JP3305281B2 - α−アミラーゼ遺伝子中の糖応答性エンハンサー - Google Patents
α−アミラーゼ遺伝子中の糖応答性エンハンサーInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は植物遺伝子の転写調
節に関する。
節に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物細胞培養発現系は細菌、酵母又はバ
キュロウイルス発現系に比べて幾つかの利点を有してい
る。細菌は発現する組換え真核生物タンパク質の転写後
修飾を行わず、そして酵母はこれを限られた範囲でしか
行わない。タンパク質の適切な機能にはこのような修飾
がしばしば必要である。バキュロウイルスは高等真核生
物用の有力な形質転換媒体であり、そして一般に、バキ
ュロウイルス発現系で発現されたタンパク質は適切に修
飾される。しかしながら、バキュロウイルスを培養する
費用は高い。加えて、宿主細胞は最終的にバキュロウイ
ルスによって溶解され、発現された組換えタンパク質は
培養培地中に放出される多数の宿主タンパク質で汚染さ
れる。従って、発現された組換えタンパク質の精製が困
難となる可能性がある。
キュロウイルス発現系に比べて幾つかの利点を有してい
る。細菌は発現する組換え真核生物タンパク質の転写後
修飾を行わず、そして酵母はこれを限られた範囲でしか
行わない。タンパク質の適切な機能にはこのような修飾
がしばしば必要である。バキュロウイルスは高等真核生
物用の有力な形質転換媒体であり、そして一般に、バキ
ュロウイルス発現系で発現されたタンパク質は適切に修
飾される。しかしながら、バキュロウイルスを培養する
費用は高い。加えて、宿主細胞は最終的にバキュロウイ
ルスによって溶解され、発現された組換えタンパク質は
培養培地中に放出される多数の宿主タンパク質で汚染さ
れる。従って、発現された組換えタンパク質の精製が困
難となる可能性がある。
【０００３】他方、植物細胞は高等真核細胞であるの
で、発現された真核生物タンパク質の精巧な翻訳後タン
パク質修飾を行うことができる。植物細胞は発現タンパ
ク質を培養培地中に分泌することもできるので、タンパ
ク質の精製がより容易になる。植物細胞培養用の培地
は、主として塩類やビタミン類を含有しており、血清を
補充する必要がない。従って、培地の費用はバキュロウ
イルスのトランスフェクションに使用される昆虫細胞を
培養するために使用される培地費用よりはるかに安い。
で、発現された真核生物タンパク質の精巧な翻訳後タン
パク質修飾を行うことができる。植物細胞は発現タンパ
ク質を培養培地中に分泌することもできるので、タンパ
ク質の精製がより容易になる。植物細胞培養用の培地
は、主として塩類やビタミン類を含有しており、血清を
補充する必要がない。従って、培地の費用はバキュロウ
イルスのトランスフェクションに使用される昆虫細胞を
培養するために使用される培地費用よりはるかに安い。
【０００４】植物細胞培養物は医薬品、染料、酵素、賦
香剤及び香油の潜在的な商業的供給源である。このよう
な成分の植物細胞培養による製造は次のようなときに需
要がある: （１）上記成分が植物によって少量で、又は
植物の生活環の発育段階の短い間若しくは採集不可能な
発育段階で天然に産生されるとき；（２）上記成分が、
農業になじみ難いか又は消失過程の環境若しくは利用し
難い環境の原産の植物によって産生されるとき; 及び
（３）上記成分がインビトロでは満足できるほど合成さ
れ得ないとき。
香剤及び香油の潜在的な商業的供給源である。このよう
な成分の植物細胞培養による製造は次のようなときに需
要がある: （１）上記成分が植物によって少量で、又は
植物の生活環の発育段階の短い間若しくは採集不可能な
発育段階で天然に産生されるとき；（２）上記成分が、
農業になじみ難いか又は消失過程の環境若しくは利用し
難い環境の原産の植物によって産生されるとき; 及び
（３）上記成分がインビトロでは満足できるほど合成さ
れ得ないとき。
【０００５】しかしながら、植物細胞培養によって産生
物を製造する試みは、所望の産生物の産生又は分泌が不
十分であること、細胞の増殖が乏しいこと、及び培養中
に適当な細胞タイプを維持することが困難であることと
いった要因のために商業的には殆ど成功していない。
物を製造する試みは、所望の産生物の産生又は分泌が不
十分であること、細胞の増殖が乏しいこと、及び培養中
に適当な細胞タイプを維持することが困難であることと
いった要因のために商業的には殆ど成功していない。
【０００６】コメのカルスのα-アミラーゼ発現系が有
する特徴によって、この発現系は植物細胞発酵工学にお
いて使用できるようになる。これらの特徴には、発現レ
ベルが高く且つ持続的であること、組織起源の細胞培養
物であるのかそれとも組織が培養物中に形成されるのか
に関係なく発現されること、及び組換えタンパク質産生
物を分泌できることが含まれる。
する特徴によって、この発現系は植物細胞発酵工学にお
いて使用できるようになる。これらの特徴には、発現レ
ベルが高く且つ持続的であること、組織起源の細胞培養
物であるのかそれとも組織が培養物中に形成されるのか
に関係なく発現されること、及び組換えタンパク質産生
物を分泌できることが含まれる。
【０００７】α-アミラーゼは、穀粒の発芽中に胚乳に
貯蔵されている澱粉を加水分解するための主要なデンプ
ン分解酵素である。これらの酵素はα-１,４結合グルコ
ースポリマーの加水分解を触媒する。初期発芽期間中
に、種子の糊粉層内の細胞はα-アミラーゼを合成す
る。α-アミラーゼはα-グルコシダーゼやデキストリナ
ーゼ制限酵素と一緒に胚乳内に分泌され、そして澱粉を
加水分解してグルコースとマルトースを形成し、胚芽の
成長に必要な栄養素を提供する（Rogers等、J. Biol. C
hem.、259:12234〜12240、1984年; Rogers、J. Biol. C
hem.、260:3731〜3738、1985年）。
貯蔵されている澱粉を加水分解するための主要なデンプ
ン分解酵素である。これらの酵素はα-１,４結合グルコ
ースポリマーの加水分解を触媒する。初期発芽期間中
に、種子の糊粉層内の細胞はα-アミラーゼを合成す
る。α-アミラーゼはα-グルコシダーゼやデキストリナ
ーゼ制限酵素と一緒に胚乳内に分泌され、そして澱粉を
加水分解してグルコースとマルトースを形成し、胚芽の
成長に必要な栄養素を提供する（Rogers等、J. Biol. C
hem.、259:12234〜12240、1984年; Rogers、J. Biol. C
hem.、260:3731〜3738、1985年）。
【０００８】現在、７個のα-アミラーゼｃＤＮＡと９
個のα-アミラーゼゲノムＤＮＡ群がオオムギでクロー
ン化されている（Chandler等、 Plant. Mol. Biol.、3:
401〜418、1984年; Deikman等、Plant Physiol.、78:19
2〜198、1985年; Krushseed等、J. Biol. Chem.、263:1
8953〜18960、1988年; Knox等、Plant Molecular Biolo
gy、9:3〜17、1987年）。コムギのα-アミラーゼ遺伝子
はα-Ａmy1、α-Ａmy2及びα-Ａmy3に分類される。α-
Ａmy1とα-Ａmy2でコードされるタンパク質はそれぞれ
高い等電点と低い等電点を有しており、これら２つの遺
伝子群は各々、発芽中の種子で発現される10個より多い
遺伝子を含んでいる。α-Ａmy3遺伝子群は３〜４個の遺
伝子を含んでおり、これらの遺伝子は未成熟種子中で発
現される（Baulcombe等、Mol. Gen. Genet.、209:33〜4
0、1987年）。
個のα-アミラーゼゲノムＤＮＡ群がオオムギでクロー
ン化されている（Chandler等、 Plant. Mol. Biol.、3:
401〜418、1984年; Deikman等、Plant Physiol.、78:19
2〜198、1985年; Krushseed等、J. Biol. Chem.、263:1
8953〜18960、1988年; Knox等、Plant Molecular Biolo
gy、9:3〜17、1987年）。コムギのα-アミラーゼ遺伝子
はα-Ａmy1、α-Ａmy2及びα-Ａmy3に分類される。α-
Ａmy1とα-Ａmy2でコードされるタンパク質はそれぞれ
高い等電点と低い等電点を有しており、これら２つの遺
伝子群は各々、発芽中の種子で発現される10個より多い
遺伝子を含んでいる。α-Ａmy3遺伝子群は３〜４個の遺
伝子を含んでおり、これらの遺伝子は未成熟種子中で発
現される（Baulcombe等、Mol. Gen. Genet.、209:33〜4
0、1987年）。
【０００９】コメのα-アミラーゼアイソザイムは少な
くとも９個の遺伝子によってコードされる（Thomas等、
Plant Physiol.、106:1235〜1239、1994年）。コメのα
-アミラーゼ遺伝子の発現は種々の態様の組織特異的調
節下にあることが見い出されている: 発芽中の種子の胚
や懸濁培養細胞では、発現は糖枯渇で活性化され、そし
て糖供給で抑制される（Karrer等、Plant J.、2:517〜5
23、1992年; Yu等、J.Biol. Chem.、266:21131〜2113
7、1991年; Yu等、Gene、122:247〜253、1992年; 及びY
u等、Plant Mol. Biol.、30:1277〜1289、1996年）。発
芽中の種子の胚乳においては、発現はジベレリン酸で活
性化されそしてアブシジン酸や浸透圧で抑制される（It
oh等、Plant Physiol.、107:25〜31、1995年; 及びYu
等、PlantMol. Biol.、30:1277〜1289、1996年）。コメ
の懸濁細胞を用いた研究によってα-アミラーゼ発現、
炭水化物代謝及び維管束自食（vascular autophagy）が
培地中のスクロース値によって同等に調節されることが
示されている（Chen等、Plant J.、6:625〜636、1994
年）。細胞内におけるα-アミラーゼ遺伝子の転写速度
とｍＲＮＡの安定性は共に、培養培地中のスクロース枯
渇に応答して上昇する（Sheu等、Plant J.、5:655〜66
4、1994年）。β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を
有するトランスジェニックライスをα-アミラーゼ遺伝
子プロモーターの転写制御下で使用する研究によって、
糖によるα−アミラーゼ遺伝子発現の調節は転写制御メ
カニズムに関係していることが証明された（Chan等、Pl
ant Mol.Biol.、22:491〜506、1993年; Chan等、J. Bio
l. Chem.、269:17635〜17641、1994年; 及びHuang等、P
lant Mol. Biol.、23:737〜747、1993年）。α-アミラ
ーゼ遺伝子発現の糖依存的抑制はアスペルギルス・オリ
ザエ（Tonomura等、Agric.Biol. Chem.、25:1〜6、1961
年）及びキイロショウジョウバエ（Benkel等、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA、84:1337〜1339、1987年）でも観
察され、そしてこのメカニズムは転写制御に関係してい
ることが示された（Magoulas等、Genetics、134:507〜5
15、1993年; 及びTsuchiya等、Biosci. Biotech. Bioch
em.、56:1849〜1853、1992年）。
くとも９個の遺伝子によってコードされる（Thomas等、
Plant Physiol.、106:1235〜1239、1994年）。コメのα
-アミラーゼ遺伝子の発現は種々の態様の組織特異的調
節下にあることが見い出されている: 発芽中の種子の胚
や懸濁培養細胞では、発現は糖枯渇で活性化され、そし
て糖供給で抑制される（Karrer等、Plant J.、2:517〜5
23、1992年; Yu等、J.Biol. Chem.、266:21131〜2113
7、1991年; Yu等、Gene、122:247〜253、1992年; 及びY
u等、Plant Mol. Biol.、30:1277〜1289、1996年）。発
芽中の種子の胚乳においては、発現はジベレリン酸で活
性化されそしてアブシジン酸や浸透圧で抑制される（It
oh等、Plant Physiol.、107:25〜31、1995年; 及びYu
等、PlantMol. Biol.、30:1277〜1289、1996年）。コメ
の懸濁細胞を用いた研究によってα-アミラーゼ発現、
炭水化物代謝及び維管束自食（vascular autophagy）が
培地中のスクロース値によって同等に調節されることが
示されている（Chen等、Plant J.、6:625〜636、1994
年）。細胞内におけるα-アミラーゼ遺伝子の転写速度
とｍＲＮＡの安定性は共に、培養培地中のスクロース枯
渇に応答して上昇する（Sheu等、Plant J.、5:655〜66
4、1994年）。β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を
有するトランスジェニックライスをα-アミラーゼ遺伝
子プロモーターの転写制御下で使用する研究によって、
糖によるα−アミラーゼ遺伝子発現の調節は転写制御メ
カニズムに関係していることが証明された（Chan等、Pl
ant Mol.Biol.、22:491〜506、1993年; Chan等、J. Bio
l. Chem.、269:17635〜17641、1994年; 及びHuang等、P
lant Mol. Biol.、23:737〜747、1993年）。α-アミラ
ーゼ遺伝子発現の糖依存的抑制はアスペルギルス・オリ
ザエ（Tonomura等、Agric.Biol. Chem.、25:1〜6、1961
年）及びキイロショウジョウバエ（Benkel等、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA、84:1337〜1339、1987年）でも観
察され、そしてこのメカニズムは転写制御に関係してい
ることが示された（Magoulas等、Genetics、134:507〜5
15、1993年; 及びTsuchiya等、Biosci. Biotech. Bioch
em.、56:1849〜1853、1992年）。
【００１０】α-アミラーゼの合成及びα-アミラーゼの
ｍＲＮＡレベルはスクロース飢餓下で大いに誘導され
る。α-アミラーゼ合成の上昇は、外来性炭素供給源が
枯渇しているとき、エネルギー供給源として細胞内澱粉
の加水分解を促進するものと考えられる。糖が適切に供
給されている通常の増殖条件下では、α-アミラーゼは
代謝的抑制に供される。更に、培養されたコメ細胞によ
って合成されたα-アミラーゼは培養培地中に分泌さ
れ、そして糖枯渇期間中に培地に存在する総タンパク質
の約15〜20％を占め得ることが観察されている。
ｍＲＮＡレベルはスクロース飢餓下で大いに誘導され
る。α-アミラーゼ合成の上昇は、外来性炭素供給源が
枯渇しているとき、エネルギー供給源として細胞内澱粉
の加水分解を促進するものと考えられる。糖が適切に供
給されている通常の増殖条件下では、α-アミラーゼは
代謝的抑制に供される。更に、培養されたコメ細胞によ
って合成されたα-アミラーゼは培養培地中に分泌さ
れ、そして糖枯渇期間中に培地に存在する総タンパク質
の約15〜20％を占め得ることが観察されている。
【００１１】α-アミラーゼ遺伝子に特異的なＤＮＡフ
ラグメント及び核ランオン（run-on）転写分析を使用す
ることによって、８個のα-アミラーゼ遺伝子の転写は
スクロース飢餓に応答して上昇することが示されている
（Sheu等、J. Biol. Chem.、271:26998〜27004、1996
年）。転写速度と安定状態のｍＲＮＡ値の間の正の相互
関係は、転写調節が個々のα-アミラーゼ遺伝子の特異
的発現で重要な役割を果たしていることを示唆してい
る。
ラグメント及び核ランオン（run-on）転写分析を使用す
ることによって、８個のα-アミラーゼ遺伝子の転写は
スクロース飢餓に応答して上昇することが示されている
（Sheu等、J. Biol. Chem.、271:26998〜27004、1996
年）。転写速度と安定状態のｍＲＮＡ値の間の正の相互
関係は、転写調節が個々のα-アミラーゼ遺伝子の特異
的発現で重要な役割を果たしていることを示唆してい
る。
【００１２】米国特許第5,460,952号は、α-アミラーゼ
遺伝子プロモーター領域の転写調節特性を利用する遺伝
子発現系を開示している。この系では、α-アミラーゼ
プロモーターは形質転換した植物細胞における外来遺伝
子の発現並びにこの外来遺伝子産生物の培地中への分泌
を制御している。
遺伝子プロモーター領域の転写調節特性を利用する遺伝
子発現系を開示している。この系では、α-アミラーゼ
プロモーターは形質転換した植物細胞における外来遺伝
子の発現並びにこの外来遺伝子産生物の培地中への分泌
を制御している。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、穀類
α-アミラーゼ遺伝子から誘導される糖応答性エンハン
サーを提供することにある。また、本発明は、このよう
なエンハンサーを含有する発現ベクター及び他の単離Ｄ
ＮＡ、並びにこれら発現ベクターの使用をも提供するこ
とをも目的とする。
α-アミラーゼ遺伝子から誘導される糖応答性エンハン
サーを提供することにある。また、本発明は、このよう
なエンハンサーを含有する発現ベクター及び他の単離Ｄ
ＮＡ、並びにこれら発現ベクターの使用をも提供するこ
とをも目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するために、（１）ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を
含む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサー
を含んでいる単離ＤＮＡを提供する。また、本発明は、
（２） 上記穀類α-アミラーゼ遺伝子がコメαＡmy3で
ある（１）に記載のＤＮＡを提供する。また、本発明
は、（３） 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:１
に記載の塩基配列からなる（２）に記載のＤＮＡを提供
する。また、本発明は、（４） 上記糖応答性エンハン
サーが配列番号:２に記載の塩基配列からなる（２）に
記載のＤＮＡを提供する。また、本発明は、（５） 被
子植物細胞中でコード化配列の発現を指令し得るプロモ
ーター、及びＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を含む穀類
α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサー、を含ん
でいる発現ベクターであって、上記糖応答性エンハンサ
ーが糖の非存在下でプロモーターの転写活性を高めるよ
うに上記プロモーターと機能的に結合している発現ベク
ターを提供する。また、本発明は、（６） 上記穀類α
-アミラーゼ遺伝子がコメαＡmy3である（５）に記載の
発現ベクターを提供する。また、本発明は、（７） 上
記糖応答性エンハンサーが配列番号:１に記載の塩基配
列からなる（６）に記載の発現ベクターを提供する。ま
た、本発明は、（８） 上記糖応答性エンハンサーが配
列番号:２に記載の塩基配列からなる（６）に記載の発
現ベクターを提供する。また、本発明は、（９） シグ
ナルペプチドをコードするシグナル配列を更に含んでい
る（５）に記載の発現ベクターであって、上記シグナル
配列が上記プロモーターの下流に位置している発現ベク
ターを提供する。また、本発明は、（１０） 被子植物
細胞中でポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）
上記ポリペプチドのコード化配列、（ii）被子植物細胞
中で上記コード化配列の転写を指令し得るプロモータ
ー、及び（iii）ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣ Ａ配列を含む
穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーを含
有し、該糖応答性エンハンサーが糖の非存在下で上記プ
ロモーターの転写活性を高めるように該プロモーターと
機能的に結合している発現構築物を提供すること、被子
植物宿主細胞を上記発現構築物で形質転換すること、お
よび上記形質転換宿主細胞を無糖環境に付して上記ポリ
ペプチドの発現を促進すること、を含む方法を提供す
る。また、本発明は、（１１） 上記穀類α-アミラー
ゼ遺伝子がコメαＡmy3である（１０）に記載の方法を
提供する。また、本発明は、（１２） 上記糖応答性エ
ンハンサーが配列番号:１に記載の塩基配列からなる
（１１）に記載の方法を提供する。また、本発明は、
（１３） 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:２に
記載の塩基配列からなる（１１）に記載の方法を提供す
る。また、本発明は、（１４） 上記発現構築物がシグ
ナルペプチドをコードするシグナル配列を更に含んでお
り、該シグナル配列が上記プロモーターの下流に位置し
ている（１０）に記載の方法を提供する。また、本発明
は、（１５） 被子植物細胞中でポリペプチドを製造す
る方法であって、（ｉ）上記ポリペプチドのコード化配
列、（ii）被子植物細胞中で上記コード化配列の転写を
指令し得るプロモーター、及び（iii)ＴＡＴＣＣＡＴＡ
ＴＣＣＡ配列を含む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答
性エンハンサーを含有し、ジベレリン酸の非存在下でプ
ロモーターの転写活性を高めるように該プロモーターと
機能的に結合している発現構築物を提供すること、被子
植物宿主細胞を上記発現構築物で形質転換すること、お
よび上記形質転換宿主細胞をジベレリン酸に付して上記
ポリペプチドの発現を促進すること、を含む方法。ま
た、本発明は、（１６） 上記穀類α-アミラーゼ遺伝
子がコメαＡmy3である（１５）に記載の方法を提供す
る。また、本発明は、（１７） 上記糖応答性エンハン
サーが配列番号:１に記載の塩基配列からなる（１６）
に記載の方法を提供する。また、本発明は、（１８）
上記糖応答性エンハンサーが配列番号:２に記載の塩基
配列からなる（１６）に記載の方法を提供する。また、
本発明は、（１９） 上記発現構築物がシグナルペプチ
ドをコードするシグナル配列を更に含んでおり、該シグ
ナル配列が上記プロモーターの下流に位置している（１
５）に記載の方法を提供する。また、本発明は、（２
０） （５）に記載の発現ベクターを含有している被子
植物細胞を提供する。また、本発明は、（２１）
（６）に記載の発現ベクターを含有している被子植物細
胞を提供する。また、本発明は、（２２） （７）に記
載の発現ベクターを含有している被子植物細胞を提供す
る。
決するために、（１）ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を
含む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサー
を含んでいる単離ＤＮＡを提供する。また、本発明は、
（２） 上記穀類α-アミラーゼ遺伝子がコメαＡmy3で
ある（１）に記載のＤＮＡを提供する。また、本発明
は、（３） 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:１
に記載の塩基配列からなる（２）に記載のＤＮＡを提供
する。また、本発明は、（４） 上記糖応答性エンハン
サーが配列番号:２に記載の塩基配列からなる（２）に
記載のＤＮＡを提供する。また、本発明は、（５） 被
子植物細胞中でコード化配列の発現を指令し得るプロモ
ーター、及びＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を含む穀類
α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサー、を含ん
でいる発現ベクターであって、上記糖応答性エンハンサ
ーが糖の非存在下でプロモーターの転写活性を高めるよ
うに上記プロモーターと機能的に結合している発現ベク
ターを提供する。また、本発明は、（６） 上記穀類α
-アミラーゼ遺伝子がコメαＡmy3である（５）に記載の
発現ベクターを提供する。また、本発明は、（７） 上
記糖応答性エンハンサーが配列番号:１に記載の塩基配
列からなる（６）に記載の発現ベクターを提供する。ま
た、本発明は、（８） 上記糖応答性エンハンサーが配
列番号:２に記載の塩基配列からなる（６）に記載の発
現ベクターを提供する。また、本発明は、（９） シグ
ナルペプチドをコードするシグナル配列を更に含んでい
る（５）に記載の発現ベクターであって、上記シグナル
配列が上記プロモーターの下流に位置している発現ベク
ターを提供する。また、本発明は、（１０） 被子植物
細胞中でポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）
上記ポリペプチドのコード化配列、（ii）被子植物細胞
中で上記コード化配列の転写を指令し得るプロモータ
ー、及び（iii）ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣ Ａ配列を含む
穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーを含
有し、該糖応答性エンハンサーが糖の非存在下で上記プ
ロモーターの転写活性を高めるように該プロモーターと
機能的に結合している発現構築物を提供すること、被子
植物宿主細胞を上記発現構築物で形質転換すること、お
よび上記形質転換宿主細胞を無糖環境に付して上記ポリ
ペプチドの発現を促進すること、を含む方法を提供す
る。また、本発明は、（１１） 上記穀類α-アミラー
ゼ遺伝子がコメαＡmy3である（１０）に記載の方法を
提供する。また、本発明は、（１２） 上記糖応答性エ
ンハンサーが配列番号:１に記載の塩基配列からなる
（１１）に記載の方法を提供する。また、本発明は、
（１３） 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:２に
記載の塩基配列からなる（１１）に記載の方法を提供す
る。また、本発明は、（１４） 上記発現構築物がシグ
ナルペプチドをコードするシグナル配列を更に含んでお
り、該シグナル配列が上記プロモーターの下流に位置し
ている（１０）に記載の方法を提供する。また、本発明
は、（１５） 被子植物細胞中でポリペプチドを製造す
る方法であって、（ｉ）上記ポリペプチドのコード化配
列、（ii）被子植物細胞中で上記コード化配列の転写を
指令し得るプロモーター、及び（iii)ＴＡＴＣＣＡＴＡ
ＴＣＣＡ配列を含む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答
性エンハンサーを含有し、ジベレリン酸の非存在下でプ
ロモーターの転写活性を高めるように該プロモーターと
機能的に結合している発現構築物を提供すること、被子
植物宿主細胞を上記発現構築物で形質転換すること、お
よび上記形質転換宿主細胞をジベレリン酸に付して上記
ポリペプチドの発現を促進すること、を含む方法。ま
た、本発明は、（１６） 上記穀類α-アミラーゼ遺伝
子がコメαＡmy3である（１５）に記載の方法を提供す
る。また、本発明は、（１７） 上記糖応答性エンハン
サーが配列番号:１に記載の塩基配列からなる（１６）
に記載の方法を提供する。また、本発明は、（１８）
上記糖応答性エンハンサーが配列番号:２に記載の塩基
配列からなる（１６）に記載の方法を提供する。また、
本発明は、（１９） 上記発現構築物がシグナルペプチ
ドをコードするシグナル配列を更に含んでおり、該シグ
ナル配列が上記プロモーターの下流に位置している（１
５）に記載の方法を提供する。また、本発明は、（２
０） （５）に記載の発現ベクターを含有している被子
植物細胞を提供する。また、本発明は、（２１）
（６）に記載の発現ベクターを含有している被子植物細
胞を提供する。また、本発明は、（２２） （７）に記
載の発現ベクターを含有している被子植物細胞を提供す
る。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明はα-アミラーゼプロモー
ター内部の糖応答性エンハンサー配列の発見に基づいて
いる。これらの配列は糖誘導性の遺伝子発現を投与量依
存的態様で、例えば１倍より高める。
ター内部の糖応答性エンハンサー配列の発見に基づいて
いる。これらの配列は糖誘導性の遺伝子発現を投与量依
存的態様で、例えば１倍より高める。
【００１６】従って、本発明はコメαＡmy3のような穀
類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーのコピ
ーを２個又はそれより多く（例えば３個、４個、10個又
は任意の実現可能な数）含有する単離ＤＮＡを特徴とし
ている。このエンハンサーは穀類α-アミラーゼ遺伝子
のプロモーター領域から誘導される(即ち、単離され
る）。このエンハンサーの例には配列番号:１、２及び
３が含まれる。一定のエンハンサーの複数のコピーは互
いに関して同一方向に配置される必要はない。
類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーのコピ
ーを２個又はそれより多く（例えば３個、４個、10個又
は任意の実現可能な数）含有する単離ＤＮＡを特徴とし
ている。このエンハンサーは穀類α-アミラーゼ遺伝子
のプロモーター領域から誘導される(即ち、単離され
る）。このエンハンサーの例には配列番号:１、２及び
３が含まれる。一定のエンハンサーの複数のコピーは互
いに関して同一方向に配置される必要はない。
【００１７】α-アミラーゼ遺伝子座に存在する多形の
ために、任意の所定の穀類種では、糖応答性エンハンサ
ーのヌクレオチド配列に僅かな変化が生じている可能性
がある。本発明の目的では、糖飢餓に応答した適切な転
写増強効果が残っている限り、天然の多形の結果とし
て、又は組換え遺伝子操作の結果としてであっても、僅
かな配列変動を有しているエンハンサー配列は本発明の
範囲内である。換言すれば、本発明のエンハンサーは天
然生起の配列、即ち、天然生起のα-アミラーゼ遺伝子
中に見られる配列と同一の配列を有しているか; 又は天
然生起の配列の活性変異体である。
ために、任意の所定の穀類種では、糖応答性エンハンサ
ーのヌクレオチド配列に僅かな変化が生じている可能性
がある。本発明の目的では、糖飢餓に応答した適切な転
写増強効果が残っている限り、天然の多形の結果とし
て、又は組換え遺伝子操作の結果としてであっても、僅
かな配列変動を有しているエンハンサー配列は本発明の
範囲内である。換言すれば、本発明のエンハンサーは天
然生起の配列、即ち、天然生起のα-アミラーゼ遺伝子
中に見られる配列と同一の配列を有しているか; 又は天
然生起の配列の活性変異体である。
【００１８】単離された（例えば、精製された）ＤＮＡ
とは、これが由来する生物の天然生起のゲノム中では直
接隣接している（１つは５'末端でそして１つは３'末端
で）コード化配列の両方と直接隣接していないＤＮＡで
ある。それ故、この用語には、例えば、ベクター、自律
複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しく
は真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる組換えＤＮ
Ａか; 或いは他の配列から独立した別個の分子（例え
ば、ｃＤＮＡ又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアー
ゼ処理で産生されたゲノムＤＮＡフラグメント）として
存在している組換えＤＮＡが含まれる。この用語にはま
た、更なるポリペプチド配列をコードしているハイブリ
ッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含まれる。
とは、これが由来する生物の天然生起のゲノム中では直
接隣接している（１つは５'末端でそして１つは３'末端
で）コード化配列の両方と直接隣接していないＤＮＡで
ある。それ故、この用語には、例えば、ベクター、自律
複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しく
は真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる組換えＤＮ
Ａか; 或いは他の配列から独立した別個の分子（例え
ば、ｃＤＮＡ又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアー
ゼ処理で産生されたゲノムＤＮＡフラグメント）として
存在している組換えＤＮＡが含まれる。この用語にはま
た、更なるポリペプチド配列をコードしているハイブリ
ッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含まれる。
【００１９】本発明はまた、被子植物細胞中でコード化
配列の発現を指令し得るプロモーターを含有する発現ベ
クターや穀類α-アミラーゼ遺伝子（即ち、コメαＡmy
3）中のプロモーター領域の糖応答性エンハンサー（例
えば、配列番号:１、２又は３）も特徴としている。こ
れらのベクターでは、糖応答性エンハンサーはプロモー
ターと機能的に結合して（５'か又は３'のどちらか）糖
の非存在下でプロモーターの転写活性を高める。更に、
このベクター中の糖応答性エンハンサーは、該エンハン
サーが元々由来しているα-アミラーゼ遺伝子プロモー
ター領域と天然の（即ち、天然に生じている）配置では
もはや結合していない。換言すれば、糖応答性エンハン
サーはその同族のα-アミラーゼ遺伝子から単離されて
いる。このエンハンサーはベクター中で１個又は複数の
コピーとして存在することができ、そしてどちらの方向
でも配置されうる。被子植物細胞は穀類（例えば、コ
メ、オオムギ及びコムギ）のような単子葉植物細胞又は
双子葉植物細胞である。
配列の発現を指令し得るプロモーターを含有する発現ベ
クターや穀類α-アミラーゼ遺伝子（即ち、コメαＡmy
3）中のプロモーター領域の糖応答性エンハンサー（例
えば、配列番号:１、２又は３）も特徴としている。こ
れらのベクターでは、糖応答性エンハンサーはプロモー
ターと機能的に結合して（５'か又は３'のどちらか）糖
の非存在下でプロモーターの転写活性を高める。更に、
このベクター中の糖応答性エンハンサーは、該エンハン
サーが元々由来しているα-アミラーゼ遺伝子プロモー
ター領域と天然の（即ち、天然に生じている）配置では
もはや結合していない。換言すれば、糖応答性エンハン
サーはその同族のα-アミラーゼ遺伝子から単離されて
いる。このエンハンサーはベクター中で１個又は複数の
コピーとして存在することができ、そしてどちらの方向
でも配置されうる。被子植物細胞は穀類（例えば、コ
メ、オオムギ及びコムギ）のような単子葉植物細胞又は
双子葉植物細胞である。
【００２０】発現ベクター中のプロモーターは、アクチ
ン遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓ（「Ｃa
ＭＶ35Ｓ」）ＲＮＡ若しくはユビキチン遺伝子から誘導
されるプロモーターのような遍在的活性プロモーター、
又はα-アミラーゼ（例えば、コメαＡmy3、αＡmy6、
αＡmy7、αＡmy8又はαＡmy10遺伝子、これらも糖応答
性である; 米国特許第5,460,952号参照）、インベルタ
ーゼ、スクロースシンターゼ、パタチン、β-アミラー
ゼ、スポラミン若しくは光合成遺伝子から誘導されるよ
うな誘導可能なプロモーターでありうる。他のエンハン
サーのような更なる転写調節要素がベクター内に含まれ
うる。
ン遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓ（「Ｃa
ＭＶ35Ｓ」）ＲＮＡ若しくはユビキチン遺伝子から誘導
されるプロモーターのような遍在的活性プロモーター、
又はα-アミラーゼ（例えば、コメαＡmy3、αＡmy6、
αＡmy7、αＡmy8又はαＡmy10遺伝子、これらも糖応答
性である; 米国特許第5,460,952号参照）、インベルタ
ーゼ、スクロースシンターゼ、パタチン、β-アミラー
ゼ、スポラミン若しくは光合成遺伝子から誘導されるよ
うな誘導可能なプロモーターでありうる。他のエンハン
サーのような更なる転写調節要素がベクター内に含まれ
うる。
【００２１】コード化配列は、例えば、ポリペプチド又
は、別のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボ
ソームＲＮＡ及び核小体ＲＮＡ）の機能に干渉するアン
チセンスＲＮＡをコードしうる。
は、別のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボ
ソームＲＮＡ及び核小体ＲＮＡ）の機能に干渉するアン
チセンスＲＮＡをコードしうる。
【００２２】発現ベクターは、プロモーター下流にシグ
ナルペプチドをコードする配列（例えば、コメのα-ア
ミラーゼ遺伝子から誘導される配列）を更に含むことが
できるので、宿主細胞は発現ベクターから発現したポリ
ペプチド産生物を分泌することができる。
ナルペプチドをコードする配列（例えば、コメのα-ア
ミラーゼ遺伝子から誘導される配列）を更に含むことが
できるので、宿主細胞は発現ベクターから発現したポリ
ペプチド産生物を分泌することができる。
【００２３】クローニングを促進するために、本発明の
発現ベクターはプロモーターの下流に複数の制限部位を
含むことができ、その結果コード化配列をベクターのプ
ロモーターの下流に簡便に挿入することができる。糖応
答性エンハンサーはコード化配列の上流又は下流のどち
らかに位置させることができる。
発現ベクターはプロモーターの下流に複数の制限部位を
含むことができ、その結果コード化配列をベクターのプ
ロモーターの下流に簡便に挿入することができる。糖応
答性エンハンサーはコード化配列の上流又は下流のどち
らかに位置させることができる。
【００２４】本発明はまた、被子植物細胞中でポリペプ
チドを製造する方法も特徴としている。これらの方法
は、被子植物細胞中で発現を指令し得るプロモーターと
機能的に結合した当該ポリペプチドのコード化配列と、
穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーを含
有する発現構築物を使用する。このような構築物はコー
ド化配列を本発明の発現ベクター中に挿入することによ
って得ることができる。この構築物やこの構築物を含有
する細胞も本発明の範囲内である。
チドを製造する方法も特徴としている。これらの方法
は、被子植物細胞中で発現を指令し得るプロモーターと
機能的に結合した当該ポリペプチドのコード化配列と、
穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーを含
有する発現構築物を使用する。このような構築物はコー
ド化配列を本発明の発現ベクター中に挿入することによ
って得ることができる。この構築物やこの構築物を含有
する細胞も本発明の範囲内である。
【００２５】本発明の方法では、適当な被子植物宿主細
胞を先ず上記発現構築物で形質転換し、そしてその後形
質転換した細胞（該細胞から、例えば複製、再生又は分
化によって誘導された細胞を含む）を無糖環境に付して
ポリペプチドの発現を促進する。糖は、代謝可能であり
且つ細胞に炭素源を提供するスクロース、グルコース、
フラクトース、マルトース又は他の任意のポリサッカラ
イドであることができる。
胞を先ず上記発現構築物で形質転換し、そしてその後形
質転換した細胞（該細胞から、例えば複製、再生又は分
化によって誘導された細胞を含む）を無糖環境に付して
ポリペプチドの発現を促進する。糖は、代謝可能であり
且つ細胞に炭素源を提供するスクロース、グルコース、
フラクトース、マルトース又は他の任意のポリサッカラ
イドであることができる。
【００２６】無糖（即ち、糖飢餓又は糖枯渇）環境と
は、糖を全く含有していない環境、例えば培養培地、又
は糖濃度が非常に低く細胞の増殖又は呼吸作用を支持で
きない環境を言う。糖飢餓の発生は糖濃度、細胞対培地
容量比及び培地中でのインキュベーション時間の長さの
ような複数の要因に依存する。
は、糖を全く含有していない環境、例えば培養培地、又
は糖濃度が非常に低く細胞の増殖又は呼吸作用を支持で
きない環境を言う。糖飢餓の発生は糖濃度、細胞対培地
容量比及び培地中でのインキュベーション時間の長さの
ような複数の要因に依存する。
【００２７】ＴＡＴＣＣＡを含有している本発明の糖応
答性エンハンサーはまた、ジベレリン酸のようなホルモ
ンに応答して転写を高めることもできる。かくして、上
記方法では、上記のようなエンハンサーを含有している
構築物で形質転換した細胞を無糖環境の代わりにジベレ
リン酸含有環境に暴露してポリペプチドの製造を促進す
ることができる。発芽中の穀類種子は比較的高い濃度の
ジベレリン酸を含有している。かくして、形質転換され
た種子が発芽するときに当該ポリペプチドを製造するよ
うに穀類種子中の細胞を上記のような１つの構築物で形
質転換することができる。
答性エンハンサーはまた、ジベレリン酸のようなホルモ
ンに応答して転写を高めることもできる。かくして、上
記方法では、上記のようなエンハンサーを含有している
構築物で形質転換した細胞を無糖環境の代わりにジベレ
リン酸含有環境に暴露してポリペプチドの製造を促進す
ることができる。発芽中の穀類種子は比較的高い濃度の
ジベレリン酸を含有している。かくして、形質転換され
た種子が発芽するときに当該ポリペプチドを製造するよ
うに穀類種子中の細胞を上記のような１つの構築物で形
質転換することができる。
【００２８】勿論、上記形質転換体はまた組織又は更に
は全植物（即ち、トランスジェニック植物）に再生させ
てポリペプチドの発現を促進することもできる。このよ
うなトランスジェニック植物の種子を発芽させて組換え
ポリペプチドの発現を促進することもできる。
は全植物（即ち、トランスジェニック植物）に再生させ
てポリペプチドの発現を促進することもできる。このよ
うなトランスジェニック植物の種子を発芽させて組換え
ポリペプチドの発現を促進することもできる。
【００２９】発現したポリペプチドの回収を促進するた
めに、シグナルペプチドをコードする配列を発現構築物
の適当な位置、例えばプロモーターとポリペプチドコー
ド化配列の間に組み込むことができる。その結果、ポリ
ペプチドを培養培地に分泌させ、または発芽中の種子に
発現させ、そしてそれによって好都合に回収することが
できる。
めに、シグナルペプチドをコードする配列を発現構築物
の適当な位置、例えばプロモーターとポリペプチドコー
ド化配列の間に組み込むことができる。その結果、ポリ
ペプチドを培養培地に分泌させ、または発芽中の種子に
発現させ、そしてそれによって好都合に回収することが
できる。
【００３０】穀類α-アミラーゼ遺伝子のプロモーター
領域における糖応答性エンハンサーの発見を以下に記載
する。更に、糖飢餓誘導性転写効率は遺伝子内に挿入さ
れたエンハンサーのコピー数と共に直線的に上昇するこ
とが見い出される。このようなエンハンサーを使用し
て、糖枯渇又はジベレリン酸含有環境に暴露される被子
植物細胞中で外来遺伝子の発現を高めることができる。
領域における糖応答性エンハンサーの発見を以下に記載
する。更に、糖飢餓誘導性転写効率は遺伝子内に挿入さ
れたエンハンサーのコピー数と共に直線的に上昇するこ
とが見い出される。このようなエンハンサーを使用し
て、糖枯渇又はジベレリン酸含有環境に暴露される被子
植物細胞中で外来遺伝子の発現を高めることができる。
【００３１】穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エン
ハンサー要素を含有する本発明の単離ＤＮＡ及び発現ベ
クターは標準的な組換え技術（例えば、Sambrook等、分
子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual）、第２版、Cold Spring Harb
or Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、1989年; 及びAusubel等、分子生物学における現在
のプロトコール（CurrentProtocols in Molecular Biol
ogy）、Greene Publishing and Wiley-Intersciece、ニ
ューヨーク州ニューヨーク、1993年参照）によって得る
ことができる。例えば、上記エンハンサーを含有するＤ
ＮＡフラグメントは先ず、鋳型としてコメα-アミラー
ゼｃＤＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応で得る。次
に、このフラグメントを、適当な裸子植物プロモーター
（又は更に、該プロモーターの下流のコード化配列）を
既に適所に有しているプラスミド内に挿入する。
ハンサー要素を含有する本発明の単離ＤＮＡ及び発現ベ
クターは標準的な組換え技術（例えば、Sambrook等、分
子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual）、第２版、Cold Spring Harb
or Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、1989年; 及びAusubel等、分子生物学における現在
のプロトコール（CurrentProtocols in Molecular Biol
ogy）、Greene Publishing and Wiley-Intersciece、ニ
ューヨーク州ニューヨーク、1993年参照）によって得る
ことができる。例えば、上記エンハンサーを含有するＤ
ＮＡフラグメントは先ず、鋳型としてコメα-アミラー
ゼｃＤＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応で得る。次
に、このフラグメントを、適当な裸子植物プロモーター
（又は更に、該プロモーターの下流のコード化配列）を
既に適所に有しているプラスミド内に挿入する。
【００３２】任意の穀類α-アミラーゼ遺伝子から得ら
れる糖応答性エンハンサーは以下の実施例に記載した方
法で同定することができる。或いは、以下に記載する例
示的なエンハンサー配列と相同的な配列を穀類α-アミ
ラーゼプロモーター領域で検索することによってこのよ
うなエンハンサーを同定することができる; このように
して同定されたエンハンサーの糖応答性は以下に記載す
るアッセイで確認することができる。実際、穀類α-ア
ミラーゼ遺伝子の或る転写調節領域中には相同性が存在
する。例えば、ジーンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）で入手
できる９個のコメ、９個のオオムギ、そして５個のコム
ギα-アミラーゼ遺伝子内のプロモーター配列の試験に
よって、これら遺伝子は４個を除いて全てＴＡＴＣＣＡ
要素の改変体を含有しており、そしてこれらのＴＡＴＣ
ＣＡ要素／改変体は転写開始部位の概ね100〜150bp上流
に位置していることが明らかにされている。任意の天然
生起の糖応答性エンハンサー配列の組換え改変体は突然
変異誘発のような標準的な組換え技術で得ることができ
る。
れる糖応答性エンハンサーは以下の実施例に記載した方
法で同定することができる。或いは、以下に記載する例
示的なエンハンサー配列と相同的な配列を穀類α-アミ
ラーゼプロモーター領域で検索することによってこのよ
うなエンハンサーを同定することができる; このように
して同定されたエンハンサーの糖応答性は以下に記載す
るアッセイで確認することができる。実際、穀類α-ア
ミラーゼ遺伝子の或る転写調節領域中には相同性が存在
する。例えば、ジーンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）で入手
できる９個のコメ、９個のオオムギ、そして５個のコム
ギα-アミラーゼ遺伝子内のプロモーター配列の試験に
よって、これら遺伝子は４個を除いて全てＴＡＴＣＣＡ
要素の改変体を含有しており、そしてこれらのＴＡＴＣ
ＣＡ要素／改変体は転写開始部位の概ね100〜150bp上流
に位置していることが明らかにされている。任意の天然
生起の糖応答性エンハンサー配列の組換え改変体は突然
変異誘発のような標準的な組換え技術で得ることができ
る。
【００３３】植物細胞は、エレクトロポーレーション、
粒子衝撃、マイクロインジェクション、超音波法、ポリ
エチレングリコール介在プロトプラスト形質転換、ポリ
-Ｌオルニチン法、リン酸カルシウム法及びアグロバク
テリウム介在形質転換系のような標準的な方法を使用し
て、単離ＤＮＡ又は発現ベクターでトランスフェクショ
ンすることができる（例えば、米国特許第5,460,952
号、17〜18欄; 及び該特許の参照文献参照）。
粒子衝撃、マイクロインジェクション、超音波法、ポリ
エチレングリコール介在プロトプラスト形質転換、ポリ
-Ｌオルニチン法、リン酸カルシウム法及びアグロバク
テリウム介在形質転換系のような標準的な方法を使用し
て、単離ＤＮＡ又は発現ベクターでトランスフェクショ
ンすることができる（例えば、米国特許第5,460,952
号、17〜18欄; 及び該特許の参照文献参照）。
【００３４】発現構築物（即ち、例えば所望のポリペプ
チドをコードする配列を含有する発現ベクター）で形質
転換した植物細胞は無糖又はジベレリン酸含有培養培地
中で維持しそして膨張させて、ポリペプチドの発現を促
進することができる。続いて、標準的な技術を使用して
ポリペプチドを細胞から抽出しそして精製することがで
きる。或いは、発現構築物がシグナルペプチドをコード
する配列を含有していてポリペプチドを培地中に分泌す
る場合、ポリペプチドは培養培地から単離することがで
きる（Chen等、Plant J.、6:625〜638、1994年; Sijmon
s等、Bio／Technology、8:217〜221、1990年）。培養培
地からタンパク質を直接精製することの１つの利点は、
培養培地中では夾雑タンパク質の量が細胞抽出物中より
実質的に少ないということである。
チドをコードする配列を含有する発現ベクター）で形質
転換した植物細胞は無糖又はジベレリン酸含有培養培地
中で維持しそして膨張させて、ポリペプチドの発現を促
進することができる。続いて、標準的な技術を使用して
ポリペプチドを細胞から抽出しそして精製することがで
きる。或いは、発現構築物がシグナルペプチドをコード
する配列を含有していてポリペプチドを培地中に分泌す
る場合、ポリペプチドは培養培地から単離することがで
きる（Chen等、Plant J.、6:625〜638、1994年; Sijmon
s等、Bio／Technology、8:217〜221、1990年）。培養培
地からタンパク質を直接精製することの１つの利点は、
培養培地中では夾雑タンパク質の量が細胞抽出物中より
実質的に少ないということである。
【００３５】形質転換した植物細胞は周知の技術でトラ
ンスジェニック組織又はトランスジェニック植物に再生
することもできる（例えば、Datta等、Bio／Technolog
y、8:736〜740、1990年; Peng等、Plant Cell Report
s、9:168〜172、1990年; Yang等、Plant Cell Report
s、7:421〜425、1988年; 米国特許出願 08/509,962及び
08/639,792参照）。次に、組換えポリペプチドをトラン
スジェニック組織又は植物（又は、使用したプロモータ
ーの組織特異性に依存して、植物の一部分、例えば葉、
葉鞘、茎、種子及び根）から回収することができる。
ンスジェニック組織又はトランスジェニック植物に再生
することもできる（例えば、Datta等、Bio／Technolog
y、8:736〜740、1990年; Peng等、Plant Cell Report
s、9:168〜172、1990年; Yang等、Plant Cell Report
s、7:421〜425、1988年; 米国特許出願 08/509,962及び
08/639,792参照）。次に、組換えポリペプチドをトラン
スジェニック組織又は植物（又は、使用したプロモータ
ーの組織特異性に依存して、植物の一部分、例えば葉、
葉鞘、茎、種子及び根）から回収することができる。
【００３６】他に定義しない限り、本明細書で使用する
全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技
術分野の通常の技倆を有する者に通常理解されるものと
同一の意味を有している。本発明の実施又は試験では本
明細書に記載した方法や材料に類似するか又は同等の方
法や材料を使用することができるが、例示的な方法と材
料を以下に記載する。本明細書で言及した刊行物や他の
参照文献は全て、それらを全体として参照して組み入れ
る。相反する場合、定義を含めて本明細書によって支配
される。加えて、材料、方法及び実施例は説明的なもの
にすぎず、そして限定することを意図しているものでは
ない。
全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技
術分野の通常の技倆を有する者に通常理解されるものと
同一の意味を有している。本発明の実施又は試験では本
明細書に記載した方法や材料に類似するか又は同等の方
法や材料を使用することができるが、例示的な方法と材
料を以下に記載する。本明細書で言及した刊行物や他の
参照文献は全て、それらを全体として参照して組み入れ
る。相反する場合、定義を含めて本明細書によって支配
される。加えて、材料、方法及び実施例は説明的なもの
にすぎず、そして限定することを意図しているものでは
ない。
【００３７】以下のデータ及びプロトコールは、本発明
の単離ＤＮＡ、発現ベクター、構築物及び方法を説明す
るために実施例として使用するものであって、これらを
限定するためのものではない。
の単離ＤＮＡ、発現ベクター、構築物及び方法を説明す
るために実施例として使用するものであって、これらを
限定するためのものではない。
【００３８】
【実施例】この実施例では、コメαＡmy3プロモーター
中の幾つかのシス作用性糖応答性エンハンサー配列の同
定を記載する。コメ懸濁細胞から調製したプロトプラス
トで幾つかの一時的発現系を使用した。機能喪失、機能
獲得及びリンカースキャニング変異分析を実施すること
によって、出願人はグルコース飢餓誘導性の遺伝子発現
を高レベルで行う糖応答性エンハンサーを同定した。こ
れらの配列は、方向に非依存的であるが投与量に依存的
な態様で最小プロモーターに糖応答性を付与する。αＡ
my3発現の制御で相乗的に作用する３つの重要なモチー
フ（即ち、ＧＣボックス、Ｇボックス及びＴＡＴＣＣＡ
要素）も同定した。最後に、コメ懸濁細胞から得られる
核タンパク質は配列特異的及び糖依存的態様でＴＡＴＣ
ＣＡ要素と結合することが示された。 コメの細胞培養物
中の幾つかのシス作用性糖応答性エンハンサー配列の同
定を記載する。コメ懸濁細胞から調製したプロトプラス
トで幾つかの一時的発現系を使用した。機能喪失、機能
獲得及びリンカースキャニング変異分析を実施すること
によって、出願人はグルコース飢餓誘導性の遺伝子発現
を高レベルで行う糖応答性エンハンサーを同定した。こ
れらの配列は、方向に非依存的であるが投与量に依存的
な態様で最小プロモーターに糖応答性を付与する。αＡ
my3発現の制御で相乗的に作用する３つの重要なモチー
フ（即ち、ＧＣボックス、Ｇボックス及びＴＡＴＣＣＡ
要素）も同定した。最後に、コメ懸濁細胞から得られる
核タンパク質は配列特異的及び糖依存的態様でＴＡＴＣ
ＣＡ要素と結合することが示された。 コメの細胞培養物
【００３９】コメ（Oryza sativa cv. Tainan 5）の懸
濁細胞培養物は以前に記載された（Yu等 J. Biol. Che
m. 266:21131〜21137、1991年）ようにして調製した。
確立された懸濁細胞は、125mlフラスコ中３％スクロー
スを含有する新たな液体ムラシゲ（Murashige）及びス
クーグ（Skoog）（「ＭＳ」）培地（Murashige及びSkoo
g、1962年）25ml中に約0.5mlの細胞を移すことによって
７日毎に継代培養した。細胞は120rpmの交互振とう器上
で培養し、そして暗所中26℃でインキュベートした。 プライマー伸長法分析
濁細胞培養物は以前に記載された（Yu等 J. Biol. Che
m. 266:21131〜21137、1991年）ようにして調製した。
確立された懸濁細胞は、125mlフラスコ中３％スクロー
スを含有する新たな液体ムラシゲ（Murashige）及びス
クーグ（Skoog）（「ＭＳ」）培地（Murashige及びSkoo
g、1962年）25ml中に約0.5mlの細胞を移すことによって
７日毎に継代培養した。細胞は120rpmの交互振とう器上
で培養し、そして暗所中26℃でインキュベートした。 プライマー伸長法分析
【００４０】18〜20ヌクレオチド長でありそしてそれぞ
れコメαＡmy7及びαＡmy8のシグナルペプチド領域並び
にコメαＡmy3の５'非翻訳リーダー（図１Ｂ）と相補的
な３つの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを合成し、そ
してプライマーとして使用した。プライマー伸長法分析
はサトリフ（Sutliff）等、Plant Mol. Biol.、16:579
〜591、1991年、に従って実施した。 プラスミドの構築
れコメαＡmy7及びαＡmy8のシグナルペプチド領域並び
にコメαＡmy3の５'非翻訳リーダー（図１Ｂ）と相補的
な３つの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを合成し、そ
してプライマーとして使用した。プライマー伸長法分析
はサトリフ（Sutliff）等、Plant Mol. Biol.、16:579
〜591、1991年、に従って実施した。 プラスミドの構築
【００４１】コメαＡmy3から得られる1.7kbのＳalI−
ＥcoＮIフラグメントを平滑末端化しそしてｐＢＳI-132
のＣlaI部位にクローン化して、ｐ3Ｇ-132IIを形成させ
た。このフラグメントはプロモーター領域、５'非翻訳
配列及びコメαＡmy3の翻訳開始部位の下流の84bp領域
を含有していた。ｐＢＳI-132は、ｐＢＳＩ（Chan等、P
lant Mol. Biol.、22:491〜506、1993年）から得られ平
滑末端化したＰvuIIフラグメントをｐＴＲＡ132（Hayas
himoto等、Plant Physiol.、93:857〜863、1990年）の
ＨindIII部位に挿入することによって得た。ＰvuIIフラ
グメントはアグロバクテリウム ノパリン（nopaline）
シンターゼ（「Ｎos」）遺伝子ターミネーターの上流に
融合したβ-グルクロニダーゼ（「Ｇus」）コード化配
列を含有していた。ｐＴＲＡ132はカリフラワーモザイ
クウイルス35Ｓ ＲＮＡ（「ＣaＭＶ35Ｓ」）プロモータ
ー、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
（「hph」）コード化配列及び腫瘍形態学大遺伝子（「t
ml」）ターミネーターをこの順序で含有しているプラス
ミドである。
ＥcoＮIフラグメントを平滑末端化しそしてｐＢＳI-132
のＣlaI部位にクローン化して、ｐ3Ｇ-132IIを形成させ
た。このフラグメントはプロモーター領域、５'非翻訳
配列及びコメαＡmy3の翻訳開始部位の下流の84bp領域
を含有していた。ｐＢＳI-132は、ｐＢＳＩ（Chan等、P
lant Mol. Biol.、22:491〜506、1993年）から得られ平
滑末端化したＰvuIIフラグメントをｐＴＲＡ132（Hayas
himoto等、Plant Physiol.、93:857〜863、1990年）の
ＨindIII部位に挿入することによって得た。ＰvuIIフラ
グメントはアグロバクテリウム ノパリン（nopaline）
シンターゼ（「Ｎos」）遺伝子ターミネーターの上流に
融合したβ-グルクロニダーゼ（「Ｇus」）コード化配
列を含有していた。ｐＴＲＡ132はカリフラワーモザイ
クウイルス35Ｓ ＲＮＡ（「ＣaＭＶ35Ｓ」）プロモータ
ー、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
（「hph」）コード化配列及び腫瘍形態学大遺伝子（「t
ml」）ターミネーターをこの順序で含有しているプラス
ミドである。
【００４２】プラスミドｐ3Ｇ-132IIはこの実施例に記
載した全ての構築物用の前駆体として使用した。αＡmy
3プロモーター構築物を調製するために使用したオリゴ
ヌクレオチド配列は表１に示す。５'プライマーと３'プ
ライマーの適当な組合せを使用して、ポリメラーゼ連鎖
反応（「ＰＣＲ」）によって種々の５'欠失、内部欠失
又は他の任意の突然変異を発生させた。
載した全ての構築物用の前駆体として使用した。αＡmy
3プロモーター構築物を調製するために使用したオリゴ
ヌクレオチド配列は表１に示す。５'プライマーと３'プ
ライマーの適当な組合せを使用して、ポリメラーゼ連鎖
反応（「ＰＣＲ」）によって種々の５'欠失、内部欠失
又は他の任意の突然変異を発生させた。
【００４３】
【表１】
【００４４】５'欠失構築物については、ＰＣＲ産生物
をＥcoＲIとＰstIで消化し、ｐＢluescript ＫＳ+（Str
atagene）に結合させて、ｐ3.4、ｐ3.5及びｐ3.6を得
た。これらのプラスミドをＫpnIとＰstIで消化してプロ
モーター領域を放出させ、そしてその後これらの領域を
ＫpnIとＰstIで消化したｐＬucに結合させ、それぞれｐ
3Ｌuc.4、ｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6を形成させた。ｐＬu
cは、ｐＪＤ312（Luehrsen等、Meth. Enzymol.、216:39
7〜414、1992年）から得られるＳalI−ＢglIIフラグメ
ント（これはnosターミネーターに融合したルシフェラ
ーゼ（「Ｌuc」）コード化配列を含有していた）をｐＢ
luescriptのＳmaI部位に挿入することによって得た。
をＥcoＲIとＰstIで消化し、ｐＢluescript ＫＳ+（Str
atagene）に結合させて、ｐ3.4、ｐ3.5及びｐ3.6を得
た。これらのプラスミドをＫpnIとＰstIで消化してプロ
モーター領域を放出させ、そしてその後これらの領域を
ＫpnIとＰstIで消化したｐＬucに結合させ、それぞれｐ
3Ｌuc.4、ｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6を形成させた。ｐＬu
cは、ｐＪＤ312（Luehrsen等、Meth. Enzymol.、216:39
7〜414、1992年）から得られるＳalI−ＢglIIフラグメ
ント（これはnosターミネーターに融合したルシフェラ
ーゼ（「Ｌuc」）コード化配列を含有していた）をｐＢ
luescriptのＳmaI部位に挿入することによって得た。
【００４５】内部欠失構築物については、ピカード（Pi
card）等、Nucl. Acids. Res.、22:2587〜2591、1994
年、が記載したようにしてオリゴヌクレオチド指令変異
誘発を使用してＰＣＲを実施した。この方法では、５'
内部欠失プライマーを先ず３'プライマーと対合させ
て、ＰＣＲによって短いＤＮＡフラグメントを得た。次
に、このＰＣＲ産生物を５'プライマーとして使用しそ
して上記３'プライマーと対合させて内部欠失を有する
フラグメントを得た。これらのフラグメントを、５'欠
失を構築する方法と同じ方法を使用してｐＬuc中にクロ
ーン化した。得られたプラスミドはｐ3Ｌuc.7、ｐ3Ｌu
c.8及びｐ3Ｌuc.9であった。
card）等、Nucl. Acids. Res.、22:2587〜2591、1994
年、が記載したようにしてオリゴヌクレオチド指令変異
誘発を使用してＰＣＲを実施した。この方法では、５'
内部欠失プライマーを先ず３'プライマーと対合させ
て、ＰＣＲによって短いＤＮＡフラグメントを得た。次
に、このＰＣＲ産生物を５'プライマーとして使用しそ
して上記３'プライマーと対合させて内部欠失を有する
フラグメントを得た。これらのフラグメントを、５'欠
失を構築する方法と同じ方法を使用してｐＬuc中にクロ
ーン化した。得られたプラスミドはｐ3Ｌuc.7、ｐ3Ｌu
c.8及びｐ3Ｌuc.9であった。
【００４６】機能獲得分析用の構築物を調製するため
に、鋳型としてｐＪＤ312を使用して、ＣaＭＶ35Ｓ最小
プロモーター-アルコールデヒドロゲナーゼイントロン
Ｉ（ＡdhI）を含有するフラグメントをＰＣＲによって
得、そしてｐＬucのＰstI及びＮcoI部位に挿入してｐ35
mＡＬucを得た。野生型又は変異αＡmy3プロモーターの
種々の領域を含有するＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増
幅し、そしてｐＢluescript中にクローン化して、ｐ3.1
5からｐ3.19まで及びｐ3.40を得た。続いて、これらの
プラスミドをＸhoIとＰstIで消化し、それによって放出
されたプロモーター領域をｐ35mＡＬuc中にクローン化
してｐ3Ｌuc.15からｐ3Ｌuc.19まで及びｐ3Ｌuc.40を得
た。
に、鋳型としてｐＪＤ312を使用して、ＣaＭＶ35Ｓ最小
プロモーター-アルコールデヒドロゲナーゼイントロン
Ｉ（ＡdhI）を含有するフラグメントをＰＣＲによって
得、そしてｐＬucのＰstI及びＮcoI部位に挿入してｐ35
mＡＬucを得た。野生型又は変異αＡmy3プロモーターの
種々の領域を含有するＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増
幅し、そしてｐＢluescript中にクローン化して、ｐ3.1
5からｐ3.19まで及びｐ3.40を得た。続いて、これらの
プラスミドをＸhoIとＰstIで消化し、それによって放出
されたプロモーター領域をｐ35mＡＬuc中にクローン化
してｐ3Ｌuc.15からｐ3Ｌuc.19まで及びｐ3Ｌuc.40を得
た。
【００４７】ＳＲＳを逆方向に含有するプラスミドｐ3
Ｌuc.18Ｒを得るために、ＳＲＳ（−182〜−82）を正し
い方向に含有するｐ3Ｌuc.18をＸhoIとＰstIで消化し、
平滑末端化し。再度結合させた。
Ｌuc.18Ｒを得るために、ＳＲＳ（−182〜−82）を正し
い方向に含有するｐ3Ｌuc.18をＸhoIとＰstIで消化し、
平滑末端化し。再度結合させた。
【００４８】ｐ3Ｌuc.19中の−186〜−122フラグメント
及びｐ3Ｌuc.40中の−133〜−82フラグメントをＸhoIと
ＰstIで消化し、再度結合させた。これによって、これ
らフラグメントの複数のコピーを含有するプラスミドが
得られ、これらとｐ3Ｌuc.19ｘ2及びｐ3Ｌuc.41〜ｐ3Ｌ
uc.44と呼称した。フラグメント−133〜−82（ｐ3Ｌuc.
41）中の重複ＴＡＴＣＣＡ要素の下流又は上流のコピー
の変異は、ＰＣＲに基づくオリゴヌクレオチド指令変異
誘発を使用して生じさせた（Picard等、Nucl.Acids. Re
s.、22:2587〜2591、1994年）。得られた構築物をそれ
ぞれ、ｐ3Ｌuc.41m1及びｐ3Ｌuc.41m2と呼称した。
及びｐ3Ｌuc.40中の−133〜−82フラグメントをＸhoIと
ＰstIで消化し、再度結合させた。これによって、これ
らフラグメントの複数のコピーを含有するプラスミドが
得られ、これらとｐ3Ｌuc.19ｘ2及びｐ3Ｌuc.41〜ｐ3Ｌ
uc.44と呼称した。フラグメント−133〜−82（ｐ3Ｌuc.
41）中の重複ＴＡＴＣＣＡ要素の下流又は上流のコピー
の変異は、ＰＣＲに基づくオリゴヌクレオチド指令変異
誘発を使用して生じさせた（Picard等、Nucl.Acids. Re
s.、22:2587〜2591、1994年）。得られた構築物をそれ
ぞれ、ｐ3Ｌuc.41m1及びｐ3Ｌuc.41m2と呼称した。
【００４９】ＳＲＳのリンカースキャニング変異は、鋳
型としてｐ3Ｌuc.18を使用して、ＰＣＲに基づくオリゴ
ヌクレオチド指令変異によって10bp間隔で得た。このプ
ラスミドをＸhoIとＰstIで消化して変異ＳＲＳフラグメ
ントをｐ3Ｌuc.18から放出させた。放出されたフラグメ
ントをｐ35mＡＬuc中にクローン化してｐ3Ｌuc.28から
ｐ3Ｌuc.36までを得た。
型としてｐ3Ｌuc.18を使用して、ＰＣＲに基づくオリゴ
ヌクレオチド指令変異によって10bp間隔で得た。このプ
ラスミドをＸhoIとＰstIで消化して変異ＳＲＳフラグメ
ントをｐ3Ｌuc.18から放出させた。放出されたフラグメ
ントをｐ35mＡＬuc中にクローン化してｐ3Ｌuc.28から
ｐ3Ｌuc.36までを得た。
【００５０】Ａct1プロモーター中にＳＲＳを有するプ
ラスミドを構築するために、Ａct1の５'領域（1.4kbの
５'フランキング配列、79bpの５'非コード化エキソン、
447bpの５'イントロン及び25bpの第１のコード化エキソ
ンを含む）をＨindIIIでｐＤＭ302（Cao等、1992年）か
ら切断し、そしてｐＢluescript中にサブクローン化し
た。ｐＢluescriptの複数のクローニング部位中のＥco
ＲI部位をＥcoＲＶとＸhoIで消化して除き、その後平滑
末端化し、再度結合した。35Ｓ最小プロモーター及びＡ
dhIイントロンの一部分と一緒になったＳＲＳ配列をＨi
ndIIIでｐ3Ｌuc.18から切断し、そしてｐＢluescriptの
ＨindIII部位に挿入し、そしてｐ3.182を得た。ＳＲＳ
はＥcoＲIでｐ3.182から切断し、そして１個、２個又は
３個のコピーとしてｐＢluescript中のＡct1プロモータ
ーのＥcoＲI部位（−459）に挿入し、そしてｐ3.37+、
ｐ3.37++及びｐ3.37+++を得た。次に、これら３つのプ
ラスミドをＳalIとＰstIで消化し、そしてＳＲＳを含有
するＡct1プロモーターを使用してｐＪＤ312中の35Ｓプ
ロモーター及びＡdhIイントロンを置換し、そしてｐ3Ｌ
uc.37+、ｐ3Ｌuc.37++及びｐ3Ｌuc.37+++を得た。 プロトプラストの単離
ラスミドを構築するために、Ａct1の５'領域（1.4kbの
５'フランキング配列、79bpの５'非コード化エキソン、
447bpの５'イントロン及び25bpの第１のコード化エキソ
ンを含む）をＨindIIIでｐＤＭ302（Cao等、1992年）か
ら切断し、そしてｐＢluescript中にサブクローン化し
た。ｐＢluescriptの複数のクローニング部位中のＥco
ＲI部位をＥcoＲＶとＸhoIで消化して除き、その後平滑
末端化し、再度結合した。35Ｓ最小プロモーター及びＡ
dhIイントロンの一部分と一緒になったＳＲＳ配列をＨi
ndIIIでｐ3Ｌuc.18から切断し、そしてｐＢluescriptの
ＨindIII部位に挿入し、そしてｐ3.182を得た。ＳＲＳ
はＥcoＲIでｐ3.182から切断し、そして１個、２個又は
３個のコピーとしてｐＢluescript中のＡct1プロモータ
ーのＥcoＲI部位（−459）に挿入し、そしてｐ3.37+、
ｐ3.37++及びｐ3.37+++を得た。次に、これら３つのプ
ラスミドをＳalIとＰstIで消化し、そしてＳＲＳを含有
するＡct1プロモーターを使用してｐＪＤ312中の35Ｓプ
ロモーター及びＡdhIイントロンを置換し、そしてｐ3Ｌ
uc.37+、ｐ3Ｌuc.37++及びｐ3Ｌuc.37+++を得た。 プロトプラストの単離
【００５１】継代培養３日後に、25mlの懸濁細胞培養物
を９cmのペトリ皿に移した。ＭＳ培地を除去しそして細
胞をＣＰＷ7.4緩衝液（２mＭ ＫＨ２ＰＯ４、１mＭ Ｋ
ＮＯ ３、10mＭ ＣaＣl２・２Ｈ２Ｏ、１mＭ ＭgＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ、１μＭ ＫＩ、0.16μＭ ＣuＳＯ４・５Ｈ
２Ｏ、５mＭ ＭＥＳ及び0.4Ｍマンニトール、ｐＨ 5.
8）（Frearson等、1973年）で１回洗浄した。細胞をプ
ロトプラスト単離緩衝液（ＣＰＷ7.4緩衝液中１％のセ
ルラーゼＲＳ及び0.1％のペクトリラーゼＹ-23）15mlと
共に50rpmで振とうしながら25℃で４時間インキュベー
トした。細胞壁を消化した後、プロトプラストを33μm
のナイロンメッシュ（Small Parts, Inc.）でろ過し、1
00×ｇで５分間遠心してＣＰＷ7.4緩衝液で３回洗浄
し、そしてＣＰＷ7.4緩衝液２mlに静かに再度懸濁させ
た。プロトプラストを、15mlのコニカル管中のＣＰＷ7.
4緩衝液中0.6Ｍのスクロースクッション５ml上に層状に
置き、そしてスイングバケットローター中40×ｇで10分
間遠心した。スクロースクッション上部のプロトプラス
トを集め、そしてＣＰＷ7.4緩衝液10mlに移した。次
に、プロトプラストをエレクトロポーレーション緩衝液
（0.14Ｍ ＮaＣl、2.7mＭ ＫＣl、0.7mＭ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、4.2mＭ Ｎa２ＨＰＯ４、５mＭ ＣaＣl２、0.4Ｍ
マンニトール）（Ou-Lee等、1986年）で洗浄し、同じ緩
衝液で再度懸濁し、そして５×10６個のプロトプラスト
／mlに調整した。 エレクトロポーレーションとプロトプラストの培養
を９cmのペトリ皿に移した。ＭＳ培地を除去しそして細
胞をＣＰＷ7.4緩衝液（２mＭ ＫＨ２ＰＯ４、１mＭ Ｋ
ＮＯ ３、10mＭ ＣaＣl２・２Ｈ２Ｏ、１mＭ ＭgＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ、１μＭ ＫＩ、0.16μＭ ＣuＳＯ４・５Ｈ
２Ｏ、５mＭ ＭＥＳ及び0.4Ｍマンニトール、ｐＨ 5.
8）（Frearson等、1973年）で１回洗浄した。細胞をプ
ロトプラスト単離緩衝液（ＣＰＷ7.4緩衝液中１％のセ
ルラーゼＲＳ及び0.1％のペクトリラーゼＹ-23）15mlと
共に50rpmで振とうしながら25℃で４時間インキュベー
トした。細胞壁を消化した後、プロトプラストを33μm
のナイロンメッシュ（Small Parts, Inc.）でろ過し、1
00×ｇで５分間遠心してＣＰＷ7.4緩衝液で３回洗浄
し、そしてＣＰＷ7.4緩衝液２mlに静かに再度懸濁させ
た。プロトプラストを、15mlのコニカル管中のＣＰＷ7.
4緩衝液中0.6Ｍのスクロースクッション５ml上に層状に
置き、そしてスイングバケットローター中40×ｇで10分
間遠心した。スクロースクッション上部のプロトプラス
トを集め、そしてＣＰＷ7.4緩衝液10mlに移した。次
に、プロトプラストをエレクトロポーレーション緩衝液
（0.14Ｍ ＮaＣl、2.7mＭ ＫＣl、0.7mＭ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、4.2mＭ Ｎa２ＨＰＯ４、５mＭ ＣaＣl２、0.4Ｍ
マンニトール）（Ou-Lee等、1986年）で洗浄し、同じ緩
衝液で再度懸濁し、そして５×10６個のプロトプラスト
／mlに調整した。 エレクトロポーレーションとプロトプラストの培養
【００５２】プラスミドＤＮＡをエレクトロポーレーシ
ョンでコメプロトプラスト中にトランスフェクションし
た。エレクトロポーレーション緩衝液0.4ml中２×10５
個のプロトプラストを含有する各試料を試験プラスミド
ＤＮＡ 20μg、対照プラスミドＤＮＡ ５μg及び担体
（ウシ胸腺）ＤＮＡ 50μgと混合した。この混合物をキ
ュベットに移し、そして氷中に10分間置いた。エレクト
ロポーレーター（ＢＴＸ）を1000Ｖ／cm、400μＦ及び1
86Ωで使用してエレクトロポーレーションを実施した。
エレクトロポーレーション後、プロトプラストを氷中に
10分間維持し、その後エレクトロポーレーション緩衝液
0.4ml及び、400mＭグルコース又は400mＭマンニトール
と５mＭグルコースを加えた２Ｘ改変ＭＳ培地（１リッ
トル当たり0.2mgの2,4-Ｄと0.1mgのキネチンを含有す
る）と混合した。これらのプロトプラストを３cmのペト
リ皿に播き、そして暗所中26℃で18時間培養した。 ＧＵＳ及びルシフェラーゼアッセイ
ョンでコメプロトプラスト中にトランスフェクションし
た。エレクトロポーレーション緩衝液0.4ml中２×10５
個のプロトプラストを含有する各試料を試験プラスミド
ＤＮＡ 20μg、対照プラスミドＤＮＡ ５μg及び担体
（ウシ胸腺）ＤＮＡ 50μgと混合した。この混合物をキ
ュベットに移し、そして氷中に10分間置いた。エレクト
ロポーレーター（ＢＴＸ）を1000Ｖ／cm、400μＦ及び1
86Ωで使用してエレクトロポーレーションを実施した。
エレクトロポーレーション後、プロトプラストを氷中に
10分間維持し、その後エレクトロポーレーション緩衝液
0.4ml及び、400mＭグルコース又は400mＭマンニトール
と５mＭグルコースを加えた２Ｘ改変ＭＳ培地（１リッ
トル当たり0.2mgの2,4-Ｄと0.1mgのキネチンを含有す
る）と混合した。これらのプロトプラストを３cmのペト
リ皿に播き、そして暗所中26℃で18時間培養した。 ＧＵＳ及びルシフェラーゼアッセイ
【００５３】プロトプラスト（２×10６）は12,000×ｇ
で10秒間遠心して集め、抽出緩衝液（100mＭ Ｋ２ＨＰ
Ｏ４、ｐＨ 7.8、１mＭ ＥＤＴＡ、７mＭ β-メルカプ
トエタノール、１％トリトンＸ-100及び10％グリセリ
ン）0.3ml中に再度懸濁し、そして高速で10秒間撹拌し
た。破壊したプロトプラストを12,000×ｇ及び４℃で５
分間遠心した。上清液を集めそしてＧＵＳ又はルシフェ
ラーゼ活性アッセイ用に使用した。細胞抽出物の酵素活
性は−80℃で少なくとも１カ月間安定に維持される。
で10秒間遠心して集め、抽出緩衝液（100mＭ Ｋ２ＨＰ
Ｏ４、ｐＨ 7.8、１mＭ ＥＤＴＡ、７mＭ β-メルカプ
トエタノール、１％トリトンＸ-100及び10％グリセリ
ン）0.3ml中に再度懸濁し、そして高速で10秒間撹拌し
た。破壊したプロトプラストを12,000×ｇ及び４℃で５
分間遠心した。上清液を集めそしてＧＵＳ又はルシフェ
ラーゼ活性アッセイ用に使用した。細胞抽出物の酵素活
性は−80℃で少なくとも１カ月間安定に維持される。
【００５４】ＧＵＳ活性に関する蛍光生成アッセイはジ
ェファーソン（Jefferson）、Plant. Mol. Biol. Rept
r.、5:387〜405、1987年が記載した方法を修正して実施
した。各アッセイで、２Ｘ ＧＵＳアッセイ緩衝液［100
mＭ ＮaＰＯ４、ｐＨ７、10mＭ β-メルカプトメタノー
ル、20mＭ Ｎa２-ＥＤＴＡ、0.2％（ｗ／ｗ）ラウリル
サルコシンナトリウム、0.25％（ｖ／ｖ）トリトンＸ-1
00及び1.8mＭ ４-メチルウンベリフェリル β-Ｄ-グル
クロニド（ＭＵＧ）］100μlを1.5mlのエッペンドルフ
管中に調合した。細胞抽出物100μlを添加し、そして暗
所中37℃で種々の時間インキュベートした。反応混合物
50μlを0.2 Ｎa２ＣＯ３ 1,950μl中に直ちに（ｔ＝０
分）加え、そして120分後に繰り返した。蛍光（365nmで
の励起及び455nmでの発光）はＴＫＯ 100 フルオロメー
ター（Hofer）を使用して検出した。
ェファーソン（Jefferson）、Plant. Mol. Biol. Rept
r.、5:387〜405、1987年が記載した方法を修正して実施
した。各アッセイで、２Ｘ ＧＵＳアッセイ緩衝液［100
mＭ ＮaＰＯ４、ｐＨ７、10mＭ β-メルカプトメタノー
ル、20mＭ Ｎa２-ＥＤＴＡ、0.2％（ｗ／ｗ）ラウリル
サルコシンナトリウム、0.25％（ｖ／ｖ）トリトンＸ-1
00及び1.8mＭ ４-メチルウンベリフェリル β-Ｄ-グル
クロニド（ＭＵＧ）］100μlを1.5mlのエッペンドルフ
管中に調合した。細胞抽出物100μlを添加し、そして暗
所中37℃で種々の時間インキュベートした。反応混合物
50μlを0.2 Ｎa２ＣＯ３ 1,950μl中に直ちに（ｔ＝０
分）加え、そして120分後に繰り返した。蛍光（365nmで
の励起及び455nmでの発光）はＴＫＯ 100 フルオロメー
ター（Hofer）を使用して検出した。
【００５５】ルシフェラーゼアッセイでは、細胞抽出物
50μlをルミノメーターキュベット（Sarstedt）に入
れ、その後ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（25mＭ トリ
シン、ｐＨ 7.8、15mＭ リン酸カリウム、ｐＨ 7.8、15
mＭ ＭgＳＯ４、４mＭ ＥＧＴＡ、２mＭ ＡＴＰ及び１m
Ｍ ＤＴＴ）180μlを添加した。この混合物を約15分間
室温に平衡化させた。キュベットをルミノメーター（Ｌ
ＵＭＡＴ、Berthold）の計数室に入れて機械を自動的に
始動させ、そして250μＭルシフェリン（Promega）50μ
lをキュベットに注入して反応を開始させた。発光した
光子を20秒間積分し、そして光線単位（ＲＬＵ）／20秒
として表した。
50μlをルミノメーターキュベット（Sarstedt）に入
れ、その後ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（25mＭ トリ
シン、ｐＨ 7.8、15mＭ リン酸カリウム、ｐＨ 7.8、15
mＭ ＭgＳＯ４、４mＭ ＥＧＴＡ、２mＭ ＡＴＰ及び１m
Ｍ ＤＴＴ）180μlを添加した。この混合物を約15分間
室温に平衡化させた。キュベットをルミノメーター（Ｌ
ＵＭＡＴ、Berthold）の計数室に入れて機械を自動的に
始動させ、そして250μＭルシフェリン（Promega）50μ
lをキュベットに注入して反応を開始させた。発光した
光子を20秒間積分し、そして光線単位（ＲＬＵ）／20秒
として表した。
【００５６】ユビキチンプロモーター-ＧＵＳ遺伝子融
合物を含有するプラスミドｐＵＧＩを内部標準として使
用した。ｐＵＧＩは、ｐＡＨＣ18（Bruce等、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA、86:9692〜9696、1989年）から得ら
れるＢamＨＩ−ＨindIIIフラグメント［ユビキチン（ub
i）プロモーター］を同じ酵素で消化したｐＢＳＩ中に
挿入して得た。ユビキチンプロモーターからの発現はプ
ロトプラストのグルコース飢餓によって２倍未満に低下
した。ｐＵＧＩから発現したＧＵＳ活性を使用して、グ
ルコースを用いて又は用いないで増殖させた細胞から得
られる細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を標準化した。 タバコの形質転換
合物を含有するプラスミドｐＵＧＩを内部標準として使
用した。ｐＵＧＩは、ｐＡＨＣ18（Bruce等、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA、86:9692〜9696、1989年）から得ら
れるＢamＨＩ−ＨindIIIフラグメント［ユビキチン（ub
i）プロモーター］を同じ酵素で消化したｐＢＳＩ中に
挿入して得た。ユビキチンプロモーターからの発現はプ
ロトプラストのグルコース飢餓によって２倍未満に低下
した。ｐＵＧＩから発現したＧＵＳ活性を使用して、グ
ルコースを用いて又は用いないで増殖させた細胞から得
られる細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を標準化した。 タバコの形質転換
【００５７】αＡmy3-Ｌuc-Ｎosキメラ遺伝子を含有す
るＤＮＡフラグメントは、ＫpnIとＳpeIを使用してプラ
スミドｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6から切断し、そしてｐＢ
ＩＮ19（Bevan、Nucl. Acids. Res.、12:8711〜8721、1
984年）のＫpnI及びＸbaI部位に結合してｐＡ3Ｌuc.5及
びｐＡ3Ｌuc.6を得た。ｐＡ3Ｌuc.5及びｐＡ3Ｌuc.6
は、エレクトロポーレーターＢＴＸに関する製造者の指
示マニュアルに記載されたエレクトロポーレーション法
又は凍結融解法（Holster等、Mol. Gen. Genet.、163:1
81〜187、1984年）を使用してアグロバクテリウムツメ
ファシエンス（tumefaciens）株ＥＨＡ105中に移した。
この試験では、タバコ変種ニコチアナタバカム（Nicoti
ana tabacum）Ｌ. cv. ペチットハバンス（Petit Havan
s）ＳＲＩを使用した。トランスジェニックタバコ細胞
系は、ホルシュ（Horsch）等、植物分子生物学マニュア
ル（Plant Molecular Biology Manual）、エス・ビイ・
ゲルビン（S.B. Gelvin）及びアール・エイ・シルペル
ート（R.A. Schilperoot）編集、Ａ5:1〜9頁、1988年の
方法に従って、リーフディスクのアグロバクテリウムに
よる形質転換によって得た。トランスジェニックタバコ
の懸濁細胞培養物は以前に記載された（Yu等、J. Biol.
Chem.、266:21131〜21137、1991年; 及び米国特許第5,
460,952号）ようにして増殖させた。トランスジェニッ
クタバコ懸濁細胞のルシフェラーゼ活性は細胞を糖の存
在下又は非存在下で２日間増殖させた後に試験した。 核抽出物の調製
るＤＮＡフラグメントは、ＫpnIとＳpeIを使用してプラ
スミドｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6から切断し、そしてｐＢ
ＩＮ19（Bevan、Nucl. Acids. Res.、12:8711〜8721、1
984年）のＫpnI及びＸbaI部位に結合してｐＡ3Ｌuc.5及
びｐＡ3Ｌuc.6を得た。ｐＡ3Ｌuc.5及びｐＡ3Ｌuc.6
は、エレクトロポーレーターＢＴＸに関する製造者の指
示マニュアルに記載されたエレクトロポーレーション法
又は凍結融解法（Holster等、Mol. Gen. Genet.、163:1
81〜187、1984年）を使用してアグロバクテリウムツメ
ファシエンス（tumefaciens）株ＥＨＡ105中に移した。
この試験では、タバコ変種ニコチアナタバカム（Nicoti
ana tabacum）Ｌ. cv. ペチットハバンス（Petit Havan
s）ＳＲＩを使用した。トランスジェニックタバコ細胞
系は、ホルシュ（Horsch）等、植物分子生物学マニュア
ル（Plant Molecular Biology Manual）、エス・ビイ・
ゲルビン（S.B. Gelvin）及びアール・エイ・シルペル
ート（R.A. Schilperoot）編集、Ａ5:1〜9頁、1988年の
方法に従って、リーフディスクのアグロバクテリウムに
よる形質転換によって得た。トランスジェニックタバコ
の懸濁細胞培養物は以前に記載された（Yu等、J. Biol.
Chem.、266:21131〜21137、1991年; 及び米国特許第5,
460,952号）ようにして増殖させた。トランスジェニッ
クタバコ懸濁細胞のルシフェラーゼ活性は細胞を糖の存
在下又は非存在下で２日間増殖させた後に試験した。 核抽出物の調製
【００５８】スクロースの存在下又は非存在下で増殖さ
せたコメ懸濁細胞約５ｇ（新たな重量）を液体窒素中で
粉末化し、そしてホモジネーション緩衝液（400mＭ マ
ンニトール、50mＭ トリス-ＨＣl、ｐＨ 7.9、５mＭ Ｍ
gＣl２、１mＭ ＥＤＴＡ、0.1％ＢＳＡ、0.1％ＮＰ-4
0、５mＭ ＤＴＴ及び１mＭ ＰＭＳＦ）200ml中でホモジ
ネートした。この段階の後、核抽出物の調製はミツナガ
（Mitsunaga）等、Nucl.Acids. Res.、22:1948〜1953、
1994年によって記載された方法に従った。 ゲル移動性シフトアッセイ
せたコメ懸濁細胞約５ｇ（新たな重量）を液体窒素中で
粉末化し、そしてホモジネーション緩衝液（400mＭ マ
ンニトール、50mＭ トリス-ＨＣl、ｐＨ 7.9、５mＭ Ｍ
gＣl２、１mＭ ＥＤＴＡ、0.1％ＢＳＡ、0.1％ＮＰ-4
0、５mＭ ＤＴＴ及び１mＭ ＰＭＳＦ）200ml中でホモジ
ネートした。この段階の後、核抽出物の調製はミツナガ
（Mitsunaga）等、Nucl.Acids. Res.、22:1948〜1953、
1994年によって記載された方法に従った。 ゲル移動性シフトアッセイ
【００５９】オリゴヌクレオチドＦ１からＦ５までを合
成し、それらの配列を図７Ａに示した。プローブとして
使用したＦ２は、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼとγ-
３２Ｐ-ＡＴＰ（5000Ｃi／mmol）を使用して５'ヒドロ
キシル末端をリン酸化して調製した。ＤＮＡ-タンパク
質結合反応は、17mＭヘペス（Ｈepes）、ｐＨ 7.9、60m
Ｍ ＫＣl、7.5mＭ ＭgＣl２、0.12mＭ ＥＤＴＡ、17％
グリセリン、1.2mＭ ＤＴＴ、ポリ-(ｄＩ−ｄＣ）（Pha
rmacia）0.5μg及び競合ＤＮＡ ３又は10ng（それぞ
れ、プローブの150倍又は500倍量）を含有する溶液20μ
l中20μgの核抽出物と共に0.02ngの標識Ｆ２をインキュ
ベーションして実施した。このアッセイ混合物を室温で
20分間インキュベートした。この段階の後、アッセイ混
合物の電気泳動及びゲルのオートラジオグラフィーはミ
ツナガ等、Nucl. Acids. Res.、22:1948〜1953、1994年
によって記載された方法に従った。 結果 （１）α-アミラーゼ遺伝子プロモーターの配列分析
成し、それらの配列を図７Ａに示した。プローブとして
使用したＦ２は、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼとγ-
３２Ｐ-ＡＴＰ（5000Ｃi／mmol）を使用して５'ヒドロ
キシル末端をリン酸化して調製した。ＤＮＡ-タンパク
質結合反応は、17mＭヘペス（Ｈepes）、ｐＨ 7.9、60m
Ｍ ＫＣl、7.5mＭ ＭgＣl２、0.12mＭ ＥＤＴＡ、17％
グリセリン、1.2mＭ ＤＴＴ、ポリ-(ｄＩ−ｄＣ）（Pha
rmacia）0.5μg及び競合ＤＮＡ ３又は10ng（それぞ
れ、プローブの150倍又は500倍量）を含有する溶液20μ
l中20μgの核抽出物と共に0.02ngの標識Ｆ２をインキュ
ベーションして実施した。このアッセイ混合物を室温で
20分間インキュベートした。この段階の後、アッセイ混
合物の電気泳動及びゲルのオートラジオグラフィーはミ
ツナガ等、Nucl. Acids. Res.、22:1948〜1953、1994年
によって記載された方法に従った。 結果 （１）α-アミラーゼ遺伝子プロモーターの配列分析
【００６０】αＡmＹ3（Ｒamy3Ｄ）（Huang等、Plant M
ol. Biol.、23:737〜747、1993年）、αＡmＹ7（Ｒamy1
Ａ）（Itoh等、Plant Physiol.、107:25〜31、1995年）
及びαＡmＹ8（Ｒamy3Ｅ）（Chan等、Plant Mol. Bio
l.、22:491〜506、1993年; Chan等、J. Biol. Chem.、2
69:17635〜17641、1994年）のプロモーター領域はトラ
ンスジェニックコメのＧＵＳリポーター遺伝子発現の糖
又はホルモン調節に介在することが示されているが、こ
れらα-アミラーゼ遺伝子の転写開始部位は正確にはマ
ップ化されていない。ここで、αＡmy3の転写開始部位
はＴＡＴＡボックスの下流28bpにそしてαＡmy7及びα
Ａmy8の転写開始部位は29bpにマップ化し、そして＋１
と呼称した（図１Ａ）。プロモーター領域の精査によっ
て10bp（ＴＴボックス）と31bp（ＧＣボックス）の２つ
の保存される配列要素（Huang等、Nucl. Acids. Res.、
18:7007〜7014、1990ｂ）が明らかにされ、これらはα
Ａmy3とαＡmy8プロモーター中には存在しているがαＡ
my7プロモーター中には存在していない（図１Ｂ）。Ｇ
Ａ抑制要素（ＧＡＲＥ）（Gubler及びJacobsen、1992
年;Rogers等、1994年）はαＡmy7中には存在している
が、αＡmy3及びαＡmy8プロモーター中には存在してい
ない。Ｇボックス配列（ＡＣＧＴコアを含有している）
はαＡmy3プロモーターのヌクレオチド−141と−132の
間及びαＡmy8プロモーターのヌクレオチド−334と−32
5の間に位置している。Ｇボックスは、幾つかの環境及
び生理学的刺激に応答する多様な遺伝子のプロモーター
中に存在している（Devetten等、Int. J. Biochem.、2
6:1055〜1068、1994年）。αＡmy3プロモーター中には
６bpの別の配列（ＴＡＴＣＣＡ要素）が２個のコピーと
して存在しているが、αＡmy7及びαＡmy8プロモーター
では１個のコピーとしてしか存在していない。α-アミ
ラーゼ遺伝子発現の糖依存的調節におけるこれら要素の
機能はこれまでには決定されていない。ここで、以下の
試験のモデルとしてαＡmy3プロモーターを選択する。 （２）αＡmy3プロモーターの欠失分析
ol. Biol.、23:737〜747、1993年）、αＡmＹ7（Ｒamy1
Ａ）（Itoh等、Plant Physiol.、107:25〜31、1995年）
及びαＡmＹ8（Ｒamy3Ｅ）（Chan等、Plant Mol. Bio
l.、22:491〜506、1993年; Chan等、J. Biol. Chem.、2
69:17635〜17641、1994年）のプロモーター領域はトラ
ンスジェニックコメのＧＵＳリポーター遺伝子発現の糖
又はホルモン調節に介在することが示されているが、こ
れらα-アミラーゼ遺伝子の転写開始部位は正確にはマ
ップ化されていない。ここで、αＡmy3の転写開始部位
はＴＡＴＡボックスの下流28bpにそしてαＡmy7及びα
Ａmy8の転写開始部位は29bpにマップ化し、そして＋１
と呼称した（図１Ａ）。プロモーター領域の精査によっ
て10bp（ＴＴボックス）と31bp（ＧＣボックス）の２つ
の保存される配列要素（Huang等、Nucl. Acids. Res.、
18:7007〜7014、1990ｂ）が明らかにされ、これらはα
Ａmy3とαＡmy8プロモーター中には存在しているがαＡ
my7プロモーター中には存在していない（図１Ｂ）。Ｇ
Ａ抑制要素（ＧＡＲＥ）（Gubler及びJacobsen、1992
年;Rogers等、1994年）はαＡmy7中には存在している
が、αＡmy3及びαＡmy8プロモーター中には存在してい
ない。Ｇボックス配列（ＡＣＧＴコアを含有している）
はαＡmy3プロモーターのヌクレオチド−141と−132の
間及びαＡmy8プロモーターのヌクレオチド−334と−32
5の間に位置している。Ｇボックスは、幾つかの環境及
び生理学的刺激に応答する多様な遺伝子のプロモーター
中に存在している（Devetten等、Int. J. Biochem.、2
6:1055〜1068、1994年）。αＡmy3プロモーター中には
６bpの別の配列（ＴＡＴＣＣＡ要素）が２個のコピーと
して存在しているが、αＡmy7及びαＡmy8プロモーター
では１個のコピーとしてしか存在していない。α-アミ
ラーゼ遺伝子発現の糖依存的調節におけるこれら要素の
機能はこれまでには決定されていない。ここで、以下の
試験のモデルとしてαＡmy3プロモーターを選択する。 （２）αＡmy3プロモーターの欠失分析
【００６１】ルシフェラーゼ遺伝子のコード化領域に融
合したαＡmy3遺伝子の１kbプロモーター領域（900bpの
プロモーター＋91bpの非翻訳配列）を含有するＤＮＡ構
築物(ｐ3Ｌuc.3）を作成した（図２Ａ）。この構築物は
コメ懸濁細胞中に安定的にトランスフェクションされ、
ルシフェラーゼ発現を糖依存的に抑制することが見い出
された。糖依存的調節に関係するαＡmy3プロモーター
中の配列を同定するために、αＡmy3プロモーターの５'
末端に累進的欠失を有する３つの構築物（ｐ3Ｌuc.4、
ｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6）を作成した（図２Ａ）。得ら
れた構築物はコメプロトプラストにおける一時的発現に
よって分析した。
合したαＡmy3遺伝子の１kbプロモーター領域（900bpの
プロモーター＋91bpの非翻訳配列）を含有するＤＮＡ構
築物(ｐ3Ｌuc.3）を作成した（図２Ａ）。この構築物は
コメ懸濁細胞中に安定的にトランスフェクションされ、
ルシフェラーゼ発現を糖依存的に抑制することが見い出
された。糖依存的調節に関係するαＡmy3プロモーター
中の配列を同定するために、αＡmy3プロモーターの５'
末端に累進的欠失を有する３つの構築物（ｐ3Ｌuc.4、
ｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6）を作成した（図２Ａ）。得ら
れた構築物はコメプロトプラストにおける一時的発現に
よって分析した。
【００６２】出願人は、５mＭグルコースでコメプロト
プラストの飢餓が生じ得ることやコメプロトプラストの
モル浸透圧濃度を維持するためには通常400mＭグルコー
スが必要であることを見い出した。そこで、トランスフ
ェクション後に、５mＭグルコース＋400mＭマンニトー
ルを含有する培地（飢餓）又は400mＭグルコースを含有
する培地（非飢餓）中でプロトプラストを分析した。こ
れらの結果は、転写開始部位の上流の−450のヌクレオ
チド位置までαＡmy3プロモーターを欠失させた（ｐ3Ｌ
uc.4）とき、グルコース飢餓で誘導されるルシフェラー
ゼ発現の値が劇的に低下したことを示している。−274
の位置まで欠失させた（ｐ3Ｌuc.5）とき、発現を更に
低下させた。２つのプロモーター欠失によって発現の絶
対値が劇的に低下したにも拘わらず、グルコース飢餓に
よる発現の誘導倍率は類似する値で維持された。次の17
4bp（−100位まで）の欠失（ｐ3Ｌuc.6）はグルコース
濃度に関係なくルシフェラーゼを発現させなかった。
プラストの飢餓が生じ得ることやコメプロトプラストの
モル浸透圧濃度を維持するためには通常400mＭグルコー
スが必要であることを見い出した。そこで、トランスフ
ェクション後に、５mＭグルコース＋400mＭマンニトー
ルを含有する培地（飢餓）又は400mＭグルコースを含有
する培地（非飢餓）中でプロトプラストを分析した。こ
れらの結果は、転写開始部位の上流の−450のヌクレオ
チド位置までαＡmy3プロモーターを欠失させた（ｐ3Ｌ
uc.4）とき、グルコース飢餓で誘導されるルシフェラー
ゼ発現の値が劇的に低下したことを示している。−274
の位置まで欠失させた（ｐ3Ｌuc.5）とき、発現を更に
低下させた。２つのプロモーター欠失によって発現の絶
対値が劇的に低下したにも拘わらず、グルコース飢餓に
よる発現の誘導倍率は類似する値で維持された。次の17
4bp（−100位まで）の欠失（ｐ3Ｌuc.6）はグルコース
濃度に関係なくルシフェラーゼを発現させなかった。
【００６３】それぞれ274bp及び100bpのαＡmy3プロモ
ーター領域に融合したルシフェラーゼコード化配列を含
有するｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6から得られるフラグメン
トをバイナリーベクター中にサブクローン化し、そして
アグロバクテリウム介在形質転換によってタバコ中にト
ランスフェクションした。各構築物に対して別個のトラ
ンスジェニックタバコ植物を使用して懸濁細胞培養物を
産生させ、そして培養細胞中のルシフェラーゼ発現を分
析した。図２Ｂに示されるように、274bpのプロモータ
ー（ｐ3Ｌuc.5）はルシフェラーゼのグルコース飢餓誘
導発現を付与したが、100bpのプロモーター（ｐ3Ｌuc.
6）はグルコース濃度に関係なく発現させなかった。図
２Ａ及び２Ｂに示した結果は、糖依存的調節に必要なシ
ス要素（単数又は複数）がαＡmy3プロモーターのヌク
レオチド−274とー100の間の領域内に位置していること
を示唆している。
ーター領域に融合したルシフェラーゼコード化配列を含
有するｐ3Ｌuc.5及びｐ3Ｌuc.6から得られるフラグメン
トをバイナリーベクター中にサブクローン化し、そして
アグロバクテリウム介在形質転換によってタバコ中にト
ランスフェクションした。各構築物に対して別個のトラ
ンスジェニックタバコ植物を使用して懸濁細胞培養物を
産生させ、そして培養細胞中のルシフェラーゼ発現を分
析した。図２Ｂに示されるように、274bpのプロモータ
ー（ｐ3Ｌuc.5）はルシフェラーゼのグルコース飢餓誘
導発現を付与したが、100bpのプロモーター（ｐ3Ｌuc.
6）はグルコース濃度に関係なく発現させなかった。図
２Ａ及び２Ｂに示した結果は、糖依存的調節に必要なシ
ス要素（単数又は複数）がαＡmy3プロモーターのヌク
レオチド−274とー100の間の領域内に位置していること
を示唆している。
【００６４】保存されるＧＣボックス、Ｇボックス及び
ＴＡＴＣＣＡ要素はαＡmy3プロモーターのヌクレオチ
ド−172と−105の間に位置していた（図１Ｂ）ので、ヌ
クレオチド−174〜−42の間に内部欠失を有する３つの
構築物を作成した（図２Ａ)。ヌクレオチド−174から−
126まで（ＧＣボックスとＧボックスを含む）の欠失
（ｐ3Ｌuc.7）又は−125から−86まで（ＴＡＴＣＣＡを
含む）の欠失（ｐ3Ｌuc.8）によってルシフェラーゼ活
性の絶対値は激烈に低下したが依然としてグルコース応
答を付与した。驚いたことに、ヌクレオチド−85から−
42までの欠失（ｐ3Ｌuc.9）ではグルコース依存的ルシ
フェラーゼ発現は全長プロモーター（ｐ3Ｌuc.3）の発
現に類似するレベルに回復した。上記の欠失分析によっ
て、αＡmy3プロモーターの高レベルのグルコース飢餓
誘導発現にはヌクレオチド−990と−450の間及びヌクレ
オチド−274と−86の間のプロモーター領域が必要であ
ることが示唆される。 （３）αＡmy3プロモーター中の糖応答配列の機能分析
ＴＡＴＣＣＡ要素はαＡmy3プロモーターのヌクレオチ
ド−172と−105の間に位置していた（図１Ｂ）ので、ヌ
クレオチド−174〜−42の間に内部欠失を有する３つの
構築物を作成した（図２Ａ)。ヌクレオチド−174から−
126まで（ＧＣボックスとＧボックスを含む）の欠失
（ｐ3Ｌuc.7）又は−125から−86まで（ＴＡＴＣＣＡを
含む）の欠失（ｐ3Ｌuc.8）によってルシフェラーゼ活
性の絶対値は激烈に低下したが依然としてグルコース応
答を付与した。驚いたことに、ヌクレオチド−85から−
42までの欠失（ｐ3Ｌuc.9）ではグルコース依存的ルシ
フェラーゼ発現は全長プロモーター（ｐ3Ｌuc.3）の発
現に類似するレベルに回復した。上記の欠失分析によっ
て、αＡmy3プロモーターの高レベルのグルコース飢餓
誘導発現にはヌクレオチド−990と−450の間及びヌクレ
オチド−274と−86の間のプロモーター領域が必要であ
ることが示唆される。 （３）αＡmy3プロモーター中の糖応答配列の機能分析
【００６５】糖依存的調節に必要なシス作用性要素（単
数又は複数）がαＡmy3プロモーターのヌクレオチド−2
74の下流の領域内に位置しているかどうかを決定するた
めに、ヌクレオチド−274と−82の間の種々の領域に及
ぶフラグメントを、図３に示されているようにＣaＭＶ3
5Ｓ（即ち、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓ ＲＮ
Ａ）最小プロモーター-ＡdhI-Ｌuc融合遺伝子（上述）
の上流に挿入した。得られた構築物はコメのプロトプラ
スト中で転写活性を試験した。αＡmy3プロモーター配
列を含有していない基本的な構築物（ｐ35mＡＬuc）の
発現はグルコース飢餓に応答しなかった。ヌクレオチド
−274〜−82（ｐ3Ｌuc.15）又はヌクレオチド−186〜−
82（ｐ3Ｌuc.18）を含有するフラグメントを35Ｓ最小プ
ロモーターの上流に融合させたとき、ルシフェラーゼの
グルコース飢餓誘導発現が高レベルで観察された。αＡ
my3プロモーター中のヌクレオチド−274と−176の間の
領域は、それぞれボックス１、ボックス２及びボックス
３と称される３つのタンパク質結合配列を含有している
（Mitsunaga等、Nucl. Acids. Res.、22:1948〜1953、1
994年）。これら３つの各ボックスは保存されるＧＣＣ
Ｇ Ｇ／Ｃ ＣＧモチーフを含有しており、そしてこれら
はαＡmy3プロモーターの糖依存的調節に関係している
と提案されている（Mitsunaga等、Nucl. Acids. Res.、
22:1948〜1953、1994年）。これら３つのボックスを含
有するプロモーター領域が欠失している（ｐ3Ｌuc.18）
とグルコース飢餓誘導発現が30％増加し、この領域が負
のシス作用性要素を含有していることが示唆された。驚
いたことに、ヌクレオチド−186〜−82を含有するフラ
グメント（「フラグメント−186〜−82」）を35Ｓ最小
プロモーターの上流に逆方向に挿入した（ｐ3Ｌuc.18
Ｒ）とき、グルコース飢餓に応答したルシフェラーゼの
発現は正しい方向に挿入されたプロモーターフラグメン
ト（ｐ3Ｌuc.18）の発現と同程度に高かった。これらの
結果は、ヌクレオチド−186と−82の間の領域が、35Ｓ
最小プロモーター下で高レベルのグルコース飢餓誘導発
現を付与するために必要なシス作用性要素（単数又は複
数）の、全部ではないとしても、大部分を含有している
ことを示している。この領域は糖応答配列（「ＳＲ
Ｓ」）と呼称される。
数又は複数）がαＡmy3プロモーターのヌクレオチド−2
74の下流の領域内に位置しているかどうかを決定するた
めに、ヌクレオチド−274と−82の間の種々の領域に及
ぶフラグメントを、図３に示されているようにＣaＭＶ3
5Ｓ（即ち、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓ ＲＮ
Ａ）最小プロモーター-ＡdhI-Ｌuc融合遺伝子（上述）
の上流に挿入した。得られた構築物はコメのプロトプラ
スト中で転写活性を試験した。αＡmy3プロモーター配
列を含有していない基本的な構築物（ｐ35mＡＬuc）の
発現はグルコース飢餓に応答しなかった。ヌクレオチド
−274〜−82（ｐ3Ｌuc.15）又はヌクレオチド−186〜−
82（ｐ3Ｌuc.18）を含有するフラグメントを35Ｓ最小プ
ロモーターの上流に融合させたとき、ルシフェラーゼの
グルコース飢餓誘導発現が高レベルで観察された。αＡ
my3プロモーター中のヌクレオチド−274と−176の間の
領域は、それぞれボックス１、ボックス２及びボックス
３と称される３つのタンパク質結合配列を含有している
（Mitsunaga等、Nucl. Acids. Res.、22:1948〜1953、1
994年）。これら３つの各ボックスは保存されるＧＣＣ
Ｇ Ｇ／Ｃ ＣＧモチーフを含有しており、そしてこれら
はαＡmy3プロモーターの糖依存的調節に関係している
と提案されている（Mitsunaga等、Nucl. Acids. Res.、
22:1948〜1953、1994年）。これら３つのボックスを含
有するプロモーター領域が欠失している（ｐ3Ｌuc.18）
とグルコース飢餓誘導発現が30％増加し、この領域が負
のシス作用性要素を含有していることが示唆された。驚
いたことに、ヌクレオチド−186〜−82を含有するフラ
グメント（「フラグメント−186〜−82」）を35Ｓ最小
プロモーターの上流に逆方向に挿入した（ｐ3Ｌuc.18
Ｒ）とき、グルコース飢餓に応答したルシフェラーゼの
発現は正しい方向に挿入されたプロモーターフラグメン
ト（ｐ3Ｌuc.18）の発現と同程度に高かった。これらの
結果は、ヌクレオチド−186と−82の間の領域が、35Ｓ
最小プロモーター下で高レベルのグルコース飢餓誘導発
現を付与するために必要なシス作用性要素（単数又は複
数）の、全部ではないとしても、大部分を含有している
ことを示している。この領域は糖応答配列（「ＳＲ
Ｓ」）と呼称される。
【００６６】ＧＣボックスとＧボックスを含有するフラ
グメント−186〜−122の１個のコピー（ｐ3Ｌuc.19）は
顕著な発現低下をもたらしたが、依然としてグルコース
応答を付与した。フラグメント−186〜−122の２個のコ
ピー（ｐ3Ｌuc.19ｘ2）はグルコース飢餓に応答して発
現を増加させた。ＴＡＴＣＣＡ要素を重複して含有する
フラグメント−133〜−82の１個のコピー（ｐ3Ｌuc.4
0）は対照（ｐ35mＡＬuc）と比較してルシフェラーゼの
発現を僅かに上昇させたが、グルコース応答を付与しな
かった。興味深いことに、このフラグメントをタンデム
として反復した（ｐ3Ｌuc.41）とき、グルコース応答は
回復し、そしてルシフェラーゼ活性の絶対値はＧＣボッ
クスとＧボックスを含有するプロモーター（ｐ3Ｌuc.19
又はｐ3Ｌuc.19ｘ2）の絶対値より高かった。ＴＡＴＡ
ボックスに関してＴＡＴＣＣＡ要素の配列又は位置が重
要であるかどうかを試験するために、重複したＴＡＴＣ
ＣＡ要素の変異を発生させた。結果は、重複したＴＡＴ
ＣＣＡ要素の下流（ｐ3Ｌuc.41m1）か又は上流（ｐ3Ｌu
c.41m2）のコピーの変異は発現を低下させることを示し
た。 （４）ＴＡＴＣＣＡ要素を含有する52bpフラグメントは
転写活性を高める
グメント−186〜−122の１個のコピー（ｐ3Ｌuc.19）は
顕著な発現低下をもたらしたが、依然としてグルコース
応答を付与した。フラグメント−186〜−122の２個のコ
ピー（ｐ3Ｌuc.19ｘ2）はグルコース飢餓に応答して発
現を増加させた。ＴＡＴＣＣＡ要素を重複して含有する
フラグメント−133〜−82の１個のコピー（ｐ3Ｌuc.4
0）は対照（ｐ35mＡＬuc）と比較してルシフェラーゼの
発現を僅かに上昇させたが、グルコース応答を付与しな
かった。興味深いことに、このフラグメントをタンデム
として反復した（ｐ3Ｌuc.41）とき、グルコース応答は
回復し、そしてルシフェラーゼ活性の絶対値はＧＣボッ
クスとＧボックスを含有するプロモーター（ｐ3Ｌuc.19
又はｐ3Ｌuc.19ｘ2）の絶対値より高かった。ＴＡＴＡ
ボックスに関してＴＡＴＣＣＡ要素の配列又は位置が重
要であるかどうかを試験するために、重複したＴＡＴＣ
ＣＡ要素の変異を発生させた。結果は、重複したＴＡＴ
ＣＣＡ要素の下流（ｐ3Ｌuc.41m1）か又は上流（ｐ3Ｌu
c.41m2）のコピーの変異は発現を低下させることを示し
た。 （４）ＴＡＴＣＣＡ要素を含有する52bpフラグメントは
転写活性を高める
【００６７】図３のｐ3Ｌuc.40とｐ3Ｌuc.41によっても
たらされるルシフェラーゼ活性の比較によって、ヌクレ
オチド−133〜−82を包含する52bpフラグメントが転写
を高めることが示唆される。このフラグメント内のＴＡ
ＴＣＣＡ要素の変異は転写を低下させ、転写を高めるた
めにはＴＡＴＣＣＡ要素が必須であることが確認され
た。転写を高める際のこの要素の機能を更に証明するた
めに、52bpフラグメントの複数のコピーを35Ｓ最小プロ
モーターの上流に融合させ、そしてルシフェラーゼ活性
をアッセイした。図４に示されるように、52bpフラグメ
ントの重複によって飢餓誘導性のルシフェラーゼ活性は
上昇した。この上昇はこのフラグメントのコピーを更に
追加したとき、ほぼ直線状になった。非飢餓細胞のルシ
フェラーゼ活性も52bpフラグメントのコピーの追加によ
って直線的に上昇し、そしてその結果、グルコース飢餓
によるルシフェラーゼ活性の誘導倍率は平行的には高め
られなかった。これらの結果は、52bpフラグメントがグ
ルコース濃度に関係なく最小プロモーターの転写を高め
ることを示唆している。 （５）ＳＲＳは糖非感受性プロモーター中で転写エンハ
ンサーとして作用する
たらされるルシフェラーゼ活性の比較によって、ヌクレ
オチド−133〜−82を包含する52bpフラグメントが転写
を高めることが示唆される。このフラグメント内のＴＡ
ＴＣＣＡ要素の変異は転写を低下させ、転写を高めるた
めにはＴＡＴＣＣＡ要素が必須であることが確認され
た。転写を高める際のこの要素の機能を更に証明するた
めに、52bpフラグメントの複数のコピーを35Ｓ最小プロ
モーターの上流に融合させ、そしてルシフェラーゼ活性
をアッセイした。図４に示されるように、52bpフラグメ
ントの重複によって飢餓誘導性のルシフェラーゼ活性は
上昇した。この上昇はこのフラグメントのコピーを更に
追加したとき、ほぼ直線状になった。非飢餓細胞のルシ
フェラーゼ活性も52bpフラグメントのコピーの追加によ
って直線的に上昇し、そしてその結果、グルコース飢餓
によるルシフェラーゼ活性の誘導倍率は平行的には高め
られなかった。これらの結果は、52bpフラグメントがグ
ルコース濃度に関係なく最小プロモーターの転写を高め
ることを示唆している。 （５）ＳＲＳは糖非感受性プロモーター中で転写エンハ
ンサーとして作用する
【００６８】ＳＲＳは方向非依存的態様で35Ｓ最小プロ
モーター下で高レベルのグルコース飢餓誘導発現を付与
し、ＳＲＳは転写エンハンサーとして機能し得ることが
示唆された。これを確認するために、コメＡct1プロモ
ーター（McElroy等、Plant Cell、2:163〜171、1990
年）のＥcoＲI部位（転写開始部位の上流−459bp）にＳ
ＲＳを１個、２個及び３個のタンデムなコピーとして挿
入した。野生型及びＳＲＳ含有Ａct1プロモーターは図
５に示されているようにＬuc遺伝子の上流に融合させ
た。次に、コメのプロトプラスト中でこれら構築物の転
写活性を試験した。対照構築物（ｐ35mＡＬuc）による
ルシフェラーゼ発現は検出されなかった。高いグルコー
ス濃度では、野生型Ａct1プロモーター（ｐＡctＬuc）
下のルシフェラーゼ発現は１個〜３個のＳＲＳコピーを
含有するＡct1プロモーター下での発現に類似してい
た。グルコース飢餓細胞では、１個のＳＲＳコピーを含
有するＡct1プロモーター（ｐ3Ｌuc.37＋）下での発現
は野生型Ａct1プロモーター下での発現と比較したとき
２倍高まった。驚いたことに、ＳＲＳの重複（ｐ3Ｌuc.
37++）はグルコース飢餓による誘導倍率を高め、そして
誘導倍率はＳＲＳコピーをより多く添加した（ｐ3Ｌuc.
37+++）とき、ほぼ直線的に高くなった。これらの結果
は、プロモーターがＳＲＳのコピーを含有している場
合、Ａct1プロモーター下でのルシフェラーゼの発現が
グルコース飢餓によって誘導可能になることを証明して
いる。 （６）αＡmy3プロモーター中のＳＲＳのリンカースキ
ャニング変異分析
モーター下で高レベルのグルコース飢餓誘導発現を付与
し、ＳＲＳは転写エンハンサーとして機能し得ることが
示唆された。これを確認するために、コメＡct1プロモ
ーター（McElroy等、Plant Cell、2:163〜171、1990
年）のＥcoＲI部位（転写開始部位の上流−459bp）にＳ
ＲＳを１個、２個及び３個のタンデムなコピーとして挿
入した。野生型及びＳＲＳ含有Ａct1プロモーターは図
５に示されているようにＬuc遺伝子の上流に融合させ
た。次に、コメのプロトプラスト中でこれら構築物の転
写活性を試験した。対照構築物（ｐ35mＡＬuc）による
ルシフェラーゼ発現は検出されなかった。高いグルコー
ス濃度では、野生型Ａct1プロモーター（ｐＡctＬuc）
下のルシフェラーゼ発現は１個〜３個のＳＲＳコピーを
含有するＡct1プロモーター下での発現に類似してい
た。グルコース飢餓細胞では、１個のＳＲＳコピーを含
有するＡct1プロモーター（ｐ3Ｌuc.37＋）下での発現
は野生型Ａct1プロモーター下での発現と比較したとき
２倍高まった。驚いたことに、ＳＲＳの重複（ｐ3Ｌuc.
37++）はグルコース飢餓による誘導倍率を高め、そして
誘導倍率はＳＲＳコピーをより多く添加した（ｐ3Ｌuc.
37+++）とき、ほぼ直線的に高くなった。これらの結果
は、プロモーターがＳＲＳのコピーを含有している場
合、Ａct1プロモーター下でのルシフェラーゼの発現が
グルコース飢餓によって誘導可能になることを証明して
いる。 （６）αＡmy3プロモーター中のＳＲＳのリンカースキ
ャニング変異分析
【００６９】ＳＲＳがＡct1及び35Ｓ最小プロモーター
下で高レベルのグルコース飢餓誘導性発現を付与するこ
とが分かると、次の段階は糖応答性に関係するシス作用
性要素の位置を一層正確に決定することであった。Ｅco
ＲI部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含有する種々の10bpフラグ
メントを個々にｐ3Ｌuc.18に導入してＳＲＳ内の種々の
領域を置換することによって、図６Ａに示されているよ
うにｐ3Ｌuc.28からｐ3Ｌuc.36までの構築物が得られ
た。次に、これらの構築物のルシフェラーゼ発現を試験
した。
下で高レベルのグルコース飢餓誘導性発現を付与するこ
とが分かると、次の段階は糖応答性に関係するシス作用
性要素の位置を一層正確に決定することであった。Ｅco
ＲI部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含有する種々の10bpフラグ
メントを個々にｐ3Ｌuc.18に導入してＳＲＳ内の種々の
領域を置換することによって、図６Ａに示されているよ
うにｐ3Ｌuc.28からｐ3Ｌuc.36までの構築物が得られ
た。次に、これらの構築物のルシフェラーゼ発現を試験
した。
【００７０】図６Ｂに示されているように、ＳＲＳ内の
リンカー置換体は全てルシフェラーゼ発現に効果を有し
ていた。ＧＣボックスはそれぞれＧＣ１、ＧＣ２及びＧ
Ｃ３ボックスと呼称されるＧＣに富む３つのサブドメイ
ンに分割することができる。ＧＣ２ボックスとＧＣ３ボ
ックスは各々同一の９bp配列ＣＣＧＡＣＧＣＧＧを含有
している。ＧＣ２ボックスの変異（ｐ3Ｌuc.29）及びＧ
Ｃ３ボックスの変異（ｐ3Ｌuc.30）は、野生型ＳＲＳ配
列で調節される発現と比較して、発現をそれぞれ40％及
び60％低下させた。重複したＴＡＴＣＣＡ要素における
２種類のリンカー置換体（ｐ3Ｌuc.33及びｐ3Ｌuc.34）
は各々、グルコース飢餓誘導性発現値をそれぞれ対照
（ｐ3Ｌuc.18）の12％及び８％にまで劇的に低下させ
た。Ｇボックスの変異（ｐ3Ｌuc.31）は発現を80％低下
させた。これらの結果はＳＲＳ内の配列が全て必要であ
ること及びグルコースによって遺伝子転写を高レベルで
誘導するためにはＧＣ３ボックス、Ｇボックス及びＴＡ
ＴＣＣＡ要素が最も重要であることを示している。 （７）ＳＲＳ中のシス作用性要素と核タンパク質の結合
リンカー置換体は全てルシフェラーゼ発現に効果を有し
ていた。ＧＣボックスはそれぞれＧＣ１、ＧＣ２及びＧ
Ｃ３ボックスと呼称されるＧＣに富む３つのサブドメイ
ンに分割することができる。ＧＣ２ボックスとＧＣ３ボ
ックスは各々同一の９bp配列ＣＣＧＡＣＧＣＧＧを含有
している。ＧＣ２ボックスの変異（ｐ3Ｌuc.29）及びＧ
Ｃ３ボックスの変異（ｐ3Ｌuc.30）は、野生型ＳＲＳ配
列で調節される発現と比較して、発現をそれぞれ40％及
び60％低下させた。重複したＴＡＴＣＣＡ要素における
２種類のリンカー置換体（ｐ3Ｌuc.33及びｐ3Ｌuc.34）
は各々、グルコース飢餓誘導性発現値をそれぞれ対照
（ｐ3Ｌuc.18）の12％及び８％にまで劇的に低下させ
た。Ｇボックスの変異（ｐ3Ｌuc.31）は発現を80％低下
させた。これらの結果はＳＲＳ内の配列が全て必要であ
ること及びグルコースによって遺伝子転写を高レベルで
誘導するためにはＧＣ３ボックス、Ｇボックス及びＴＡ
ＴＣＣＡ要素が最も重要であることを示している。 （７）ＳＲＳ中のシス作用性要素と核タンパク質の結合
【００７１】ＴＡＴＣＣＡ要素を含有する52bpフラグメ
ントはグルコース飢餓誘導性転写活性を高め（図４）そ
してＴＡＴＣＣＡ要素は糖依存的調節を付与するために
必須である（図５）ので、コメ懸濁細胞から得られる核
タンパク質がＴＡＴＣＣＡ要素と結合するか否かを試験
した。種々のＳＲＳ領域を包含するＤＮＡフラグメント
を合成し、Ｆ１〜Ｆ５と呼称した（図７）。これらのフ
ラグメントが、スクロースの存在下又は非存在下で増殖
したコメ懸濁細胞から得られる核タンパク質抽出物と相
互作用する能力についてアッセイした。プローブとして
Ｆ２（これはＴＡＴＣＣＡ要素を含有している）を使用
するゲル移動性シフトアッセイで、上記核抽出物がスク
ロースの存在下（「＋Ｓ」）で増殖させた細胞に由来す
るのかそれとも非存在下（「−Ｓ」）で増殖させた細胞
に由来するのかに関係なく、２種類のＤＮＡ−タンパク
質コンプレックス（Ｃ１及びＣ２）が観察された。しか
しながら、バンドの強度は＋Ｓ細胞より−Ｓ細胞の方が
５倍高かった。Ｆ２自体の500倍過剰又はＦ２を包含す
るＦ５の150倍過剰でＣ１及びＣ２と競合した。
ントはグルコース飢餓誘導性転写活性を高め（図４）そ
してＴＡＴＣＣＡ要素は糖依存的調節を付与するために
必須である（図５）ので、コメ懸濁細胞から得られる核
タンパク質がＴＡＴＣＣＡ要素と結合するか否かを試験
した。種々のＳＲＳ領域を包含するＤＮＡフラグメント
を合成し、Ｆ１〜Ｆ５と呼称した（図７）。これらのフ
ラグメントが、スクロースの存在下又は非存在下で増殖
したコメ懸濁細胞から得られる核タンパク質抽出物と相
互作用する能力についてアッセイした。プローブとして
Ｆ２（これはＴＡＴＣＣＡ要素を含有している）を使用
するゲル移動性シフトアッセイで、上記核抽出物がスク
ロースの存在下（「＋Ｓ」）で増殖させた細胞に由来す
るのかそれとも非存在下（「−Ｓ」）で増殖させた細胞
に由来するのかに関係なく、２種類のＤＮＡ−タンパク
質コンプレックス（Ｃ１及びＣ２）が観察された。しか
しながら、バンドの強度は＋Ｓ細胞より−Ｓ細胞の方が
５倍高かった。Ｆ２自体の500倍過剰又はＦ２を包含す
るＦ５の150倍過剰でＣ１及びＣ２と競合した。
【００７２】Ｆ３（これはＧボックス及びＴＡＴＣＣＡ
要素の５'フランキング配列を含有する）を使用するゲ
ル移動性シフトアッセイでは、上記の核抽出物が＋Ｓ細
胞に由来するのかそれとも−Ｓ細胞に由来するのかに関
係なくＤＮＡ−タンパク質コンプレックス（Ｃ３）が観
察された。しかしながら、バンドの強度は−Ｓ細胞より
＋Ｓ細胞の方が4.5倍高かった。Ｆ３自体若しくはＦ４
の500倍過剰又はＦ５の150倍過剰でＣ３と競合した。Ｆ
３は７bp配列ＴＴＴＡＴＴＧ（ヌクレオチド−126〜−1
20）を含有しており、この配列はＦ４及びＦ５中にも存
在している（ヌクレオチド−99〜−93）ので、Ｃ３は核
抽出物中の成分がこの７bp配列と結合することによって
形成されたと考えられる。Ｆ２はＣ３に対して僅かに競
合するが、その理由はおそらくこれが、７bp配列の一部
分と重複する４bp配列ＡＴＴＧを含有している（図７）
ためである。これらの結果は、コメ懸濁細胞から得られ
る核タンパク質がＴＡＴＣＣＡ要素及びそのフランキン
グ配列と配列特異的態様及び糖依存的態様で結合するこ
とを示している。
要素の５'フランキング配列を含有する）を使用するゲ
ル移動性シフトアッセイでは、上記の核抽出物が＋Ｓ細
胞に由来するのかそれとも−Ｓ細胞に由来するのかに関
係なくＤＮＡ−タンパク質コンプレックス（Ｃ３）が観
察された。しかしながら、バンドの強度は−Ｓ細胞より
＋Ｓ細胞の方が4.5倍高かった。Ｆ３自体若しくはＦ４
の500倍過剰又はＦ５の150倍過剰でＣ３と競合した。Ｆ
３は７bp配列ＴＴＴＡＴＴＧ（ヌクレオチド−126〜−1
20）を含有しており、この配列はＦ４及びＦ５中にも存
在している（ヌクレオチド−99〜−93）ので、Ｃ３は核
抽出物中の成分がこの７bp配列と結合することによって
形成されたと考えられる。Ｆ２はＣ３に対して僅かに競
合するが、その理由はおそらくこれが、７bp配列の一部
分と重複する４bp配列ＡＴＴＧを含有している（図７）
ためである。これらの結果は、コメ懸濁細胞から得られ
る核タンパク質がＴＡＴＣＣＡ要素及びそのフランキン
グ配列と配列特異的態様及び糖依存的態様で結合するこ
とを示している。
【００７３】本発明はその詳細な説明と共にに記載した
が、上述の説明は本発明を説明するように意図したもの
であって本発明の範囲を限定するように意図したもので
はなく、そして本発明の範囲は前記特許請求の範囲によ
って特定されると理解すべきである。
が、上述の説明は本発明を説明するように意図したもの
であって本発明の範囲を限定するように意図したもので
はなく、そして本発明の範囲は前記特許請求の範囲によ
って特定されると理解すべきである。
【００７４】他の特徴、利点及び修正は前記特許請求の
範囲の範囲内である。
範囲の範囲内である。
【００７５】
【発明の効果】本発明により、穀類α-アミラーゼ遺伝
子から誘導される糖応答性エンハンサーが提供された。
また、このようなエンハンサーを含有する発現ベクター
及び他の単離ＤＮＡ、並びにこれら発現ベクターの使用
が提供された。これにより、糖飢餓誘導性転写効率を遺
伝子内に挿入されたエンハンサーのコピー数と共に直線
的に上昇させることが可能である。また、このようなエ
ンハンサーを使用して、糖枯渇又はジベレリン酸含有環
境に暴露される被子植物細胞中で外来遺伝子の発現を高
めることができる。
子から誘導される糖応答性エンハンサーが提供された。
また、このようなエンハンサーを含有する発現ベクター
及び他の単離ＤＮＡ、並びにこれら発現ベクターの使用
が提供された。これにより、糖飢餓誘導性転写効率を遺
伝子内に挿入されたエンハンサーのコピー数と共に直線
的に上昇させることが可能である。また、このようなエ
ンハンサーを使用して、糖枯渇又はジベレリン酸含有環
境に暴露される被子植物細胞中で外来遺伝子の発現を高
めることができる。
【００７６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Science Council <120> SUGAR-RESPONSIVE ENHANCERS IN ALPHA-AMILASE GENES <130> TT-101 <140> <141> <150> TW-87103633 <151> 1998-03-12 <160> 53 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 105 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 1 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 2 gccatgcttt attgccttat ccatatccac gccatttatt gtggtcgtct ct 52 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 3 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttat 65 <210> 4 <211> 128 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 4 tatatatgcc ccccgacgtc gaggtcattc gccacgaaca catcgatcat ccatcatcta 60 caagagatcg atcagtagtg gttagcagca actcactatc gaacacggtt tcagcttaca 120 cagatatg 128 <210> 5 <211> 109 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 5 tataaatacc tgaccagaca cacccaggag cttcatcaat catccatctc cgaagtgtgt 60 ctgcagcatg caggtgctga acaccatggt gaacaaacac ttcttgtcc 109 <210> 6 <211> 188 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 6 tataaataga ggccagttca ggcaatgcaa gagcagagaa gcagagtaca gcaggcagct 60 cttcttctct ttgcgaaggt tggctacttg gccagccatt aggaaacaag ttagtttgga 120 gaagaagcag agttgagact gcatttgcat tgctctgtag ccatgggcaa gcaccatgtc 180 accctgtg 188 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 7 gagaccgggc cccgacgcgg ccgacgcggc g 31 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 8 tatccatatc ca 12 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA (double-stranded, linear form) <400> 9 gagagctcgc gccgcctcga tcggcgcggc g 31 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 10 ataacaaact ccgg 14 <210> 11 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 11 atcccgtcgc cttacgaatt catccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 12 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 12 atcccgtcgc cttggagacc ggggtgaatt catgccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 13 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 13 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcgctgaatt catcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 14 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 14 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggatgaatt ccagccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 15 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 15 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtgtagaatt 60 ccgattgcct tatccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 16 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 16 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttgcgaatt ccgccatatc cacgccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 17 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 17 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tattaggaat tcggccattt attgtggtcg tctct 105 <210> 18 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 18 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacctagaat tcggtggtcg tctct 105 <210> 19 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of SRS that contains linker-scan mutation (double-stranded, linear form). <400> 19 atcccgtcgc cttggagacc gggccccgac gcggccgacg cggcgcctac gtggccatgc 60 tttattgcct tatccatatc cacgccattt attacgaatt cagct 105 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 20 agaccgggcc ccgacgcggc cgacgcggcg 30 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 21 attgccttat ccatatccac 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 22 cctacgtggc catgctttat tgcct 25 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 23 cgccatttat tgtggtcgtc tct 23 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 24 gccatgcttt attgccttat ccatatccac gccatttatt gtggtcgtct ct 52 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 25 atcttcaacc acctgtgcta 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 26 gtggatagaa ttgccatgt 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 27 aaatggctcg ccttatcca 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 28 atttattgtg gtcgtctct 19 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 29 atctgtgtaa gctgattggc a 21 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 30 gtcgccttgg attgccttat ccata 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 31 gccatgcttt tctcctgatc attct 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 32 tgtggtcgtc cggtgttcta tatat 25 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 33 atcccgtcgc cttggaga 18 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 34 agagacgacc acaataaat 19 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 35 ataaagcatg gccacgta 18 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 36 cctccatcca agatggtacc ggataaggcg 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 37 gcctgaggca tcatctagag gtctcctcct 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 38 aaggcgacgg tgctatgcat cgtgatcgcg 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 39 cggccgcgtc tacaagctta ctccaaggcg 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 40 tattgcctct cggatccagc cgccatttat 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 41 cccggtctcc agaattcact gatgcggcgg 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 42 cgcgtcgggg atgaattcgt aaggcgacgg 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 43 ccgcgtcggc atgaattcac cccggtctcc 30 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 44 cacgtaggcc atgaattcgt cgccgtcggg gg 32 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 45 aaagcatggc tggaattcat ccgcgtcggc 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 46 ataaggcaat cggaattcta cacgtaggcg 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 47 gtggatatgg cggaattcgc aaagcatggc 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 48 aataaatggc cgaattccta ataaggcaat 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 49 agacgaccac cgaattctag gtggatatgg 30 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 50 tgatccagga gctgaattcg taataaatgg c 31 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 51 tcactcgagg ccatgcttta ttgcctt 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 52 tccatcgatg ccatgcttta ttgcctt 27 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: An artificially synthesized origonucleotide sequence (single-stranded, linear form). <400> 53 gccatcgata gagacgacca caataaa 27
【図１】図１ＡはコメαＡmy3、αＡmy7及びαＡmy8の
プロモーター領域（配列番号:４〜６）のヌクレオチド
配列比較を示す。図１Ｂは、コメαＡmy3、αＡmy7及び
αＡmy8のプロモーター領域の保存される種々のモチー
フ（配列番号：７〜10）の位置を示す概略図である。
プロモーター領域（配列番号:４〜６）のヌクレオチド
配列比較を示す。図１Ｂは、コメαＡmy3、αＡmy7及び
αＡmy8のプロモーター領域の保存される種々のモチー
フ（配列番号：７〜10）の位置を示す概略図である。
【図２】図２Ａは、コメαＡmy3プロモーター中に種々
の欠失を有している発現構築物で形質転換したコメプロ
トプラストのルシフェラーゼ活性を示す図である。これ
らの各プラスミドはｐＵＧＩを使用してコメプロトプラ
スト中にコトランスフェクションさせた。誤差の棒印は
各構築物の３つの重複物の標準誤差を示す。「Ｘ」は増
加倍率を示す。図２Ｂは、ｐＡ3Ｌuc.5及びｐＡ3Ｌuc.6
を含有するトランスジェニックタバコ懸濁細胞のルシフ
ェラーゼ活性を示す図である。誤差の棒印は各構築物の
10個の独立したトランスジェニック細胞系から得られる
ルシフェラーゼ活性の標準誤差を示す。
の欠失を有している発現構築物で形質転換したコメプロ
トプラストのルシフェラーゼ活性を示す図である。これ
らの各プラスミドはｐＵＧＩを使用してコメプロトプラ
スト中にコトランスフェクションさせた。誤差の棒印は
各構築物の３つの重複物の標準誤差を示す。「Ｘ」は増
加倍率を示す。図２Ｂは、ｐＡ3Ｌuc.5及びｐＡ3Ｌuc.6
を含有するトランスジェニックタバコ懸濁細胞のルシフ
ェラーゼ活性を示す図である。誤差の棒印は各構築物の
10個の独立したトランスジェニック細胞系から得られる
ルシフェラーゼ活性の標準誤差を示す。
【図３】図３は、最小プロモーターにグルコース飢餓誘
導性を付与する糖応答性配列を同定する機能分析から得
られた結果を示す図である。この図にはＧボックス、Ｇ
Ｃボックス及びＴＡＴＣＣＡ要素のような種々のモチー
フが示されている。
導性を付与する糖応答性配列を同定する機能分析から得
られた結果を示す図である。この図にはＧボックス、Ｇ
Ｃボックス及びＴＡＴＣＣＡ要素のような種々のモチー
フが示されている。
【図４】図４は、コメαＡmy3プロモーター領域のヌク
レオチド−133から−82に相当する配列番号:３の糖依存
的転写増強効果を示す図である。これら構築物の幾つか
は配列番号:３のタンデムなコピーを含有している。
レオチド−133から−82に相当する配列番号:３の糖依存
的転写増強効果を示す図である。これら構築物の幾つか
は配列番号:３のタンデムなコピーを含有している。
【図５】図５はＳＲＳ（即ち、配列番号：１）が糖上方
調節Ａct1プロモーターを糖下方調節プロモーターに変
換することを示す図である。試験した構築物は１個から
３個のＳＲＳコピーを含有している。
調節Ａct1プロモーターを糖下方調節プロモーターに変
換することを示す図である。試験した構築物は１個から
３個のＳＲＳコピーを含有している。
【図６】図６Ａは種々のリンカースキャニング変異を有
するＳＲＳの配列（配列番号:１及び11〜19）を示す。
最上部の配列は野生型である。図６Ｂは、ＳＲＳ又はそ
の変異体を含有する発現構築物で形質転換したコメプロ
トプラストのルシフェラーゼ活性を示す図である。
するＳＲＳの配列（配列番号:１及び11〜19）を示す。
最上部の配列は野生型である。図６Ｂは、ＳＲＳ又はそ
の変異体を含有する発現構築物で形質転換したコメプロ
トプラストのルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図７】図７は、ゲル移動性シフトアッセイに使用した
数個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：20〜24）の
配列とそのＳＲＳ（配列番号:１）内の位置を示す。
数個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：20〜24）の
配列とそのＳＲＳ（配列番号:１）内の位置を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−143895（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ，Ｖｏｌ. 192（１−２），ｐ．93−108（1996) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．18（23），ｐ. 7007−7014（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A01H 1/00 C12N 5/10 C12P 21/02 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (22)
- 【請求項１】 ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を含む穀
類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーを含ん
でいる単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 上記穀類α-アミラーゼ遺伝子がコメα
Ａmy3である請求項１に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:
１に記載の塩基配列からなる請求項２に記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:
２に記載の塩基配列からなる請求項２に記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 被子植物細胞中でコード化配列の発現を
指令し得るプロモーター、及びＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣ
Ａ配列を含む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エン
ハンサー、を含んでいる発現ベクターであって、上記糖
応答性エンハンサーが糖の非存在下でプロモーターの転
写活性を高めるように上記プロモーターと機能的に結合
している発現ベクター。 - 【請求項６】 上記穀類α-アミラーゼ遺伝子がコメα
Ａmy3である請求項５に記載の発現ベクター。 - 【請求項７】 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:
１に記載の塩基配列からなる請求項６に記載の発現ベク
ター。 - 【請求項８】 上記糖応答性エンハンサーが配列番号:
２に記載の塩基配列からなる請求項６に記載の発現ベク
ター。 - 【請求項９】 シグナルペプチドをコードするシグナル
配列を更に含んでいる請求項５に記載の発現ベクターで
あって、上記シグナル配列が上記プロモーターの下流に
位置している発現ベクター。 - 【請求項１０】 被子植物細胞中でポリペプチドを製造
する方法であって、 （ｉ）上記ポリペプチドのコード化配列、（ii）被子植
物細胞中で上記コード化配列の転写を指令し得るプロモ
ーター、及び（iii）ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を
含む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサー
を含有し、該糖応答性エンハンサーが糖の非存在下で上
記プロモーターの転写活性を高めるように該プロモータ
ーと機能的に結合している発現構築物を提供すること、 被子植物宿主細胞を上記発現構築物で形質転換するこ
と、および上記形質転換宿主細胞を無糖環境に付して上
記ポリペプチドの発現を促進すること、を含む方法。 - 【請求項１１】 上記穀類α-アミラーゼ遺伝子がコメ
αＡmy3である請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 上記糖応答性エンハンサーが配列番
号:１に記載の塩基配列からなる請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１３】 上記糖応答性エンハンサーが配列番
号:２に記載の塩基配列からなる請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１４】 上記発現構築物がシグナルペプチドを
コードするシグナル配列を更に含んでおり、該シグナル
配列が上記プロモーターの下流に位置している請求項１
０に記載の方法。 - 【請求項１５】 被子植物細胞中でポリペプチドを製造
する方法であって、 （ｉ）上記ポリペプチドのコード化配列、（ii）被子植
物細胞中で上記コード化配列の転写を指令し得るプロモ
ーター、及び（iii)ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡ配列を含
む穀類α-アミラーゼ遺伝子の糖応答性エンハンサーを
含有し、ジベレリン酸の非存在下でプロモーターの転写
活性を高めるように該プロモーターと機能的に結合して
いる発現構築物を提供すること、 被子植物宿主細胞を上記発現構築物で形質転換するこ
と、および上記形質転換宿主細胞をジベレリン酸に付し
て上記ポリペプチドの発現を促進すること、を含む方
法。 - 【請求項１６】 上記穀類α-アミラーゼ遺伝子がコメ
αＡmy3である請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 上記糖応答性エンハンサーが配列番
号:１に記載の塩基配列からなる請求項１６に記載の方
法。 - 【請求項１８】 上記糖応答性エンハンサーが配列番
号:２に記載の塩基配列からなる請求項１６に記載の方
法。 - 【請求項１９】 上記発現構築物がシグナルペプチドを
コードするシグナル配列を更に含んでおり、該シグナル
配列が上記プロモーターの下流に位置している請求項１
５に記載の方法。 - 【請求項２０】 請求項５に記載の発現ベクターを含有
している被子植物細胞。 - 【請求項２１】 請求項６に記載の発現ベクターを含有
している被子植物細胞。 - 【請求項２２】 請求項７に記載の発現ベクターを含有
している被子植物細胞。
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|---|---|---|---|
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| TW87103633 | 1998-03-12 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP10986799A Expired - Fee Related JP3305281B2 (ja) | 1998-03-12 | 1999-03-12 | α−アミラーゼ遺伝子中の糖応答性エンハンサー |
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| Country | Link |
|---|---|
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| TW (1) | TW515842B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| TWI334440B (en) | 2003-04-03 | 2010-12-11 | Academia Sinica | Rice glutelin gene promoters |
| JPWO2005001088A1 (ja) * | 2003-06-30 | 2006-10-19 | 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 | 植物培養細胞で糖欠乏により働くプロモーターの有用タンパク質の分泌生産への適用 |
| CN114774420B (zh) * | 2022-04-27 | 2023-09-22 | 扬州大学 | 一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法 |
-
1998
- 1998-03-12 TW TW87103633A patent/TW515842B/zh not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-12 JP JP10986799A patent/JP3305281B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Title |
|---|
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１８（２３），ｐ．７００７−７０１４（１９９０） |
| Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ，Ｖｏｌ．１９２（１−２），ｐ．９３−１０８（１９９６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW515842B (en) | 2003-01-01 |
| JPH11332584A (ja) | 1999-12-07 |
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