 이러한 전사 인자(트랜스-액팅(trans-acting) 인자의 결합 사이트로 작용한다.
식물 유전자 프로모터 내에서 발견되는 cis-요소는 2개의 카테고리로 나뉠 수 있다. 첫 번째 카테고리는 전사의 개시에 포함되는 이들 cis-요소로 구성된다. TATA 박스 및 CAAT 박스는 전사 개시에 포함된 기부의(proximal) cis-요소의 예이다. CAAT 박스는 RNA 중합효소의 결합 사이트를 정의하고, TATA 박스는 RNA 중합효소가 전사 시작 사이트를 교정하도록 지시한다. 일반적으로 다수의 CAAT 박스의 존재는 구성적(constitutive) 프로모터를 나타낸다. TATA 박스 및 CAAT 박스는 원핵세포와 진핵세포 사이에서 보존되나, 일부 식물 유전자 프로모터의 기능에는 필수적이지 않다. 두 번째 카테고리는 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절에 포함된 cis-요소로 구성된다. 종자 저장 단백질(글루타민(Glutamins), 레구민(Legumins), 프롤라민(Prolamins) 등)을 인코딩하는 유전자는 시간적으로 및 공간적으로 조절되어 조직-특이적 및 발달적 방식으로 발현되는 유전자의 예이다. 배유-특이적 cis-요소의 예는 AACA 모티프(motif) 및 배유 박스이다. 이러한 배유 저장 단백질 유전자의 조직-특이적 및 발달적 발현에 기여하는 cis-요소는 광범위한 종자 저장 단백질 유전자 사이에서 보존된다.
전사 인자의 복합적 패턴이 특이적 cis-요소에 작용하는 방식은 유전자가 다소 구성적으로 발현하는지 또는 발달 동안의 특별한 시간에 발현하는지를 결정한다. 더욱이 이러한 상호작용은 발현이 일부 조직 즉, 종자의 것에 의해 디스플레이되는 배유와 같은 특이적 조직 내에서 발생하는지 또는 식물의 모든 부분에서 일반적인지를 결정한다. 다수의 트랜스-액팅 인자는 cis-요소 컨센서스(consensus) 서열의 변이체를 인식하고, 복잡한 발현 패턴을 결합하고, 산출하는 것을 완성할 수 있다. 각각의 식물 유전자 프로모터는 프로모터 서열 및 RNA 중합효소와 상호작용하여 유일한 패턴으로 유전자 발현을 조절하는 한 세트의 전사 인자 및 다른 트랜스-액팅 인자를 지닌다.
생물체의 특정 조직 - 식물과 같은 - 내에서 관심있는 뉴클레오타이드 서열("NOI")의 발현을 지시하는 것이 바람직하다고 알려졌다. NOI는 일반적으로 관심있는 생성물("POI")을 인코드할 것이다. 예를 들어 최적화된 아미노산 조성물을 지닌 농작물 단백질 생성물을 생성하여 농작물의 영양적 가치를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 포유류 생성물의 유전자와 같은 비-식물 유전자를 발현하는 농작물을 이용하는 것도 바람직할 수 있다. 후자 생성물의 예는 인터페론(interferons), 인슐린(insulin), 혈액 인자 및플라스미노겐(plasminogen) 활성자를 포함한다.
그러나 특정 조직 내에서 NOI의 발현을 달성하는 것이 바람직할 수 있는 반면, 때로는 해로운 효과가 발생하는 다른 조직 내에서 NOI가 발현되지 않는다는 것을 확신하는 것이 중요하다(필요하지 않다면). 더욱이 어느 정도의 해로운 효과가 발생하는 생물체의 정상적 신진대사를 교란시키지 않는 것이 중요하다. 예를 들어 식물 잎 또는 슈트(shoot) 내의 정상적 신진대사 상의 교란은 식물의 발육 중단된 생장을 일으킨다.
식물 조직 내에서 NOI 발현을 유발하는 식물 프로모터 사용의 예는 CA-A-2006454에서 발견되며 이는 감자 괴경(tuber) 특이적 조절 구역이 제한된 발현 카세트의 DNA 서열을 기술하였다. 발현 카세트는 파타틴(patatin)-유전자 프로모터를 지닌 파타틴-유전자를 포함한다. DNA 서열은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 식물 게놈으로 트랜스퍼된다. CA-A-2006454에 따라 DNA 서열은 이형적 생성물이 농작물에서 준비되도록 할 수 있다.
그러나 식물 형질전화 과정에서 일반적으로 형질전환 및 재생은 시험될 수 있는 유전적 구조물의 수를 제한하기 때문에 이들 모두 효율성이 낮다. 유전적 조작 효과에 크게 영향을 미칠 수 있는 다른 전사적 프로모터의 강도 및 조직 특이성의 연구는 노동 집약적으로 다루기 힘들 수 있다. 이는 안정한 형질전환체 즉,바이러스(콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 35S 프로모터) 및 아그로박테리움(노팔린(nopaline) 합성효소 프로모터(NOS)) 내에서의 직접적인 형질전환적 발현에 조직-특이적이지 않은 강한 구성적 프로모터를 이용하는 경향을 유발하였다. 모든 조직 내에서의 유전자 발현의 불필요한 억제는 비-타겟 조직의 발달상의 지연 또는 형질전환체의 약화를 유발할 수 있기 때문에 안티센스(antisense) 전사체에 의한 유전자 발현의 감소가 시도될 경우 이러한 접근의 적어도 의심스러운 요소는 발생하지 않는다. 이러한 환경 하에서 유전적 구조물이 유전자 발현을 불충분하게 억제하는 형질전환체만이 선택에서 생존할 것으로 기대된다. 따라서 안티센스 전사를 지시하기 위한 조직-특이적 전사 프로모터의 이용을 위한 강한 주장이 있으나 많은 농작물 종에서 안정한 형질전환체 내의 이러한 프로모터를 특성화하는 것은 형질전환 및 재생의 낮은 효율성으로 인해 실행가능하지 못하다.
당 분야에서 유용한 일부 프로모터가 있다는 사실에도 불구하고 부가적인 프로모터, 특히 NOI의 발현을 가능하게 하는 능력에 있어서 효과적이고, 또는 선택적인 프로모터를 지니는 것이 여전히 필요하다.
따라서 본 발명은 NOI의 발현(전사)을 유발하는 것이 가능한 프로모터 제공하고자 하는 것이다.
또한 특히 본 발명은 특정한 조직, 또는 생물체, 일반적으로 식물의 특정한조직 내의 관심있는 뉴클레오타이드 서열의 발현(전사)을 지시하는 것이 가능한 프로모터 제공하고자 하는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 관점은 청구범위 및 하기의 설명에 나타나 있다.
간단히 본 발명의 일부 관점은 :
1. 선택적인 발현을 가능하게 하는 신규한 프로모터
2. 신규한 프로모터 뉴클레오타이드 서열
3. 상기 프로모터로 구성된 발현 시스템
4. 상기 프로모터를 이용한 발현 방법
5. 상기 프로모터로 구성된 형질전환된 숙주/숙주 세포
에 관한 것이다.
본 발명의 참고문헌에 사용된 바와 같이 "발현", "발현하다", "발현되다" 및 "발현가능한"이라는 용어는 "전사", "전사하다", "전사되다" 및 "전사가능한"이라는 용어와 동의어이다. 따라서 NOI가 코딩 서열인 경우 그의 발현 생성물은 또한 전사 생성물로 불릴 수 있다. 마찬가지로 NOI가 안티-센스 뉴클레오타이드 서열인 경우 그의 전사 생성물은 또한 발현 생성물로 불릴 수 있다.
하기의 설명에서 "본 발명의 뉴클레오타이드 서열"의 참조문헌은 "본 발명의 프로모터"의 참조문헌을 포함한다. 또한 "본 발명의 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 "본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열"과 동의어이다.
본 발명의 프로모터 및/또는 뉴클레오타이드 서열에 관한 또 다른 관점은 : 본 발명의 서열로 구성된 구조물; 본 발명의 서열로 구성된 벡터; 본 발명의 서열로 구성된 플라스미드; 본 발명의 서열로 구성된 형질전환된 세포; 본 발명의 서열로 구성된 형질전환된 조직; 본 발명의 서열로 구성된 형질전환된 기관; 본 발명의 서열로 구성된 형질전환된 숙주; 본 발명의 서열로 구성된 형질전환된 생물체를 포함한다. 또한 본 발명은 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 동일한 것을 이용하여 NOI를 발현하는 방법을 포함한다; 동일한 것을 트랜스퍼하기 위한 방법을 포함한다.
편의상 본 발명의 프로모터는 때로RSus3프로모터(또는 RSus3 프로모터)로 나타낸다. 그러나 본 발명의 프로모터는 Huanget al(ibid)의 학설에 공개되지 않았다는 사실이 중요하다. 더욱이 또한 "RSus3및RSus2의 유전자 조직화 패턴은 동일하다"는 저자의 설명과는 반대로RSus3의 프로모터는RSus2와 매우 다르다는 것을 발견하였다.
이러한 관점에서RSus3프로모터와RSus2프로모터 사이의 매우 낮은 정도의 상동성(즉, 동일성)을 발견하였고, 또한RSus3프로모터와RSus1프로모터도 마찬가지이다 - 하기의 표에 의해 제시된 바와 같이.
얼라인먼트 % 상동성1 % 상동성2
RSus3및RSus1 7.7% 5.4%
RSus3및RSus2 4.6% 5.4%
RSus1및RSus2 4.6% 8.8%
1멀티플 얼라인먼트(multiple alignment)에 기초한 상동성 점수(인트론을 포함한 번역 시작 코돈 상부의 모든 프로모터 구역 :RSus1(2663bp),RSus2(2900bp),RSus3(2667bp))
2멀티플 얼라인먼트에 기초한 사동성 점수(인트론 1의 절단된RSus1,RSus2,RSus3)
상기 표에 나타난 상동성 점수는RSus1,RSus2및RSus3의 프로모터 구역 사이의 낮은 정도의 유사성을 나타낸다.
상동성 백분율은 CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1):237-244)와 유사한 알고리즘에 기초한 DNASISTM(Hitachi Software) 내의 멀티플 얼라인먼트 특색을 이용하여 산출되었다.
더욱이RSus1프로모터,RSus2프로모터,RSus3프로모터의 서열 분석 결과로서 보존된 TATA 박스 및 인트론 스플라이세스 사이트(intron splice site)와는 별도로 일반적으로 어떤 모티프도 지니지 않는다는 것을 발견하였다.
따라서 종래의 당 분야의 학설에 반대로RSus2및RSus3의 유전자 조직화 패턴은 동일하지 않다는 것을 발견하였다.
참조의 편의를 위해 본 발명의 관점은 적당한 섹션 표제 하에 논의될 것이다. 그러나 각각의 섹션 하의 설명은 각각의 특정한 섹션에 항상 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 동일한 것으로 구성된 구조물 및 발현 벡터 및 동일한 것으로 구성된 형질전환된 세포를 포함하는 프로모터에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은 동일한 것으로 구성된 식물뿐만 아니라 식물 세포에 관한 것이다.
도 1은 개략도이다.
도 2는 개략도이다.
도 3은 개략도이다.
도 4는 사진이다.
도 5는 개략도이다.
도 6은 개략도이다.
도 7은 개략도이다.
도 8은 개략도이다.
도 9는 개략도이다.
도 10은 개략도이다.
도 11은 그래프이다.
도 12는 개략도이다.
도 13은 개략도이다.
도 14는 개략도이다.
도 15는 사진이다.
도 16은 사진의 시리즈이다.
도 17은 그래프이다.
도 18은 그래프이다.
도 19는 개략도이다.
도 20은 개략도이다.
도 21은 개략도이다.
도 22는 개략도이다.
도 23은 개략도이다.
도 24는 개략도이다.
도 25는 개략도이다.
도 26은 그래프이다.
부분 Ⅰ - 더욱 상세한 도면
도 1 : 본 발명의 프로모터 및 그와 결합된 서열의 일부의 개략적 묘사이다(not to scale).
도 2 : 포위 제한 사이트를 지닌 pScaK3(pTBR-ScaK3) 내의 RSus3 서열의 지도. 다른 클론은 이에 상동적이나, 일부는 반대 방향을 지닌다.
도 3은 본 발명의 프로모터의 제한 지도이다.
도 4 : 세미-네스티드(semi-nested) PCR의 결과를 나타내는 아가로스 겔. 레인 1 및 12 마커 Ⅱ; 완충액 F와의 레인 2∼6 EcoRV, Dral, Pvull, Scal 및 Sspl; 동일한 완충액 H와의 레인 7∼11.
도 5 : pScaK3 및 pSspK3으로부터의 프로모터 구역은 프라이머 M13 포워드 및 RSusNco로부터 증폭되었다. 증폭된 생성물은 Xhol/Ncol 단편으로서 pGUSNOSt 내의 유일한 Scall 및 Ncol 내로의 직접적인 클로닝을 위한 Xhol 및 Ncol 사이트를 포함한다.
도 6은 구조물의 개략도이다.
도 7은 구조물의 개략도이다.
도 8은 구조물의 개략도이다.
도 9는 구조물의 개략도이다.
도 10은 구조물의 개략도이다.
도 11은 구아 배유의 발달 동안 시간에 따른 슈크로스 합성효소 활성을 나타낸 것이다. 슈크로스 합성효소의 특이적 활성은 개화 후 7∼41일로부터의 다양한 발달상의 단계에 구아 배유로부터의 추출물에서 측정되었다. 각각의 포인트의 값은 각각의 포드(pod)가 모인 적어도 5개 이상의 배유로부터 3에서 4까지 독립적인 측정으로부터 수득된 평균 슈크로스 합성효소 활성이다.
도 12 : pTBR-ScaK3에 대한 서열화 계??의 프리젠테이션(presentation). 화살표는 서열화 프라이머를 나타내고, 숫자는 RSus3 ATG 코돈에 대한 서열화 프라이머의 5' 말단의 대략적인 포지션을 나타낸다.
도 13 : 다양한 RSus3/GUS/NOSt 구조물의 개략적 프리젠테이션. 숫자는 번역 시작 코돈에 대한 염기 쌍을 나타낸다.
도 14 : 다양한 탠덤 RSus3 구조물의 개략적 프리젠테이션. 숫자는 번역 시작 코돈에 대한 염기 쌍을 나타낸다.
도 15 : 탠덤 반복 클론의 대조군 분해의 결과를 나타내는 아가로스 겔. 레인 1 : 740 bp의 특정한 단편을 야기하는 pTandem leg/pro의 HindⅢ 분해. 레인 2 : 570 bp의 특정한 단편을 야기하는 pTandem 레구민(legumin)의 Nhel 분해. 레인 3 : DNA 마커 Ⅵ. 레인 4 : 160 bp의 특정한 단편을 야기하는 pTandem 프롤리민(prolamin)의 HindⅢ 분해.
도 16a는 GUS 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 ENOS 대조군 플라스미드로 탄도성으로 형질전환된 구아의 자엽 조직 사진이다. 이는 대조군 연구이다. 나타나는 바와 같이 높은 수준의 GUS 일시적 발현이 관찰된다.
도 16b는 GUS 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 ENOS 대조군 플라스미드로 탄도성으로 형질전환된 구아의 배유 조직 사진이다. 이는 대조군 연구이다. 나타나는 바와 같이 GUS 일시적 발현이 관찰된다.
도 16c는 GUS 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RSus3 구조물 플라스미드 p1730(본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 단일 복제를 포함함)로 탄도성으로 형질전환된 구아의 자엽 조직 사진이다. 나타나는 바와 같이 매우 낮은 수준의 GUS 일시적 발현이 관찰된다.
도 16d는 GUS 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RSus3 구조물 플라스미드 p1730(본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 단일 복제를 포함함)로 탄도성으로 형질전환된 구아의 배유 조직 사진이다. 나타나는 바와 같이 상당한 수준의 GUS 일시적 발현이 관찰된다.
도 16e는 GUS 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RSus3 구조물 플라스미드 pTandem leg/pro(본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 탠덤 복제를 포함함)로 탄도성으로 형질전환된 구아의 자엽 조직 사진이다. 나타나는 바와 같이 매우 낮은 수준의 GUS 일시적 발현이 관찰된다.
도 16f는 GUS 발현 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RSus3 구조물 플라스미드 pTandem leg/pro(본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 탠덤 복제를 포함함)로 탄도성으로 형질전환된 구아의 배유 조직 사진이다. 나타나는 바와 같이 매우 높은 수준의 GUS 일시적 발현이 관찰된다.
도 17 : RSus3 구조물로의 포격 후 구아 배유 내에서의 일시적 GUS 발현을 나타내는 히스토그램. 데이터는 산출된 표준 오류와 함께 배유 당 청색점의 평균 수로 나타나 있다.
도 18 : 조직 크기 보정 후 구아 조직 내에서의 일시적 GUS 발현을 나타내는 히스토그램. 데이터는 산출된 표준 오류와 함께 자엽 당 청색점의 평균 수로 나타나 있다.
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌 프로모터가 제공된다.
다르게 표현되면 본 발명은 :
(a) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열;
(b) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편인 뉴클레오타이드 서열;
(c) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열;
(d) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 상보적인 뉴클레오타이드 서열;
(e) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈(hybridize) 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열;
(f) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열;
(g) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열;
(h) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열;
(i) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열;
(j) 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열;
(k) (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) 및/또는 (j)의 어느 하나로 구성된 뉴클레오타이드 서열
로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
바람직한 관점에서 프로모터는 벼(Oryza) 속의 식물, 특히 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터 수득 가능하다(실제로 수득가능하지 않더라도).
본 발명의 또다른 관점은 본 발명에 따라서 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 부가적인 관점은 실험실 내에서(즉, 육즙(broth)과 같은 배양 배지 내) 및/또는 생체 내에서(즉, 형질전환된 생물체 내) NOIs를 발현하기 위한 프로모터를 이용하는 것을 포함한다.
더욱 바람직한 관점에서 본 발명은 본 발명의 프로모터에 실시가능하게 연결될 때 NOI를 발현하는 것으로 구성된 배유 내에서 NOI를 발현하기 위한(바람직하게는 배유 내에서 선택적으로 발현하는) 방법을 제공한다.
본 발명에 관하여 여기 사용된 "선택적" 및 "선택적으로"라는 용어는 "특이적" 및 "특이적으로"라는 용어와 동의어이다. 이러한 관점에서 배유층 내에서의 본 발명의 프로모터에 의한 선택적 또는 특이적 발현은 다른 타입의 조직 또는 세포 보다 배유 내에서 더 높은 수준의 발현이 발생한다는 것을 의미한다.
어떤 경우 NOI는 배유 내에서 매우 선택적으로 발현된다. 이러한 점에서 배유층 내에서의 본 발명의 프로모터에 의한 매우 선택적인 또는 특이적인 발현은 다른 타입의 조직 또는 세포 보다 배유 내에서 발현이 우세하게 발생하고, 어떤 경우는 거의 독점적으로 배유층 내에서 발생한다는 것을 의미한다.
바람직하게는 형질전환된 숙주/숙주 세포들은 식물/식물 세포들 이다.
식물은 적당한 단자엽 식물(옥수수와 같은) 또는 적당한 쌍자엽 식물(콩 또는 구아(guar)와 같은)이 될 수 있다.
바람직하게는 식물은 배유성 곡물 또는 콩류가 될 수 있다.
바람직한 관점에서 식물은 화본과의 멤버 - 밀, 옥수수, 보리, 귀리, 호밀 또는 쌀 중 어느 하나와 같은 - 가 될 수 있다.
또다른 바람직한 관점에서 식물은 콩류 - 구아 또는 로커스(locus) 콩 중 어느 하나와 같은 - 가 될 수 있다.
따라서 바람직하게는 형질전환된 숙주는 분류적 그룹 그라미네(Gramineae)(포아세(Poaceae)로 알려진) 또는 레규미노세(Leguminosae)(파바세(Fabaceae)로 알려진)의 형질전환된 멤버 또는 그의 세포 또는 조직이다.
따라서 바람직하게는 형질전환된 식물은 형질전환된 화본과 식물 또는 형질전환된 콩과식물이다.
또한 바람직하게는 형질전환된 식물 세포는 형질전환된 화본과 식물 세포 또는 형질전환된 콩과 식물 세포이다.
본 발명은 많은 이유에 있어서 유리하다.
예로서 본 발명은 NOI의 발현 생성물의 바람직한 수준이 수득될 수 있기 때문에 유리하다. 여기서 예를 들어 NOI 발현 생성물은 인간 또는 동물에 이로운 바람직한 화합물 즉, 바람직한 식료품, 또는 식료품 처리 효과 또는 약제적 효과와 같은 유익한 효과를 지닌 효소일 수 있다.
또한 NOI 발현 생성물은 숙주 내에서 신진대사에 영향을 미친다. 일부의경우 NOI 발현 생성물은 숙주 내에서의 신진대사에 필수적인 구성성분일 수 있다. 이러한 경우 POI가 숙주로부터 회수되는 것이 중요하지 않을 수 있다. 일부의 경우 POI가 숙주로부터 회수되지 않는 것이 중요할 수 있다.
본 발명은 또한 형질전환된 식물 또는 식물 세포가 NOI의 발현 생성물의 바람직한 수준을 발현하는 것을 가능하게 하기 때문에 유리하다.
본 발명은 또한 형질전환된 식물 또는 식물 세포가 NOI의 발현 생성물의 바람직한 수준을 선택적인 조직 또는 세포 타입에서 발현하는 것을 가능하게 하기 때문에 유리하다.
본 발명의 프로모터는 식물 세포 내에서 일시적인 발현 조건 하에서 NOI의 좋은 발현 수준을 제공할 수 있기 때문에 더욱 유리하다.
바람직한 관점에서 프로모터는 서열번호 2에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 연결된다. "연결된"이라는 용어는 직접적 또는 간접적(적당한 스페이서(spacer) 서열(들)의 준비와 같이) 연결을 포함한다.
바람직하게는 서열번호 2에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편은 본 발명의 프로모터와 NOI 사이에 위치한다.
이러한 관점에서 형질전환된 식물(형질전환된 구아와 같이)과 같은 일부 형질전환된 숙주의 경우 NOI의 발현 수준은 증가될 수 있다. 이는 이러한 증가된 발현을 지니는 것이 바람직할 경우 중요하다.
프로모터는 하나 이상의 다른 발현 요소 - "기능적 요소"라도 달리 불리 수 있다 - 와 함께 사용될 수 있다. 이들 부가적인 발현 요소는 본 발명의 프로모터에 연결된다. "연결된"이라는 용어는 직접적 또는 간접적(적당한 스페이서(spacer) 서열(들)의 준비와 같이) 연결을 포함한다.
부가적인 발현 요소는 발현을 강화시키거나 또는 바람직하지 않은 발현을 억제한다.
부가적인 발현 요소는 본 발명의 프로모터 또는 그의 일부분과 동일하거나 다른 프로모터일 수 있다.
본 발명은 또한 프로모터의 반복 유니트(unit) - 적어도 2개 이상의 프로모터 요소로 구성된 탠덤(tandem) 반복과 같은 - 을 포함한다 - 그중 하나는 본 발명의 프로모터가 될 것이다 - 3개 프로모터 요소와 같이.
바람직하게는 부가적인 발현 요소는 본 발명의 프로모터와 NOI의 중간에 위치한다. 바람직한 경우 부가적인 발현 요소 및 본 발명의 프로모터는 적당한 제한 사이트에 의해 분리될 것이다.
이러한 관점에서 형질전환된 식물(형질전환된 구아와 같이)과 같은 일부 형질전환된 숙주의 경우 NOI의 발현 수준은 증가될 수 있다. 이는 이러한 증가된 발현을 지니는 것이 바람직할 경우 중요하다.
하나의 관점에서 NOI는 안티센스 뉴클레오타이드 서열이다.
이러한 점에서 바람직하게는 NOI는 에피머라제(epimerase), 특히 UDP 갈락토스(galactose) 에피머라제, 더욱 특히 UDP 갈락토스-4-에피머라제(EC 5.1.3.3.)를 인코딩하는 유전자 모두 또는 일부분에 안티센스인 서열이다.
NOI가 UDP 갈락토스 에피머라제 - 더욱 특히 UDP 갈락토스-4-에피머라제(EC 5.1.3.3.) - 을 인코딩하는 유전자 모두 또는 일부분에 안티센스인 서열인 경우 본 발명의 프로모터에 의한 안티센스 서열의 발현은 갈락토마난(galactomannan) 또는 세포외 폴리사카라이드(polysccharide) 상에서 갈락토스 유니트에 영향을 미칠 수 있다(그의 감소를 유발하는).
또다른 관점에서 NOI는 센스 뉴클레오타이드 서열이다.
따라서 NOI는 UDP 갈락토스 에피머라제 더욱 특히 UDP 갈락토스-4-에피머라제(EC 5.1.3.3.)를 인코딩하는 유전자 모두 또는 일부분을 구성하는 서열일 수 있다.
프로모터
따라서 본 발명은 신규한 조절적 서열 즉, 프로모터 - RSus3 프로모터라고 불리는 - 에 관한 것이다.
"프로모터"라는 용어는 당 분야의 일반적인 의미 즉, RNA 중합효소 결합 사이트로 사용된다.
프로모터는 자연적으로 발생한 형태와 동일하다 - 이러한 관점에서 바람직하게는 프로모터는 그의 자연적 환경 내에서 존재하지 않는다. 더욱이 또는 그 대신에 프로모터는 분리된 및/또는 정제된 형태이다. 본 발명의 프로모터는 자연적으로 발생한 프로모터의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체가 될 수 있다. 프로모터는 자연적이거나 그렇지 않거나 또는 합성적, 반-합성적 또는 재조합이거나 어떤 적당한 원료로부터 수득될 수 있거나 또는 그에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 프로모터 및 다른 관련된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 뉴클레오타이드 서열은 도 1에 개략적으로 나타난 있다(축적으로 그린 것이 아님).
이러한 점에 있어서 프로모터 서열 서열번호 1은 박스 A로 나타나 있다. 보는 바와 같이 박스 A는 2개의 유니트로 구성된다 - 박스 B 및 박스 C로 도식화된다. 박스 B는 서열번호 6에 상응하고, 박스 C는 서열번호 4에 상응한다. 서열번호 6은 TATA 박스까지의 서열이다. 서열번호 4는 엑손(exon) 서열의 첫 번째 부분이다.
본 발명에 따라 발현은 서열번호 4의 모두 또는 그 일부분의 부재시 본 발명의 프로모터를 지닌 일부 숙주 세포 내에서 여전히 달성된다는 것을 발견하였다. 이러한 점에 있어서, 본 발명의 프로모터는 서열번호 6으로 표현되고, 서열번호 1에 관한 설명은 서열번호 6에 동일하게 적용된다.
도 1은 또한 박스 D를 나타낸다 - 서열번호 2에 상응한다. 서열번호 2는 인트론(intron) 서열이다. 본 발명에 따라 서열번호 2의 모두 또는 그 일부분의 부재시 본 발명의 프로모터로도 대단한 발현이 여전히 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명의 실시태양에서 본 발명의 프로모터는 서열번호 2의 모두 또는 그 일부분과 함께 사용되지 않는다.
그러나 일부의 경우 서열번호 2가 NOI의 발현을 증가시킬 수 있고/또는 발현의 선택성을 증가시킬 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서 본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서 본 발명의 프로모터는 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 함께 사용된다.
도 1은 또한 박스 E를 나타낸다 - 서열번호 5에 상응한다. 서열번호 5는 서열번호 C와 결합된 엑손 서열의 두 번째 부분이다. 일부의 적용에 있어서 본 발명의 프로모터 서열은 서열번호 4가 서열번호 5와 융합된 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다.
따라서 개략적으로 또한 예로서 본 발명의 프로모터는 : 박스 A; 박스 C를 지니거나 지니지 않은 박스 B; 박스 D를 지닌 박스 A; 박스 D를 지닌 박스 B - 박스 C를 지니거나 지니지 않은 - ; 박스 E를 지닌 박스 A; 박스 E를 지닌 박스 B - 박스 C를 지니거나 지니지 않은 - ; 박스 D 및 박스 E를 지닌 박스 A; 박스 D 및 박스 E를 지닌 박스 B - 박스 C를 지니거나 지니지 않은 - 의 어느 하나 이상으로 표현된다.
이는 : 박스 A가 서열번호 1 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 나타내고, 바람직하게는 박스 A는 서열번호 1을 나타내고; 박스 B는 서열번호 6 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 나타내고, 바람직하게는 박스 B는 서열번호 6을 나타내고; 박스 C는 서열번호 4 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 나타내고, 바람직하게는 박스 C는 서열번호 4를 나타내고; 박스 D는 서열번호 2 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 나타내고, 바람직하게는 박스 D는 서열번호 2를 나타내고; 박스 E는 서열번호 5 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 나타내고, 바람직하게는 박스 E는 서열번호 5를 나타낸다.
본 발명의 프로모터의 분석시 컨센서스 서열 또는 그의 일부분과 유사한 많은 관심있는 발현 요소/기능적 요소를 증명하였다.
이러한 증명된 서열은 하기의 표 1에 나타나 있다.
(표 1)
1. 컨센서스 서열로부터의 편차는 필기체로 나타냈다.
현재 컨센서스 서열과 동일 또는 유사한 이러한 증명된 서열의 적어도 하나 이상이 본 발명의 프로모터 서열에 나타난다고 믿는다.
상기에 나타난 바와 같이 프로모터는 적당한 숙주 내에서의 발현을 확신하거나 증가시키는 특징을 부가적으로 포함하거나 그와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 특징은 프립나우(Pribnow) 박스 또는 TATA 박스와 같은 보존된 구역일 수 있다.
프로모터는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준에 영향을 미치는(유지하고, 강화하고, 감소시키는 것과 같이) 다른 서열을 포함하거나 또는 이와 함께 사용된다. 예를 들어 적당한 다른 서열은 Shi-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열은 유도가능한 요소 - 온도, 화학, 빛 또는 스트레스 유도가능한 요소와 같은 - 을 포함한다. 또한 전사 또는 번역을 강화하는 적당한 요소가 존재할 수 있다. 후자의 요소의 예는 TMV 5' 신호 서열(Sleat Gene 217[1097]217-225; 및 Dawsnon Plant Mol. Biol. 23[1993]97)이다.
본 발명의 프로모터는 하나 이상의 다른 발현 요소 또는 기능적 요소 또는 조절적 요소와 조합하여 사용될 수 있다.
"발현 요소", " 기능적 요소" 및 "조절적 요소"라는 용어는 인핸서(enhancer), 발현 조절 신호, 분비 리더(leader) 서열, 프로모터 컨센서스 서열, 종결자 서열을 포함하고, 다른 프로모터도 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 프로모터 적어도 일부분 및 또다른 프로모터의 적어도 일부분으로 구성된 하이브리드(hybrid) 프로모터를 포함한다.
상기에 나타난 바와 같이 본 발명은 또한 적어도 하나이상의 프로모터가 본 발명의 프로모터인 탠덤 프로모터를 포함한다. 다른 프로모터가 본 발명의 프로모터이거나 또는 그 일부분일 경우 조합은 텐덤 반복이라고 불린다.
다른 프로모터는 또다른 프로모터 또는 그의 일부분일 수 있다. 예로서 다른 프로모터는 바람직한 발현 숙주 내에서 NOI의 발현을 지시하는 데 있어서의 효율성을 위해 선택된다.
하나의 실시태양에서 구성적 프로모터는 NOI의 발현을 지시하는데 선택된다. 이러한 발현 구조물은 유도 기질을 포함한 배지 상에서 발현 숙주를 배양하는 필요성을 회피할 수 있기 때문에 부가적인 장점을 제공한다. 예를 들어 진균성 발현 숙주 내에서 바람직하게 이용되는 강한 구성적 및/또는 유도가능한 프로모터의 예는 크실라나제(xylanase)(xlnA), 파이타제(phytase), ATP-합성효소, 서브유니트 9(oliC), 트리오스(triose) 인산염 이소머라제(isomerase)(tpi), 알코올 탈수소효소(AdhA), α-아밀라제(amylase)(amy), 아밀로글루코시다제(amyloglucoidase)(AG -glaA 유전자로부터의), 아세트아미다제(acetamidase)(amdS) 및 글리셀알데하이드(glyceraldehyde)-3-인산염 탈수소효소(gpd) 프로모터의 진균성유전자로부터 수득가능한 것들이다. 강한 효모 프로모터의 예는 알코올 탈수소효소, 3-포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase) 및 트리오스 인산염 이소머라제의 유전자로부터 수득가능하다. 강한 박테리아성 프로모터의 예는 세포외 프로테아제(protease) 유전자로부터의 프로모터뿐만 아니라 α-아밀라제 및SP02프로모터이다. 강한 식물 프로모터의 예는 CaMV 프로모터, SV40 35S 프로모터 및 NOS 프로모터이다.
일부의 적용에 있어서 바람직하게는 프로모터는 형절전환된 생물체의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
"형질전환된(transformed)"이라는 용어는 "형질전환(transgenic)"이라는 용어와 동의어이다.
바람직한 관점에서 프로모터 서열번호 2에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 연결된다.
자연적 발생
여기 사용된 바와 같이 "자연적으로 발생한"이라는 것은 자연상태 즉, 야생형 프로모터에서 발견되는 프로모터 서열을 나타낸다.
분리된/정제된
여기 사용된 바와 같이 "분리된" 및 "정제된"이라는 용어는 그들의 자연적 환경으로부터 제거되고, 자연적으로 결합된 적어도 하나 이상의 다른 구성성분으로부터 분리되거나 격리된 핵산 서열을 나타낸다.
생물학적으로 활성적
여기 사용된 바와 같이 "생물학적으로 활성적"이라는 용어는 자연적으로 발생한 프로모터와 유사한 구조적 기능(동일한 정도일 필요는 없다) 및/또는 유사한 조절적 기능(동일한 정도일 필요는 없다) 및/또는 유사한 생화학적 기능(동일한 정도일 필요는 없다)을 지닌 본 발명에 따른 프로모터 - 재조합 프로모터와 같이 - 을 나타낸다. 특히 본 발명의 프로모터는 배유 내에서, 바람직하게는 배유내에서 선택적으로 NOI를 발현하는 능력을 지닌다.
삭제
여기 사용된 바와 같이 "삭제""라는 용어는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 없는 뉴클레오타이드 서열 상의 변화를 정의한다.
삽입/첨가
여기 사용된 바와 같이 "삽입" 또는 "첨가"라는 용어는 자연적으로 발생한 프로모터와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가가 일어난 뉴클레오타이드 서열 상의 변화이다.
치환
여기 사용된 바와 같이 "치환"이라는 용어는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오타이드에 의한 대치로부터 초래된다.
변이체/상동체
본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 대한 "변이체" 또는 "상동체"라는 용어는 서열의 대립 유전자적 변형과 동의어이다.
특히, 여기 사용된 바와 같이 "상동체"라는 용어는 "동일체"라는 용어와 동일하다. 여기서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 대한 서열 상동체는 하나 이상의 서열을 다른 서열이 그 서열(들)에 대해 적어도 75% 이상의 동일성을 지니는지여부를 다른 서열과의 단순한 "안구" 비교에 의해 결정될 수 있다. 상대 서열 상동성(즉, 서열 동일성)은 또한 2개 이상의 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있는 상업적으로 유용한 컴퓨터 프로그램에 의해 결정될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 일반적인 예는 CLUSTAL이다.
서열 상동성(또는 동일성)은 예를 들어 디폴트(default) 파라미터(parameter)를 이용한 적당한 상동성 알고리즘을 이용하여 결정되기도 한다. 유리하게 BLAST 알고리즘은 디폴트 값에 셋팅된 파라미터와 함께 사용된다. BLAST 알고리즘은 참고문헌에 나타난 http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html에 상세히 기술되어 있다. 검색 파라미터는 하기와 같이 정의되고, 정의된 디폴트 파라미터에 유리하게 셋팅된다.
유리하게 BLAST에 의해 평가될 경우 "실질적인 상동체"는 적어도 7 이상, 바람직하게는 적어도 9 이상, 가장 바람직하게는 10 이상의 예상(EXPECT) 값과 매치(match)하는 서열과 동일시 된다. BLAST 내 예상의 디폴트 역치(threshold)는 일반적으로 10이다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용된 발견적(heuristic) 검색 알고리즘이다; 이러한 프로그램은 약간의 등귀(enhancement)로 Karlin and Altschul(http://www.ncbi.
nih.gov.BLAST/blast_help.html 참고)의 통계적 방법을 사용한 그들의 발견에 유의성을 둔다. BLAST 프로그램은 예를 들어 의문의 서열에 대한 상동성을 증명하기위해 서열 유사성 검색을 위해 만들어졌다. 서열 데이터베이세스의 유사성 검색 내의 기본 이슈(issue)의 토론을 위해 Altschulet al(1994) Nature Genetics 6:119-129을 참고하시오.
http://www.ncbi.nih.gov.에서 유용한 5개의 BLAST 프로그램은 하기의 테스크(task)를 수행한다 :
blastp- 단백질 서열 데이터베이세스에 대한 아미노산 질문 서열을 비교한다.
blastn- 뉴클레오타이드 서열 데이터베이세스에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열을 비교한다.
blastx- 단백질 서열 데이터베이세스에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열(두가닥 모두)의 6-프레임 개념적 번역을 비교한다.
tblastn- 모든 6 리딩(reading) 프레임(두가닥 모두) 내에서 다이나믹하게 번역된 뉴클레오타이드 데이터베이세스에 대한 단백질 질문 서열을 비교한다.
tblastx- 뉴클레오타이드 서열 데이터베이세스의 6-프레임 번역에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열의 6-프레임 번역을 비교한다.
BLAST는 하기의 검색 파라미터를 사용한다 :
HISTOGRAM(막대그래프) - 각각의 검색에 대한 점수의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 책자 내의 파라미터 H를 참고하시오).
DESCRIPTIONS(설명) - 특성화된 숫자로 리포트되는 매치된 서열의 간단한 디스크립션(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100 디스크립션다(책자 페이지 내의 파라미터 V를 참고하시오).
ALIGNMENTS(정렬) - 높은-득점 세그먼트(HSPs)가 보고되는 특정화된 숫자에 데이터베이세스 서열을 제한함; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이터베이세스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키게 될 경우(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조하시오) 가장 큰 통계적 유의성의 매치만이 리포트된다(BLAST 책자 내의 파라미터 B를 참고하시오).
EXPECT(예상) - 리포트를 위한 통계적 유의성 역치는 데이터베이세스 서열에대해 매치된다; 디폴트 값은 10이고, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라 10 매치는 단지 우연히 발견되는 것으로 기대된다. 매치의 통계적 유의성이 EXPECT 역치보다 클 경우 매치는 리포트되지 않을 것이다. 더 낮은 EXPECT 역치가 더 엄격하고, 리포트되는 매치 기회를 더 적게 한다. 분수 값이 수용될 수 있다(BLAST 책자내의 파라미터 E를 참고하시오).
CUTOFF(컷오프) - 높은-득점 세그먼트(segment) 쌍을 리포팅하기 위한 점수를 차단함. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산출된다. HSP는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 점수를 지닌 고립 HSP의 크기와 같을 때 데이터베이세스 서열에 대해 리포트된다. CUTOFF 값이 높을수록 더 엄격하여, 리포트되는 매치의 기회를 적게 한다(BLAST 책자 내의 파라미터 S를 참고하시오). 일반적으로 유의성 역치는 EXPECT를 사용하여 더욱 강력하게 관리될 수 있다.
MATRIX(매트릭스) - BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX를 위한 다른 득점 매트릭스를 특성화함. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 유요한 다른 득점 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request) 내에서 MATRIX 지시를 특성화시키는 것은 오류 반응으로 나타난다.
STRAND(스트랜드) - TBLASTN 검색을 데이터베이세스 서열의 상부 또는 하부로만 한정함; 또는 LASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상의 리딩 프레임에만 한정함.
FILTER(필터) - Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 낮은 구성 복잡성을 지닌 질문 서열의 세그먼트 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우 Tatusov and Lipman (http://www.ncbi.nih.gov.를 참고하시오)의 DUST 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 짧은-주기성 간격 반복으로 구성된 세그먼트를 마스크 오프(mask off)함. 필터링(filtering)은 blast 출력으로부터 통계적으로는 유의적이나 생물학적으로는 흥미없는 리포트를 제거하고(즉, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 구역), 데이터베이세스 서열에 대한 특정 매칭에 유용한 질문 서열의 생물학적으로 흥미있는 더 많은 구역을 남긴다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 뉴클레오타이드 서열 내에서 문자 "N"을 사용하여(즉, "NNNNNNNNNNNNN"), 단백질 서열 내에서 문자 "X"를 사용하여(즉, "XXXXXXXXX") 대치된다.
필터링은 데이터베이세스 서열이 아니라 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용될 경우 SEG 또는 XNU 또는 이 둘 모두에 의해마스크된 어떤것에도 전혀 특별하지 않아서 필터링이 항상 효과를 나타내지 않는다. 더욱이 일부의 경우 서열이 완전히 마스크되어 여과되지 않은 질문 서열에 대해 리포트된 어떤 매치의 통계적 유의성이 의심받을 수 있다는 것을 나타낸다.
NCBI-gi - NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여 출력 내에 나타나도록 유발함.
바람직하게는 서열비교는 http://www.ncbi.nih.gov.BLAST에서 제공되는 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 수행된다.
2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 다른 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereuxet al1984 Nucleic Acids Research 12:387) 및 FASTA(Atschulet al1990 J Molec Biol 403-410)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
서열 동일성을 측정할 경우 갭 패널티(gap penalty)가 사용되어야 하고, 바람직하게는 하기의 파라미터가 사용된다.
BLAST의 경우
갭 오픈 0
갭 확장 0
CLUSTAL의 경우 DNA
단어 크기 2
갭 패널티 10
갭 확장 0.1
가장 바람직하게는 서열 비교는 DNASISTM을 이용하여 수행된다.
여기 사용된 바와 같이 "변이체", "상동체", "단편" 및 "유도체"라는 용어는 서열의 대립 유전적 변형을 포함한다.
또한 "변이체"라는 용어는 여기에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
하이브리디제이션
여기 사용된 바와 같이 "하이브리디제이션(hybridisation)"이라는 용어(때로는 "hybridization"으로 쓰이기도 함)는 Dieffenbach CW 및 GS Dveksler(1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)에 기술된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술에서 수행될 때의 증폭 과정뿐만 아니라 "핵산의 스트랜드가 염기쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정"(Coombs J(1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY)을 포함한다.
하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 의해 알려진 바와 같이 핵산 결합 복합물의 녹는점(Tm) 상에 기초를 두고, 하기에 설명된 바와 같이 정의된 "스트린젠시"를 나타낸다
하이브리디제이션의 스트린젠시는 폴리뉴클레익 에시드(polynucleic acid) 하이브리드가 안정한 조건을 나타낸다. 이러한 조건은 당 분야의 일반적인 숙련자에게 명백하다. 당 분야의 숙련자에게 알려진 바와 같이 하이브리드의 안정성은 서열 상동성에서의 매 1% 마다 약 1∼5℃ 감소하는 하이브리드의 녹는점(Tm)에 반영된다. 일반적으로 하이브리드의 안정성은 나트륨 이온 농도 및 온도의 기능이다. 일반적으로 하이브리디제이션 반응은 더 높은 스트린젠시의 조건하에서 수행되고 다양한 스트린젠시의 세척이 뒤따른다.
여기 사용된 바와 같이 높은 스트린젠시는 65∼68℃의 1M Na+ 내에서 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 서열만이 하이브리디제이션을 가능하게 하는 조건을 나타낸다.
최대 스트린젠시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브(probe)의 Tm 5℃ 이하)에서 발생한다.
일반적으로 높은 스트린젠시는 프로브(probe)의 Tm 5℃ 내지 10℃ 이하에서 발생한다. 예를 들어 높은 스트린젠시 조건은 6×SSC, 5×Denhardt's, 1% SDS(sodium dodecyl sulphate), 0.1 Na+ 피로인산염(pyrophosphate) 및 특이적 경쟁자로서 0.1mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 수용액 내에서의 하이브리디제이션에 의해 제공될 수 있다. 하기의 하이브리디제이션에서 높은 스트린젠시 세척은 0.2∼0.1×SSC, 0.1% SDS 내에서 하이브리디제이션 온도로의 최종 세척(약 30분)과 함께 여러 단계로 수행된다.
보통의 또는 중간의 스트린젠시는 일반적으로 프로브(probe)의 Tm 10℃ 내지 20℃ 이하에서 발생한다.
낮은 스트린젠시는 일반적으로 프로브(probe)의 Tm 20℃ 내지 25℃ 이하에서 발생한다.
당 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 최대 스트린젠시 하이브리디제이션은 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 증명하거나 검출하는데 사용되는 반면 중간의(또는 낮은) 스트린젠시 하이브리디제이션은 유사한 또는 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 증명하거나 검출하는데 사용될 수 있다.
보통의 스트린젠시는 상기에 기술된 용액 내에서의 하이브리디제이션과 동일하나 약 65∼62℃인 조건을 나타낸다. 이러한 경우 최종 세척은 1×SSC, 0.1% SDS 내에서 하이브리디제이션 온도로 수행된다.
이러한 조건은 개선되고 또한 다양한 완충액 즉, 포름아마이드(formamide)-기초 완충액 및 온도를 이용하여 반복된다고 이해된다. Denhardt's 용액 및 SSC는 다른 적당한 하이브리디제이션 완충액과 같이 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(즉, Sambrook et al., eds(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 또는 Ausubel et al., eds.(1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). 프로브의 길이 및 GC 함량이 중요한 역할을 하기 때문에 최적 하이브리디제이션 조건은 실험적으로 측정되어야 한다.
뉴클레오타이드 서열
여기 사용된 바와 같은 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(그의 일부분과 같은)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 스트랜드를 나타내든지 안티센스 스트랜드를 나타내든지 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드인 게노믹(genomic) 또는 합성적 또는 재조합 오리진(origin)이다.
바람직하게는 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA를 의미한다.
바람직한 실시태양에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 그 자체는 그의/그들의 자연적 환경 내에 있는 자연적으로 결합된 서열(들)에 연결될 경우 그의 자연적 환경에서의 본 발명에 따른 천연의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 참고에 용이하게 이러한 바람직한 실시태양을 "비-천연의 뉴클레오타이드 서열"이라고 부를 것이다.
일반적으로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 기술(즉, 재조합 DNA)을 이용하여 준비된다. 그러나 본 발명의 또다른 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 당 분야에서 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여(Caruthers MH et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T et al.,(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232를 참조하시오) 전체 또는 일부로 합성될 수 있다.
또한 본 발명은 여기에 나타난 서열 또는 유도체, 단편 또는 그의 유도체에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 서열은 다른 생물체에서의 유사한 서열을 증명하는 프로브로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 여기에 나타난 서열 또는 유도체, 단편 또는 그의 유도체에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 여기에 나타난 서열 또는 유도체, 단편 또는 그의 유도체에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1×SSC {1×SSC = 0/15M NaCl, 0.015 Na3구연산 pH 7.0}) 하에서 여기 나타난 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(여기 나타난 서열에 상보적인 서열을 포함하여)에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(여기 나타난 서열에 상보적인 서열을 포함하여)에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
또한 중간 내지 최대 스트린젠시의 조건 하에서 여기 나타난 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 범위 내에서 유도된다.
바람직한 관점에서 본 발명은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1×SSC) 하에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
유리하게 본 발명은 스트린전트 조건 하에서 서열번호 1의 단편에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 핵산 서열을 제공한다. 바람직하게는 단편은 길이로 15에서 50 염기 사이이다. 유리하게는 이는 길이로 약 25 염기이다.
여기에 나타난 핵산 서열의 지식에 의해 cDNA 및/또는 게노믹 클론(clone)과 같은 일부 또는 전체-길이 핵산 서열을 고안하는 것이 가능하다. PCR에 의해 수득된 핵산 서열 - 전체 길이 서열의 단편, 바람직하게는 유일한 서열을 지닌 단편과 같이 - 은 하이브리디제이션 라이브러리(library) 스크리닝 기술을 이용하여 동일 또는 유사한 서열을 수득하는데 이용된다. 단편은 10∼100 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직하게는 단편은 15∼90 뉴클레오타이드 길이이다. 더욱 바람직하게는 단편은 20∼80 뉴클레오타이드 길이이다.
예로서 PCR 클론은 방사성 원자로 표지되고, 다른 종 바람직하게는 다른 식물 종으로부터의 게노믹 라이브러리를 스크린하는데 이용된다. 하이브리디제이션 조건은 일반적으로 높은 스트린젠시의 배지 조건일 것이다(예를 들어 약 50℃ 내지 약 60℃에서 0.03M 염화나트륨 및 0.03M 구연산나트륨).
또한 아미노산 서열의 모두 또는 일부분을 인코딩하는 퇴화한 핵산 프로브는 다른 종으롭부터 바람직하게는 다른 식물 종 또는 진균 종으로부터의 cDNA 및/또는 게노믹 라이브러리를 조사하는데 이용된다. 그러나 시행절차의 더한 스크리니에 이용하기 위한 단일 서열을 수득하기 위해 PCR 기술을 초기에 수행하는 것이 바람직하다.
상기에 서술된 기술을 이용하여 수득된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기에 서술된 기술을 이용하여 더한 상동성 서열 및 변이체를 수득하는데 이용된다.
따라서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 즉, PCR 프라이머, 또다른 증폭 반응을 위한 프라이머, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용한 통상적인 수단에 의한 시현(revealing) 표지로 표식된 프로브를 생성하는데 이용되거나 또는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15 이상, 바람직하게는 20, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 뉴클레오타이드 길이일 것이고, 또한 여기 사용된 바와 같이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드라는 용어에 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 프라이머는 시현 표지를 운반한다. 적당한 표지는 32P 또는 35S와 같은 방사성동위원소, 효소 표지 또는 비오틴(biotin) 또는 디옥시게닌(dioxigenin)과 같은 다른 표지를 포함한다. DIGTM시스템(Boehringer Mannheim)은 매우 활성적인 비-방사성 시스템을 제공하기 때문에 유용하다. DIG 시스템은 디지탈리스(Digitalis) 식물에서 독점적으로 발생하여 비오틴과 같이 다른 합텐(hapten)의 경우 내생적 백그라운드(background) 문제를 회피하는 스테로이드(steroid) 합텐 디옥시게닌에 기초를 둔다. 이러한 표지는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 프라이머에 첨가되고, 그 자체로 알려진 기술에 의해 검출된다.
본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드 및 프라이머는 재조합적으로, 합성적으로, 또는 당 분야의 숙련자에게 유용한 수단에 의해 생성된다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클론된다. 일반적으로 프라이머는 한번에 원하는 핵산 서열 1개 뉴클레오타이드의 한단계씩의 제조를 포함하는 합성적 방법에 의해 생성될 것이다. 이러한 자동화된 기술을 수행하기 위한 기술은 당 분야에서 매우 유용하다.
더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 수단, 예를 들어 PCR 클로닝 기술을 이용하여 생성될 것이다. 이는 클론되기를 원하는 뉴클레오타이드 서열의 구역에 프라이머 한쌍(즉 약 15∼30 뉴클레오타이드)을 만들고, 프라이머를 진균, 식물 또는 원핵 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉하게 하고, 원하는 구역의 증폭을 야기하는 조건 하에서의 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(즉, 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 반응 혼합물을 정제함으로서), 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하도록 고안되어 증폭되어 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있게 된다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 처리과정 및/또는 발현을 변형시키는 변화를 포함하나 이에 한정적이지는 않은 많은 이유로 그 활성을 변화시키기 위해 설계된다. 예를 들어 글리코실레이션(glycosylation) 패턴을 변화시키기 위해 또는 코돈 우선권(preference)을 변화시키기 위해 돌연변이가 당 분야에서 잘 알려진 기술 즉, 새로운 제한 사이트를 삽입하는 사이트-다이렉티드(site-directed) 돌연변이화를 이용하여 도입된다. 더한 예로서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한 특정한 숙주 세포 내에서 발현을 최적화하기 위해 변형된다 - 부가적인 프로모터(들) 또는 그의 일부분의 포함과 같이, 텐덤 반복의 공급 및/또는 인트론 서열과 같은 다른 발현 요소의 공급과 같이. 제한 효소 인식 사이트를 도입하기 위해 다른 서열 변화가 요구된다.
프로모터 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체 및 단편
본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 관련된 "변이체", "상동체" 또는 "단편"이라는 용어는 프로모터로서 역할을 하는 능력을 지닌 결과적 뉴클레오타이드 서열을 제공하는, 바람직하게는 서열번호 1에 나타난 서열을 지닌 프로모터로서 적어도 같은 생물학적인 활성을 지닌 서열로부터 또는 그로의 하나(또는 그 이상) 핵산의 치환, 변이, 변형, 대치, 삭제, 삽입을 포함한다. 특히 "상동체"라는 용어는 프로모터로서 역할을 하는 능력을 지닌 결과적 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 구조 및/또는 기능에 대한 상동성을 포함한다. 서열 상동성에 있어서 서열번호 1에 나타난 바와 같은 서열에 대해 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 더욱 바람직하게는 90% 이상이다. 서열번호 1에 나타난 바와 같은 서열에 대해 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 지닌다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열 또는 이러한 서열의 대립 유전자성 변이로 구성된 DNA 분절에 관한 것이다. 이러한 분절은 조절적 구역/유니트로서 역할 할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 서열번호 2의 변이체, 상동체 및 단편
본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 관련된 "변이체", "상동체" 또는 "단편"이라는 용어는 발현 수준을 증가시키는 능력을 지닌 결과적 뉴클레오타이드 서열을 제공하는, 바람직하게는 서열번호 2에 나타난 서열과 적어도 같은 생물학적인 활성을 지닌 서열로부터 또는 그로의 하나(또는 그 이상)의 핵산의 치환, 변이, 변형, 대치, 삭제, 삽입을 포함한다. 특히 "상동체"라는 용어는 발현 수준을 증가시키는 능력을 지닌 결과적 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 구조 및/또는 기능에 대한 상동성을 포함한다. 서열 상동성에 있어서 서열번호 2에 나타난 바와 같은 서열에 대해 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 더욱 바람직하게는 90% 이상이다. 서열번호 2에 나타난 바와 같은 서열에 대해 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 지닌다.
또한 본 발명은서열번호 2의 DNA 서열 또는 이러한 서열의 대립 유전자성 변이로 구성된 DNA 분절에 관한 것이다. 이러한 분절은 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
표 1 내에서 증명된 뉴클레오타이드 서열의 어느 하나 이상의 변이체, 상동체 및 단편
표 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 어느 하나에 관련된 "변이체", "상동체" 또는 "단편"이라는 용어는 발현에 영향을 미치는 능력을 지닌 결과적 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 서열로부터 또는 그로의 하나(또는 그 이상)의 핵산의 치환, 변이, 변형, 대치, 삭제, 삽입을 포함한다. 특히 "상동체"라는 용어는 발현에 영향을 미치는 능력을 지닌 결과적 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 구조 및/또는 기능에 대한 상동성을 포함한다. 서열 상동성에 있어서 표 1에 나타난 각각의 서열에 대해 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 더욱 바람직하게는 90% 이상이다. 표 1에 나타난 각각의 서열에 대해 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 지닌다.
NOI/POI
바람직한 관점에서 본 발명은 하나 이상의 적당한 NOIs를 발현하기 위한 본 발명의 프로모터의 이용에 관한 것이다.
따라서 바람직한 관점에서 프로모터는 NOI에 실시가능하게 연결된다.
"실시가능하게 연결된"이라는 용어는 기술된 구성성분이 그들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계를 나타낸다 - 적당한 병렬과 같이 -. NOI에 "실시가능하게 연결된" 조절적 서열은 코딩 서열의 발현이 대조군 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되도록 결찰된다.
NOI는 POI를 인코드할 수 있다.
NOI는 NOI가 그의 자연적인 환경 내에서 프로모터에 실시가능하게 연결될 때 본 발명의 프로모터에 정상적으로 결합된 완전한 자연적인 서열 이외의 관심있는 폴리펩타이드를 인코딩하는 어떤 적당한 서열도 될 수 있다.
바람직하게는 NOI는 본 발명의 야생형 프로모터와 자연적으로 결합된 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.
NOI는 의문의 생물체에 대해 외부적(이형적) 또는 자연적(상동적)인 어떤 뉴클레오타이드 서열도 될 수 있다 - 섬질의 진균 또는 식물일 수 있다.
일반적으로 POI는 관심있는 적당한 원핵세포성 또는 진핵세포성 이형체 또는 상동적 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
일부의 적용에 있어서, POI는 선택되고 또는 회수된다.
일부의 적용에 있어서, POI가 선택되고 또는 회수되는 것은 중요하다.
일부의 적용에 있어서, POI는 선택되거나 또는 회수되지 않는다.
일부의 적용에 있어서, POI가 선택되거나 회수되지 않는 것은 중요하다.
NOI는 예를 들어 안티센스(antisense) RNA 또는 리보자임(ribozyme)과 같은 조절적 RNA, mRNA 또는 tRNA 또는 생물체의 신진대사를 조절할 수 있는 rRNA와 같이 핵산을 발현할 수 있는 서열도 된다.
또한 NOI는 삽입, 첨가, 삭제 또는 변화에 의한 것과 같이 돌연변이화되어 더 이상 자연적 상동적 뉴클레오타이드 서열과 동일하지 않은 상동적 뉴클레오타이드 서열이다.
POI는 개체의 조성 폴리펩타이드가 공유결합 또는 비-공유결합에 의해 연결된 복합-폴리펩타이드 뿐만 아니라 단일-체인 폴리펩타이드가 될 수 있다. 여기서 "폴리펩타이드"라는 용어는 2 이상의 길이의 아미노산, 일반적으로는 5 이상 또는 10 이상 또는 20 이상 아미노산의 펩타이드를 포함한다.
NOI의 일반적인 예는 신진대사 및 이화작용 과정을 변형시키는 단백질 및 효소를 코딩하는 서열은 포함한다. 이형적 뉴클레오타이드 서열은 병원균 저항성을 도입하거나 또는 증가시키기 위한 약제를 암호화한다. 이형적 뉴클레오타이드 서열은 관련 조직 내에 존재하는 자연적이 전사체의 발현을 변형시키기 위한 안티센스 구조물일 수 있다.
이형적 뉴클레오타이드 서열은 식품 또는 농작물에 영양적인 가치를 부여하는 단백질일 수 있다. 일반적인 예는 인간 또는 동물의 소화를 도울 수 있고, 항-영양 인자의 형성을 억제할 수 있는 식물 단백질 및 더욱 바람직한 아미노산 조성(즉, 비-형질전환 식물보다 더 높은 라이신 함량)을 지닌 식물 단백질을 포함한다.
예를 들어 POIs의 비-제한적 예는 세포 분열의 조절에 관련된 단백질, 예를 들어 신경영양적(neurotrophic) 생장 인자, 시토킨(α-, β-, 또는 γ-인터페론(interferon), IL-1, IL-2를 포함하는 인터루킨(interleukin), 종양 회저(necrosis) 인자 또는 인슐린-유사 생장 인자 Ⅰ 또는 Ⅱ와 같은), 단백질 키나제(MAP 키나제와 같은), 단백질 인산효소 및 상기한 것의 세포 수용체를 포함한다.
또한 POI는 세포 신진대사성 경로에 관련된 효소, 예를 들어 탄수화물 생합성 또는 분해, 아미노산 생합성 또는 분해(티로신 가수분해와 같은), 퓨린 또는 피리미딘 생합성 또는 분해 및 도파민(dopamine)과 같은 신경전달물질의 생합성 또는 분해에 관련된 효소 또는 예를 들어 단백질 키나제 및 인산효소와 같은 이러한 경로의 조절에 관련된 단백질일 수 있다.
또한 POI는 식물의 포스트-하베스트(post-harvest) 과정 - 즉, 브루잉(brewing) 또는 베이킹(baking) 과정에 효과적이다.
또한 POI는 그들의 조절에 관련된 전사 인자 또는 단백질, 예를 들어 Rb 또는 p107과 같은 Rb 패밀리, 막단백질, 구조성 단백질 또는 hsp70과 같은 히트 쇼크(heat shock) 단백질의 포켓(pocket) 단백질일 수 있다.
NOI는 센스 또는 안티센스 방향에 있는 것이 가능한 특정한 뉴클레오타이드 서열의 인트론을 암호화한다.
POI의 비-제한적 예는 : 전분 대사에 관련된 단백질 또는 효소, 글리코겐(glycogen) 대사에 관련된 단백질 또는 효소, 아세틸 에스테라제(acetyl esterase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 아밀라제, 아라비나제(arabinase), 아라비노푸라노시다제(arabinofuranosidase), 카르복시펩티다제(carboxypeptidase), 카탈라제(catalase), 셀룰라제(cellulase), 키티나제(chitinase), 카이모신(chymosin), 큐티나제(cutinase), 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease), 에피머라제(epimerase), 에스테라제, α-갈락토시다제(galatosidase), β-갈락토시다제, α-글루카나제(glucanase), 글루칸 라이사제(glucan lyasase), 엔도-β-글루카나제,글루코아밀라제(glucoamylase), 글루코스 옥시다제(glucose oxidase), α-글루코시다제(glucosidase), β-글루코시다제, 글루쿠로니다제(glucuronidase), 헤미셀룰라제(hemicellulase), 헥소오스(hexose) 옥사다제, 하이드롤라제(hydrolase), 인벌타제(invertase), 이소머라제(isomerase), 락카제(laccase), 리파제(lipase), 리아제(lyase), 만노시다제(mannosidase), 옥시다제, 옥시도리덕타제(oxidoreductase), 펙테이트(pectate) 리아제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 펙틴 디폴리머라제(depolymerase), 펙틴 메틸 에스테라제, 펙티노라이틱 엔자임(pectinolytic enzyme), 펄옥시다제(peroxidase), 페놀옥시다제(phenoloxidase), 피타제(phytase), 폴리갈락투로나제(polygalacturonase), 프로테아제(protease), 람노(rhamno)-갈락투로나제, 리보뉴클레아제, 타우마틴(thaumatin), 트랜스퍼라제(transferase), 운반 단백질, 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 크실라나제(xylanase) 또는 그의 조합을 포함한다. NOI는 이러한 서열의 안티센스 서열일 수도 있다.
NOI는 PCT 특허출원 제PCT/IB99/00649호(참고문헌에 나타남)의 주제인 엑소(exo)-아밀라제 효소를 코딩하기 위한 뉴클레오타이드 서열이 될 수 있다.
NOI는 영국 특허출원 제GB99078057호(참고문헌에 나타남)의 주제인 크실라나제 효소를 코딩하기 위한 뉴클레오타이드 서열이 될 수 있다.
NOI는 PCT 특허출원 제PCT/EP96/01009호(참고문헌에 나타남)의 주제인 아라비노푸라노시다제 효소를 코딩하기 위한 뉴클레오타이드 서열이 될 수 있다.
NOI는 PCT 특허출원 제PCT/EP94/01082호(참고문헌에 나타남)의 주제인 ADP-글로코스 피로포스포릴라제(pyrophosphorylase) 효소를 코딩하기 위한 어떤 뉴클레오타이드 서열도 될 수 있다.
NOI는 PCT 특허출원 제PCT/EP94/03397호(참고문헌에 나타남) 내에 기술된 α-글루칸 리아제 효소를 코딩하기 위한 어떤 뉴클레오타이드 서열도 될 수 있다.
NOI는 참고문헌에 나타난 PCT 특허출원 제PCT/EP95/02607호 내에 기술된T. lanuginosus를 코딩하기 위한 어떤 뉴클레오타이드 서열도 될 수 있다.
NOI는 PCT 특허출원 제PCT/EP96/01008호(참고문헌에 나타남) 내에 기술된 글루카나제 효소를 코딩하기 위한 어떤 뉴클레오타이드 서열도 될 수 있다.
NOI는 그의 안티-센스 서열뿐만 아니라 UDP-갈락토스 에피머라제 효소를 코딩하기 위한 어떤 뉴클레오타이드 서열도 될 수 있다 - PCT 특허출원 제WO-A-98/54335호(참고문헌에 나타남) 내에 기술된 바와 같이.
NOI는 홍조류Chondrus crispus로부터의hox또는Aspergillus niger로부터의lipA가 될 수 있다.
POI는 이러한 특허 출원 내에 공개된 서열의 변이체, 유도체 또는 상동체뿐만 아니라 제WO-A-97/03574호 내에 공개된 PME 또는 제WO-A-94/2575호 또는 제WO-A-97/31102호 내에 공개된 PME가 될 수 있다.
POI는 예를 들어 추출 및 정제를 돕는 융합 단백질일 수도 있다.
융합 단백질 파트너의 예는 말토스(maltose) 결합 단백질, 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라제(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성화 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 융합 구성성분 사이에 단백질분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다.
POI는 분비 서열에 융합되기도 한다. 분비 리더(leader) 서열의 예는 아밀로글루코시다제 유전자, α-인자 유전자, α-아밀라제 유전자, 리파제 A 유전자, 크실라나제 A 유전자로부터 기원한 것이다.
또한 다른 서열은 분비를 촉진시키거나 분비된 POI의 양을 증가시킬 수 있다. 이러한 서열은 예를 들어 영국 특허출원 제9821198.0호에 기술된Aspergillus niger cyp B유전자의 생성물과 같은 샤프롱(chaperone) 단백질을 암호화할 수 있다.
NOI는 과정 및/또는 그의 발현 생성물의 발현을 변형시키는 변화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 많은 원인으로 그들의 활성을 변화시키기 위해 설계된다. 예를 들어 돌연변이는 새로운 제한 사이트를 삽입시키고, 글리코실레이션 패턴을 변화시키거나 또는 코돈 우선권을 변화시키는 당 분야에서 잘 알려진 기술 즉, 사이트-다이렉티드 돌연변이화를 이용하여 도입된다. 더한 예로서 NOI는 또한 특정한 숙주 세포 내에서 발현을 최적화시키도록 변형된다. 다른 서열 변화는 제한 효소 인식 사이트를 도입시키기 위해 바람직하다.
NOI는 합성적 또는 변형된 뉴클레오타이드 내에 포함된다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 많은 다른 타입의 변형이 당 분야에 알려져 있다. 이들은 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포네이트 백본(backbone), 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서의 아크리딘(acridine) 또는 폴리라이신(polylysine)의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적에 있어서 NOI는 당 분야에서 유용한 어떤 방법에 의해서도 변형된다는 것이 이해된다. 이러한 변형은 생체 내에서의 활성 또는 NOI의 수명을 강화시키도록 수행된다.
NOI는 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키도록 변형된다. 가능한 변형은분자의 백본 내에서의 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) 결합보다는 분자의 5' 및/또는 3' 말단의 측면에 위치한 서열의 첨가 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 2'O-메틸의 이용을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
구조물
"구조물"이라는 용어는 - "컨쥬게이트(conjugate)", "카세트" 및 "하이브리드(hybrid)"와 동의어이다 - NOI에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 직접적인 부착의 예는 프로모터와 NOI를 중재하는 Sh1 인트론 또는 ADH 인트론과 같은 인트론 서열과 같은 적당한 스페이서(spacer) 그룹이다. 직접적인 또는 간접적인 부착을 포함하는 본 발명에 관련된 "융합된"이라는 용어와 동일한 것도 사실이다. 각각의 경우 이 용어는 야생형 유전자 프로모터와 그의 결합된 뉴클레오타이드 서열이 모두 그들의 자연적인 환경에 존재할 때 그 둘의 조합을 포함하지는 않는다.
구조물은 예를 들어 트랜스퍼될 식물 세포와 같은 유전적 구조물의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하거나 발현하기도 한다.
선택가능한 마커 수단은 부가적 벡터 상에 주재하거나 발현 시스템을 포함하는 핵산 분자내에 포함된다. 선택가능한 마커 수단의 성질은 숙주 및 배양 조건의 성질에 따라 다를 것이다. 산업적 미생물용으로 가장 적당한 선택 시스템은 숙주 생물체 내에서 돌연변이를 필요로 하지 않는 선택 마커의 그룹에 의해 형성된 것이다.
US-A-5358864는 본 발명에 사용된 적당한 선택가능한 마커의 짧은 리스트를 제공한다 - 예로 아세트아미다제(amdS), ATP 합성효소, 서브유니트 9(oliC) 및 베노밀(benomyl) 저항성(benA)에 대한 유전자와 같은 진균성 선택 마커를 포함한다.
비-진균성 선택 마커의 예는 박테리아성 G418 저항성 유전자(효모에서도 이용되나 진균에서는 그렇지 않다), 암피실린 저항성 유전자(E. coli), 네오마이신 저항성 유전자(Bacillus) 및 β-갈락토시다제(GUS)를 코딩하는 대장균uidA 유전자이다.
본 발명의 특정한 관점에서 ble 마커의 이용 - 플레오마이신(phleomycin)/블레오마이신(bleomycin)/제오신(zeocin)에 대한 저항성을 부여하는 - 이 바람직하다. 그러나 당 분야에 알려진 다른 선택 마커가 사용될 수 있다. 자가영양 마커의 예는 우리딘 프로토트로프(uridine prototroph)를 선택하는pyrG, 아르기닌 프로토트로프를 선택하는argB, 질산 프로토트로프를 선택하는niaD, 트립토판 프로토트로프를 선택하는trpC, 단독 질소 원료로서의 아세트아마이드의 증가된 이용을 선택하는amdS이다. 우세한 저항성 마커는 올리고마이신(oligomycin)에 대한 저항성을 부여하는oliC3, 하이그로마이신 B에 대한 저항성을 부여하는hph, 비알라포스(bialaphos)에 대한 저항성을 부여하는bar또는 G418에 대한 저항성을 부여하는NPTⅡ로부터 선택될 수 있다.
구조물은 트랜스퍼될 예를 들어 박테리아, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스속 또는 감자, 사탕무 등과 같은 식물 내에서의 유전적 구조물의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하거나 발현하기도 한다.
구조물은 예를 들어 식물 내에서의 유전적 구조물의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하거나 발현하기도 한다. 예를 들어 만노스 6-인산 이소머라제, 글루코사민 6-인산 디아미나제(deaminase)/케토이소머라제(ketoisomerase), 크실로스 이소머라제를 인코딩하는 것 또는 항생제 저항성 - 즉, G418, 하이그로마이신, 블레오마이신, 카나마이신 및 젠타마이신(gentamycin)에 대한 저항성 -을 제공하는 마커와 같이 이용될 수 있는 다양한 마커가 존재한다.
벡터
"벡터"라는 용어는 발현 벡터, 복제가능 벡터, 형질전환 벡터 및 셔틀(shuttle) 벡터 및 이들의 벡터 조합을 포함한다.
"발현 벡터"라는 용어는 생체 내에서의 또는 실험실 내에서의 발현을 가능하게 하는 구조물을 의미한다.
바람직하게는 발현 벡터는 생물체의 게놈에 통합된다. "통합된다"라는 용어는 바람직하게는 게놈 내로의 안정한 통합을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 벡터는 본 발명에 따른 구조물로 구성된다. 다르게 표현되면 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 벡터 내에 존재하고, 상기 프로모터는 적당한 숙주 생물체에 의한 코딩 서열의 발현을 제공하는 것이 가능하도록 NOI에 실시가능하게 연결되는 즉, 벡터는 발현 벡터이다.
"형질전환 벡터"라는 용어는 하나의 실체(entity) 로부터 다른 실체로 트랜스퍼되는 것이 가능한 구조물을 의미한다 - 이는 그 종일수 있고 또는 다른 종일수 있다 - . 구조물이 하나의 종으로부터 다른 종으로 트랜스퍼되는 것이 가능할 경우 - 대장균 플라스미드로부터 바실러스속과 같은 박테리아로와 같이 - 형질전환 벡터는 종종 "셔틀 벡터"라고 명명된다. 이는 대장균 플라스미드로부터 식물로의 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 트랜스퍼되는 것이 가능한 구조물일 수도 있다.
본 발명의 벡터는 POI의 발현을 제공하는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된다.
따라서 더한 관점에서 본 발명은 POI를 인코딩하는 NOI의 본 발명의 프로모터에 의한 발현을 제공하는 조건 하에서 발현 벡터로 형질전환되거나 세포감염된 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 발현된 POI를 회수하는 것으로 구성된 POI를 준비하기 위한 과정을 제공한다.
일반적으로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 통합된다. 벡터는 양립가능한 숙주 생물체내에서 핵산을 복제하는데 이용된다.
따라서 더한 실시태양에서 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 복제가능 벡터 내로 도입하고, 벡터를 양립가능한 숙주 생물체 내로 도입하고, 본 발명의 프로모터에 의한 NOI의 발현을 유발하는 조건 하에서 숙주 생물체를 배양하는 방법을 제공한다. 그런 후 POI는 숙주 생물체로부터 회수된다. 적당한 숙주 생물체는 식물 또는 식물 세포를 포함한다.
NOI는 예를 들어 본 발명의 프로모터로 구성된 클로닝 또는 발현 벡터와 같은 복제가능 벡터 내로 통합된다. 벡터는 양립가능한 숙주 세포 내에서 NOI를 복제하는데 이용된다.
따라서 더한 실시태양에서 본 발명은 본 발명의 프로모터로 구성된 복제가능 벡터 내로 NOI를 도입시킴으로서 NOI를 생성하고, 벡터를 양립가능한 숙주 세포 내로 도입하고, 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수된다.
벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지(phage) 벡터이다. 본 발명의 프로모터 외에 벡터는 어느 하나 이상의 복제 오리진과 함께 제공되고, NOI는 NOI의 발현을 위한 프로모터 및 프로모터의 조절자에 실시가능하게 연결된다.
예를 들어 벡터는 실험실 내에서 또는 생체 내에서 숙주 생물체를 세포감염시키거나 형질전환하는데 이용된다.
이러한 벡터는 본 발명의 단백질의 발현을 제공하는 적당한 숙주 생물체 내로 형질전환되거나 세포감염된다. 이러한 과정은 상기에 기술된 바와 같이 단백질을 인코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하는 조건 하에서 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 발현된 단백질을 회수하는 것으로 구성된다.
본 발명의 벡터는 벡터/뉴클레오타이드 서열을 복제하고/또는 NOI를 발현하는 것을 목적으로 숙주 세포 내로 도입된다. 하나의 바람직한 관점에서 숙주 세포는 식물 세포이다.
본 발명의 벡터는 세포감염, 형질전환 및 일렉트로포레이션(elctroporation)과 같은 당 분야에서 알려진 다양한 기술을 이용하여 적당한 숙주 생물체 내로 도입된다. 또다른 기술은 프로토플라스트(protoplast) 형질전환 방법이다(Winer et al., Microbiology, 1985, 468, American Society for Microbiology).
벡터는 실험실 내에서 예를 들어 RNA 생성을 위해 이용되거나 또는 숙주 세포를 세포감염시키거나 형질전환하는데 이용된다.
조직
여기에 사용된 "조직"이라는 용어는 조직 그 자체 및 기관을 포함한다.
숙주 세포
"숙주 세포"라는 용어는 - 본 발명에 관련된 - 숙주 세포 내에 존재할 경우 NOI의 발현을 가능하게 할 수 있는 본 발명의 프로모터 및/또는 그로부터 수득된 생성물로 구성될 수 있는 세포를 포함한다.
따라서 본 발명의 더한 실시태양은 본 발명의 프로모터로 형질전환되거나 세포감염된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는 프로모터는 NOI의 복제 및 발현을 위해 벡터 내에서 운반된다. 세포는 상기 벡터와 양립가능하도록 선택될 것이고, 예를 들어 원핵성(예를 들어 박테리아성), 진균성, 효모 또는 식물 세포이다.
바람직하게는 숙주 세포는 식물 세포이다.
그람-음성 박테리아 대장균은 이형적 유전자 발현을 위한 숙주로 널리 이용된다. 그러나 이형적 단백질의 많은 양이 세포 내부에 축적되는 경향이 있다. 대장균 세포내 단배질의 벌크(bulk)로부터의 바람직한 단백질의 수반되는 정제는 종종 어렵다.
대장균과는 대조적으로 바실러스속으로부터의 박테리아는 배양 배지 내로 단백질을 분비시키는 능력 때문에 이형적 숙주로서 매우 적당하다. 숙주로서 적당한 다른 박테리아는 스트렙조마이세스(Streptomyces)속 및 슈도모나스(Pseudomonase)속으로 부터의 것이다.
POI를 인코딩하는 NOI의 성질 및/또는 발현된 단백질의 더한 처리과정의 바람직성에 따라 다르게 효모 또는 진균 같은 진핵성 숙주가 바람직하다. 일반적으로 효모 세포는 조작하기 용이하기 때문에 진균 세포보다 바람직하다. 그러나 일부 단백질은 효모 세포로부터 불충분하게 분비되거나 또는 어떤 경우에는 적당히 처리되지 않는다(즉, 효모 내 하이퍼글리코실레이션(hyperglycosylation)). 이러한 경우 진균성 숙주 생물체가 선택되어야 한다.
본 발명의 범위 내에서의 적당한 발현 숙주의 예는 아스퍼질러스(Aspergillus)종(EP-A-0184438 및 EP-A-0284603 내에 기술된 바와 같이) 및 트리코더마(Trichoderma)종과 같은 진균; 바실러스종(EP-A-0134048 및 EP-A-0253455 내에 기술된 바와 같이), 스트렙토마이세스종 및 슈도모나스종과 같은 박테리아; 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)종(EP-A-0096430 및 EP-A-0301670 내에 기술된 바와 같이) 및 사카로마이세스(Saccharomyces)종과 같은 효모이다. 예로서 일반적인 발현 숙주는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리몰파(Hansenula polymorpha), 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 니거 바. 튜비게니스(Aspergillus niger var. tubigenis), 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리(Aspergillus niger var. awamori), 아스퍼질러스 아쿨레아티스(Aspergillus aculeatis), 아스퍼질러스 니툴란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 오르브제(Aspergillus orvzae), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택된다.
적당한 숙주 세포의 이용 - 효모, 진균 및 식물 숙주 세포와 같이 - 은 본 발명의 재조합 발현 생성물 상에 적당한 생물학적 활성을 부여하는데 필요하기 때문에 후-번역적 변형(즉, 미리스톨레이션(myristolation), 글리코실레이션, 절단, 라피데이션(lapidation) 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화)을 제공한다.
따라서 본 발명은 또한 서열번호 1에 나타난 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체, 상동체, 변형체 또는 단편으로 숙주 세포를 형질전환하기 위한 방법을 제공한다.
NOI에 실시가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터로 형질전환된 숙주 세포는 발현 및 세포 배양으로부터의 POI 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. POI는 분비되거나 또는 이용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 세포내에 포함된다. 당 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 NOI에 실시가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터를 함유하는 발현 벡터는 특정한 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 NOI/POI의 분비를 지시하는 신호 서열과 함께 고안될 수 있다. 다른 재조합 구조는 NOI를 용해성 단백질의 정제를 촉진시키는 폴리펩타이드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시킨다(Kroll DJ et al., (1993) DNA Cell Biol. 12:441-453).
생물체
본 발명에 관련된 "생물체"라는 용어는 프로모터가 NOI가 생물체 내에 존재할 경우 NOI의 발현을 가능하게 할 수 있는, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 생물체를 포함한다. 생물체의 예는 진균, 효모 또는 식물을 포함한다.
본 발명에 관련된 "형질전환 생물체"라는 용어는 프로모터가 생물체내의 NOI의 발현을 가능하게 할 수 있는, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 생물체를 포함한다. 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 생물체의 게놈 내로 통합된다.
"형질전환 생물체"라는 용어는 본 발명에 따른 본래의 뉴클레오타이드 서열이 그의 자연적 환경 내에서 역시 자연적인 환경 내에 존재하는 그의 결합된 코딩 서열에 실시가능하게 연결될 경우 이를 포함하지 않는다.
따라서 본 발명의 형질전환 생물체는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열, 본 발명에 따른 구조물(그의 조합을 포함하여), 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 플라스미드, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 조직 또는 그의 생성물의 어느 하나 또는 그의 조합으로 구성된 생물체를 포함한다. 형질전환된 세포 또는 생물체는 수용가능한 양의 POI를 준비할 수 있다.
숙주 세포/숙주 생물체의 형질전환
앞서 나타낸 바와 같이 숙주 생물체는 원핵성 또는 진핵성 생물체가 될 수 있다. 적당한 원핵성 숙주의 예는 대장균 및 바실러스 서브틸리스이다. 원핵성 숙주의 형질전환의 기술은 예를 들어 Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.)와 같이 당 분야에 잘 기록되어 있다.
원핵성 세포가 이용되면 NOI는 형질전환 전에 적당하게 변형될 필요가 있다 - 인트론의 제거와 같은 -.
형질전환된 진균
숙주 생물체는 진균이다 - 몰드(mold)와 같은 -. 이러한 적당한 숙주의 예는 터모마이세스(Termomyces)속, 아크레모니움(Acremonium)속, 아스퍼질러스속, 페니실리움(Penicillium)속, 무코(Mucor)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 트리코더마속 및 그와 유사한 것 - 터모마이세스 라누기노시스(Thermomyces lanuginosis), 아크레모니움 크리소게눔(Acremonium chrysogenum), 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리제, 아스퍼질러스 아와모리, 페니실리움 크리소게넴(Penicillium chrysogenem), 무코 자바니오우스(Mucor javanious), 뉴로스포라 크라사(Neurosprora crassa), 트리코더마 비리데(Trichoderma viridae) 및 그와 유사한 것과 같은 - 에 속하는 멤버 중의 하나를 포함한다.
하나의 실시태양에서 숙주 생물체는 섬질의 진균이다.
거의 모든 세기 동안 섬질의 진균은 유기화합물 및 효소의 생성을 위한 많은 형태의 산업에 널리 사용되어 왔다. 예를 들어 전통적인 일본 코지(koji) 및 콩 발효는 아스퍼질러스종을 사용하였다. 또한 금세기에는 아스퍼질러스 니거가 유기산 특정 시트르산의 생성 및 산업에 이용하기 위한 다양한 효소의 생성에 이용되었다.
섬질의 진균이 산업에 널리 사용되는 이유에 있어서 2가지의 주요한 원인이 있다. 첫 번째로 섬질의 진균은 예를 들어 항체 또는 유기산과 같은 효소 및 유기화합물과 같은 많은 양의 세포외 생성물을 생성할 수 있다. 두 번째로 섬질의 진균은 곡물, 겨, 비트(beet), 펄프 등과 같은 저비용의 기질 상에서 생장할 수 있다. 동일한 이유로 본 발명에 따른 이형적 발현을 위한 숙주로서의 섬질의 진균을 관심대상의 생물체로 만들었다.
형질전환 아스퍼질러스를 준비하기 위해 발현 구조물이 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열(및 선택적으로는 NOI)을 섬질의 진균 내에서의 발현을 위해 고안된 구조물 내로 삽입시킴으로서 준비된다.
이형적 발현에 이용되기 위한 구조물의 일부 타입이 발달되어 왔다. 이러한 구조물은 바람직하게는 : 일반적으로 진균 오리진의 것으로서 POI의 분비를 지시하는 단일 서열 및 발현 시스템을 종결짓는 종결자(일반적으로 진균 내에서 활성인)의 하나 이상을 포함한다.
발현 시스템의 또다른 타입은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열(및 선택적으로는 NOI)이 안정한 단백질을 인코딩하는 진균성 유전자의 작거나 또는 큰 부분에 융합될 수 있는 진균 내에서 발달되어 왔다. 이는 POI를 안정화시킬 수 있다. 이러한 시스템 내에서 특정한 프로테아제에 의해 인식되는 분열 사이트는 진균 단백질과 POI 사이에 도입되어 생성된 융합 단백질이 특정한 프로테아제에 의해 이러한 포지션에서 분열될 수 있어 결국 POI를 유리시킬 수 있다. 예로서 적어도 일부 아스퍼질러스 내에서 발견되는 KEX-2 유사 펩타이드에 의해 인식되는 사이트를 도입할 수 있다. 이러한 융합은 생체 내에서의 분열을 유도하여 발현된 생성물 및 크지 않은 융합 단백질의 생성을 야기한다.
아스퍼질러스 내에서의 이형적 발현은 박테리아, 진균, 척추동물 및 식물 단백질을 코딩하는 일부 유전자에 대해 보고되었다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(또는 NOI 조차도)이 단일 서열에 융합되지 않은 경우 단백질은 세포내적으로 축적될 수 있다. 이러한 단백질은 세포질 내에 축적될 것이고, 일반적으로 일부 박테리아 단백질에 있어 이로울 수 있는 글리코실레이트되지 않을 것이다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(또는 NOI 조차도)이 단일 서열과 함께 준비될 경우 단백질은 세포외적으로 축적될 것이다.
생성물 안정성 및 숙주 균주 변형에 있어서 일부 이형적 단백질은 그들이 진균의 배양액 내로 분비될 경우 매우 안정하지 않다. 대부분의 진균은 이형적 단백질을 분해하는 일부의 세포외 프로테아제를 생성한다. 이러한 문제를 회피하기 위해 프로테아제 생성이 감소된 특정한 진균 균주가 이형적 생성을 위한 숙주로서 이용되었다.
형질전환 섬질의 진균의 기술은 섬질의 진균의 형질전환 및 진균의 배양을 위한 표준 기술 당 분야에 잘 알려져 있다고 기술한 US-A-5741665 내에서 검토되었다. N. crassa에 적용된 기술의 광범한 연구가 예를 들어 Davis and de Serres, Methods Enzymol(1971) 17A:79-143과 같은 것에서 발견된다. 표준 절차는 일반적으로 균주의 유지 및 분생자의 준비에 이용된다. 균사체는 Lambowitz et al, J. Cell Biol (1979) 82:17-31에서 기술된 바와 같이 일반적으로 약 14시간 동안(25℃) 액체 배양액 내에서 배양된다. 숙주 균주는 일반적으로 예를 들어 : his, arg, phe, tyr, trp, p-아미노벤조산 및 이노시톨(inosito)의 어느 하나 이상과 같은 적당한 영양분(들)으로 보충된 Vogel's 또는 Fries 최소 배지 내에서 배양될 수 있다.
섬질의 진균을 형질전환하는 더한 기술은 구조물이 한번 수득되면 DNA-매개 형질전환, 일렉트로포레이션, 입자 총 충격, 프로토플라스트 융합 및 그와 유사한 것 등을 이용하여 선택된 섬질의 진균 숙주 내로 선형으로 또는 플라스미드 형태 즉, pUC계 또는 다른 벡터로 도입될 수 있다고 기술한 US-A-5674707에서 검토된다. 더욱이 Ballance 1991(ibid)는 형질전환된 진균을 준비하기 위한 형질전환 프로토콜이 프로토플라스트의 준비 및 PEG 및 Ca2+이온을 이용한 프로토플라스트 내로의 DNA 도입에 기초를 둔다고 기술하였다. 그 후 형질전환된 프로토플라스트는 재생하고, 형질전환된 진균은 다양한 선택적 마커를 이용하여 선택된다.
결과적 형질전환체의 선택을 가능하게 하기 위해 또한 일반적으로 형질전환은 동일한 벡터 상에서 또는 동시-형질전환에 의해 유전자 마커가 선택가능하게 되는 숙주 균주 내로 발현 카세트와 함께 도입되는 선택가능한 유전자 마커를 포함한다. 아스퍼질러스 니둘란스의 자가영양성 균주에 이용하기 위한 pyrG, argB 및 niaD 유전자; 아스퍼질러스 오리제 자가영양생물에 이용하기 위한 pyrG, argB 유전자; 페니실리움 키리소게눔 자가영양생물에 이용하기 위한 pyrG, trpC 및 niaD 유전자; 및 트리코더마 리세이 자가영양생물에 이용하기 위한 argB 유전자를 포함한 다양한 마커/숙주 시스템이 유용하다. amdS, oliC, hyg 및 phelo를 포함하는 우세한 선택가능 마커는 또한 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리제, 아스퍼질러스 피쿠움(A. ficuum), 페니실리움 크리소게눔, 세팔로스포리움 아크레모니움, 코클리오보루스 헤테로스트로퍼스(Cochliobolus heterostrophus), 글로메렐라 신굴라타(Glomerella cingulata), 플라비아 플바(Fulavia fulva) 및 렙토스페리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans)와 같은 섬질의 진균에 이용하기에 유용하다(예를 들어 Ward in Modern Microbiral Genetics, 1991, Wiley-Liss, Inc., 페이지 455-495를 참조하시오). 통상적으로 사용되는 형질전환 마커는 높은 복제수로 진균을 단독 질소 원료로서 아크릴아마이드와 함께 배양하는 것을 가능하게 하는 아스퍼질러스 니둘란스의 amdS 유전자이다.
섬질의 진균의 형질전환을 위해 일부 형질전환 프로토콜이 많은 섬질의 진균에 대해 발달되었다. 그 중에서 형질전환을 위해 사용되는 마커는 argG, trpC, niaD 및 pyrG와 같은 많은 자가영양성 마커, 베노밀 저항성, 하이그로마이신 저항성 및 플레오마이신 저항성과 같은 항생제 저항성 마커이다.
하나의 관점에서 숙주 생물체는 아스퍼질러스 니거와 같은 아스퍼질러스속이 될 수 있다.
또한 본 명에 따른 형질전환 아스퍼질러스는 하기의 Rambosek, J. and Leach, J. 1987(Recombinant DNA in filamentous fungi : Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6:357-393), Davis R.W. 1994(Heterologous gene expression and protein secretion inAspergillus. In : Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp 525-560), Ballance, D.J. 1991(Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. In : Leong, S.A., Berka R.M.(Editors) Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc. New York 1991. pp 1-29) 및 Turner G. 1994(Vectors for genetic manipulation. In : Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)의 기술에 의해 준비될 수 있다.
형질전환된 효모
또다른 실시태양에서 형질전환된 생물체는 효모가 될 수 있다.
이러한 점에 있어서 효모는 또한 이형적 유전자 발현을 위한 비히클(vehicle)로서 널리 사용된다.
예로서 사카로마이세스 크레비시에는 그의 이형적 유전자 발현을 위한 이용을 포함하여 긴 산업적 이용의 역사를 지닌다. 사카로마이세스 크레비시에 내의 이형적 유전자의 발현은 Goodey et al(1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al, eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London) 및 King et al(1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Tarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow)에 의해 연구되었다.
몇가지 이유로 인해 사카로마이세스 크레비시에는 이형적 유전자 발현에 매우 적합하다. 첫 번째로 이는 인간에게 비-병원성이고, 특정한 내독소를 생성하는 것이 불가능하다. 두 번째로 이는 다양한 목적으로의 상업적 이용에 있어 안정한 이용의 긴 역사를 지닌다. 이는 넓은 공공 수용가능성을 지닌다. 세 번째로 생물체에 대한 광범한 상업적 이용 및 연구는 사카로마이세스 크레비시에의 대규모 발현 특성 뿐만 아니라 유전학 및 생리학에 관한 많은 지식을 초래하였다.
사카로마이세스 크레비시에 내에서의 이형적 유전자 발현의 원리의 연구는 E Hinchcliffe E Kenny(1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeast, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)에 의해 이루어졌다.
그들의 유지를 위해 숙주 게놈과의 재조합을 필요로하는 음성적 벡터 및 자발적으로 복제하는 플라스미드 벡터를 포함하여 효모 벡터의 일부 타입이 유용하다.
형질전환 사카로마이세스를 준비하기 위해서 발현 구조물은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 효모 내에서 발현하기 위해 고안된 구조물 내로 삽입시킴으로서 준비된다. 이형적 발현에 사용되는 구조물의 일부 타입이 발달되었다. 구조물은 GAL1 프로모터와 같은 효모 오리진의 프로모터와 같이 효모 내에서 활성인 프로모터를 포함한다. 일반적으로 SUC2 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열과 같은 효모 오리진의 신호 서열이 사용된다. 효모 내에서 활성인 종결자가 발현 시스템을 종결짓는다.
효모의 형질전환을 위해 일부 형질전환 프로토콜이 발달되었다. 예를 들어 본 발명에 따른 형질전환 사카로마이세스는 하기의 Hinnen et al(1978, Proceeding of the National Academy of Science of the USA 75, 1929); Beggs J D(1978, Nature, London, 275, 104); 및 Ito, H et al(1983, J Bacteriology 153, 163-168)의 기술에 의해 준비된다.
형질전환된 효모 세포는 다양한 선택적 마커를 이용하여 선택된다. 그 중에서 형질전환에 이용되는 마커는 LEU2, HIS4 및 TRP1과 같은 많은 자가영양성 마커 및 아미노글리코사이드 항생제 마커 즉, G418과 같은 우성 항생제 저항성 마커이다.
형질전환된 식물/식물 세포
본 발명에 적당한 바람직한 숙주 생물체는 식물이다.
이러한 점에서 유전적으로 변형된 식물의 구조에서의 기본적인 원리는 유전적 정보를 식물 게놈 내로 삽입시켜 삽입된 유전적 물질의 안정한 유지를 수득하는 것이다.
유전적 정보를 삽입시키기 위한 일부 기술이 존재하고, 두 가지의 주요한 원리는 유전적 정보의 직접적인 도입 및 벡터 시스템의 이용에 의한 유전적 정보의 도입이다. 일반적인 기술의 연구는 Potrykus(Ann Rev Physiol Plant Mol Biol[1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문 내에서 발견된다.
본 발명의 프로모터가 EP-B-0470145 및 CA-A-2006454 내에 공개되지 않았더라도 이들 두 문서는 본 발명에 따른 형질전환 식물을 준비하는데 이용되는 기술 타입에 대한 유용한 배경적 설명을 제공한다. 이러한 배경 지침의 일부는 하기의설명에 포함된다.
유전적으로 변형된 식물의 구조의 기본적인 원리는 식물 게놈 내로 유전적 정보를 삽입하여 삽입된 유전적 물질의 안정한 유지를 수득하는 것이다.
따라서 하나의 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열 및 구조물을 운반하고, 뉴클레오타이드 서열 및 구조물을 식물과 같은 생물체의 게놈 내로 도입시키는 것이 가능한 벡터 시스템에 관한 것이다.
벡터 시스템은 하나의 벡터로 구성되나 2개의 벡터를 포함하는 것이 가능하다. 2개의 벡터의 경우 벡터 시스템은 일반적으로 이원적(binary) 벡터 시스템을 타낸다. 이원적 벡터 시스템은 Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Mannual A3, 1-19에 더욱 상세히 기술되어 있다.
주어진 프로모터 또는 뉴클레오타이드 서열 또는 구조물로의 식물 세포의 형질전환을 위해 광범위하게 이용되는 하나의 시스템은 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 Ti 플라스미드 또는 아그로박테리움 리조게네스로부터의 Ri 플라스미드의 이용에 기초를 둔다(An et al.(1986), Plant Physiol. 81, 301-305 및 Butcher D.N. et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208).
일부 다른 Ti 및 Ri 플라스미드가 상기 기술된 식물 또는 식물 세포 구조물의 구조에 적당하도록 구조되었다. 이러한 Ti 플라스미드의 비-제한적 예는 pGV3850이다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 구조물은 적어도 T-DNA 또는 T-DNA의 인접한 것의 말단 서열들의 구역의 적어도 하나 이상이 변형된 T-DNA의 식물 게놈 내로의 삽입에 필수적으로 보이기 때문에 바람직하게는 이들 사이에서 Ti-플라스미드 내로 삽입되어 T-DNA 가장자리(border) 바로 주위의 서열의 파열을 방지하도록 해야한다.
상기 설명으로부터 이해될 수 있는 바와 같이 생물체가 식물인 경우 본 발명의 벡터 시스템은 바람직하게는 식물(즉, vir 구역)을 감염시키는데 필요한 서열 및 적어도 하나 이상의 T-DNA 서열의 가장자리 부분을 포함하고, 가장자리 부분은 유전적 구조물로서 동일한 벡터 상에 위치한다. 바람직하게는 잘 알려져 있고, 형질전환 식물의 구조에 널리 사용되는 이유로 벡터 시스템은 아그로박테리움 투메파시엔스 Ti-플라스미드 또는 아그로박테리움 리토게네스 Ri-플라스미드 또는 그의 유도체이고, 이러한 플라스미드 또는 그의 유도체에 기초를 둔 많은 벡터 시스템이 존재한다.
형질전환 식물의 구조에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 및 구조물은 벡터가 복제 가능하고, 식물 내로의 삽입되기 전에 조작하기 용이한 미생물 내에서 먼저 구조된다. 유용한 미생물의 예는 대장균이나 상기 성질을 지닌 다른 미생물도 사용된다. 상기 정의된 바와 같이 벡터 시스템의 벡터가 대장균 내에서 구조되면 필요한 경우 적당한 아그로박테리움 균주 즉, 아그로박테리움 튜메파시엔스 내로 트랜스퍼된다. 따라서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 구조물을 잠복시킨 아그로박테리움 세포를 수득하기 위해 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 구조물을 잠복시킨 Ti-플라스미드는 바람직하게는 적당한 아그로박테리움 균주 즉, 아그로박테리움 튜메파시엔스 내로 트랜스퍼되고 이러한 DNA는 결과적으로 변형되는 식물 세포 내로 트랜스퍼된다.
CA-A-2006454에서 보고된 바와 같이 대장균 내에 복제 시스템 및 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하는 많은 양의 클로닝 벡터가 이용가능하다. 벡터는 예를 들어 pBR 322, pUC 시리즈, M13 mp 시리즈, pACYC 184 등과 같은 것을 포함한다.
이러한 방법으로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 구조물은 벡터 내의 적당한 제한 포지션 내로 도입될 수 있다. 포함된 플라스미드는 대장균 내에서의 형질전환에 이용된다. 대장균 세포는 적당한 영양분 배지 내에서 배양되고, 채취되고 분해된다. 그 후 플라스미드는 회수된다. 분석 방법으로 일반적으로 사용되는 것은 서열 분석, 제한 분석, 전기영동 및 더한 생화학-분자 생물학적 방법이다. 각각의 조작 후에 사용된 DNA 서열은 제한되고, 다음의 DNA 서열과 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 원하는 프로모터 또는 구조물 또는 뉴클레오타이드 서열의 식물 내로의 각각의 도입 방법 후 더한 DNA 서열의 존재 및/또는 삽입이 필요하다. 예를 들어 형질전환을 위해 식물의 Ti- 또는 Ri-플라스미드가 사용될 경우 도입된 유전자의 측면 서열로서 적어도 우측 경계 및 종종 Ti- 및 Ri-플라스미드 T-DNA의 우측 및 좌측 경계가 결합될 수 있다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 이용은 집중적으로 연구되었고, EP-A-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Chapter Ⅴ; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; 및 An et al., EMBO J(1985) 4:277-284 내에 기술되어 있다.
아그로박테리움에 의한 식물 조직의 직접적 감염은 널리 사용되고 Butcher D.N et al.(1980),Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208 내에 기술된 간단한 기술이다. 이러한 주제에 대한 더한 지침은 Potrykus(Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)를 참조하시오. 이러한 기술로 식물의 감염 식물의 특정 부분 또는 조직 즉, 잎, 뿌리, 줄기 또는 식물의 다른 부분 상에 수행된다.
일반적으로 프로모터 및/또는 GOI를 운반하는 아그로박테리움에 의한 식물 조직의 직접적인 감염으로 감염된 식물은 면도칼로 식물을 절단함으로서 또는 바늘로 식물에 구멍을 뚫음으로서 또는 연마제로 식물을 문지름으로서 상처입는다. 그 후 접종된 식물 또는 식물 부분은 적당한 배양 배지 상에서 배양되고, 성체 식물로의 발달이 가능하게 된다.
식물 세포가 구조되면 이들 세포는 아미노산, 식물 호르몬, 비타민 등과 같은 필요한 생장 인자로 보충된 적당한 배양 배지 내에서 세포를 배양하는 것과 같은 잘 알려진 조직 배양 방법에 따라 배양되고 유지된다. 형질전환된 세포의 유전적으로 변형된 식물로의 재생은 예를 들어 항생제를 이용한 형질전환된 슈트(shoot)를 선택하고, 적당한 영양분, 식물 호르몬 등을 함유한 배지상에서 슈트를 하위배양시키는 것과 같이 세포 또는 조직 배양으로부터의 식물의 재생에 알려진 방법을 이용하여 달성된다.
식물 형질전환하는 다른 기술은 탄도성(ballistic) 형질전환, 실리콘 위스커카바이드(silicon whisker carbide) 기술(Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA & Wang K(1994) Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation, The Plant Journal 6:941-948 참조) 및 바이러스 형질전환 기술(즉, Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I(1992) The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants, Gene 110:213-217)을 포함한다.
식물 형질전환 상의 더한 기술은 EP-A-0449375 내에서 발견된다.
식물 및 식물 세포의 탄도성 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 형질전환이 되지 않는 식물 종의 안정한 형질전환체를 생성하도록 발달되면서 안정한 금속 입자의 표면 상에서 세포 내로 DNA를 도입하는 식물 조직의 탄도성 형질전환이 일시적 발현 동안의 유전적 구조물의 수행을 테스트하는데 유용하다고 알려졌다. 이러한 방법으로 유전자 발현은 관심있는 유전자의 안정적인 통합없이 따라서 안정적인 형질전환체의 시간-소요되는 발생(generation)없이 일시적으로 형질전환된 세포 내에서 연구될 수 있다.
더욱 자세하게는 탄도성 형질전환 기술(입자 포격 기술로도 알려진)은 Klein et al.[1987], Sanford et al.[1987] 및 Klein et al.[1988]에 의해 처음으로 기술되었고, 용이한 조작 및 관심있는 세포 또는 조직의 전-처리의 부재에 기인하여 널리 유포되었다.
입자 포격 기술의 원리는 추진력(즉, 방전 또는 압축공기)에 의한 손상되지 않은 식물 내로의 DNA-코팅된 미세-발사체의 직접적인 전달이다. 미세-발사체는 단지 최소한의 손상으로 세포벽 및 세포막을 관통하고 그 후 형질전환된 세포는 프로모터 구조물을 발현한다.
수행될 수 있는 입자 포격 기술의 하나는 입자 유입 총(PIG)을 이용하고, 이는 Finer et al.[1992] 및 Vain et al.[1993]에 의해 발달되고 기술되었다. PIG는 부분 진공을 통해 식물 세포 내로 헬륨 흐름의 스트림(stream) 내에서 미세-발사체를 촉진시킨다.
PIG의 하나의 장점은 미세-발사체의 촉진이 시간-의존적 솔레노이드(solenoid) 및 제공된 헬륨 압력의 조절에 의해 제어될 수 있다. 추진력으로서 가압된 헬륨의 이용은 불활성의 장점이 있고, 잔여물을 남기지 않으며 재생가능한 추진을 준다. 진공은 입자 상의 방해물을 감소시키고, 충격에 앞선 헬륨 가스의 분산에 의한 조직 손상을 감소시킨다.
어떤 경우는 PIG 시스템의 효율성 및 용이성이 프로모터/리포터 유전자 융합의 일시적 발현에 대해 시험되는 일시적 형질전환된 구아(guar) 조직의 생성에 좋은 선택이 된다.
구아
상기에 나타난 바와 같이 하나의 관점에서 바람직한 형질전환된 생물체는 형질전환된 구아이다.
구아(시아몹시스 테트라고놀로바(Cyamopsis tetragonoloba))는 가뭄-내성종으로, 인도 및 파키스탄에서 기원한 것이나 많은 다른 나라 즉, 미국에서 산업적인 이용을 위해 재배된다. 구아는 완두콩과 강낭콩과 함께 곡물 콩과 내에 분류학적으로 배열된다. 콩과는 쌍자엽식물로 넓은 잎과 2개의 자엽을 지니는 특성이 있고, 반면에 단자엽식물은 "초본과 유사한" 형태를 나타내고 단지 하나의 자엽을 지닌다. 다른 쌍자엽식물의 예는 담배 및 감자이고, 단자엽식물의 예는 호밀, 쌀, 옥수수 및 보리와 같은 곡식이다. 그러나 구아는 그의 종자 탄수화물 저장이 자엽 내의 전분이 아니라 배유 내에 축적된 갈락토만난(galactomannan)이라는 점에서 완두콩 및 강낭콩과 같은 대부분의 농작 콩과식물과는 다르다. 배유는 종자 내에서 종자 코트(coat)의 바로 아래의 종자 내에서 자엽을 감싸고 다른 종자 조직과 분리되게 할 수 있는 비-광합성 조직이다.
구아 검
구아는 동물 사료용 및 인간 소모용 곡물로 재배된다. 그러나 구아의 중요한 이용은 아이스크림의 농축제와 같이 식품 내의 기능적 성분으로 이용되는 구아 검 또는 '구아란(guaran)'의 추출이다. 구아 검은 배유 내에 위치한 세포외 세포벽 폴리사카라이드(polysaccharide)인 갈락토만난으로 구성된다.
바람직한 관점에서 본 발명은 구아 검 합성에 영향을 미칠 수 있는 NOI의 발현을 유발하기 위한 본 발명의 프로모터의 이용에 관한 것이다.
갈락토만난
갈락토만난은 갈락토실-그룹으로 치환된 만난 백본으로 구성되고 이들의 결합은 (1→6)-α-D-갈락토-(1→4)-β-D-만난이고, 폴리머는 220,000 달톤의 분자량을 지닌다(Whistler & Hymowitz 1979).
갈락토만난 내의 치환의 정도 및 이에 따른 갈락토스 잔기와 만노스 잔기 사이의 비율은 콩과의 종에 따라 다르다. 구아 내에서 비율은 약 0.56이고, 성숙 종자는 약 35∼42% 갈락토만난을 포함한다(Whistler & Hymowitz 1979).
바람직한 관점에서 본 발명은 갈락토만난 합성에 영향을 미칠 수 있는 NOI의 발현을 유발하기 위한 본 발명의 프로모터의 이용에 관한 것이다.
배유 발현
바람직한 관점에서 본 발명의 프로모터는 식물 조직 내의 배유에서 활성이다.
이러한 점에서 배유 - 엠브리오(embryo) 뿐만 아니라 - 는 개화 식물의 종자 발생의 초기에 형성된다. 특히 배유는 엠브리오를 생성하기 위해 하나의 정핵이 난자와 융합하고, 3배체 배유를 생성하기 위해 두 번째 정핵이 2개의 극핵과 융합하는 이중 수분 동안 형성된다(Lopes & Larkin 1993). 모두가 아닌 일부 식물의 경우 이러한 조직은 종자를 위한 저장소로 작용하고 구아 및 곡식은 이들 중의 하나이다. 그러나 다른 종에 있어서 자엽은 종자의 주요한 저장 조직의 역할을 맡게 되고 배유는 퇴화하게 된다.
쌀, 호밀, 보리 및 옥수수와 같은 곡식에서 배유 내의 주요한 탄수화물 저장은 아밀로플라스트(amyloplast)로 알려진 플라스티드(plastid) 내에 세포내적으로 축적되는 전분이다. 그러나 구아 배유에서 주요한 저장 탄수화물은 세포간 공간 내에 세포외적으로 축적되고 따라서 세포 외부로 분비되는 갈락토만난이다.
성숙되는 동안 발생하는 종자는 유의적인 세포 확장 및 발아 동안 C 및 N 원료로서 사용될 탄수화물, 단백질 및 지질의 축적에 기인하여 부피 및 질량이 증가한다. 성숙 후 종자는 이른 발아를 방지하는 앱시스산(ABA)과 같은 식물 호르몬에 노출되는 휴면상태에 진입한다(Thomas 1993). 구아 종자의 발아시 만나나제(mannanase) 및 갈랄토시다제 활성은 배유의 갈락토만난을 분해하고, 방출된 만노스 및 갈락토스는 묘목의 발달을 지지한다.
탄수화물 대사
바람직한 관점에서 본 발명은 특히 식물 조직 내에서의 슈크로스 대사와 같은 탄수화물 대사에 영향을 미칠 수 있는 NOI의 발현을 유발하기 위한 본 발명의 프로모터의 이용에 관한 것이다.
이러한 점에서 슈크로스는 식물 내에서 광합성 '원료' 조직으로부터 탄수화물 영양분의 주요 버팀줄인 유기영양적 에너지-소비성 '싱크(sink)' 조직으로 원거리의 운송을 하는 주요한 광동화물(photoassimilate)이다.
슈크로스 합성을 위한 초기 전구체는 광합성 세포 내에서 탄소-고정(캘빈) 사이클 내에서 합성된 트리오스-인산(tiose-phosphate)이다. 이러한 트리오스 인산(글리세르알데하이드 3-인산)는 세포질로 운송되고, 프록토스 6-인산(프록토스-6-P) 및 글루코스 1-인산(글로코스-1-P)로 변환된다. 글루코스-1-P는 프록토스-6-P가 슈크로스 인산 합성효소에 의해 슈크로스 6-인산(슈크로스-6-P)로 변환될 때함께 UDP-글루코스로 변환된다. S-6-P는 슈크로스에 대한 직접적인 전구체이고, 변환은 슈크로스 인산효소에 의해 촉매된다.
엽육(mesophyll) 세포의 세포질 내에서의 합성 후 슈크로스는 동반(companion) 세포에 의해 체관부 내로 적재되고 싱크 조직으로 분포된다. 운송 과정은 원료와 싱크 사이의 농도 기울기에 기인한 삼투압에 의해 촉진되는 '매스 플로우(mass flow)이다. 광합성은 초록색 조직 내에 슈크로스를 축적함으로서 느려지고, 이는 발달하는 싱크 조직 내로 언로딩(unloading)함으로서 탄수화물에 대한 도관 조직 커뮤니케이팅(communicating) 요구와 함께 많은 요구-주도 과정으로서 보여진다.
발달하는 종자는 저장-활성 싱크 기관이고, 따라서 슈크로스의 거대한 사용자이다. 발달하는 종자는 구아 배유 내에서 갈락노만난과 같은 저장 폴리사카라이드의 합성과 같이 몇가지의 이유로 슈크로스를 이용한다.
슈크로스는 슈크로스 합성효소에 의해 프록토스(F) 및 UDP-갈락토스(UDPG)로 분해되고, 일련의 변환을 통해 GDP-만노스(GDPM) 및 UDPG가 형성된다. GDPM 및 UDPG는 갈락토만난의 직접적인 전구체이고, 합성은 만난 합성효소 및 갈락토실 트랜스퍼라제에 의해 촉매된다. 갈락토만난은 합성되고, 골리체에서 세포외 공간으로 운송된다. 갈락토만난의 합성에 있어서 또다른 주요한 효소는 UDP 갈락토스4-에피머라제이다.
식물 내에서의 슈크로스의 분해는 2개의 효소의 활성에 의해 달성된다 : 인벌테이즈(E.C. 3.2.1.26) 및 슈크로스 합성효소(E.C. 2.4.1.13). '슈크로스 합성효소'라는 명칭은 효소가 슈크로스의 합성을 촉매함을 의미하나 슈크로스 합성효소의 대사적 역할은 동화 작용적이라기 보다는 이화 작용적이고, 슈크로스 합성효소는 우선적으로 생체 내에서 슈크로스를 분열시킨다. 이러한 역할과 일치하여 슈크로스 합성효소는 발달하는 종자와 같은 싱크 조직 내에서 풍부하나 광합성 조직에는 충분히 요구에 맞지 않다. 슈크로스 합성효소는 UDP의 존재시 슈크로스의 UDP-갈락토스와 프록토스로의 분열을 촉매한다. UDP의 존재시 슈크로스의 분열에 의해 슈크로스 글리코사이드 링크의 높은 에너지가 더한 반응에서 글리코사이드 도너(donor)로 작용할 수 있는 UDP-글루코스로 변환된다. 이와는 반대로 인벌타제는 슈크로스의 글루코스와 프록토스로의 가수분해를 촉매하고, 아마도 저장을 위한 탄수화물을 덜 제공하게 하나 발달의 직접적인 에너지 요구를 공급한다.
바람직한 관점에서 본 발명은 UDP 갈락토스 4-에피머라제의 인 시츄(in situ) 활성에 영향을 미칠 수 있는 NOI의 발현을 유발하기 위한 본 발명의 프로모터의 이용에 관한 것이다.
GUS 리포터 유전자
본 발명의 연구의 일부에서 대장균uidA유전자(GUG 유전자로도 알려짐)가 리포터 유전자로 사용된다. 여기서 대장균uidA유전자는 본 발명의 프로모터가 NOI의 발현을 유발시킬 수 있다는 증거물로서 이용된다. 그러나 본 발명은 NOI를 대장균uidA유전자에만 한정짓지 않는다는 것이 주목된다.
더욱 상세하게는uidA유전자는 β-글루코시다제의 분열 즉, X-gluc 및 MUG로의 분열을 촉매하는 가수분해효소인 β-갈락토시다제 효소(GUS)를 암호화한다. 고등 식물을 위한 GUS 리포터 유전자 시스템이 Jefferson 1987에 의해 발달되었다.
상기 시스템은uidA유전자가 프로모터에 융합되고, 발현을 위한 식물 세포 내로 도입된다는 것을 이용한다. 형질전환 조직 내 GUS 단백질의 활성을 분석함으로서 주어진 프로모터의 활성이 모니터될 수 있다. 우리의 연구의 일부에서 대장균uidA유전자는 식물 내에서의 글리코실레이션을 방지하도록 변형되었고, 이는 소포체(ER) 내로 타겟될 경우 GUS가 활성을 유지할 수 있게 한다.
일시적인 발현 연구를 위해 X-Gluc(5-브로모(bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌릴(indolyl) b-D-글루쿠로니드(glucuronide))가 GUS의 조직화학적 검출(양적)의 기질로서 사용되었고, MUG(4-메틸 움벨리페릴(umbelliferyl) 글루쿠로니드)는 형광계 검출(양적)의 기질로서 사용되었다. 무색의 X-Gluc 기질의 효소적 분열은 분열의 사이트에서 인디고블루 침전물을 생성한다. 침전은 X-Gluc의 분열에 의해 생성된 인독실(indoxyl) 유도체의 산화성 이량체화(dimerisation)에 의해 유발된다. 따라서 GUS의 활성이 검출되고, 분석을 시행하기 전에 효소를 추출할 필요없이 형질전환 조직 내에서 분석된다.
POI의 생성
본 발명의 벡터로 구성된 숙주 생물체는 본 발명의 프로모터의 사용함으로서 POI를 발현하는데 이용된다. 이러한 점에서 숙주 생물체는 POI의 발현을 가능하게 하는 적당한 조건 하에서 배양된다. 일부의 경우 POI의 발현은 연속적으로 생성되거나 발현을 개시하는 유도인자를 필요로 하는 유도가능한 것인 구성적인(constitutive) 것이다. 유도가능한 발현의 경우 단백질 생성은 예를 들어 배양 배지로의 유도 인자 기질의 첨가와 같이 필요시 될 경우 개시될 수 있다.
벡터가 적당한 숙주 생물체 내로 형질전환 또는 세포감염되면 숙주 생물체는 배양될 수 있다. 여기서 참고문헌은 형질전환체의 배양을 위해 형질전환체에 의해 동화될 수 있는 탄소 및 질소 원료 및 그의 유사물을 함유한 배양 배지가 이용될 수 있다고 기술한 US-A-5543322에 간단히 나타나 있다. 형질전환체에 의해 동화될 수 있는 어떤 탄소 원료도 사용될 수 있다. 그 예는 유기산(즉, 아세트산, 푸마르산, 안식향산 등), 알코올(즉, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 지방 및 오일(대두기름, 라드(lard) 등) 및 그 유사물 뿐만 아니라 글로코스, 슈크로스, 전분, 용해성 전분, 덱스트린, 글리세린, n-파라핀 및 그 유사물을 포함한다. 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 질소 원료로서는 예를 들어 펩톤, 대두분, 면 종자 분말, 고기 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 옥수수주(corn steep liquor), 옥수수 글루텐 밀(meal), 요소, 암모늄염(즉, 염화암모늄, 황산암모늄 등), 질산(즉, 진산칼륨, 질산암모늄 등) 다른 유기 또는 무기 질소-함유 금속 및 그 유사물이 있다. 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 더욱이 무기염(즉, 인산염 등), 중금속염(마그네슘염, 칼슘염, 망간염 등)이 적당히 첨가될 수 있다.
원하는 경우 POI는 효소적, 화학적 및/또는 삼투압적 용해 및 물리적 파열을 포함하여 당 분야에 알려진 다양한 기술에 의해 숙주 생물체로부터 추출될 수 있다. 일부의 적용에 있어서 바람직한 추출/정제 프로토콜은 필요한 경우 이온교환 또는 어피니티(affinity) 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 뒤따르는 원심분리 단계를 포함한다.
따라서 원하는 생성물(즉, POI)이 배양 배지 내에 축적된 후 POI를 포함하는 상청액은 원심분리 또는 여과에 의해 수득될 수 있다. 반대로 배양 후 POI가 생물체 내에 축적된 경우 생물체는 알려진 방법에 의해 수집될 수 있고, 원하는 생성물은 적당한 방법에 의해 회수된다. 예를 들어, 생물체는 구아니딘(guanidine)염화수소와 같은 단백질 변성제를 함유한 완충액 내에 부유될 수 있고, 현탁액은 차가운 곳에서 교반된 후 원하는 생성물을 포함하는 상청액이 원심분리 또는 그와 유사한 것에 의해 수득된다.
또한 생물체가 완충액 내에 부유된 후 생물체는 유리 구슬에 의해 갈아지거나 프렌치 프레스(French press), 초음파 분해, 효소처리 또는 그와 유사한 것에 의해 파괴된 후 상청액이 원심분리 또는 그와 유사한 것에 의해 수득된다.
상기 상청액으로부터 POI를 분리 및 정제하기 위한 참고문헌은 원래 알려진 분리 및 정제 방법이 적당히 결합될 수 있다고 기술된 US-A-554332 내에 나타날 수 있다. 알려진 분리 및 정제 방법으로서 예를 들어 용해성에서의 차이를 이용한 방법(즉, 설팅 아웃(salting out), 솔벤트로의 침전 등), 분자량의 차이를 주로 이용한 방법(즉, 투석, 한외여과, 겔 여과 등), 전하의 차이를 이용한 방법(즉, 이온교환 크로마토그래피 등), 어피니티의 차이를 이용한 방법(즉, 어피니티 크로마토그래피 등), 소수성의 차이를 이용한 방법(즉, 역상고성능액체크로마토그래피 등), 등전점의 차이를 이용한 방법(즉, 등전성 포커싱(focusing) 등) 및 그와 유사한 것이 있다.
분비
일부의 경우 POI가 발현 숙주 생물체로부터 POI가 더욱 용이하게 회수되는 배양 배지 내로 분비되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 분비 리더 서열은 원하는 발현 숙주를 기초로하여 선택된다. 또한 하이브리드 신호 서열은 본 발명의 전후 관계에 따라 이용될 수 있다.
이형적 분비 리더 서열의 일반적인 예는 진균성 아밀로글루코시다제(AG) 유전자(galA - 모두 18 및 24 아미노산 버전 즉, 아스퍼질러스로부터의 것), a-인자 유전자(효모 즉, 사카로마이세스 및 클루베로마이세스) 또는 α-아밀라제 유전자(바실러스)로부터 기원된 것들이다.
검출
POI의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당 분야에 알려져 있다. 그 예는 효소-연결된 이뮤노솔벤트(immunosorbent) 분석(ELISA), 방사면역검정법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다. POI 상에서 2개의 비-간섭 에피토프에 반응하는 단일클론 항체를 이용한 2-사이트 단일클론계 면역검정이 사용되거나 또는 양립가능한 결합 분석(competitive binding assay)이 사용된다. 이들 및 다른 분석법이 R et al(1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) 및 Maddox DE et al(1983, J Exp Med 15 8:121 1)에 기술되어 있다.
많은 다양한 표지 및 컨쥬게이션(conjugation) 기술이 당 분야의 숙련자에 의해 알려졌고, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다. POI를 검출하기 위해 표지된 하이브리디제이션 또는 PCR 프로브를 생성하기 위한 수단은 올리고레이블링(oligolabelling), 니크(nick) 번역, 표지된 뉴클레오타이드를 이용한 말단-표지 또는 PCR 증폭을 포함한다. 또한 NOI 또는 그의 일부분은 mRNA 프로브 생성을 위한 벡터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당 분야에 알려져 있고, 상업적으로 유용하며 T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오타이드와 같은 적당한 RNA 중합효소를 첨가함으로서 실험실 내에서의 RNA 프로브를 합성하는데 사용된다.
Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ), Promega(Madison, WI) 및 US Biochemicla Corp(Cleveland, OH)와 같은 많은 회사는 이러한 절차를 위한 상업적인 키트 및 프로토콜을 공급한다. 적당한 리포터 분자 또는 표지는 기질, 보조인자, 억제자, 자기성 입자 및 그 유사물 뿐만 아니라 방사성 핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 색원체제를 포함한다. 이러한 표지의 사용에 대한 지침 특허는 US-A-4,275,149; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 및 US-A-4,366,241을 포함한다. 또한 재조합 면역글로블린은 US-A-4,816,567에 나타난 바와 같이 생성된다.
POI의 발현의 정량화하는 부가적인 방법은 방사선 동위원소 표지된(Melby PCet al 1993 J Immunol Methods 159:235-44) 또는 바이오틴화된(biotinylating) 뉴클레오타이드, 대조군 핵산의 동시증폭 및 실험 결과가 인터폴레이트된(interpolated) 표준 곡선을 포함한다. 다수의 표본의 정량화는 관심있는 올리고머(oligomer)가 다양한 희석 정도로 존재하는 ELISA 포맷 내에서의 분석을 수행함으로서 속도가 증가되고, 분광측정 또는 열량측정 반응은 빠른 정량화를 나타낸다.
마커 유전자 발현의 존재/부재가 관심있는 유전자의 존재를 나타낸다고 하더라도 그의 존재 및 발현은 확인되어야 한다. 예를 들어 NOI가 마커 유전자 서열 내로 삽입되면 NOI를 포함하는 재조합 세포는 마커 유전자 융합의 부재에 의해 증명될 수 있다. 또한 마커 유전자는 본 발명의 프로모터 또는 또다른 프로모터(바람직하게는 본 발명의 프로모터)의 조절하에 NOI와 일렬로 위치될 수 있다. 일반적으로 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 또한 POI의 발현을 나타낸다.
또한 NOI를 포함하는 숙주 세포는 당 분야의 숙련자에게 알려진 다양한 절차에 의해 확인된다. 이러한 절차는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 막-기초, 용액-기초 또는 칩(chip)-기초 기술을 포함하는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 및 단백질 바이오에세이(bioassay) 또는 면역검정 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
요약
요약적으로 본 발명은 프로모터 및 또한 동일한 것으로 구성된 구조물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 생물체 내에서의 NOI의 발현을 위한 프로모터의 이용에 관한 것이다.
바람직한 관점에서 본 발명은 탄수화물 대사에 영향을 미치는 NOI의 발현을 유발하기 위해서 본 발명의 신규한 프로모터를 사용에 의한 식물의 형질전환에 의한 탄수화물 대사의 변형에 관한 것이다.
하나의 바람직한 관점에서 본 발명은 갈락토만난 합성에 영향을 미치는 NOI의 발현을 유발하기 위해서 본 발명의 신규한 프로모터의 사용에 의한 콩과 식물 시아모놉시스 테트라고놀로바(구아)의 형질전환에 의한 갈락토만난 합성의 변형에 관한 것이다.
미생물기탁
하기의 표본은 부다페스트 조약에 의거 1999년 3월 15일 영국 스코틀랜드 아버딘 세인트 마샤 드라이브 23에 소재하는 산업 및 해양 박테리아 리미티드 네셔날콜렉션(NCIMB)에 기탁되었다.
미생물 균주 번호 NCIMB 번호
대장균 TOP (Invitrogen) NCIMB 41011
+ pTBR-ScaK3
NCIMB 41011는 본 발명의 신규한 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.
본 발명의 신규한 뉴클레오타이드 서열의 제한 지도는 도 3에 나타나 있다.
또한 본 발명은 이러한 기탁물 및 동일한 것으로 구성된 실시태양으로부터 유출가능한 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 이러한 기탁물 및 동일한 것으로 구성된 실시태양으로부터 유출가능하고, 조절적 요소를 암호화하는 부분적 서열을 포함한다.
본 발명의 프로모터는 도 2에 나타난 적당한 제한효소의 이용에 의해 기탁물로부터 분리된다. 또한 프로모터 서열을 "PCT 아웃"하는 PCR 기술을 이용할 수도 있다. 여기서 적당한 프라이머는 서열번호 1에 나타난 서열에 기초를 둘 것이다.
예로서 pTBR-ScaK3으로부터의 전체-길이 RSu3 프로모터(2700 bp)의 증폭을위해 프라이머-쌍 "M13 포워드(forward)"와 "RSusNcol"이 이용될 수 있다. 상위 M13 포워드 프라이머는 클로닝 사이트로부터의 클론 일부 110 bp의 pCR2.1-TOPO 부분에 어닐(aneal)되고, 하위 RSusNcol 프라이머는 RSus3의 번역 시작 부분에 어닐된다. 또한 프라이머-쌍 "AP2"와 "RSusNcol"은 유사한 단편을 분리하는데 사용될 수도 있다(AP2는 클론된 단편의 어댑터(adaptor) 부분에 어닐된다).
pTBR-ScaK3으로부터의 인트론 1이 없는 RSus3 프로모터의 증폭을 위해 프라이머-쌍 "AP2"와 "Lowexon1/2"가 이용될 수 있다. 하위 Lowxon1/2 프라이머는 하기와 같이 고안된다 : 프라이머의 3' 말단은 인트론 1 내의 5 스플라이싱(splicing) 사이트의 바로 상부 24 bp에 상응한다. 프라이먼의 5' 말단은 3' 스플라이싱 사이트와 ATG-코돈 사이의 27 bp에 상응하고, Ncol 사이트에 통합된다.
따라서 요약적으로 본 발명은 형질전환된 배유 조직/세포 내의 NOI의 선택적인 발현을 유발하는데 유용한 프로모터에 관한 것이다. NOI 및/또는 프로모터는 - NOI 및/또는 프로모터가 형질전환되지 않은 식물 내에서 자연적으로 발생하지 않는다는 점에서 - 형질전환된 식물에 이형적이다. 본 발명의 프로모터는 서열번호 1에 나타난 것과 상응하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변형체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌 것으로 정의된다.
실시예 섹션 및 도면의 소개
본 발명은 도면을 수반하는 참조만을 지닌 실시예에 의해서 기술될 것이다.
재료 및 방법
DAN 분리
본 연구에서 사용된 플라스미드는 Qiagen사(Hilden, Germany)의 Qiaprep Spin Miniprep Kit 및 Plasmid Maxi Kit를 이용하여 분리되었다. 이들 키트는 클로닝, 서열화 및 일시적 발현 분석에 사용되는 깨끗한 플라스미드 제제를 제공한다. 따라서 더한 정제는 필요하지 않다. 10mM Tris-Cl, pH 8.5가 용출 완충액 및 보관 완충액으로 사용되었다. 모든 DNA는 -20℃에서 보관되었다.
플라스미드 제제의 농도가 PowerwaveTM200 스펙트로포토미터로 260nm에서의 흡광도를 측정함으로서 결정되었다. 1 OD260은 약 50㎍/ml DNA에 상응한다. 분리된 단편 내의 DNA의 양은 아가로스 겔 내의 에티디움-브로마이드(Ethidium-bromide(Etbr)) 염색된 DNA의 비교 형광도에 의해 측정되었다.
제한 효소
효소 분해는 NEB 및 Boehringer M으로부터의 제한 효소를 이용함으로서 수행되었다. 공급자에 의해 제공된 T 완충액이 제한에 사용되었다. 이중 분해가 수행될 경우 둘 모두의 효소와 양립가능한 완충액이 선택되었다(즉, Nhel와 Ncol 모두의 분해가 BSA를 지닌 NEBuffer 2 내에서 수행되었다).
전기영동
전기영동은 DNA를 분리하고 확인하는데 사용되었다. DNA는 0.6㎍/ml의 농도로 겔 내에 통합된 형광 염료 에티디움-브로마이드(Etbr)로 염색되었다. 적당한 양의 DNA가 Nusieve 또는 Seakem 아가로스 겔(FMC Bioproducts)에 로드된(loaded) 로딩 완충액(0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 16% Ficoll 400)과 함께 혼합되었다. TBE 완충액(0.1M Tris, 0.09M 붕산, 0.00M EDTA)이 전기영동 완충액으로 사용되었다. DNA는 관심있는 밴드의 크기에 따라 0.5∼2%(w/v) 아가로스 겔 내에서 전기영동함으로서 분리되었다. 1000 bp의 밴드의 경우는 Nusieve GTG 아가로스 겔이, 1000 bp 이상의 밴드의 경우는 0.5∼1.5% Seakem LE 아가로스 겔이 사용되었다.
DNA 분자량 마커 Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ, Ⅵ 및 Ⅶ(Boehringer M)이 전기영동 DNA의 평가를 위해 사용되었다. 마커는 0.23㎍/㎕의 농도로 제공되었고 하기와 같이 희석되었다 : 2㎕ DNA 마커; 2㎕ 로딩 완충액 및 8㎕ H2O. 이들 혼합물의 4㎕ 또는 10㎕가 웰 크기에 따라 겔에 로드되었다.
선택된 밴드는 Qiaquick Gel Extraction(Qiagen)을 이용한 최소 UV 조사에 의해 겔로부터 분리되었다.
결찰
모든 결찰은 제조사(Amersham Life Science)에 의해 공급된 제한 완충액(66mM Tris-HCl, pH 7.6, 6.6 MgCl2, 10mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 66μM ATP) 내에서 T4 DNA 리가제(ligase)를 이용하여 수행되었다. 결합성 말단을 지닌 단편은 1 U T4 리가제를 이요하여 결찰된 반면 블런트(blunt)-말단의 단편은 효소의 5 U를 이용하여 결찰되었다.
오픈 플라스미드의 분자내 재결찰(religation)을 방지하기 위해 사이크로필릭(psychrophilic) 새우 판달루스 보레알리스(Pandalus borealis)(Boehringer M)으로부터의 알카리성 인산효소로 처리되었다. 이러한 효소는 플라스미드 DNA로부터의 5' 인산의 탈인산화를 촉매하나 60℃로 15동안 가열함으로서 하위 결찰로 방해하는 것이 용이하게 방지된다.
형질전환
모든 플라스미드는 수퍼컴피턴트(supercompetent) TOP10 One ShotTM Cell(Invitrogen) 유전형을 형질전환하고, 증식되는데 사용되었다 :mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ△M15 △lacX74deoRrecA1araD139 △(ara-leu)7697galUgalKrpsLendA1nupG
수퍼컴피턴트 세포의 50㎕는 결찰 혼합물 1∼5㎕와 조심스럽게 혼합되었고, 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이트되었고, 그 후 30초 히트 쇼크가 수행되었고, 얼음 위에서 2분 동안의 회복 기간이 수반되었다. 마지막으로 SOC 배지의 250㎕가 첨가되었고, 100㎍/ml의 암피실린을 함유한 LB 플레이트 상에 펼쳐지기 전에 세포는 30분 동안 37℃의 오르비탈(orbital) 진탕기 내에서 인큐베이트되었다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 서열의 측면에 있는 합성 프라이머를 이용한 특정 DNA 서열의 실험실 내에서의 증폭 및 DNA의 복제를 위한 열안정성 DNA 중합효소(즉, Taq DNA 중합효소)에 기초를 두는 기술이다.
넓은 범위의 PCR 기술은 이러한 연구 즉, Hot Start, Touch Down, Long PCR, Nested PCR 및 Sequencing PCR에 광범하게 사용되었다.
PCR 반응의 최적화를 위해 PCR optimizerTMKit(Invitrogen)이 적용되었다. 이러한 키트는 4개의 다른 pH 값의 16개의 완충액으로 구성되고, 각각은 4개의 다른 마그네슘 이온 농도 범위로 보충되었고, PCR 반응의 최적화를 완화시킨다.
하기의 중합효소가 사용되었다 :
·AmpliTaq GoldTM(Perkin-Elmer)
·ExpandTMHigh Fidelity PCR 시스템(Boehringer M)
·Taq DNA 중합효소(Pharmacia Biotech)
ExpandTMHigh Fidelity PCR 시스템은 Taq와 Pwo 중합효소의 중합효소 혼합이고, 높은 특이성으로 12 kb까지의 PCR 생성물의 증폭을 위해 고안되었다. Taq는 5'→3' 트랜스퍼라제 활성을 지니고, 단일 3' A 돌출을 지닌 말단을 생성하는 반면 Pwo는 3'→5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 지니고, 블런트 말단을 지닌 생성물을 생성한다.
사이클 서열화를 제외하고는 여기에 보고된 모든 PCR 반응은 낮은 온도에서주형 상에 불충분하게 매치된 사이트로의 프라이머의 결합 및 반응의 첫 번째 사이클 내에서 형성된 의사 확정 생성물을 최소화하는 Hot Start 기술을 이용하였다. 이는 지나가는(elapsed) 주형의 변성의 실질적인 기간 전의 중합(polymerisation)을 방지함으로서 달성된고, 이는 중합효소의 타입에 따라 2개의 다른 방법으로 영향을 받는다.
ExpandTM또는 AmpliTaq GoldTMDNA 중합효소가 사용될 경우 왁스 펠렛은 중합효소를 제외한 모든 구성성분을 함유한 반응 혼합물 상에 위치된다. 왁스는 95℃에서 2분 동안 녹여지고, 4℃에서 식혀져서 반응 혼합물의 상부의 얇은 표면을 형성하는 경화제를 초래한다. 이러한 표면 상에 중합효소 1㎕가 첨가되었고, 그 후 튜브는 95℃에서 미리 가열된 써모사이클러(thermocycler)에 위치되었으며 PCR 프로그램이 즉시 시작되었다.
AmpliTaq GoldTM는 고형의 왁스 표면 상에 중합효소를 도포하는 불편없이 hot start를 가능하게 하는 열적으로 활성화된 중합효소 혼합물이다. 효소는 이에 결합된 불활성화 항체와 함께 제공된다. 중합효소는 예비 가열 단계에 의해 활서화되는 반면 항체는 변성하고, 따라서 효소가 활성적이 되게 한다. 이는 고형 왁스 표면 상에 중합효소를 도포하는 불편없이 hot start PCR을 가능하게 하고, 변성 시간은 유의적으로 길어지고 따라서 더욱 완전해 진다. 이러한 반응에서 모든 구성성분은 왁스 펠렛과 함께 첨가되었고, 반응은 상기에 기술된 바와 같이 시작되었다.
긴 PCR 생성물의 증폭이 바람직할 경우 시간 증가는 PCR 프로그램의 확장 단계에 첨가되었다.
PCR 반응은 마스터사이클러(Mastercycler)(Eppendorf) 내에서 수행되었다.
이러한 반응의 일반적인 예는 하기의 표에 요약되어 있다.
PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/reac. 단계 온도(℃) 시간
주형 (1:100) 1 1 94 2'
5* 완충액 10 2 94 30"
dNTP 혼합 4 3 68 30"
상위 프라이머 4 μM 5 4 2, 29 시간 까지
하위 프라이머 4 μM 5 5 68 10'
물 50까지 6 4 무한
익스팬드(Expand) 0.75
초: " 및 분: '
PCR 생성물의 클로닝
대부분의 환경 하에서 분리된 PCR 생성물은 단일 3'-T 돌출 및 TOPO 이소머라제로 선형화된 단편으로 제공된 pCR2.1-TOPO(Invitrogen) 내에서 클론되었다.이러한 시스템은 증폭된 생성물의 양 말단 내에 단일 돌출 3'-A를 첨가하는 Taq 중합효소의 경향을 이용한다. TOPO 이소머라제는 분열 및 결찰 활성 모두를 지니고, 이는 단일 5'-A 돌출과 함께 PCR 생성물로 재결찰할 단일 3'-T 돌출을 생성하는 CCTTT 사이트에서 벡터를 분열시킨다. 따라서 이러한 시스템은 T4 리가제로의 결찰의 이용없이 Tq 증폭된 PCR 생성물의 클로닝을 가능하게 한다.
pCR2.1-TOPO의 클로닝 사이트는 클론이 β-갈락토시다제(x-gal)를 위한 색원체성 기질의 존재시 청색/흰색 스크리닝에 의해 선택되는 삽입이 가능하게 되는 lacZ 유전자의 분열적 로커스(locus) 내에 존재한다. 흰색 콜로니로부터의 Miniprep DNA는 제한 분해, PCR 및/또는 서열화에 의해 분석되었다.
일부 PCR-단편은 효소로 분해되었고, 하위-클로닝 단계없이 플라스미드 벡터 내로 직접적으로 클론되었다. 결합성 말단이 이러한 방법으로 제한 효소에 의해 생성되고, 직접적인 클로닝에 사용될 수 있을 경우 실질적인 시간 절약이 달성되었다.
프라이머
관련된 프라이머는 하기의 표에 나타나 있다.
서열화(sequencing)
Rsus 3 프로모터 영역은 ALFexpress DNA 서열기(sequencer)로 서열화되었다. ALFexpress는 전기영동으로 분리된 형광 표지된 DNA 분자의 자동화된 검출을 위해 고안된다.
pCR2.1-TOPO 벡터에 대한 Cy5-라벨된 형광 M13 리버스와 포워드 프라이머는 클론된 PCR 산물의 5'와 3' 말단의 서열화를 위해 사용되었다. 게다가 Cy5-표지된 서열화 프라이머는 기술된 OLIGOTM프로그램 - Version 5.0 forWindows(National BioSciences Inc, Plymouth, Ma)를 이용하여 Rsus 3 프로모터 영역의 특정 영역을 위해 고안되었다.
서열화에 대한 재료
· ALFexpressTMDNA 시퀀서(Pharmacia biotech AB)
· 7-deaza-dGTP를 지닌 형광 표지된 프라이머 사이클 시퀀싱 키트 써모 시쿼나제(Amersham Pharmacia biotech)
· 기계의 ALFR패밀리를 지닌 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 대한 ReproGelTMLong Read(Amersham Pharmacia Biotech)
· ReprogelTM의 UV 중합에 대한 ReproSetTM(Amersham Pharmacia Biotech)
· ALFexpress를 조절하는 Windows 95 기초 프로그램 ALFwinTM서열 분석기 2.00(Amersham Pharmacia Biotech)
디오데옥시 체인 터미네이터 시퀀싱은 형광 표지된 프라이머를 받아들이고 4개의 디오데옥시 체인 종결자에 대한 동일한 친화력을 갖도록 선택된 Amersham Pharmacia Biotech이 공급하는 특별한 돌연변이 중합효소 써모시퀀스(ThermoSequence)를 이용하여 써모사이클드(thermocycled) 반응에서 수행된다. 겔 상에서의 밴드 압축은 반응에서 7-deaza-dGTP의 사용으로 제한되었다.
서열 분석
결과 서열은 Denmark, DTU, Department of microbiology, F.G.Hansen이 개발한 Winseq 1.01을 이용하여 조합되었다. 이러한 예비 서열 조합 후, 서열 분석은 동일한 프로그램을 이용하여 수행되었다.
쌀 게놈 DNA로부터 RSus 3 프로모터 영역의 분리
쌀 슈크로스 합성효소 (RSus3) 프로모터 영역은 알려진 서열 측면에 위치한 알려지지 않은 서열을 증폭하기 위해 고안된 Siebert et al. 1995에 기술된 어댑터 중개 PCR 방법인 염색체 워킹 기술(chromosome walking technique)을 이용하여 쌀 게놈 DNA로부터 분리되었다.
게놈 DNA는 어댑터가 결찰된 블런트 말단의 생성물(Dral, EcoRV, Pvull, Scal 또는 Sspl)을 생산하는 효소로 처음 소화된다. 결과는 알려진 서열에 특정한 하나의 프라이머와 Siebert et al(ibid)에 기술된 어댑터-특정 프라이머를 이용한 PCR에 대한 주형으로 서브할 수 있는 5 DNA-라이브러리의 발생이다.
어댑터 서열과 어댑터 프라이머(AP1)와 네스티드(nested) 어댑터 프라이머(AP2)가 제공되었다. 예를 들어 유전자-특정 프라이머로부터 증폭의 초기 라운드가 없을 때, 어댑터는 AP1 프라이머 결합 사이트로부터 증폭을 방지하는 3' 말단의 아미노그룹과 함께 고안되었다[After Siebert et al. 1995].
어댑터는 양쪽 말단에서 어댑터 바인딩 사이트를 지닌 주형이 증폭되지 않음을 확실하게 하는 두가지 특징을 결합한다. 첫 번째로, 어댑터의 3' 말단에서 아미노 그룹에 기인하여, 더 낮은 스트랜드 3' 말단의 연장에 의한 AP1 프라이머 결합 사이트의 발생이 방지된다. 따라서, PCR 동안 AP1 프라이머 결합 사이트가 형성되는 환경만이 제한 단편 내에 결합하는 프라이머로부터 증폭의 초기 라운드가 있는 것이다. 두 번째로, AP1으로부터 비특정 프라이밍에 의해 형성되는 주형의 증폭은 억제될 것이다. 이 방법에서 형성된 단편은 싱글 스트랜디드 생성물에서 인버티드 터미널 반복(inverted terminal repeats)를 포함하여, 2차 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 것이며, 주형-프라이머 하이브리드보다 더 안정하다. 스템-루프 구조의 형성은 프라이머의 어닐링을 억제하여, 비특정 PCR 생성물의 증폭을 억제한다. 방법의 특이성은 네스티드 PCR 프라이머를 이용한 생성물의 재증폭에 의해 더욱 향상된다.
게놈 DNA의 제조
게놈 DNA는 쌀로부터 얻어졌다. 1 ㎍의 DNA는 50 ㎕의 총 부피에서 다음의 블런트 말단 효소 : Dral, EcoRV, Pvull, Scal 및 Sspl 중 어느 것 20 U로 소화되었다.
소화는 효소 제거 컬럼(Amicon)을 통해 런 되었으며 알코올 침전과 20 ㎕ TE에 용해시킴으로써 농축되었다.
어댑터는 22 ㎕의 총 부피에서 올리고 1과 올리고 2 각각의 800 pmol을 혼합하여 제조되었다. 혼합물은 94℃에서 1분 동안 처리되어 변성되었으며, 얼음으로 옮겨졌다.
어댑터의 익세스(excess)는 T4 DNA 리가제를 이용한 블런트-말단 다이제스트로 결찰되었다. 4 ㎕ 어댑터와 13 ㎕ 다이제스트는 30 ㎕의 총 부피에서 10 U T4 DNA 리가제와 혼합되었으며, 상온에서 24시간 동안 배양되었다.
익세스 어댑터는 >100 bp PCR 생성물을 회수하여 익세스 어댑터를 또한 제거하는 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 결찰 후 제거되었다
Rsus3 프로모터 영역에 대한 PCR 스크리닝
Rsus3 프로모터 영역의 분리에 대해, 다음의 서열-특정 프라이머가 고안되었다 :
5'-ACG ACG GAA TGG ATA ATA GCA GAT A-3'
이 안티센스 프라이머의 3' 말단은 RSus3의 ATG의 대략 300 bp 하류를 어닐한다.
증폭은 Mastercycler(Eppendorf)에서 뜨겁게 시작된, 두 단계, PCR(68°/94℃)로 수행되었다. 최적 생성물 길이와 에러의 한계를 확실하게 하기 위해 프루프-리딩 열안정 DNA 중합효소 혼합물 ExpandTM(Boehringer M)가 사용되었다.
증폭의 부가적인 최적화를 위해, 하나의 네스티드 프라이머로 PCR이 수행되었다. 초기 PCR(프라이머-페어 AP1/Rsus3) 후, 주형으로써 초기 증폭으로부터의 생성물을 이용하여 2차 세미-네스티드 증폭(프라이머-페어 AP2/Rsus3)이 수행되었다.
초기 PCR에 대한 조성과 반응 조건이 아래 표에 요약된다.
초기 PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/반응 단계 온도(℃) 시간
주형(1:20) 5 1 94 1'45"
5x 완충액(E,F,G and H) 10 2 94 15"
dNTP 혼합(10 mM) 4 3 68 4'
AP1(4 μM) 5 4 스텝 2로, 9번
Rsus3(4 μM) 5 5 94 15"
물 20 6 68 4'+20"/사이클
ExpandTM 0.75 7 단계 5로, 19번
8 4 무한
* 분: ' 및 초: "
PCR optimizerTMKit(Invitrogen)에 대한 완충액 E, F, G와 H는 완충액 조건의 최적화에 대해 선택되었다.
세미-네스티드 PCR은 아래 표에서 기술한 대로 수행되었다.
2차 PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/반응 단계 온도(℃) 시간
주형(1:100) 1 1 94 1'45"
5x완충액(F and H) 10 2 94 15"
dNTP 혼합(10 mM) 4 3 68 4'
AP2(4 μM) 5 4 스텝 2로, 9번
Rsus3(4 μM) 5 5 94 15"
물 25 6 68 4'+20"/사이클
ExpandTM 0.5 7 단계 5로, 19번
8 4 무한
* 분: ' 및 초: "
Sall과 양립할 수 있으며, Rsus3에 내부 Xhol 사이트가 존재하지 않으므로,이 Xhol 사이트는 모든 천연 Rsus3 단편의 5' 말단을 나타낸다.
서열화는 Rsus3에서 ATG 시작 코돈 주위의 서열이 CAATGG 임을 밝혀냈다. 그래서 ATG 주위의 컨센서스 서열에서 Ncol(CCATGG)의 도입만이 싱글 베이스페어에 영향을 미친다. 프로모터 영역의 3' 말단의 발생 때문에, RSus3Nco 프라이머는 pGUSNOSt에서 uidA 유전자와 함께 증폭된 프로모터 단편의 번역 융합에 대한 ATG 시작 코돈에 위치한 Ncol 사이트로 고안되었다.
2개의 RSus3 단편(1450 bp와 2700 bp)의 증폭을 위해서 프라이머-페어 M13 포워드/RSusNco가 사용되었으며 RSus3 단편은 pSspK3와 pScaK3로부터 증폭되었다. M13 프라이머는 pSsp의 pCR2.1-TOPO 부분으로 어닐하며 pSca는 클로닝 사이트로부터 약 110bp를 클론한다.
2개의 RSus3 단편은 다음 스킴에 따라 증폭되었다.
PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/반응 단계 온도(℃) 시간
주형(1:20) 5 1 95 2'
5x완충액(G and H) 10 2 95 1'
dNTP 혼합(10 mM) 4 3 55 1'
M13 포워드(4 μM) 5 4 72 2'
RsusNcol(4 μM) 5 5 단계 2로, 25번
물 20 6 72 10'
ExpandTM 0.5 4 0'
* pSspK3 또는 pScaK3의 카이아겐 미니프렙(Qiagen miniprep)
결과 생성물은 pCR2.1-TOPO에서 클론되었으며 Xhol/Ncol 단편으로써 pGUSNOSt로 서브클론되었다. 양성 클론은 미니프렙 DNA의 제한 매핑(mapping)에 의해 확인되었다. pGUSNOSt는 Sall 및 Ncol과 직선화되었지만 벡터는 플라스미드의 재결찰을 방지하기 위해 결찰 전에 인산효소로 처리되었으며 Sall과 Ncol 사이트(G/TCGAC/CATGG)에 가까이 위치한 한 효소로만 잘려졌다.
NOS 종결자는 E357/E356 프라이머쌍으로 pDB2로부터 266 bp 단편으로 증폭되었으며, 각각은 어닐링 영역에 EcoRI 사이트 5'를 포함한다. 증폭된 단편은 pCR2.1-TOPO에서 클론되었으며, 양성 클론이 확인되었으며, pNOSt9로 이름지어졌다. 이는 유니버설과 역 서열화 프라이머(pCR2.1-TOPO)로 양방향에서 서열화되었으며 결과 서열은 Entrez 검색 엔진에서 BLAST 기능을 이용하여 증명되었다. NOSt는 EcoRI로 pCR2.1-TOPO로부터 삭제되었으며 pGUSN358 →S에서 이 효소에 대한 특이한 사이트로 클론되었다. pGUSN358 →S에서 단편의 오리엔테이션은 바른 오리엔테이션에 대한 프라이머 페어 E357/pGUSlower와 역방향(350 bp의 생성물)에 대한 E356/pGUSlower를 이용한 PCR에 의해 시험되었다. 정방향에서 NOSt와 함께 클론이 선택되었으며, pGUSNOSt 2(5253 bp)로 명명되었으며, 후에 pGUSNOSt로 불려진 반면에, 역방향에서 NOSt와 함께 클론이 선택되었으며 pGUSNOSt1으로 명명되었다.
pGUSNOSt에서 RSus3 프로모터의 클로닝
초기 목적은 프로모터 서열의 어떠한 변화 없이 RSus3 프로모터를 pGUSNOSt로 가능하면 많이 클론하는 것이었다.
RSus3 프로모터의 제한 매핑은 다음의 지방적 특징을 준다 :
1. ATG 코돈에 상류인 대략 1200 bp의 내부 Hindlll 사이트.
2. Ssp 1(pSsp 클론)로 소화된 것이 아닌, Sca 1(pSca 클론)로 소화된 쌀 DNA 주형으로부터 비롯된 클론에서의 Pstl 사이트.
3. pSca와 pSsp 클론 양쪽에서 여러 개의 Sphl 사이트.
4. Sall과 Ncol 사이트는 클론된 단편 어디에서도 발견되지 않았다.
이러한 특징은 pGUSNOSt에서 RSus3 프로모터의 클로닝에 대한 특이한 제한 사이트의 수를 제한했다. Sall과 Ncol 만이 RSus3 프로모터의 클로닝에 이용 가능했다.
클로닝 방법은 RSus3 프로모터와 uidA 유전자의 방향 및 번역 융합에 대해 Sall과 Ncol 사이트에 양립할 수 있는 말단을 지닌 2개의 RSus3 상류 단편(1450 bp와 2700 bp)을 발생시키는 것이었다. 클로닝 방법은 도 5에 기술된다.
염색체 워킹 기술(chromosome walking technique)로부터의 어댑터는 Xhol 사이트를 포함하여 따라서 pSsp와 pSca 클론에서 분리된 RSus3 프로모터는 모두 프로모터 영역의 5' 말단에서 이 Xhol 사이트를 포함한다. Xhol로 잘려 발생된 위에 걸친 말단은 Sall과 양립할 수 있으며, 내부 Xhol 사이트는 RSus3에 존재하지 않으므로, 이 Xhol 사이트는 모든 천연 RSus3 단편의 5' 말단을 나타낸다.
서열화는 RSus3에서 ATG 시작 코돈 주위의 서열이 CAATGG 임을 밝혀냈다. 그래서 ATG 주위의 컨센서스 서열에서 Ncol(CCATGG)의 도입만이 싱글 베이스페어에 영향을 미친다. 프로모터 영역의 3' 말단의 발생에 대해, RSus3Nco 프라이머는 pGUSNOSt에서 uidA 유전자와 함께 증폭된 프로모터 단편의 번역 융합에 대한 ATG 시작 코돈에 위치한 Ncol 사이트와 함께 고안되었다.
2개의 RSus3 단편(1450 bp와 2700 bp)의 증폭을 위해서 프라이머-페어 M13 포워드/RSusNco가 사용되었으며 RSus3 단편은 pSspK3와 pScaK3로부터 증폭되었다. M13 프라이머는 pSsp의 pCR2.1-TOPO 부분으로 어닐하며 pSca는 클로닝 사이트로부터 약 110bp를 클론한다.
2개의 RSus3 단편은 다음 스킴에 따라 증폭되었다.
PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/반응 단계 온도(℃) 시간
주형(1:20) 5 1 95 2'
5x완충액(G and H) 10 2 95 1'
dNTP mix(10 mM) 4 3 55 1'
M13 포워드(4 μM) 5 4 72 2'
RsusNcol(4 μM) 5 5 단계 2로, 25번
물 20 6 72 10'
ExpandTM 0.5 4 0'
* pSspK3 또는 pScaK3의 카이아겐 미니프렙(Qiagen miniprep)
결과 생성물은 pCR2.1-TOPO에서 클론되었으며 Xhol/Ncol 단편으로써 pGUSNOSt로 서브클론되었다. 양성 클론은 미니프렙 DNA의 제한 매핑(mapping)에 의해 확인되었다. pGUSNOSt는 Sall 및 Ncol과 선형화되었지만 벡터는 플라스미드의 재결찰을 방지하기 위해 결찰 전에 인산효소로 처리되었으며 Sall과 Ncol 사이트(G/TCGAC/CATGG)에 가까이 위치한 한 효소로만 잘려졌다.
양성 1450 bp 클론은 "p1450"으로 명명되었으며 양성 2700 bp 클론은 "p2700"으로 명명되었다.
RSus3 프로모터의 삭제
활성도와 특이성을 주는 클론된 프로모터 영역의 그런 부분을 확인하기 위해, 우리는 다른 유전자의 프로모터에서 확인된 모티프를 포함하기 위해 DNA 서열로부터 간주되는 영역의 일련의 삭제를 함으로써 클론된 단편의 분자 해부를 수행하였다.
RSus3 프로모터 삭제부분의 발생은 프로모터 영역의 선택된 부분의 PCR 증폭을 포함했으며, 이러한 단편의 컨스트럭션으로의 클로닝은 P1450 구조물에 기초한 것이었다. 프로모터의 모든 절단(truncation)은 번역 시작 코돈의 989 bp 5'에 위치한 TATA 박스의 상류가 되며, 인트론 1의 대략 100 bp 상류가 됨이 결정되었다. 이 방법은 구조물로부터 인트론 1을 보유하거나 후에 제거하는 선택을 주었으나, 모든 인식된 프로모터 모티프가 위치한 영역 삭제에 초점을 맞추었다.
상기 기술된 대로, 절단된 프로모터 인서트의 클로닝에 대한 pGUSNOSt MCS에서 이용 가능한 제한 사이트의 수에는 제한이 있다. 사실, 결과 클론의 pGUSNOSt 부분에 남겨진 특정 사이트는 없다. 그러나 클론된 1450 bp와 2700 bp 단편의 어댑터 부분에는 많은 제한 사이트가 있다.
약간의 제한 사이트만 p2700의 RSus3 부분과 p1450 구조물 내에서 특정하다. 이들 중, BamHI, BgIII, BsiWI와 Clal만이 결합성 말단을 발생시키며 따라서 클로닝에 편리하지만, BamHI는 그 내에서 인트론 1과 BgIII의 하류에 위치한다. 반면에 BsiWI와 Clal은 MCS로부터 300-400 bp에만 위치하며 따라서 절단될 수 있는 매우 작은 서열을 남긴다.
사용할 수 있는 클로닝 사이트의 부족은 다음의 방법을 이끌어 냈다 :
MCS HindIII 사이트는 부분적 소화, Klenow로 필-인(fill-in)되고 결과 블런트 말단의 단편의 재결찰에 의해 Nhel 사이트로 전환되었다. Nhel/HindIII를 지닌 PCR 증폭된 단편은 나중에 결과 특정한 Nhel과 HindIII 사이트에서 방향적으로 클론될 수 있다.
이 방법은 힘들지만 여러 장점을 가졌다.
1) 특정 Nhel과 HindIII 사이트가 포함된, PCR 증폭된 생성물이 방향적으로 클론될 수 있는 표준 테스트 플라스미드가 만들어졌다.
2) 모든 절단된 클론으로부터 얻어질 수 있는 HindIII/Ncol 단편의 서열은 동일해서, 이 영역에서 PCR-발생된 돌연변이에 기인하는 가능한 변이들이 억제되었다.
PCR 삭제의 방향 클로닝에 대한 HindIII →Nhel 변환
MCS에서 HindIII 사이트의 Nhel 사이트로의 변환은 HindIII로 부분적 소화, Klenow 단편 위에 걸친 5' 싱글 스트랜디드의 필링-인, Nhel 사이트를 형성시킨 재결찰을 포함한다. Hind III로 부분적 소화에 영향을 미치는 반응 조건은 하기 표에서 효소의 희석 범위를 이용하고 37℃보다는 25℃에서 수행하여 반응을 늦춤으로써 실험적으로 결정되었다.
부분적 소화에 대한 반응 스킴 :
샘플 플라스미드 희석물1(㎕) NEBuffer 2(㎕) HindIII 희석물1(㎕) 물(㎕)
1 2 1.5 2 9.5
2 2 1.5 4 7.5
3 2 1.5 6 5.5
4 2 1.5 8 3.5
5 2 1.5 10 1.5
6 2 1.5 12 0
희석물 : 0.25 ㎍/㎕ 플라스미드와 0.02 U/㎕ HindIII
부분적 소화물은 Mastercycler(Eppendorf)에서 25℃에서 15분 동안, 65℃에서 10분 동안 배양되었다. 결과는 1% Seakem 아가로스 겔에서 평가되었으며 표본 2와 3은 가장 좋은 결과를 주었다. 이 두가지 표본에서 4개의 밴드가 있었다 : 잘려지지 않은 플라스미드로부터 2개의 밴드, 싱글 HindIII 컷으로부터 밴드 그리고 양쪽 HindIII 사이트의 절단으로부터 페인트(faint) 밴드. 마지막 밴드는 싱글 컷 밴드를 희생하여 다음의 표본에서 세기가 증가되었다.
부분적으로 HindIII-소화된 1450bp 구조물은 결찰 전에 DNA 중합효소 I Large Fragment(Klenow)(NEB)를 이용하여 필 인 되었다. dNTP's의 존재 하에서,Klenow 단편은 5' 터미널 분해 없이 E. coli DNA 중합효소 I의 중합 충실도를 보유한다. Klenow 단편으로 처리는 다음과 같이 수행되었다 :
14 ㎕ 부분 소화된 플라스미드
2 ㎕ 10 mM dNTP mix(Invitrogen)
0.6 ㎕ NEBuffer 2(NEB)
2.9 ㎕ 물
0.5 ㎕ Klenow 단편(NEB)
반응물은 25℃에서 15분 동안, 75℃에서 10분 동안 배양되었다. 필링-인 반응 후 단독으로 절단된 플라스미드 밴드는 겔로부터 분리되어, 결찰되고 양성 클론은 분리되었다. 이 방법은 상류 Nhel 사이트(p2700(upNhel) 1과 3)를 지닌 것과 하류 Nhel(p2700(downNhel) 7과 10) 사이트를 지닌 것, 2개의 다른 타입의 클론을 발생시킨다. 후자 타입의 클론은 프로모터 절단 연구에 적절하지 않지만, 프로모터 모티프의 탠덤 반복의 구조 동안 후에 유용함을 발견하였다.
부가적으로, RSus3 서열을 포함하지 않는 모체 플라스미드 pGUSNOSt의 MCS에서 HindIII 사이트는 pGUSNOStNhel 2와 3을 형성하기 위해 동일한 방법으로 Nhel 사이트로 수정되었지만, 부분적 소화는 이 플라스미드에서 특정 HindIII 사이트에 대해 필요하지 않았다.
p2700(upNhel)에서 3개의 RSus3 삭제부분의 클로닝
도 6 참고.
3개의 삭제부분은 다른 상위 프라이머, 동일한 낮은 프라이머 : Nhedel1/Dellow1, Nhedel2/Dellow1과 Nhedel3/Dellow1을 지닌 3개의 프라이머-쌍을 이용하여 발생하였다. Nhedel1-3 프라이머는 Nhel 사이트와 함께 고안되었으며 Dellow1 프라이머는 내부 HindIII 사이트의 하류를 어닐하도록 고안되었다. 따라서 이러한 프라이머-페어는 주형으로써 2700bp 구조물을 지니고, 각각은 p2700(upNhel)에서 클로닝에 대한 Nhel/HindIII 사이트를 지닌 3개의 다른 PCR 생성물(650 bp, 590 bp와 480 bp)을 발생시킨다.
증폭은 하기 표에서 기술된 2-스텝 PCR(68/94℃)로써 Mastercycler (Eppendorf)에서 수행되었다.
PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/반응 단계 온도(℃) 시간
주형(1:100) 1 1 95 2'
5x완충액(E, F, G or H) 10 2 94 45"
dNTP 혼합(10 mM) 4 3 68 45"
Nhedel1,2,3(4 μM) 5 4 단계 2로, 25번
Dellow1(4 μM) 5 5 68 10'
물 24.5 6 4 무한
ExpandTM 0.5
PCR 생성물은 pCR2.1-TOPO에서 클론되었으며 양성 클론은 제한 매핑에 의해 확인되었다. 이로부터의 Nhel/HindIII 단편은 분리되어 p2700(upNhel) 1으로 클론되었다.
3개의 양성 클론이 확인되었으며 "p1730" 클론 3, "p1670" 클론 3 및 "p1560" 클론 3으로 이름지어졌다.
p1160 구조물
도 7 참고.
이 삭제부분은 p2700 구조물 HindIII를 자름으로써 발생하였다. 벡터는 재결찰되고 2개의 양성 클론은 "p1160" 클론 1과 2로 이름지어졌다.
p2700-프롤라민 구조물
도 8 참고.
상기 기술된 모든 RSus3 삭제부분은 5' 말단 삭제부분인 반면에, 이 절단은RSus3 프로모터에서 내부 HindIII 사이트와 TATA-box 사이의 161 bp의 내부 삭제를 포함한다. RSus3 서열에 기초하여, 프라이머-쌍(RsusTATA/RsusNco)은 한쪽 말단에 HindIII 사이트를 지니고 다른 말단에 Ncol 사이트를 지닌 1020 bp의 증폭을 위해 고안되었다. 따라서 이 생성물은 TATA 박스 측면에 위치한 인트론 1과 ATG 번역 시작 코돈을 포함한다. 프라이머 RsusTATA는 내부 HindIII 사이트를 포함하며 TATA-box 상류를 어닐한다. uidA 유전자와 함께 증폭된 프로모터 단편의 번역 융합에 대한 ATG 시작 코돈에 위치한 Ncol 사이트를 포함하는 프라이머 RsusNco는 섹션 5에서 상기 기술된 것처럼 동일했다.
PCR 반응은 Mastercycler(Eppendorf)에서 다음의 스킴 후 2-스텝 PCR(68/94℃)로써 수행되었다.
PCR 반응 PCR 프로그램
시약 ㎕/반응 단계 온도(℃) 시간
주형(1:100) 1 1 95 2'
5x완충액(A and B) 10 2 94 45"
dNTP mix(10 mM) 4 3 68 45"
RsusTATA(4 μM) 5 4 단계 2로, 30번
RsusNco(4 μM) 5 5 68 10'
물 24.5 6 4 무한
ExpandTM 0.5
1020 bp HindIII/Ncol 생성물은 PCR에 의해 발생하였으며 pCR2.1-TOPO로 클론되었다. 양성 클론은 확인되고, HindIII/Ncol 단편은 2700bp(upNhel)로 클론되었다(대응 1160 bp 단편의 치환에 대해 HindIII와 Ncol로 직선화됨). 양성 클론은 분리되어 "p2700-프롤라민" 클론 1로 이름지어졌다.
RSus3 프로모터 영역 내에서 인트론 1의 제거
인트론 1이 부족한 프로모터를 만들기 위해, 쌀 DNA 라이브러리에서 RSus3 클론의 5'-비번역된 영역에 대한 스크리닝과 이것의 이미 클론된 상류 프로모터 모티프로의 스플라이싱이 처음으로 고려되었다. 그러나, 서열 분석은 인트론 1의 3' 억셉터 스플라이스 사이트가 ATG-코돈의 27 bp 상류에만 위치한다는 것을 밝혀냈다. 이 점에서, 바람직한 방법은 이 27 bp 하류 논-코딩 엑손의 서열이 프로모터 증폭시 사용된 낮은 스트랜드 PCR 프라이머로 결합되는 것으로 공식화되었다.
도 9 참고.
프라이머 페어는 pSca와 pSsp 클론으로부터 RSus3 프로모터 영역의 PCR 증폭을 위해 고안되었다. 낮은 프라이머(Lowexon1/2)는 다음과 같이 고안되었다 : 프라이머의 3' 말단은 인트론 1에서 추정 5' 스플라이싱 사이트에 대해 상류인 24 bp 서열에 대응한다. 프라이머의 5' 말단은 3' 스플라이싱 사이트와 ATG-코돈(Ncol) 사이의 27 bp 서열에 대응한다. 상위 프라이머 UppCR2.1은 pSca와 pSsp 클론으로부터의 인트론 1 없이 RSus3 프로모터의 증폭을 위해 M13 리버스 프라이머 사이트의 상류인 pCR2.1-TOPO의 44 bp 서열을 어닐하도록 고안되었다.
양쪽 프라이머는 매우 길고(Lowexon1/2는 56 bp이며 UppCR2.1은 44 bp), 전체 길이를 확인하기 위해, HPLC 정제를 행하였다. Lowexon1/2는 56℃의 녹는 온도를 지닌 헤어핀 루프를 형성하기 위한 가능성을 가지며 내부 BamHI 사이트는 안정한 프라이머 다이머를 주게 되어 PCR 증폭은 AmpliTaq Gold를 이용하여 2단계 프로그램(68℃/94℃)으로 수행되었다.
3' 말단에서 부분적으로 미스-매치된 더블-스트랜디드 2차 구조를 형성하기 위한 긴 프라이머의 포텐셜에 기인하여, 프루프-리딩 Pwo 중합효소에 의한 올리고뉴클레오타이드의 수정을 피하기 위해 AmpliTaq Gold가 ExpandTM중합효소 대신 사용되었다.
결과는 정확한 사이즈의 페인트 밴드여서, M13 리버스/RsusNco1을 지닌 세미-네스티드 PCR 증폭이 주형으로써 정제된 생성물을 이용하여 수행되었다.
이 네스티드 PCR은 더욱 강한 밴드를 주어서, pCR2.1-TOPO에서 클론되었다. 양성 클론은 확인되고 Xhol/Ncol 단편은 pGUSNOSt에서 서브클론되었다(pScaK3과 pSsp3으로부터의 Xhol/Ncol 단편의 서브클로닝과 유사한). 양성 클론은 "p1450-인트론" 클론 2로 이름지어졌다.
탠덤-리피트 RSus3 프로모터의 발생
RSus3 프로모터의 활성도를 증가시키기 위해, RSus3에서 TATA-box 상류 서열의 범위가 더블되었다. 이 방법은 3 탠덤-리피트 RSus3 프로모터를 가져오며, RSus3 영역의 다른 부분이 더블되었다.
도 10 참고.
DNA 서열 분석은 추정 시스-요소의 다수를 TATA 박스의 상류 700 bp(-1709 bp to -1027 bp) 내에 위치시킨다. 따라서 이 700 bp는 요소들이 더블되도록 포함한다.
3개의 탠덤-리피트 프로모터는 프로모터의 특정 서열의 증폭, 이들의 pCR2.1-TOPO로의 클로닝, 마지막으로 p1730 구조물에서 Nhel 사이트 또는 HindIII 사이트에서 클론된 단편의 서브클로닝으로 만들어진다.
탠덤 레구민
탠덤 레구민 프로모터에서 반복된 서열은 주형으로써 p2700(downNhel)를 지니고 p1730에서 Nhel/HindIII 생성물로써 동일한 기술 후에 증폭되었다. 이는 2개의 Nhel 사이트만 지닌 동일한 생성물을 가져와, pCR2.1-TOPO로 클로닝 후 Nhel 단편으로써 p1730의 Nhel 사이트로 서브클론되었다. 양성 클론은 Nhel 소화에 의해 확인되고, 오리엔테이션은 주형으로써 서브클론을 사용하여 PCR을 반복하여 정해졌다. 결과 클론은 "pTandem legumin"으로 명명되었다.
pTandem leg/pro
이 탠덤-리피트 프로모터는 동일한 접근으로 만들어졌다. 프라이머 페어는 p2700 구조물로부터의 750 bp 단편의 증폭을 위해 고안되었다. 프라이머 페어 각각은 Nhel 사이트(p1730에 대해 사용된 Nhedel1과 NheGCN4)를 지녔다. 프라이머 페어 Nhedel1/NheGCN4의 증폭은 다시 수행되었으며, p1730 구조물에 대한 동일한 기술 후, 750 bp 생성물(양쪽 말단에 Nhel 사이트를 지닌)을 생성하여, pCR2.1-TOPO에서 클론되었으며, 후에 p1730 구조물의 Nhel 사이트로 서브클론되었다. 양성 클론은 제한 소화에 의해 확인되고, 오리엔테이션은 동일한 방법으로 정해졌으며, 클론은 "pTandem leg/pro"로 명명되었다.
pTandem 프롤라민
이 탠덤-리피트 프로모터는 탠덤 leg/pro에서와 거의 동일한 방법으로 만들어졌다. 프라이머페어는 동일한 상위 프라이머와 HindIII 사이트(HindGCN4)를 지닌 유사한 낮은 프라이머를 지녔다. 결과 생성물은 pCR2.1-TOPO로 클론되었으며 이로부터의 170 bp HindIII/HindIII 단편은 p1730 구조물에서 HindIII 사이트에서 서브클론되었다. 양성 클론은 제한 소화에 의해 확인되고, 오리엔테이션은 주형으로써 서브클론을 사용한 PCR을 반복하여 결정되었다. 결과 클론은 "pTandem prolamin"으로 명명되었다.
파티클 인플로우 건(PIG)으로 일시적 탄도 변형
이 연구에 사용된 파티클 인플로우 건(PIG)은 Finer et al. 1992와 Vain et al. 1993에 따랐다. 오염물질을 최소화하기 위해 살균-벤치에 놓인 PIG는 디지털 진공 센서, 헬륨 실린더 조절기(1-16 bar)에 부착된 전자적으로 작동되는 솔레노이드 가스 밸브, 진공 펌프에 연결된 쓰리-웨이 밸브를 지닌 진공 챔버를 포함한다. 솔레노이드는 헬륨 흐름을 조절하며, 펄스에서 게이티드(gated) 흐름을 25 밀리세컨즈 아래로 허가하는 타이머 릴레이에 의해 조절된다. PIG는 타이머 릴레이, 디지털 디스플레이 진공 게이지와 화이어-버튼을 지닌 대조군 패널로부터 작동된다.
진공 챔버는 20 mm 아크릴릭 도어를 지닌 3 mm 스테인리스 스틸과 선반에 대해 각 20 mm에서 그루브를 지닌 폴리프로필렌의 10 mm 안의 라이닝으로 만들어진다. 챔버와 도어 사이의 실리콘 폼 가스켓은 진공 챔버를 밀봉한다.
PIG와 동일한 탄도 변형 장치는 입자 충격에 의한 구아 배유의 변형 가능성을 테스트하기 위해 예비 실험에서 사용되었다.
변형을 위한 구아 조직의 제조
이 연구에서 입자 충격에 대한 1차 타겟은 구아 배유이며, 어린잎은 물론 이머지드(emerged) 자엽과 프리-이머지드(pre-emerged) 자엽은 또한 비교 조직으로 사용되었다. 배유와 이머지드 자엽은 3-4주된 구아 포드(pod)로부터 분리되었으며, 프리-이머지드 자엽은 12 그리고 20일된 인 비트로 성장 묘목으로부터 수확되었으며, 어린잎은 성숙한 구아 식물로부터 수확되었다.
구아 조직의 분리
배유는 다음의 절차 후 무균 조건하에서 구아 종자로부터 분리되었다 :
살균된 구아 포드가 열려지고, 종자가 얻어졌다. 각 종자에 대해, 껍질은 조심스럽게 제거되고, 나머지 부분은 배유와 엠브리오로 나누어졌다. 배유는 2개의 동일한 절반으로 나누어졌고, 양쪽 절반의 볼록한 등 면은 입자 충격의 타겟 표면이었다. 양분과 오리엔테이션은 헬륨 폭발에 의한 조직의 분산을 최소화했다. 프리-이머지드 자엽은 엠브리오로부터 분리된 반면에, 이머지드 자엽은 12시간 낮/밤 제도에서 인 비트로 성장한 묘목으로부터 분리되었다. 어린 구아 잎은 완전히-자란 식물로부터 절제되었다.
분리된 조직은 고체 아가로스 배지와 필터 종이 디스크를 포함하는 60 mm 페트리 디쉬로 옮겨졌다(섹션 1.4.3 참고). 조직은 다음과 같이 놓여졌다 : 페트리 디쉬 중앙에 등 면이 위로 된 배유 ; 페트리 디쉬 중앙에 상부 면이 위로 접한 묘목으로부터의 자엽 ; 배유와 함께 엠브리오 자엽.
입자 충격 실험은 구조물당 5 내지 6번의 반복된 충격으로 이루어졌다. 6-8 배유, 묘목으로부터의 2-3 자엽, 또는 6-7 배유 플러스 4-5 프리-이머지드 자엽은 PIG의 각 방전에서 충격이 가해졌다. 자엽과 배유 양쪽의 비교 분석은 같은 실험에서 충격이 가해졌다.
구아 조직의 살균
항생물질이 변형에 사용되지 않아서, 미생물 오염은 방지되었다. 따라서 까다로운 살균 절차가 매우 중요하다.
성숙한 구아 식물로부터의 구아 포드의 살균은 다음과 같이 실행되었다 : 포드는 살균수에 세척되고, 96% EtOH에서 1분 동안 물에 잠겨지고, 마지막으로 살균수로 3번 세척되었다. 또한 구아 포드와 종자의 살균은 필요하지 않다.
성숙한 구아 식물로부터의 새 잎의 살균은 다음과 같이 실행되었다 : 잎은 살균수에 세척되고, 96% EtOH에서 10초 동안 그리고 0.15% NaOCl과 0.05% Triton X-100에서 20분 동안 물에 잠겨졌다. 마지막으로 잎은 살균수로 3번 세척되고, 사용할 때까지 물에저 저장되었다.
인 비트로 성장한 묘목으로부터 자엽은 단종되어 살균은 필요하지 않다.
배지
입자는 충격이 가해져 다음 배지에서 배양되었다. 배지는 고체 배지이며, 성분의 농도에 약간의 수정을 가한 Donovan & Lee 1977의 처방에 기초한 것이었다.
화합물 농도(mg/L)
염 슈크로스M&S mix1 20,0004,300
비타민 미오-이노시톨티아민 1000.4
아미노산 L-알라닌L-아르기닌L-아스파라긴L-아스파르트산L-시스테인L-글루탐산L-글루타민글리신L-히스티딘L-이소류신L-류신L-라이신L-메티오닌L-페닐알라닌L-프롤린L-세린L-트레오닌L-트립토판L-타이로신L-발린 89126.511710069664.5665.5156112174274.57767287.5443.5202.596164144161.5
아가 아가타입 A 1296 8,000
1Murashige & Skoog basal salt mixture M5524
입자 충격 절차
이 연구에서 입자 충격 실험은 하기 기술된 대로 수행되었다.
금 입자의 DNA 코팅
PIG의 5개 반복된 방전을 포함하는 싱글 플라스미드와의 전형적인 변형은3mg의 금 입자를 사용한다. 실제로, 이보다 더 큰 금 입자 배치는 한번에 신선하게 제조되어서, 후에 즉시 여러 변형에 사용되었다. 3mg의 금 입자 제조를 위해 하기 기술된 절차는 물질의 양에 비례하여 양과 부피가 증가하도록 조정된다.
1. 3mg의 금 입자(1.6 ㎛, Biorad)는 50㎕ 99.9% EtOH(Danisco Distillers)로 처리되었다.
2. 금 입자는 에탄올에서 3분 동안(전체 속도) 소용돌이 되었고 10,000g에서 1분 동안 원심분리 되었다.
3. 상청액은 제거되고 50㎕의 살균수에 재현탁 되었다.
4. 입자는 10,000g에서 1분 동안 원심분리 되었고 상청액은 제거되고 물로 세척은 반복되었다.
5. 입자는 50㎕의 50% w/v 글리세롤(살균)에 재현탁 되었다.
금 입자는 다음 방법에서 플라스미드 DNA로 코팅되었다.
1. 50㎕의 금 입자 현탁액은 써모믹서(Eppendorff)에서 소용돌이(14,000min-1) 되는 동안 제거되었다.
2. 50㎕의 금 입자 샘플이 소용돌이(14,000min-1) 되는 동안, 다음의 성분이 연속적으로 첨가되었다.
10㎕ 플라스미드(10㎍/㎕)
50㎕ 2.5M CaCl2
20㎕ 0.1M 스퍼미딘(Spermidine)
3. 소용돌이는 16,000 min-1에서 3분 동안 계속되었다. 샘플은 10초 동안 10,000 g에서 침전되었으며 상청액은 제거되었다.
4. 샘플은 250㎕ 99.9% EtOH에 재현탁 되었으며, 동일한 힘에서 10초 동안 원심분리 되었다.
5. 상청액은 제거되고 입자는 40㎕ 99.9% EtOH에 재현탁 되었다.
6. DNA 코팅된 마이크로프로젝타일(microprojectile)은 사용할 때까지 얼음에 보관되었다.
금 입자는 수용액에서 비가역적으로 덩어리가 되므로, 사용하기 전에 즉시 제조하는 필요하다[Kikkert 1993]. CaCl2는 4℃에 보관될 수 있지만, 스퍼미딘(N-[3-아미노프로필]-1,4-부탄디아민)은 시간에 따라 탈아미노화 하며, 용액은 매달 신선하게 만들어져 -20℃에서 냉동 저장되어야 한다.
코팅 절차에서 스퍼미딘의 목적은 DNA 인산 백본에서 음전하를 보호하여 DNA를 농축함으로써, 소수성 상호작용이 우세하게 한다[Bloomfield 1991].
PIG 작동
PIG는 다음 절차에 따라 작동되었다.
1. 타겟 조직을 지닌 페트리-디쉬(직경 60mm)는 진공 챔버에 놓여졌다.
2. 스테인레스 스틸 메쉬(250㎛-메쉬, 직경 13mm)는 필터 유니트에 놓여졌다.
3. DNA-코팅된 마이크로-프로젝타일 현탁액 5㎕는 스틸 메쉬의 중앙에 로드되었다.
4. 필터 유니트는 조립되어 헬륨 솔레노이드 밸브에 부착되었다.
5. 250㎛-메쉬 스테인레스 스틸 프로젝션 스크린은 페트리-디쉬의 상부에 놓여졌다.
6. 도어와 밸브는 닫혀지고 챔버의 진공화가 시작되었다.
7. 원하는 진공에 도달하는 점에서 정확하게 파이어 버튼을 누름으로써 헬륨 폭발은 면해졌다.
8. 진공은 진공화 포트를 열어 면해졌으며, 조직은 제거되었다.
9. 모든 샘플에 충격이 가해질 때까지 사이클은 반복되었다. 필터 유니트, 메쉬와 프로젝션 스크린은 각 새로운 구조물에 대해 교환되었다.
충격 조건
구아 배유, 엠브리오 및 자엽의 탄도 변형에 대한 좋은 결과는 다음의 충격 조건으로 얻어졌다.
· 진공 챔버는 0.1 bar의 부분 진공으로 진공화 되었다.
· 타겟은 필터 유니트에서 메쉬로부터 타겟 조직까지 측정된 16㎝ 거리에 놓여졌다.
· 조절기에서 헬륨 압력은 5 bar에 맞춰졌다.
· 타이머 릴레이는 50 밀리세컨드에 맞춰졌다.
· 스테인레스 스틸 프로젝션 스크린(250㎛-메쉬)은 타겟 조직위로 약 2㎝에 놓여졌다.
· 1.6㎛의 직경을 지닌 금 마이크로-프로젝타일(Biorad)은 플라스미드 DNA를 옮기는 데 사용되었다.
충격 후
충격 후 충격이 가해진 조직을 포함하는 페트리-디쉬는 밀봉되어 25℃에서 48시간 동안 배양되었다. 배유와 엠브리오는 어두운 곳에서 배양되었으며, 잎과자엽은 12시간 낮/밤 제도에서 배양되었다.
GUS 분석
히스토케미컬 GUS 분석은 Jefferson 1987이 기술한 대로 수행되었다. 배양 기간 후 충격이 가해진 조직은 마이크로타이터 플레이트로 옮겨져 GUS-분석 완충액에 담가져서 37℃ 어두운 곳에서 24시간 동안 배양되었다.
GUS-분석 완충액 :
100mM 소디움-포스페이트 완충액, pH 7.5
0.5mM 포타시움 페리시아나이드(III)
0.5mM 포타시움 페로시아나이드(II)
10mM Na2EDTA(Titriplex III)
1.9mM X-Gluc
GUS 발현 및 푸른 점의 수를 세어 프로모터 활성도를 결정하는 방법은 Knudsen & Muller[1991]로부터 적용되었다. 충격, 배양 및 GUS-분석 후, 푸른 점(발현 유니트)의 수는 현미경에서 세어졌으며, 면적에 비교하여 발현된 것을 검사하였다.
자엽과 잎은 여러 세척 단계에서 96% EtOH에서 선명해졌으며, 푸른 점을 셀 때까지 70% EtOH에 저장되었다.
배유에서 푸른 점은 GUS 배양 기간 후 즉시 세어져야 했다. 갈락토만난과 물의 높은 함량 때문에, 알코올 또는 물에 저장하는 것은 가능하지 않다. 배유의 스웰링(swelling)을 일으키는 물과 에탄올은 배유를 줄어들게 만들었다. 이러한 변화는 배유의 표면에서 발현 패턴을 무너뜨렸다.
구아 배유에서 슈크로스 합성효소의 존재
씨드-필(seed-fill)과 일치하는 슈크로스 합성효소에서 전형적인 발생 증가는 연속적인 슈크로스 합성효소 분석을 이용하여 구아 배유로부터의 추출물에서 확인되었다(도 11 참고). 슈크로스 합성효소 분석의 상세한 내용은 다음과 같다.
슈크로스 합성효소 분석
구아 배유 발생에서 슈크로스 합성효소 분석은 슈크로스 분할 방향에서 분석 되었다. 슈크로스 합성효소는 UDP 존재하에서 슈크로스의 프록토스와 UDP-글루코tm로의 분할을 촉매한다 :
슈크로스 + UDP ↔ 프록토스 + UDP-글루코tm
슈크로스 합성효소의 활성도는 Keller et al.이 기술한 연속적인 효소 반응에서 UDP-글루코스의 형성을 모니터함으로써 분석되었다(Keller F, Frehner M & Wiemken A (1988) Sucrose Synthase, a Cytosolic Enzyme in Protoplasts of Jerusalem Artichoke Tubers (Helianthus tuberosus L.) Plant Physiol. 88, 239-241). UDP-글루코스의 형성은 UDP-글루코스의 UDP-글루쿠로닉산으로의 산화를 촉매하는 UDP-글루코tm 탈수소효소(E.C. 1.1.1.22) 존재 하에서 NAD+의 환원과 짝을 이루었다 :
UDP-글루코tm + 2NAD++ H2O ↔ UDP-글루쿠로닉산 + 2NADH
배유는 발달한 종자로부터 절개되며, 로테이팅 페스틀(rotating pestle)을 이용하여 헤페스(Hepes)/KOH 완충액(20 mM, pH 8.00)에서 풀되고 균질화되었다. 이 과정 동안 갈락토만난 백본의 효소에 의한 파괴는 β-만나제(E.C. 3.2.1.78, Megazyme)의 첨가로 이루어졌다. 샘플은 20,000 g에서 20분 동안 원심분리 되었으며, 크루드 추출물로부터 내생적 당을 제거하기 위해 결과 상청액은 Sephadex G-25 컬럼(NAPTM-5, Pharmacia Biotech)을 이용하여 탈염되었다.
적절한 양의 효소 추출물은 슈크로스 합성효소 분석 완충액(1 ml)에 첨가되었다.
20mM 헤페스/KOH (pH 8.0)
200mM 슈크로스
2mM UDP
1.5mM NAD+
20mU UDP-글루코스 탈수소효소(Sigma)
NAD+의 NADH로의 환원 후에 스펙트로포토미터에서 340 nm에서 흡광도가 연속적으로 측정되었다(25℃, εNADH= 6300 l mol-1cm-1). 생성된 UDP-글루코tm의 양(μmol min-1)은 결과 흡광도 곡선의 기울기로부터 계산되었다. 남은 상청액에서 단백질의 총량은 표준으로 보바인 세럼 알부민을 지니는 Biorad Protein Assay를 이용하여 결정되었으며, 슈크로스 합성효소의 특정 활성도는 계산되었다(단백질 mg 당 슈크로스 합성효소 유니트, 또는 μmol min-1mg-1).
슈크로스 합성효소의 활성도는 7-41일로부터 개화 후까지 다양한 발달 단계에서 구아 배유으로부터의 추출물에서 측정되었다. 각 발달 단계에 대한 평균 슈크로스 합성효소 활성도는 3 내지 4개의 독립적인 측정에서 얻어졌으며, 각각은 동일한 포드로부터 적어도 5개의 배유로부터 얻어진 추출물로 만들어졌다.
결과
RSus3 프로모터 영역의 분리
쌀 슈크로스 합성효소 3(RSus3) 프로모터 영역은 Siebert et al. 1995에 기술된 염색체 워킹 기술(chromosome walking technique)을 이용하여 쌀 게놈 DNA로부터 분리되었다. 세미-네스티드 PCR 반응 후, 3개의 밴드가 다음의 반응에서 나타났다 : Dral(약 700 bp), Scal(약 3000 bp) 및 Sspl(약 1800 bp).
1800bp와 3000bp 생성물은 싱글 프라이머 대조군 반응에 의해 프라이머-쌍 AP2/RSus3로부터 얻어진 특정 생성물로 확인되었다.
주형/프라이머 AP2 RSus3 AP2/RSus3
Scal(완충액 H) - - 약 3000 bp
Sspl(완충액 H) - - 약 1800 bp
이 싱글 프라이머 대조군 반응의 결과는 1800 bp와 3000 bp가 AP2/Rsus3 프라이머-쌍으로부터의 특정 증폭으로부터 비롯된 것이지 싱글 프라이머 생성물이 아님을 보여준다. AP2로부터의 싱글 프라이머 생성물은 2개의 어댑터로부터의 증폭의 결과와 더욱 비슷하다.
1800 bp와 3000 bp 생성물은 pCR2.1-TOPO로 클론되었다. 1800 bp 결찰의 9개의 클론과 3000 bp 결찰의 7개의 클론이 분리되었다. EcoRI와의 제한 매핑은 이들 중 4개의 1800 bp 클론과 6개의 3000 bp 클론이 2개의 EcoRI 사이트 사이에 인서트를 가짐을 보여준다.
1800 bp와 3000 bp 인서트를 지닌 결과 pCR2.1 클론은 pCR2.1-TOPO에 대해 특정한 M13 유니버설과 역 서열화 프라이머를 이용하여 부분적으로 서열화되었다. 1800 bp와 3000 bp 클론에 대한 하류 서열은 Winseq 프로그램에서 정렬 특징을 이용하여 RSus3 서열의 공개된 부분[Huang et al. 1996(GenBank accession number : L03366)]에 비교되었다.
모든 4개의 1800 bp 클론은 삽입된(각 방향의 2개의 클론) RSus3의 전사 영역의 상류 부분을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 클론은 pSsp A2, K1, K3 및 K4로 이름지어졌다.
4개의 3000 bp 클론은 또한 삽입된(표시된 양쪽 오리엔테이션을 지니고) RSus3의 전사 영역의 상류 부분을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 클론은 pSca K3, K5, New1 및 New5로 이름지어졌다.
도 2 참고.
서열 데이터의 표시
클론 pTBR-ScaK3 (pScaK3)은 RSus3 프로모터 영역의 총 시퀀싱에 대해 선택되었다. 이 클론은 도 12에 나타낸 서열화 계획 후 양쪽 스트랜드에서 서열화되었다.
상기 기술된 다른 양성 RSus3 클론은 부분적으로 서열화되었다. RSus3 클론의 서열화는 2700 bp 상류 ATG 코돈을 결정하였다(서열번호 1 참고).
DNA 서열 분석
RSus3 프로모터 영역에 대한 서열은 유전자 발현 조절에 포함된 추정 시스-요소의 존재하에서 분석되었다. 번역 시작 코돈의 상류 영역은 보존된 TATA와 CAAT 컨센서스 서열에 대해 검사되었으며, 영역은 추정 배유 또는 종자 특정 요소존재하에서 분석되었다.
부가적으로 TATA 박스와 번역 시작 코돈 사이의 영역이 인트론 도너와 억셉터 스플라이스 사이트 존재하에서 분석되었다.
번역 시작 코돈은 RSus3 프로모터에서 베이스를 배당하기 위한 베이시스로 선택되었으며, 예를 들어 ATG에서 A는 +1로 번호 되어졌다(CAATGG 주변의 베이스-페어는 -2, -1, +1, +2, +3과 +4로 번호됨).
RSus1(GenBank accession number : X59046)과 RSus2(GenBank accession number : X64770)로부터의 프로모터 영역을 지닌 RSus3 프로모터 영역의 정렬은 명백한 동일성을 주지 않았다.
DNA 서열 분석의 결과는 표 1에 요약되었다.
GCN4 박스와 3개의 배유 박스는 배유 특이성에 포함된 시스-요소이며 레구민 박스는 종자 특이성에 포함된 시스-요소이다. 부가적으로 -1072 bp 배유 박스와 GCN4 모티프는 또한 배유 특이성에 포함된 추정 프롤라민 요소로 구성되며, RSus3에서 배유 박스와 GCN4 모티프 사이의 거리는 이(34 bp)보다 크지만, 서열은 컨센서스 서열에 높은 동일성을 보인다.
GCN4 박스, 2개의 배유 박스와 다수의 레구민 박스는 -1023 bp에서 -1707 bp까지 걸려있는 700 bp 내에 위치한다. 이 700 bp 서열은 TATA 박스 상류에 위치한다.
RSus3 프로모터 영역의 제한 맵은 도 3으로 여기에 나타내어진다.
RSus3/GUS/NOSt 구조물의 표시
이 연구에서, 다양한 RSus3 프로모터 서열은 RSus3/GUS 발현 카세트 시리즈의 발생에 대한 uidA 유전자와 융합되었다. RSus3 프로모터의 특정 삭제부분은 조직-특이성에 포함된 프로모터의 그러한 부분을 확인하기 위해 만들어졌다. 탠덤-리피트 프로모터 시리즈는 프로모터 활성도를 증가시키기 위해 만들어졌으며, 인트론 1은 구아 배유에서 발현에 필요한지를 정하기 위해 프로모터 영역으로부터 제거되었다.
구조물은 PCR에 의한 특정 단편의 증폭 또는 서브클로닝으로 발생되었다. 결과 구조물의 확인을 위해서, 전형적으로 HindIII, Nhel과 Ncol로 대조군 제한 소화가 수행되었다. 부가적으로, 대조군 PCR 또는 서열화 반응이 어떤 경우에 수행되었다.
RSus3 프로모터의 모든 변이에서 공통적인 특징은 uidA 유전자로의 번역 융합, TATA 박스의 존재 및 이것의 하류 영역의 보존이다(인트론이 제거된 싱글 구조물의 예외를 지닌). RSus3 프로모터 구조물 시리즈는 TATA 박스 말단의 상류 700 bp 영역 주위의 중심에 있다. 상기 기술된 대로, 이 서열은 특이성에 포함된 추정 시스-요소 다수를 포함한다.
다양한 RSus3 프로모터 구조물은 도 13에 요약되었다.
p2700 구조물(플라스미드 크기 7938 bp)
2700 bp의 RSus3 프로모터는 초기에 만들어졌다. 이 구조물은 전체-길이 RSus3 프로모터로 구성되며, pGUSNOSt에서 2700 bp Xhol/Ncol 단편을 pTBR-ScaK3로부터 Sall/Ncol로 증폭함으로써 제조되었다. 양성 클론은 Ncol/HindIII 소화로 확인되었으며, 결과로 pGUSNOSt 부분으로부터 5230 bp Ncol/HindIII 단편에 더하여 1160 bp와 1540 bp의 2개의 특정 단편이 생겼다.
p1730 구조물(플라스미드 크기 6963 bp)
RSus3의 5' 절단은 -1160 bp에서 -1730 bp까지 걸려있는 571 bpNhel/HindIII 단편의 발생으로 만들어졌다. p2700에서 상류 HindIII 사이트의 Nhel 사이트로의 변화 후, 발생된 Nhel/HindIII 단편은 이 p2700(upNhel)으로 서브클론되었다. 양성 클론은 Nhel/HindIII 대조군 소화로 확인되었으며, 결과로 서브클론된 단편과 동일한 크기의 특정 단편이 생겼다.
p1670 구조물(플라스미드 크기 6907 bp)
5' 절단은 571 bp Nhel/HindIII 단편 대신 515 bp를 포함하는 p1730과 유사하며, 양성 클론은 동일한 방법으로 확인되었다.
p1560 구조물(플라스미드 크기 6791 bp)
5' 절단은 571 bp Nhel/HindIII 단편 대신 400 bp를 포함하는 p1730과 유사하며, 양성 클론은 동일한 방법으로 확인되었다.
p1450 구조물(플라스미드 크기 6704 bp)
이 구조물은 pScaK3로부터 동일하게 증폭된 대신 pSspK3 주형으로부터 증폭된 1450 bp Xhol/Ncol 단편의 결찰을 지닌 p2700과 유사하다. Ncol/HindIII 소화는 5230 bp pGUSNOSt 단편에 비해서 1160 bp와 290 bp의 2개 특정 밴드를 나타냈다.
p1160 구조물(플라스미드 크기 6390 bp)
이 절단된 프로모터는 내부 HindIII 사이트 1540 bp 상류의 제거로 구성되고, HindIII로 p2700을 자르고 재결찰하여 발생되었다. 양성 클론은 HindIII 대조군 소화로 확인되었으며, 양성 클론에서 싱글 단편이 생겼다.
p2700-프롤라민 구조물(플라스미드 크기 7777 bp)
161 bp의 내부 절단은 ATG 코돈으로 TATA 박스를 포함하는 1020 bp 단편의 증폭으로 생산되었다. 이 단편은 HindIII/Ncol 단편으로써 p2700(upNhel)에서 클론되었다. 양성 클론은 HindIII/Ncol 소화로 확인되었으며, 결과로 1000 bp의 특정 단편과 6770 bp의 단편이 생겼다.
p1450-인트론(플라스미드 크기 5837 bp)
이 구조물에서, 인트론 1은 추정 인트론 1 억셉터와 도너 스플라이스 사이트의 정확한 스플라이싱으로 제거되었다. 인트론 1의 내부 삭제는 인트론 1이 부족한 RSus3에 대응하는 p1450 영역의 증폭으로 발생되었다. pCR2.1-TOPO에서 클로닝 후, 이를 포함하는 Xhol/Ncol 단편은 pGUSNOSt에서 서브클론되었다. 양성 클론은 HindIII/Ncol 제한 소화로 확인되었으며, 3' 프로모터 말단은 서열화로 확인되었다.
pTandem 레구민(플라스미드 크기 7536 bp)
탠덤 리피트 프로모터는 PCR에 의한 -1160 bp에서 -1730 bp까지 걸려있는 570 bp Nhel 단편의 발생으로 만들어졌다. 이 단편은 p1730에서 Nhel 사이트에서 서브클론되었다. 양성 클론은 대조군 소화로 확인되었으며, Nhedel1/Dellow1으로 대조군 PCR 반응은 오리엔테이션을 확인하였다. 정방향은 650 bp와 1300 bp 2개의 밴드를 나타냈으나, 역방향은 단지 650 bp 생성물을 만들었다.
pTandem leg/pro(플라스미드 크기 7704 bp)
탠덤-리피트 프로모터는 -990 bp에서 -1730 bp까지 걸려있는 740 bp Nhel 단편의 PCR 증폭에 의해 만들어졌다. 이 단편은 p1730에서 Nhel 사이트에서 서브클론되었다. 양성 클론은 Nhel 소화로 처음 확인되었으며, 적당한 방향의 그것은 HindIII 소화로 결정되었다. 이는 프로모터에서 내부 HindIII 사이트에 기인하여 가능하며, 구조물에서 복제되었다. 정방향은 740 bp HindIII 단편을 만들었으나, 역방향은 1140 bp HindIII 단편을 만들었다.
pTandem 프롤라민(플라스미드 크기 7135 bp)
탠덤-리피트 프로모터는 PCR에 의한 -990 bp에서 -1160 bp까지 걸려있는 170 bp HindIII 단편의 발생에 의해 만들어졌으며, p1730에서 HindIII 사이트에서 서브클론되었다. 양성 클론은 대조군 소화로 확인되었으며, 정방향은 대조군 PCR로 결정되었다. 프라이머 페어 Nhedel1/HindGCN4로 증폭은 정방향을 지닌 클론에 대해 600 bp와 750 bp 2개의 밴드를 나타냈으며, 역방향의 클론에 대해 300 bp와 750 bp 밴드를 나타냈다.
도 15 참고.
일시적 발현 실험
상기 기술된 RSus3 발현 카세트는 입자 충격 기술을 이용한 구아 조직의 일시적 변형을 시키는 데 사용되었다.
이러한 실험은 여러 목적을 제공한다. 첫 번째로, 일시적 변형된 구아 조직의 발생에 대한 방법의 유용성 테스트. 두 번째로, 대니스코 바이오테크놀로지, 홀비에서 파티클 인플로우 건(PIG)을 셋업하고 최적화하는 것. 마지막으로,주요 목적은 구아 조직에서 RSus3와 같은 프로모터의 강도와 특이성을 평가하는 것이다.
대조군
대조군 실험을 통해, ENOS 프로모터에 융합된 uidA 유전자를 포함하는 대조군 플라스미드가 만들어졌다. ENOS 프로모터는 배유와 잎 조직 양쪽에서 높은 레벨의 발현을 지니는 것으로 알려졌다.
구아 조직에서 RSus3/GUS/NOSt의 일시적 발현
총 11세트의 입자 충격 실험이 RSus3 프로모터 영역의 프로모터 강도와 특이성을 테스트하기 위해 수행되었다. 상기 기술된 RSus3/GUS/NOSt 구조가 이 시기에 시험되었다. 충격, 구아 조직의 제조 그리고 금 입자의 코팅에 대한 절차는 상기에 기술된다.
첫 번째 접근은 RSus3 프로모터가 구아 배유에서 활성인지 아닌지를 테스트하는 것이다. p2700과 p1450은 구아 배유로 충격을 받게 되며, 결과는 ENOS 대조군보다 발현이 더 낮지만 양쪽 구조물에 대해 배유에서 GUS의 중요한 발현을 나타냈다. 이러한 결과는 매우 유망하여 그 후의 작업은 이 프로모터 주변에 집중되었다.
두 번째 접근은 RSus3이 배유에 대해 특정한지 또는 식물의 다른 부분에서 발현을 지니는 지 테스트하는 것이다. 인 비트로 성장한 묘목으로부터의 자엽에서 수행된 초기 실험은 p2700과 p1450 사이에서 발현에 차이를 보였다. p2700은 자엽에서 GUS의 발현이 거의 없었으며, p1450으로 변형된 어떤 자엽은 매우 높은 발현을 나타냈다.
p2700과 p1450에 대한 이 발현 패턴이 잎에서 동일한 지 테스트하기 위해, 이러한 구조물들은 또한 성숙한 식물로부터의 어린 잎의 일시적 변형을 수행하는 데 사용되었다. 이 변형은 헬륨 폭발에 의한 잎 조직의 심각한 손상에 기인하여 어려운 것으로 판명되었다. 잎의 혈관 조직에 집중된 RSus3의 발현뿐 아니라 ENOS 대조군도 잎에 대한 절차의 최적화가 필요함을 가리키는 동일한 발현 패턴을 나타냈다. 그러나, 시간 제한 때문에 이러한 최적화 실험은 후에 폐지되었으며, 대신 묘목과 종자로부터의 자엽에 충격을 가하기 위해 선택되었다.
2개의 RSus3 프로모터 구조물, p2700과 p1450으로 지시되는 일시적 GUS 발현은 프로모터 강도와 조직 특이성의 분석을 더욱 정당화하였다. 상기 기술된 대로 RSus3 프로모터 삭제 시리즈는 만들어져서 구아 배유, 구아 엠브리오 자엽과 12와 20일된 묘목의 자엽에서 테스트되었다. 부가적으로, 프로모터 활성도를 증가시키기 위해, 3개의 탠덤 프로모터가 만들어져서 결과 구조물이 또한 프로모터 강도와 특이성의 평가를 위해 동일한 조직에서 테스트되었다.
도 16은 대조군 ENOS 프로모터, RSus3 프로모터 구조물 p1730 및 RSus3 프로모터 구조물 pTandem leg/pro(탠덤 리피트)로부터의 일시적 GUS 발현 데이터를 나타낸다. 다른 RSus3 프로모터 구조물에 대한 발견에 따른 결과는 상기 토론되었다. 이런 결과는 NOI의 선택적 배유 발현을 나타낸다.
RSus3 구조물로 충격 후, 구아 배유에서 일시적 GUS 발현의 결과는 도 17에 요약되었다.
데이터는 본 발명의 프로모터가 배유에서 NOI의 선택적 발현을 일으킴을 보여준다. 게다가, 본 발명의 프로모터의 탠덤 반복은 발현 레벨의 증가를 일으킨다.
도 17에서 볼 수 있듯이 구아 배유에서 발현은 2700 bp와 1160 bp 사이의 서열의 삭제부분에 의해 조금 영향을 받는다. 1160 bp는 구아 배유에서 발현의 중요한 부분을 일으키는 시스-요소가 1160 bp와 TATA 박스(989 bp) 사이에 존재함을 가리키는 여전히 중요한 발현을 지닌다. 이 부분은 p2700 프롤라민 구조물에서 제거되었으며, 이는 p2700에 비교하여 프로모터 활성도의 25% 감소를 나타낸다.
pTandem leg/pro는 배유에서 2700 구조물보다 3배 더 높은 가장 높은 발현을 나타내며 발현 레벨은 배유에서 NOS 발현에 비슷하다.
구아 조직이 DNA 없이 동일한 방법으로 처리된 미세-발사체로 충격을 받고 PIG가 미세-발사체 없이 방전되면 푸른 점이 발견되지 않았다. 프로모터 없는 GUS 구조물(pGUSNOSt)로 충격은 아마 프로모터에 인접한 염색체로의 적당하지 않은 재조합에 의해 일어나는 약간의 푸른 점만을 나타냈다.
자엽에 대한 배유에서 발현의 비교 분석을 위해, 충격 받은 조직의 면적에 상대적인 값이 계산되었다. 평균 4주된 배유는 0.2 ㎠의 면적을 포함하며, 프리-이머지드 자엽도 동일하다. 평균 12일된 자엽은 1.5 ㎠의 면적을 덮으며, 평균 20일된 자엽은 2.8 ㎠의 면적을 덮는다. 따라서 12일 또는 20일 자엽 당 푸른 점의 수는 0.2 ㎠ 당 푸른 점의 수에 정정되었다.
도 18은 프로모터 강도에서 고도로 중요한 변화만이 탠덤 leg/pro 변이에 의해 디스플레이 되었음을 나타낸다. 이 구조물은 모체 구조물 p2700의 그것보다 3배 더 큰 GUS 발현을 가리키지만, 배유에 대한 특이성을 보유한다. 자엽에서 발현 레벨은 p2700과 같이 탠덤 leg/pro 변이와 동일하게 낮았다.
동시-형질전환(Co-transformation)
탄도 변형에 따르는 일시적 유전자 발현의 측정으로 얻어진 데이터에서 변이의 가장 큰 성분은 DNA의 타겟으로의 전달 효율에서 차이가 있다. 다른 리포터 유전자를 포함하는 대조군 발현 벡터로 동시-형질전환함으로써 이 문제를 보충할 수 있고, 일시적 유전자 발현의 더욱 정확한 평가를 얻을 수 있는 것으로 나타났다(Godon, C., Caboche, M, Daniel-Vedele, F. (1993) Biochimie 75 : 591-595). 대조군의 그것에 대한 테스트 활성도의 비로써 리포터 활성도와 발현 결과를 측정함으로써, 타겟을 때리는 DNA 양에서 차이로부터의 결과인 변동이 설명된다.
RSus3 프로모터 변이 또한 이 방법에서 테스트되었다. 개똥벌레(firefly) 루시퍼라제 유전자(luc)는 리포터로써 그들 각각에 융합되었으며, 탄도 변형은 이전에 기술된 대로 반복되었으나 2개의 대조군 플라스미드는 테스트 플라스미드에 동일한 몰 양으로 포함되었다. 다른 프로모터 구조물의 강도와 조직-특이성은 동일한 구아 종자로부터의 탄도 변형된 배유와 프리-이머지드 자엽의 수정된 일시적 발현 연구에서 테스트되었다. 각 실험은 3개의 분리된 플라스미드로 동시 변형을 포함하였다. 이들 중, 하나는 테스트 플라스미드였으며(p2700 + 인트론/luc+, p2700 - 인트론/luc+, pTandem leg/pro + 인트론/luc+, 또는 pTandem leg/pro - 인트론/luc+ 또는 pDB16/luc+), 프로모터는 개똥벌레 루시퍼라제 유전자(luc+)로 융합되었다(도 19, 20, 21, 22 및 23). 남은 2개는 대조군 플라스미드였으며, uidA(GUS) 유전자 또는 레닐라(renilla) 루시퍼라제 유전자(pDB16/Rluc)가 NOS 프로모터의 조절 하에 있었다(도 24 및 25). 2 ㎍의 테스트 플라스미드는 2 ㎍의 각 대조군 플라스미드에 혼합되었으며, 이 DNA로 입자 코팅, 제조, 충격 및 조직의 배양이 상기 기술된 대로 모두 수행되었다.
충격 받은 조직의 효소 추출물은 액체 질소에서 이를 갈아서 만들어졌다, 대략 400mg의 각 조직은 800㎕의 추출 완충액(50mM NaH2PO3, 50mM H2BO3, 1mM 디티오트레이톨, 1mM EDTA 디소디움 솔트, 10mg/ml 보바인 세럼 알부민, pH는 수산화나트륨 첨가로 7.0으로 조정됨)로 추출되었다. 표본은 4℃에서 2분 동안 12,000 g에서 원심분리 되었으며, 결과 상청액이 분석을 위해 사용되었다.
3개의 리포터 유전자의 활성도는 Turner TD-20/20 루미노미터(Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 광학적으로 측정되었다. 2개의 루시퍼라제 활성도는 Promega Technical Manual No. 40(Promega Corporation, Madison, WI, USA)에 기술된 'Dual-Luciferase' 방법 후 동일한 반응 혼합물에서 측정되었다. 20 ㎕의 구아 조직은 기구에서 100 ㎕의 LARⅡ 시약과 빠르게 혼합되었으며, 2초 후 측정되고 10초에 걸쳐 방출된 빛을 통합하였다. 이후에 즉시, 100 ㎕의 'Stop and Glo' 시약이 반응 혼합물에 첨가되었고 레닐라 루시퍼라제 발광이 동일한 방법으로 측정되었다.
GUS 활성도는 GUS-LightTM시스템 지도 매뉴얼(TROPIX Inc., Bedford, MA, USA)에 따라 측정되었다. 20 ㎕의 구아 조직 추출물은 180 ㎕의 GUS 반응 완충액에 첨가되었으며, 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 튜브는 루미노미터에 위치되고, 300 ㎕의 '빛 방출 가속제'가 첨가되고, 2초 후 10초 동안 방출된 빛이 측정되고 통합되었다.
얻어진 값은 하기 표에 요약되었다.
상대적 통합된 빛 신호
Rsus3/루시퍼라제실험 듀얼 루시퍼라제 리포터 분석시스템(Promega) GUS-LightTM(Tropix)
배유 자엽 배유 자엽
luc+ Rluc luc+ Rluc GUS GUS
p2700+인트론/luc+(pDB16/Rluc andpDB16/GUS) 7.7 352.0 1.2 248.7 194.5 208.2
7.6 350.4 0.8 236.4 165.3 192.4
7.6 353.2 0.8 256.7 189.8 206.7
p2700-인트론/luc+(pDB16/Rluc andpDB16/GUS) 20.9 574.0 0.6 185.2 269.7 215.0
20.9 585.1 0.5 179.3 252.1 151.3
21.2 596.7 0.5 195.1 228.0
PTandem(leg/pro)+인트론/luc+(pDB16/Rluc andpDB16/GUS) 13.9 249.5 1.1 209.2 93.4 166.4
13.3 248.8 0.9 202.3 99.6 142.0
13.3 247.5 0.8 206.6 104.9 182.7
pTandem(leg/pro)-인트론/luc+(pDB16/Rluc andpDB16/GUS) 42.8 570.1 1.7 205.1 249.2 172.3
43.2 591.8 1.5 202.6 225.2 156.3
44.7 604.3 1.5 213.9 167.2
pDB16/luc+(pDB16/Rluc andpDB16/GUS) 45.3 565.5 22.3 155.5 289.8 206.6
43.4 582.0 21.4 176.2 205.8 191.8
45.1 623.4 19.9 172.4 333.2 206.4
동일한 결과를 '프로모터의 상대적 강도'로 도 26에 나타냈으며, 그 값은 테스트 비율과 대조군 비율의 두가지 비율로 나누어 계산된다. 테스트 비율은 NOS 프로모터 조절하에서 대조군 리포터 유전자(uidA 또는 Rluc)로부터 얻어진 값으로 테스트 프로모터 컨스트럭트 조절하에서 개똥벌레 루시퍼라제에 의해 발생한 발광을 나누어 계산되었다. 대조군 비율은 양쪽 유전자가 NOS 프로모터 조절하에 있을 때 대조군 리포터 유전자(uidA 또는 Rluc)로부터 얻어진 값으로 개똥벌레 루시퍼라제로부터의 발광을 나누어 계산되었다. '프로모터의 상대적 강도'는 대조군비율로 테스트 비율을 나누고 얻어진 값에 백을 곱하여 계산되었다.
도 26의 결과는 Tandem leg/pro 배열로서 도 17에 나타난 거울이 조직 특이성을 유지하는 동안 프로모터의 활성도를 증가시키는 패턴을 보여준다. Tandem leg/pro 프로모터 구조물이 배유 조직에서 NOS 프로모터 강도보다 2배 강하지만, 도 26의 결과는 이러한 2개의 프로모터가 사실 이 조직에서 동일한 강도를 나타냄을 보인다. 이러한 결과는 또한 구조물로부터 인트론의 제거는 구아 조직에서 프로모터 강도를 증가시키는 것으로 보인다. 이는 본 발명의 실시태양의 바람직한 면이다. 따라서, 바람직하게는 NOI는 인트론을 포함하지 않는다.
요약
요약하면, 본 발명은 프로모터에 관한 것이며, 또한 프로모터를 포함하는 구조물에 관한 것이다. 특별히 본 발명은 생물에서 NOI의 발현에 대한 프로모터의 사용에 관한 것이다.
상기 명세서 내에 언급된 모든 간행물들은 참고문헌에 의해 여기에 포함된다. 본 발명의 기술된 방법과 시스템의 다양한 변경과 변형은 발명의 범위와 정신으로부터 벗어남이 없이 이 분야의 당업자에게는 명확할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 실시태양에 관련하여 기술되었을 지라도, 청구된 발명은 그러한 특정실시태양을 부당하게 한정하는 것은 아니다. 실제로, 생화학과 바이오테크놀로지 또는 관련된 분야의 당업자가 명백하게 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 다음의 청구항 범위 내에 있을 것이다.
참고문헌
표 1에 대한 참고문헌

Claims (26)

  1. 서열번호 1에 나타난 것에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체로 구성된 프로모터
  2. 서열번호 1에 나타난 것에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체를 지닌 프로모터
  3. 서열번호 1에 나타난 것에 상응하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 프로모터
  4. 서열번호 1에 나타난 것에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 프로모터
  5. 제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 벼속의 식물로부터 수득가능함을 특징으로 하는 프로모터
  6. 벼속 식물로부터 수득가능한, 배유 특이적 발현을 유발하는 것이 가능한 프로모터
  7. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 NOI에 실시가능하게 연결됨을 특징으로 하는 프로모터
  8. 상기한 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 2에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 연결됨을 특징으로 하는 프로모터
  9. 제 8항에 있어서, NOI가 프로모터에 실시가능하게 연결된 경우 서열번호 2에 나타난 상기 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편이 본 발명의 프로모터와 NOI의 중간에 위치함을 특징으로 하는 프로모터
  10. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 표 1에 나타난 하나 이상의 증명된 서열 또는 그의 변이체, 상동체 또는 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 프로모터
  11. 제 10항에 있어서, 상기 프로모터는 표 1에 나타난 하나 이상의 증명된 서열로 구성됨을 특징으로 하는 프로모터
  12. 제 11항에 있어서, 상기 프로모터는 표 1에 나타난 증명된 모든 것으로 구성됨을 특징으로 하는 프로모터
  13. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 5에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 연결됨을 특징으로 하는 프로모터
  14. 제 13항에 있어서, NOI가 프로모터에 실시가능하게 연결된 경우 서열번호 5에 나타난 상기 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편이 본 발명의 프로모터와 NOI의 중간에 위치함을 특징으로 하는 프로모터
  15. 제 1항 내지 제 14항의 어느 한 항에 따른 프로모터로 구성되나 상기 프로모터는 NOI에 실시가능하게 연결된 구조물
  16. 제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항에 따른 본 발명으로 구성된 발현 벡터
  17. 제 1항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 본 발명으로 구성된 형질전환 벡터
  18. 제 1항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 본 발명으로 구성된 형질전환된 숙주 또는 숙주 세포
  19. 제 18항에 있어서, 상기 숙주 또는 숙주 세포는 식물 또는 식물 세포임을 특징으로 하는 형질전환된 숙주 또는 숙주 세포
  20. 프로모터에 실시가능하게 연결되고 POI의 적어도 일부분을 인코드하는 NOI를발현하고, 선택적으로 NOI의 발현 생성물을 분리하고, NOI의 발현 생성물이 POI의 전부가 아닌 경우 POI를 형성하고, 선택적으로 POI를 분리하는 것으로 구성된; 상기 프로모터는 제 1항 내지 제 19항의 어느 한 항에 따른 프로모터임을 특징으로 하는 POI를 준비하는 방법
  21. 제 20항에 있어서, 상기 NOI는 POI의 모든 것을 암호화함을 특징으로 하는 방법
  22. NOI가 제 1항 내지 제 20항의 어느 한 항에 따른 프로모터에 실시가능하게 연결된 경우 NOI를 발현하는 것으로 구성된 배유 내에서 NOI를 발현하기 위한 방법
  23. 기탁번호 NCIMB 41011로부터 수득가능한 어떤 하나의 프로모터 서열
  24. 여기 제공된 실험 섹션 내에 나타난 어떤 하나의 플라스미드
  25. NOI의 발현 수준을 증가시키기 위한 서열번호 2에 나타난 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편의 이용
  26. 여기에 실질적으로 기술되 바와 같고, 상기한 청구항의 어느 한 항에 의해 참조된 프로모터
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