KR100500260B1 - 소의 뇌에서의 세포질형 포스포리파아제 에이 투 효소를활성화시키는 신규의 단백질, 이의 용도 및 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 소의 뇌에서의 세포질형 포스포리파아제 에이 투 효소(cytosolic phospholipase A_2, cPLA₂)를 활성화시키는 단백질인 cPLAP, 이들의 용도 및 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 cPLAP 는 분자량 42 kDa이고, cPLA₂의 시험관내 활성을 특별히 증강시키는, GTP-결합단백질인 G 단백질의 일종임을 특징으로 한다. 단백질 활성이 칼슘의 농도에 비 의존적이고, 마그네슘(Mg²⁺)존재하에서 GTPγS에 의하여 증강되며 GDPβS의 첨가에 의해 감소되는 특징을 보이며, [γ-³²P]GTP에 안정한 결합을 하며, 항-Rac1 G 단백질 항체와 반응하는 것을 특징으로 하는 G 단백질의 일종이다. 따라서 본 발명의 cPLAP 는 cPLA₂ 가 관여하는 생리현상의 연구 분야 및 cPLA₂ 와 관련된 질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

소의 뇌에서의 세포질형 포스포리파아제 에이 투 효소를 활성화시키는 신규의 단백질, 이의 용도 및 제조 방법{Novel cPLAP activating cPLA2 enzyme in bovine brain, its use and the preparation method thereof}

본 발명은 소의 뇌에서의 세포질형 포스포리파아제 에이 투 효소(cytosolic phospholipase A₂, 이하 "cPLA₂" 라 함)를 활성화시키는 신규한 단백질인 cPLAP, 이들의 용도 및 제조 방법에 관한 것이다.

현재 막지질은 세포외 공간과 세포내 공간을 구별짓는 막의 구성성분으로서 뿐만 아니라, 2차 전달자로서의 역할을 수행한다고 일반적으로 받아들여진다. 많은 지질들은 2차 전달자로서의 역할을 한다고 믿어지고 있으며 더 많은 것들이 밝혀지고 있다. 각각의 지질 이차 전달자들은 특이한 포스포리파아제에 의해 생성이되고 엄격히 조절된다. 왜냐하면 비정상적 신호는 심각한 병리학적 문제들을 불러일으키기 때문이다. 그래서 포스포리파아제의 조절사건들은 병리기전의 본질을 이해하고 새로운 치료 타겟을 개발하고자 널리 연구되어지고 있다.

포스포리파아제 A₂ (Phospholipase A_2, 이하 "PLA₂" 이라 함)는 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids)의 sn-2 위치의 에스터 결합을 가수분해시켜 유리지방산 및 리소포스포리피드(lysophospholipids)를 생성시키는 효소 중의 한 분류이다. 막지질상의 PLA₂의 활동의 중요한 생성물은 아라키돈산(arachidonic acid) 및 1-O-알킬-2-리소-글리세로포스포콜린(1-O-alkyl-2-lyso-glycerophosphocholine, 이하 "리소-PAF" 라 함) 이다. 아라키돈산은 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 포함하는 에이코사노이드로 더 대사되며, 리소-PAF는 혈소판-활성인자(platelet-activation factor, PAF)의 전구체로서 역할을 한다. 아라키돈산 그 자체, 에이코사노이드 및 PAF는 많은 막채널의 조절(modulation) 및 신호전달계(signal transduction pathway) 내에서의 효과자(effector)를 통한 염증 및 세포 손상시 일어나는 다양한 세포 반응에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Irvine, R.F; Biochem. J., 204, pp3-16, 1982; Dennis,E.A. et al.; FASEB J., 5, pp2068-2077, 1991; Bonventre, J.V.; J.Am. Soc. Nephrol., 3, pp128-150,1992).

포유동물의 PLA₂의 슈퍼패밀리는 크기, 조직내 분포, 칼슘에 대한 의존도, 기질 선호도, DTT(dithiothreitol)에 대한 민감도 및 조절 기작에 따라 다양한 효소들로 구성되어 있다(Murakami, M. et al.; Rew. Immunol., 17, pp225-283, 1997). 요약하자면, 칼슘 농도 의존도에 따라 PLA₂는 칼슘의존적 및 칼슘비의존적 PLA₂효소로 크게 분류할 수 있다. 칼슘의존적 PLA₂는 다시 크기와 활성부위에 따라 5개의 그룹으로 나누어지는데, 즉, 1) 대략 14kDa의 낮은 분자량의 PLA₂ 형태를 갖는 4 그룹(그룹Ⅰ, ⅡA, ⅡC 및 Ⅴ)은 분비 PLA₂ (secretory PLA_2, sPLA₂)라 불리우며, 세포 밖의 공간으로 분비되고, 활성화되려면 10^-4 내지 10^-3 M의 칼슘 농도를 필요로 한다. 그리고 sn-2 위치에서는 아라키돈산에 대한 선호도를 전혀 보이지 않는다. 2) 85 kDa의 높은 분자량을 갖는 그룹 Ⅳ PLA₂ (cDNA 클로닝에서는 85 kDa, SDS-PAGE 상에서는 100kDa을 보인다)는 세포질 PLA₂ (cytosolic PLA₂, cPLA₂)라 불리우며, 세포질에 존재하고, 기질의 효과적인 가수분해를 위하여 10^-6M의 칼슘 농도를 필요로 한다. 그리고 sn-2위치에서는 아라키돈산을 포함한 기질을 선호하여 가수분해시킨다(Clark, J.D.L. et al.; Cell, 65, pp1043-1051, 1991; Kim D.K. et al; Biochem. J., 310, pp83-90, 1995). 그래서, cPLA₂는 아라키돈산 및 PAF의 수용체-매개 생성에 있어서 중요한 역할을 하며, 새로운 치료제 개발을 위한 매력적인 목표물이 된다는 것은 현재 일반적으로 인지되어 있다(Clark,J.D. et al.; J. Lipid Mediat. Cell Signal., 12, pp83-117, 1995). 반면에, 칼슘 비의존적형태 iPLA₂는 여러 형태의 효소로도 또한 분류될 수 있다.

최근에, 많은 연구들이 cPLA₂의 조절기작에 대해 초점을 맞추어 수행되었음에도 불구하고, 정확한 기작은 아직 불완전하게 알려져 있다. 현재 두가지 주요한 기작들이 밝혀졌는데, 그 첫 번째로는 칼슘이 cPLA₂의 활성을 위한 중요한 조절자(regulator)라는 것이다. cPLA₂의 클로닝으로 칼슘의존적 지질결합부위(Ca²⁺-dependent lipid-binding domain, CaLB domain)이 밝혀졌으며, 이 부위는 10^-6M 이하의 칼슘 농도의 존재하에서 세포질에서 막 구역으로의 cPLA₂의 이동을 책임진다(Clark,J.D.L. et al.; Cell, 65, pp1043-1051, 1995; Sharp, J.D. et al., J. Biol. Chem., 266, pp14850-14853, 1991). 이 부위는 단백질 키나아제 C (protein kinase C), 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파아제 (Phosphatidylinositol-specific phospholipase, PI-PLC), 시냅토택민 (synaptotagmin) 및 GTP아제-활성화 단백질(GTPase-activating protein) 같은 여러 단백질들과 유의적인 동질성을 보인다. 즉, sPLA₂는 촉매활성을 위하여 칼슘의 10^-3M 정도의 농도가 필요한 반면, cPLA₂는 이동 또는 CaLB 부위를 통한 cPLA₂의 기질 막과의 결합을 위하여서만 칼슘을 필요로 한다는 것이다(Dennis, E.A.; Trends Biochem. Sci., 22, pp1-2, 1997). 두 번째로는, cPLA₂의 인산화는 그것의 활성화의 가능한 기작으로서 또한 요구된다. 아라키돈산의 분비를 촉발시키는 다양한 작용제들(agonists)은 또한 다양한 키나아제들을 또한 활성화시킨다(Hannigan, G.E. and Williams, B.R.G; Science, 251, pp204-207, 1991; Piomelli, D. et al.; Nature, 353, pp164-167, 1991; Lin, L.L. et al.; Cell, 72, pp269-278, 1993). cPLA₂ 는 세포분열인자로 활성화된 단백질키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAP kinase)에 의한 세린-505 부근의 인산화 자리와 동일한 서열을 가지고 있으며, 이 잔기가 인산화됨으로서 cPLA₂의 내재적활성정도가 어떤 계에 있어서는 약 2배까지 증가하고, 전기적 이동도의 변화(electrophoretic mobility shift)를 유발한다(Lin,L.L. et al.; Cell, 72, pp269-278, 1993). 더욱이, 2차원적 인산단백질 맵핑 연구로 38 kDa의 스트레스로 활성화되는 단백질(p38-Map kinase)는 cPLA₂ 의 세린-505 및 세린-727을 둘 다 인산화시키는데 참여한다는 것을 확인하였으나 이것은 cPLA₂의 인산화에 의한 효소 활성에 있어 어떠한 증가도 유발시킬 수 없었다(Borsch-Haubold, A.G. et al.; J. Biol. Chem., 273, pp4449-4458, 1998). 단백질 키나아제 C (PKC)는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetatePMA)로 자극된 세포 또는 PKC 활성을 저하시킨 세포에서 보여지는 것처럼 cPLA₂의 활성화에 주요한 역할을 또한 할 수도 있다(Xing, M. et al.; J. Clin. Invest., 99, pp805-814, 1997; Nemenoff, R.A. et al.; J. Biol.Chem., 268, pp1960-1964, 1993). 어쨌든, cPLA₂가 세포 활성화 동안에 직접적으로 PKC 자체에 의해 인산화된다는 증거는 없다. 지난 수십년 동안에, 많은 세포들과 조직들에서 GTP-결합 단백질(G-단백질)이 PLA₂의 한 형태를 조절할수 있다는 것은 많은 증거들을 통하여 제시되어 왔는데, 이런 세포나 조직들에서 아라키돈산의 분비가 가수분해되지 않는 G-단백질 작용제, 구아노신-5'-O-(3-티오트리포스페이트)(guanosine-5'-O-3-thiotriphosphate, GTPγS) (Nishizuka, Y.; Science, 233, pp305-312, 1986; Rao, G.N. et al; J. Biol. Chem., 269, pp32586-32591, 1994; Jayadev, S. et al.; J. Biol. Chem., 272, pp17196-17203, 1997; Jayadev, S. et al; J. Biol. Chem., 269, pp5757-5763, 1994) 및 알려진 G 단백질의 비특이적 활성제 AIF₄- 에 의하여 PLA₂ 가 증가되었고, G-단백질을 변형시키는 박테리아톡신에 의해서는 감소되었다(Samuelsson, B et al.; Science, 237, pp1171-1176, 1987). 그러나, 현재, 생체내 또는 시험관내 실험 두 시스템상에서 G-단백질과 cPLA₂의 직접적인 상호관계에 대한 증거는 없다.

28 kDa의 PLA_2-활성화 단백질(PLA_2-activating protein, PLAP)는 1987년에 처음 확인되고 특성이 밝혀졌다. PLAP는 cPLA₂가 아닌 sPLA₂를 자극하였다. 정제된 단백질은 포스파티딜콜린이 기질로 사용이 될 때 선택적으로 sPLA₂를 자극시켰으나 포스파티딜에탄올아민이 기질로 사용될 때에는 활성도에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 흥미롭게도, 상동성연구를 통하여 PLAP가 G_β 슈퍼패밀리중의 하나인 β-튜랜듀신(β-tranducin)과 유의적인 상동성을 보이는 부위를 가지고 있음이 밝혀졌다. 그러나, PLAP 활성정도가 GTPγS 또는 GDPβS에 의해 변화하지 않기 때문에, PLAP 활성에 있어서 이 부위의 중요성은 아직 알 수 없다.

그룹 Ⅳ의 cPLA₂는 아라키돈산, 에이코사노이드 및 혈소판활성인자 같은 다양한 생활성매개인자의 생성에 의한 신호전달계내의 염증과 세포손상 같은 많은 세포반응에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 세포내 칼슘의 농도 증가 및 세포분열인자가 활성화시키는 단백질 키나아제에 의한 효소의 인산화가 가능한 활성기작이라 알려졌음에도 불구하고, 칼슘에 비의존적인 방식으로 cPLA₂가 활성화되는 기작은 확실히 밝혀지지 않았었다. 포유동물에서 아라키돈산의 유리는 에이코사노이드라고 하는 오타코이드(autacoid)를 생산하여 프로스타글란딘의 일종인 트롬복산 A2는 혈전증에 관여하고, 프로스타글란딘, 로이코트리엔 등은 염증에 관여하며, 이러한 아라키돈산 대사물은 뇌조직에서 생성되어 뇌졸중, 뇌부종 등에 밀접한 관련이 있음이 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 cPLA₂의 활성을 조절할 수 있는 단백질을 검색 및 분리하기 위해 노력한 결과, 소의 뇌에서 cPLA₂를 활성화시키는 단백질 분획을 분리 정제하여 42kDa의 신규한 단백질인 cPLAP를 분리 정제하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 cPLA₂를 활성화시키는 신규한 단백질인 cPLAP, 이들의 용도 및 제조 방법을 제공하고자 한다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 소의 뇌에서의 cPLA₂를 활성화시키는 신규한 단백질인 cPLAP를 제공한다.

본 발명의 상기 cPLAP는 SDS-PAGE에 의해 측정한 분자량이 42kDa이고 칼슘 비의존적(Ca²⁺-independent) 활성을 보이며, cPLA₂의 시험관내 활성을 현격하게 증강시키는 GTP-결합단백질인 G 단백질의 일종임을 특징으로 하는 신규한 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명의 cPLAP은, 소의 뇌를 분쇄하여 얻은 균질혼합액을 원심분리하여 수득한 상층액에 약산을 가하여 원심분리한 다음 침전물을 수득하고; 상기 침전물을 완충액에 현탁시킨 후 음이온 교환수지 컬럼으로 여과하고; 용출된 단백질을 소수성 컬럼 크로마토그래피, 고성능액체크로마토그래피(HPLC), 양이온 교환수지 고성능 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 젤 여과 컬럼 크로마토크래피를 차례로 수행하여 정제하는 단계를 포함하는 신규의 cPLAP의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 소의 뇌에서 PLAP의 두 종류의 특성을 동정하였고, 이것은 특별하게 돼지 지라과 소의 뇌로부터 정제한 cPLA₂의 시험관 내 시험에서 활성도를 증강시킴을 확인하여, 이것을 cPLA₂-활성화 단백질(cPLA₂-activating protein, cPLAP)이라 명명하였다.

본 발명의 cPLAP는 SDS-PAGE에 의해 측정한 분자량이 42kDa이고 칼슘 비의존적(Ca²⁺-independent) 활성을 보이며, cPLA₂의 시험관내 활성을 특별히 증강시키는 GTP-결합단백질인 G 단백질의 일종임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 cPLAP는 10^-6M 이하의 칼슘농도에서 cPLA₂를 완전히 활성화시키는 특징을 제공한다.

또한, 본 발명의 cPLAP는 마그네슘 존재하에서 GTPγS에 의하여 증강되며 GDPβS의 첨가에 의해 감소되는 특징을 제공한다.

추가적으로, [γ-³²P]GTP에 안정한 결합을 하며, 소분자량 G 단백질인 Rac1의 항-Rac1 항체와 반응하는 G 단백질의 일종인 cPLAP를 제공한다.

상기 cPLAP는 사람 또는 소 등의 포유동물로부터 유래하여 제공될 수 있다.

본 발명의 신규한 cPLAP를 소의 뇌로부터 분리정제하는 방법을 설명하면,

예를 들어 소의 뇌 무게(㎏)의 약 3-8배의 완충액을 가한 뒤, 분쇄하여 얻은 균질혼합액을 원심분리하고, 이에 수득한 상층액에 아세트산 등과 같은 약산을 가하여 pH 4.5내지 5.5로, 바람직하게는 pH 5.0으로 조정하여 원심분리한 다음 침전물을 수득하는 1 단계;

상기 침전물을 완충액에 현탁시킨 후 DEAE-셀룰로오스 등과 같은 음이온 교환수지 컬럼으로 여과하고; 용출된 단백질을 페닐세파로스 CL-4B 등과 같은 소수성 컬럼, 페닐-5PW 등과 같은 고압액체크로마토크래피(HPLC), 리소스 S 등과 같은 양이온 교환 고성능액체크로마토그래피(FPLC), 및 수퍼로스 12 등과 같은 젤 여과 컬럼을 순서대로 이용하여 정제함으로써 신규의 cPLAP를 분리하는 제 2단계를 포함한다.

상기의 cPLAP의 활성은 슈퍼로스 12 젤 여과 HPLC 컬럼내에서 200 및 42 kDa의 분자량을 보이는 두 피크상에서 나타내었다. 42kDa PLAP 는 연속적인 크로마토그래피에 의해 거의 동질한 것으로 분리되었고, 이것은 GTP-결합 단백질이라는 것을 다음의 결과로 보여주었다. ; (1)42 kDa cPLAP 활성은 마그네슘 존재하에서, GTP 유사체인 GTPγS에 의해 증강되었고, 이것은 10^-6M 이하의 칼슘농도에서 cPLA₂ 를 완전히 활성화시켰고, 증가된 활성은 GDP 유사체인 GDPβS의 연속적인 첨가에 의해서 활성이 감소되었다는 것과 (2) 포토친화적 표지 SDS-PAGE 상에서 42 kDa 단백질이 [γ-³²P]GTP에 안정하게 결합되었다.

또한 본 발명은 상기 제조 방법으로부터 분리된 cPLAP를 유효성분으로 하는 cPLA₂ 활성증강용 약학조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명의 cPLAP는 아라키돈산 및 cPLA₂가 관여하는 생리현상의 연구 및 cPLAP와 관련된 뇌졸중, 뇌부종, 알쯔하이머, 파킨슨씨병 및 허혈 등의 퇴행성뇌질환, 염증질환, 혈전증 등의 혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

그 예로 본 발명의 cPLAP의 발현, 기능 및 조절 기전이 밝혀지게 되면, cPLAP에 의한 대사산물들의 작용 경로와 이들이 관여하는 질병의 발생 기전 또한 밝혀질 수 있다. 또한 본 발명의 cPLAP의 저해제 또는 항체를 개발하거나 또는 돌연변이를 일으켜 활성을 저하시키거나 비활성화시킴으로써, cPLAP 및 cPLA₂가 관여하는 질병을 진단, 예방 및 치료할 수 있다.

또한 본 발명의 cPLAP는 cPLA₂에 의한 생리작용의 연구에 유용하게 사용될 수 있으며, 이들을 유효성분으로 함유하는 조성물은 cPLA₂의 활성증강제로 이용될 수 있다.

본 발명의 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물은, 유효성분으로 본 발명의 cPLAP 뿐만 아니라 이들과 유사한 기능을 지닌 물질 또는 유도체를 함께 첨가할 수 있으며, 필요에 따라 다른 유효성분을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 어쥬반트 유전자 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 cPLAP를 유효성분으로 함유하는 조성물은 경구, 비경구(경피, 피내, 근육내 및 정맥내 포함), 직장 및 흡입 중에서 선택되어지는 경로에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 근육내 주사법으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 제한되지는 않는다.

참조예 1. PLA ₂ 활성도 측정

기질인 1-스테아로일-2-[1-¹⁴C]아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-Stearoyl-2-[1-14C]arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 2-[1-¹⁴C]AA-GPC) (55 mCi/mol, Amersham사) 및 1-아시일-2-[1-¹⁴C]아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-acyyl-2-[1-¹⁴C]arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 2-[1-14C]AA-GPE) (55.6 mCi/mol, Amersham사)은 질소하에서 건조된 후 에탄올에 재용해시켰다. PLA₂의 활성분석을 위한 표준배양시스템(100㎕)은 PLA₂ 시료, 75 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl₂ 및 4.5 nmol 기질 (대략 55,000 cpm)을 포함하였다. 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 560㎕의 변형된 돌의 시약(Dole's reagent, n-heptane:isopropyl alcohol:1N H₂SO₄= 400:390:10 (v:v:v))(Judd,M., and Macleod, R.M.; Endocrinology, 131, pp1251-1260, 1992) 및 110㎕의 물을 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 볼텍싱하여 혼합한 후 원심분리하였다. 그 다음 150㎕의 상층액을 새 마이크로튜브에 옮겨서, 또 800㎕의 n-헵탄 및 5㎎ 이하의 실리카겔을 첨가하였다. 이 시료를 볼텍싱하여 혼합하고 다시 원심분리하여 800㎕의 상층액을 β-신틸레이션 용액(INSTA GEL-XF) 2.5㎖내로 넣었다. 팩카드 트리-카브 액체 신틸레이션 카운터(Packard Tri-Carb scintillation counter, PACKARD사, 호주)로 방사능활성정도를 측정하였다. cPLAP 활성정도는 cPLA₂ 활성의 증가 배수에 의해 표현되었다.

참조예 2. 돼지 지라로부터의 cPLA ₂ 의 정제

100 kDa cPLA₂는 (Choi, J.S.; 중앙대 석사논문, 1996)의 방법대로 정제되었다. 요약하면, 돼지 지라는 완충액 A(50 mM Tris/HCl, pH 9.0, 1 mM EDTA, 0.12 M NaCl)를 사용하여 분쇄되었고, 10000×g에서 40분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 옮겨 아세트산으로 pH를 6.0으로 맞추고, 상기와 같은 조건으로 다시 원심분리하였다. 이로 생성된 침전물을 완충액 A에 용해시킨 다음, 이 효소 시료를 가지고 DE52 (Whatman사, 영국)를 이용한 크로마토그래피를 수행하였다. 젤은 용출완충액(elution buffer, 50 mM Tris/HCl, pH 9.0, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl)을 사용하여 순차적으로 용출되었으며, 활성분획은 다음 단계를 위해 4.0M 염화나트륨용액을 첨가하여, 염화나트륨 최종농도가 0.5M이 되게 하였다. 이 활성분획은 완충액(50 mM Tris/HCl, pH 9.0, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl)으로 평형을 맞춘 부틸-토요펄 컬럼(Butyl-Toyopearl column, Tosoh Co Tokyo사, 일본)에 넣어 통과시키고, 같은 완충액을 사용하여 씻어내었다. 컬럼을 서서히 용출완충액( 50 mM Tris/HCl, pH 9.0, 1 mM EDTA)을 사용하여 용출시켰다. PLA₂ 활성을 갖는 분획은 미리 평형이 맞춰진 DEAE-5PW 컬럼(Tosoh Co Tokyo사, 일본)에 통과시켰으며, 이 컬럼은 직선상의 0.12-0.5M의 염화나트륨 농도구배를 갖는 용액으로 용출되었으며, 가장 높은 활성을 갖는 분획은 cPLAP 정제를 위한 cPLA₂의 원재료로 사용되었다.

실시예 1. cPLA ₂ -활성화 단백질인 cPLAP의 분리, 정제

하기의 cPLAP의 분리 및 정제과정을 도 1 에서 개략적으로 나타내었다.

1.1 cPLA ₂ -활성화 단백질 원료 준비

소의 뇌는 지역도축장으로부터 신선한 것을 구입하여 -70℃에서 얼려 보관하였다. 뇌 600g 정도를 5배의 분쇄완충액 Ⅴ(homogenizing buffer Ⅴ, 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 50mM KCl, 3mM MgCl₂, 1 mM EDTA 및 10mM 2-mercaptoethanol)에 녹여 분쇄기로(polytron PT-MR6000, kinematica사, 스위스) 분쇄한 후, 10000×g에서 60분간 원심분리한 다음, 상층액을 아세트산을 사용하여 pH 5.0으로 맞춘 후, 다시 10000×g에서 15분간 원심분리하였다. 그 결과 침전물을 분쇄 완충액Ⅴ에 재용해시켰다.

1.2 DEAE-셀룰로오스 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피(DEAE-cellulose anion exchange column chromatography)

상기 용해액을 DEAE-셀룰로오즈(DE52, Whatman사, 영국) 음이온 교환 컬럼(2.5㎜×12.5㎝; bed volume 200㎖), P-3 펌프(P-3 peristaltic pump, Pharmacia LKB biotechnology AB 사, 스웨덴)를 완충액 A(50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA 및 10mM 2-mercaptoethanol)와 사용하였고, 유속은 25㎖/분의 속도로 조절하였다. 컬럼을 완충액 A를 사용하여 씻어낸 후 0 내지 1.0M의 염화나트륨 용액의 농도구배를 가지고 유속 25㎖/분의 속도로 용출하였다. 1.0M 염화나트륨 용액을 가지고 용출된 단백질 분획은 분획당 30㎖씩 나누었으며, 각각의 분획의 분배된 용액을 iPLA₂ 활성 측정과 cPLA₂ 활성화시키는 활성도(cPLA₂ activating activity)를 측정하였다(도 2a 참조). 그 활성 분획들은 합쳐져서 페닐-세파로즈 컬럼(Phenyl-Sepharose column)에 통과시켰다.

1.3 페닐-세파로즈 CL-4B 소수성 컬럼 크로마토그래피

DEAE-셀룰로오즈컬럼으로부터 얻어진 활성 분획 풀(pool)에 4.0M 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 용액을 첨가하여 최종농도 0.5M 황산암모늄으로 조정하여, 미리 0.5M 황산암모늄을 포함한 완충액A로 평형을 맞춰 놓은 페닐-세파로즈 CL-4B 컬럼(Pharmacia LKB biotechnology사, 스웨덴; 30㎜×25㎝, bed volume 30㎖)에 통과시켰다. 컬럼은 0.25M 내지 0.0M 황산암모늄 농도구배를 갖는 용액으로 서서히, 10㎖/분의 유속으로 용출되었다. 그 다음 컬럼은 0.25M 황산암모늄을 포함한 완충액A와 완충액B(25mM Glycine/NaOH, pH9.0, 1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol)을 사용하여 10㎖/분의 속도로 연속적으로 서서히 용출되었다.

각 10㎖ 분획 중 30㎕를 cPLAP 활성 분석에 사용하였고, 5분동안 반응시켜 분석하였다. 0.25M 황산암모늄 완충액 A로부터의 용출분획의 풀(pool)은 cPLA₂-활성화시키는 활성도를 갖고 있고, 0 M 염화나트륨, 25mM 글라이신 완충액인 완충액B으로부터의 용출분획의 풀(pool)은 iPLA₂ 활성도를 갖고 있었다(도 2b 참조). 각 분획들의 분배된 것은 iPLA₂ 활성 분석을 시행하였다. 활성을 보이는 cPLAP 분획은 합쳐져서 페닐-5PW(TSK-GEL Tosoh Co Tokyo사, 일본) HPLC 컬럼에 통과시켰다.

1.4 페닐-5PW HPLC

페닐 CL-4B 컬럼의 활성 풀(active pool)은 최종농도 0.5M 황산암모늄을 포함하도록 조정되었고, 0.5M 황산암모늄을 포함한 완충액 A를 가지고 미리 평형을 맞춘 페닐-5PW HPLC 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 1㎖/분의 유속으로, 0.25M 황산암모늄을 포함한 완충액을 가지고 직선상의 농도구배로 용출되었다. 각 10㎖ 분획 중 20㎕씩을 cPLA₂를 가지고 cPLAP 활성분석을 시행하였고 5분동안 반응시켜 분석하였다(도 2c 참조).

1.5 리소스 S 양이온 교환 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)

페닐-5PW의 활성 풀(active pool)은 완충액S (25mM Imidazole/HCl, pH 6.6, 3mM MgCl₂, 1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol)를 사용하여 18시간 동안 투석(dialysis)되었다. 투석된 시료는 완충액S로 미리 평형을 맞춘 리소스 S FPLC 컬럼(Pharmacia LKB biotechnology AB 사, 스웨덴)에 통과시켰다. 컬럼은 0.0M 내지 1.0M 염화나트륨 용액의 직선상의 농도구배를 가지고 유속 1㎖/분의 속도로 용출되었다. 각 1.0㎖ 분획에서 20㎕씩을 cPLAP 활성 분석에 사용하였으며, 활성분획들은 다음 단계를 위해 합쳐졌다(도 2d 참조).

1.6 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC

리소스 S의 활성 풀(active pool)을 완충액12 (50mM Tris/HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol, 0.1M NaCl)를 사용하여 미리 평형을 맞춘 슈퍼로즈 12 젤 여과 FPLC 컬럼(Pharmacia LKB biotechnology AB 사, 스웨덴)에 통과시켰다. 컬럼은 유속 0.5㎖/분의 속도로 용출되었다. 각 0.5㎖ 분획에서 50㎕씩을 cPLAP 활성 분석에 사용하였으며, 5분 동안 반응을 시켰다.

슈퍼로스 12 젤 여과 컬럼에서 cPLAP 활성을 보이는 분획들은 구아닌 뉴클레오티드를 이용하여 GTP아제(GTPase) 활성도를 측정하는 한편, 0.4 ㎖에 대해 탈염을 위해 PD-10 탈염컬럼(desalting column)에 통과시킨 후 SDS-PAGE 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 그 결과 표준 분자량 마커를 사용하여 최대활성 분획의 위치를 조사한 결과 약 42 kDa이였으며, 도 9에서 보는 바와 같이 전기영동 젤 사진에서도 42 kDa의 단일밴드로 나타났다.

상기 실시예 1.5의 각각의 피크 α, β 및 γ에 해당하는 분획들 20 ㎕를 비가수분해성 GTP 유사체인 GTPγS 0.1mM, 비가수분해성 GDP 유사체인 GDPβS 0.1mM 와 반응시켜 참조예 1의 방법으로 cPLA₂ 활성화 증가정도를 측정하였다. 도 3의 결과에서, 피크 γ활성 분획에서 가장 높은 cPLA₂ 활성 증가가 관찰되었고, GTP유사체를 첨가하여 반응시켰을 때에 약 3.5배의 가장 높은 증가를 보여, 하기 실험예에서 사용하였다.

실험예 1. cPLA ₂ -활성화시키는 단백질의 활성도 변성 효과

cPLA₂-활성화시키는 활성도(cPLA₂-activating acitivity)의 성질을 알아보기 위하여, cPLA₂-활성화시키는 활성도의 고온처리 및 단백질분해효소인 트립신 처리에 대한 효과를 측정하였다. 실시예 1.5에서의 리소스 S 용출액 cPLAPγ분획에서 20㎕ 덜어내어 활성도를 참조예 1의 방법을 사용하여 알아보았다. 각 실험 그룹에 대조군과 0.1 M GTPγS 을 함께 처리한 결과를 관찰하였으며, 트립신 억제제인 어프로티닌(approtinin)을 트립신처리군에 사용하였다.

그룹 1 : cPLAPγ

그룹 2 : cPLAPγ+ 어프로티닌 0.25㎎/㎕ 처리 후, 트립신 0.5㎎/㎕ 처리군

그룹 3 : cPLAPγ+ 트립신 0.5㎎/㎕ 처리 후, 어프로티닌 0.25㎎/㎕ 처리군

그룹 4 : cPLAPγ+ 75℃에서 15분 처리군,

그룹 5 : cPLAPγ+ 75℃에서 30분 처리군,

도 4 의 결과에서와 같이, cPLA₂-활성화시키는 활성도는 그룹 1의 대조군과 비교하였을때, 고온처리와 트립신 처리에 민감함을 확인할 수 있었다.

실험예 2. cPLAP의 특성 1 : 다양한 PLA ₂ 들에 대한 cPLAP의 효과

다양한 PLA2s의 활성도는 같은 조건 하에서 1-스테아로일-2-[1-¹⁴C]아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-Stearoyl-2-[1-¹⁴C]arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 2-[1-¹⁴C]AA-GPC)을 기질로 사용하여 참조예 1의 방법으로 분석되었다. 도 5의 결과와 같이, 췌장 PLA₂, 비췌장 그룹인 혈소판의 sPLA₂ 및 소의 뇌로부터 부분적으로 정제된 iPLA₂ 에는 영향을 미치지 않았으나, 지라지라A₂에 있어서 2배 이상의 활성을 증가시키는 것을 관찰하였고(도 5 참조), 결론적으로 cPLAP 활성은 cPLA₂에 특이적임을 확인하였다.

실험예 3. cPLAP의 특성 2 : cPLAP의 G 단백질 특성 분석

cPLAP 작용 기작을 연구하기 위하여, cPLAP 활성에 대한 구아노신 뉴클레오타이드 및 그의 유사체에 대한 효과들을 알아보았다. GTP 결합 단백질, 즉 G 단백질은 뉴클레오타이드의 결합 및 활성을 위한 적절한 구성(configuration)을 위해 마그네슘의 적정한 농도를 요구하기 때문에, cPLAP 활성은 2.5mM의 염화마그네슘(MgCl₂)을 표준분석시스템에 첨가하여 결정되었다(Dole, V.P. and Meimertz, H.; J. Biol. Chem., 235, pp2595-2599, 1960). 이 농도에서 cPLA₂ 의 활성은 염화마그네슘의 농도에 의해 확실히 영향을 받지 않는다(도 6 참조). 또한, cPLAP의 효과는 구아노신 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 사용한 결과 GTPγS를 첨가한 경우에만 cPLAP의 활성을 증가시켰으므로 cPLAP이 G 단백질임을 더욱 입증하였다(도 6).

3.1. 구아노신 뉴클레오티드의 cPLAP에 대한 영향.

상기 실시예의 도 3의 결과에서, 가장 높은 cPLA₂ 활성 증가가 관찰된 피크 γ에 해당하는 분획 10 ㎕를 사용하여 GTPγS 및 GDPβS 의 농도를 10^-8 M 에서 10^-4M 로 변화시키면서 cPLA₂를 활성화시키는 활성도를 측정하였을 때, GTP 유사체인 GTPγS 는 cPLAP 활성도를 거의 2.5배 이상 까지 증가시키는 반면, GDP 유사체인 GDPβS는 농도가 증가함에따라 cPLAP 활성도를 감소시켰다(도 7 참조).

3.2. 구아노신 뉴클레오티드와 퓨린계 뉴클레오티드의 cPLAP에 대한 영향.

상기의 피크 γ의 활성 분획을 사용하여, GTP 유사체인 GTPγS, 퓨린계 뉴클레오티드인 ATP 및 5'-아데닐일이미도디포스페이트(5'-adenylylimidodiphosphate, AppNHp) 존재시 cPLAP에 대한 영향을 세 그룹으로 나누어 활성을 비교 관찰하였다.

그룹 1 : cPLA₂ 처리군

그룹 2 : cPLA₂ + cPLAPγ처리군

그룹 3 : cPLA₂ + cPLAPγ+ 마그네슘 처리군

도 6의 결과를 보면, 그룹 1의 기본 활성 수치와 비교하여 cPLAPγ첨가시 활성이 2배로 증가하였으며, 그룹 3의 마그네슘 첨가시 GTPγS가 존재하는 실험군에 cPLA₂를 활성화시키는 활성도가 3배 이상으로 증가하는 결과를 관찰하였다. 이에 반해 다른 퓨린 뉴클레오타이드들은 효과적이지 못한 것으로 나타났다(도 6 참조).

이런 결과들로 cPLAP가 GTP의 증가에 따라 활성이 증가되는, G 단백질과 동일한 특성을 갖고 있음을 확인하였다.

실험예 4. cPLA2-활성화시키는 단백질의 기질에 따른 활성도 효과

cPLAP의 효과가 인지질 2번 탄소의 아라키돈산에 특이적인 활성을 나타내는 cPLA₂에 대해 그 기질 특이성에 영향을 미치는지 여부를 검토하기 위하여, 실시예 1.5의 리소스 S 양이온교환 FPLC의 분획 중 피크γ에 해당하는 분획을 가지고, 2-[1-¹⁴C]PA-GPC (1-palmitoyl-2-[1-¹⁴C]palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine, 55.6 mCi/mmol, Amersham사), 2-[1-¹⁴C]LA-GPC (1-palmitoyl-2-[1-¹⁴C]linoleoyl-sn -glycerol-3-phosphocholine, 55.9 mCi/mmol, , Amersham사) 및 2-[1-¹⁴C]AA-GPC (1-acyl-2-[1-¹⁴C] arachidonyl-sn-glycerol-3-phosphocholine 55.3 mCi/mmol, Amersham사)을 기질로 사용하여 참조예 1의 방법을 사용하여 cPLA₂의 활성도를 측정하였다.

그룹 1 : cPLA₂ 첨가군

그룹 2 : cPLA₂ + cPLAPγ 첨가군

그룹 3 : cPLA₂ + cPLAPγ+ GTPγS 첨가군

도 8의 결과를 보면, cPLA₂의 활성도는 2-AA-PC를 기질로 사용하는 경우에 현저하게 높은 활성을 나타냈으며, cPLA₂ 첨가군은 2배 이상, cPLAPγ를 첨가한 경우 4배이상의 활성을 보였고, cPLAPγ 및 GTPγS를 첨가하였을 때는 6배 이상의 활성을 보였다. 이 결과로, 실시예 1에서 분리 정제한 cPLAP 은 기질인 2-AA-PC에 특이적인 cPLA₂의 활성을 증가시키며 GTPγS에 의해 cPLAP의 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다 그리고, cPLA₂의 기질 특이성에는 특별한 영향이 미치지 않음을 확인하였다.

실험예 5. cPLAP의 특성 3 :[γ- ³² P]GTP를 사용한 cPLAP에 광친화 표지(Photoaffinity labeling)로 cPLAP의 G 단백질 특성 분석

광반응(Photoreaction) 및 분자량에 의해 GTP가 cPLAP에 결합하는지 확인하기 위하여, 기존의 방법(Kim, D.K. and Bonventre, J.V.; Biochem. J., 294, pp261-270, 1993; Higashijima, T. et al; J. Biol. Chem., 262, pp762-766, 1987; Linse, K. and Mandelkow, E. M; J. Biol. Chem., 263, pp15205-15210, 1988 )을 변형하여 [γ-³²P]를 가지고 cPLAP에 광친화 표지(Photoaffinity labeling)를 수행하였다. 요약하면, 시료들을 5-10mCi의 [γ-³²P]GTP, 0.1mM AppNHp 및 2mM 염화마그네슘을 혼합하여, 4℃에서 5분 정도 둔 후, 혼합물을 얼음 위에서 5-10분동안 UV 크로스링커(Spectrolinker XL-1000, Spectronics사)를 사용하여 254nm의 UV를 조사(irradiation)하여 광표지(photolabel)를 시켰다. 조사 후, 시료들을 라엠리 완충액(Laemmli buffer, Baek, K.J. et al.; Biochemistry, 35, pp2651-2657, 1996)와 섞어, 교차결합(crosslinking) 반응을 멈추게 한 다음, 12% 폴리아크릴아마이드젤을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 후 젤을 은염색(silver staining)을 수행하여 분리정도를 확인하였으며, 강화스크린(intensifying screen)을 같이 사용하여 필름(Kodak BIOMAX MR, Kodak사)에 노출시켜 결과를 확인하였다(도 9 참조).

생화학적특성에서 예상되는 바대로 DEAE-셀룰로오즈 및 페닐 HIC 로부터 수득된 활성분획은 GTP로 표지되었고, 뚜렷한 분자량은 62 와 42 kDa이었으며 이것은 슈퍼로스 12 젤 필트레이션 결과와 일치함을 알 수 있었으며, 이것으로 이형삼합체(heterotrimeric) G 단백질의 α-서브유니트와 유사함을 확인할 수 있었다. 슈퍼로즈 12 젤 필트레이션 FPLC에서의 200 kDa cPLAP의 활성도는 구아노신 뉴클레오타이드에 영향을 받지 않았으며 UV 교차결합에 의해서도 표지되지 않았다. 이런 결과들로 cPLAP가 GTP-결합 단백질, 즉 G 단백질임을 확인하였다.

실험예 6. cPLAP의 특성 4 : G 단백질인 Rac1의 항체를 이용한 cPLAP 웨스턴 블롯 분석

적은 분자량의 GTP-결합 조절 단백질 Rac-1가 매개하는 cPLA₂는 안티센스 또는 억제제를 사용한 실험에 의해 알려졌다. cPLAP가 기존 분류의 하위분류 단계임을 확인하기 위하여, 폴리클로날 Rac1 항체를 이용한 웨스턴블롯분석을 시행하였다. Rat 2 섬유아세포의 균질분쇄액(fibroblast homogenate)은 Rac1 표준시료로 사용되었다.

페닐-5PW 분획들을 사용하여 SDS-PAGE를 수행한 후, 상온에서 30mA의 일정한 전류로 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 옮겨졌다. 멤브레인을 상온에서 2.5% 스킴밀크(non-fat dry skim milk)를 함유한 TBS-T(Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20)에서 2시간동안 블로킹시킨 후, 멤브레인은 4시간동안 Rac1 폴리클로날 항체(1:1000 희석)로 반응시키고, 그 다음 염소 항-토끼 IgG (goat anti-rabbit IgG, horse radish peroxidase 컨쥬게이트된 것 또는 알칼라인포스파타제가 컨쥬게이트된 것, Santa Cruz biotechnology사, 미국)를 1:2000으로 희석시켜 2시간동안 반응시킨다. 검출은 ECL 키트(Amersham Life Science 사, 영국) 또는 NBT/BCIP(1-step NBT/BCIP, Pierce사, 미국)을 사용하여 수행하였다.

페닐-5PW로부터 수득된 활성분획은 42, 35, 40 kDa의 위치에서 Rac1 항혈청과 교차반응(cross-reacted)을 하였으나, 다음 단계의 은염색단계에서는 42kDa의 단백질만이 나타났고, Rat 2 섬유아세포 균질분쇄액에서 얻은 Rac1는 21kDa에서 발견되었다(도 9 참조).

실험예 7. cPLAP 특성 5 : cPLA ₂ 활성을 위한 cPLAP 자극에 대한 칼슘의 효과

cPLAP에 의한 cPLA₂의 활성의 칼슘 농도에 대한 의존도를 알아보기 위하여, cPLA₂, cPLAPγ 및 GTPγS의 세가지 조합으로 그 활성도를 측정 비교하였다.

cPLAP의 활동 양식을 이해하기 위하여, cPLAP에 의한 자극을 칼슘 농도 10^-8 M 내지 10^-3M의 범위에 걸쳐 관찰하였다(도 10 참조).

그룹 1 : cPLA₂ 만의 칼슘 농도별 활성도 측정군.

그룹 2 : cPLA₂ + cPLAPγ의 칼슘 농도별 활성도 측정군.

그룹 3 : cPLA₂ + cPLAPγ + GTPγS 의 칼슘 농도별 활성도 측정군.

도 10의 결과와 같이, 칼슘농도 10^-8 M에서 10^-7M으로의 증가시에 세 그룹에서 모두 활성 증가를 보였으며, 흥미롭게도, 칼슘의 10^-6M 이하의 농도에서는 그룹3에서 GTPγS가 유도한 cPLA₂ 활성도 증가가 그룹 1의 cPLA₂ 활성도 증가와 비교하였을 때 최고치를 보였다. 그룹 1의 cPLA₂ 활성도는 칼슘 농도 증가에 따라 활성이 증가되는 칼슘-의존적인 양상을 보이나, 그룹 2에서는 10^-7M 에서 10^-3M 로의 칼슘농도증가시 그룹 1과 비슷한 그래프 양상을 보이며, cPLAP 활성화에 의한 cPLA₂ 활성 증가는 관찰되지 않았다. 최고의 활성자극이외에도, cPLAP 활성은 모든 농도에서 달성되었으며, 칼슘 농도에 비의존적 활성을 가짐을 확인하였다.

실험예 8. L-[ ³⁵ S]메티오닌으로 표지한 세포에서 cPLA ₂ 와 함께 동시침전되는 42 kDa 단백질의 발견

HL-60 및 U937 세포들을 10% FCS를 함유한 DMEM 배지에서 배양하여, 400×g 에서 5분간 원심분리시켜 수집하였다. 침전물은 수세완충액(wash buffer)인 L-글루타민이 2%로 첨가되었고, L-메티오닌이 없는 DMEM 배지(10% FCS)에 재용해하여, 400×g 에서 5분간 원심분리시켰다. 수세완충액을 완전히 제거하고나서, 세포들은 1㎖당 1×10⁷ 세포 정도의 농도로 메티오닌이 없는 배지에 녹여졌다. 이것을 24 웰 플레이트에 옮긴 후, 배지에 잔존한 메티오닌을 소모시키기 위하여 세포들을 37℃에서 30분간 배양시켰다.

[³⁵S]-메티오닌 0.1mCi을 플레이트에 첨가하고 3시간동안 세포가 방사선표지된 것을 전체 단백질내에 삽입할 수 있도록 하였다. 세포들에 200nM PMA 또는 비히클(vehicle)로 30분간 처리하였으며, 1.5㎖ 의 시험관에 옮겨, 5㎖의 PBS를 사용하여 400×g 에서 5분간 원심분리시켜 세포를 2회 수세하였다. 생성된 침전물은 1×10⁷ 세포당 1.0㎖의 RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50mM Tris, pH 7.5, 및 1mM EDTA)에 녹여 세포를 용해시켰다. 세포들을 30분간 얼음에서 반응시킨 후, 4℃, 10000×g에서 10분간 원심분리시켰다. 상층액들을 다시 100000×g에서 30분간 원심분리하여 그 상층액들을 사용하였다.

상층액 내의 비특이적으로 형성된 면역복합체(immune complex) 또는 고체상에 결합하는 단백질들을 미리 제거하기 위하여, 상층액 1.0㎖을 50㎕의 정상 혈청과 함께 얼음 위에서 1시간동안 반응시켰다. 그 다음 고정된 SAC(S.aureus Cowan I)의 10% 수세된 현탁액 500㎕를 상층액에 첨가하여 얼음 위에서 30분동안 더 반응시켰다. 상층액을 항-cPLA₂ 항체가 결합된 단백질 A-세파로스 비드(sepharose beads) 20㎕와 12시간동안 반응시켰다. 비드에 결합된 면역복합체을 침전시켜 용해완충액 1.0㎖을 사용하여 5회 수세하였다. cPLA₂ 및 결합된 단백질들은 2×라엠리 완충액 70㎕를 사용하여 100℃에서 5분동안 반응됨으로서 용출되었고, 이것을 가지고 10% SDS-PAGE를 수행하였다. DMSO로 30분동안 2회 수세를 한 후에 DMSO에 녹인 22% PPO를 가지고 1시간동안 수세하였다. 그 다음 순환챔버에서 물로 30분동안 수세하고, 젤을 80℃에서 40분간 말린 후, -70℃에서 16시간 이상 필름에 노출시켰다

도 11의 결과를 보면, 사용한 두 종류 세포주 모두에서 대조군의 비특이적 결합 단백질 외에 52 kDa 과 42 kDa의 위치에 뚜렷한 밴드가 관찰됨으로써 세포 내에서도 42 kDa cPLAP이 cPLA₂ 효소와 특이적으로 결합하여 작용함을 알 수 있었다.

본 발명의 신규한 cPLAP 는 cPLA₂ 가 관여하는 생리현상의 연구 분야 및 cPLA₂ 와 관련된 뇌졸중, 뇌부종 등의 퇴행성질환, 염증질환, 혈전증 등의 혈관질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 은 cPLAP의 분리 및 정제 방법을 개략적으로 나타낸 도이고,

도 2a 는 DEAE-셀룰로오스 음이온 교환 컬럼 통과 분획 및 염화나트륨 농도에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 도이고,

도 2b 는 페닐-세파로스 CL-4B 소수성 컬럼 통과 분획에 따른 cPLA₂를 활성화시키는 활성도(배수) 및 iPLA₂의 활성정도를 나타낸 도이고,

도 2c 는 페닐-5PW HPLC 컬럼 통과 시간 및 염화나트륨 농도에 따른 cPLA₂를 활성화시키는 활성도(배수)를 나타낸 도이고,

도 2d 는 리소스 S FPLC 컬럼 통과 후, 용출 부피에 따른 cPLA₂를 활성화시키는 활성도(배수)를 나타낸 도이고,

도 3 은 리소스 S FPLC 컬럼 크로마토 그래피 후, 세 피크 α,β,γ 분획의 GTP 유사체 및 GDP 유사체 처리시, cPLAP 활성도 양상을 나타낸 도이고,

도 4 는 cPLAP의 트립신 처리 및 고온 처리에 대한 영향을 나타낸 도이고,

도 5 는 여러 PLA₂들 중 cPLA₂에 대한 cPLAP의 특이적 영향을 나타낸 도이고

도 6 은 GTP 유사체와 퓨린계 뉴클레오티드들에 대한 cPLAP와 마그네슘의 영향을 나타낸 도이고,

도 7 은 GTP 유사체와 GDP 유사체의 농도증가에 대한 cPLAP의 활성 영향을 나타낸 도이고,

도 8 은 기질 특이적인 cPLA₂를 활성화시키고, GTP 유사체에 의해 활성화되는 cPLAP 활성도를 나타낸 도이고,

도 9 는 정제 분획들을 항-Rac1 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴블롯분석을 시행한 결과 도이고,

도 10 은 칼슘 농도에 따른 cPLAP에 의한 cPLA₂ 활성도 증가 양상을 나타낸 도이고,

도 11 은 HL-60 및 U937세포에서의 cPLA₂와 동시 침전되는 단백질을 SDS-PAGE한 결과도이다.

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8. 소의 뇌 무게(㎏)의 3-8배의 완충액을 가한 뒤, 분쇄하여 얻은 균질혼합액을 원심분리하고, 이에 수득한 상층액에 약산을 가하여 pH 5.0으로 조정하여 원심분리한 다음 침전물을 수득하여, 침전물을 완충액에 현탁시킨 후 음이온 교환수지 컬럼으로 여과하고 용출된 단백질을 소수성 컬럼크로마토그래피, 고성능액체크로마토크래피(HPLC), 양이온 교환 FPLC 및 젤 여과 컬럼을 순서대로 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 cPLAP(cytosolic phospholipase A₂-activating protein)의 제조 방법.
9. 제 8항에 있어서, 약산은 아세트산으로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조 방법.
10. 제 8항에 있어서, 음이온 교환 수지 컬럼으로 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 사용하는 제조방법.
11. 제 8항에 있어서, 소수성 컬럼 크로마토그래피에서 페닐세파로스 CL-4B 소수성 컬럼을 사용하는 제조방법.
12. 제 8항에 있어서, 고성능액체크로마토그래피(HPLC)에서 페닐-5PW HPLC를 사용하는 제조방법.
13. 제 8항에 있어서, 양이온 교환 FPLC에서 리소스 S 컬럼을 사용하는 제조방법.
14. 제 8항에 있어서, 젤 여과 컬럼은 수퍼로스 12 컬럼을 사용하는 제조방법.
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