KR20010106041A

KR20010106041A - 말라리아 항체 진단 키트 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010106041A
Application number: KR1020000027305A
Authority: KR
Inventors: 박현
Original assignee: 고석수,박현; 주식회사 휴먼바이오
Priority date: 2000-05-20
Filing date: 2000-05-20
Publication date: 2001-11-29

Abstract

본 발명은 혈액 및 혈청 검사를 통하여 말라리아 감염증을 진단하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 말라리아 항원과 검사하고자 하는 시료를 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정함으로써 말라리아 감염증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 효소면역측정검사(ELISA) 방법을 적용하여, 기존의 말라리아 진단법에 비해 민감도와 특이성을 개선시키면서 쉽고 간편하게 말라리아 감염증을 진단할 수 있도록 한다.

Description

말라리아 항체 진단 키트 및 이의 제조 방법{MALARIA ANTIBODY-DIAGNOSTIC KITS AND METHODS FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 혈액 검사를 통하여 말라리아 감염증을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 삼일열 말라리아 항원과 검사하고자 하는 시료를 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정함으로써 말라리아 감염증을 진단하는 것에 관계된다.

말라리아는 학질(栖疾) 또는 학(栖)이라 하여 우리 나라에서도 오래 전부터 알려진 열병으로서 지금 우리 나라는 물론 세계적으로 널리 유행하고 있다. 세계적으로 10억 이상의 인구가 말라리아 위험 지역에 살고 있고, 매년 1억 이상의 말라리아 환자가 발생하며, 연간 1백만명 이상이 사망하고 있다고 한다. 따라서, 세계보건기구(WHO)가 선정한 6대 열대병 중에서도 가장 중요한 질환으로 인정되고 있다. 열원충은 인체의 적혈구 내에 기생하며, 적혈구를 파괴함에 따라 주기적인 열 발작, 빈혈, 비종대 등의 증상을 나타낸다.

최근에는 해외여행이 증가 하면서 여행 도중에 감염되어 귀국 후에 발병하는 수입성 말라리아(imported malaria) 환자는 우리 나라뿐 아니라 말라리아의 유행이 없었던 선진국에서도 큰 문제가 되고 있다.

말라리아의 감염은 모기 주둥이에서 말라리아 포자(sporozoite)가 인체 내에 유입되어 간실질 세포 내에서 번식한 후(8∼9일), 적혈구로 들어가 무성 생식을 하고 약 48시간 동안 분열된 분열소체(merozoite)들이 적혈구를 파괴하고 혈액 속에 나와 다시 새 적혈구 속으로 들어간다. 이같은 무성 번식을 되풀이하는 중 일부는 자웅생식모세포(macrogametocyte 및 microgametocyte)로 변형된다. 이들이 모기 체내로 들어가면 유성 생식을 하게 된다. 융합체(zygote)∼ookimete∼낭포체(oocyst)의 단계를 거쳐 포자로 되어 (포자번식:sporgony), 침샘에 존재하다가 또 다른 사람에게 감염될 수 있는 기회를 갖는다.

말라리아의 임상적 특성은 열원충의 포자소체가 간세포 내에서 분열, 증식하고 많은 수의 크립토메로조이트(cryptomerozoite)를 형성한 후 적혈구에 기생한다는 것이며, 이는 생활사에서 이미 언급하였다. 모기에 물린 후 이 때까지가 잠복기인데, 이 기간은 매우 다양하여 수주에서 수개월까지 가능하다. 따라서, 모기가 없는 겨울에도 말라리아 환자가 발생할 수 있으며 이것은 잠복기가 수개월 경과되었기 때문이다.

말라리아 환자에서 보는 전형적인 임상적 경과는 수분 내지 한두시간 동안 오한, 두통, 구역 등을 보이는 오한 전율기(cold stage)를 거쳐, 따뜻하고 건조한 피부, 빈맥, 빈호흡 등을 보이는 발열기(hot stage)가 3∼6시간 이상 지속된 후, 땀을 흘리는 발한기(wet stage)로 이어진다. 발열의 주기는 충체의 종에 따라 다른데 삼일열 말라리아의 경우에는 48시간이다.

발열 이외에 환자는 빈혈, 두통, 비종대, 혈소판감소증 등의 소견을 보인다. 빈혈은 적혈구의 파괴로 인해, 비종대는 파괴된 적혈구 및 헤모글로빈의 침착으로 인해, 혈소판 감소증은 원충 항원으로 코팅된 혈소판의 antibody-mediated splenic sequestration으로 인해 유발될 수 있다.

말라리아는 그 임상적인 경관을 잘 관찰함으로써 진단할 수 있다. 발열주기가 매우 규칙적이고 전형적이라면 충체의 종까지도 진단할 수 있다. 후층 도말은 많은 양의 혈액을 도말하여 말린 후 적혈구를 모두 용혈시키고 원충과 백혈구만 남겨서 검경하므로 말라리아 양성, 음성의 판정에 매우 편리한 방법이다. 그러나, 혈액 표본을 염색하여야 관찰이 가능하므로 혈액 필름을 수시간 후에 관찰할 수 있다. 또한 수련된 사람이 침지 오일(immersion oil)을 떨어뜨린 후 현미경 아래서 적어도 100 필드(field) 이상을 이동하면서 관찰하여야 하므로 1시간 이상의 관찰 시간이 필요하다. 이처럼, 말라리아의 진단에 많은 숙련된 현미경 사용자가 필요하고, 이러한 과정에 많은 시간과 노동력이 소요된다. 다수의 말라리아 유행 지역에서 이러한 숙련된 사람의 부족과 노동력의 부족으로 인해, 임상적인 증상만으로 말라리아를 진단 및 치료하고 있다. 실험실에서의 확진이 아닌 임상 증상에 근거한 진단 방식은 부적절함과 함께 빈번한 부작용(side-effects)과 약제 내성의 확산을 일으킬 수 있다.

따라서, 말라리아 감염증에 대해 이를 신속하게 진단할 수 있는 혈청학적 진단법의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

열대열 말라리아의 분열소체 막 단백질(merozoite surface protein)이 말라리아 원충에 의해 발병되는 질환에서 항원성을 나타낸다는 사실(Derek Wakelin, Immunity to parasite, 44-54, 1996)로부터, 본 발명자는 이를 삼일열 말라리아 원충의 진단에 이용하고자 하였다. 이를 위해, 말라리아 원충으로부터 분열소체 막 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 이를 이용한 재조합 단백질을 만들어 본 발명을 완성하게 되었다.

현재 삼일열 말라리아를 진단하기 위해 분열소체 막 단백질의 c-terminal에 해당하는 부위에 융합 단백질(fusion protein)을 부가하여 19 kDa을 만드는 것이 알려져 있는데, 이 19 kDa는 항원성이 강하여 진단 및 백신 개발에 이용될 수 있다. 이 경우 역학 조사에 의해 진단율이 60-80% 정도라는 것이 또한 보고되었다(Infection and Immunity May 1997, p.1606-1614; Southeast Asian J Trop Med Public Health Vol 29, No.4, December 1998; Am J Trop Med Hyg 60(3), 1999 pp357-363; Vaccine 17, 1999 , 2959-2968). 그러나, 삼일열 말라리아 감염증에 대한 낮은 진단율 및 진단 특이도를 개선하기 위해, 본 발명자는 분열소체 막 단백질의 일부 유전자(서열 번호 1로 표시되는 유전자)를 이용하여 말라리아증을 진단하는 방법을 고안하게 되었다.

구체적으로, 본 발명은 클론된 말라리아 원충의 merozoite surface protein 유전자를 이용한 재조합 단백질 및 이를 이용한 효소면역측정방식(ELISA)의 진단 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 말라리아 원충의 재조합된 27 kDa 단백질이 특이 항원으로 사용될 수 있으며, DNA 프로브, 단일클론항체, 백신 등의 제조에도 이용될 수 있다. 본 발명의 재조합된 단백질을 이용한 효소면역측정방식의 진단 키트를 사용함으로써 보다 용이하게 말라리아 감염증을 진단하거나, 치료 효과를 측정할 수 있게 된다는 이점이 있다.

또한, 본 발명은 말라리아 감염증(특히, 삼일열 말라리아) 환자 및, 기타 B, C형간염, 성병(VDRL), 자가면역질환(Rheumatoid arthritis, ANA)등 감염자와 감별할 수 있는 특이도와 민감도를 가지면서, 말라리아 원충 감염 여부를 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

도1은 재조합 말라리아 항원의 전기영동 분리도를 나타낸 것이다. M은 표준 분자량 단백질이다. 여기서, (1)은 결합되지 않은 단백질 분획, (2)는 정제된 단백질 분획 1, (3)은 정제된 단백질 분획 2를 각각 의미한다.

도2는 재조합 27 kDa 단백질에 대한 혈액내 항체 측정 결과를 도시한 것이다. 여기서, (-)는 음성 기준, (+)는 양성 기준, malaria는 말라리아 감염자의 혈청, normal은 정상군 사람의 혈청을 각각 의미한다.

일반적으로 말라리아 감염증은 열원충속(genus Plasmodium)에 속하는 다음 4종의 기생 원충의 감염에 의해 일어난다. 삼일열 원충(Plasmodium vivax), 열대열 원충(P. falciparum), 사일열 원충(P. malariae), 난형열 원충(P. ovale)인데, 그 중 삼일열 말라리아와 사일열 말라리아가 주종을 이루고 있다. 삼일열 말라리아는가장 광범위한 분포를 이루고 있으며, 한국에서 말라리아 감염증의 주된 원충이다(인체기생충학, 소진탁저). 말라리아의 분열소체 막 단백질(MSP)중 MSP-1, MSP-2, MSP-4은 말라리아 분열소체의 외부막의 GPI-지질에 의해 결합되어 있으므로 숙주에 대해 항원성을 나타낸다(Camila I et al, Vaccine. 17, 2959-2968, 1999). 그런데, 이러한 MSP중 삼일열 말라리아의 MSP-1에 대한 단세포군 항체가 열대열 말라리아의 MSP-1와는 교차반응이 없다는 보고가 있다(John WB et al, Experimental parasitology, 91, 238-249, 1999).

상기한 사실들로부터, 본 발명자는 삼일열 말라리아 MSP-1 재조합 단백질 중에서 말라리아 원충증 환자의 혈청과 반응하는 재조합 단백질을 찾게 되다면 삼일열 말라리아의 진단에 이용할 수 있다는 점에 착안하게 되었다. 그에 따라, 본 발명자는 삼일열 말라리아로부터 MSP-1를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다.

삼일열 원충으로부터 MSP-1를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 과정은 첫번째 과정은 MSP에 관련된 유전자를 분리하기 위하여 β-시아노에틸포스포미디트(cyanoethyl phosphormidite)방법으로 프라이머를 설계하는 것이다.

MSP의 보존 부위와 제한효소 EcoRⅠ로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 1(5'- gtggaattcgagtacgagtcc-3')과 제한효소 SalⅠ로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 2(5-tctgtcgacaagctccatgca-3')를 설계한다.

두번째 과정은, 말라리아 원충으로부터 게놈성 DNA와 상기 프라이머를 반응시켜 MSP에 관련된 DNA 조각을 분리하는 것이다.

세번째 과정은, DNA 염기 서열을 결정하는 것이다.

네번째 과정은, 이 유전자에 대한 재조합 단백질을 제조하는 것이다.

다섯번째 과정은, 이에 대한 항원성을 검증하는 것이다.

여섯번째 과정은, 이를 이용한 효소면역측정용 키트를 제조하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 말라리아 혈액(특히, 삼일열 말라리아에 감염된 혈액)을 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정하는 것에 의해 말라리아 감염 여부를 진단한다.

즉, 본 발명의 방법은 공지된 효소면역측정법(Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)의 원리에 따라 혈액으로부터 말라리아 감염증에 대한 항체의 유무를 검정하는 것에 의해 말라리아 감염증을 진단한다.

보다 구체적으로 설명하면, 본 발명에서는 말라리아 항원을 고체 지지체의 일종인 96웰 마이크로 플레이트의 각웰에 흡착시킨 후, 웰 내에서 흡착시킨 말라리아 항원과 피검자의 혈액 중 항체를 다음과 같은 단계에 따라 반응시킴으로써 말라리아 감염여부를 진단한다.

첫째, 혈청이나 혈액을 시료 원액으로 하여, 이를 항원이 흡착된 웰 내에서 적정시간 및 적정온도에서 반응시킨다. 만약, 혈액중에 말라리아에 대한 항체가 존재한다면 항원-항체 결합체가 형성될 것이다.

둘째, 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)가 접합된 토끼 항-인간 면역글로불린 항체, HRP가 접합된 항-개 면역글로불린 항체 및 HRP가 접합된 토끼 항-고양이 면역글로불린 항체를 웰에 가하여, 형성된 항원-항체 결합체의항체 부위에 특이적으로 결합되도록 한다. 이 때, 항원-항체 결합체가 존재하지 않는 경우는 결합이 일어나지 않은 것이므로 발색효소인 HRP 접합 2차 항체가 세척단계에서 제거된다.

셋째,o-페닐렌디아민과 과산화수소로 구성된 발색시약을 부가한다. 두번째 단계에서 항원-항체 결합체에 HRP가 접합된 2차 항체가 결합되었다면 발색반응[효소에 대한 기질로 TMB(3,3', 5,5'-Tetramethyl benzidine, Merck)을 사용]이 일어나므로 노랑색으로 나타난다. 이어서, 묽은 황산을 가하여 반응을 종결시킨 후, 최종 발색 반응물의 색도를 마이크로 웰 리더로 측정한다. 이로써, 혈액중 말라리아 항체의 존재 여부를 판별할 수 있다.

상기한 3단계 진단원리에 따라 혈액내의 말라리아 항체를 진단함에 있어서, 항원 부착용 고체지지체로는 폴리스티렌 비이드, 니트로셀룰로오스 스트립 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 고체지지체에 부착된 말라리아 항원이외에 상기 진단원리에 따라 혈액내의 말라리아 항체를 진단하는데 필요한 시약들로 구성된 말라리아 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 사용된 말라리아 항원으로는 27 kDa의 재조합된 단백질을 사용하였다. 상기 재조합된 단백질은 말라리아 혈청을 이용하여 강한 반응성을 가진 클론을 얻은 것으로, 널리 알려진 재조합 단백질의 제조 방법에 따라 제조한 것이다.

한편, 재조합 단백질 제조에 사용되는 유전자는 말라리아 원충으로부터 추출한 게놈성 DNA 유래의 gDNA 라이브러리와 상기 프라이머를 반응시켜 DNA 조각을 분리한 후, DNA 염기서열결정법에 의해 클로닝한 것이다. 예를 들면, 서열 번호 1로 표시되는 유전자 등이 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이는 예시의 목적일 뿐 본 발명은 실시예에 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1

말라리아 원충으로부터 DNA의 분리

삼일열 말라리아 원충 0.5g(습윤 중량)을 액체 질소로 동결하고, 이들을 막자사발로 분쇄한 후 충체 100 mg당 분해 완충액(digestion buffer; 100mM NaCl, 10mM tris-HCl, pH 8.0, 25mM EDTA, 0.5% SDS, 0.12mg proteinase K) 1.2ml를 첨가하여 50℃에서 18시간동안 진탕하면서 세포막을 용해시켰다. 이들 시료에 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1)을 첨가하고 잘 혼합한 후 실온에서 20,000 g(swinging bucket rotor;Sorvall RC-5, USA)로 10분간 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 7.5 M 아세트산 암모늄(상층액의 1/2의 양)과 100% 에탄올(상층액의 2배의 양)을 첨가하여 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다. 이어서, 70% 에탄올로 펠렛을 세척한 후 건조시켰다. TE 완충액(10mM tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)로 DNA를 65℃에서 3시간동안 방치하여 완전히 용해시키고, 잔존하는 RNA를 제거하기 위해 0.1% SDS와 1ug/ul DNase-free RNase를 첨가하여 37℃에서 1시간 처리한 후, 유기용매 추출 공정(organic extraction)과 에탄올 침전법(ethanol precipitation)을 실시하였다.

실시예 2

상기 실시예 1에서 얻은 게놈성 DNA 10 ㎕와 프라이머 1 및 2 각각 10㎕를 GeneAmp PCR reagent 키트 with AmpliTaq DNA Polymerase(Perkin-Elmer Cetus사 )시스템에 첨가하였다. 이렇게 얻어진 PCR 반응액 99.5 ㎕를 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus사, model=9600)에 첨가하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃에서 1.5분간 DNA를 변성시키는 단계; 25℃에서 1.5분간 어닐링(anealing) 시키는 단계; 72℃에서 3분간 DNA를 합성하는 단계를 총 45회 반복하여 실시하였다. 증폭된 DNA 단편들을 확인하기 위하여, PCR 증폭을 실시한 반응액 10㎕에 시료 완충액(6X, 0.25% 브로모페놀블루, 0.25% 자일렌 시아노 FF, 40% 슈크로스) 2㎕를 혼합하여 1% 아가로스젤에서 전기영동을 실시하였다. 이 때, 트리스-초산/에틸렌디아민테트라아세트산(TAE) 전기영동 완충액으로 100 V에서 30분 동안 전기영동하여, 618bp 정도의 DNA분획을 분리하였다.

실시예 3

상기 실시예 2에서 증폭된 DNA 분획을 1% 아가로스 젤에서 전기영동하고 난 후, 잘라내어 Geneclean II kit (Bio 101 Inc.)를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 정제하였다(Wilson VG et al., 1988 ). 상기 정제한 DNA를 pT7Blue T-벡터 (Novagen)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드 DNA를 알칼리시스 방법으로(Birnboim HC et al., 1979; Ish-Horowicz O and Barke JF, 1981) 정제한 후, 다시 Geneclean II 키트를 이용하여 정제하였다.

실시예 4

상기 실시예 3에서 정제한 DNA를 T7 프로모터 프라이머(promotor primer)와 T3 리버스(reverse) 프라이머(ABI cloning system)를 첨가하여 PCR 반응시킨 다음, 8M의 우레아가 함유된 4.75% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 2,500V, 30mA로 12시간 전기영동하였다. 전기영동 결과는 Microgene software program (ABI사 제품)을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 서열 1과 같다.

서열 1은 기존에 보고된 바 있는 삼일열 말라리아 MSP중 본 발명자가 클로닝한 부분적인 염기 서열이다(Proc Natl Acad Sci U.S.A, 1991, 4030-4034).

실시예 5

상기 클로닝한 유전자를 대장균(E. coli) 발현 벡터인 pET21a(Novagen사)에 넣고, 히트 쇼크(heat shock)를 이용하여 pET21-Pv를 만들고, 항생제인 암피실린 50 ㎍/㎖를 포함하는 LB 플레이트(0.5% 효모 추출액, 1% 트립톤, 1% 염화나트륨, 및 1.5% 한천)에서 37℃로 배양하여 재조합체 클론을 선택하였다. 선택된 클론을 LB amp+ 10 ㎖에 넣고, 16시간동안 200 rpm 쉐이킹(shaking) 배양기에서 배양하였다. 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 1ℓ LB amp+ 배지에 배양된 세포를 넣은 후 OD600에서 0.6∼0.8이 되도록 배양한 다음 1M IPTG(Bioneer사) 4 ㎖을 넣고, 추가로 3시간 배양하였다. 원심분리 후 모아진 세포는 20 mM Tris-Cl(pH 8.0) 100 ㎖로 세척한 후 다시 원심분리에 의해 모아서 완충액 A[20 mM Tris-Cl(pH 8.0), 150mM NaCl, 1.5% Sarkosyl] 50 ㎖을 넣어 음파처리(sonication)한다. 원심분리로 상층액만 분리하여 Ni2+-NTA 아가로스 비드를 완충액 B[5 mM Imidazol, 20 mM Tris-Cl(pH 8.0), 150 mM NaCl]로 세척한 후 이 매트릭스를 C10 컬럼(PharmaciaBiotech Inc.)에 붓고, 단백질을 Imidazol 농도별로 용출하였다. 그 결과, 재조합된 27 kDa의 단백질을 얻었다.(도 1).

실시예 6

항원의 면역 특이도 및 민감도 측정을 위한 효소면역측정법

물질

(1) 항원 흡착 플레이트: 96 웰에 재조합된 말라리아 항원 단백질을 0.05M 중탄산염 완충액(Sigma사 제품, capsuale)로 희석하여 100㎕/well로 흡착하였다.

(2) 검체 시료 희석액: 0.15M PBS(0.2M phosphate buffer, 0.13M NaCl. pH 7.2)에 0.05% 트윈 20과 0.5% 카제인을 첨가하였다.

(3) 양성 대조액: 말라리아 항체를 함유하는 혈청 1을 검체 시료 희석액 100으로 희석한다.

(4) 음성 대조액: 정상인의 혈청 1을 검체 시료 희석액 100으로 희석한다.

(5) 농축 세척액: 10배 농축 PBS 인산염 완충액(0.13M NaCl, pH 7.2)에 0.5% 트윈 20을 첨가하고 증류수에 10배 희석하여 사용한다.

(6) 농축효소 표지액: 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)가 접합된 토끼항-인간 면역글로불린 항체(rabbit anti-humaan immunoglobulin (Serotec)를 접합체 희석액(0.15M PBS(0.2M phosphate buffer, 0.13M NaCl. pH 7.2)에 0.05% Tween 20을 첨가하였다.)으로 1: 40 의 비율로 희석하고, 검체시료 희석액에 1000배 희석하여 사용한다.

(7) 기질 농축액: TMB(3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine)을 기질로 하여기질 완충액 중에 1:100으로 희석하여 사용한다.

(8) 기질 완충액: 인산 시트르산 완충액(pH 5.0) 에 0.035% 과산화수소를 첨가하여 사용한다.

(9) 반응 정지액 :2M 황산

27 kDa의 재조합 단백질을 고체지지체에 부착

실시예 1의 27 kDa 재조합 단백질을 1~5㎍/㎖의 농도가 되도록 0.05M 중탄산염 완충액 캡슐(Sigma)을 사용하여 희석한 후, 폴리스티렌 ELISA판(Immunoplate, Nunc)에 100㎕/well씩 분주하고, 4℃에서 18시간동안 방치하여 항원을 흡착시켰다. 플레이트를 동결건조하고 건조제가 들어 있는 비닐봉지에 넣은 후 4℃에 보관하였다. 이 플레이트는 상기 조건에서 적어도 1개월 동안 안정하였다.

사용 방법

(1) 플레이트를 상온에서 개봉하였다.

(2) 3개의 음성 대조액, 2개의 양성 대조액 및 검사하고자 하는 검체의 수만큼 검체시료 희석액(키트내 포함) 200 ㎕를 각 웰에 분주하였다(기질 블랭크는 제외).

(3) 음성 대조액, 양성 대조액, 그리고 검체 시료를 각각 2㎕씩 희석 용액이 포함된 웰에 넣고 약 5∼10초 동안 조심스럽게 톡톡 친 후 플레이트 밀봉 테이프로 밀봉하였다.

(4) 밀봉한 플레이트를 37℃±1에서 60분동안 반응시켰다.

(5) 반응후, 플레이트 밀봉 테이프를 벗기고 5회 세척하였다. 세척액을 웰에완전히 충전하고 약 15초∼30초 방치하였다. 잔여 용액을 제거하였다.

(6) 효소표지 용액을 각 웰에 50 ㎕씩 분주하고 플레이트 밀봉 테이프로 밀봉하였다.

(7) 밀봉한 플레이트를 37℃±1에서 60분동안 반응시켰다.

(8) 물질 중 상기 (5)의 농축 세척액을 사용하여 플레이트를 세척하였다.

(9) 미리 조제한 기질 완충액을 기질 블랭크를 포함한 모든 웰에 100 ㎕씩 분주하였다.

(10) 15∼30℃의 암소에서 10분±30초 동안 반응시켰다.

(11) 반응 정지액(키트에 포함됨)을 기질 블랭크를 포함한 모든 웰에 100 ㎕씩 분주하였다.

(12) 450nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 이중파장 흡광도측정기를 사용할 경우에는 보조(reference)파장을 620nm∼650nm로 하여 사용하였다.

도2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 재조합 단백질을 항원으로 이용시 진단민감도가 100%(16명중 16명)였고, 진단특이도가 100%(72명중 72명)로 정상인과 명확하게 구별되었다.

결과 판정

음성 대조액의 평균 흡광도 NC계산

상기 사용방법에 따라 음성 대조액의 흡광도를 얻은 다음 3개 값의 평균을 산출하였다. 예로서 표 1을 참조한다.

음성 표준액 번호	흡광도(450nm)
1	0.024
2	0.028
3	0.031

음성 대조액의 평균 흡광도 NC = (0.024+0.028+0.031/3=0.028

음성 대조액의 평균 흡광도는 0.000 내지 0.100이어야 한다. 3개의 음성대조액의 흡광도 중 1개의 값이 상기 범위를 벗어났을 경우 나머지 2개 값의 평균값으로 산출한다. 3개의 음성대조액의 흡광도 값 중 2개 이상의 값이 위 범위를 벗어났을 경우 재시험을 실시한다.

양성 대조액의 평균 흡광도 PC 계산

상기 사용방법에 따라 양성 대조액의 흡광도를 얻은 다음, 그 2개 흡광도값의 평균을 산출하였다. 예로서 표 2를 참조한다.

양성대조액번호	흡광도(450nm)
1	0.768
2	0.756

양성 대조액의 평균 흡광도 PC = (0.768+0.756)/2=0.762

양성 대조액의 평균 흡광도는 0.500 이상이어야 하며 두 값의 차이가 0.100 이하이어야 한다. 양성 대조액의 평균 흡광도가 상기 범위를 벗어난 경우 검사 과정이나 시약에 문제가 있는 것이므로, 그 원인을 확인한 후 재시험을 실시한다.

판정 기준치(cutoff value)의 계산

음성 대조액의 평균흡광도(NC)값에 0.260을 더하여 판정 기준치를 구한다.상기 예의 경우에 있어서, 판정 기준치는 NC + 0.260=0.028+0.260=0.228

본 발명은 말라리아 원충의 MSP를 코딩하는 유전자에 대한 재조합 단백질(27 kDa)을 제조하여 이를 말라리아 감염증의 진단에 이용함으로써 민감도 및 특이도를 현저히 증가시킬 수 있다.

[서열목록]

·서열번호(SEQ IN NO): 1

·서열의 길이(Sequence length): 618

·서열의 타입(Sequence type): 핵산

·쇄의 수(Strandedness): genomic DNA

·추정서열(Hypothetical): 아니오

·앤티센스(Anti-sense): 아니오

·기원(Original source)

(A) 생물명(Organism): Plasmodium vivax(isolated from Korean patients)

·직접적인 기원(Immediate source)

(A) 라이브러리명(Library): genomic DNA

·서열의 특징(Feature)

(A) 특징을 나타내는 기호(Name/Key): CDS

(B) 존재위치(location) : 4557

(C) 특징을 결정하는 방법(Identification method) : S

II*

서열번호(SEQ IN NO): 2

서열의 길이: 206

서열의 타입(Sequence type): 아미노산

Claims

서열 번호 1로 표시되는 유전자에 대한 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:

MSP의 보존 부위와 제한 효소 EcoR I로 절단되는 특이성이 있는 프라이머 1과 제한효소 Sal I로 절단되는 특이성이 있는 프라이머 2를 설계하는 단계;

말라리아 원충으로부터 게놈성 DNA와 상기 프라이머를 반응시켜 MSP에 관련된 DNA 조각을 분리하는 단계;

상기 DNA의 염기 서열을 결정하는 단계;

상기 서열에 상응하는 재조합 단백질을 제조하는 단계.
제1항에 있어서,

상기 서열이 삼일열 말라리아 원충의 MSP(merozoite surface protein)-1을 암호화하는 서열로서 말라리아 항체에 대한 항원성이 큰 부위인 방법.
제1항에 있어서,

재조합 단백질을 제조하는 단계에서 대장균(E. coli) 발현 벡터인 pET 21a를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 재조합 단백질.
제4항에 있어서,

분자량이 27 kDa인 재조합 단백질.
말라리아 원충의 감염 여부를 알기 위해, 말라리아 감염된 개체의 혈액중 항체와의 반응성이 큰 제4항 또는 제5항의 재조합 단백질을 말라리아 항원으로 사용하는 키트.
제6항에 있어서,

상기 말라리아 원충이 삼일열 말라리아 원충임을 특징으로 하는 키트.
제6항 또는 제7항에 있어서,

상기 키트가 효소면역측정법(ELISA)의 원리를 이용하는 것을 특징으로 하는 키트.
제6항 또는 제7항에 있어서,

상기 항원이 부착된 고체지지체, 및 효소면역측정법에 따라 상기 항체를 진단하는 데 필요한 시약들을 포함하는 키트.
제9항 있어서,

항체 여부를 진단하는 데 필요한 시약으로 농축 세척액, 농축효소 표지액, 기질 농축액, 기질 완충액, 반응 정지액 등을 포함하는 키트.
제6항 내지 제9항의 키트를 사용하여 효소면역측정법에 의해 말라리아 감염 여부를 확인하는 방법.