KR20010108249A - 난모세포 및 배세포 생육성의 손상 없는 세포질 부분의 분리 - Google Patents

난모세포 및 배세포 생육성의 손상 없는 세포질 부분의 분리 Download PDF

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KR20010108249A
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시드니 아이브이에프 피티와이 리미티드
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Abstract

난모세포로부터 난모세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 유리하는 단계를 포함하는, 난모세포의 수정능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법. 세포로부터 세포부피의 약 5%인 세포질 부분을 유리하는 단계를 포함하는, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법.

Description

난모세포 및 배세포 생육성의 손상 없는 세포질 부분의 분리{ISOLATING A CYTOPLASMIC FRACTION WITHOUT IMPAIRING THE VIABILITY OF OOCYTES AND EMBRYONIC CELLS}
난모세포 세포질의 분석 방법은 난모세포의 파괴를 요한다. 결국, 분석에서 회수되는 정보가 특히 흥미로울 수 있음에도 불구하고, 연구자는 분석으로부터 회수된 정보와 관련하여 완전한 세포 단위로서 난모세포를 더 이상 연구할 수 없다. 더욱이, 난모세포가 이어서 수정되어, 배, 태아 및 유아로 발생하는 것이 허락되지 않는다.
난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포에서 세포질 메카니즘의 연구를 허락하는 방법에 대한 요구가 있다. 또한, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포에서 세포질 메카니즘의 연구를 허가하는 방법에 대한 요구가 있다. 이들 방법은 미토콘드리아에 의해 매개되며, 난모세포 또는 배세포에서, 또는 수정된 난모세포 또는 배세포로부터 유래한 자손에서 기능 장애 또는 질환의 원인이거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 난모세포 또는 배세포에서의 메카니즘을 연구하는데 유용할 것이다.
본 발명은 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 올리고뉴클레오티드 프라이머 L29 및 H04를 사용한, 난모세포 A1 내지 A7의 세포질 생체검사 샘플로부터 유도된 미토콘드리아 게놈의 D-루프 영역으로부터 증폭된 400bp 단편을 나타낸다.
도 2는 mtDNA 위치 8201 및 8472에 해당하는 프라이머를 사용하여 배세포로부터 분리된 미토콘드리아 게놈의 271bp 부분의 증폭을 나타낸다.
본 발명은 이들 요구를 다루려고 노력하며, 제 1 양태로서 난모세포로부터 세포질 부분을 유리하는 단계를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법을 제공한다. 난모세포로부터 유리된 세포질 부분의 부피는 난모세포 부피의 약 5%이다. 바람직하게 이 부피는 난모세포 부피의 약 2%이다.
본 발명의 제 1 양태의 구체예에서, 방법은
a) 난모세포내에 유리 수단을 삽입하는 단계;
b) 유리 수단내에 난모세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 인입하는 단계; 및
c) 부분이 유리 수단중에 분리되도록 난모세포로부터 유리 수단을 꺼내는 단계
를 포함한다.
유리 수단내로 인입된 세포질 부분의 부피는 전형적으로 10pL 미만, 바람직하게는 8pL이다. 바람직하게는, 유리 수단은 적어도 ICSI 피펫을 포함하고, 바람직하게 세포질 부분이 피펫 내로 대략 100㎛ 인입된다.
유리 수단내에 난모세포로부터 세포질 부분을 인입하는 것은 전형적으로 유리 수단과 난모세포 사이의 세포질 내용물의 압출을 형성한다. 압출이 분리되도록압출을 부드럽게 신장 또는 전단함에 의해 세포질 부분이 난모세포로부터 분리된다. 바람직하게는, 세포질 부분은 압출을 신장함에 의해 분리된다.
전형적으로, 세포질 부분은 세포질 세포소기관을 함유하고, 난모세포의 미토콘드리아 및 미토콘드리아 생성물의 샘플을 포함하거나, 또는 구성된다.
난모세포에 위치된 미토콘드리아는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에 있는 모든 미토콘드리아가 유도되는 템플레이트이다. 본 발명자들은 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고, 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법이 미토콘드리아 게놈의 완전성과 난모세포 및 수정된 난모세포로부터 유래된 자손의 기능 사이의 관계에 대한 연구를 허락한다는 것을 인지했다.
따라서, 제 2 양태로서 본 발명은
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계
를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포에 위치된 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 방법에 관한 것이다.
미토콘드리아 게놈의 돌연변이는 기능장애 또는 질환을 일으키거나, 또는 적어도 관련된다. 예를 들어, 소위 "5kb 공통 결실"이라고 하는, 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 위치 번호 8470에서 13,446까지의 뉴클레오티드 서열 결실은 Kearns-Sayre 증후군(KSS) 및 만성 진행성 외안근마비(CPEO)와 관련된다고 이해된다. 공통 결실과 함께 관찰될 수 있거나 또는 함께 관찰될 수 없는, 결실을 일으키는 다른 질환은 각종 점돌연변이뿐만 아니라, 뇌 및 심장의 미토콘드리아 게놈의 7.4kb 결실 및 10.4kb 결실/삽입을 포함한다. 또한, 결실은 골격근, 심장, 뇌, 난모세포, 백혈구, 망막 및 난소를 포함하는 인간 조직에서 관찰된다.
미토콘드리아 게놈의 40 이상의 병원성 점돌연변이는 중추신경계, 심장, 근육, 내분비계, 신장 및 간을 포함하는 광범위한 퇴행성 질환과 관련될 수 있다. 점돌연변이와 관련된 질환은 Leigh 증후군, MELAS(미토콘드리아 뇌근병증, 락트산산증 및 뇌졸증 같은 발작), MERRF(찢어진-적 섬유(ragged-red fibres)를 갖는 간대성 근경련 간질), NARP(신경병증, 운동실조 및 색소성 망막염) 및 LHON(Leber 유전성 시 신경병증)을 포함한다.
난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법은 미토콘드리아 게놈에서 뉴클레오티드 서열 돌연변이를 검출하는데 유용하며, 난모세포 및 수정된 난모세포로부터 유래된 자손의 기능적 완전성과 관련하여 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 연구를 가능하게 한다.
따라서, 제 3 양태로서 본 발명은
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
b) 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 세포질 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계
를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포에 위치된미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
점돌연변이를 포함하는 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈 돌연변이가 거의 전적으로 모계로 유전되기 때문에, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 세포질 부분을 분리하는 방법이 수정된 난모세포로부터 유래된 자손이 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것인지 아닌지 예측하는데 유용하다.
따라서, 제 4 양태로서 본 발명은 수정된 난모세포로부터 유래된 자손이 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것인지 어떤지 예측하는 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
b) 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계;
를 포함하며,
여기에서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손이 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 가능성을 나타낸다.
질환 또는 기능장애와 관련된다고 알려지거나, 또는 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되는, 난모세포에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 단순한 존재는 난모세포 자체에서, 또는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 매개하는데 충분하지 않을 수 있다. 실제로, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하는 난모세포에서, 또는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애의 가능성 및/또는 심각성에 기여하는 적어도 추가적인 요인이 나타난다. 즉, 난모세포에서 미토콘드리아 게놈에 있는 특정 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하는 미토콘드리아의 실제 비율 또는 "역치 레벨"이 난모세포의, 또는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손의 질환 또는 기능장애의 가능성 및/또는 심각성에 기여할 것 같다. 특히, 그리고 핵 게놈과는 대조적으로, 난모세포에는 미토콘드리아 게놈의 대략 적어도 100,000개의 복제가 있다. 난모세포가 1종 이상의 미토콘드리아 게놈을 함유할 때 "이종형성"이 관찰된다. 난모세포, 및 실제로 수정된 난모세포로부터 유래된 자손의 조직은, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 도입 전 단일 종의 미토콘드리아 게놈을 함유한 세포 내로 도입될 때, "이종형성화"된다. 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 관해서는, 이종형성이 특정 레벨을 넘게될 때, 질환 또는 기능장애의 발현이 조만간 관찰된다는 것이 일반적으로 인지된다.
마우스 난모세포에 있는 미토콘드리아가 감수분열의 특정 단계에서 난모세포 세포질의 특정 영역, 특히 핵주위 영역으로 이동한다는 관찰을 기초로 하여, 인간 난모세포에 있는 모든 미토콘드리아 게놈의 표본인 샘플을 얻기 위해, 인간 난모세포에서의 이종형성의 정도를 결정하는 방법이 감수분열의 특정 단계에서 전형적으로 적용된다. 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 세포질 부분을 분리하는 방법이 난모세포에서의 이종형성의 레벨을 결정하고, 수정된 난모세포로부터 유래된 자손의 조직에서 이종형성의 평균 레벨 또는 가능한 범위를 예측하는데 유용하다.
따라서, 제 5 양태로서 본 발명은
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖는 미토콘드리아 게놈의 수와, 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖지 않는 게놈의 수를 비교하는 단계
를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고, 난모세포에서의 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 결정하는 방법을 제공한다.
수정된 난모세로로부터 유래된 자손에서 이종형성의 레벨 및 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재가 질환 또는 기능장애의 가능성 및/또는 심각성에 기여하기 때문에, 난모세포에서의 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 결정하는 방법이 수정된 난모세포로부터 유래된 자손이 특정 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 의해 생기거나, 또는 관련된 질환 또는 기능장애로부터 고통받을 것 같은지 어떤지, 또는 질환 또는 기능장애의 심각성을 예측하는데 유용하다.
따라서, 제 6 양태로서 본 발명은 수정된 난모세포로부터 유래된 자손이 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 의해 생기거나, 또는 생긴다고 의심되거나, 또는 관련된 질환 또는 기능장애로부터 고통받을 것 같은지 어떤지 결정하는 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계; 및
부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈의 분석이, 난모세포에서의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨이 질환 또는 기능장애의 발현과 관련된다고 알려진 이종형성의 레벨과 적어도 같다는 것을 증명하는, 자손이 질환 또는 기능장애로부터 고통받을 것 같은지 결정하는 단계
를 포함한다.
상기 기술된 바와 같이, 난모세포로부터 세포질 부분을 분석하는 방법은 난모세포의 파괴를 포함한다. 이들 방법이 난모세포에 대한 유용한 정보를 밝힘에도 불구하고, 이로써 난모세포는 파괴되며, 이 정보의 가치는 평가될 수 없는 다른 난모세포로의 외삽에 한정된다. 같은 개체로부터의 난모세포의 집단이 전형적으로 난형질 내용물에 관해 불균질하기 때문에, 파괴된 난모세포로부터 유도된 정보가 다른 난모세포에 정확히 또는 신뢰할 수 있게 외삽될 수 있는 범위에 관한 어떤 질문이 있다. 즉, 이들 방법을 사용하여, 한 난모세포가 난모세포에서, 또는 수정된 난모세포의 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 가지지 않거나, 또는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 관하여 낮은 정도의 이종형성을 가진다는 것이 밝혀졌기 때문에, 같은 개체로부터 유도된 다른 난모세포가 같은 미토콘드리아 유전자형을 가질 것이라고는 결론내릴 수 없다. 결국, 난모세포를 분석하는 이들 방법은 체외 수정 분야에서는 사용이 제한되며, 여기에서 환자로부터 유도된 어떤 난모세포는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 수 있다고 예상된다.
난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법은 수정 전, 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 난모세포를 스크리닝하는데 특히 유용하다.
따라서, 제 7 양태로서 본 발명은 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 난모세포의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 난모세포를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계
를 포함한다.
체외 수정 치료를 제안받는 환자들은 주로 수정을 위한 선택에 이용가능한 소수의 난모세포를 가지며, 이용가능한 난모세포에 있어, 이들 중 일부는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것이라고 예상된다. 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 다른 방법은 수정용 난모세포를 선택하는데 특히 부적합하고, 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하지 않는 난모세포, 또는 이 돌연변이와 관련된 낮은 레벨의 이종형성을 가지는 난모세포의 파괴를 잠재적으로 초래할 수 있다.
난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법은 수정 전, 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하지 않는 수정용 난모세포를 선택하는데 특히 유용하다.
따라서, 제 8 양태로서 본 발명은
(i) 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 난모세포에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하지 않거나; 또는
(ii) 질환 또는 기능장애의 발현과 관련된다고 알려진 이종형성의 레벨 미만으로 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 가지는
수정용 난모세포를 선택하는 방법에 관한 것으로서,
여기에서, 방법은 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계; 및
c) 적어도 난모세포의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 및 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 정도가 질환 또는 기능장애의 발현과 관련된다고 알려진 이종형성의 정도 미만으로 제공되는, 수정용 난모세포를 선택하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 제 7 또는 제 8 양태에 따라 스크리닝되거나 또는 선택된 난모세포는 각각, 세포질내 정자 주입(ICSI)에 의해, 또는 체외 수정에 의해 수정될 수 있다. 바람직하게 난모세포는 ICSI에 의해 수정된다.
본 발명의 제 8 양태가 수정용 난모세포를 선택하는데 특히 적합하고, ICSI 또는 IVF 전에 사용될 수 있다는 점에서, 본 발명자들은 본 발명의 제 8 양태에서 구현된 방법이 신규 체외 수정 과정의 절대 필요한 부분임을 인지한다.
따라서, 제 9 양태로서 본 발명은
a) 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계; 및
c) 난모세포에서의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 정도가 질환 또는 기능장애의 발현과 관련된다고 알려진 이종형성의 정도 미만으로 제공되는, 난모세포를 수정하는 단계
를 포함하는, 난모세포를 수정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 분리된 세포질 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈은 표준 기술에 따라 분석될 수 있다. 이들 기술은 본원에 더 예시되며, 중합효소 사슬 반응(PCR), 제한 부분 길이 다형성(RFLP) 분석, 게놈 하이브리드 형성, 뉴클레오티드 서열화 및 유전자 기능 검출 및/또는 측정을 포함한다.
난모세포에서의 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 결정할 때, 게놈의 대표적 부분은 미토콘드리아가 세포질에 무작위로 분포될 때 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 일차 난모세포의 배아소포(GV) 단계 및/또는 이차 난모세포의 감수분열의 중기 II 단계에서 배우자합체 전까지의 단계를 포함하여, 난모세포에 있는 미토콘드리아의 분포가 무작위일 것이 기대될 수 있을 때, 세포질 부분이 난모세포로부터 인입된다.
난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법이 난모세포의 대사를 상당히 방해하기 때문에, 본 발명자들은 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고, 세포질 부분을 분리하는 방법이 예를 들어 배세포와 같은 다른 세포의 세포질을 연구하는데 유용하다는 것을 인지했다.
따라서, 제 10 양태로서 본 발명은 세포로부터 세포질 부분을 유리하는 단계를 포함하는, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법을 제공한다. 세포로부터 유리된 세포질 부분의 부피는 세포 부피의 약 5%이다. 바람직하게 부피는 세포 부피의 약 2%이다.
본 발명의 제 10 양태의 구체예로서, 방법은
a) 배세포내에 유리 수단을 삽입하는 단계;
b) 유리 수단내에 배세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 인입하는 단계; 및
c) 부분이 유리 수단중에 분리되도록 세포로부터 유리 수단을 꺼내는 단계
를 포함한다.
유리 수단내로 인입된 세포질 부분의 부피는 전형적으로 10pL 미만, 바람직하게는 8pL이다. 바람직하게는, 유리 수단은 적어도 ICSI 피펫을 포함하고, 바람직하게 세포질 부분은 피펫내로 대략 100㎛ 인입된다.
유리 수단 내에 배세포로부터 세포질 부분을 인입하는 것은 전형적으로 유리 수단과 배세포 사이의 세포질 내용물의 압출을 형성한다. 압출이 분리되도록 압출을 부드럽게 신장 또는 전단함에 의해 세포질 부분이 배세포로부터 분리된다. 바람직하게는, 세포질 부분은 압출을 신장함에 의해 분리된다.
전형적으로, 세포질 부분은 세포질 세포소기관을 함유하고, 배세포의 미토콘드리아 및 미토콘드리아 생성물의 샘플을 포함하거나, 또는 구성된다.
상기 본원에 기술된 바와 같이, 미토콘드리아 게놈의 각종 결실 및 점돌연변이가 기능장애 또는 질환을 일으키거나, 또는 적어도 관련된다고 알려져 있다. 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법이 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출하는데 유용하며, 배세포 및 배세포로부터 유래된 자손의 기능적 완전성과 관련하여 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 연구를 가능하게 한다.
따라서, 제 11 양태로서 본 발명은
a) 본 발명의 제 10 양태의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계;
b) 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 세포질 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계
를 포함하는, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포에 위치된 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 배세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 세포질 부분을 분리하는 방법이 배세포로부터 유래된 자손이 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것인지 아닌지를 예측하는데 유용하다는 것을 인지했다.
따라서, 제 12 양태로서 본 발명은 배세포로부터 유래된 자손이 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것인지 어떤지 예측하는 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 10 양태의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
b) 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계
를 포함하며,
여기에서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재는 배세포로부터 유래된 자손이 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유할 가능성을 나타낸다.
상기 본원에 논의된 바와 같이, 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 의해 생기거나, 또는 관련된 질환 또는 기능장애의 발현이 관찰되기 전, 이종형성이 특정 레벨을 넘어서는 것이 틀림없는 것 같다.
따라서, 제 13 양태로서 본 발명은 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포에서의 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 결정하는 방법을 제공하며, 이것은
a) 본 발명의 제 10 양태의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
b) 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖는 미토콘드리아 게놈의 수와, 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖지 않는 게놈의 수를 비교하는 단계
를 포함한다.
제 14 양태로서, 본 발명은 배세포로부터 유래된 자손이 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 의해 생기거나, 또는 생긴다고 의심되거나, 또는 관련된 질환 또는 기능장애로부터 고통받을 것 같은지 어떤지 결정하는 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 10 양태의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
b) 뉴클레오티드 서열, 다형성 및 돌연변이의 존재에 대해 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계;
부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈의 분석이, 배세포에서의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨이 질환 또는 기능장애의 발현과 관련된다고 알려진 이종형성의 레벨과 적어도 같다는 것을 증명하는, 자손이 질환 또는 기능장애로부터 고통받을 것 같은지 결정하는 단계
를 포함한다.
배 전달 과정을 시작하기 전,
(i) 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하지 않는 배, 및/또는
(ii) 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 낮은 레벨의 이종형성을 가지는 배
를 선택하는 것이 중요하다.
세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법은 배 전달 전, 배세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 관련된 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하지 않는 배 전달용 배를 선택하는데 특히 유용하다.
따라서, 제 15 양태로서 본 발명은
(i) 배세포 또는 배로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 배로부터 유도된 배세포에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 함유하지 않거나; 또는
(ii) 질환 또는 기능장애의 발현과 관련된다고 알려진 이종형성의 레벨 미만으로 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성 레벨을 가지는
배 전달용 배를 선택하는 방법에 관한 것으로서,
여기에서, 방법은 배의 발생 잠재성을 손상시키지 않고,
a) 본 발명의 제 10 양태의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
b) 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈을 분석하는 단계; 및
c) 적어도 배세포의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 정도가 질환 또는 기능장애와 관련된다고 알려진 이종형성의 정도 미만으로 제공되는, 배 전달용 배를 선택하는 단계
를 포함한다.
제 17 양태로서, 본 발명은 난모세포, 또는 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 키트는 수정된 난모세포 또는 배세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 난모세포 또는 배세포에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이에 대해 특이적인 적어도 1개의 뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 1개의 뉴클레오티드 프로브는 표 1에 나타낸 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열 돌연변이 중 어느 하나에 대해 특이적이다.
N = 어떤 뉴클레오티드
R = 어느 puRine (A, G)
Y = 어느 pYrimidine (U, C)
본 발명의 제 10 양태의 방법에 따라 분리된 세포질 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈은 표준 기술에 따라 분석될 수 있다. 이들 기술은 본원에 에 더 예시되며, 중합효소 사슬 반응(PCR), 제한 부분 길이 다형성(RFLP) 분석, 게놈 하이브리드 형성, 뉴클레오티드 서열화 및 유전자 기능 검출 및/또는 측정을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 다음 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 제공한다.
ATP6F: TCACCACCCAACAATGAC
ATP6R: TAAGGCGACAGCGATTTC
정의
본 명세서 및 청구항에서, "난모세포"는 일차 난모세포 및 이차 난모세포를 포함하는 암컷 배선세포를 의미하며, 인간 난모세포를 포함한다. 일차 난모세포는 감수분열의 GV(배아소포) 단계에 있는 생식세포를 포함한다. 이차 난모세포는 감수분열의 중기 II 단계에 있는 생식세포를 포함한다.
본 명세서 및 청구항에서, "수정된 난모세포로부터 유래된 자손"은 암컷 생식세포와 수컷 생식세포의 수정으로부터 생성된 개체를 의미한다. "개체"는 배태생활의 최초 단계(예를 들어, 2세포 단계)에서 성인생활까지의 다세포생물을 의미한다.
본 명세서 및 청구항에서, "난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않는다"는 분리된 세포질의 부분을 가지고 있는 난모세포가 수정될 있거나, 또는 달리 말해서, 정자의 침입에 의한 난모세포의 활성화에서 접합체의 발생 및 접합체의 분열 생성물의 형성까지, 어떤 하나 이상의 수정 단계와 관련된 어떤 하나 이상의 생화학적 또는 세포적 사건을 겪을 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 세포질의 부분이 분리된 후, 난모세포는 예를 들어 ICSI 및 IVF를 포함하는 표준 기술에 의해 체외 수정될 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서, "배세포"는 2세포 단계에서 착상 단계까지 진화의 어떤 단계에 있는 암컷 및 수컷 생식세포의 후-배우자합체성 융합 생성물, 접합체, 및 접합체의 분열 생성물을 포함한다.
본 명세서 및 청구항에서, "배세포로부터 유래된 자손" 또는 "배로부터 유래된 자손"은 암컷 및 수컷 생식세포의 후-배우자합체성 융합 생성물로부터 생성된 개체를 의미한다. "개체"는 배태생활의 최초 단계(예를 들어, 2세포 단계)에서 성인생활까지의 다세포생물을 의미한다.
본 명세서 및 청구항에서, "세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않는다" 또는 "배의 발생 잠재성을 손상시키지 않는다"는 분리된 세포질의 부분을 가지고 있는 배세포, 및 배세포가 유도될 수 있는 배가 세포 분화 및/또는 성숙과 관련된 어떤하나 이상의 생화학적 또는 세포적 사건을 겪을 수 있음을 의미한다.
(본 발명을 실시하기 위한 최선의 방법)
1. 난모세포의 생체검사
물질 및 방법
난모세포 공급원
인간 난모세포 A1 내지 A5를 연구를 위해 기증받았다. 이들 난모세포는 배아소포(GV) 세포이거나 또는 감수분열의 MI 단계에 있었고, 회수 후 6시간 있었다.
인간 난모세포 B1 내지 B8을 연구를 위해 기증받았다. 이들 난모세포는 감수분열의 MII 단계에 있었고, 회수 후 24시간 있었다.
인간 난모세포 C1을 환자의 요청으로 연구의 일부로 지정했다. 이 난모세포는 감수분열의 MII 단계에 있었고, 회수 후 24시간 있었다.
난모세포 세포질 부분의 분리
소량의 난형질 물질을 ICSI 피펫(Sydney IVF, Sydney)을 사용하여 인간 난모세포로부터 생체검사했다. 간단히, 피펫은 비스듬히 잘려진 팁을 갖는 대략 7㎛의 말단 직경을 갖도록 잡아늘인 유리 캐필러리이다.
생체검사 기술을 다음과 같이 수행했다:
난형질을 대략 100㎛(대략 8pl)의 거리로 피펫내에 인입했다. 다음에, 피펫을 난모세포로부터 꺼내어, 얇은 난형질 다리를 형성시키고, 다음에 이것을 신장하여 파괴했다. 각 난형질 생체검사를 PCR 완충액 20㎕, 프로테이나제 K 및 DTT 20mM을 함유하는 PCR 튜브 내에 직접 방출시켰다. 튜브를 37℃에서 하룻밤 또는 50℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 냉동시켰다. 두가지 프로토콜 모두 95℃에서 10분 동안 프로테이나제 K의 열 불활성화가 이어졌다.
난모세포 세포질 부분에 있는 미토콘드리아 게놈의 분석
난모세포 세포질 부분에 있는 미토콘드리아 게놈을 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 분석했다.
(i) D-루프 부분
반응물 20㎕를 확립했다; 반응 혼합물 10㎕에 난형질 생체검사 조제물 10㎕를 첨가했다. 101 반응 혼합물은 각 프라이머 2.5pmol, 각 dNTP 200μM, PCR 완충액, 밀리-Q 물 및 Taq 0.5 유니트를 함유했다. 모든 반응을 뚜껑이 덮힌 0.2ml 튜브 스트립에서 실시했다. PCR 순환을 다음 조건하에 FTS Thermal Sequencer (Corbett Research, Sydney, NSW)에서 수행했다: 93℃에서 5분 동안 초기 변성, 이어서 93℃에서 45초 동안 변성, 60℃에서 1분 동안 아닐링, 그리고 72℃에서 1분 동안 확장 24 내지 40 사이클; 72℃에서 7분 동안 폴리싱 단계, 15℃로 냉각, 그리고 4℃로 유지하여 마침. 템플레이트 DNA가 부족한 완전한 반응 혼합물을 음성 대조표준으로서 모든 PCR 반응에 포함시켰다.
미토콘드리아 D-루프 영역의 400bp 서열에 대해 특이적인, 프라이머 L29(5'-GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3') 및 H04(5'-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3')를 사용했다.
(ii) 공통 결실 단편
상술된 것과 동일한 프로토콜을 사용했으나, 다음 조건을 따랐다: 3분 동안 95℃에서 초기 변성, 이어서 92℃에서 1분 동안 변성, 60℃에서 10초 동안 아닐링, 그리고 68℃에서 45초 동안 확장 20 내지 35 사이클; 75℃에서 7분 동안 폴리싱 단계, 15℃로 냉각, 그리고 4℃로 유지하여 마침. 11 사이클부터, 모든 사이클의 확장 시간에 15초를 더했다. 템플레이트 DNA가 부족한 완전한 반응 혼합물을 음성 대조표준으로서 모든 반응에 포함시켰다.
4977bp 공통 결실 영역에 대해 특이적인 프라이머, L820(5'-TTCATGCCCATCGTCCTAGA-3') 및 H1363(5'-GGGGAAGGGAGGTTGACCTG-3')는 증폭되는 큰 단편 크기 및 특별히 "긴" PCR 프로그램으로 인해 변성 효소 ExpandTMHigh Fidelity의 사용을 필요로 한다.
D-루프 영역 또는 공통 결실 영역으로부터 증폭된 DNA 부분을 5% 37:1 아크릴아미드:비스아크릴아미드 겔 상에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석했다.
생체검사된 난모세포의 매정
B1 내지 B8 난모세포 및 C1 난모세포를 표준 프로토콜에 따라 ICSI 또는 IVF에 의해 수정시켰다(1, 2). 매정을 난모세포의 세포질 생체검사 후 즉시 수행했다.
결과
세포질 생체검사 후 난모세포 운명
난모세포 A1 내지 A5는 세포질 생체검사 과정에 의해 눈에 띄는 영향을 받지 않았고, 생체검사 후 48시간에서 변성의 징후를 나타내지 않았다. 난모세포 B1 내지 B3 및 B5 내지 B8은 생체검사 후 48시간에서 변성의 징후를 나타내지 않았다. 난모세포 C1은 생체검사 후 48시간에서 변성의 징후를 나타내지 않았다. 하나의 난모세포 B4가 생체검사 후 17시간에서 변성했다(표 2).
세포질 생체검사로부터 미토콘드리아 DNA의 PCR 증폭
난모세포로부터 취해진 세포질 생체검사로부터 미토콘드리아 DNA의 증폭을 검토했다. PCR을 위한 충분한 템플레이트 DNA가 있을지 어떤지를 결정하기 위해, 그러한 생체검사에서 아마도 얻어지는 대략의 미토콘드리아 수를 계산하는 것이 필요하다.
세포질 생체검사를 상술된 바와 같은 ICSI 피펫을 사용함에 의해 얻었다. 이 세포질 생체검사의 부피를 대략 8pl일 것으로 추정했다. 난모세포의 부피가 대략 500pl이기 때문에, 제거된 세포질 생체검사는 대략 2%의 세포질을 포함한다고 추정된다. 보수적 추정으로, 난모세포 당 대략 100,000개의 미토콘드리아 게놈이 있다(3). 이 추정에 따라, 생체검사는 대략 1000개의 미토콘드리아를 제거했을 것이다. 이 미토콘드리아 양은 중합효소 사슬 반응의 증폭 능력 내에 있다.
D-루프 영역으로부터 PCR 증폭
400bp D-루프 부분을 35 증폭 사이클로 난모세포 A1 내지 A5의 세포질 생체검사로부터 증폭시켰다(도 1).
공통 결실 영역으로부터 PCR 증폭
5.5kb 부분을 난모세포 B1 내지 B3 및 B5 내지 B8의 세포질 생체검사로부터 증폭시켰다(데이타 나타내지 않음).
생체검사된 난모세포의 매정
생체검사된 난모세포 B1 내지 B8 및 C1의 매정 결과를 표 3에 나타낸다.
ICSI 프로토콜이 행해진 모든 난모세포(B4 제외)가 수정되었다. 수정 후 17시간 에서, 2개의 전핵이 B1, B3 및 C1에서 관찰되었고, 3개의 전핵이 B3에서 관찰되었다. 수정 후 48시간에서, 난모세포 B1, B3 및 C1은 분열하여 2세포 단계로 진행했다. 48시간 에서, 세포 분열은 B2에서 관찰되지 않았다.
B5 내지 B8 난모세포가 생체검사 후 48시간에서 변성하지 않았음에도 불구하고, 이들 난모세포 중 어느 것도 IVF 프로토콜에 의한 매정에 의해 수정되지 않았다.
고찰
변성이 세포질 생체검사 기술이 행해진 14개의 난모세포 중 단지 하나에서만 관찰되었다. 어떤 난모세포는 회수 후 대략 24시간에서 변성하려는 경향이 있기 때문에(4, 5), B4 난모세포가 세포질 생체검사 기술 중 독립적으로 변성했던 것이 가능하다. 난모세포 A1 내지 A5를 난모세포 성숙보다는 오히려 매정에 대해 특이적으로 제조된 배지에서 성숙시켰음을 유념해야 한다.
결과는 세포질 생체검사 기술이 일반적으로 난모세포의 회수 후 24시간까지 적용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 생체검사 기술은 예를 들어 ICSI 및 IVF를 포함하는 공지의 수정 기술과 함께 사용될 수 있으며, 이것은 일반적으로 난모세포의 회수 대략 4 내지 6시간 사용된다. 본 연구에서, 매정이 생체검사 후 즉시 수행되었음에도 불구하고, 생체검사는 매정 후 수행될 것으로 기대된다.
우리는 ICSI 과정 후 형태적으로 완전한 난모세포의 퍼센트(즉, 세포질의 제거 없이 정자 주입)가 95.2%(주입된 2649개의 난모세포를 기준으로 하여)인 것을 알았다(미공개 결과).
비교로서, 다른 종으로의 핵 이식을 위한 극체 및 기본적인 세포질 제거 후의 변성 비율이 입증되지 않은, 다른 종류의 미세-조작에 대한 표준을 확립하는 것은 어려웠다(6, 7). 이질적인 미토콘드리아 주입에 대해 예증된 30.8%(67/217)의 생존 비율 및 6% 용균 비율이 인간 난모세포에 난형질 주입에 있어 보고되었다.
세포질의 제거가 ICSI 단독보다 더 침략적임에도 불구하고, 본 연구에서 전체 난모세포 생존 비율은 우리의 상기 논의된 표준 ICSI 후 생존 비율보다 놀랍게도 더 높다. 따라서, 세포질 생체검사 기술은 잠재적으로는 임상적으로 허용가능하게 고려될 수 있다.
세포질 생체검사에서 미토콘드리아로부터의 미토콘드리아 게놈의 D-루프 영역 및 공통 결실 영역으로부터의 부분의 증폭은 PCR에 의한 분석용 생체검사 샘플에 템플레이트 DNA의 충분한 공급원이 있고, 0.5kb 미만 내지 5kb 이상 정도의 부분이 샘플로부터 증폭될 수 있음을 증명한다. 미토콘드리아 게놈의 2개의 독립적인 유전자좌로부터의 부분의 증폭은 미토콘드리아 게놈의 다른 유전자좌에서의 돌연변이, 특히 표 1에 기술된 돌연변이가 PCR 및 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포질 생체검사 샘플로부터 증폭될수 있음을 제안한다.
수정 비율 및 이어지는 분열 비율은 이들 실험군에서 기증된 난모세포가 세포질 생체검사 및 시도된 수정의 기간에 24시간 이상 나이를 먹는다는 것을 고려하여 고무적이다. 이전 연구는 매정 전 20시간을 초과한 기간 동안의 배양이 난모세포 수정 및 발생을 손상시킬 수 있다는 것을 나타내고 있다(4, 5). 게다가, 체외 성숙된 난모세포는 높은 비율의 분열을 유지하는 체내 성숙된 난모세포의 능력이 부족하다(8). 이런 이유로, B5 내지 B8 난모세포가 IVF 프로토콜에 의한 매정에 이어서 수정되지 않았다는 것은 놀라운 것이 아니었다.
2. 배세포
물질 및 방법
배세포 공급원
냉동 연구 배(3 * 2개 전핵 배, 1 * 2세포 배 및 1 * 4세포 배)를 해동하고, 성장 배지에서 평형화시켰다.
배세포 세포질 부분의 분리
각각의 다세포 배로부터 3 단일 세포 배 및 1세포를 표준 ICSI 피펫을 사용하여 생체검사했다. 각 경우에 있어서, 피펫은 세포질 영역내로 도입되고, 세포질 부피의 대략 5%에 해당하는 세포질의 분획을 뽑아냈다. 이 분획을 수크로스 용액내로 이동시켰다. 배를 성장을 계속시키기 위해 인큐베이터로 돌려보냈다.
배세포 세포질 부분에 있는 미토콘드리아 게놈의 분석
세포질 조제물을 수산화칼륨으로 알카리성으로 만들고, 5분 동안 90℃로 가열했다. 트리스-HCl로 중화시킨 후, 분획을 mtDNA 위치 8201 및 8472에 해당하는 271 베이스 페어 부분을 증폭하도록 설계된 미토콘드리아 DNA 특이 프라이머를 함유하는 반응 혼합물에 가했다. 이 미토콘드리아 영역의 게놈은 산화효소 및 ATPase에 대한 코딩 영역의 일부를 포함한다. 혼합물을 이중나선 DNA의 증폭과 관련된 증가한 형광의 실시간 모니터링이 가능한 열순환기를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 시약 및 배지 블랭크가 어떤 형광 변화에 대한 음성이었다. DNA 복제수의 분석을 대조표준 인간 DNA의 외부 희석액과 비교하여 행했다.
결과
세포질 생체검사로부터 미토콘드리아 DNA의 PCR 분석
모든 5개 샘플은 미토콘드리아 타겟 DNA의 존재를 나타냈다. 표 4는 생체검사 샘플에 있는 추정된 mtDNA 복제를 나타낸다.
생체검사 후 배의 운명
생체검사 과정 후 대략 24시간에서, 배를 현미경을 사용하여 검사하여 그것들의 개체 연속 생존율을 조사했다. 2PN 배 중 단지 1개만이 어떤 변성 세포 물질이 원래의 2세포 및 4세포 배에서 관찰되었음에도 불구하고, 분열에 실패했다. 3일 후, 2개 배가 낭포 형성으로 진행되었음을 더 관찰했다.
참고문헌

Claims (32)

  1. 난모세포로부터 난모세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 유리하는 단계를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법.
  2. 제 2 항에 있어서, 부분이 난모세포 부피의 약 2%인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    (a) 난모세포내에 유리 수단을 삽입하는 단계;
    (b) 유리 수단내로 난모세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 인입하는 단계; 및
    (c) 부분이 유리 수단중에 분리되도록 난모세포로부터 유리 수단을 꺼내는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 부분의 부피가 10pL 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 부분의 부피가 세포질내 정자 주입(ICSI) 피펫 내로 약100㎛ 인입될 수 있는 난모세포 세포질의 부피와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 세포질 부분이 미토콘드리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 유리 수단이 주입 피펫을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 주입 피펫이 ICSI 피펫인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. (a) 제 1 항의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
    (b) 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 세포질 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계
    를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포에 위치된 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 난모세포에서, 또는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 표 1에 나타낸 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. (a) 제 1 항의 방법에 따라 난모세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
    (b) 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖는 미토콘드리아 게놈의 수와, 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖지 않는 게놈의 수를 비교하는 단계
    를 포함하는, 난모세포의 수정 능력을 손상시키지 않고 난모세포에 있는 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 결정하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 세포질 부분이 분리되는 난모세포가 난모세포 발생의 배아소포 단계에 있는 일차 난모세포, 또는 감수분열의 중기 II 단계에서 배우자합체 전까지의 난모세포 발생의 단계에 있는 이차 난모세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 난모세포에서 또는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 표 1에 나타낸 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 세포로부터 세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 유리하는 단계를 포함하는, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포로부터 세포질 부분을 분리하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 부분이 세포 부피의 약 2%인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    (a) 배세포내에 유리 수단을 삽입하는 단계;
    (b) 유리 수단내로 세포 부피의 약 5%인 세포질 부분을 인입하는 단계; 및
    (c) 부분이 유리 수단중에 분리되도록 세포로부터 유리 수단을 꺼내는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 부분의 부피가 10pL 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 부분의 부피가 ICSI 피펫 내로 약 100㎛ 인입될 수 있는 배세포 세포질의 부피와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 세포질 부분이 미토콘드리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 유리 수단이 주입 피펫을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 주입 피펫이 ICSI 피펫인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. (a) 제 16 항의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
    (b) 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이의 존재에 대해 세포질 부분에 있는 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계
    를 포함하는, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포에 위치된 미토콘드리아의 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 배세포에서, 또는 배세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 표 1에 나타낸 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. (a) 제 16 항의 방법에 따라 배세포로부터 미토콘드리아를 포함하는 세포질 부분을 분리하는 단계; 및
    (b) 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖는 미토콘드리아 게놈의 수와, 부분에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 갖지 않는 게놈의 수를 비교하는 단계
    를 포함하는, 세포의 발생 잠재성을 손상시키지 않고 배세포에 있는 미토콘드리아 게놈의 이종형성의 레벨을 결정하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 미토콘드리아 게놈의 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 배세포에서, 또는 배세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이가 표 1에 나타낸 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 난모세포에서, 또는 수정된 난모세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 9 항 또는 제 12 항에 따르는 방법에 사용되는 키트.
  31. 배세포에서, 또는 배세포로부터 유래된 자손에서 질환 또는 기능장애를 일으키거나, 또는 일으킨다고 의심되거나, 또는 관련된 미토콘드리아 게놈에 있는 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 24 항 또는 제 27 항에 따르는 방법에 사용되는 키트.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 다형성 또는 돌연변이를 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 키트.
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