KR20010102351A - 진단 시험 - Google Patents

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KR20010102351A
KR20010102351A KR1020017010738A KR20017010738A KR20010102351A KR 20010102351 A KR20010102351 A KR 20010102351A KR 1020017010738 A KR1020017010738 A KR 1020017010738A KR 20017010738 A KR20017010738 A KR 20017010738A KR 20010102351 A KR20010102351 A KR 20010102351A
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알라스털 캠프벨 애그뉴 글렌
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Abstract

특히 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병의 진단에 사용하기 위한, 적혈구를 사용하는 단계를 포함하는, IV형 세포질성 포스포리파제A2(cPLA2) 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 검출용 검정.

Description

진단 시험{DIAGNOSTIC TEST}
포스포리파제A2(cPLA2) 효소는 글리세로포스페이트(glycerophosphate)의 Sn2 아실-에스테르 결합의 가수분해를 촉매하여 유리 지방산을 배출시키는 능력에 특징이 있다(Mayer R.J. 및 Marshall L.,FASEB J, 7, 339∼348; Dennis E.A., Ed., Phospholipase A2Methods in Enzymology, 1991, 197, 359∼433). 과학문헌에 의하면, 여러 형의 PLA2효소가 알려져 있다(Dennis E.A.,Trends Biochem. Sci., 22, 1∼2). I, II 및 III형은 분비성 포스포리파제 A2(sPLA2) 효소라고 한다. 분비성 포스포리파제 A2효소는 분자량이 약 14kDa이고, 세포외에서 발견되었고, 혈장 속에서도 확인되었다.
IV형 PLA2효소는 세포질성 포스포리파제 A2(cPLA2) 효소라고 한다. 이는 C2 도메인이라는 칼슘 결합 도메인이 있는 것이 특징이며, 그 포스포리파제 활성은 고도로 불포화된 지방산, 특히 Sn2 아실-에스테르 글리세로포스페이트 결합에 있는아라키돈산(arachidonic acid)에 아주 특이적이다. 세포막 인지질로부터 아라키돈산을 배출시킬 수 있는 능력으로 인하여, 아라키도네이트의 공급과 그에 따른 세포 신호 전달과정에 있어서의 작용의 조절에 중심적 역할을 한다.
PLA2효소의 또 다른 형은 역시 세포질성 PLA2효소이나, 인지질 아실에스테르 가수분해를 위한 글리세로포스페이트의 Sn2 위치의 아라키돈산에 대한 높은 특이성은 없는 VI형 효소이다(Tang J. 등,J. Biol. Chem., 272, 1997, 8567∼8575). 이 효소는 촉매 활성을 위하여 칼슘 수준에 의존적이지 않다는 것이 확인되어 iPLA2라고 한다.
IV형 아라키도네이트-특이성 cPLA2효소는 인간 모노사이트(Clark J.D 등,Cell, 65, 1991, 1043∼1051; Kramer R.M. 등,J. Biol. Chem., 266, 1991, 5268∼5272) 및 인간 혈소판(Takayama K. 등,FEBS, 282, 326∼330)을 포함한 많은 조직에서 동정되었다.
IV형 cPLA2의 아미노산 서열은 인간 모노사이트(U937) 세포로부터 정제된 효소에 대해 결정되었다(Clark J.D. 등,Cell, 65, 1991, 1043∼1051). U937 세포에서 발견된 IV형 cPLA2는 749개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 가지고 있다. 이 서열에는 단백질 키나제 C(PKC), GTPase 활성화 단백질(GAP), 포스포리파제 C 및 시냅스 낭 단백질 p65를 포함한 제한된 수의 다른 단백질과 상동성을 보이는 영역이 있다. 상동성의 위치는 상기 서열의 36번 내지 81번(NH2말단 끝으로부터)아미노산 또는 그 근처인 소위 칼슘 결합 부위인 단백질의 N말단 끝 쪽에 있다(Nalefski 등,J. Biol. Chem., 269, 18239∼18249). 129번 내지 135번 아미노산 유래의 서열이 폐 계면활성제 단백질 C(Clark 등,J. Lipid Mediators Cell Signalling, 12, 83∼117) 및 cPLA2β와 cPLA2γ로 명명된 최근 보고된 두개의 효소(R.T. Pickard 등,J. Biol. Chem., 1999, 274, 8823∼8831)에서 공통인 것을 제외하고는, 다른 포유동물 단백질과 IV형 cPLA2의 82번 내지 749번 아미노산 사이에 상동성을 보이는 영역은 알려지지 않았다. 상기 두개의 효소는 인간 U937 모노사이트로부터 분리된 cPLA2효소(지금은 cPLA2α로 명명될 수 있다)와는 다른 단백질이다. cPLA2α, β및 γ의 서열 상동성은 cPLA2α의 228번 세린 내지 232번 트립토판에서 발견된 5개 아미노산에 한정된다.
IV형 cPLA2의 촉매 활성 중심은 228번 아미노산을 포함하는 펩티드 서열에 위치하고 있는 것으로 보고되었고(Clark J.D. 등,J. Lipid Mediators Cell Signalling, 12, 83∼117), 최근에는 분자의 겹쳐진(folded) 3차 구조에서는 인접하게 되는 두 아미노산, 즉 228번 세린과 549번 아스파테이트의 인접성에 따라 달라진다는 설명이 있었다(Dessen A. 등,Cell, 1999, 97, 349∼360).
종래의 혈액 중에 있는 PLA2효소의 관찰은 기질 검정 방법(substrate assay method)에 의하여 혈청 또는 혈장 내에서 측정하는 것에 방향을 두었으며, 관련된 효소의 형을 확인하지는 않았다(Thuren T. 등,Clin. Chem., 31, 1985, 714∼717;Gattaz W.F. 등,Biol. Psychiatry, 22, 1987, 421∼426; Gattaz W.F. 등,Biol. Psychiatry, 28, 1990, 495∼501). 혈청 및 혈장 PLA2효소는 인간 정신분열증에서는, 이 역시 관련된 효소의 PLA2형은 특징짓지 못하였지만, 정상 대조군 피검체에 대하여 상대적으로 높은 활성을 보였다. 최근까지, 적혈구 내에 있거나 적혈구에 부착된 세포질성 포스포리파제A2IV형 단백질이 생리적으로나 병리학적으로나 확인된 바는 없었다.
IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2에 면역학적으로 상동성인 단백질이 순환중인 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 cPLA2단백질의 검출 및 검정은 질병의 진단, 치료에 대한 환자 반응의 모니터링 및 cPLA2의 활성 또는 농도에 영향을 미치는 약제개발에 적용된다. 이들 cPLA2단백질들이 적혈구 내 또는 적혈구 상에서 검출될 수 있다는 것을 확인하므로써, 간단하고 편리한 cPLA2수준의 검정방법이 제공될 수 있게 되었다.
본 발명은 세포질성 포스포리파제A2효소 단백질의 동정 및 그들의 응용, 특히 진단, 치료 모니터링 및 약제개발에 관한 것이다.
도1a 및 도1b는 하기 시료에 대한 두개의 웨스턴 블롯 분석(도1a는 시험 막이고, 도1b는 대조군(blank) 막이다)을 나타낸다:
레인1 : 분자량 마커
레인2 : IV형 cPLA2를 발현하는 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 유래의세포질.
레인3 : 환자 시료. 시료는 클로자핀(clozapine)(레인 4, 7, 9 및 10)에 대한 정신분열증 환자, 신경이완제(neuroleptic drugs)에 대한 정신분열증 환자(레인 8 및 12) 및 대조군 환자(레인 3, 5, 6 및 11)로부터 취해졌다.
도2는 표준 편차가 표시된 10개의 별개의 검정으로부터 얻은 보정 곡선을 나타낸다.
도3A, 3B 및 3C는 ELISA 법에 의하여 측정된, g 헤모글로빈(Hb) 당 cPLA2㎍으로 나타낸 적혈구 IV형 cPLA2또는 단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 빈도 히스토그램으로서, 각각, 대조군 그룹, 정신 분열증 그룹 및 독서장해증 그룹에 관한 것이다.
도4는 SDS PAGE/웨스턴 블롯에 의하여 관찰된, 적혈구 파열물(haemolysates)에서의 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질 및 대조군 환자로부터 유래한 적혈구 파열물(haemolysates)에서 관찰된 단백질을 나타낸다.
레인1: 분자량 마커.
레인2: IV형 cPLA2를 발현하는 바큘로바이러스로 감염된 곤충세포 유래의 세포질.
레인3: cPLA2단백질을 포함하는 인간 모노사이트 U937 유래의 세포질.
레인4: 대조군 환자 유래의 적혈구 파열물.
레인5: 정신분열증 환자 유래의 적혈구 파열물.
본 발명의 첫 번째 양상에 따르면, 적혈구를 이용하는 단계를 포함하는, IV형 cPLA2또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질 검출을 위한 검정이 제공된다. 본 발명의 두 번째 양상에서는, 적혈구 시료에서의 IV형 cPLA2및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질 정량을 위한 검정이 제공된다. 상기 검정은전체 혈액 시료에 대하여 행하여지거나 전체 혈액으로부터 분리된 후, 적혈구 시료에 대하여 행하여질 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질"이라는 용어는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 어떠한 부분으로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들, 바람직하기로는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산으로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들을 인지하는 항체 또는 항체들에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, "IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질"이라는 용어는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 촉매 활성 중심을 포함하는 펩티드 서열 또는 서열들로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들을 인지하는 항체 또는 항체들에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, "IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질"이라는 용어는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 241번 내지 260번 아미노산의 펩티드 서열로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들을 인지하는 항체 또는 항체들에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다.
또 다른 구체예에 있어서, "IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질"이라는 용어는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 어떤 일부분또는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 서열과 일치하는 합성 펩티드로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. 바람직한 또 다른 구체예에 있어서, "IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질"이라는 용어는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산, 바람직하기로는 촉매 활성 중심을 포함하는 펩티드 서열 또는 서열들로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들 또는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산의 서열, 바람직하기로는 촉매 활성 중심을 포함하는 서열 또는 서열들과 일치하는 합성 펩티드로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. 더욱 바람직한 또 다른 구체예에 있어서, "IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질"이라는 용어는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 241번 내지 260번 아미노산의 펩티드 서열로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들 또는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 241번 내지 260번 아미노산의 펩티드 서열로부터 유래한 아미노산의 서열과 일치하는 합성 펩티드로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다.
본 발명의 세번째 양상에 따르면, 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병의 진단 방법이 제공된다. 상기 방법은 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 수준을 결정하는 단계 및 선택적으로는, 이 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "고도로 불포화된 지방산"이라는 용어는 IV형 cPLA2효소의 작용에 의하여 배출된 모든 지방산을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에 있어서, "고도로 불포화된 지방산"이라는 용어는 3이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방산을 포함한다. 특히, 상기 용어는 필수 지방산, 구체적으로는 디호모감마리놀렌산(dihomogammalinolenic acid)(DGLA; 8,11,14-eicosatrienoic acid), 아라키돈산(AA; 5,8,11,14-eicosatetraenoic acid), 아드렌산(adrenic acid)(7,10,13,16-docosatetraenoic acid), 4,7,10,13,16-docosapentaenoic acid, 스테아리돈산(stearidonic acid)(SA; 6,9,12,15-octadecatetraenoic acid), 8,11,14,17-아이코사테트라에논산(8,11,14,17-eicosatetraenoic acid), 아이코사펜타에논산(eicosapentaenoic acid(EPA;5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid)), 도코사펜타에논산(docosapentaenoic acid(DPA; 7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid)) 및 도코사헥사에논산(docosahexaenoic acid(DHA; 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid))이 포함된다.
본 발명의 제4의 양상에 의하면, 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병을 앓는 환자에게 투여된 약물의 유효성을 모니터링하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 예컨대, 시험될 화합물을 환자에게 투여하는 단계, 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 수준을 결정하는 단계 및 선택적으로, 이 수준을 대조군 수준 또는 약물 투여의 초기 단계나 약물투여 개시 전에 결정된 수준 또는 수준들과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제5의 양상에 따르면, 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병용 약제개발 방법이 제공된다. 상기 방법은 예컨대, 시험될 화합물을 환자나 시험 동물에 투여하는 단계, 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 수준을 결정하는 단계 및 선택적으로, 이 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방법이며, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병의 치료에 사용되는 화합물의 탐색에 사용될 수 있다.
본 발명은 구체적으로는 아라키돈산, 디호모감마리놀렌산, 아이코사펜타에논산, 도코사펜타에논 및/또는 도코사헥사에논이 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 아라키돈산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병에 관한 것이다.
적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 동정에 유용할 수 있는 질병 조건에는 다음이 포함된다:
1) cPLA2발현 및 활성의 증가에 의하여 질병이 발생하는 것으로 그 기작이 제안되어 있는 정신분열증;
2) cPLA2이상이 존재할 수 있는 이극성 또는 정신이상성 우울증;
3) 종양괴사 인자가 cPLA2활성을 촉진하는 악액질;
4) cPLA2가 손상된 막으로부터 또는 아포토시스(apoptosis)과정의 일부분으로서 방출되는 발작(stroke) 및 기계적 상처를 포함한 뇌상;
5) 비정상적 cPLA2활성이 있을 수 있는 독서장해증;
6) IV형 cPLA2활성 또는 농도가 정상 수준으로부터 증가하거나 감소된 어떤 다른 질병 또는 질병과정, 특히 IV형 cPLA2활성 또는 농도가 증가된 어떤 질병 또는 질병과정.
본 발명의 검정 및 방법은 피검체로부터 혈액 시료를 수집하는 단계, exvivo에서 단백질을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하기로는, 적혈구를 다른 혈액성분으로부터 분리하는 단계, 초음파 처리, 질소 캐비테이션, 냉동 또는 파열(lysis)와 같은 방법에 의하여 적혈구를 파괴하는 단계 및 직접적 또는 단백질 분리 기술 적용 후 단백질을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 검정 및 방법을 위한 또 다른 적용에는 적혈구를 사전 분리한 또는 사전 분리하지 않은 전체 혈액의 사용을 포함하고, 그러한 적용에는 예컨대, 근접-환자 시험 진단 스트립(near-patient testing diagnostic strip), 카트리지 또는 장치가 포함될 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 검정 및 방법은 3개의 특정 단백질 그룹들 중 하나이상으로부터 하나이상의 단백질을 적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 검출하는 것을 포함한다. 상기 단백질은 웨스턴 블롯을 추가한 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS PAGE)을 사용하여 측정한 추정 분자량에 의하여 그룹지어지며, 그 결과 다음과 같이 명명될 수 있다;
추정 분자량이 80∼110kDa 범위, 특히 90∼105kDa 범위인 하나이상의 단백질을 포함하는 그룹 A;
추정 분자량이 70∼80kDa 범위인 하나이상의 단백질을 포함하는 그룹 B;
추정 분자량이 50∼60kDa 범위인 하나이상의 단백질을 포함하는 그룹 C.
주어진 한 그룹 내의 단백질은 구조적으로 관련되고, 주어진 한 그룹 내의 단백질 사이의 추정 분자량의 변이는 인산화의 정도 때문일 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명의 범위를 이들 이론에 한정하고자 하는 것은 아니다. 주어진 한 그룹내의 단백질 사이의 추정 분자량의 변이는 단순히 단백질 또는 단백질 단편의 아미노산 서열의 길이에 있어서의 변이 때문일 수 있다.
이들 단백질들은 면역학적으로 cPLA2에 대한 항체와 반응한다. 상기 단백질들은 다른 단백질과 서열 상동성을 갖지 않는 IV형 cPLA2의 일 영역, 예컨대 단백질의 칼슘 결합 부분 이외의 영역에 존재하는 에피토프 또는 에피토프들과 반응하는 항체 또는 항체들에 의하여 동정될 수 있다. 상기 단백질은 또한 다른 단배질과 상동성을 가진 서열, 예컨대 IV형 cPLA2단백질의 칼슘 결합 부분에 존재하는 에피토프 또는 에피토프들과 반응하는 제1 항체("캡쳐 항체") 및 필요한 특이성을 제공하기 위하여 다른 단백질과 상동성을 갖지 않는 단백질의 영역 내에 존재하는 에피토프 또는 에피토프들과 반응하는 제2 항체("검출 항체")를 사용하므로써 동정될 수 있다. 단백질 검출 및 동정은 이하에서 더 상세하게 설명한다.
적혈구 내에서 또는 적혈구 상에서 분리된 단백질 또는 단백질 단편은 인간 모노사이트(U937) 세포에서 발견된 IV형 cPLA2단백질, 또는 그 단편과 동일할 수 있다. 따라서, 추정 분자량이 80∼110kDa 범위(특히 90∼105kDa 범위), 70∼80kDa 범위 및 50∼60kDa 범위인 단백질은 온전한 IV형 cPLA2이거나 IV형 cPLA2의 주요 성분일 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위를 이 이론에 한정하려는 의도는 아니다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, IV형 cPLA2에 면역학적으로 상동성이며, 적혈구로부터의 분리에 의하여 얻어질 수 있는 단백질이 제공된다. 상기 단백질은분자량이 80∼110kDa 범위(특히 90∼105kDa 범위)인 단백질의 형태 또는 70∼80kDa 범위인 단백질의 형태 및 50∼60kDa 범위인 단백질의 형태로 체내에 존재할 수 있다.
단백질 분리
IV형 cPLA2및 IV형 cPLA2단백질과 면역학적으로 상동성인 단백질은 일반적으로 SDS PAGE에 의하여 적혈구의 다른 단백질로부터 분리되나, 예컨대, 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 및 다양한 세파로즈와 다른 상업적으로 구입할 수 있는 칼럼과 같은 많은 다른 형태의 단백질 분리 기술이 사용될 수 있다. 2차원 전기영동 기술이 또한 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 사전 단백질 분리가 반드시 필요한 것은 아니며, IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2단백질과 면역학적으로 상동성인 단백질은 사전 단백질 분리 없이, 면역학적인 수단에 의하여 적혈구 내에서 검출될 수 있다.
단백질 검출
IV형 cPLA2단백질 및/또는 IV형 cPLA2단백질과 면역학적으로 상동성인 단백질의 검출은 다음을 포함하는 다양한 단백질 검출 과정에 의하여 이루어질 수 있다;
1) 효소연결면역검정, 방사능면역검정, 발광 면역검정, 형광 면역검정 또는 바이오센서 기술(소멸파 광 바이오센서(evanescent wave optical biosensor))를 포함한 다른 다양한 경쟁적 또는 태그된 항체 면역 검정;
2) 도말 표본(smear), 방울, 필름, 고정된 조직 절편 또는 조직 시료 내의 적혈구에 대한 면역형광 또는 다른 면역검정;
3) 특정한 폴리클론 또는 단일클론 항체에 의하여 단백질이 인지되고, 이 특정 항체 자체는 쿰스형(Coombs-type) 시험에 의하여 인지되는 in vitro 시험; 및
4) 다른 포스포리파제 효소의 특이적인 저해제와 함께 천연 또는 인공의 인지질 기질을 이용한 IV형 cPLA2단백질의 효소적 기질 검정.
본 발명의 한 구체예에 있어서, 단백질 검정은 상기한 기법들 중 어느 것이나 당업계에 알려진 다른 어떤 기술을 사용하여 단백질을 검출하는 근접-환자 시험에 적절한 진단 스트립, 카트리지 또는 장치를 사용하여 이루어진다.
바람직한 구체예에 있어서, 상기 단백질은 폴리클론 또는 단일클론 항체 또는 이들의 조합을 사용하여 검출된다. 표1에 IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 검출을 위한 본 발명의 검정에 사용하는데 적절한 항체의 예들을 나타내었다.
본 발명용의 적절한 항체 또는 항체의 조합에는 또한, 예컨대 U937 세포로부터 유래한 IV형 cPLA2의 730번 내지 749번 아미노산을 포함하는 펩티드 사슬 에피토프, 또는 상기 분자의 C말단 끝으로부터 유래한 확장되거나 다른 아미노산 서열 에피토프에 대항하여 만들어진 폴리클론 항체; U937 세포로부터 유래한 IV형 cPLA2의 촉매 활성 부위를 포함하는 분자 중간(mid-molecule) 펩티드 서열 또는 서열들에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들; 서열의 N 말단부(1번에서 216번 아미노산)로부터 유래한 에피토프에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들; IV형 cPLA2단백질; 및 U937 세포로부터 유래한 IV형 cPLA2단백질의 아미노산 서열 82번 및 749번 사이로부터 유래한 또 다른 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들 중의 하나이상이 포함될 수 있다.
항원 형 생산 방법 생성원 적혈구내의 cPLA2-유사단백질의 검출
분자 중간 유래의 인간 IV형 cPLA2합성 펩티드 폴리클론 IgG 토끼에서만들어짐 Cayman Chemical 사 예
C말단 도메인 유래의 24 아미노산 서열의 인간 IV형 cPLA2합성 펩티드 폴리클론 IgG 양에서만들어짐 The Binding Site 예
아미노 말단에 해당하는 인간 IV형 cPLA2합성 펩티드(1∼216 펩티드) 단일클론 IgG 생쥐 Chemical International Inc. 예
인간 IV형 cPLA2의 분자 중간 서열의합성 펩티드(241∼260아미노산)a 폴리클론 IgG 양에서만들어짐 자가 생산 예
a: 이 항체는 IV형 cPLA2(인간 모노사이트, U937세포에서 발견된 것임)의 241∼260 아미노산을 포함하는 합성 펩티드를 항원으로서 사용하여 준비되었고, 오브알부민과 커플링되었다. 상기 항원은 표준 인가된 과정에 따라 근육 및 피하 경로를 조합하여 프로인트 어주반트(Freund adjuvant)와 함께 양에 주입되었다. 최종 항혈청은 먼저 단백질 A를 사용하여 정제하고, 그 후 정제된 IgG 항체에 대한 친화성을 부여하기 위하여, 오브알부민에 커플링되지 않은 241∼260 펩티드를 갖는 친화성 매질을 사용하여 더 정제하였다.
혈액의 접근가능한 성분 중에서 IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 확인하므로써, 다음과 같은 그의 용도가 기대된다;
a) 단백질 수준의 직접적인 면역검정에 의한 진단 용도.
b) 쿰스형 시험의 일부분으로서의 간접적인 진단 의미로서의 용도.
c) 슬라이드 또는 도말 표본 또는 조직 시험편 상의 적혈구 상에서 또는 적혈구 내에서의 면역형광에 의한 확인.
d) 근접-환자 시험에 있어서 전체 혈액 중의 IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 확인하기 위한 면역침전 또는 다른 반응에의 용도.
e) PLA2활성 또는 농도를 억제할 의도인 치료의 모니터링에의 용도.
f) 약제개발을 위하여 PLA2활성 또는 농도를 억제하는 약제를 찾는 연구에의 용도.
본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 본 발명이 실시예에 의하여 기술되었고, 이에 의하여 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 세부 사항을 변경할 수도 있을 것이다.
I. 시료의 수집
단백질 분리 및 검출용 시료의 수집은 다음과 같이 하였다;
1) 정맥혈 시료(4∼6ml)를 항응고를 위하여 표준 농도의 EDTA(VacutainerR또는 Starstedt MonovetteR)를 사용하여 정맥 천자(穿刺)에 의하여 수집하였다. 당업자에게 알려진 다른 적절한 항응고제도 또한 사용될 수 있다.
2) 시료를 취한 3분 이내에, 프로테아제 저해제를 첨가하였다. 4 또는 6ml 부피의 혈액에 다음과 같이 근방 만든 프로테아제 저해제 칵테일 0.5ml를 첨가하였다;
아프로티닌(Aprotinin)(TrasylolR) 농축액(ml 당 10,000 칼리크라인 불활성화제 단위) 3ml에 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 2mg 및 루펩틴 0.5mg을 첨가하였다. 당업자에게 알려진 다른 적절한 저해제 제제도 또한 사용될 수 있다.
3) 다음으로, 전체 혈액 시료를 3,000rpm(1,000g)에서, 10분 동안 원심분리하였다. 혈장을 제거하고, 플라스틱 피펫으로 백혈구 및 혈소판 층(담황갈색의 코트)을 제거하여, 튜브에 적혈구를 남겼다.
4) 얼음으로 냉각된 포스페이트 버퍼된 염수 PBS pH7.4 또는 다른 적절한 버퍼를 적혈구 부피와 동량으로 첨가하고, 적혈구와 버퍼를 뒤집어 섞었다.
5) 다음으로, 버퍼내의 적혈구를 1,000g에서 원심분리하고, 세척된 적혈구를 가지고 단계 3 및 4를 3번 반복하였다.
6) 상기 세척된 적혈구를 다음과 같이 준비된 버퍼 0.5ml에 재부유시켜 0.5ml 분액으로 냉동하였다; 물 1리터 중에 KCl 0.37g, 디소듐 EDTA 0.74g, 트리스(Tris) 3.0g, NaCl 9g을 녹이고, HCl로 pH를 7.4로 조정하였다(Kramer 등,J. Biol. Chem.266, 5268∼5272). 상기 세척된 적혈구는 또한 충진된 세포로서 직접적으로 냉동되어질 수도 있다.
단순화된 과정으로, EDTA 베큐테이너(vacutainer)에 혈액을 수집하고, 3,000rpm(1,000g)에서 10분 동안 원심하고, 혈장 및 담황갈색의 코트는 흡출(aspiration)에 의하여 제거하였고, 충진된 적혈구는 냉동보관하였다.
7) 이들 시료를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 보정된(calibrated) 검정에 있어서의 면역검정을 위하여 파열(lysis)시키기 위하여, -80℃로 냉동 보관하거나 잠시 냉동한 후 바로 사용하였다. 사용하기 전에 충진된 세포가 냉동보관된 경우에는, 상기 단계 6)에 기술된 버퍼에 녹인다.
단순화된 과정을 사용하는 경우에는, 버퍼 200ml 당 COMPLETETM프로테아제저해제(Boehringer Mannhein) 1정의 형태로된 프로테아제 저해제를, 해동 과정을 위하여 적혈구에 첨가되는 버퍼에 포함시킨다.
II. SDS PAGE를 사용한 단백질 분리 및 검출
단백질 분리 및 검출은 하기한 SDS PAGE를 사용하여 이루어졌다.
SDS PAGE에 있어서, 상기 시료를 6% SDS, 0.5% 디티오트레이톨(dithithreitol) 및 100ml 당 글리세롤 20ml를 포함하는 트리스 버퍼 pH6.8(당업자에게 알려진 다른 버퍼가 사용될 수도 있다)를 포함하는 일정한 부피의 시료 버퍼(sample buffer)로 처리하였다. 파열물(lysate)을 시료버퍼에 첨가하여 파열물을 4배 또는 그 이상으로 희석되도록 하였다. 상기 시료를 전기영동용 표준 SDS 7.5% 폴리아크릴아미드 겔로 옮겼다. 전기영동한 후, 상기 단백질을 전기 블롯팅(electroblotting)에 의하여 겔로부터 막으로 옮겼다.
시험 막을 토끼에서 만들어진 IV형 cPLA2의 분자 중간(mid-molecule)에 대한 폴리클론 항체와 반응시킨 다음, cPLA2항원의 존재를 증명하기 위하여 고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase)에 연결된 돼지에서 만들어진 항 토끼 IgG 항체와 반응시켰다. 대조군(blank) 막을 고추냉이 퍼옥시다제에 연결된 돼지에서 만들어진 항 토끼 IgG 항체와 반응시켰다. 대조군 막에서 발견된 밴드는 모두 cPLA2이외의 다른 항원의 존재로 인한 것이다.
도1a 및 도1b는 하기 시료에 대한 두개의 웨스턴 블롯 분석(도1a는 시험 막이고, 도1b는 대조군 막이다)을 나타낸다:
레인1 : 분자량 마커.
레인2 : IV형 cPLA2를 발현하는 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 유래의 세포질.
레인3 : 환자 시료. 시료는 클로자핀(clozapine)(레인 4, 7, 9 및 10)에 대한 정신분열증 환자, 신경이완제(neuroleptic drugs)에 대한 정신분열증 환자(레인 8 및 12) 및 대조군 환자(레인 3, 5, 6 및 11)로부터 취해졌다.
시험 막 상의 환자 시료는 상기한 바와 같은 분자량에 의하여 그룹지어진 3가지의 밴드 형태를 보였다;
그룹A : 한 밴드는 97kDa 분자량 마커 위에 관찰되어, 분자량이 약 100 내지 105kDa이었고, 한 밴드 97kDa 분자량 마커 아래에 관찰되어, 분자량이 약 90 내지 95kDa이었다;
그룹B : 분자량이 약 70kDa인 단일 밴드가 관찰되었다;
그룹C : 분자량이 약 60kDa인 3개의 밴드가 관찰되었다. 이 분자량 그룹의 밴드 중 둘은 IV형 cPLA2단백질인 것으로 예상된다. 이들 중 가장 명확한 것은 대조군 막상에 나타나며, 특이적 면역반응이 적어 IV형 cPLA2단백질이 아니다.
요약하면, 상기 적혈구 파열물은 SDS PAGE 웨스턴 블롯 분석에서 IV형 cPLA2의 분자 중간 서열에 대항하여 제조된 폴리클론 항체와 특이적으로 반응하는, 약 90 내지 약 105kDa 범위에서 둘, 약 70 내지 약 80kDa 범위에서 하나, 약 50 내지 약 60kDa 범위에서 둘로 된, 5개의 단백질을 포함하고 있다.
상기한 바와 같이, 그룹A, B 및 C로 그룹지어진 밴드들은 각각, 인산화(phosphorylation)의 다른 단계에 있는 온전한 IV형 cPLA2단백질 및 단백질 분해에 의하여 아미노산이 상실된 IV형 cPLA2단백질의 펩티드 서열의 두 그룹을 나타낼 수도 있다. 그러나, 상기한 바와 같이, 본 발명의 범위를 이 이론에 한정시키고자 하는 것은 아니다. 그룹A, B 및 C로 그룹지어진 밴드들은 또한 온전한 IV형 cPLA2및 아미노산 서열의 길이가 다른 IV형 cPLA2의 단편을 나타낼 수 있다.
III. 효소연결면역검정(ELISA)을 사용한 단백질 검출
면역검정, 특히 효소연결면역검정(ELISA)이 적혈구 IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하기 위하여 또한 사용된다. 이 방법은 단백질 검출을 위한 발광종말점(luminescence end point)을 사용한다.
본 명세서의 전반부에서 설명한 바 대로, 시료를 수집하고 준비하였다. 분석용 적혈구 시료는 -80℃에 보관하였다.
하기의 시약이 ELISA에 필요하다.
1) 코팅 버퍼, pH9.6.
1리터 증류수에 소듐 카보네이트 1.59g, 소듐 비카보네이트 2.93g을 포함한다;
2) 세척 버퍼(wash buffer), pH7.4.
6.07g 트리스, 0.2g 포타슘 클로라이드, 29.2g 소듐 클로라이드가 포함된800ml 증류수를 염산으로 pH7.4로 조정한 후, 1리터로 만들었다;
3) 표준/시료 희석액 버퍼, pH7.4.
0.37g 포타슘 클로라이드, 0.74g 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 3g 트리스, 8.58g 소듐 클로라이드가 포함된 800ml 증류수를 염산으로 pH7.4로 조정한 후, 1리터로 만들었다;
4) 표준/시료 희석액.
0.2g 인간 알부민과 CompleteR프로테아제 저해제(Boehringer Mannheim) 1정이 첨가된 버퍼(3) 200ml;
5) 시트레이트 용액, pH7.4.
2.94g 소듐 시트레이트를 녹인 800ml 증류수를 염산으로 pH7.4로 조정하고, 1리터로 만들었다;
6) 항체 연결체(conjugate) 시약.
5ml 시약(2), 6ml Roti-BlockR(Rotech Scientific, Milton Keynes, UK), 0.2ml 시약(5), 0.012g 인간 혈청 알부민 및 1ml의 자체 제작한 항-cPLA2IgG(본 명세서에 기재된 바와 같은)-알칼라인 포스파타제 연결체(conjugate);
7) Lumi-PhosR530(dioxetane LumigenRPPD, fluorescer 및 계면활성제를 포함하는 완충용액(buffered solution))을 포함하는 발광시약(Beckman Coulter, UK사로부터 구입).
검정은 다음 과정에 따라 96웰 미세역가판(microtitre plate)을 사용하여 행하여졌다.
1) 캡쳐 항체(The Binding Site(Birmingham, UK)사로부터 구입)를 염수(saline)로 1:10 희석하고, -20℃에 500㎕ 분액을 보관하였다. 이 항체 1 분액을 코팅버퍼 11.5ml에 첨가, 혼합한 후, 희석된 캡쳐 항체 100㎕를 역가판의 웰을 캡쳐 항체로 도포하기 위하여 백색 미세역가판의 각 웰에 분주하였다. 이 역가판을 봉하고 4℃에서 밤새 보관하였다. 사용에 앞서, 상기 역가판을 세척 버퍼 pH7.4(본 명세서의 상기한 시약(2))로 4번 세척하였다.
2) 상기 역가판은, 각 웰을 시약(2)으로 1:2 희석된 Roti-BlockR300㎕로 분주하므로써 차단되었다. 차단반응(blocking)은 25℃에서 90분 동안 소요되었다. 차단 시약(blocking reagent)은 시약(2)로 4번 세척하므로써 제거되었다.
3) 다음으로, 시료 또는 표준물의 2배수 분액(100㎕)을 각 미세역가판 웰에 분주하고, 25℃에서 90분 동안 배양하였다. 시약(2)로 4번 세척하므로써 배양을 종료시켰다.
4) 다음으로, 2차 항체(연결된 항체, 시약(6))를 첨가하였다. 항체는 표준방법(Duncan 등,Analytical Biochemistry132, 68∼73)에 의하여 알칼라인 포스파타제에 연결된 것이다. 항체 연결체, 시약(6) 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 상기 역가판을 25℃에서 90분 동안 배양하였다.
5) 이 배양 말에, 상기 역가판을 시약(2)로 8번 세척하였다.
6) 각 웰에 발색 시약(7) 100㎕를 첨가하고, 발색계(luminometer)(Luminoscan Labsystems, Helsinki)에서 흔들어 주면서 20분 동안 배양하므로써 역가판의 웰에서 발색이 되었다.
7) 각 시료에 대하여 상대적 빛의 단위로 나타낸 발색이 측정되었고, 표준 IV형 cPLA2준비물의 발색과 비교하였다. 표준 IV형 cPLA2준비물을 사용한 것은 cPLA2검정을 위한 보정 곡선(calibration curve)을 얻기 위하여 사용된 것이다. 도2는 표준 편차가 표시된 10개의 별개의 검정으로부터 얻은 보정 곡선을 나타낸다.
8) 시료 준비
분석하기에 앞서, 냉동된 적혈구를 해동하고, 10,000g에서 5분 동안 원심하고 시료 희석액(시료(4))으로 1:40 희석하였다.
9) 표준물 준비
U937 세포 세포질을 표준으로 하였다. 이것은 U937 인간 모노사이트 배양액(Clark 등,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 7708∼7712)에서 준비한 것이다. 세포를 배양액으로부터 수집하여, 표준/시료 희석액에 재부유시키고, 알부민 함량을 제거하고 자당(sucrose)을 11.6g/100ml 첨가하였다. 세포를 파르 봄(Parr bomb)에서 질소 케비테이션에 의하여 파괴하고, 그 결과 나온 준비물을 4℃에서 150,000g로 1시간 동안 원심분리하였다. 상등액인 U937 세포 세포질은 분액화하여, 표준화(standardization)를 위하여 -80℃에 보관하였다. 이 물질의 희석액에 대한웨스턴 블롯 분석에 의하여, 웨스턴 블롯에 의하여 IV형 cPLA2가 단지 검출될 정도로부터 IV형 cPLA2함량에 대한 값을 할당할 수 있게 되었다. 상기 표준물은 -80℃에서 안정하다. 모든 검정에는 분액화된 적혈구 파열물(haemolysate)로 된 내부 품질 대조군 시료가 포함되었다.
10) 적혈구 파열물 중의 IV형 cPLA2의 추정을 위한 단위는 g 헤모글로빈 당 ㎍ cPLA2이다.
헤모글로빈 함량은 시료를 0.04% 암모니아에 희석하고, 540nm에서 농도가 알려진 헤모글로빈에 대하여 표준화된 흡광도를 읽으므로써 추정된다.
상대적 변이의 측정, 즉, 산술적 평균의 백분율로 표현된 표준편차인 변이의 뱃치-내 백분율 지수(CV%)는 일반적으로 8.6%로 측정되었고, 뱃치-간 CV%는 일반적으로 10.8%이었다. 이들은 각 9.0ng cPLA2/g 헤모글로빈(ng/gHb) 및 9.7 ng/gHb에서 측정되었다.
IV. 다양한 환자 그룹의 적혈구 내의 IV형 cPLA2 수준의 측정
적혈구 내의 IV형 cPLA2단백질 및 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 측정의 임상적 적용의 일 예로서, 각각 일정한 정신 질환을 앓는 환자 및 대조군 그룹으로부터 다양한 혈액 시료를 수집하였다. 본 연구에서 있어서의 각 환자 그룹 유래의 시료는 본 명세서의 상기한 ELISA 법을 사용하여 분석되었다. 각 그룹내의 환자들은 하기에 상세하게 설명된 바와 같은, 임상진단용 기준을 만족시켰다.시료는 본 명세서의 상기한 (1) 단계 내지 (7) 단계를 사용하여 수집되었다. 표본(specimens)은 또한 (4)와 (5)의 세척 단계를 생략하고서 수집 및 준비되었다. (1) 단계 내지 (3) 단계 및 (6)과 (7) 단계만을 채용하는, 또 다른 단축세포 준비법이 cPLA2수준의 측정에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 조사되었다. 전 세척 과정을 거친 시료와 단축된 과정을 거친 시료를 비교하였다. 상기 두 적혈구 준비 과정을 비교하는 경우, 그룹 내이거나 모든 그룹에서의 결과를 조합하여도 유의한 차이는 발견되지 않았다. 상기 환자 그룹은 다음과 같다;
그룹1: 정신분열증(Schizophrenia)
정신분열증 진단용 DSM IV 기준을 충족시키는 49명의 환자들(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 4th Edition, American Psychiatric Association 1994);
평균연령 37.3 +/- 11.9세인 17 내지 66세 범위의 36명의 남성 및 13명의 여성.
그룹2: 독서장해증(Dyslexia)
독서장해증 확인용의 기준, 예컨대 웨흐슬러 성인 지능지수 개정판(WAIS-R) 미리 등급화된(pro-rated) 상당(equivalent) IQ(The Psychological Corporation Limited 1986) 및 광범위 성취도 테스트 점수(WRAT)(Wilkinson Wide Range Inc, 1993) 사이의 차이가 15점 이상 또는 방고르 독서장해증 점수(T.R. Miles in Dyslexia, The Pattern of Difficulties, Grenada, 1983)가 7 이상으로 확인된 27명의 자원자(Volunteer);
평균연령 35.4 +/- 13.2세인 16 내지 67세 범위의 17명의 남성 및 10명의 여성.
그룹3 : 대조군
대조군 그룹을 포함하는 51명의 자원자;
평균연령 35.4 +/- 12.4세인 16 내지 57세 범위의 25명의 남성 및 26명의 여성.
이 연구의 결과는 도3A, 3B 및 3C에 나타내었으며, 이는 상기한 ELISA 법에 의하여 측정된, g 헤모글로빈(Hb) 당 cPLA2㎍으로 나타낸 적혈구 IV형 cPLA2또는 단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 빈도 히스토그램을 나타낸다. 도3A, 3B 및 3C는 각각, 대조군 그룹, 정신 분열증 그룹 및 독서장해증 그룹에 관하여 설명한다.
g 헤모글로빈(Hb) 당 ㎍으로 측정된 적혈구 IV형 cPLA2또는 단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 위한 검정의 결과 분포도는 양성 비대칭(positively skewed)(도3)이었고, 비계수적 시험(non-parametric test)을 분석에 적용하였다. 상기 정신 분열증 환자 그룹 및 대조군의 만 휘트니 유 시험(Mann Whitney U test)에 의하면, 대조군 그룹에 비하여 정신분열증 환자 그룹에서의 적혈구 cPLA2가 아주 유의하게 증가되었다(P<0.0001). 대조군 그룹에 비하여 독서장해증 환자에서의 적혈구 cPLA2는 더 적게 증가하였다(P<0.001). 적혈구 cPLA2에 대한 대조군 그룹 95%를 포함하는 참조범위의 결정은 g Hb 당 2.8㎍의 적혈구 cPLA2에 대한 참조범위를 위한 상한 컷오프점(upper cut off point)의 결정을 가능하게 한다. 이는 절대적인 값은 아니지만, 상기한 바와 같이, 이들 연구를 위하여 사용된 표준 과정으로부터 유도된 값이다.
적혈구 파열물(haemolysates)에서의 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 ELISA 분석의 확인은 이미 공개된 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 이루어질 수 있다. 대조군 그룹에 속하는 환자 및 정신분열증 환자 그룹(그룹1)에 속하는 환자 유래의 시료는 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯을 사용하여 더 분석하였다. 그룹1 시료는 ELISA에 의하여 적혈구 파열물(haemolysates)에서의 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 수준이 높은 것으로 밝혀진 환자로부터 채취하였다.
도4는 SDS PAGE/웨스턴 블롯에 의하여 관찰된, 적혈구 파열물(haemolysates)에서의 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질 및 대조군 환자로부터 유래한 적혈구 파열물(haemolysates)에서 관찰된 단백질을 나타낸다. 인간 모노 사이트 U937 유래의 cPLA2단백질의 분자량에 해당하는 단백질이 정신분열증 환자 유래의 파열물에서 관찰되었다; 대조군 환자로부터 유래한 파열물에서는 이 분자량을 갖는 단백질이 검출되지 않았다. 도4에 나타낸, 여러 웨스턴 블롯 분석의 시료는 다음과 같다.
레인1: 분자량 마커.
레인2: IV형 cPLA2를 발현하는 바큘로바이러스로 감염된 곤충세포 유래의 세포질.
레인3: cPLA2단백질을 포함하는 인간 모노사이트 U937 유래의 세포질.
레인4: 대조군 환자 유래의 적혈구 파열물.
레인5: 정신분열증 환자 유래의 적혈구 파열물.

Claims (33)

  1. 적혈구를 사용하는 단계를 포함하는, IV형 세포질성 포스포리파제A2(cPLA2) 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질의 검출용 검정.
  2. 제1항에 있어서, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병의 진단에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 검정.
  3. 제1항에 있어서, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병을 앓고 있는 환자에 투여된 약물의 유효성을 모니터링하는 데에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 검정.
  4. 제1항에 있어서, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병용 약제개발에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 검정.
  5. 적혈구 내 또는 적혈구 상에서 IV형 세포질성 포스포리파제A2(cPLA2) 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병의 진단 방법.
  6. 적혈구 내 또는 적혈구 상에서 IV형 세포질성 포스포리파제A2(cPLA2) 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병을 앓고 있는 환자에 투여된 약물의 유효성을 모니터링하는 방법.
  7. 적혈구 내 또는 적혈구 상에서 IV형 세포질성 포스포리파제A2(cPLA2) 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 고도로 불포화된 지방산과 관련된 세포 신호전달 체계의 기능이상이 관여된 질병용 약제개발 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적혈구는 인체로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검정 또는 방법은 상기 적혈구의 사전분리 없이 전체 혈액 시료를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 IV형 cPLA2활성 또는 농도가 정상수준으로부터 변화된 질병 또는 질병 과정인 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  11. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 IV형 cPLA2활성 또는 농도가 증가된 질병 또는 질병 과정인 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 정신분열증, 독서장해증, 이극성 또는 정신이상성 우울증, 악액질(cachexia) 또는 뇌상인 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 뇌상은 발작 또는 기계적 뇌상인 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질은 분자량이 80∼110kDa의 범위 또는 70∼80kDa의 범위 또는 50∼60kDa의 범위인 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질은 분자량이 90∼105kDa의 범위 또는 70∼80kDa의 범위 또는 50∼60kDa의 범위인 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체로부터 혈액 시료를 수집하는 단계 및 체외(ex vivo)에서 상기 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 다른 혈액 성분들로부터 적혈구를 분리하는 단계, 적혈구를 파괴하는 단계, 직접적으로 또는 단백질 분리 기법을 적용한 후 상기 단백질을 검출하는 단계 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 적혈구는 초음파 처리, 냉동, 질소 캐비테이션(cavitation) 또는 파열에 의하여 파괴되는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 면역검정에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산으로부터 유래하는 에피토프 또는 에피토프들을 인지하는 항체 또는 항체들을 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산으로부터 유래하는 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 생성된 항체 또는 항체들, 또는 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산에 대응하는 합성 펩티드인 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 생성된 항체 또는 항체들을 사용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 에피토프 또는 에피토프들은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 촉매활성 중심을 포함하는 펩티드 서열 또는 서열들로부터 유래하는 것임을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 에피토프 또는 에피토프들은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 241번 내지 260번 아미노산의 펩티드 서열로부터 유래하는 것임을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 단백질은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 1번 내지 216번 아미노산으로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 항체 또는 항체들을 사용하여 검출되는 것임을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  25. 제20항, 제21항, 제22항, 제23항 또는 제24항에 있어서, 요구되는 특이성을 가진 2 이상의 항체가 상기 단백질을 검출하기 위하여 조합으로(in combination) 또는 순서대로(in sequence) 사용되는 것을 특징으로 하는 검정 또는 방법.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 기질 검정(substrate assay)에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는 IV형 cPLA2를 검출하기 위한 검정 또는 방법.
  27. IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성이고, 분자량이 80∼110kDa의 범위 또는 70∼80kDa의 범위 또는 50∼60kDa의 범위이며, 적혈구로부터 분리에 의하여 얻어질 수 있는 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 단백질은 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성이고, 분자량이 90∼105kDa의 범위 또는 70∼80kDa의 범위 또는 50∼60kDa의 범위인 것을 특징으로 하는 단백질.
  29. 적혈구를 파괴하는 수단을 포함하며, IV형 cPLA2단백질 또는 IV형 cPLA2와 면역학적으로 상동성인 단백질로서, 적혈구로부터 분리에 의하여 얻어질 수 있는 단백질에 대한 항체 또는 항체들을 더 포함하는 진단 키트.
  30. 제28항에 있어서, 상기 항체 또는 항체들은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 82번 내지 749번 아미노산으로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 것임을 특징으로 하는 진단 키트.
  31. 제28항에 있어서, 상기 항체 또는 항체들은 인간 모노사이트(U937) 세포 유래의 IV형 cPLA2단백질의 촉매 활성 중심을 포함하는 펩티드 서열 또는 서열들로부터 유래한 에피토프 또는 에피토프들에 대항하여 만들어진 것임을 특징으로 하는 진단 키트.
  32. 제28항, 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 적혈구를 파괴하는 수단은 적혈구를 파열(lysing)시키기 위한 수단임을 특징으로 하는 진단 키트.
  33. 제28항, 제29항 또는 제30항에 있어서, 근접-환자 시험(near-patient testing)에 적절한 것임을 특징으로 하는 진단 키트.
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