KR20010091129A - 6가지 ｃｙｐ효소의 기질 및 그의 대사물질 모두 분리가능한 단일 용매체계와 분리방법 - Google Patents

6가지 ｃｙｐ효소의 기질 및 그의 대사물질 모두 분리가능한 단일 용매체계와 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일 분리 컬럼에서 단일 이동상 용매체계로 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 분리할 수 있는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 6 가지 CYP 효소 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4 등의 기질과 그의 대사물질들을 역상(reversed-phase) C18충전물질로 채워진 단일 컬럼이 장착된 액상크로마토그래피(HPLC)에서 단일 이동상 용매체계를 이용하여 분리하는 방법과 그의 용매체계에 관한 것이다. 본 발명의 분리방법은 CYP 효소의 유전적 조절기능 등의 학문적 연구분야 뿐만 아니라 신약개발 등의 산업적 응용분야에서 CYP 효소의 활성을 측정하기 위해서 경제적으로 매우 유용하고 효과적인 방법으로 사용될 수 있다.

Description

6 가지 ＣＹＰ 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두 분리 가능한 단일 용매체계와 분리방법{A novel method and a solvent system thereof for determination of all metabolites of 6 CYP enzymes}
본 발명은 단일 분리 컬럼에서 단일 이동상 용매체계로 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 분리할 수 있는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 6 가지 CYP 효소 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4 등의 기질과 그의 대사물질들을 역상(reversed-phase) C18충전물질로 채워진 단일 컬럼이 장착된 액상크로마토그래피(HPLC)에서 단일 이동상 용매체계를 이용하여 분리하는 방법과 그의 용매체계에 관한 것이다.
Cytochrome P450(이하 "CYP"로 약칭함) 효소는 약물이나 외부에서 들어온 독성화학물질 등의 생물학적 전환(biotransformation)에 매우 중요한 역할을 하는 약물대사효소로서, 최근 들어 CYP 효소에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히, CYP 관련 논문이 1995년부터 1999년까지 연 평균 1636편이 게재될 만큼 CYP 효소의 중요성이 대두되고 있는 실정이다. 이러한 중요성을 갖는 CYP 효소는 인체 내에서 상기 독성 물질들을 대사하여 재빨리 배출시키는 기능을 담당하는데, 인체 내에서 단일 형태로 존재하는 것이 아니고 여러 개의 동위효소들로 구성된 복합적인 형태로 존재한다. 인간에게는 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4 동위효소들이 존재하여 인체에 흡수된 약물을 대사시키는데 매우 중요한 역할을 한다. 따라서, 이들 효소의 활성도를 측정하는 것은 신약개발 등의 산업적 응용분야나 인체 내의 유전적 조절기능 연구 등의 학문적 분야에 있어서 반드시 필요한 과정이다. 상기 6 가지 CYP 효소는 각각 서로 다른 약물들을 대사시키기 때문에 이들의 효소활성을 측정하기 위해서는 서로 다른 기질(substrate)로 부터 생성된 각각의 대사산물을 측정해야 한다.
이와 같이 CYP의 효소활성을 측정하기 위하여 기질 및 그의 대사물질을 분리하는 기존의 방법들은 주로 액상 크로마토그래피(high performance liquid chromatograph, 이하 "HPLC:로 약칭함)를 이용하여 분리하는 방법들이다. 현재, 각 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질을 분석하기 위해 사용되고 있는 대표적인 분석방법들은 다음과 같다.
CYP1A2의 기질인 카페인(caffeine) 및 그의 대사물질 파라잔틴(paraxanthine)은 뉴클레오실(Nucleosil) C18칼럼(0.46x25cm)이 장착된 테트라하이드로푸란-아세테이트-아세토니트릴(terahydrofuran-acetic acid-acetonitrile) 용매를 이용하여 분리한다(Berthou 등,Xenobiotica.19: 401-417, 1989). CYP2A6의 기질인 구마린(coumarin) 및 그의 대사물질 하이드록시구마린(hydroxycoumarine)은 슈펠코실(Supelcosil) C18칼럼이 장착된 HPLC에서 25% 메탄올 용매를 이용하여 40 ℃에서 분리한다(Moran 등,J. Chromatogr.416: 165-169, 1987). CYP2C19의 기질인 오메프라졸(omeprazole) 및그의 대사물질 하이드록시오메프라졸(hydroxyomeprozole)은 캅셀 펙(capcell Pak) C18SG120 칼럼(0.46x25cm)이 장작된 HPLC에서 50 mM의 인산염(phosphate)을 함유한 아세토니트릴(acetonitrile) 용매를 이용하여 분리한다(Kobayashi 등,J. Chromatogr.579: 299-305, 1992). CYP2D6의 기질인 뷰퍼랄올(bufuralol) 및 그의 대사물질 하이드록시뷰퍼랄올(hydroxybufuralol)은 스페리소브(Spherisorb) 칼럼이 장착된 HPLC를 이용하여 분리한다(Kronbach 등,Anal. Biochem.162: 24-32, 1987). CYP2E1의 기질인 니트로페놀(nitrophenol) 및 그의 대사물질 니트로카테콜(nitrocatechol)은 본다 팩(Bondapak) C18 칼럼이 장착된 HPLC에서 아세토니트릴-아세테이트(acetonitrile-acetic acid) 용매를 이용하여 분리한다(Tassaneeyakul 등,J. Chromatogr.616: 73-78, 1993). CYP3A4의 기질인 테스토스테론(testosterone) 및 그의 대사물질 6-베타하이드록시 테스토스테론(6-β hydroxytestosterone)은 C18칼럼(0.2x30cm)이 장착된 HPLC에서 10 내지 40% 아세토니트릴(acetonitrile) 용매를 이용하여 분리한다(van der Hoeven,Biochem. Biophys. Res. Commun.100: 1285-1291, 1981).
이와 같이 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질들을 분석하기 위하여 개발된 분리방법들은 6 가지 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분석하지 못할 뿐 아니라 각 효소의 기질과 대사물질의 분석에 적합한 서로 다른 HPLC 분석용 컬럼 및 용매쳬계를 필요로 한다.
6 가지 CYP 효소 중의 하나인 CYP2C19를 예로 들어 구체적으로 설명하면, CYP2C19는 오메프라졸을 기질로 하여 그의 대사물질로 하이드록시오메프라졸을 생성하는 효소이다. CYP2C19 효소의 기질로 사용되는 오메프라졸은 벤지미다졸의 치환체(substituted benzimidazole)로서 위의 체벽세포 내에서 H+/K+-ATPase를 선택적으로 저해하여 위의 산 분비를 억제하는 물질이다. 오메프라졸은 간에서 광범위하게 대사되어 오메프라졸 설폰(omeprozole sulphone), 하이드록시오메프라졸 및 오메프라졸 설프하이드(omeprazole sulphide) 등과 같은 다양한 대사물질들을 생성한다. 오메프라졸 설폰 및 오메프라졸 설프하이드는 주로 혈장(plasma)에서 발견되는 CYP2C19 효소의 주요 대사물질이고, 하이드록시오메프라졸은 대부분이 오줌에 존재한다. 일반적으로, 혈장 내 오메프라졸 설프하이드의 양은 측정할 수 없을 정도의 소량이며, 오줌 내 오메프라졸 설폰 및 오메프라졸 설프하이드 역시 거의 무시할 정도의 양으로 존재한다.
이처럼 혈장 및 오줌 내에 따로 존재하는 서로 다른 오메프라졸의 CYP2C19 효소의 대사물질들을 분석하기 위하여, 몇몇 HPLC 분리방법이 사용되고 있다. 하지만, 현재까지 개발된 HPLC 분석방법 중 오직 하나의 역상(reversed-phase) HPLC 분리방법만이 오메프라졸과 그의 대사물질들, 특히 혈장 내 존재하는 오메프라졸 설폰 및 오메프라졸 설프하이드를 동시에 분석하였을 뿐이다(M. A. Amantea 등,J. Chromatogr., 426: 216, 1988). 또한, 혈장 내 또는 혈장 및 오줌 모두에 존재하는 오메프라졸, 오메프라졸 설폰 및 오메프라졸 설프하이드를 분리하는 역상 HPLC 분리방법이 개발되었지만, 이 분리방법 역시 혈장 내 존재하는 하이드록시오메프라졸을 분리하지는 못하였다(G. W. Mihaly 등,J. Chromatogr., 278: 311, 1983). 더욱이, 상기 HPLC 분리방법에 사용된 표준형의 옥타데실실리카(octadecylsilica, ODS) 컬럼은 산성 조건에서 쉽사리 분해되는 오메프라졸의 안정화를 위해 사용되는 알칼라인 이동상(alkaline mobile phase)과 함께 장기간의 사용이 불가능하다는 문제점이 있다. 이 외에도, 기질인 오메프라졸, 혈장 내 존재하는 오메프라졸 설폰과 오메프라졸 설프하이드 및 오줌 내 존재하는 하이드록시오메프라졸을 분석할 수 있는 또 다른 HPLC 분리방법이 개발되었지만, 이 HPLC 분리방법 역시 두 개의 독립적인 HPLC 시스템을 사용해야 하는 단점이 있다. 즉, 혈장 내 오메프라졸 설폰 및 오메프라졸 설프하이드 분석을 위한 정상(normal-phase)의 HPLC 시스템과 오줌 내 하이드록시오메프라졸을 분석하기 위한 역상의 HPLC 시스템으로 구성된 두 개의 독립적인 HPLC 시스템을 필요로 한다.
이와 같이 6 가지 CYP 효소 중의 하나인 CYP2C19의 기질인 오메프라졸과 그의 대사물질을 분리하는 데에도 두 종류 이상의 HPLC 분석 시스템이 요구되기 때문에, 6 가지 CYP 효소 모두의 기질과 그의 대사물질들을 분석하기 위해서는 이 보다 더욱 복잡하고 다양한 HPLC 분석용 칼럼과 용매체계가 필요하다. 따라서, CYP 효소에 관한 연구를 위해 요구되는 6 가지 CYP 효소 각각의 기질과 그의 대사물질에 적합한 여러 가지 다른 HPLC 분석용 칼럼과 분석 용매를 갖추기 위해서는 많은 경비가 소요되고 이러한 경제적인 문제가 이들 효소에 대한 연구를 저해하고 있다.
이렇게 기존의 HPLC 분리방법들이 안고있는 경제적인 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명은 단일 컬럼으로 6 가지 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질 모두를분리할 수 있는 단일 용매체계와 이를 이용하는 분리방법을 개발하였다. 구체적으로, 역상 C18충전물질로 채워진 단일 컬럼이 장착된 HPLC를 이용하여 6 가지 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 이동상의 비율과 분리 조건을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 단일 컬럼으로 6 가지 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질 모두를 분리할 수 있는 단일 용매체계와 이를 이용하는 분리방법을 제공하는 것이다.
도 1은 CYP1A2의 기질인 카페인(caffeine)과 그의 대사물질의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 2는 CYP2A6의 기질인 구마린(coumarin)과 그의 대사물질의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 3은 CYP2C19의 기질인 오메프라졸(omeprazole)과 그의 대사물질의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 4는 CYP2D6의 기질인 뷰퍼란올(bufuranol)과 그의 대사물질의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 5는 CYP2E1의 기질인 니트로페놀(p-nitrophenol)과 그의 대사물질의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 6은 CYP3A4의 기질인 테스토스테론(testosterone)과 그의 대사물질의 분리 크로마토그램을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 동시에 분리 할 수 있는 단일 용매체계와 분리방법을 제공한다.
이를 위하여, 본 발명자들은 역상 C18충전물질로 채워져 있는 단일 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 6 가지 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 이동상의 비율과 분리조건을 개발한다. 구체적으로, 단일 용매체계는 5% 메탄올 : 2% 프로판올 : 93% 물을 포함하는 이동상 A(pH 2 내지 4)와 80%메탄올 : 10% 프로판올 : 10% 물을 포함하는 이동상 B(pH 2 내지 4)로 구성되며, 상기 이동상은 각각의 용매를 부피 대 부피로 혼합한 후 인산염 완충용액으로 pH를 맞추어 제조한다. 본 발명의 분리방법은 상기와 같이 제조된 이동상 A와 B를 6 가지 CYP 효소의 기질과 대사물질에 따라 서로 다른 비율로 맞추어 시간에 따라 주입하면서 6 가지 CYP 효소 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4 각각의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분리하는 방법이다. 이 때, 6 가지 CYP 효소 각각의 기질과 그의 대사물질을 분리하기 위하여 사용되는 이동상에서 용매의 pH 범위는 pH 2 내지 4가 바람직하다. 일반적으로, 용매의 pH가 낮을수록 각 효소들의 기질 및 그의 대사물질들이 잘 분리되지만, 역상 C18충전물질로 채워져 있는 컬럼은 pH 내구 한도가 pH 2 내지 8이기 때문에 pH 2 이하의 용매를 사용할 경우에는 컬럼의 수명을 단축하게 된다. 따라서, 이동상 A와 B의 바람직한 pH 범위는 2 내지 4이고 보다 바람직하게는 pH 3이 적당하다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조된 이동상 A와 B를 이용하여 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 이동상의 비율과 분리조건을 개발하였다. 6 가지 CYP 효소 각각의 기질 및 그의 대사물질을 분리하기 위하여 사용된 이동상의 비율과 분리조건은 하기와 같다.
(1) CYP1A2의 기질인 카페인과 이의 대사물질 분리를 위한 이동상의 비율;
0 내지 2분 ; 100% A,
2 내지 3분 ; 100% A에서 95% A + 5% B로,
3 내지 8분 ; 95% A + 5% B,
8 내지 10분 ; 95% A + 5% B에서 90% A + 10% B로,
10 내지 11분 ; 90% A + 10% B,
11 내지 12분 ; 90% A + 10% B에서 60% A + 40% B로,
12 내지 14분 ; 60% A + 40% B
(2) CYP2A6의 기질인 구마린 및 이의 대사물질 분리를 위한 이동상의 비율;
70% A + 30% B
(3) CYP2C19의 기질인 오메프라졸과 이의 대사물질 분리를 위한 이동상의 비율;
75% A + 25% B
(4) CYP2D6의 기질인 뷰퍼랄올 및 이의 대사물질 분리를 위한 이동상의 비율조성;
0 내지 4분 ; 75% A + 25% B,
4 내지 9분 ; 75% A + 25% B에서 20% A + 80% B로,
9 내지 13분 ; 20% A + 80% B
(5) CYP2E1의 기질인 p-니트로페놀 및 이의 대사물질 분리를 위한 이동상의 비율;
0 내지 8분 ; 60% A + 40% B,
8 내지 10분 ; 60% A + 40% B에서 50% A + 50% B로,
10 내지 14분 ; 50% A + 50% B
(6) CYP3A4의 기질인 테스토스테론 및 이의 대사물질 분리를 위한 이동상의 비율;
0 내지 3분 ; 50% A + 50% B,
3 내지 15분 ; 50% A + 50% B에서 0% A + 100% B로,
15 내지 29분 ; 0% A + 100% B
상기와 같이 각 효소의 기질 및 그의 대사물질에 따라 서로 다른 이동상의 비율과 분리조건을 이용하여 6 가지 CYP 효소의 각 기질 및 그의 대사물질을 분리한 후 자외선 검출기를 이용하여 크로마토그램으로 나타낸 결과, 각 효소의 기질로 사용하는 카페인, 구마린, 오메프라졸, 뷰퍼랄올, 니트로페놀 및 테스토스테론 뿐 아니라 각 효소의 대사물질인 파라잔틴, 하이드록시구마린, 하이드록시오메프라졸, 1-하이드록시뷰퍼랄올, 4-니트로카테콜 및 하이드록시테스토스테론이 모두 분리되었다(도 1, 2, 3, 4, 5 및 6참조).
결론적으로, 본 발명의 분리방법은 각각의 6 가지 CYP 효소에 따라 이동상의 비율과 분리조건만을 바꾸어줌으로써 6 가지 CYP 효소의 각 기질과 대사물질들을 단일 칼럼에서 동시에 분리할 수 있는 매우 유용한 방법이다. 구체적으로, 역상 C18충전물질이 채워진 단일 컬럼이 장착된 HPLC를 이용하여 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 각 효소에 적합한 이동상 체계를 개발함으로써, 본 발명의 분리방법은 종래에 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질을 분리하기 위해서 최소한 6 가지 HPLC 분석용 컬럼과 6 가지 이동상 체계를 사용해야만 하던 것을 단일 HPLC 칼럼과 이동상 체계로 간소화시켜 HPLC 분석용 컬럼과 용매의 사용이 매우 효율적인 방법이다. 따라서, 본 발명의 분리방법은 CYP 약물대사효소의 기질 및 그의 대사물질의 분리를 위한 초기 컬럼 구입 비용을 절감할 수 있으며, HPLC에 사용되는 이동상의 용매 대부분을 가격이 저렴한 메탄올을 이용하여 제조함으로써 상대적으로 가격이 비싼 다른 용매의 이용보다 경제적인 비교 우위를 차지하여 HPLC 분석용 이동상 체계의 사용에서도 경제적 절감 효과를 가져올 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 분리하기 위한 단일 용매체계와 분리방법
본 발명은 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 분리하기 위하여, 역상 C18충전물질로 채워져 있는 단일 컬럼(Kromasil 4.6x150mm, Phase Separations, USA)이 장착된 HPLC(510 pump, 996 Photodiode array detector, Waters, USA)를 사용하여 6 가지 CYP 효소의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 이동상의 비율과 분리조건을 개발하였다.
구체적으로, 단일 용매체계는 5% 메탄올 : 2% 프로판올 : 93% 물을 포함하는이동상 A(pH 2 내지 4)와 80% 메탄올 : 10% 프로판올 : 10% 물을 포함하는 이동상 B(pH 2 내지 4)로 구성되며, 상기 이동상은 각각의 용매를 부피 대 부피로 혼합한 후 인산염 완충용액으로 pH를 맞추어 제조하였다. 상기와 같이 제조된 이동상 A와 B를 6 가지 CYP 효소의 기질과 대사물질에 따라 서로 다른 비율로 맞추어 시간에 따라 주입하면서 6 가지 CYP 효소 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4 각각의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분리하였다. 이 때, 6 가지 CYP 효소 각각의 기질과 그의 대사물질을 분리하기 위해 사용되는 이동상에서 용매의 pH 범위는 pH 2 내지 4가 바람직하다. 일반적으로, 용매의 pH가 낮을수록 각 효소들의 기질 및 그의 대사물질들이 잘 분리되지만, 역상 C18충전물질로 채워져 있는 컬럼은 pH 내구 한도가 pH 2 내지 8이기 때문에 pH 2 이하의 용매를 사용할 경우에는 컬럼의 수명을 단축하게 된다. 따라서, 이동상 A와 B의 바람직한 pH 범위는 2 내지 4이고 보다 바람직하게는 pH 3이 적당하다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조된 이동상 A와 B를 이용하여 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 이동상의 비율과 분리조건을 개발하였다.
또한, 본 발명자들은 상기의 이동상의 비율과 분리조건을 이용하여 6 가지 CYP 효소 각각의 기질 및 그의 대사물질을 분석하였다.
<실험예 1> CYP1A2의 기질 및 그의 대사물질 분리
역상 C18충전물질로 채워져 있는 컬럼(4.6x150mm)이 장착된 HPLC에 CYP1A2의 기질인 카페인(caffeine, Sigma)과 그의 대사물질 파라잔틴(paraxanthine, Sigma), 쎄오브로마인(theobromine, Sigma), 쎄오필린(theophylline, Sigma), 1,3,7-트리메틸우레이트(1,3,7-trimethylurate, Sigma) 등을 주입한 후 하기와 같은 이동상 A(5% 메탄올: 2% 프로판올 : 93% 물, pH 3)와 이동상 B(80% 메탄올 : 10% 프로판올 : 10% 물, pH 3)의 비율로 시간에 따라 분리하였다. 이때, 이동상 A와 B는 각각의 용매성분을 부피 대 부피로 혼합한 후 인산염 완충용액을 이용하여 pH 3을 맞추는 것이 바람직하다.
0 내지 2분 ; 100% A,
2 내지 3분 ; 100% A에서 95% A + 5% B로,
3 내지 8분 ; 95% A + 5% B,
8 내지 10분 ; 95% A + 5% B에서 90% A + 10% B로,
10 내지 11분 ; 90% A + 10% B,
11 내지 12분 ; 90% A + 10% B에서 60% A + 40% B로,
12 내지 14분 ; 60% A + 40% B.
이 때, 이동상의 유속은 일정하게 분당 0.8 ml을 유지시켰다.
도 1은 상기와 같은 이동상 조건으로 CYP1A2의 기질과 그의 대사물질을 분리한 후 자외선 분리기를 이용하여 280 nm 파장에서 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.도 1에 나타난 바와 같이, 14 분대에서 기질인 카페인이 분리되었고, 그의 대사물질 파라잔틴, 쎄오브로마인, 쎄오필린 및 1,3,7-트리메틸우레이트가 각각 6, 9, 10 및 11 분대에서 분리됨을 확인하였다. 따라서, 상기의 복잡한 이동상 비율 및 분리조건을 사용하면 CYP1A2의 기질인 카페인 및 그의 대사물질 파라잔틴 이외 3개의 다른 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있다.
<실험예 2> CYP2A6의 기질 및 대사물질 분리
실험예 1과 동일한 컬럼이 장착된 HPLC에 CYP2A6의 기질인 구마린(coumarin, Sigma)과 그의 대사물질 7-하이드록시구마린(7-hydroxycoumarin, Sigma)를 주입한 후 이동상의 비율을 70% A + 30% B로 일정하게(isocratic) 유지하면서 분리하였다. 이 때, 이동상의 유속은 분당 0.8 ml로 유지시켰다.
상기와 같은 이동상 비율 및 분리조건으로 분리한 후 자외선 분리기를 이용하여 240 nm 파장에서 분석한 결과, CYP2A6의 기질인 구마린과 그의 대사물질 하이드록시구마린이 동시에 12 분대와 8 분대에서 각각 분리되었다(도 2).
<실험예 3> CYP2C19의 기질 및 그의 대사물질 분리
실험예 1과 동일한 컬럼이 장착된 HPLC에 CYP2C19의 기질인 오메프라졸(omeprazole, Fujisawa-Astra)과 그의 대사물질 하이드록시오메프라졸(hydroxyomeprazole, Fujisawa-Astra)을 주입한 후 이동상의 비율을 75% A + 25% B로 일정하게 유지하면서 분리하였다. 이 때, 이동상의 유속은 분당 0.8 ml로 유지시켰다.
상기와 같은 이동상 비율 및 분리조건으로 분리한 후 자외선 분리기를 이용하여 302 nm 파장에서 분석한 결과, CYP2C19의 기질인 오메프라졸과 그의 대사물질 하이드록시오메프라졸이 동시에 9 분대와 7 분대에서 각각 분리되었고 하이드록시오메프라졸 이외의 다른 대사물질인 오메프라졸 설폰(omeprazole sulphone) 역시 15분대에서 동시에 분리됨을 확인하였다(도 3).
<실험예 4> CYP2D6의 기질 및 그의 대사물질 분리
실험예 1과 동일한 컬럼이 장착된 HPLC에 CYP2D6의 기질인 뷰퍼랄올(bufuralol, GENTEST)과 그의 대사물질 1-하이드록시뷰퍼랄올(1-hydroxybufuralol, GENTEST)을 주입한 후 하기와 같은 이동상의 비율로 시간에 따라 분리하였다.
0 내지 4분 ; 75% A + 25% B,
4 내지 9분 ; 75% A + 25% B에서 20% A + 80% B로,
9 내지 13분 ; 20% A + 80% B.
이때, 이동상의 유속은 일정하게 분당 0.8 ml을 유지시켰다.
도 4는 상기와 같은 이동상 조건으로 CYP2D6의 기질과 그의 대사물질을 분리한 후 자외선 분리기를 이용하여 240 nm 파장에서 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.도 4에 나타난 바와 같이, CYP2D6의 기질인 뷰퍼랄올과 그의 대사물질 1-하이드록시뷰퍼랄올이 13 분대와 5 분대에서 동시에 분리되었다.
<실험예 5> CYP2E1의 기질 및 그의 대사물질 분리
실험예 1과 동일한 컬럼이 장착된 HPLC에 CYP2E1의 기질인 p-니트로페놀(p-nitirophenol, Sigma)과 그의 대사물질 4-니트로카테콜(4-nitrocatechol,Sigma)를 주입한 후 하기와 같은 이동상의 비율로 시간에 따라 분리하였다.
0 내지 8분 ; 60% A + 40% B,
8 내지 10분 ; 60% A + 40% B에서 50% A + 50% B로,
10 내지 14분 ; 50% A + 50% B.
이 때, 이동상의 유속은 일정하게 분당 0.8 ml을 유지시켰다.
도 5는 상기와 같은 이동상 조건으로 CYP2E1의 기질과 그의 대사물질을 분리한 후 자외선 분리기를 이용하여 240 nm 파장에서 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.도 5에 나타난 바와 같이, CYP2E1의 기질인 p-니트로페놀과 그의 대사물질 4-니트로카테콜이 10 분대와 6 분대에서 동시에 분리되었다.
<실험예 6> CYP3A4의 기질 및 그의 대사물질 분리
실험예 1과 동일한 컬럼이 장착된 HPLC에 CYP3A4의 기질인 테스토스테론(testosterone, Sigma)과 그의 대사물질 7-α, 6-β, 16α 및 16-β 하이드록시테스토스테론(7-α, 6-β, 16α, 16-β hydroxytestosterone, Sigma)을 주입한 후 하기와 같은 이동상의 비율로 시간에 따라 분리하였다.
0 내지 3분 ; 50% A + 50% B,
3 내지 15분 ; 50% A + 50% B에서 0% A + 100% B로,
15 내지 29분 ; 0% A + 100% B.
이 때, 이동상의 유속은 일정하게 분당 0.8 ml을 유지시켰다.
도 6은 상기와 같은 이동상 조건으로 CYP3A4의 기질과 그의 대사물질을 분리한 후 자외선 분리기를 이용하여 242 nm 파장에서 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.도 6에 나타난 바와 같이, CYP3A4의 기질인 p-니트로페놀은 14 분대에서 분리되었고 그의 대사물질 7-α, 6-β, 16α 및 16-β 하이드록시테스토스테론 모두 5 내지 10 분대에서 동시에 분리됨을 확인하였다.
결론적으로, 본 발명의 분리방법은 각각의 6 가지 CYP 효소에 따라 이동상의 비율과 분리조건만을 바꾸어줌으로써 6 가지 CYP 효소의 각 기질과 대사물질들을 단일 칼럼에서 동시에 분리할 수 있는 매우 유용한 방법이다. 구체적으로, 역상 C18충전물질이 채워진 단일 컬럼이 장착된 HPLC를 이용하여 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 동시에 분리할 수 있는 각 효소에 적합한 이동상 체계를 개발함으로써, 본 발명의 분리방법은 종래에 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질을 분리하기 위해서 최소한 6 가지 HPLC 분석용 컬럼과 6 가지 이동상 체계를 사용해야만 하던 것을 단일 HPLC 칼럼과 이동상 체계로 간소화시켜 HPLC 분석용 컬럼과 용매의 사용이 매우 효율적인 방법이다. 따라서, 본 발명의 분리방법은 CYP 약물대사효소의 기질 및 그의 대사물질의 분리를 위한 초기 컬럼 구입 비용을절감할 수 있으며, HPLC에 사용되는 이동상의 용매 대부분을 가격이 저렴한 메탄올을 이용하여 제조함으로써 상대적으로 가격이 비싼 다른 용매의 이용보다 경제적인 비교 우위를 차지하여 HPLC 분석용 이동상 체계의 사용에서도 경제적 절감 효과를 가져올 수 있다.
본 발명은 C18충전물질로 채워진 단일 컬럼이 장착된 HLPC를 이용하여 6 가지 CYP 효소 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4 각각의 기질과 그의 대사물질 모두를 동시에 분석할 수 있는 단일 이동상 용매체계와 분리방법에 관한 것이다. 본 발명의 분리방법은 단일 컬럼이 장착된 HPLC에서 단일 이동상 체계를 이용하는 방법으로써, 종래에 6 가지 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 분리하기 위해서 최소한 6 가지 HPLC 분석용 컬럼과 6 가지 이동상 체계를 사용하던 것을 단일 칼럼과 단일 이동상 체계로 간소화시킬 뿐 아니라 가격이 저렴한 메탄올을 용매로 이용하기 때문에 경제적 절감 효과를 가져올 수 있다. 따라서, 본 발명의 분리방법은 CYP 효소의 활성도 측정을 용이하게 하여 신약개발 등의 산업적 응용 분야 또는 인체 내의 유전적 조절기능 연구 등의 학문적 분야에 있어서 경제적으로 매우 유용하고 효과적인 분리방법으로 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 단일 컬럼 및 용매체계를 이용하여 CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질 모두를 동시에 분리하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 역상(reversed-phase) C18충전물질로 채워진 단일 컬럼을 장착한 액상 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분리하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 5% 메탄올 : 2% 프로판올 : 93% 물을 포함하는 이동상 A와 80% 메탄올 : 10% 프로판올 : 10% 물을 포함하는 이동상 B로 구성되는 단일 용매체계를 이용하여 분리하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, pH 2 내지 4 범위의 이동상을 이용하여 분리하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, CYP 효소의 기질 및 그의 대사물질에 따라 이동상 A와 B의비율을 달리한 단일 용매체계를 이용하여 분리하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, CYP 효소는 CYP1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A4의 일부 또는 전체인 것을 특징으로 하여 분리하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, CYP 효소의 기질은 카페인(caffeine), 구마린(coumarine), 오메프라졸(omeprazole), 뷰퍼랄올(bufuralol), 니트로페놀(nitrophenol) 또는 테스토스테론(testosterone)인 것을 특징으로 하여 분리하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, CYP 효소의 대사물질은 파라잔틴(paraxanthine), 쎄오브로마인(theobromine), 쎄오필린(theophylline), 7-하이드록시구마린(7-hydroxycoumarin), 하이드록시오메프라졸(hydroxyomeprazole), 1-하이드록시뷰퍼랄올(1-hydroxybufuralol), 4-니트로카테콜(4-nitrocatechol) 또는 7-α, 6-β, 16α, 16-β 하이드록시테스토스테론(7-α, 6-β, 16α, 16-β hydroxytestosterone)인 것을 특징으로 하여 분리하는 방법.
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