KR20010102460A

KR20010102460A - 운동 유발 천식의 치료 방법

Info

Publication number: KR20010102460A
Application number: KR1020017011097A
Authority: KR
Inventors: 리차드 니맨; 씨어도어 토피; 시그프리드 크리스텐슨
Original assignee: 스튜어트 알. 수터, 스티븐 베네티아너, 피터 존 기딩스; 스미스클라인 비참 코포레이션
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2001-11-15
Also published as: PL352822A1; CA2366041A1; NZ513697A; EP1156800A1; CZ20013148A3; CN1350453A; US6555576B1; NO20014221D0; AU3715000A; HUP0200026A2; WO2000051599A1; NO20014221L; HK1043727A1; EP1156800A4; BR0008625A; IL144996A0; JP2002538115A; CO5150236A1; AR035987A1; HUP0200026A3

Abstract

PDE4 억제제를 사용하여 운동 유발 천식을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

운동 유발 천식의 치료 방법{Method for Treating Exercise Induced Asthma}

환상 뉴클레오티드 포스포디에스테라아제들(PDE)은 산재해 있는 세포내 2차 전달자, 즉 아데노신 3',5'-모노포스페이트(cAMP) 및 구아노신3',5'-모노포스페이트(cGMP)를 대응하는 비활성 5'-모노포스페이트 대사물로 가수분해하는 일군의 엔자임을 나타낸다. PDE 이소자임들은 적어도 9개의 별종이 존재하며, 각각은 고유의 물리적, 동적 특성을 가지며 또한 각각은 서로 다른 유전자군의 산물을 나타낸다. 이들은 부호 1~9를 사용하여 구별하였다.

본 발명에서의 표적(target) 엔자임은 모든 세포내의 전체 분포 영역에 있는 모든 다양한 형태의 PDE4 이소자임이다. PDE4 이소자임은 cGMP에 대하여 거의 활성을 갖지 않는 (K_m>100μM) 저-K_m(cAMP K_m=1~5 μM) cAMP 선택적 엔자임이다. 이 부류의 이소자임들은 롤리프람과 기타 PDE4 억제제들에 각기 특유의 역가(potency) 서열로 결합하는 2개 이상의 비상호전환 형태들 또는 서서히 상호전환하는 형태들이 존재하는 흥미로운 특성을 갖는다. 따라서 동일 유전자 산물이 둘 이상의 촉매적 활성 형태의 상태로 존재할 수 있다. 서로 다른 결합 형태들의 상대적 비율은 조직 세포 유형에 따라 변할 수 있음이 중요하다. 예를 들어, 염증 세포(inflammatory cell)는 롤리프람에 저친화성으로 결합하는 형태의 비율이 상대적으로 높은 반면, 뇌 세포 및 벽 세포(parietal cell)는 롤리프람을 고친화성으로 결합하는 비율이 상대적으로 높다.

본 발명에서는 염증과 기도 평활근(airway smooth muscle)에서의 상기 종류의 이소자임의 역할에 특히 주목한다. 연구 결과, 이들 이소자임은 다양한 종류의염증 세포(예: 비만 세포(mast cell), 호염기구(basophils), 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils), 및 단구(monocytes))와 기도 평활근내에서 cAMP를 조절하는데 우수한 역할을 함이 밝혀졌다. 본 발명의 연구는 특히 염증 세포 및 기도 평활근에 적용할 수 있고; 인간 단구에서 발현되는 상기 이소자임이 특히 흥미롭다. 그 이유는 환상 AMP는 염증 세포의 주화성(chemotaxis)과 활성을 억제하는 2차 전달자로 역할을 하기 때문이다. 또한, cAMP는 기도 평활근 이완을 매개한다. 이 사실과 cAMP 대사 과정에서의 PDE4의 주요 역할은 PDE4 억제제를 연구 개발하는 기초를 제공하였다: 백혈구와 기도 평활근 내에서 cAMP 함량을 증가시킬 수 있는 능력에 의하여, PDE4 억제제는 항염증 활성 및 기관지 확장제 활성을 가질 수 있다.

염증을 치료하는데, 그리고 기관지 확장제로 사용하는 통상의 PDE 억제제인 테오필린 및 펜톡시필린과 같은 약물은 모든 조직에서 무차별적으로 PDE 이소자임을 억제한다. 이들 화합물은 모든 조직내에서의 PDE 이소자임 종류를 모두 또는 대부분 비선택적으로 억제하기 때문에, 부작용을 일으킨다. 이것은 상기 화합물의 치료 프로파일을 평가하는데 고려사항이다. 표적 질병 상태는 상기 화합물에 의하여 효과적으로 치료될 수 있으나, 바람직스럽지 않는 2차적 효과가 일어날 수 있으며, 이 2차적 효과를 예방할 수 있거나 감소할 수 있다면, 특정 질병 상태를 치료하기 위한 이러한 시도는 전체 치료 효과를 증가시킬 것이다. 이러한 정보를 총체적으로 파악하면, 표준 비선택적 PDE 억제제의 사용과 관련된 부작용은 관심있는 조직 또는 세포에서 우세한 PDE를 신규 이소자임 선택적 억제제의 표적으로 함으로써 감소시킬 수 있음을 시사한다. 이론적으로는 이소자임 선택적 PDE 억제제가 비선택적 억제제보다 개선되어야 하지만, 지금까지 시험한 선택적 억제제는 부적절한 조직 또는 비표적 조직에 있는 해당 이소자임의 억제 결과 생기는 부작용이 없지 않다. 예를 들어, 항우울제로 개발되었던 선택적 PDE4 억제제 롤리프람에 대한 임상 연구 결과, 이 약물이 향정신성 활성을 가지며 또한 위장관 효과, 예를 들어 가슴앓이, 구역질 및 구토를 나타낸다는 것이 드러났다. 덴부필린(다경색 치매의 치료를 겨낭한 다른 PDE4 억제제)의 부작용도 가슴앓이, 구역질 및 구토를 포함한다. 이들 부작용은 CNS와 위장관 시스템의 특정 지역에서 PDE4가 억제되어 일어나는 것으로 생각된다.

1986년에, Schneider과 그 동료들은 쥐 뇌 균질액내에 있는 고친화성, 입체선택적 [³H]-롤리프람 결합부위의 존재와 그 특성을 기술하였다. 이들 결합 부위는 쥐 뇌 "칼모듀린 비의존성(non-calmodulin-dependent) cAMP 포스포디에스테라아제" (즉 PDE4)의 촉매 부위를 나타내는 것으로 생각되었지만, 데이터에 현저한 이상이 나타났다. 동일하지는 않더라도 비슷한 실험 조건에서, 데이터에 의하면 롤리프람은 K_d=1nM이지만, 쥐 뇌 PDE4 활성은 K_i=1μM으로 억제하였다. 따라서, 결합부위에 대한 롤리프람의 친화성과 촉매 활성에 대한 롤리프람의 영향은 1000배의 차이가 있었다. PDE 억제 및 [³H]-롤리프람 결합에 대한 경쟁과 관련한 종합적인 구조 활성 관계(SAR)는 확립되어 있지 않지만, PDE 억제제로서의 롤리프람의 역가와 상기 결합 부위에서의 그것의 역가를 비교하였을 때의 큰 차이로 보아 양 활성이 동일한 분자 부위에 존재한다는 가정에는 문제가 있는 것 같다.

이러한 난제 때문에, 여러가지 연구를 착수하였다. 하나의 연구는 롤리프람 고친화성 결합부위가 cAMP 촉매 부위와 동일 단백질상에 존재하는지 여부를 알아내려는 것이다. 또 다른 연구는 PDE4의 억제에 대한 SAR이 롤리프람 고친화성 결합부위를 두고 일어나는 경쟁에 대한 SAR과 동일한지 여부를 알아내려는 것이다. 세번째 연구는 이들 발견에 어떤 생물학적 중요성이 있는가, 특히 신약 치료 요법의 개발에 관련하여 어떠한 생물학적 중요성이 있는가를 밝히려고 착수하였다.

여러 분석으로부터 데이터를 수집한 결과, 인간 단구 재조합 PDE4(hPDE4)에 억제제가 결합하는 적어도 2개의 결합 형태가 있음이 입증되었다. 이들 관찰에 대한 하나의 설명은 hPDE4는 2개의 다른 형태들로 존재한다는 것이다. 하나의 형태는 롤리프람 및 덴부필린과 같은 화합물에 고친화성으로 결합하는 반면에, 다른 형태는 이들 화합물과 저친화성으로 결합한다. 본 명세서에서는 이들 형태를 롤리프람 고친화성 결합형태(HPDE4)와 롤리프람 저친화성 결합형태(LPDE4)로 명명하여 구분한다.

이 사실의 중요성은 롤리프람 고친화성 결합 형태(HPDE4)에 대해 강력하게 경쟁하는 화합물들은 롤리프람 저친화성 결합형태(LPDE4)에 대해 강력하게 경쟁하는 화합물보다 부작용이 더 많고, 또는 더 심하다는 것을 발견한 것에 있다. 추가의 데이터로부터, 화합물들이 PDE4의 저친화성 결합형태를 표적으로 하도록 만들 수 있고 또한 이 저친화성 결합형태는 롤리프람 고친화성 결합형태와 구별됨을 알 수 있다. 롤리프람 고친화성 결합형태와 롤리프람 저친화성 결합형태에 작용하는 억제제들은 SAR이 다름이 발견되었다. 또한, 이들 두 형태들은 서로 다른 기능적역할을 하는 것으로 보인다. 그 결과 롤리프람 저친화성 결합형태와 상호 작용하는 화합물들은 항염증 활성을 나타내는 반면, 롤리프람 고친화성 결합형태와 상호 작용하는 화합물들은 부작용을 유발하거나 부작용을 더 심하게 나타낸다.

이들 발견에 대하여 명확한 설명은 없다. 그러나, PDE4가 3차 또는 4차 구조가 서로 구별되는 두 가지 상태로 존재할 수 있음이 제안되었다. 두 형태는 모두 촉매 활성을 지닌 것 같다. 롤리프람은 한 가지 형태의 한 촉매 부위에는 고친화성(본 명세서에서는 K_i가 10nM 미만인 것을 말함)으로 결합하며, 다른 형태에는 저친화성(본 명세서에서는 K_i가 100nM 초과인 것을 말함)으로 결합한다. 이들 발견의 유용성은 PDE4 엔자임이 롤리프람에 저친화성으로 결합하는 형태로 있는 cAMP 촉매 활성을 우선적으로 억제하는 화합물을 동정할 수 있고, 그 결과 롤리프람에 고친화성으로 결합하는 형태의 억제와 연관되는 것으로 보이는 부작용을 감소시킬 수 있다는 것이다.

따라서 본 발명은 EIA 대 부작용에 대한 우수한 치료 지수를 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 위장관 및 향정신성 효과를 최소화하면서 운동 유발 천식을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 롤리프람에 고친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀을 롤리프람에 저친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀으로 나눈 IC₅₀비가 약 0.1 이상인 화합물을 필요로 하는 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 포스포디에스테라아제4(향후 PDE4라 함)라 지칭하는 포스포디에스테라제 이소자임의 하나의 형태를 우선적으로 억제하거나 그에 결합하며, 상기 엔자임의 또다른 형태에 대해서는 상기와 동등하게 억제 또는 결합, 또는 바람직하게는 적게 결합 또는 억제함으로써, 천식 환자의 운동 유발 기관지 수축을 치료하는 데 유용한 화합물에 관한 것이다. 이들 이소엔자임 형태들은 동일 엔자임의 상이한 형태의 비상호전환(non-interconvertible) 구조로 여겨지며, 롤리프람 (rolipram)(전형적인 PDE4 억제제)에 대한 결합 친화성에 따라서 구별된다. 롤리프람은 PDE4 이소자임의 하나의 형태의 한 부위에는 고친화성으로 결합하며, 다른 형태의 촉매 부위에는 저친화성으로 결합한다. 본 명세서에서는 PDE4 이소자임의 하나의 형태를 롤리프람 고친화성 결합부위라고 명명하며, 다른 형태는 롤리프람 저친화성 결합부위라 명명한다. 또한 PDE4 이소자임내의 저친화성 형태의 촉매 부위를 우선적으로 억제함으로써, 운동 유발 천식(EIA)을 선택적으로 치료하는 방법도 개시한다. 또한 저친화성 결합부위에 우선적으로 결합하는 화합물을 투여함으로써 EIA를 치료하는 방법도 개시한다.

천식은 가역적 기도 폐쇄, 기도 염증 및 다양한 약리학적 및 환경적 요인에 대한 비특이적 기도 과민증으로 특징지워지는 복합적, 다인성 질병이다. 다양한 매개체가 활성화된 염증 및 면역 세포에 의해 방출되어 폐부종, 기관지 수축 및 점액 과분비를 일으켜서 기도 형태의 변화를 초래한다. 기도 염증이 천식의 명시적 징후를 가져오는 주된 근본적인 병리학적 과정임을 시사하는 증거가 있다.

운동 유발 천식(EIA)은 격렬한 운동 후 수분내에 일어나는 기도 저항의 일시적 증가로서 정의된다. EIA는 천식 환자의 80%에 영향을 미치고, 알레르기성 비염을 가진 환자 35-40%가 EIA를 경험한다. EIA를 가진 환자에 있어서 운동은 과호흡, 호흡성 물손실, 및 기도 냉각을 초래하고, 이것이 다시 기도 비만 세포 및 순환 호염기구에서 염증, 점액 분비, 평활근 수축 및 혈관확장을 매개하는 화학물질이 운동 도중에 방출되는 것을 촉발할 수 있다.

운동 뿐만 아니라, 다른 인자도 기도 저항의 일시적 증가를 유발할 수 있다. 이들 인자는 SO₂와 같은 공해물질 및 온도 변화, 특히 찬 공기로 인한 온도변화를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 공해 유발 천식(PIA) 및 찬 공기 유발 천식(CIA)의 치료도 본 발명의 범위 내이다.

이 질병에서 PDE4 억제제의 역할에 대한 근거는 면역 및 염증 세포 활성의 광범위한 억제를 매개하는 2차 전달자로서의 환상 아데노신 모노포스페이트(cAMP)의 역할과 더불어, PDE4가 비록 염증 세포에서보다는 덜 지배적이더라도 이들 평활근 내의 주된 cAMP-가수분해 이소자임이라는 사실에 기초한다.

본 발명의 목적을 위해, 롤리프람에 저친화성으로 결합하는 cAMP 촉매 부위를 "저친화성" 결합 부위(LPDE4)로 명명하고, 롤리프람에 고친화성으로 결합하는 이 촉매 부위의 다른 형태를 "고친화성" 결합 부위(HPDE4)로 명명한다.

초기 실험은 [³H]-롤리프람 결합 분석을 확립하고 검증하기 위해 행하였다. 이 실험의 상세한 내용은 하기 실시예 1에 기술한다.

동일 유전자 산물 내에 고친화성 결합 활성과 저친화성 결합 활성이 모두 존재하는지를 결정하기 위해, 이스트를 공지의 방법에 의해 형질전환하였으며, 이어서 6시간의 발효 기간에 걸쳐 재조합 PDE를 발현시켰다. PDE4에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 발현된 PDE4의 양이 시간에 따라 증가하여, 3시간 성장 후 최고에 도달함을 나타내었다. 또한, 면역반응성 물질의 90% 이상이 이스트 분해물의 고속(100,000×g) 상징액 내에 존재하였다. [³H]R-(-)-롤리프람 결합 및 PDE 활성을 단백질 발현과 함께 모니터하였다. PDE4 활성은 롤리프람 결합 활성과 동시 발현되었는데, 이것은 두 기능 모두 동일한 유전자 산물 상에 존재함을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석 결과와 마찬가지로, 롤리프람-저해성 PDE 활성 및 [³H]-롤리프람 결합 활성의 85% 이상이 이스트 상징액 분획에 존재함이 발견되었다.

전체적으로, 이 시스템에서 발현된 대분분의 재조합 PDE4는 LPDE4로서 존재하고 단지 소량의 분획만이 HPDE4로서 존재한다. 결론적으로, 재조합 PDE4 촉매 활성의 억제는 주로 LPDE4에 대한 화합물의 작용을 반영한다. 그러므로 PDE4 촉매활성의 저해는 LPDE4에 대한 화합물의 역가(potency) 지수로서 사용될 수 있다. HPDE 4에 대한 화합물의 역가는 [³H]R-롤리프람과 경쟁하는 능력을 검사함으로써 평가될 수 있다. 롤리프람 저친화성 결합부위 및 롤리프람 고친화성 결합부위 모두에 대한 구조-활성 관계(SAR)를 밝히기 위해, 선택 화합물의 역가들을 두 가지 분석 시스템에서 결정하였다. 표준 화합물을 사용하여 실험한 결과를 표로 나타냈다. 예상한 바와 같이, 특정 화합물은 롤리프람이 저친화성 결합제인 다른 부위와 비교하여 롤리프람 고친화성 결합을 나타내는 부위에서 [³H]-롤리프람과 경쟁할 때 명백히 더욱 강력하다. 고친화성 결합과 저친화성 결합 사이의 SAR 상관관계는 작고, [³H]-롤리프람 고친화성 결합의 억제에 대한 SAR은 롤리프람 저친화성 결합부위로의 결합에 대한 SAR과 다름을 결론내렸다. 표 1에 SAR 시험의 결과를 나타낸다.

화합물	저친화성IC₅₀	고친화성IC₅₀	고친화성/저친화성 비
1-(5-테트라졸)-3-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로펜탄	1.1	0.002	0.0018
시스-[3-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로펜탄-1-카복실레이트]	2.7	0.021	0.0078
N-[2-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)에틸]옥사미드	0.89	0.012	0.013
R-롤리프람
N-[2-(3,4-비스디플루오로메톡시-페닐)에틸]옥사미드	1.6	0.4	0.25
Ro 20-1724	2.6	0.19	0.07
S-롤리프람	1.1	0.095	0.086
(R)-(+)-1-(4-브로모벤질)-4-[(3-시클로펜틸옥시)-4-메톡시페닐]-2-피롤리돈	4.0	0.45	0.11
1-(4-아미노벤질)-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-이미다졸리디논	1.4	0.1	0.07
덴부필린	0.29	0.05	0.17
3-(시클로펜틸옥시-4-메톡시펜틸)-1-(4-N'-[N2-시아노-S-메틸-이소티오우레이도]벤질)-2-피롤리돈	0.1	0.03	0.30
(R)-(+)-1-(4-브로모벤질)-4-[(3-시클로펜틸옥시)-4-메톡시페닐]-2-피롤리돈	0.06	0.02	0.33
IBMX	29.1	20.3	0.698
(S)-(-)-에틸[4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)피롤리딘-2-일리덴]아세테이트	0.46	0.45	0.98
파파버린	10	10	1.0
시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트]	0.095	0.110	1.1
시스-[4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-올]	0.021	0.04	2.0
(R)-(+)-에틸[4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)피롤리딘-2-일리덴]아세테이트	0.14	0.3	2.143
2-카보메톡시-4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-온	0.140	0.5	3.571
트레퀸신	1.6	5.0	3.125
디피리다몰	5.2	32.5	6.25

덴부필린은 SmithKline Beecham에서 제조한 7-아세토닐-1,3-디부틸크산틴이다. 파파버린은 1-[(3,4-디메톡시페닐)메틸]-6,7-디메톡시이소퀴놀린이다. 트레퀸신은 2,3,6,7-테트라하이드로-2(메시틸이미노)-9,10-디메톡시-3-메틸-4H-피리미도[6,1-a]이소퀴놀린-4-온이다. 디피리다몰은 2,2', 2",2"'-[[4,8-디피페리디노피리미도[5,4-d]피리미딘-2,6-디일]디니트릴로]테트라에탄올에 대한 일반 명칭이다.

이들 결과에 의하면, 어떤 화합물은 고친화성 형태보다 소위 저친화성 형태를 선택적으로 억제할 수 있으며, 어떤 화합물은 저친화성 형태보다 소위 고친화성 형태를 선택적으로 억제할 수 있다. 이 발견의 중요성은 한 부위를 선택적으로(우선적으로) 억제하는 화합물을 설계하거나 또는 선택함으로써 소망하는 반응이 일어나게 하고, 다른 바람직스럽지 않는 반응이 일어나지 않게 하거나 또는 의도한 치료가 수용할 수 없는 정도로 방해되지 않도록 비표적 반응을 최소화하여, 부작용을 최소화할 수 있다는 것에 있다.

이러한 작업에도 불구하고, 본 발명자들은 PDE4 이소자임에서 롤리프람 고친화성 결합과 롤리프람 저친화성 결합에 대한 본질적으로 다른 SAR의 근거를 규정하지 않았다. 그러나, 화합물이 롤리프람 고친화성 결합형태에 대한 IC₅₀을 롤리프람 저친화성 결합형태에 대한 IC₅₀으로 나누어 계산되는 IC₅₀비가 0.1 이상을 나타내면, 수용할 수 있는 치료 지수를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 즉, 다양한 면역 질병 및 염증 질병을 다른 생리적 현상에 전혀 영향을 주지 않거나 그렇지 않더라도 수용할 수 없는 정도까지 영향을 주지는 않으면서 성공적으로 치료할 수 있다. 여기서 염증 질병 및 알레르기 질병을 치료하는 수단으로서 가장 바람직한 모습은 롤리프람 저친화성 결합부위를 억제하는 것이다.

화합물

본 발명은 IC₅₀비(고결합/저결합)가 약 0.1이상인 화합물을 포함한다. 여기에는 본 명세서에 기재된 시험에 따를 때 PDE4 억제제이며, 이들 시험이나 유사한 분석에서 상기 정의된 범위 내의 IC₅₀비를 보이는 모든 화합물이 포함된다. 이들 화합물 중 특히 중요한 화합물은 특허권이 소멸되지 않았고 (않았거나) 본 출원전에 PDE4 억제제로 알려지거나 시험되지 않은 화합물이다.

상기 IC₅₀비를 충족하는 화합물의 예는 표 1 외에도 미국특허 5,448,686; 미국특허 5,605,923; 및 미국특허 5,552,438에 기재되어 있다. 이들 각각의 출원은 본 명세서에 기재한 것과 마찬가지로 그 전체를 본 명세서에 포함시킨다.

유용한 화합물을 선택하는 방법으로는 IC₅₀비가 약 0.1 이상인 화합물을 결정하는 것이 바람직하며, 상기 IC₅₀비는 롤리프람에 고친화성으로 결합하는 PDE4 형태에 대해 [³H]R-롤리프람 1nM의 결합과 경쟁할 때의 IC₅₀값과, 기질로서 1μM[³H]-cAMP를 사용하여 롤리프람에 저친화성으로 결합하는 형태의 PDE4 촉매 활성을 억제할 때의 IC₅₀값 비이다.

본 발명의 화합물은 IC₅₀의 비가 0.5 이상인 화합물이 바람직하며, IC₅₀의 비가 1.0 이상인 화합물이 특히 바람직하다. 저친화성 결합부위에 우선적으로 결합하며 또한 IC₅₀의 비가 0.1 이상인 화합물의 예로는 시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트], 2-카보메톡시-4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-온, 및 시스-[4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-올]을 들 수 있다.

본 발명의 화합물과 이것의 제약상 허용되는 염은 상기한 질병의 치료를 위한 표준 방법, 예를 들어, 경구, 비경구, 설하, 국소, 경피, 직장내, 흡입 또는 구강 투여 등으로 투여할 수 있다. 또한 서방성 제제(controlled-release preparation)도 이용할 수 있다.

본 발명의 화합물과 이것의 제약상 허용되는 염이 경구적으로 활성일 경우, 시럽, 타블렛, 캡슐, 서방성 제제, 또는 구중정으로 제제화할 수 있다. 시럽 제제는 통상 에탄올, 땅콩유, 올리브유, 글리세린 또는 물과 같은 액체 담체내에 향료 또는 착색제와 함께 상기 화합물 또는 이것의 염의 현탁액 또는 용액으로 구성된다. 조성물이 타블렛 형태인 경우, 고체 제제를 제조할 때 통상적으로 사용하는 의약 담체를 사용할 수 있다. 이런 담체의 예로는 스테아린산 마그네슘, 회백질, 탈크, 겔라틴, 아카시아, 스테아린산, 스타치, 락토오스 및 슈크로스를 들 수 있다. 조성물이 캡슐의 형태인 경우, 경질 겔라틴 껍질내에 상기한 담체를 사용하는 통상의 캡슐화가 적합하다. 조성물이 연질 겔라틴 껍질 캡슐의 형태인 경우, 분산액 또는 현탁액을 제조하는데 통상적으로 사용되는 임의의 의약 담체, 예를 들어 검수용액, 셀루로오스, 실리케이트 또는 오일을 사용할 수 있으며, 이 담체들은 연질 겔라틴 캡슐 껍질내에 포함되어 있다.

비경구 조성물은 필요에 따라 비경구적으로 수용가능한 오일, 예를 들어, 에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 레시틴, 땅콩유 또는 참깨유를 함유하는 멸균된 수성 또는 비수성 담체 중의 화합물 또는 이것의 염의 용액 또는 현탁액으로 구성하는 것이 전형적이다.

흡입 조성물은 디클로로디플루오로메탄 또는 트리클로플루오로메탄과 같은 종래의 추진체를 사용하여 건조 분말로써 또는 에어로졸 형태로 투여될 수 있는 용액, 분산액 또는 유화액의 형태가 전형적이다.

좌약 제제는 결합제 및/또는 윤활제, 예를 들어 고분자성 글리콜, 겔라틴, 코코아-버터 또는 다른 저융점 식물 왁스 또는 지방 또는 이들의 합성 유사체와 함께, 이 방법으로 투여할 때 활성이 있는 본 발명의 화합물 또는 제약상 허용되는 이들의 염을 포함하는 것이 전형적이다.

국소 및 경피 제제는 크림, 연고, 로션 또는 페이스트와 같은 통상적인 수성 또는 비수성 부형제를 포함하거나 약포, 패치 또는 멤브레인의 형태로 존재하는 것이 전형적이다.

상기 조성물은 타블렛, 캡슐 또는 계량된 에어로졸 투여량과 같은 단위 제형(dosage)으로 있는 것이 바람직한데, 그 이유는 환자에게 일회량(single dose)을 투여할 수 있기 때문이다.

각각의 경구 투여용 투여량 단위는 화합물 또는 제약상 허용되는 이것의 염을 0.3mg/Kg~60mg/Kg, 바람직하게는 1mg/Kg~30mg/Kg 함유하는 것이 좋다. 바람직한 투여량은 10mg/Kg과 15mg/Kg이다. 각각의 비경구 투여용 투여량 단위는 화합물 또는 제약상 허용되는 이것의 염을 0.1mg/Kg~100mg/Kg 함유하는 것이 좋다. 각각의 비강내 투여용 투여량 단위는 1인용으로 1~400mg, 바람직하게는 10~200mg 함유하는 것이 좋다. 국소 제제는 본 화합물을 0.01~5.0% 함유하는 것이 좋다.

이 활성 성분은 요구한 활성이 충분히 나타나도록, 하루에 1~6번 투여한다. 이 활성 성분은 하루에 1번 또는 2번 투여하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 하루에 2번 투여한다.

본 화합물은 문제의 자극이 예상되는 경우에 간헐적으로 사용하는 것뿐 아니라 만성 상태의 EIA, PIA 및 CIA의 예방과 치료에 유용하다. 본 화합물은 장기 치료에 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물을 본 발명에 따라 투여하면 허용할 수 없는 독성 효과는 없을 것으로 기대된다.

다음의 실시예에서 본 발명의 화합물의 제조 방법 및 사용 방법을 설명한다. 이들 실시예가 본 발명의 범위를 임의 특정 방법으로 또는 임의 특정 범위로 한정하는 것은 아니다.

다음의 5가지 종에 걸친 각종 분석을 이용하여 IC₅₀비 0.1이상을 선택하는 것에 대한 지지 데이터를 얻었다. 이들 분석은: 단리된 토끼 두정선(parietal gland)으로부터 산 생산의 자극; 인간 호중구에서 FMLP 유발 과립감소(미엘로퍼옥시다아제의 방출)의 억제; 기니픽(guinea pig) 호산구에서 FMLP 유발 O₂ ^-형성의 억제; 인간 단구에서 LPS 유발 TNF_α생산의 억제; 개의 구토 유발; 기니픽의 항원 유발 기관지 수축의 억제; 쥐의 레세르핀 유발 저체온의 반전; 및 쥐에 이식된 인간단구로부터 LPS 유도성 TNF_α생산의 억제이다. 이들 분석과 데이터를 하기에 나타낸다.

통계적 분석

저친화성 부위 PDE4의 억제는 이런 종류의 화합물의 항염증 작용과 연관되고, 고친화성 부위의 억제는 특성 부작용의 생성과 연관된다는 가정을 검사하기 위하여, 본 발명자들은 생체내(in vivo)와 시험관내(in vitro) 모두에서 염증 세포의 기능을 차단하는 다양한 PDE4 억제제의 능력과, 생체내(in vivo)와 시험관내(in vitro) 모두에서 부작용을 유발하는 이들 화합물의 능력을 결정하였다. PDE4의 저친화성 결합부위를 억제하는 능력과 PDE4의 고친화성 결합부위를 억제하는 능력을 대비하여 소정의 치료 효과 또는 부작용을 유발하는 PDE4 억제제들의 능력을 비교하기 위하여, 본 발명자들은 단리된 엔자임 촉매 활성 또는 고친화성 부위에 대한 PDE4 억제제들의 역가와 시험관내 또는 생체내 분석에서의 이들 화합물의 역가를 선형 상관관계(r²) 또는 순위서열 상관관계(Spearman's Rho)에 의하여 비교하였다. 선형 상관관계는 고친화성 부위 또는 저친화성 부위를 억제하는 경우의 화합물의 역가가 소정의 항염증 또는 부작용을 유발하는 능력을 예측하는데 사용할 수 있는지를 알아보는 것이다. 순위서열 상관관계는 소정의 항염증 또는 부작용을 일으키는 순위서열 역가가 저친화성 또는 고친화성 부위를 억제하는 순위서열 역가와 유사한가 여부를 시험한다. r²와 Spearman's Rho 모두 매킨토시용 STAT View II 컴퓨터 프로그램을 사용하여 계산하였다.

PDE4 대 롤리프람 고친화성 결합

실시예 1

포스포디에스테라아제와 롤리프람 결합 분석

실시예 1A

단리된 인간 단구 PDE4와 hrPDE4는 주로 저친화성 형태로 존재하는 것으로 판정되었다. 그러므로, PDE4의 저친화성 형태에 대한 시료 화합물의 활성은 기질로서 1μM [³H]cAMP를 사용하여 PDE4 촉매 활성에 대한 표준 분석을 이용하여 평가할 수 있다(Torphy 등, 1992).

쥐 뇌 고속 상징액을 단백질원으로서 사용하였다. [³H]-롤리프람의 거울상 이성질체들이 고유 활성도 25.6 Ci/mmol로 제조되었다. 표준 분석 조건은 공표된 방법을 수정하여 마지막 cAMP를 제외하면 PDE 분석 조건과 동일하게 되었다: 50mM 트리스 HCl(pH 7.5), 5mM MgCl₂, 1nM [³H]-롤리프람(Torphy 등, The J. of Bio. Chem., Vol 267, No. 3, pp 1798-1804, 1992). 분석은 30℃에서 1시간 행하였다. 반응을 종료하고 브랜델 셀 하베스터(Brandel cell harvester)를 사용하여 자유 리간드로부터 결합 리간드를 분리하였다. 고친화성 결합부위에 대한 경쟁은 [³H]-cAMP가 존재하지 않는 것을 제외하고는 저친화성 PDE 활성을 측정하는데 사용한 조건과 동일한 조건하에서 평가하였다. 표 1에 나타낸 데이터는 실시예 1A에 기술한 프로토콜을 이용하여 얻은 것이다.

실시예 1B

포스포디에스테라제 활성 측정

PDE 활성은 공급자(Amersham Life Science)에 의하여 기술한 바와 같은 [³H]cAMP 섬광 근접 분석(SPA) 또는 [³H]cGMP SPA 엔자임 분석을 이용하여 분석하였다. 반응은 실온, 96 웰 플레이트에서 50mM 트리스 HCl(pH 7.5), 8.3mM MgCl₂, 1.7mM EGTA, [³H]cAMP 또는 [³H]cGMP(약 2000 dpm/pmol), 엔자임 및 각종 농도의 억제제들을 함유하는(최종 농도) 반응 버퍼 0.1ml에서 행하였다. 이 분석을 1시간 동안 계속하고, 황산아연의 존재하에서 SPA 이트륨실리케이트 비드 50ul를 첨가하여 종료하였다. 이 플레이트를 흔들고 실온에서 20분동안 정치하였다. 방사성 표지된 생성물의 형성은 섬광 분광계에 의하여 분석하였다. PDE3과 PDE7의 활성은 기질로서 [³H]cAMP 0.05μM을 사용하여 분석하고, PDE4는 기질로서 [³H]cAMP 1μM을 사용하여 분석하였다. PDE1B, PDE1C, PDE2, PDE5 활성은 기질로서 [³H]cGMP 1μM을 사용하여 분석하였다.

[ ³ H]R-롤리프람 결합 분석

[³H]R-롤리프람 결합분석은 Schneider과 그 동료들의 방법을 수정하여 행하였다(Nicholson 등, Trens Pharmacol. Sci., Vol. 12, pp. 19-27(1991)와 McHale등, Mol. Pharmacol., Vol. 39, 109-113(1991) 참조). R-롤리프람은 PDE4의 촉매부위에 결합한다(Torphy 등, Mol. Pharmacol., Vol. 39, 376-384(1991) 참조). 결과적으로, [³H]R-롤리프람 결합에 대한 경쟁은 비표지 경쟁물질의 PDE4 억제제 역가에 대한 독립적인 확인을 제공한다. 이 분석은 50mM 트리스 HCl(pH 7.5), 5mM MgCl₂, 0.05% 소 혈청 알부민, 2nM [³H]R-롤리프람(5.7 ×104 dpm/pmol) 및 각종 농도의 비방사성 표지 억제제들을 함유하는(최종 농도) 반응 버퍼 0.5ul내에서, 30℃에서 1시간 행하였다. 반응을 얼음냉각 반응 버퍼([³H]-R-롤리프람은 없음) 2.5ml를 첨가하여 정지시키고, 0.3% 폴리에틸렌이민에 침지한 Whatman GF/B 필터를 통하여 급속 진공 여과(Brandel Cell Harvester)하였다. 필터를 냉버퍼 7.5ml를 추가하여 세정하고, 건조하고, 액체 섬광 분광계를 통하여 계수하였다.

실시예 2

아미노피린 축적

특정 메틸크산틴과 다른 비선택적 PDE 억제제는 다양한 종에서 산 분비를 증가시킨다. 특정 선택적 PDE4 억제제, 예를 들어 롤리프람과 Ro 20-1724는 특히 히스타민과 같은 아데닐화 시클라아제(cyclase)의 활성제와 함께 조합하는 경우, 래트의 산 분비를 증가시킨다. 이러한 산 분비의 증가는 히스타민 유발 cAMP 축적의 상승을 동반한다. 상기 보고된 정보를 시험하여 이러한 현상이 실제로 존재하는지 여부를 결정하였다. 산 분비를 유발하는 화합물의 능력은 저친화성 부위 또는 고친화성 부위에 대한 이들의 능력과 관련이 있었다. 이 시험에 사용된 분석법은 산분비 증가의 생화학적 마커 역할을 하는 것으로 보고된 약염기인 방사성 표지 아미노피린의 축적을 이용한 것이다. 분석은 다음과 같이 행하였다:

위선 조제(Gastric Gland Preparation)

임의 성(sex)의 토끼를 목 탈구하여 안락사시키고, 위(stomach)를 제거하였다. 위의 체부로부터 점막층을 도려냈다. 위의 머리쪽과 전적부는 버렸다. 위선을 Berglindh과 Obrink(1976) 및 Sack와 Spenney(1982)이 기술한 방법을 변형하여 단리하였다. 그 후 이 점막층을 콜라게나아제로 세분화하고 소화하여 위선을 단리하였다. 이 소화된 선(gland)을 여과하고, 세정하고, 다음 조성의 배양액(pH 7.4)에 재현탁(부피:부피=1:15)하였다: NaCl 132.4mM; KCl 5.4 mM; Na₂HPO₄5.0mM; NaH₂PO₄1.0 mM; MgSO₄1.2mM; CaCl₂1.0mM; NaHCO₃12.0mM; 토기 혈청 알부민 2mg/ml; 덱스트로오스 2mg/ml.

아미노피린 축적

산 분비를 결정하기 위하여, [¹⁴C]-아미노피린, 각종 농도의 선택적 PDE4 억제제, 및 최저유효농도의 히스타민(0.3~1.0μM)과 조합한 위선을 Sack와 Spinney 방법에 따라 수평 진탕기(shaker)(110회/분)상에서 37℃에서 20분동안 배양하였다. 그 후 시료를 원심분리하고, 상징액 분획 일부와 펠렛의 방사선 활성을 구하였다. 아미노피린 비율을 Sack와 Spinney(1982)이 기술한 바와 같이 계산하였다. 이 데이터를 히스타민의 최대 농도(100μM)에 의하여 만들어진 반응의 백분율로 표시하였다. EC₅₀값을 각 화합물에서 얻어진 최대 반응을 사용하여 선형 삽입법에 의하여구하였다.

실시예 3

개에서의 선택적 PDE 억제제의 구토(emetic) 잠재성의 평가

임의 성(sex)의 몬그릴 개(Mongrel dogs)(각 연구마다 5마리)를 동물 군락(colony)으로부터 얻었다. 하루 밤 푹 재운 후, 연구에 앞서 이 개들에게 개 먹이(Big Bet) 1/2 캔을 공급했다. 약을 투여하기 위하여 앞발 한쪽의 두정맥(cephalic vein)에 도관(cannula)을 설치하였다. 시험 화합물을 투여하기에 앞서, 이 도관을 등장 식염수(0.9%) 1ml로 씻어 내렸다. 화합물들을 에틸렌글리콜과 식염수의 혼합물에 또는 100% 에틸렌글리콜에 용해시켜서 체적 1.0~2.0ml/10kg로 했다. 투여량 전체가 순환계에 투입된 것을 확실히 하기 위해, 도관을 식염수 0.5~1.0ml로 추가하여 씻어 내렸다. 이 동물을 1시간 관찰 주기로 우리에 돌려 보냈다. 각각의 개들에게서의 헛구역질 또는 구토의 징후를 관찰하였으며, 화합물 투여 후 이러한 행동이 일어나기까지의 시간을 기록하였다. 관찰 주기의 말기에, 이 동물을 집 우리에 돌려보냈다. 각 연구 사이에 7일의 간격을 두었다. 구토 효과가 관찰될 때까지 매 연구일마다 각 화합물의 투여량을 증가시켜 개에게 투여하였다. 구토 효과가 관찰된 개는 연구를 중단하고, 아직 반응하지 않은 개들에게만 투여량을 증가시켜 평가하였다.

상기 데이터를 계수(quantal)투여 반응 곡선에 대하여 문헌에 기재되어 있는 대로 각각 투여에서 반응하는 개의 누적 백분율로 나타냈다. ED₅₀값을 프로빗분석(probit analysis)을 사용하여 계산하였다.

실시예 4

기니픽 호산구(Eosinophil) 분석

호산구 단리와 정제

수컷(Hartley, Hazelton Labs) 기니픽을 사용하기에 앞서, 각 동물에게 4~6주 동안 매주 말(horse) 혈청 1ml를 주입하였다. 동물들은 말 혈청 주입후 적어도 24시간에 케타민/크실라진(88mg;12mg/ml;0.4ml/kg)의 혼합물에 의해 마비되었다. 마비가 일어난 후에 복막안을 따뜻한 멸균 식염수(09%) 50ml로 세척하였다. 이 세척 유체를 14G 카테테르(catheter)를 사용하여 50ml 플라스틱 원뿔형 원심분리 튜브에 수집하였다. 이 기니픽을 마비에서 회복시키고 2주간 휴식시킨 후 재사용하였다.

세포들을 상기 세척 유체로부터 원심분리(400×g, 10분)에 의하여 단리하고, 이 세포들을 포스페이트 버퍼 식염수(PBS) 35ml내에 재현탁하고, 등장 Percoll(1.075g/ml) 10ml로 하지(underlay)하였다. 이 현탁액을 300×g에서 30분간 원심분리하였다. 주로 호산구와 적혈구를 함유하는 펠렛을 PBS로 세정하고 적혈구를 용해하였다. 이들 세포들을 20% FBS를 갖는 RPMI 1640 배지내에 재현탁하고, 습도 5% CO₂배양기내에서 37℃에서 하루밤 배양하였다. 다음날 세포 생육성(trypan blue 배제법)과 순도의 결정을 위하여, 세포들을 세정하고 PBS내에 재현탁하였다.

초과산화물 음이온 생성(O ₂ ^- )

정제된 호산구(생육성>95%, 순도>90%)를 20mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 및 0.1% 겔라틴을 갖는 PBS내에 농도 1~2 ×10⁶cell/ml로 재현탁하였다. 호산구(1×10⁵)를 96웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 약 1시간 배양하였다. PDE4 억제제들은 반응 개시에 앞서 첨가하였다. 초과산화물 디스무타제(SOD) 60 단위의 존재 또는 부존재하에서 시토크롬C(160μM) 및 포르밀Met-Leu-Phe(fMLP)(30nM)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 시토크롬C 환원은 여러 시점에서 630nm를 기준으로 하여 550nm에서 Dynatech MR 7000 플레이트 판독기로 감시되었다. O₂ ^-생성 속도는 SOD의 존재 또는 부존재하에서 여러 시간점에서 웰의 순 흡수도를 사용하여 선형 회귀 분석에 의하여 결정되었다. 결과는 대조 O₂ ^-생성에 대한 백분율을 기초 방출(basal release)에 대해 보정하여 표시하였다. 관찰된 최대 억제는 60%이었으므로, logIC₃₀을 농도 구간 30%의 선형 삽입법을 이용하여 계산하였다.

실시예 5

기니픽의 기관지 수축

수컷 하트리 기니픽(Male Hartley guinea pig)(200~250g/4주,Hazelton Research, Denver, PA)는 5%(w/v) 오발부민/증류수 용액 0.35ml를 각 대퇴부에 1일과 4일에 I.M. 주입(전체 0.35ml)함으로써 감작(sensitization)되었다. 기니픽은25일후에 사용할 수 있었다.

실험 과정

오발부민에 활성적으로 감작화된 수컷 하트리 기니픽(600~800g Hazelton)을 수술에 앞서 소듐 펜토바비탈(40mg/kg I.P.)로 약 10~15분간 마비시켰다. 경정맥, 경동맥, 기도에 약 투여, 혈압 감시 및 환기를 위하여 도관(Deseret Intracath(등록상표) Vialon(등록상표) 중합체 수지 방사선 불투과성의 카테테르(Deseret Medical, Inc., Sandy, UT), 22GA 및 19GA, PE 튜브 260)를 삽입하였다. 콜린작동 방해를 최소화하기 위하여 좌우대칭의 미주신경절단술을 행하였다. 동물들을 판크로늄 브로마이드 0.1mg/kg i.v.로 마비시키고, Havard Rodent Respirator(모델 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA)로 환기(45 호흡/분)시켰다. 기도압 변화를 Elcomatic transducer(Buxco Electronic, Sharon, CT)를 갖는 기관 도관(tracheal cannula)의 사이드암(side arm)을 통하여 측정하였다. 환기 박출량은 사이드암 압력이 H₂O 8cm(약 5cc 실내대기)가 되도록 설정하였다. 혈압은 Statham P23XL Physical Pressure Transducer(Vigg-Spectramed, Oxnard, CA)으로 측정하였다. 압력은 Grass Model 7D Polygraph(grass InstrμMent Co., Quincy, MA)로 기록하였다. 이 동물들을 실험기간 내내 가열 테이블 위에서 따뜻하게 하여 체온을 유지시켰다.

시험 화합물 또는 부형제를 항원 감염에 앞서 i.v. 루트를 거쳐 10분간 투여하였다. 0 시간점에서, 0.1mg/kg 오발부민을 i.v. 루트를 거쳐 투여하였다. 항원반응의 정점에서, 항원의 추가량, 0.2mg/kg 오발부민을 i.v. 루트를 거쳐 투여하였다. 오발부민 누적량 0.3mg/kg으로 항원 반응이 정점에 도달한 후에, 포화 KCl 용액 1cc/kg를 i.v. 루트를 거쳐 투여하여 최대 기관지 수축을 일으켰다.

실시예 6

인간 단구내에서의 LPS 유도 TNF _α 의 억제

시험관내 연구

TNF_α억제가 LPDE4 또는 HPDE4의 억제와 관련이 있는지를 결정하기 위하여, LPDE4와 HPDE4에 대해 일정 범위의 역가를 갖는 일련의 PDE4들을, 지질다량류(LPS)로 자극된 인간단구에서 TNF_α생성을 억제하는 이들의 능력에 따라 시험관내에서 선별하였다. 이 선별을 위하여 1차 인간 세포를 사용하는 것이 아주 중요한데, 다른 종들은 염증 세포에서 cAMP를 가수 분해하는데 LPDE4와 HPDE4의 상대적 기여가 아주 다르기 때문이다.

방법

일반 인간 제공자로부터 새롭게 얻은 연막(buffy coat) 또는 혈장 영동(plasma-phoresis) 잔사로부터 정제된(Collata) 인간 말초혈 단구에서 TNF_α억제를 분석하였다. 단구를 24 웰 다중 그릇내에 1×10⁶세포/ml 배지액/웰의 밀도로 놓았다. 이 세포들을 1시간 동안 유착시킨 후, 상징액을 빨아들이고, 새로운 배지액(1% 태아 송아지 혈청과 페니실린/스트렙토마이신을 10U/ml 함유하는 RPMI-1640)1ml를 첨가하였다. 상기 세포들을 LPS(E.coli055;B5, Sigma Chemical) 첨가에 앞서 시료 화합물의 존재 또는 부존재하에서 농도 범위 1nM~1mM로 45분간 배양하여 최종 농도 100ng/ml를 얻었다. 단구 배지액내의 최종 용매 농도가 0.5% 디메틸설폭사이드와 0.5% 에탄올이 되도록, 시료 화합물을 디메틸설폭사이드/에탄올의 50:50 농도로 용해하고 희석하였다. 37℃/5%CO₂로 14~16시간 배양한 후에 단구로부터 배양 상징액을 제거하고, 100×g로 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 사이토킨 분석을 즉시 행하거나 또는 배양 상징액을 분석할 때 까지 -70℃로 저장하였다.

TNF_α의 농도를 포획 항체로서 쥐의 단클론 항-사람 TNF_α항체를 사용하고 2차 항체로서 다클론 토끼 항-사람 TNF_α를 사용하여 ELISA(Winston)를 이용하여 측정하였다. 검출을 위하여, 다음에 퍼옥시다아제 결합 염소 항토끼 항체(Boehringer Mannheim, Cat. #605222)를 첨가하고, 이어서 퍼옥시다아제용 기질(0.1% 우레아 퍼옥사이드를 갖는 오르토페닐렌디아민 1mg/ml)을 첨가하였다. 시료내 TNF_α농도를E.Coli에서 만든 재조합 인간 TNF_α에서 얻어진 표준 곡선으로부터 계산하였다. 인간 TNF_α에 대한 단클론 항체를 재조합 인간 TNF_α으로 면역된 BALB/c 쥐의 지라로부터, Kohler와 Millstein(Nature, Vo. 256, P495-497, 1975)의 방법을 수정하여 준비하였다. 다클론 토끼 항-사람 TNF_α항체는 완전 프로인트 보조액에 유화된 재조합 인간 TNF_α로 뉴질랜드 흰토끼를 반복 면역화시켜 준비하였다.

양자 복막염 모델에서의 인간 TNF _α 생성의 생체내 억제

방법

헤파린 처리 정맥 전혈의 1/2 단위를 아무런 약도 복용하지 않고 있는 건강한 종업원으로부터 뽑았다. Histopaque-1077 상에 혈액을 적층하고, 25℃에서 30분간 800×g로 원심분리하여 다형핵백혈구를 분리하였다. 림프구/단구 부분을 하베스팅하고, 25℃에서 10분간 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)으로 2번 세정하였다. 이 펠렛을 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS내에 재현탁하고, 25℃에서 혈청이 없는 RPMI 1640 배양액에서 제조한 5ml Percoll 용액상에 적층하고, 25℃에서 30분간 550×g로 원심분리하였다. 단구의 부양층(buoyant layer)을 제거하고, 25℃에서 10분간 1000rpm에서 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS로 2번 세정하였다. 최종으로 세정된 단구 단리물을 25℃에서 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS내에 6~10×10⁶세포/ml로 재현탁하였다. 또한 Source Leukocyte 팩으로부터 동일 과정을 거쳐 단구를 단리하였다. 단구 제조물은 65~90% 단구 범위이며, 이 세포들의 생육성은 97%이상이었다(트리판 블루 배제법).

4 또는 5마리씩 군을 이룬 BALB/c 수컷(Chares River Laboratories, Wilmington, MA)을 장벽으로 지지된 설비내에 유지하였다. 무게가 18~25g이고 같은 나이의 쥐들에게 단구들이 최소 전단력과 응력에 노출되도록 23ga 바늘의 주사기로 약한 압력을 사용하여, 복막내로 6~10×10⁶단구/ml 주입하였다. 단구들을 주사한지 2분내에, 이 쥐들에게 부형제 또는 화합물을 15분간 경구 투여하여 치료하였다. 그 후 이 동물들에게 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS에 용해한 내독소(E. coli., W, Difco) 125mg/ml의 0.2ml를 복막내(i.p.)에 주사하였다. 2시간 후, 이 동물들을 이산화탄소로 질식시켜서 안락사시키고, Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS(4℃) 1.5ml를 복막내에 주입하였다. 복막을 부드럽게 마사지하고, 세정액을 제거하고, 빙조내의 폴리프로필렌 튜브에 넣었다. 시료를 원심분리 (12,000 ×g, 4℃에서 5분간)에 의해 맑게 하였다. 상징액을 새로운 튜브(-20℃에서 저장)에 데칸테이션하고, 인간과 쥐 TNF_α를 ELISAs를 사용하여 분석하였다. ED₅₀값을 표준 방법에 의하여 계산하였다.

실시예 7

인간 호중구 방법(HμMan Neutrophils Method)

단리와 정제

헤파린 처리 혈액으로부터, Ficoll(Histopaque 1077)를 사용한 구배(gradient) 원심분리와, 이어서 적혈구를 제거하기 위한 덱스트란 침전에 의하여 호중구(PMN)를 단리하였다. 남아있는 적혈구를 물로 30초간 용해(lyse)하고, 10X DB-PBS(w/o Ca²⁺와 Mg²⁺)를 사용하여 등장성을 회복하였다. PMN을 원심분리에 의하여 단리하고, IX DB-PBS으로 한번 더 세정한 후에 세포수와 생육성(트리판 블루 염료 배제법)을 결정하였다. 세포수는 각각의 공여자에 따라 0.75~1.5×10⁶세포 /ml로 조절하였다.

과립 감소(미엘로퍼옥시다아제의 방출)

상기 세포 현탁액의 일부(0.1ml)를 사이토칼라신B 5ug/ml의 존재하에 20mM HEPES버퍼(pH 7.4)와 0.1% 겔라틴을 함유하는 Earles Balanced Salt Solution내에서 37℃에서 5분 동안 진탕 수조(shaking water bath)내에서 배양하였다. fMLP(30nM)를 첨가하기에 앞서서, 세포들을 각종 농도의 선택적 PDE4 억제제와 PGE₂(3~10nM)로 5분동안 추가적으로 예비 처리하였다. fMLP를 첨가하고 30분동안 계속해서 배양하였다. 시료를 얼음 위에 놓아 반응을 종료하고 이어서 원심분리하였다. 상징액 분획을 제거하여 미엘로퍼옥시다아제 활성을 분석하기까지 -30℃에서 저장하였다.

미엘로퍼옥시다아제 활성의 결정

미엘로퍼옥시다아제의 활성을 기질로써 o-디아니시딘을 사용하고 표준구로서 고추냉이 퍼옥시다아제를 사용하여 결정하였다. 상징액의 일부(50ul)를 기질(o-디아니시딘, 0.53mM; H₂O₂, 0.147mM; 최종 농도) 100ul과 함께 50mM Na 포스페이트 버퍼(pH 6.0)내에서 배양하였다. 반응을 4M H₂SO₄50uL을 첨가하여 종료하였다. 생성물 형성을 410nm에서의 흡수도를 측정하여 결정하고, 활성을 고추냉이 퍼옥시다아제를 사용한 표준 곡선과 비교하여 결정했다. 데이터를 대조구(PGE₂만 존재할 때방출된 미엘로퍼옥시다아제의 양)의 백분율로써 나타냈다. 화합물의 대부분에서 관찰된 최대 억제가 30%이었기 때문에, log(IC₁₅)를 농도 구간 15%의 선형 삽입법을 이용하여 계산하였다.

실시예 8

쥐에서의 레세르핀 유도 저체온(Hypothermia)의 반전

수컷 CF-1 또는 BALB/c 쥐들을 각각 철사 우리에 격리하였다. 레세르핀(10mg/kg, i.p.) 예비 처리에 앞서서, 각 쥐의 직장(rectal) 온도를 기록하였다. 레세르핀 처리후 4시간 동안 직장 온도를 기록하였고, 개개의 동물에게 시료 화합물, 부형제, 또는 롤리프람(10mg/kg)의 하나를 다양한 투여량으로 처리하였다. 그 후 직장 온도를 2시간 동안 30분 간격으로 측정하였다. 데이터는 레세르핀 처리후 4시간 동안 관찰된 온도로부터의 온도 변화로서 나타냈다(온도는 기준 레벨보다 약 10~15℃ 떨어졌음). 투여량-반응 곡선은 처리후 90분 또는 120분에서 기록한 온도 변화를 사용하여 작성하였다. ED₅₀값은 6~9 동물의 프로빗 분석 또는 선형 회귀법에 의하여 결정했다. 레세르핀 유발 저체온을 반전시켜 화합물의 능력과 저친화성 결합 또는 고친화성 결합을 억제하는 이들 화합물의 능력을 비교하기 위하여, ED₅₀값과 IC₅₀값을 -log(값)으로 나타냈다.

실시예 9

PDE4의 생화학적 기능과 억제 사이의 관계

PDE4 억제제의 특정 생화학적 효과가 LPDE4 또는 HPDE4의 억제와 연관되어있는지의 여부를 결정하기 위하여, 효과를 생성하는 화합물의 능력과 LPDE4 또는 HPDE4를 억제하는 화합물의 능력 사이의 관계를 선형 상관관계 및 순위서열 상관관계를 사용하여 결정하였다. 이들 상관관계는 여러 인자에 의하여 영향을 받을 수 있다: 1) 화합물의 안정성; 2) 세포에 침투하는 화합물의 능력; 3) 생체내 연구에서는, 화합물의 생체이용률; 4) 상관관계 값, 특히 선형 상관관계가 역가의 차이에 민감하며, 역가의 범위가 클수록, 상당한 선형 상관관계를 측정하기가 쉽다. 이들 기재사항을 각종의 분석 시스템에서 LPDE4 또는 HPDE4의 억제와 생화학적 기능 사이에 상관관계를 분석하고 종합할 때 고려하였다.

단리된 염증 세포를 사용하여, 기니픽에서 단구 TNF_α생성의 억제와 초과산화물 생성의 억제는 LPDE4의 억제와 좋은 상관관계가 있고 HPDE4의 억제와는 아니었다. 또한 생체내 항원 유발 기관지 수축의 예방은 HPDE4보다 LPDE4의 억제와 좋은 상관관계가 있었다. 이 생체내 모델에서, PDE4 억제제는 비만 세포 과립감소(Underwood 등, 인쇄중)를 저지하는 작용을 하는 것 같다. 그러나, 호중구 과립감소의 억제가 LPDE4보다 HPDE4의 억제와 더 좋은 상관관계가 있음이 발견되었기 때문에, 염증 세포 기능의 억제는 LPDE4의 억제와 항상 관련되는 것은 아니다. 따라서 염증 세포 활성의 억제는 모두는 아니나 약간 LPDE4의 억제와 연관되어 있는 것 같다. 이와 대조적으로, 산 분비의 증강, 구토 생성 및 레세르핀 유발 저체온의 반전(PDE4 억제제의 향정신성 잠재능의 측정)은 HPDE4의 억제와 좋은 상관관계에 있고 LPDE4의 억제와는 아니었다. 따라서 이런 종류의 화합물의 잠재적부작용 대부분은 HPDE4의 억제와 연관되어 있다.

따라서 이들 발견은, LPDE4를 우선적으로 억제하는 화합물들은 바람직스럽지 않는 부작용을 일으키는 잠재능이 더 저하되면서 유익한 항염증 효과를 나타낼 것임을 시사한다. 따라서 롤리프람에 고친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀을 롤리프람에 저친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀으로 나눈 IC₅₀비가 약 0.5 이상을 갖는 화합물을 선택하여야만 이들의 치료 지수의 증가, 즉 유익한 효과가 최대로 되며 해로운 효과가 최소로 된다.

이 선택 지침이 치료 지수를 향상시키는 화합물을 실제로 동정하는지 여부를 결정하기 위하여, 치료 효과와 부작용을 비교한 3개 모델을 평가하였다. 이들은 단리된 토끼 두정선(parietal gland)내에서의 산 분비를 자극하는 화합물의 능력과 단리된 인간 단구로부터 TNF_α생성을 억제하는 화합물의 능력의 하나의 시험관내 비교예와, 기니픽에서의 항원 유발 기관지 수축을 예방하는 화합물의 능력과 개에서의 구토를 일으키는 능력과 쥐의 양자 이식 모델에서의 TNF_α생성을 억제하는 화합물의 능력과 쥐에서의 레세르핀 유발 저체온을 반전하는 화합물의 능력을 시험하는 2개의 생체내 비교예들을 포함한다.

선택성비(HDPE4/LDPE4)가 0.1 이상인 PDE4 억제제들이 치료 지수의 현저한 향상을 나타냈다. 예를 들어, 선택비가 0.1 이상인 시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트], 2-카보메톡시-4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-온, 및 시스-[4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-올]은 전형적인 PDE4 억제제(예: R-롤리프람)에 비하여 치료 지수가 100배 향상됨을 나타낸다. 따라서, 선택 지침 HDPE4 IC₅₀/LDPE4 IC₅₀≥0.1을 사용하면 시험관내(in vitro) 비교에서 치료 지수를 증가시키는 화합물을 동정할 수 있음을 나타낸다.

EIA를 치료하기 위하여, 시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트]를 EIA 환자에게 투여하였다. 이 환자들에게서 염증 저감, 기관지 확장 및 폐 신경 조절(neuromodulation)이 나타났다.

운동 자극 연구(Exercise Challenge Study)

EIA 환자에서의 시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트]의 유효성, 안정성과 내성을 분석하기 위하여, 무작위, 이중맹검, 위약(placebo) 투여 , 2기 교차 연구를 행하였다. 무작위로 추출한 EIA 환자 27명에게 7일 동안 10mg의 BID 속방성 타블렛 또는 위약을 투여한 후 7일째 장세척하고 7일 동안 대체 치료를 하였다. 운동 자극 시험은 1일째, 그리고 7일째에 1회량 투여한 후에 행하였다(투여전과, 투여후 3시간).

환자들은 a) 1초내의 강제 호흡량(FEV₁)이 예상 기준의 70% 이상이고, b) FEV₁의 서류상 저하가 스크리닝 비지트에서 운동 시험에 대응하여 15% 이상이고, c) 천식 치료를 위하여 코르티코스테로이드 또는 다른 조절 약물을 흡입하지 않은, EIA에 걸린 연령 18~60세의 비흡연 남녀로 구성되었다.

상기 운동 자극 프로토콜은 다음과 같다. 환자들은 모터 부착 러닝 머신 위에서 표적 심박동수로 6분간 운동하였다. 속도와 경사는 각 환자마다 표적 심박동수가 연령 적용 최대 예상치의 85%가 되도록 조절하였다. 환자들은 시험 동안 안면 마스크를 통하여 압축 공기(실온에서 습도 0%)를 마셨다. 폐기능 시험(KoKo pneμMotach)은 상기 시험 종료후 1, 5, 10, 15, 20, 30 및 45분에 행하였으며, FEV₁이 기준선의 10% 이내로 회복되지 않았으면 그 후 계속하였다.

주 유효성 변수는 운동에 따른 FEV₁의 최대 %감소율(MPD)이었다. 상기 화합물을 1회분 투여후 평균 MPD가 32.88%에서 23.57%로, MPD FEV₁가 상당히 향상되었다. 투여 7일 후에 화합물의 증량효과가 나타나서, 평균 MPD FEV₁가 21.8%로 더 향상되었다. 치료 1주일 후에, 이 화합물을 투여한 환자 40%가 운동 후에 FEV₁이 15%이하로 떨어졌다. 상기 화합물은 치료와 관련된 심각한 역작용 또는 금단없이, 안정하며 내성이 양호하였다. 또한 본 명세서 전반에 걸쳐 참조문헌으로 포함되어 있는Am. J. Resp. Crit. Care Med. 1998:157; A413를 참조하였다.

본 명세서에서 참조문헌으로 인용되어 있는 특허 및 특허 출원뿐만 아니라, 구체적으로 개별적으로 본 명세서의 참조문헌으로 포함됨을 나타내는 모든 공보물을 본 명세서의 참조문헌으로 포함된다.

Claims

R-롤리프람에 고친화성으로 결합하는 포스포디에스테라아제4(PDE4) 촉매 형태에 대한 IC₅₀을 R-롤리프람에 저친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀으로 나눈 IC₅₀비가 약 0.1 이상인 화합물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, R-롤리프람에 저친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태를 우선적으로 억제함으로써, 포유 동물이 앓을 수 있거나 또는 현재 앓고 있는 운동 유발 천식, 찬 공기 유발 천식 또는 공해 유발 천식을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 IC₅₀비가 0.5 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 IC₅₀비가 1.0 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여 화합물이 경구용 속방성 또는 서방성 제제로 투여되는 시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트]인 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 예방되거나 치료되는 질병이 운동 유발 천식인방법.
R-롤리프람에 고친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀을 R-롤리프람에 저친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태에 대한 IC₅₀으로 나눈 IC₅₀비가 약 0.1 이상인 화합물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유 동물이 앓을 수 있거나 또는 현재 앓고 있는 운동 유발 천식, 찬 공기 유발 천식 또는 공해 유발 천식의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, R-롤리프람에 저친화성으로 결합하는 PDE4 촉매 형태를 우선적으로 억제할 수 있는 PDE4 특이적 억제제의 용도.
제6항에 있어서, 상기 IC₅₀비가 0.5 이상인 제법.
제6항에 있어서, 상기 IC₅₀비가 1.0 이상인 제법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용된 화합물이 시스-[4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카복실레이트]이고 또한 경구용 속방성 제제 또는 경구용 서방성 제제로 제조되는 제법.