KR20010097729A - 말라리아 항체 진단 키트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈액 및 혈청 검사를 통하여 삼일열 말라리아 감염증을 진단하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 삼일열 말라리아 항원과 검사하고자 하는 시료를 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정함으로써 삼일열 말라리아 감염증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 효소면역측정검사(ELISA) 방법을 적용하여 공지의 삼일열 말라리아 감염증의 진단 방법에 비해 민감도와 특이성을 개선시키는 동시에, 누구나 쉽고 간편하게 삼일열 말라리아 감염증을 진단할 수 있도록 한다.

Description

말라리아 항체 진단 키트 및 이의 제조 방법{MALARIA ANTIBODY DIAGNOSTIC KITS AND METHODS FOR THE SAME}

본 발명은 혈액검사를 통하여 말라리아증을 진단하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 삼일열 말라리아의 항원과 검사하고자 하는 시료를 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정함으로써 말라리아 감염증을 진단하는 것에 관계된다.

말라리아는 학질(栖疾) 또는 학(栖)이라 하여 우리 나라에서도 오래 전부터 알려진 열병으로서 현재 우리 나라는 물론 세계적으로 널리 유행하고 있다. 세계적으로 10억 이상의 인구가 말라리아 위험 지역에 살고 있고, 매년 1억 이상의 말라리아 환자가 발생하며, 연간 1백만명 이상이 사망하고 있다고 한다. 따라서, 말라리아는 세계보건기구(WHO)가 선정한 6대 열대병 중에서도 가장 중요한 질환으로 인정되고 있다. 열원충은 인체의 적혈구 내에 기생하며, 적혈구를 파괴함에 따라 주기적인 열 발작, 빈혈, 비종대 등의 증상을 나타내는 특성을 가지고 있다.

최근에는 해외 여행이 증가 하면서 여행 도중 감염되었다가 귀국 후에 발병하는 수입성 말라리아(imported malaria) 환자는 우리 나라는 물론 말라리아의 유행이 전혀 없는 선진국에서도 커다란 문제가 되고 있다.

말라리아의 감염은 모기 주둥이로부터 말라리아 포자(sporozoite)가 인체 내에 유입되면 간실질 세포 내에서 번식한 후(8∼9일), 적혈구로 들어가 무성 생식을 하고 약 48시간 동안 분열된 분열소체(merozoite)가 적혈구를 파괴하고 혈액 속에 나와 다시 새로운 적혈구 속으로 들어간다. 이같은 무성 번식을 되풀이하는 중 일부는 자웅생식모세포(macrogametocyte 및 microgametocyte)로 변형된다. 이들이 모기 체내로 들어가면 유성생식을 하게 된다. 융합체(zygote)∼ookimete∼낭포체(oocyst)의 단계를 거쳐 포자로 되어(포자번식:sporgony), 침샘에 존재하다가 또 다른 사람에게 감염될 수 있는 기회를 갖는다

말라리아의 임상적 특성으로는 열원충의 포자소체가 간세포 내에서 분열, 증식하고 많은 수의 크립토메로조이트(cryptomerozoite)를 형성한 후 적혈구에 기생한다는 점인데, 이는 상기 생활사에서 이미 언급하였다. 모기에 물린 후부터 이때까지가 잠복기인데, 이 기간은 매우 다양하여 수주 내지 수개월까지 가능하다. 따라서, 모기가 없는 겨울에도 말라리아 환자가 발생할 수 있는데, 이는 잠복기가 수개월 경과되었기 때문이다.

말라리아 환자에서 보는 전형적인 임상적 경과는 수 분 내지 한두 시간동안 오한, 두통, 구역 등을 보이는 오한 전율기(cold stage)를 거쳐, 따뜻하고 건조한 피부, 빈맥, 빈호흡 등을 보이는 발열기(hot stage)가 3∼6시간 이상 지속된 후, 땀을 흘리는 발한기(wet stage)로 이어지게 된다. 발열의 주기는 충체의 종에 따라 다른데 삼일열 말라리아의 경우에는 48시간이다.

발열 이외에도 환자는 빈혈, 두통, 비종대, 혈소판 감소증 등의 소견을 보인다. 빈혈은 적혈구의 파괴로 인해, 비종대는 파괴된 적혈구 및 헤모글로빈의 침착에 의해, 혈소판 감소증은 원충 항원으로 코팅된 혈소판의 antibody-mediated splenic sequestration에 의해 유발될 수 있다.

말라리아의 진단 방법으로서 임상적인 경관을 잘 관찰하여 말라리아로 진단할 수 있다.

발열 주기가 매우 규칙적이고 전형적이라면, 충체의 종까지도 진단할 수 있다. 후층 도말은 많은 양의 혈액을 도말하여 말린 후 적혈구를 모두 용혈시키고 원충과 백혈구만 남겨서 검경하므로 말라리아 양성, 음성의 판정에 매우 편리한 방법이다. 그러나, 혈액표본을 염색하여야 관찰이 가능하므로 혈액 필름(blood film)을수시간이 지난 후에 관찰할 수 있다. 또한, 숙련된 사람이 침지용 오일(immersion oil)을 떨어뜨린 후 현미경 아래서 적어도 100 필드(field) 이상을 이동하면서 관찰하기 때문에 적어도 1시간 이상의 관찰 시간이 필요하다. 이와 같이 말라리아의 진단에는 많은 숙련된 현미경 사용자가 필요하고, 이러한 과정에서 많은 시간과 노동력이 소요된다. 대다수의 말라리아 유행 지역에서는 이러한 숙련된 사람을 비롯한 노동력의 부족으로 인해, 임상적인 상황으로만 말라리아를 진단 및 치료하고 있다. 실험실에서의 확진 없이 임상적 증상에 근거한 치료 방식은 부적절함과 동시에 빈번한 부작용(side-effects)과 약제 내성의 확산을 가져올 수 있다.

따라서, 신속하고 정확하게 말라리아 감염증을 진단할 수 있는 혈청학적 진단법의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

본 발명자는 말라리아증을 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 열대열 말라리아의 분열소체 막 단백질(merozoite surface protein)이 말라리아 원충에 의해 발병되는 질환에서 항원성을 나타낸다는 사실(Derek Wakelin, Immunity to parasite, 44-54, 1996)로부터 이를 삼일열 말라리아 원충의 진단에 이용하고자 하였다. 이를 위하여, 본 발명자는 재조합된 27.5 kDa 단백질을 이용함으로써 민감도 및 특이도를 개선하면서 신속하고 정확하게 말라리아 원충 감염증을 진단하는 방법을 제공한다.

참고로, 본 발명자는 이전에 말라리아 원충의 분열소체 막 단백질에 관련된 유전자를 밝힌 바 있다(참고: 특허 출원 번호 제 1999-50616호)

또한, 본 발명자는 클론된 말라리아 원충의 분열소체 막 단백질 유전자를 이용하여 재조합 단백질을 개발하고, 이를 이용하여 효소면역측정방식의 진단 키트를 개발하였다. 본 발명에서는 말라리아 원충의 재조합된 27.5 kDa 단백질이 특이 항원으로서 사용될 수 있으며, DNA 프로브, 단일클론 항체, 백신 등의 제조에 이용될 수 있고, 결과적으로 말라리아 감염증을 진단하거나, 치료 효과를 측정하는 방법 등에 활용될 수 있다.

따라서, 말라리아 감염증의 진단에 있어서 전술한 비교적 고난이도의 숙련성을 필요로 하는 검사법 대신에 본 발명의 재조합된 단백질을 이용하는 방법을 사용한다면 누구나 쉽게 이를 진단할 수 있을 것이다.

이하에서는 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

도1은 재조합된 말라리아 항원의 전기영동 분리도를 나타낸 것이다. M은 표준 분자량 단백질이고, S는 분리된 말라리아 항원으로서 분자량이 약 27.5 kDa인 위치에 나타나 있다. C는 정제하지 않은 조단백질을 나타낸다.

도 2는 재조합된 27.5 kDa 단백질에 대한 웨스턴 블로팅 결과이다.

도 3는 재조합된 27.5 kDa 단백질에 대한 혈액내 항체 측정 결과이다. 여기서, ANA는 항핵산증 환자 혈청, EHF는 유행성 출혈열 환자 혈청, HBV는 B형 간염 감염자 혈청, HCV는 C형 간염 감염자 혈청, aRt는 쯔쯔가무시증 환자 혈청, RA는 류마티스성 관절염 환자 혈청, VDRL은 성병(VDRL)감염자 혈청, aPv는 삼일열 말라리아 감염자 혈청 및 nor는 정상군 사람 혈청을 나타낸다.

일반적으로, 사람의 말라리아는 열원충속(genus Plasmodium)에 속하는 다음 4종의 기생 원충의 감염에 의해 일어난다. 삼일열 원충(Plasmodium vivax), 열대열 원충(P. falciparum), 사일열 원충(P. malariae), 난형열 원충(P. ovale)인데, 이중 삼일열 말라리아와 사일열 말라리아가 주종을 이루고 있다. 이중 삼일열 말라리아가 가장 넓은 분포를 이루고 있으며, 한국내 말라리아 감염증의 주된 원인이다(인체기생충학, 소진탁저). 말라리아의 분열소체 막 단백질(MSP)중 MSP-1, MSP-2, MSP-4은 GPI-지질에 의해 말라리아 분열소체의 외막에 결합되어 있어 숙주에 항원성을 나타낸다(Camila I et al, Vaccine. 17, 2959-2968, 1999). 그런데, 이러한 MSP중 삼일열 말라리아의 MSP-1에 대한 단세포군 항체가 열대열 말라리아의 MSP-1과 교차반응이 없다는 보고가 있다(John WB et al, Experimental parasitology, 91, 238-249, 1999).

전기한 사실들로부터, 삼일열 말라리아 MSP-1 재조합 단백질 중에서 말라리아 원충증 환자의 혈청과 반응하는 재조합 단백질을 찾게 된다면, 이를 삼일열 말라리아의 진단에 활용할 수 있을 것임은 분명하다. 그에 따라, 본 발명에서는 삼일열 말라리아로부터 MSP-1를 코딩하는 유전자를 클로닝한다.

삼일열 원충으로부터 MSP-1를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 데 있어서 첫 번째 과정은, MSP에 관련된 유전자를 분리하기 위하여 β -시아노에틸 포스포미디트(cyanoethyl phosphormidite)방법으로 프라이머를 설계하는 것이다.

MSP의 보존 부위와 제한효소 EcoR I 으로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 1(5'- gctctagacaaaatgagctccgagcacaca-3')과 제한효소 Hind Ⅲ로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 2(5-cgggatccctattaaagctccatgag-3')를 설계한다.

두 번째 과정은, 말라리아 원충으로부터 게놈성 DNA와 상기 프라이머를 반응시켜 MSP에 관련된 DNA 조각을 분리하는 것이다.

세 번째 과정은, DNA 염기서열을 결정하는 것이다.

네 번째 과정은, 이 유전자에 대한 재조합 단백질을 제조하는 것이다.

다섯 번째 과정은 이에 대한 항원성의 검증이다.

여섯 번째 과정은 효소면역측정용 키트를 제조하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 삼일열 말라리아 혈액을 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정하는 것에 의해 말라리아를 진단하는 방법을 제공한다.

다시 말해, 본 발명의 진단 방법은 공지된 효소면역측정법(Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)의 원리에 따라 혈액으로부터 말라리아증에 대한 항체 유·무를 검정하는 것에 의해 말라리아증을 진단하는 방법이다.

구체적으로, 말라리아 항원을 고체 지지체의 일종인 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 흡착시킨 후, 마이크로 웰 내에서 흡착시킨 말라리아 항원과 피검자의 혈액내의 항체를 다음과 같은 단계에 의해 반응시켜 진단하는 방법이다.

첫째, 혈청이나 혈액을 시료 원액으로 하고, 이를 항원이 흡착된 웰 내에서 적정 시간 및 적정 온도에서 반응시킨다. 만약, 혈액내에 말라리아에 대한 항체가 존재한다면 항원-항체 결합체가 형성될 것이다.

둘째, 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)가 접합된 토끼항-인간 면역글로블린 항체, HRP가 접합된 항-개 면역글로블린 항체 및 HRP가 접합된 토끼 항-고양이 면역글로블린 항체를 웰에 가함으로써 형성된 항원-항체 결합체의 항체부위에 특이적으로 결합되게 한다. 이 때, 항원-항체 결합체가 존재하지 않으면, 결합이 일어나지 않으므로 발색효소인 HRP 접합 2차 항체는 세척 단계에서 제거된다.

셋째, ο-페닐렌디아민과 과산화수소로 구성된 발색 시약을 부가한다. 두번째 단계에서, 항원-항체 결합체에 HRP가 접합된 2차 항체가 결합되었을 경우, 과산화 효소의 ο-페닐렌디아민과 발색반응이 일어나 노랑색으로 나타난다. 다음 묽은 황산을 가하여 반응을 종결시킨다. 이어 최종 발색 반응물의 색도를 마이크로 웰 리더로 측정한다. 이로써, 혈액내에 말라리아에 대한 항체의 존재를 판별할 수 있다.

상기한 3단계 진단 원리에 따라 혈액내의 말라리아 항체를 진단함에 있어서, 항원 부착용 고체 지지체로는 폴리스티렌 비이드, 니트로셀룰로오스 스트립 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 고체 지지체에 부착된 말라리아 항원이외에 상기 진단원리에 따라 혈액내의 말라리아 항체를 진단하는데 필요한 시약들로 구성된 진단 키트를 제공한다. 상기 말라리아 항체를 제외한 키트에 사용되는 시약들은 당업계에 널리 알려진, 키트용 시약들을 비제한적으로 포함한다. 당업자라면 이를 쉽게 알 수 있을 것이다.

본 발명에 사용된 말라리아 항원으로는 27.5 kDa의 재조합된 단백질을 사용하였다. 이중 재조합된 단백질은 말라리아 혈청을 이용하여 강한 반응성을 가진 클론을 얻은 것으로, 당업계에 공지된 재조합 단백질의 제조 방법에 따라 제조한 것이다.

한편, 재조합 단백질 제조에 사용되는 유전자는 말라리아 원충으로부터 추출한 게놈성 DNA 유래의 gDNA 라이브러리와 제작된 프라이머를 반응시켜 DNA 조각을 분리한 후, DNA 염기 서열을 결정하는 방법에 의해 클로닝한 것으로, 그 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 특허 출원 번호 제 1999-50616호에서 서열 1로 표시되는 유전자 등이 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

상기에서 클로닝된 유전자를 효모(yeast) 발현 벡터인 pPIZ(Invitrogen사에서 시판)에 넣고, 전기영동기기(electrophoretor)(Bio-Rad)를 사용하여 형질전환체인 pPIZ-Pv을 만들고, 항생제 제오신^TM(Zeocin) 100㎍/㎖를 포함한 YPDS 플레이트(1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스, 1M 소르비톨, 및 2% 한천 )에서 30℃ 조건으로 배양하여 다중-복제 재조합체(multi-copy recombinant) 클론을 선택하였다. 선택된 클론을 MGYH(1.34% YNB, 1% 글리세롤, 4 x 10-5 비오틴 및 0.004% 히스티딘) 10㎖에 넣고, OD600에서 2∼6이 되도록 250rpm shaking 배양기에서 배양하였다. 이 10㎖ MGYH을 1ℓ 의 MGYH에 넣고 OD600에서 2∼6이 될 때까지 다시 배양하였다. 배양된 세포를 모은 다음, 발현시키기 위하여, 이를 MMH(1.34% YNB, 4 x 10-5% 비오틴 및 0.5% 메탄올)에 넣었다. 매일 24시간 간격으로 0.5%의 농도로 100% 메탄올을 96시간까지 첨가하였다. 원심 분리후 모여진 상층액을 완충액 A(50mM sodium dihydrogen phosphate, 300mM NaCl)로 희석하여 pH 8로 조정하였다. Ni2+ NTA 아가로스 비드를 완충액 B( PH 7로 조정한 것을 제외하고는 완충액 A와 동일함)로 2회 세척하였다. 그리고, 이 매트릭스를 C10 컬럼(Pharmacia Biotech Inc.)에 붓고, 단백질을 pH 단계 구배로 용출하였다. 재조합된 약 27.5 kDa의 단백질을 얻었다(도 1).

실시예 2

재조합된 27.5kDa의 단백질을 이용한 웨스턴 블롯팅

상기 실시예1에서 얻은 항원에 대한 특이성을 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 실시하였다. 약 05 ㎍의 혈장 단백질을 라멜리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970)에 따라 SDS의 존재하 10% 폴리아크릴아미드겔에서 전기 영동하고, 겔상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin, et al., Proc, Natl. Acad, Sci, USA 76, 4350(1979)에 따라 니트로셀룰오스막(Millipore사 제품, 구멍 크기 0.45 ㎛)에 옮겼다. 이 필터를 0.5% 우형 혈청 알부민(BSA)이 포함된 용액에 반응시켜 비특이적 결합(nonspecific binding)을 방지하였다. 이후, 삼일열 말라리아 환자에서 얻은 혈청을 0.05% 트윈(Tween) 20이 포함된 PBS 완충액(10mM 인산나트륨, 0.15M Nacl, pH 7.0)에 / 10,000 부피만큼 첨가하여 반응시킨 다음, 필터를 0.05% 트윈 20이 포함된 상기 PBS 완충액으로 15분씩 2회 세척하였다, 이 필터에 2차 항체(양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase) 로 표시된 염소의 항-토끼 면역 글로불린 G)를 넣어 반응시티고 다시 상기의 PBS완충액으로 새척하였다. 끝으로, 기질로서 과산화수소 0-페닐렌디아민을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과를 제2도에서 도시하고 있다.

제 2도의 A에서 알 수 있는 바와 같이 상기의 재조합된항원은 은 삼일열 말라리아 혈액 및 혈청에 대해 각각 단일한 밴드를 나타내었다. 그외에 건강인에서는(도면으로 표시하지 않음) 반응하지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명의 항원들이 삼일열 말라리아 환자의 항체들에 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있다.

실시예 3

항원의 면역 특이도 및 민감도 측정을 위한 효소면역측정법

(1) 재조합된 27.5kDa의 단백질을 이용한 고지지체에 부착

실시예 1의 재조합된 27.5kDa의 단백질을 1~5 ㎍/㎖의 농도가 되도록 0.05M 탄산염 완충용액(pH 9.6)에 희석한 후, 폴리스티렌 ELISA판(Immunoplate, Nunc)에 100 ㎕/well씩 분주하고, 4℃에서 18시간 동안 방치하여 항원을 흡착하였다. 플레이트를 동결건조하고 건조제가 들어 있는 비닐봉지에 넣은 후 4℃에 보관하였다. 플레이트는 위 조건에서 적어도 6개월동안 안정하였다.

(2) 재조합된 27.5kDa의 단백질을 이용한 혈액내 항체측정

항원이 흡착된 ELISA판을 세척액(0.85% 식염수, 0.05% Tween 20)으로 3분씩 3회 세척한 후, 3% 스킴밀크(Difco)로 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 흡착되지 않는 항원을 차단하였다. 도 2와 같은 여러 종류의 혈청을 인산염 완충액을 사용하여 1:500으로 희석한 후, 각 웰에 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 100 ㎕의 트윈 20을 함유하는 인산염 완충액(pH 7.0)을 사용하여 3회 세척한 후 1:4,000으로 희석한 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)가 접합된 토끼 항-인간 면역글로블린 항체(rabbit anti-human immunoglobulin(cappel)), HRP가 접합된 항-개 면역글로블린 항체 및 HRP가 접합된 토끼 항-고양이 면역글로블린 항체(cappel, U.S.A)을 100㎕/well씩 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 100 ㎕의 트윈 20을 함유하는 인산염 완충액(pH 7.0)을 사용하여, 3회 세척한 후, 기질 용액(0.01M 시트레이트 인산염 완충액(pH 5.0)에 o-페닐렌디아민을 0.05%(W/N)되게 녹인 후, 0.06%(W/V)가 되도록 과산화수소를 첨가하여 만든 것)을100 ㎕씩 넣고, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 2M 황산을 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시키고, ELISA 리더로 파장 490nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 측정 결과, 이 재조합 단백질을 항원으로 이용시에 진단 민감도가 97%(30명중 29명)였고, 진단 특이도가 100%(34명중 9명)였다. 또한, 항핵산증 환자(진단 특이도 100%, 12명중 0명), 유행성 출혈열 환자(진단 특이도 89%, 9명중 1명), B형 간염 환자(진단특이도 92.5%, 40명중 3명), C형 간염 환자(진단 특이도 87.5%, 24명중 3명), 쯔쯔가무시증 환자(진단 특이도 100%, 8명중 0명), 류마티스성 관절염 환자(진단 특이도 94.4%, 18명중 1명), VDRL 환자(진단 특이도 100%, 40명중 0명)으로 정상인과 구분이 된다는 것을 발견하였다.

본 발명의 효소-결합 면역 분석법은 삼일열 말라리아 감염증의 진단과 관련하여 이용될 수 있으며, 이렇게 하여 생산된 진단 키트는 말라리아의 조기 진단을 통한 예방 및 조기 치료에 유용하게 응용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 이용함으로써 삼일열 말라리아 환자 및, 기타 B, C형 간염, 성병(VDRL), 자가면역질환(Rheumatoid arthritis, ANA)등 감염자와 감별할 수 있는 특이도와 민감도를 가지면서 말라리아 원충 감염증의 감염 여부를 간편하고 신속하게 진단할 수 있게 된다.

Claims (10)

1. 말라리아 원충으로부터 MSP(merozoite surface protein)를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:

   1) β -시아노에틸 포스포미디트(cyanoethyl phophormidite) 방법으로 프라이머를 설계하는 단계;

   2) 상기 말라리아 원충의 게놈성 DNA와 상기 프라이머를 반응시켜 MSP에 관련된 DNA 조각을 분리하는 단계;

   3) 상기 조각의 DNA 서열을 결정하는 단계;

   4) 상기 유전자에 대한 재조합 단백질을 제조하는 단계; 및

   5) 상기 단백질의 항원성을 검증하는 단계.
2. 제1항에 있어서,

   프라이머가 MSP의 보존 부위와 제한효소 EcoR I 으로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 1(5'- gctctagacaaaatgagctccgagcacaca-3')과 제한효소 Hind Ⅲ로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 2(5-cgggatccctattaaagctccatgag-3')인 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 말라리아 원충이 특히 삼일열 말라리아 원충인 방법.
4. 제1항에 있어서,

   상기 MSP가 MSP-1인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 재조합 단백질.
6. 효소면역측정법(ELISA)의 원리를 이용하여 다음과 같은 단계에 따라 반응시켜 시료중 말라리아 항체의 존재 여부를 판별함으로써 말라리아 감염증을 진단하거나 그 치료 효과를 측정하는 방법:

   1) 폴리스티렌 비이드, 니트로셀룰로오스 스트립을 비롯한 고체 지지체의 각 웰(well)에 말라리아 항원을 흡착시킨 다음, 시료 원액을 말라리아 항원이 흡착된 웰 내에서 적정 시간 및 적정 온도에서 반응시키는 단계;

   2) 효소가 접합된 면역글로불린 항체를 웰에 가하여 형성된 항원-항체 결합체의 항체 부위에 특이적으로 결합시키는 단계; 및

   3) 발색 시약을 부가하고 묽은 산을 가하여 반응을 종결시킨 다음, 얻어진 발색 반응물의 색도를 측정하는 단계.
7. 제6항에 있어서,

   상기 말라리아 항원이 27.5 kDa의 분자량을 가진 제5항의 재조합 단백질인 방법.
8. 제6항에 있어서,

   상기 효소가 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)인 방법.
9. 폴리스티렌 비이드, 니트로셀룰로오스를 비롯한 항원 부착용 고체 지지체에 부착된 말라리아 항원, 및 제6항 내지 제9항 중 어느 하나의 진단 방법에 따라 말라리아 감염증을 진단하거나 그 치료 효과를 측정하는 데 필요한 시약들을 포함하는 말라리아 감염증 진단용 키트.
10. 제9항에 있어서,

    상기 말라리아 항원이 27.5 kDa의 분자량을 가진 제5항의 재조합 단백질인 키트.