KR20010087254A

KR20010087254A - 간섬유화 및 간경화 치료 및 예방용 의약 조성물

Info

Publication number: KR20010087254A
Application number: KR1020010010685A
Authority: KR
Inventors: 김상건; 강건욱
Original assignee: 김상건
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2001-09-15
Also published as: KR100377789B1

Abstract

본 발명은 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온[5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione{일명, 올티프라즈(Oltipraz)}와 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌 디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)를 주성분으로 함유하는 간섬유화 및 간경화 진행의 치료 및 예방용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서 올티프라즈와 DDB의 배합비는 중량비로 바람직하게는 25 : 0-25, 더욱 바람직하게는 5 : 0.1-5, 특히 바람직하게는 5 : 1이다.

본 발명에 따른 최적 용량의 올티프라즈/DDB 제제는 간섬유화 및 간경화 진행의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 나타내고 인체에 대한 독성도 낮은 안전한 약제이다.

Description

간섬유화 및 간경화 치료 및 예방용 의약 조성물{Pharmaceutical composition for treatment and prevention of liver fibrosis and cirrhosis}

본 발명은 간섬유화 및 간경화의 치료 및 예방용 의약 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온[5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione{일명, 올티프라즈}와 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌 디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)를 주성분으로 함유하는 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

간은 지속적으로 효소 반응 및 에너지 대사가 일어나는 생체 기관으로서 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질의 대사 과정에서 중추적인 역할을 담당한다. 현재 간염, 간경화 및 간암은 대한민국에서의 만성 질병들 중 순환기계 질환과 함께 가장 많이 나타나는 질병이고, 질병으로 인한 사망 원인으로서도 큰 비중을 차지하고 있다. 특히 대한민국에서는 선진국에 비하여 음주 인구가 상대적으로 많고 폭음에 의한 간 손상 발생 원인이 높은 만큼 이에 대한 관심도 지대하다. 바이러스 감염이나 음주에 의한 지속적인 간 조직의 손상은 간경화나 간암으로 발전될 수 있다. 간 조직의 생리적 특성 및 중요성을 고려할 때 간 질환의 치료 및 예방은 대단히 중요하다. 따라서 간 조직의 손상을 줄이고 궁극적으로 치료에 응용할 수있는 치료 및 예방용 의약 조성물의 개발이 요구된다.

여러 합성 화합물 및 생약제를 비롯한 여러 물질들이 시험관내 또는 생체 내에서 간 보호 작용을 나타낸다. 실리마린이나 비테인이 여기에 속하는데 그 작용 기전에는 시토킨의 억제나 글루타치온의 증가 등 여러 작용점이 관여한다고 알려져 있으나 효력이 낮다는 단점으로 인하여 요구되는 정도의 치료 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있다. 그러나 현실적으로 간 질환에 대한 적절한 치료제가 없으므로 상기의 약물들이 실제 임상에서 사용되고 있다. 간섬유화를 적응증으로 하는 말로틸레이트(malotilate) 유도체의 경우, 간내 제2상 포합효소의 유도능 및 시토크롬 P450 효소를 억제함으로써 간 독성을 방어한다. 그러나 말로틸레이트 유도체는 시토크롬 효소계를 무차별적으로 억제한다는 점과 예방 효과 밖에는 기대할 수 없다는 단점을 지닌다.

십자화과에 속하는 채소류에 천연적으로 존재하는 황함유 화합물인 디티올디티온(dithiolthione)의 몇몇 치환체들은 간 보호 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 이들 중 올티프라즈는 1980년대 초에 주혈흡충(schistosomiasis) 치료제로 사용된 것으로서 다음의 구조식을 갖는다.

이 약물은 생체의 여러 조직에서 세포내 티올(thiol) 함량을 증가시키고 글루타치온 풀{glutathione(GSH) pool}의 유지에 관련된 효소 외에 친전자성 물질의 해독화 과정에 관여하는 효소의 발현을 유도 증가시킨다. 올티프라즈에 의하여 그 활성이 증가되는 효소로는 NAD(P)H 퀴논 리덕타제(quinone reductase), 마이크로소말 에폭사이드 하이드롤라제(microsomal epoxide hydrolase), 글루타치온 S-트랜스퍼라제{glutathione S-transferase (GST)} 및 UDP-GT 등을 들 수 있으며, 이중 GST는 사염화탄소나 아세트아미노펜(acetaminophen)과 같은 독성물질에 의한 간독성을 방어한다[Ansher SS, Dolan P and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity. 1983 Hepatology 3, 932-935].

또한, 올티프라즈는 벤조[a]피렌, NDEA 및 우라실 머스타드(uracil mustad)에 의한 발암 과정을 억제하고 아플라톡신 B1(aflatoxin B1)에 의한 간암 발생, 아족시메탄(azoxymethane)에 의한 대장암 발생도 억제하는 것으로 알려져 있다[Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993, Cancer Res. 53, 3499-3504].

올티프라즈의 발암 억제 기전으로 다음과 같은 몇 가지를 들 수 있다. 첫째 중요한 체내 항산화물질인 환원형 GSH의 조직내 수준을 증가시킨다. 둘째, phase I 효소(예, cytochrome P450)를 억제하여 발암물질의 활성화를 억제한다. 셋째, phase II 대사효소(예, GST, UDP-GT)를 유도하여 발암물질의 해독화 과정을 촉진시킨다. 넷째, 시험관내에서 인간의 면역 억제 바이러스 type I의 복제를 억제한다.다섯째, 세포내 티올을 증가시켜 반응성 중간체를 제거하고 DNA 수복 과정을 증대시킨다. 이미 올티프라즈는 생체 대부분의 조직에서 GSH 수준을 증가시켜 방사선이나 제노바이오틱스(xenobiotics)에 의하여 생성되는 유리 라디칼을 제거하거나 방사선 손상에 대한 생체 적응 반응으로써 세포의 항상성 유지에 기여하여 방사선 보호 효과를 나타내는 것으로도 보고된 바 있다.

구체적으로 설명하면, 암은 체세포 유전자에 변화와 이상이 발생하고 이로 인하여 비정상적으로 세포 증식이 발생하는 현상이다[Cancer Biology, 3rd ed. Raymond W. Ruddon, pp. 61-95, 497-507, Oxford Press]. 화합물에 의한 암 예방 효과는 항돌연변이성/암세포로의 변환 또는 암세포의 증식 억제 효과에 의존한다. 올티프라즈는 암 예방제로 연구되어 왔다[Ansher et al., 1983; Bolton et al., 1993]. 올티프라즈의 암 예방 기전은 시토크롬 P450 3A의 억제뿐만 아니라 제2상 해독화 효소의 유도와 관련되는 것으로 인정된다. 세포와 동물에서 올티프라즈를 처치할 때 글루타치온 S-트랜스페라제(GST)의 발현이 증가[Clapper et al., 1994; Davidson et al., 1990]하는 현상은 독성물질에 의한 조직 손상의 억제 및 발암억제와 관련된다[Kensler et al., 1987; Maxuitenko et al., 1998]. 올티프라즈는 방사선에 의한 조직 손상에 길항하여 간 조직의 보호 효과를 나타내고[Kim et al., 1997], GST 유도는 세포 적응 반응을 의미한다는 것이 선행 연구에 의해 알려져 있다. 올티프라즈는 독성물질로부터 간 조직을 보호하기도 한다[Ansher et al., 1983]. 아플라톡신(Aflatoxin) B1에 의해 유도되는 발암성을 올티프라즈가 억제하는 현상은 시토크롬 P450 3A에 의한 발암물질의 대사 활성화를 억제하는 데 기인한다. 최근 임상 연구에 따르면 올티프라즈는 간암 발병의 위험성이 있는 사람들의 혈장에서 아플라톡신 B1의 수치를 낮추는데 효과적임이 밝혀졌다. 아플라톡신 B1에 의해 유도되는 동물에서의 발암성도 또한 올티프라즈에 의해 감소되었다.

올티프라즈는 HBV DNA를 포함하는 플라스미드로 감염시킨 2.2.15 세포에서 HBV의 복제를 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서 이 약제는 B형 간염 바이러스의 유전자 전사를 억제하고 p53 단백질의 발현을 증가시킨다[Chi et al., 1998]. 올티프라즈는 또한 인간면역억제 바이러스 (HIV)의 복제를 억제한다[Prochaska et al., 1995].

이상의 작용기전을 가지는 올티프라즈는 실제 중국인을 대상으로 수행된 간암 발생 억제에 대한 대규모 임상 시험에서 약한 보호 효과가 나타났으며, 독성물질에 의한 간 독성을 중등도 이상 억제하는 효과를 갖는 것으로 잘 알려져 있다.

또한, 올티프라즈는 쥐 및 개에 대한 독성 시험에서 그 안전성이 입증된 바 있다 (Fund. Appl. Toxicol. 1997; 35(1):9-21).

한편, DDB(디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌 디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트)는 현재 대한민국을 포함한 동아시아에서 임상적으로 쓰이는 간염치료 약물로서 쉬잔드래(shizandrae) 과육에서 나온 성분이다. DDB는 사염화탄소, 갈락토사민, 티오아세트아미드 및 프레드니솔론에 의한 조직손상을 보호하며 항체생성을 증강시킨다. 또한 실제 간염 환자에게 치료 효과를 보이며 임상적으로 많이 사용되는 약물이다. 본 발명자들은 이 약물의 작용 기전이 NF-kB의 활성화 억제 및 독성 시토킨인 TNF-α의 생성 억제라고 보고한 바 있다. 또한 이 약물은 대사 효소계에는 영향이 없는 것으로 밝혀졌다. NF-kB는 염증반응을 매개하는 전사인자로 알려져 있고, 현재 NF-kB의 억제제는 전신염증반응 억제제로서의 가능성을 갖는다.

간섬유화는 간염 등 만성 간질환에 수반되는 생체 적응 반응의 일부로서 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되는 것이 아니라 콜라겐과 같은 섬유조직으로 변형되는 상태를 칭한다. 간섬유화는 조직 손상의 복구 과정에서 발생하는 생체 적응 반응이지만 물질 대사 및 담즙 분비 등의 고유 기능을 전혀 수행할 수 없는 섬유조직으로 간조직을 대체시키므로 필연적으로 간 기능의 저하가 나타난다. 간섬유화 현상이 지속적으로 반복될 때에는 간경화로 발전되어 사망에까지 이르게 한다는 점에서 적절한 치료제의 개발은 신약 개발의 중요한 과제가 된다. 그러나 현재까지는 간섬유화의 기전 자체가 명확하게 밝혀져 있지 않으므로 적당한 치료약물이 개발되지 않은 실정이다.

최근 간 조직 내의 대식쿠퍼(Kupffer)세포와 이토세포에서 유리되는 시토킨인 전환 성장 인자-베타[transforming growth factor-beta (TGF-β)]가 간섬유화의 중요 매개물로 밝혀졌다. 또한, TGF-β의 항체, 안티센스 RNA, 세포 TGF-β수용체 변형을 통하여 TGF-β의 작용을 차단하였을 때에는 간섬유화 과정이 현저하게 억제되는 것으로 보고된 바도 있다. 그러나 이러한 연구는 실험적 차원에서 수행된 것일 뿐이며 현재까지 실제로 임상적으로 활용되는 약물은 없는 실정이다.

본 발명은 간섬유화 및 간경화를 치료하는 효과를 극대화시키고, 또한 예방에도 사용할 수 있는 신규의 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 랫트에 DMN을 투여하였을 때 간 조직 중 TGF-β1 mRNA 발현에 대한 올티프라즈의 억제 효과를 나타내는 사진이다.

도 2a는 정상 동물의 간 조직 사진이다(H & E 염색).

도 2b는 정상 동물의 간 조직 사진이다(H & E 염색).

도 3a는 DMN 투여군의 간 조직 사진이다(H & E 염색).

도 3b는 DMN 투여군의 간 조직 사진이다(Masson's Trichrome 염색).

도 4a는 DMN과 올티프라즈(25mg/kg)/DDB(5mg/kg) 동시 투여군의 간 조직 사진이다(H & E 염색).

도 4b는 DMN과 올티프라즈(25mg/kg)/DDB(5mg/kg) 동시 투여군의 간 조직 사진이다(Masson's Trichrome 염색).

도 5a는 DMN과 올티프라즈(15mg/kg)/DDB(15mg/kg) 동시 투여군의 간 조직 사진이다(H & E 염색).

도 5b는 DMN과 올티프라즈(15mg/kg)/DDB(15mg/kg) 동시 투여군의 간 조직 사진이다(Masson's Trichrome 염색).

도 6a는 DMN과 올티프라즈(5mg/kg)/DDB(25mg/kg) 동시 투여군의 간 조직 사진이다(H & E 염색).

도 6b는 DMN과 올티프라즈(5mg/kg)/DDB(25mg/kg) 동시 투여군의 간 조직 사진이다(Masson's Trichrome 염색).

본 발명자들은 간섬유화의 치료 효능이 있는 의약을 개발하기 위해 연구에 연구를 거듭한 끝에 상기 올티프라즈가 간섬유화 및 간경화의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 갖는다는 사실을 최초로 규명하고, 나아가 올티플라즈를 DDB와 병용하면 간섬유화 및 간경화의 치료 및 예방 효과가 현저히 상승된다는 사실을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

간섬유화는 여러 원인으로 인하여 간 조직에 만성적으로 심각한 손상이 있을 때 발생하는 간경화의 전단계이다. 간경화증은 부분적으로는 발암성과 관련되어 있기도 하여 간경화증 환자는 간암의 위험이 높다. 그럼에도 불구하고, 간경화의 병리적인 기전은 간암과는 뚜렷하게 구별된다. 즉, 간섬유화는 만성적으로 간 조직에 심각한 손상이 있을 때 발생하는데 그 원인으로는 바이러스, 기생충, 음주, 화학물질과 약물이 포함된다. 간섬유화는 쿠퍼세포와 성상세포 등 간 조직 중 비실질세포의 활성화로 인한 세포외 기질(예, 제 I형, 제 III형 및 제 IV형 콜라겐)의 과잉생산으로 발생된다. 특히, 섬유화에서는 간 조직 중 성상세포의 활성화가 일어나 근섬유모세포로 세포의 전이가 발생하고, 이러한 활성화된 세포는 세포외 기질을 다량으로 생산하게 된다. 따라서, 간섬유화 및 간경변증은 바이러스성 간염 또는 간암과는 구별되는 병리현상이며, 이를 예방하거나 치료하는 방법도 구별된다. 그러나, 현재 임상적으로 유용한 간경화 치료제는 없는 실정이다.

본 발명은 간암 예방에 효과가 있는 것으로 알려진 올티프라즈가 간암 발병과는 병리기전이 전혀 상이한 간섬유화 및 간경화에 대해서도 치료 및 예방 효과를 가질 뿐만 아니라, 간염에 효과가 있는 것으로 알려진 DDB를 이 올티플라즈와 병용하면 간섬유화 및 간경화에 대해 예상치 못할 정도로 우수한 치료 및 예방 효과를 나타낸다는 사실을 최초로 밝혀낸 것에 기초한 것으로, 이와 같은 사실은 이하에서 설명되는 실험에서 구체적으로 입증되었다.

올티프라즈 또는 올티프라즈/DDB는 디메틸니트로사민(dimethylnitrosamine, DMN)에 의해 증가된 간섬유화 지표인 섬유화 수(fibrosis score)와 노델 수치(Knodell score)를 감소시키고, 이는 대표 조직검경 사진의 결과와도 일치한다. 또한 올티프라즈 또는 올티프라즈/DDB의 투여는 간독성 지표인 ALT, AST, 빌리루빈(bilirubin) 및 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-GT) 수치를 유의적으로 억제한다. 이는 올티프라즈 또는 올티프라즈/DDB가 간섬유화를 개선 혹은 지연시키는 작용을 증명한다. 올티프라즈 또는 올티프라즈/DDB의 간섬유화 억제 기전은 TGF-β발현의 차단으로 나타나는 바, RT-PCR 정량 분석 결과에 따르면 이들은 TGF-βmRNA 발현의 증가를 완전히 억제한다. 이 결과는 이들이 간섬유화 발생 또는 진행을 억제할 수 있는 약물임을 보여준다. 올티프라즈가 간 내 해독화 효소인 GST와 mEH의 유도효과, GSH 증가 작용 및 라디칼 포합 작용을 갖지만 DDB는 해독화 효소 유도능이 없다는 점에서 두 약물은 상호 보완적인 약리 효능을 갖는 것으로 여겨진다. 더우기, CYP3A의 활성이 DDB에 의하여 억제되는 작용은 올티플라즈의 대사를 저해할 것이므로 저용량의 올티프라즈만으로도 강력한 간 보호 작용과 약효 지속 시간을 증가시킬 것으로 믿어진다.

본 발명자들은 DMN을 투여한 랫트 간섬유화 모델에서 올티플라즈/DDB를 여러 배합비로 투여한 후 효능을 실험하였다. 중량비로 올티프라즈와 DDB를 25 : 5 mg/kg, 15 : 15 mg/kg 및 5 : 25 mg/kg을 투여한 후 효과를 관찰하였다. 그 결과 DMN을 투여(3주 투여 후 1주 경과하여 4주째 관찰)한 경우에는 간 독성 지표인 ALT, AST, 빌리루빈, 감마-글루타밀 트랜스펩티다제, 간섬유화 수 및 노델 수치가 대조군에 비하여 현저히 증가되었으나, 올티프라즈/DDB 복합제를 투여한 경우에는 이들 수치가 감소되었다. 간섬유화의 억제 효능은 올티프라즈 25 : DDB 5 mg/kg 군에서 가장 크게 나타났다. 이는 약리작용기전이 서로 다른 두 약물이 상승적으로 간 손상 및 간섬유화를 억제하는 것을 증명하며 5 : 1 복합제가 최적의 배합비임을 시사한다. 또한 올티프라즈/DDB 복합체가 올티프라즈 50 mg/kg 투여군에 비하여 혈액 생화학적 지표, 간섬유화 수 및 노델 수치를 억제하는 효능도 우수한 것으로 나타났는 바, 올티프라즈와 DDB를 병용하였을 때 올티프라즈를 고용량으로 인체에 적용할 때 나타날 수 있는 위장관 장애 및 사지 말단의 감각 이상 등의 부작용을 감소시킬 수 있을 것으로 여겨진다. DDB는 DMN이 유발한 염증 반응의 파급을 억제하고 올티프라즈는 TGF-β발현의 차단, 증가된 항산화효소의 유도발현 및 GSH의 증가를 유도함으로써 간섬유화 치료 및 예방 효과를 극대화한다. 따라서 본 발명에 따른 올티프라즈/DDB 조성물은 간 보호 효능을 증가시키는 우수한 상호 보완적 효과를 제공할 뿐만 아니라 궁극적으로는 부작용이 작아 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 실제로 사용할 때에는 각각의 약물을 단독으로 제형화한 약물을 병용하거나 또는 각각의 약물을 혼합하여 복합제제형태로 제형화하는 것이 바람직하다. 실제적으로는 약제학적인 분야에서 통상적인 방법에 따라 경구투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여한다. 이러한 목적에 적합한 경구투여용 제형에는 경질 및 연질캅셀제, 정제, 산제, 현탁제, 시럽제, 주사제등이 포함된다. 이러한 경구투여용 제제에는 두가지 약물학적 활성 성분이외에 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다. 본 발명에서는 또한 용해를 위한 용해보조제등을 첨가할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 간 손상 정도, 간염 발병시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 언급된 중량비로 조합된 조성물 5 내지 200mg, 바람직하게는 25 내지 50 mg을 1일 1내지 2회 분할하여 투여한다. 그러나 간 손상의 정도가 심한 환자나 간암 절제 후 재발방지용으로는 본 발명의 조성물을 상기 범위를 벗어나는 대용량까지 증량하여 투여할 수 있다. 가장 바람직하게는 올티프라즈 25 mg 및 DDB 5 mg을 함유하는 단위 투여체 1-2개를 1일 2회 경구투여한다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 올티프라즈의 우수한 간섬유화억제 및 간조직보호효과와 DDB의 우수한 염증 진행 억제효과가 최적 상태로 조화를 이루어, 간섬유화 및 간경화의 진행 억제 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 치료목적 뿐만 아니라 예방목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 하기 실험예 및 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실 험 예

실험예 1 : 올티프라즈의 항섬유화 작용 (1)

랫트에 디메틸니트로사민(DMN)을 일주일에 3회씩 4주간 연속 투여시 혈장내 알라닌 아미노트랜스페라제(alanine aminotransferase) 및 아스파테이트 아미노트랜스페라제(aspartate aminotransferase) 활성이 4배 증가하였다. 올티프라즈를 50mg/kg 용량으로 전처치시 혈장내 ALT 및 AST 활성증가가 50% 억제되었다(표 1).

혈장내 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-GT) 활성과 빌리루빈 함량은 간기능의 대표적인 지표로 사용된다. 올티프라즈는 DMN을 투여한 랫트에서 증가되는 γ-GT 활성을 70%-80% 억제하였다. 반면 DMN 투여시 빌리루빈 함량이 대조군에 비하여 8배 증가하였으며 올티프라즈를 50 mg/kg 용량으로 DMN과 동시투여할 때 혈장내 빌리루빈 증가는 65% 억제되었다.

ALT, AST, γ-GT, 빌리루빈 수치

군	ALT	AST	γ-GT	빌리루빈
대조군	49 ± 2	113 ± 6	0.2 ± 0.1	0.2 ± 0.01
DMN	190 ± 12*	412 ± 39*	12.1 ± 4.1*	0.9 ± 0.2*
DMN + 올티프라즈50 mg/kg	116 ± 4^#	246 ± 32^#	2.6 ± 0.5^#	0.3 ± 0.03^#

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고 사용 동물수는 8 내지 16이었다. 각 군간 유의성은 뉴먼쿨법에 의한 다중분석으로 표시하였다. 유의성 표시는 대조군에 비하여 * p<0.05,DMN 처치군에 비하여^#p<0.05로 표시하였다.

실험예 2 : 올티프라즈의 항섬유화 작용 (2)

DMN에 의하여 유도된 간섬유화에 미치는 올티프라즈의 효과를 동물 실험 모델에서 조직병리학적으로 관찰하였다. 랫트에 DMN을 일주일에 3회씩 4주간 투여한 동물군에서 간의 현저한 섬유화가 관찰되었고, 올티프라즈(5-50 mg/kg, 일주일에 3회씩 4주간, 경구투여)를 DMN과 동시투여할 때 간 조직의 섬유화가 DMN 단독에 비하여 감소하였다. 간 조직 섬유화의 조직병리학적 지표는 반 기슨(Van Gieson) 염색과 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법에 따라 간 조직의 괴사와 섬유화 정도를 병리학적으로 평가하였다(표 2).

올티프라즈를 50 mg/kg의 용량으로 투여할 때 DMN에 의하여 유도된 섬유화가 효과적으로 개선되었다(표 2). 섬유화의 정도는 간 손상정도 및 섬유화정도를 나타내는 노델 수치로 평가하였다. DMN + 올티프라즈 투여군은 DMN 단독 투여군에비하여 노델 수치를 저하시켜 간 손상 및 섬유화를 개선하였다.

올티프라즈에 의한 간 조직의 섬유화 억제 효과

군	섬유화 수치	노델 수치
대조군	0	0
DMN	3.7±0.5	16.1±2.9
DMN + 올티프라즈 5 mg/kg	3.1±0.4*	11.1±1.7*
DMN + 올티프라즈 15 mg/kg	2.9±0.8*	12.1±1.9*
DMN + 올티프라즈 50 mg/kg	2.5±0.9**	8.0±1.6**

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고 사용 동물수는 8 내지 16이었다. 각 군간 유의성은 뉴먼쿨법에 의한 다중분석으로 표시하였다. * p<0.05, ** p<0.01. 섬유화정도는 0=정상, 1=약한 섬유조직 발견, 2=경등도 섬유조직 발견, 3=뚜렷한 섬유조직 발견, 4=심한 섬유화 진행으로 표시하였다. 간 조직 말단의 가교상 형성 (최고=10), 엽내 세포 소실 (최고=4), 간내 염증 (최고=4), 섬유화 (최고=4)의 합산 점수로 노델 수치를 표시하였다.

실험예 3 : 올티프라즈의 항섬유화 약리 작용 기전

TGF-β1은 조직 손상에 의한 섬유화에서 발현이 증가되는 대표적인 시토킨이다. DMN 단독 또는 DMN과 올티프라즈를 동시에 투여한 동물에서 TGF-β1 mRNA 발현을 RT-PCR 분석법으로 관찰하였다. DMN을 4주간 투여한 동물군에서는 불가역적인 과도한 섬유화로 인하여 TGF-β1 mRNA의 발현을 관찰할 수 없었으므로, DMN을 단회 투여후 증가되는 TGF-β1 mRNA 발현을 관찰하였다. DMN을 투여한 18 시간 후에 올티프라즈를 투여하였으며 TGF-β1 mRNA 발현은 올티프라즈를 투여한 24 시간 후에 관찰하였다. 랫트에 DMN을 투여하였을 때 간 조직 중 TGF-β1 mRNA가 현저히 증가하였다. 올티프라즈를 100 mg/kg의 용량으로 투여하였을 때 DMN에 의하여 유도되는 TGF-β1 mRNA 발현이 완전히 억제되었다. GAPDH mRNA 발현은 DMN 단독 또는 올티프라즈와의 동시투여에 의하여 변하지 않았다. 따라서 올티프라즈는 TGF-β1의 발현을 감소하는 약리 기전에 의하여 간섬유화를 억제하는 것으로 나타났다(도 1).

실험예 4 : 올티프라즈의 TGF-β생성 억제의 작용점 평가

대식세포에서 과다하게 발현되는 TGF-β생성을 올티프라즈가 직접적으로 억제하는지의 여부를 관찰하고, TGF-β생성 억제와 관련된 분자적인 약리 기전을 평가하기 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포를 사용하여 실험을 수행하였다. TGF-β 발현이 증가된 RAW264.7 세포에 올티프라즈를 직접적으로 첨가하였을 때 약물농도 의존적으로 TGF-β의 발현이 억제됨을 발견하였다. 이러한 결과는 올티프라즈가 간 조직 내의 대식세포인 쿠퍼(Kupffer)세포에서 TGF-β의 생성을 억제함으로써 항섬유화 작용을 나타낼 가능성을 제시한다. 나아가 TGF-β의 발현 증가는 EGTA와 타이로신 키나제 억제제인 제니스타인(genistein)에 의하여 억제되었다. 이러한 결과는 올티프라즈에 의한 TGF-β생성이 세포내 칼슘양의 조절 또는 프로테인 키나제의 활성 변화를 통한 효과일 가능성을 제시한다(표3).

대식세포주에서 올티프라즈에 의한 TGF-β발현 억제

	대조군	올티프라즈30 μM	올티프라즈100 μM	EGTA1 mM	제니스타인100 μM
TGF-β발현억제율 (%)	0	30	60	80	80

실험예 5 : DDB의 항염증 작용의 기전(NF-κB 활성 억제)

NF-κB 활성은 염증반응과 관련이 있다는 사실이 알려져 있다. 본 발명에 따른 의약 조성물에 포함되는 DDB를 투여한 경우와 투여하지 않은 경우 간조직에서의 NF-kB 활성도를 비교 검정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 실험동물로는 체중 150 g 전후의 SD 웅성 랫트를 각군당 7마리씩으로 나누어 사용하였다. 약제 비처리 대조군(비히클(vehicle) 투여), DDB 투여군(20-100 mg/kg/day)으로 분류하여 내독소(lipopolysacchraide, LPS) 처치시의 NF-κB 활성 정도를 전기영동 모빌 쉬프트 검정(EMSA)법으로 분석하였다.

LPS를 1μg/kg의 용량으로 처치하였을 때 NF-κB 핵 전사 p50과 p65 복합체가 증가하였으나 LPS를 처치하기 2 시간 전에 DDB를 20 - 100 mg/kg의 용량으로 투여하였을 때는 NF-κB 복합체의 핵내로의 이동과 활성이 완전히 차단되었다. 이러한 결과들은 DDB가 간조직에서 LPS에 의한 NF-κB 활성을 억제할 수 있음을 시사한다.

LPS를 1 μg/kg의 용량으로 단핵계 세포주인 Raw 264.7 세포를 자극하였을 때 30분 - 1시간후 NF-κB의 DNA 결합 활성이 증가하였다. DDB는 0.1, 0.3, 1 mM의 농도에서 농도의존적으로 NF-κB 활성을 억제하였다. 이 결과들은 동물 실험 결과와 일치하였다(표 4).

NF-κB 활성에 미치는 DDB의 효과

	LPS 1(㎍/㎏ 또는 ㎍/㎖)	LPS +DDB 20㎎/㎏	LPS +DDB 50㎎/㎏	LPS +DDB 100㎎/㎏	LPS +DDB 0.1mM	LPS +DDB 0.3mM	LPS +DDB 1.0mM
NF-κB 활성 억제율 (%)	0	42	63	73	33	35	65

I-κBα 분해의 억제

I-κBα서브유닛의 분해와 인산화에 의해서 NF-κB가 핵내로 이동하게 된다. NF-κB 활성화에 대한 DDB의 영향이 I-κBα 분해와 관련이 있는지를 알아보기 위해 연구를 진행하였다. I-κBα 단백질양은 LPS를 1 μg/kg의 용량으로 랫트에 처치시 30분에 소실됨을 확인하였다. DDB를 LPS 처치하기 2시간전에 처리하였을 때 LPS에 의한 I-κBα의 감소를 억제하였다. DDB는 Raw 264.7 세포에서도 0.3 - 1 mM의 농도에서 농도의존적으로 I-κBα 단백질의 분해를 억제하였다. 이상의 결과는 DDB가 I-κBα 분해를 억제함으로써 NF-κB 활성화를 억제함을 보여준다(표 5).

I-κBα분해에 미치는 DDB의 효과

	LPS 1(㎍/㎏ 또는 ㎍/㎖)	LPS +DDB 100㎎/㎏	LPS +DDB 0.1mM	LPS +DDB 0.3mM	LPS +DDB 1.0mM
I-κBa 분해 억제율 (%)	0	67	22	34	65

실험예 6 : DDB의 항염증 작용의 기전(TNF-α 유리 및 mRNA 발현의 억제)

TNF-α는 LPS에 대한 반응의 주요매개물질이고 염증과정에 관여된다. LPS에 의한 NF-κB의 활성이 DDB에 의해 억제될 때 혈장에 유리되는 TNF-α 양이 감소되는지를 ELISA법으로 관찰하였다. LPS (1 μg/kg, i.v.) 단독투여시는 투여 2시간후에 TNF-α 수준이 35 pg/ml에서 5160 pg/ml으로 증가된 반면, DDB를 20, 50, 100 mg/kg의 용량으로 투여하였을 때에는 LPS에 의한 플라즈마 TNF-α증가는 1350, 1230, 690 pg/kg로 억제되었다. 또한 Raw 264.7 세포에서 TNF-α의 생성을 관찰하였을 때, LPS에 의한 TNF-α의 생성을 DDB가 억제하였다. 따라서, DDB는 간에서 뿐만 아니라, 대식세포에서도 TNF-α 발현을 억제하였다(표 6).

혈장중 TNF-α 유리에 미치는 DDB의 효과

	LPS 1(㎍/㎏ 또는 ㎍/㎖)	LPS + DDB20 ㎎/㎏	LPS + DDB50 ㎎/㎏	LPS + DDB100 ㎎/㎏	LPS + DDB1.0 ㎎/㎏
NF-κB 활성 억제율 (%)	0	74	76	87	65

실험예 7 : 올티프라즈/DDB 복합제의 항섬유화 작용 (1)

올티프라즈/DDB 복합제의 배합비율 변화에 따른 항섬유화 효능을 평가하였다. 배합비율에 따른 약물의 효능을 효율적으로 평가하기 위하여 간섬유화 유발물질인 DMN의 투여 계획을 부분적으로 변형하였다. 즉, 실험예 1 및 2에서는 DMN을 1회 랫트 체중 kg당 10μl의 DMN을 1주일에 3회 4주간 총 12회 투여하였으나, 본 실험예에서는 각 배합비율 변화에 따른 약물의 효능을 감별 측정하기 위하여 1회랫트체중 kg 당 10μl의 DMN을 1주일에 3회 3주간 총 9회 투여하고 마지막 1주일은 DMN을 투여하지 않아 섬유화에 의한 간 손상 정도를 경감시킨 동물모델을 활용하였다. 실제로 DMN을 3주간 투여하고 1주일이 경과한 동물에서는 섬유화 수는 2.9 와 노델 수치는 11.7 로 나타나 DMN을 4주간 투여한 동물에서 관찰된 수치인 3.7 (섬유화 수)과 16.1 (노델 수치)에 비하여 간섬유화의 정도가 감소하는 것으로 나타났다. DMN을 1주일에 3회 3주간 연속투여하고 1주일이 경과한 동물의 혈장내 알라닌 아미노트렌스퍼라제 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 활성은 대조동물군에 비하여 약 4배 증가하였다. 올티프라즈와 DDB를 용량비로 25 : 5, 15 : 15 및 5 : 25 mg/kg 씩 매 DMN 투여 1일 후에 (1주에 3회) 3주간 투여한 동물의 경우에는 DMN만을 투여한 동물에 비하여 혈장내 ALT 및 AST 활성증가가 현저히 억제되었다. 배합비의 변화에 따른 효능을 비교하면 15 : 15 mg/kg 용량비율을 투여한 동물군에서도 유의성있는 억제가 나타났으나 그 억제정도는 25 : 5 mg/kg 용량비율을 투여한 동물군에 비하여 약하였다(표 7).

혈장내 γ-GT 활성과 빌리루빈 함량은 간기능의 대표적인 지표로 사용된다. 올티프라즈와 DDB를 용량비로 25 : 5, 15 : 15 및 5 : 25 mg/kg 씩 3 주간 투여한 랫트에서는 DMN 투여에 의하여 증가된 빌리루빈 함량이 통계적으로 유의성 있게 억제되었다. ALT, AST 수치의 결과와 마찬가지로 올티프라즈와 DDB 배합제를 투여한 동물군 중에서 25 : 5 mg/kg 용량비율을 투여한 동물군에서 빌리루빈의 증가가 가장 잘 억제되는 것으로 나타났다. 혈장 중 총단백질의 양과 알부민은 간조직 중의 단백질 합성능력의 지표가 된다. 간 경화가 발생할 때에는 일반적으로 혈장 중 총단백질의 양은 감소한다. DMN을 3주간 투여한 후 1 주일이 경과한 동물의 경우에는 총단백질의 함량이 유의성있게 감소하였으나, 올티프라즈와 DDB를 25 : 5 mg/kg 의 비율로 DMN과 함께 투여한 동물군과 15 : 15 mg/kg 의 비율로 투여한 동물군에서는 총단백질의 함량이 정상대조군의 수준으로 회복되었다(표 7).

이상의 결과는 본 실험예에서 사용한 올티프라즈와 DDB 배합비율 중에서 25 : 5 mg/kg 용량비율을 투여한 동물군에서 DMN에 의하여 유발되는 간섬유화의 억제효능이 가장 우수함을 시사한다. 또한 이러한 25 : 5 mg/kg 배합제를 투여한 동물군에서의 효과는 실험예 1 의 올티프라즈 50 mg/kg을 단독으로 투여한 동물에서 관찰한 약물의 효능과 유사하거나 그 이상임을 알 수 있다. 실제로 ALT 수치의 경우 올티프라즈를 50 mg/kg 단독으로 투여한 동물군에서 DMN에 의한 ALT 상승이 40% 억제되는데 비하여 25 : 5 mg/kg 배합제를 투여하였을 때 간섬유화 억제율은 43%로 나타났다. 다른 지표의 경우도 이와 유사하였다.

ALT, AST, 빌리루빈, 알부민 및 단백질 총량 수치

군	ALT	AST	단백질 총량	알부민	빌리루빈
대조군	44 ±3	114 ±6	6.2 ±0.1	5.1 ±0.1	0.25 ±0.02
DMN	169 ±7*	222 ±14*	5.0 ±0.2*	4.0 ±0.2*	1.1 ±0.3*
DMN + 올티프라즈 25 / DDB 5 ㎎/㎏	98 ±9#	156 ±8#	5.9 ±0.2#	4.8 ±0.1#	0.3 ±0.04#
DMN + 올티프라즈 15 / DDB 15 ㎎/㎏	108 ±10#	194 ±19	5.7 ±0.2#	4.7 ±0.1#	0.4 ± 0.08#
DMN + 올티프라즈 5 / DDB 25 ㎎/㎏	127 ±8#	206 ±14	5.3 ±0.1#	4.3 ±0.1	0.4 ±0.09#

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고 사용동물수는 8-10 이었다. 각 군간 유의성은 뉴먼쿨법에 의한 다중분석으로 표시하였다. 유의성 표시는 대조군에 비하여 * p<0.05, DMN 처치군에 비하여 # p<0.05로 표시하였다.

실험예 8 : 올티프라즈/DDB의 항섬유화 작용 (2)

올티프라즈/DDB 여러 배합 약물이 DMN에 의하여 유도되는 간섬유화를 억제하는지 조직병리학적으로 관찰하였다. 정상 동물에서는 간섬유화가 관찰되지 않았다(도 2a, 도 2b). 랫트에 DMN을 일주일에 3회씩 3주간 투여하고 1 주일이 경과한 동물에서는 간조직의 현저한 섬유화가 관찰되었다(도 3a, 도 3b). 올티프라즈와 DDB를 용량비로 25 : 5 및 15 : 15 mg/kg의 배합비율로 DMN 투여 1일 후에 1주일에 3일 3주 동안 투여했을 때 간조직의 섬유화가 DMN 만을 투여한 동물군에 비하여 현저히 감소하였다. 특히 올티프라즈와 DDB를 25 : 5 mg/kg(도 4a, 도 4b) 배합 비율로투여한 동물에서는 그 효능이 15 : 15 mg/kg(도 5a, 도 5b) 또는 5 : 25 mg/kg(도 6a, 도 6b) 배합 비율을 투여한 동물군보다 우수하였으며 섬유화의 진행을 강력히 억제하는 것으로 나타났다. 간섬유화의 조직병리학적 지표는 간조직의 괴사와 섬유화 정도를 메이슨 트리크롬 염색법으로 평가하였다. 섬유화의 정도는 간 손상정도 및 섬유화정도를 나타내는 섬유화수치 및 노델 수치로 평가하였다(표 8).

올티프라즈/DDB 복합제의 간조직중 항섬유화 효과

군	섬유화 수	노델 수치
대조군	0	0
DMN	2.9 ±0.9	11.7 ±1.8
DMN + 올티프라즈 25 : DDB 5 ㎎/㎏	0.3 ±0.5**	2.0 ±1.5**
DMN + 올티프라즈 15 : DDB 15 ㎎/㎏	0.3 ±0.5**	4.0 ±1.2**
DMN + 올티프라즈 5 : DDB 25 ㎎/㎏	1.2 ±0.6**	6.0 ±1.3**

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고 사용동물수는 8-10 이었다. 각 군간 유의성은 뉴먼쿨법에 의한 다중분석으로 표시하였다. 유의성 표시는 DMN 처리군에 비하여 ** p<0.01로 표시하였다. 섬유화 정도는 0=정상, 1=약한 섬유조직 발견, 2=경등도 섬유조직 발견, 3=뚜렷한 섬유조직 발견, 4=심한 섬유화 진행으로 표시하였다. 간조직말단의 가교상 현성 (최고=10), 엽내 세포소실 (최고=4), 간내 염증 (최고=4), 섬유화 (최고=4) 의 합산점수로 노델 수치를 표시하였다.

실험예 9 : 올티프라즈/DDB 복합제의 TGF-β발현에 미치는 효과

전술한 바와 같이 TGF-β는 간섬유화를 유발하는 시토킨으로 간섬유화 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 표 9는 RT-PCR법에 의한 TGF-βmRNA 양의 변화를 보여준다. DMN 투여군은 대조군에 비하여 TGF-β생성을 현저히 증가시켰다. 올티프라즈/DDB의 배합비율을 변화시켜 약물을 투여한 동물에서 TGF-β발현을 RT-PCR 법으로 정량한 결과 올티프라즈를 30 mg/kg 단독으로 또는 올티프라즈와 DDB를 25 : 5 mg/kg의 비율로 투여할 때에는 TGF-β발현이 현저히 억제되었으나, 올티프라즈에 비하여 DDB의 용량비율이 늘어날수록 TGF-β발현 억제는 소실되었다. DDB 를 단독으로 투여한 동물군에서는 TGF-β발현은 억제되지 않았다. 따라서, TGF-β발현의 억제는 올티프라즈의 효과로 인정되며 이는 올티프라즈와 DDB의 비율이 5 : 1일 때 효과가 가장 좋은 근거가 될 것이다(표 9).

올티프라즈/DDB 복합제의 TGF-β발현 억제율

	DMN 10 ㎕/㎏	DMN + 올티프라즈 30 ㎎/㎏	DMN + DDB 30 ㎎/㎏	DMN + 올티프라즈 25 + DDB 5 ㎎/㎏	DMN + 올티프라즈 15 + DDB 15 ㎎/㎏	DMN + 올티프라즈 5 + DDB 25 ㎎/㎏
TGF-βmRNA 발현 억제율 (%)	0	65	0	65	30	0

실 시 예

<실시예 1>

올티프라즈 25mg

DDB 1mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

<실시예 2>

올티프라즈 50mg

DDB 1mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

<실시예 3>

올티프라즈 5mg

DDB 10mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 전분의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

<실시예 4>

올티프라즈 25mg

DDB 5mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

<실시예 5>

올티프라즈 25mg

DDB 5mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

<실시예 6>

올티프라즈 1mg

DDB 50mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

<실시예 7>

올티프라즈 5mg

DDB 25mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

<실시예 8>

올티프라즈 250mg

DDB 50mg

이성화당 10g

설탕 30mg

나트륨 CMC 100mg

레몬향 적량

(정제수 적량 가하여 전체 100ml)

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조하고 100ml용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조한다.

<실시예 9>

올티프라즈 50mg

DDB 250mg

이성화당 20g

설탕 20g

나트륨 알지네이트 100mg

오렌지향 적량

(정제수 가하여 전체 100ml)

<실시예 10>

올티프라즈 25mg

DDB 5mg

유당 30mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진하고 씰링하여 산제를 제조한다.

<실시예 11>

연질캅셀제 1정중 함량

올티프라즈 25mg

DDB 5mg

폴리에틸렌글리콜 400 400mg

농글리세린 55mg

정제수 35mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60°C로 유지한 상태에서 올티프라즈를 넣고 교반기로 약 1,500rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합한 후 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거하고 연질캅셀의 내용물로 한다.

연질캅셀의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤란틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132mg, 농글리세린 52mg, 디솔비톨액 70% 6mg 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제방법으로 제조한다.

본 발명에 의하면, 올티프라즈 및 DDB를 포함하는, 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료에 우수한 효과를 갖는 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료용 의약 조성물이 제공된다.

Claims

5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온(올티프라즈) 및 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌 디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)를 함유하는, 간섬유화 및 간경화 진행의 치료 및 예방을 위한 의약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 의약 조성물이 캅셀제, 정제, 연질캅셀제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 또는 산제로 이루어지는 군 중에서 선택된 제제로 제형화된 것인 의약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 의약 조성물이 경구 투여를 위한 것인 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올티프라즈 및 DDB를 중량 기준으로 50 - 1 : 1 - 50의 비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.