KR20010112861A - 만성 류마티스성 관절염질환 유전자와 만성 류마티스성관절염의 진단방법 - Google Patents

Abstract

사람의 염색체에 존재하는 만성 류마티스성 관절염 질환의 유전자와 만성 류마티스성 관절염의 진단방법으로서 배열번호(1)에 그 제2679번째 염기로부터 제2952번째 염기까지의 배열을 나타낸 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하는 프로토 온코진 Dbl유전자의 변이배열에 있어서, 배열번호(1)의 제19번째 염기로부터 제274번째 염기까지의 영역이 배열번호(2)의 배열으로 치환되어 있는 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염질환의 유전자와, 생체시료중에서의 이 질환유전자의 mRNA 또는 그 발현물의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염의 진단방법을 제공한다.

Description

만성 류마티스성 관절염질환 유전자와 만성 류마티스성 관절염의 진단방법{Rheumatoid Arthritis Gene and Method for Diagnosing Rheumatoid Arthritis}

만성 류마티스성 관절염의 원인인 관절염과 관절파괴의 양상, 특히 이들의 병리과정은 각종 연구를 통해 점차 밝혀지고 있지만, 상기 만성 류마티스성 관절염이 속하는 자기면역질환 대부분은 다수의 원인인자가 결합하기 시작하여 질환으로 발전 및 증악하기 때문에 질환의 바른 해명과 적절한 치료를 하기 위해서는 다인자상호작용의 본체가 밝혀져야 한다.

만성 류마티스성 관절염은 세계적으로는 이환율이 1% 이하인 질환이지만(N. Engl. J. Med. 322:1277-1289, 1990), 환자중에서 약 8% 이상이 발증(Cell, 85: 311-318, 1996)한다는 점에서 그 원인인자로서 어떠한 유전적 요인이 상정되고 있다. 그러나, 질환의 유전적 인자를 특정하기 위해 통상 사용되고 있는 분자유전학적 방법이나 유전자 공학적 방법은 자기면역질환에 대해서는 유효하게 기능하고 있지 않다. 왜냐하면, 자기면역질환은 암과 같이 돌연변이를 일으킨 1개 유전자의 이상증식이라는 생물학적으로 단순한 기구에 의해 발증하는 것은 아니기 때문이다. 또 질환의 유전적 기반을 요구하는 종래의 고전적 유전학의 방법은 자기면역질환이 다인자 유전에 의한 것이라는 것을 명확하게 하였지만, 그 내부 또는 본체에 관여하는 것에 대해서는 알 수 없었다. 이와 같이 만성 류마티스성 관절염에 관련되는 유전자에 대해서는 그 실체는 물론 염색체상의 유전자 자리위치조차 파악되지 않고 있는 것이 실상이었다.

이에 본 출원의 발명자들은 마이크로위성마아커(mirco satellite marker)를 사용한 연쇄해석을 만성 류마티스성 관절염 환자 및 그 혈연자에 대해 실시함으로써 만성 류마티스성 관절염 유전자가 위치하는 3개의 장소에 유전자 자리를 특정하고(International Immunology 10(12): 1891-1895, 1998: Journal of Clinical Rheumatology 4(3): 156-158; 1998), 이하의 질환 유전자를 이미 특허출원하였다(PCT/JP98/01665호).

(1) 사람의 제1 염색체의 마이크로위성마아커 D1S214 및/또는 D1S253이 교잡(hybridize)하는 DNA배열로부터 ±1센티모오갠 이내에 위치하는 만성 류마티스성 관절염유전자.

(2) 사람의 제8 염색체의 마이크로위성마아커 D8S556이 교잡하는 DNA배열로부터 ±1센치모오갠 이내에 위치하는 만성 류마티스성 관절염유전자.

(3) 사람의 X염색체의 마이크로위성마아커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 교잡하는 DNA배열로부터 ±1센치모오갠 이내에 위치하는 만성 류마티스성 관절염유전자.

본 출원의 발명자들은 상기 선출원발명의 각 질환유전자에 대해 연구를 계속한 결과, 상기 (3)의 질환유전자에 대해 그 구체적 유전자를 특정하고, 그 분자구조를 결정하였다.

본 발명은 사람의 X염색체에 위치하는 만성 류마티스성 관절염질환 유전자와, 이 질환의 유전자 또는 그 발현물의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염의 진단방법에 관한 것이다.

도 1은 건강한 사람(Normal)에서의 Dbl유전자 cDNA의 제2679번째 염기에서제2952번째 염기까지의 염기배열(배열번호(1)과 동일)과, 이것에 대응하는 만성 류마티스성 관절염유전자의 염기배열, 및 이들의 염기배열이 각각 코드하는 아미노산잔기(1문자 표기)의 배열이다.

본 출원은 상기 과제를 해결하기 위한 발명으로, 배열번호(1)에 그 제2679번째 염기로부터 제2952번째 염기까지의 배열을 나타낸 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하는 프로토 온코진(proto-oncogene) Dbl유전자의 변이배열에 있어서, 배열번호(1)의 제20번째 염기로부터 제274번째 염기까지의 영역이 배열번호(2)의 배열로 치환되어 있는 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염질환 유전자를 제공한다.

또 본 출원은 상기 질환유전자의 cDNA; 상기 cDNA의 일부 배열로 이루어진 DNA단편; 상기 질환유전가가 발현하는 단백질; 상기 단백질의 일부로 이루어진 펩티드; 및 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다.

또 본 출원은 생체시료중에서의 상기 질환유전자의 mRNA 또는 상기 단백질의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염의 진단방법을 제공한다.

또한 본 출원은 Dbl결손을 기능적으로 보완하는 방법을 제공한다.

이하, 상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 실시예에 대해 설명한다.

본 발명의 만성 류마티스성 관절염유전자(이하,「RA질환유전자」라 기재한다)는, 후기하는 실시예의 방법에 의해 사람의 X염색체로부터 단리된 유전자이며, 공지의 프로토 온코진 Dbl유전자(EMBO J. 718: 2465-2473, 1988; GenBank Accesstion No. X12556)의 변이배열이다. 즉 상기 Dbl유전자는 배열번호(1)에 제2679번째 염기로부터 제2952번째 염기까지의 배열을 나타낸 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하지만, 이 변이유전자의 cDNA에서는 배열번호(1)의 제241번째 염기로부터 3'측 배열이 제18번째 염기하류에 결합하여 아미노산 번역의 구조이동을 유기한 결과, 배열번호(1)의 제19번째 염기로부터 제274번째 염기까지의 영역이 배열번호(2)의 배열로 치환되어 있다.

또한 일반적으로 사람의 유전자는 개인차에 의한 다양한 형태가 알려져 있다. 따라서 배열번호(2)에서, 1 또는 다수개의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 및/또는 다른 뉴클레오티드에 의해 치환되어 있는 cDNA를 코드하는 유전자도 본 발명의 RA질환유전자에 포함된다. 마찬가지로 이들의 염기의 변경에 의해 발생되는 1 또는 다수개의 아미노산의 첨가, 결손 및/또는 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 단백질도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 cDNA는, 예를 들어 후기하는 실시예의 방법에 따라 단리할 수 있다. 또 본 발명의 cDNA는, 예를 들어 만성 류마티스성 관절염환자의 세포에서 추출한 폴리(A)+RNA를 주형으로 하여 공지의 방법(Mol. Cell. Biol.2: 161-170, 1982; J. Gene 25: 263-269, 1983; Gene 150: 243-250, 1994)에 의해 작성한 cDNA 라이블러리로부터 클론화할 수 있다. 클론화 방법으로는, 예를 들어 본 발명에 의해 제공되는 배열정보에 기초하여 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이를 프로브로 사용하여 공지의 방법에 의해 콜로니 또는 플라크교잡(Plaque Hybridization)에 의한 스크리닝을 실시할 수 있다. 또 목적으로 하는 cDNA단편의 양말단에 교잡하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 이를 프라이머로서 사용하여 만성 류마티스성 관절염 환자의 세포에서 단리한 mRNA로부터 RT-PCR법에 의해 본 발명의 cDNA를 조제할 수도 있다.

본 발명의 DNA단편은 상기 cDNA의 일부배열로, 배열번호(3)의 염기배열을 포함하는 DNA단편이다. 즉, 배열번호(3)은 도 1에서 밑줄 친 배열이며, 건강한 사람의 Dbl유전자나 그 cDNA에는 존재하지 않는 특징적인 영역이다. 또한 이 DNA단편에는 센스체인 및 안티센스체인이 포함된다. 이들 DNA단편은 유전자진단용 프로브등으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 단백질은 본 발명의 RA질환 유전자의 발현물이고, 그 C말단아미노배열이 배열번호(2)의 아미노 배열인 단백질이다. 이 단백질은 본 출원에 의해 제공되는 아미노산 배열에 기초한 화학합성에 의해 펩티드를 조제하는 방법 또는 본 출원에 의해 제공되는 cDNA를 사용하여 재조합 DNA기술로 생산하는 방법 등에 의해취득할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA기술에 의해 단백질을 취득하는 경우에는 본 발명의 cDNA를 갖는 벡터로부터 인비트로 전사에 의해 RNA를 조제하고, 이를 주형으로서 인비트로번역을 실시함으로써 단백질을 얻을 수 있다. 또 cDNA의 번역영역을 공지의 방법에 의해 적당한 발현벡터로 재조합하고, 이 재조합 벡터에서 대장균, 고초균, 효모, 동식물세포 등을 형질전환하면 이들의 형질전환체에서 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다.

본 발명의 단백질을 인비트로번역으로 생산시키는 경우에는 본 발명의 cDNA의 번역영역을 RNA중합효소 프로모터를 갖는 벡터로 재조합하고, 프로모터에 대응하는 RNA중합효소를 포함한 토끼강상적혈구 용해물이나 소맥배아 추출물 등의 인비트로변역계에 첨가할 수 있다. RNA중합효소 프로모터로는 T7, T3, SP6 등을 예시할 수 있다. 이들의 RNA중합효소 프로모터를 포함하는 벡터로는 pKA1, pCDM8, pT3/T7 18, pT7/3 19, pBluescript Ⅱ 등을 예시할 수 있다.

또 본 발명의 단백질을 대장균 등의 미생물로 발현시키는 경우에는 미생물중에서 복제가능한 오리진(origin), 프로모터, 리보솜 결합부위, cDNA클로닝부위, 터미네이터 등을 갖는 발현벡터에 본 발명의 cDNA의 번역영역을 재조합하여 발현벡터를 작성하고, 본 발명의 발현벡터에서 숙주세포를 형질전환한 후, 얻어진 형질전환체를 배양할 수 있다. 그 때, 임의의 번역영역 전후에 개시코돈과 정지코돈을 첨가하면 임의의 영역을 포함하는 단백질 단편을 얻을 수 있다. 또는 다른 단백질과의 융합단백질로서 발현시킬 수도 있다. 이 융합단백질을 적당한 프로테아제로 절단함으로써 목적으로 하는 단백질만을 취득할 수 있다. 대장균용 발현벡터로는 pUC계,pBluescript Ⅱ, pET발현시스템, pGEX발현시스템 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 단백질을 진핵세포로 발현시키는 경우에는 본 발명의 cDNA의 번역영역을 프로모터, 스플라이싱영역, 폴리(A)첨가 부위 등을 갖는 진핵세포용 발현벡터로 재조합하여 진핵세포내에 도입한다. 발현벡터로는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV벡터, pRS, pYES2 등을 예시할 수 있다. 진핵세포로는 원숭이 신장세포 COS7, 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO 등의 포유동물 배양세포, 출아효모, 분열세포, 누에세포, 아프리카 발톱개구리 난세포 등이 일반적으로 사용되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 발현벡터를 진핵세포로 도입하는 것은 전기천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE덱스트란법 등의 공지의 방법을 사용할 수 있다.

상기 방법에 의해 원핵세포나 진핵세포로 단백질을 발현시킨 후, 배양물로부터 목적단백질을 단리정제하기 위해서는 공지의 분리조작을 조합하여 실시한다. 예를 들어, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파처리, 효소소화, 염석이나 용매침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔여과, SDS-PAGE, 등전점전기영동, 이온교환 크로로마토그라피, 소수성크로마토그라피, 친화크로마토그라피, 역상크로마토그라피 등이다.

또 본 발명의 단백질에는 다른 임의의 단백질과의 융합단백질도 포함된다.

본 발명의 펩티드는 적어도 배열번호(2)의 아미노산 배열에서의 일부배열(5아미노산 잔기 이상)을 포함하는 펩티드단편이다. 이 펩티드는 항체를 제작하기 위한 항원 등으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 상기 단백질 그 자체, 또는 그 부분 펩티드를 항원으로 하여 공지의 방법으로 폴리클로날항체 또는 모노클로날 항체로 얻을 수 있다.

본 발명의 만성 류마티스성 관절염 진단방법은 예를 들어 피검자의 생체시료(체액, 세포 등)에서의 RA질환 유전자로부터 전사되는 특징적인 mRNA의 존재를 검출함으로써 실시할 수 있다. 이와 같은 mRNA의 검출은 예를 들어 그 특징적배열부분(예를 들어, 도 1의 밑줄친 배열)을 포함하는 mRNA를 RT-PCR증폭하는 방법, RA질환 유전자 mRNA의 특징적 배열부분을 프로브로 한 in vitro 교잡분석이나 in situ 교잡분석 등에 의해 실시할 수 있다.

또한 본 발명의 만성 류마티스성 진단방법은 피검자의 생체시료에서의 RA질환 유전자로부터 발현되는 단백질의 존재를 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 검출은 예를 들어 본 발명의 항체를 사용한 효소면역 분석이나 방사면역 분석 등으로 실시할 수 있다. 또 이러한 유전자 발현 또는 단백질 검출은 진단키트(예를 들어, DNA팁 등의 교잡분석키트 또는 ELISA키트 등의 면역분석키트)로 실시할 수도 있다.

본 발명의 Dbl 결손을 보완하는 방법은 단백질이나 저분자화합물을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

(실시예)

이하, 실시예를 나타내어 본 발명의 RA질환유전자에 대해 더욱 상세하게 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 예로 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1; RA질환 유전자의 동정)

유전해석을 마이크로위성마아커를 사용한 이환동포대검색법으로 실시하기 위해 류마티스 환자의 가계 DNA를 환자 2, 건강한 사람 1을 1가계로 하여 구아니딘티오시아네이트법(일본수혈학회잡지 40(2), 413)으로 말초혈로부터 조제하였다. 또한 다형성(heterozygosity)이 약 0.7을 넘는 마이크로위성마아커를 발명자들이 이미 밝힌 후보 유전자자리(International Immunology 10(12): 1891-1895; Journal of Clinical Rheumatology 4(3): 156-158, 1998)의 범위내에서 11마아커(DXS1047, DXS8072, DXS8041, DXS8094, DXS1192, DXS1205, DXS1227, DXS8106, DXS8043, DXS8028, DXS1200)를 선택(Nature 360, 1996)하고, 각각의 부위를 증폭시키는 형광표식 프라이머를 Perkin Elmer사에서 합성하였다. 프라이머 배열은 상기 문헌에 기재되어 있다. 각 마아커영역의 단리는 하기의 조건의 PCR반응으로 실시하였다. 반응액 조성은 프라이머 5pmol, 주형 DNA 약 0.5㎍, Buffer II(Perkin Elmer사) 1.5㎕, 2mM의 dNPT Mix(Perkin Elmer사)를 1.0㎕, Amplitaq Gold효소(Perkin Elmer 사) 0.12㎕, 25mM의 MgC12(Perkin Elmer사)를 0.9㎕ 혼합하고, 전량을 멸균수에서 15㎕로 조정하였다. 반응은 MJ Reserch사 제조의 서멀사이클러(Thermal Cycler; PTC200형)를 사용하고, 먼저 효소활성화 행정으로서 95℃ 12분 1사이클, 열변성 94℃ 1분, 프라이머 어니일링 47℃ 1분, 신장반응 72℃ 2분의 행정을 10사이클 반복한 후, 열변성 89℃ 1분, 프라이머 어니일링 47℃ 1분, 신장반응 72℃ 2분의 행정을 20사이클 반복하였다. 얻어진 각 DNA단편 각각은 시료첨부서에 따라 Genescan용 사이즈마아커(Perkin Elmer사)로 동시에 영동하는 것으로 DNA시퀀서(Perkin Elmer사 AB1377형)에서 분석을 실시하고, 부속소프트웨어 Genescan 및 Genotyper를 사용하여 사슬길이를 해석하였다. 얻어진 테이터는 일반공개되어 있는 Mapmaker Sibs소프트웨어(Am J Hum Genet, 57, 439-454, 1995)를 사용하여 Unix 시스템상에서 유전연쇄해석을 실시하고, 최대 Lod값을 단점해석법으로 계산하였다.

그 결과, 발명자들이 이미 밝힌 후보 유전자자리(International Immunology 10(12): 1891-1895; Journal of Clinical Rheumatology 4(3): 156-158, 1998)중 하나인 DXS1232의 0.1cM 근방에 위치하는 DXS984에서 최대 로드값은 2.03을 나타내는 유의한 상관이 얻어졌다. 이를 인터넷상 국제데이타베이스(Genemap98, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap98/)에서 검색한 결과 G3 Radiation hybrid map상에서 DXS984의 물리적 위치가 4259 cR10000(F)인 것을 판명하고, 최근방에 프로토 온코진 Dbl유전자가 위치하고 있는 것이 확실해졌다.

(실시예 2; Dbl유전자이상의 해석)

Dbl유전자의 cDNA를 비교하기 위해서 RA환자 말초혈로부터 Isogen시료(Nippongene사)를 사용하여 조제한 토탈RNA로부터 Perkin Elmer사 제조의 RT-PCR키트를 사용하여 역전사반응을 실시하고, cDNA를 합성하여 20㎕의 멸균수에 용해하였다. 또한 DblcDNA배열(Genbank Accession N0.X12556)을 원래의 프라이머(배열번호 4, 5)로 합성(Amersham Pharmacia사)하고, PCR법에 의해 DblcDNA배열의 일부를 단리하였다. PCR의 반응액 조성은 포워드프라이머(배열번호 4) 및 리버스프라이머(배열번호 5) 각 10pmol, 주형 DNA 약 0.1㎍, LA-PCR Buffer(다카라슈조우사) 2.5㎕, 2.5mM의 dNTP Mix를 4.0㎕, LATaq효소(다카라슈조우사) 0.25㎕, 25mM의 MgC1₂를 2.5㎕혼합하고, 멸균수에서 전량을 25㎕으로 조정하였다. 반응은 MJReserch사 제조의 서멀사이클러(PTC200형)을 사용하고, 열변성 94℃ 30초, 프라이머어니일링 52℃ 30초, 신장반응 72℃ 2분의 행정을 35사이클 반복하였다. 얻어진 PCR산물은 1% Agarose L(Nippongene사)겔과 Promega사 제조의 DNA분자량 마아커(200bp ladder)를 사용하여 TAE완충액 중에서 통상의 방법에 따라 전기영동하고, 증폭밴드를 확인하였다. 그 결과, 정상 사슬길이의 DNA는 660-bp인 것에 비해 일부 환자 유래의 DNA는 이상단쇄장(약 440bp)인 것을 발견하였다.

이어서, 각각의 얻어진 밴드를 잘라낸 후 약 65℃ 10분의 행정으로 겔을 융해하고, 통상의 방법인 페놀추출법 및 에탄올 침전법에 의해 DNA를 정제하였다. 얻어진 DNA는 100ng를 주형으로서 Perkin Elmer사 제조의 BigDye terminater 사이클시퀀스키트를 사용하여 첨부서에 따라 사이클시퀀스 반응 및 정제를 실시하고, Perkin Elmer사 제조의 ABI377형 DNA시퀀서에 의해 배열해석을 실시하였다. 그 결과, 상기의 이상단쇄장 DNA에서는 도 1에 도시한 바와 같이, 염기번호 제2697번째로부터 제2919번째까지의 223-bp가 결손되어 있기 때문에 437-bp로 되어 있는 것이 확인되었다. 이는 염기번호 제2698번째 이후의 유전정보에서 코드되어 있는 아미노산 결손을 동반하고, 아울러 구조이동을 유기함으로써 통상보다도 65아미노산 짧은 이상폴리펩티드사슬이 발생하고 있는 것을 의미한다.

이상 상세하게 설명한 바와 같이, 본 출원에 의해 사람의 X염색체에 존재하는 만성 류마티스성 관절염유전자가 제공된다. 이에 따라 만성 류마티스성 관절염의 진단을 간편하고 확실하게 실시할 수 있다. 또 만성 류마티스성 관절염의 새로운 치료법 및 치료약제의 개발에도 유용하다.

Claims (8)

1. 배열번호(1)에 그 제2979번째 염기로부터 제2952번째 염기까지의 배열을 나타낸 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하는 프로토 온코진 Dbl유전자의 이상배열에 있어서, 배열번호(1)의 제19번째 염기로부터 제274번째 염기까지의 영역이 배열번호(2)의 염기배열로 치환되어 있는 cDNA를 코드하고 있는 mRNA를 전사하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염 질환유전자.
2. 제1항 기재의 질환유전자의 cDNA.
3. 제1항의 질환유전자 또는 제2항의 cDNA의 일부에 배열번호(3)의 염기배열을 포함한 DNA단편.
4. 제1항의 질환유전자의 발현물에 있어서, C말단의 아미노산 배열이 배열번호(2)의 아미노산 배열인 단백질.
5. 제4항의 단백질의 일부에 있어서, 배열번호(2)의 아미노산 배열에서의 일부배열을 포함하는 펩티드.
6. 제4항의 단백질 또는 제5항의 펩티드에 대한 항체.
7. 생체시료중에서의 제1항의 질환유전자의 mRNA 또는 제4항의 단백질의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 만성 류마티스성 관절염의 진단방법.
8. Dbl결손을 기능적을 보완하는 방법.