KR20010082323A - 프로스타그란딘 트랜스포터와 아폽토시스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PGT의 작용을 매개로 하여 후보물질을 선별하는 점을 특징으로 하는 아폽토시스 제어물질의 선별방법을 제공한다. 본 발명의 세포보호제는 프로스타그란딘·트랜스포터(PGT)를 매개로 하여 세포내로 투입되는 성질이 있는 물질을 유효성분으로 하고 그 선별방법은 PGT를 매개로 하는 세포내 투입을 측정함으로써 완성된다. 본 발명의 아폽토시스 유도제는 PGT의 저해작용이 있는 물질을 유효성분으로 하며 그 선별방법은 PGT를 발현하는 세포의 아폽토시스 유도능을 측정함으로써 완성된다. 본 발명의 세포보호제는 세포 아폽토시스 억제 작용이 있으므로 신경세포 아폽토시스의 억제제, 신경세포보호제등으로써 유용하며 신경질환등의 예방 및 치료에 적용할 수 있다. 또한 본 발명의 아폽토시스 유도제는 종양등의 세포 증식성 질환등의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

프로스타그란딘 트랜스포터와 아폽토시스{Prostaglandin transporter and apoptosis}
프로스타그란딘 트랜스포터(이하, "PGT"라 한다)는 생체내에 있어서 프로스타그란딘(prostaglandin)류를 담체 매개적(carrier-mediated)으로 수송하는 성질을 가지고 있다. 프로스타그란딘(prostaglandin)은 PGT를 매개로 하여 생체막을 투과하여 그 세포내에서 생리활성을 발현한다. 혹은 효소 등에 의한 대사분야를 받는다. PGT는 생체내에서는 폐, 신장, 뇌 등에 존재함이 알려져 있으며 또한 PGT를 코-드하는 유전자의 배열도 확인되었다. (Science, 268권, 866~869항, 1995년).
이 PGT를 투과하는(빠져나가는) 물질의 하나가 프로스토그란딘(이하, "PGT"라고 한다)이다. PG류에는 많은 종류가 존재하지만 특히 폐에 존재하는 PGT의 투과실험에 있어서, 프로스타그란딘E1(PGE1), 프로스토그란딘(PGE2)이 높은 투과속도(Km)를 가진다고 보고 되었다(상기 문헌을 참조할 것).
PG류는 오타코이드(autacoid)로서 생체내에서 다기에 걸친 생리활성을 발현한다. 이 중에는 신경장애의 개선, 신경세포 아폽토시스의 제어 등의 신경세포의보호작용도 보고 되어 있다(특개평 8-277222호 공보 참조). 그러나, 이 PG류와 세포 특히 신경세포의 보호작용에 관한 작용기작에 대하여는 반드시 명확한 것은 아니다.
최근에, 세포조직의 죽음에 관하여 아폽토시스(apoptosis)가 주목되고 있다. 아폽토시스란 세포의 자멸 또는 자사의 의미이다. 이 아폽토시스는 병리적 세포사인 괴사와는 다르며 유전정보로서 짜넣어진 세포 자신의 능동적인 죽음이라고 생각된다. 즉, 무엇인가 외부적 또는 내부적 요인에 의하여 아폽토시스를 유도하는 시그널이 활성화되고 세포자신이 능동적으로 분리하여 죽음에 이른다고 생각된다. PGT와 아폽토시스의 관계에 대한 보고는 없다.
본 발명은 아폽토시스(apoptosis} 제어물질, 세포보호제, 아폽토시스(apoptosis) 유도제 및 이 것의 선별방법과 이의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 PGT와 아폽토시스의 관계를 이용한 각종의 기술, 즉 PGT를 매개로 한 아폽토시스의 억제 혹은 유도, PGT를 이용한 아폽토시스를 제어하는 물질의 선별 및 선별된 물질의 사용 그리고 아폽토시스를 억제하는 물질을 이용한 PGT 발현세포의 배양에 관계하는 기술을 제공함에 있다.
본 발명자들은 상기 문제를 인식하고 연구를 진척시킨 결과, PGT와 아폽토시스의 관계를 최초로 확인하였다. 즉, PGT를 매개로 하여 아폽토시스가 발생하는 기작을 처음으로 해명하는 일에 성공한 것이다. 구체적으로는 PGT에 포지티브로 작용하는 물질을 적용하면 아폽토시스를 억제하고 세포를 보호할 수 있다는 것과 반대로 PGT에 네가티브로 작용하는 물질을 적용하면 아폽토시스를 유도할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 아폽토시스 제어물질의 선별방법은 PGT에 대한 작용을 매개로 하여 선별하는 것을 특징으로 한다. 이에 대하여는 PGT에 대한 작용이 PGT를 매개로 해서 세포내로 들어가는 양에 의해 측정하는 것이 바람직하다. 또한, PGT에 대한 작용은 PGT를 매개로 하는 세포내로 들어가는 속도에 따라 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 아폽토시스 제어 물질의 선별방법은 PGT에 대한 작용이 PGT 기능 또는 PGT발현의 저해기능에 따라 측정되는 방법이어도 좋다.
본 발명의 아폽토시스 제어물질의 선별방법은 PGT에 대한 작용이 있는 한편 실질적으로 혈압강하작용이 없는 물질을 선별하는 점을 특징으로 하는 방법이다.
본 발명의 아폽토시스 제어물질은 본 발명의 아폽토시스 제어물질의 선별방법으로 선별된 물질이다.
본 발명의 세포보호제는 PGT를 매개로 하여 세포내로 들어가는 기능이 있는 한편 아폽토시스를 억제하는 작용이 있는 아폽토시스 제어물질을 유효성분으로 한다. 상기 세포보호제는 PGT를 매개로 하여 세포내로 들어가는 기능이 적어도 약 70fmol/mg단백/10분간의 양으로 표시되는 것이 바람직하다. 또한 PGT를 매개로 하여 세포내로 들어가는 기능이 약 100nM(kM) 이하의 투과속도로 표시되어 PGT에 대한 친화성이 있는 것이 바람직하다. 더 나아가 본 발명의 세포보호제는 뇌세포, 신경세포 또는 신장세포에 대해 작용될 수 있다. 또한 본 발명의 세포보호제는 실질적으로 혈압강하작용이 없는 점을 특징으로 하는 세포보호제이다.
본 발명의 아폽토시스 유도제는 PGT 기능 또는 PGT 발현의 저해기능이 있는한편 아폽토시스를 유도하는 기능이 있는 아폽토시스 제어물질을 유효성분으로 한다. 상기 아폽토시스 제어물질이 항PGT항체 또는 PGT안티센스임이 바람직하다.
본 발명의 세포보호제는 아폽토시스 제어물질이 PGK1, PGK2혹은 비시크로PGE2중에서 선택된 세포보호제이다.
본 발명의 PGT 발현세포의 배양방법은 아폽토시스를 억제하는 작용이 있는 아폽토시스 제어물질을 유효성분으로 하는 세포보호제를 첨가한 배지를 이용하는 것을 특징으로 한다. 여기에 있어서 첨가하는 세포보호제가 PGT를 매개로 하여 세포로 진입하는 작용이 있는 것임을 특징으로 한다. 또한 여기에 있어서 첨가하는 세포보호제가 PGE1인 점을 특징으로 한다.
본 발명의 아폽토시스의 제어방법은 상기 본 발명의 세포보호제 또는 아폽토시스 유도제의 유효량을 투여함으로써 완성되는 점을 특징으로 한다.
본 발명의 아폽토시스 유도제는 아폽토시스 제어를 위한 약제를 제조하기 위해 사용되며 상기 세포보호제 또는 상기 아폽토시스 유도제를 사용하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(A) 아폽토시스 제어물질의 선별방법
본 발명의 아폽토시스 제어물질의 선별방법은 후보물질의 PGT로의 작용을 지표로 하여 원하는 물질을 선별하는 점을 특징으로 한다. 아폽토시스 제어물질이란 아폽토시스 억제작용이 있는 물질 또는 아폽토시스 유도작용이 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 아폽토시스 제어물질은 PGT의 기능 또는 그 발현을 억제 또는 유도하는 작용을 가지는 물질이다.
① 아폽토시스 억제작용이 있는 물질의 선별방법
본 발명의 아폽토시스 억제작용이 있는 물질의 선별방법은 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 물질을 선별하거나, 보다 바람직하게는 PGT에 친화성이 있는 한편 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 물질을 선별하는 것에 의해 완성된다. 상기 『PGT에 친화성이 있다』라 함은 구체적으로는 히트 PGT를 강제발현한 세포, 가령 HeLa 세포를 이용한 세포내 진입을 측정함에 있어서 Km는 100nM이하 정도가 바람직하다는 것이다. 또한 『PGT를 매개로 하여 세포내로 진입한다』라 함은 구체적으로는 가령 분화한 PC12 세포를 이용하여 토리티움 표직물과 37℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 세포중의 방사활성을 측정함에 있어서 70fmol/mg단백/10분간 이상 정도가 바람직하다는 것이다. 상기 조건을 만족하는 물질을 선별한다. 구체적 방법으로서는 상기와 같이 PGT 발현세포에 있어서의 투과속도 혹은 진입량 또는 아폽토시스 억제기능을 지표로하여 선별하는 방법등을 열거할 수 있지만 이 것에 한정되는 것은 아니다. 또한 더욱 바람직하게는 실질적으로 혈압강하작용이 없는 물질을 선별한다.
② 아폽토시스 유도작용이 있는 물질의 선별방법
본 발명의 아폽토시스 유도작용이 있는 물질의 선별방법은 PGT의 저해작용이 있는 물질 및 PGT 자체의 발현을 억제하는 작용이 있는 물질을 선별함으로써 완성된다. 구체적으로는 가령 히트 PGT를 강제발현한 HeLa 세포등의 PGT 발현세포를 이용하고 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 물질을 선별한다. 또는 PGT를 매개로 하여 세포내에 진입되는 점이 알려져 있는 물질 예컨대 PGE1등을 방사성동위체로 표식하고, PGT 발현세포에 있어서의 그 투과속도 또는 진입량을 감소 혹은 소실시키는 물질을 선별함으로써 아폽토시스 유도작용이 있는 물질을 얻을 수가 있다. 본 발명의 아폽토시스 유도작용이 있는 물질의 선별방법은 PGT의 저해작용이 있는 물질 및 PGT 자체의 발현을 억제하는 작용이 있는 물질을 선별할 수 있는 방법이라면 좋으며 상기예에 한정되지 않는다. 또한 더욱 바람직하게는 실질적으로 혈압강하작용이 없는 물질을 선별한다.
(B) 세포보호제
본 발명의 세포보호제는 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 물질을 유효성분으로 한다. 보다 바람직하게는 PGT에 친화성이 있는 한편 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 물질을 유효성분으로 한다. 상기『PGT에 친화성이 있다』라 함은 구체적으로는 히트PGT를 강제발현한 HeLa 세포를 이용한 세포내 진입을 측정함에 있어서 Km가 100nM이하 정도라면 바람직하다는 것이다. 또한 『PGT를 매개로 하여 세포내로 진입한다』라 함은 구체적으로는 분화한 PC12 세포를 이용하여 토리티움 표직물과 37℃에서 10분간 인큐베이션한 후에 세포중의 방사활성을 측정함에 있어서 70fmol/mg단백/10분간 이상 정도의 수준이 바람직하다는 것이다.
본 발명의 세포보호제는 상기 (A)의 ①아폽토시스 억제작용이 있는 물질의 선별방법으로 선별된 물질을 포함하는 것이어도 좋으며 상기 물질은 아폽토시스 억제작용이 있다. 상기의 물질은 별도로 합성, 추출분리, 혹은 유전자공학적으로 제조되어 통상의 제제화 기술에 의해 의약품으로 제공할 수가 있다.
이와 같은 물질로서 PGE1, PGE2, PGF2α,PGD2, PGK1, PGK2, 비시크로PGE2등 혹은 이들의 활성유도체 및 전구체 예컨대, 알킬에스테르(특개소 59-216820호), 알콕시카르보닐알킬, 알킬카르보닐옥시알킬에스테르(특개소 59-206344호, 동 60-13779호), 7-티오(특개소 58-110562호), 9-아실옥시(특개소 58-39660호, 특개평 3-204853호, 동 5-213862호) 혹은 상기 물질과 같은 정도의 PGT 친화성 및 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 것 등이 예시된다. 바람직하게는 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 신규물질 또는 PGT를 매개로 하여 세포내로 진입하는 성질이 있는 점이 알려져 있지 않은 공지물질이다.
특히 PGK1, PGK2및 비시크로PGE2는 아밀로이드베타펩티드에 의한 래트의 대뇌물질 뉴론의 아폽토시스를 억제하는 작용을 나타냈다. 본 작용은 PGT를 매개로 한 아폽토시스 억제작용이다. PGK1, PGK2및 비시크로PGE2는 공지물질이기는 하지만 PGT를 매개로 한 아폽토시스 억제작용에 대하여는 지금까지 보고되어 있지 않다. 더욱이 PGE1은 혈압강하작용이 있음이 알려져 있고 의약용 조성물로서 사용할 경우 그 부작용이 문제가 된다. 그러나, PGK1, PGK2및 비시크로 PGE2는 실질적으로 혈압강하를 일으키지 않는 투여량이며 아폽토시스를 충분히 억제하는 것이 가능하다는 점이 판명되었고 그 유용성은 PGE1보다 우수하다.
상기 물질은 세포보호작용 특히 신경세포의 보호작용, 구체적으로는 신경세포변성에 대한 작용과 신경세포의 아폽토시스 유도 억제작용이 있으며 신경세포보호제로서 유용하다. 이와 같은 관련질환으로서는 신경질환 및 신경변성을 수반하는 질환인 알츠하이머병, 파킨슨병, 한친튼무답병, 근위축성측색경화증, 배주관형착증 등이 예시되며 이 질환의 예방·치료·개선 등에 유용하다. 또한 이 물질은 신장세포의 보호제로서도 유용하고 신장염, 신부전, 사구체신염, 네후로제증후군 등의 신장질환의 예방 및 치료에 유용하다. 특히 NO(일산화질소)에 의한 세포상해를 억제함으로써 급성신부전, 약제성 신부전, 만성신부전등의 라디칼과 아폽토시스가 관여하는 신장질환의 예방·치료에 유용하다.
더욱이, 상기 물질 및 PGE1등은 세포보호기능이 있기 때문에 PGT 발현세포의 배양계에 첨가함으로써 PGT 발현세포의 생존 유지에 유효하게 작용한다. 특히. 뇌세포나 신경세포등의 배양이 곤란한 세포에 있어서 장기배양이 가능하게 된다.
상기 물질의 제제화로서는 에탄올 용액, 리포솜, 지방유제, 시크로덱스트린과의 포전체등의 제제화를 행하므로써 생체에 투여 가능하게 할 수가 있다.
더욱이 통상에 따라서 제재화 기술을 실시하여도 좋다.
에탄올 용액화는 이 물질을 에탄올에 용해하므로서 행할 수가 있다. 더욱이 이 에탄올 용액은 이용시에 생리식염수 또는 포도당액 등으로 희석하여 이용한다.
리포솜화는 예컨대 인지질을 유기용매(클로로포름등)에 용해시킨 용액에 해당물질을 용매(에탄올등)에 용해시킨 용액을 첨가한 후 용매를 흘러보내고 이 것에 인산완충액을 첨가, 진탕, 초음파처리 및 원심 분리한 후 상등액을 여과처리하여회수함으로써 행할 수 있다.
지방유제화는 예컨대 해당 물질 유성분 (대두유, 참기름, 올리브유 등의 식물유, MCT등) 및 유화제(인지질등)등을 혼합, 가열하여 용액으로 한 후에 필요량의 물을 첨가하여 유화기(호모지나이저(homogenizer) 예컨대 고압분사형, 초음파형등)을 이용하여 유화, 균질화 처리를 함으로써 행할 수가 있다. 또한 이것을 동결 건조화하는 것도 가능하다. 더욱이 지방유제화시에 유화조제를 첨가하여도 좋으며 유화조제로서는 예컨대 글리세린 및 당류(예컨대 포도당, 솔비톨, 과당등)를 예시할 수 있다.
시크로덱스트린포접화는 예컨대 해당 물질을 용매(에탄올등)에 용해한 용액에 시크로덱스트린을 물 등에 가온 용액한 용액을 첨가한 후 냉각하고 석출한 침전을 여과하고 멸균건조함으로써 행할 수가 있다. 이때 사용되는 시크로덱스트린은 해당 물질의 크기에 따라서 공극직경이 다른 시크로덱스트린(α,β,γ형)을 적당히 선택하면 된다.
해당물질의 투여량은 환자의 병상, 성별, 연령, 체중에 따라서 적당히 선택할 수 있다. 투여경로로서는 경구 또는 비경구 어느 것이나 좋다. 바람직하게는 주사제등의 형태로서 정맥내 투여가 예시된다. 그 투여량으로서는 1일당 1~1000μg정도가 예시된다.
(C)아폽토시스 유도제
본 발명의 아폽토시스 유도제는 PGT의 저해작용이 있는 물질을 유효 성분으로 하며 PGT기능 또는 PGT발현을 억제하는 작용이 있는 물질을 포함한다. 예컨대PGT 안티센스 또는 PGT항체 등이 예시된다.
또한, 본 발명의 아폽토시스 유도제는 상기 (A)의 아폽토시스 유도작용이 있는 물질의 선별방법으로 선별된 물질이어도 좋고 해당물질은 PGT기능 또는 PGT발현을 억제하는 작용이 있다. 이 물질은 별도로 합성, 추출단리(抽出單離), 혹은 유전자공학적으로 제조되어 통상의 제제화기술에 의거 의약품으로서 제공할 수가 있다.
① PGT안티센스
PGT안티센스란 PGT를 코오드하는 유전자와 상보적인 관계를 가지는 유전자배열이며 더구나 세포핵내의 DNA 사슬상에서 PGT를 코오드하는 유전자와 바꾸어 놓음으로써 결과적으로 PGT를 저해할 수가 있는 것이면 된다.
구체적으로는 5' -GGCTTGAGCAGGAGCCCCAT - 3'등의 DNA배열을 가지는 올리고튜클레오티드가 예시된다. 이는 통상의 DNA합성법에 따라 조제할 수 있다. 또한 이 물질은 티오에트 수식되어 있어도 좋다.
PGT안티센스는 바람직하게는 리포훼크친 등의 혼합물, 리포솜, 지방유제, 시크로덱스트린의 포접제등의 제제화를 함으로써 생체에 투여가능하게 할 수가 있다. 또한 암세포에 특이적인 결합성 및/또는 집적성을 높이기 위하여 이것의 조성물을 혈광신생인자 (예컨대 안기오포에틴, 아미노펩티다아제A등)와 결합시킨 것을 이용하는 것이 바람직하다. 더욱이 필요에 따라서 통상의 제제화 기술을 실시하여도 좋다.
② PGT항체
PGT항체는 PGT를 항원으로서 인식할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
PGT항체는 폴리클로날항체 또는 모노클로날항체의 어느 것이라도 좋으며 관계하는 PGT항체는 통상법에 준하여 조제할 수가 있다. 예컨대 폴리클로날항체는 PGT를 면역한 동물의 항혈청을 회수 정제하므로써 조제할 수가 있다. 또한 모노클로날항체는 PGT로 면역한 동물의 비장세포와 미엘로마(myeloma)세포와 같은 증식성세포를 세포융합하여 조제한 하이브리도마 혹은 해당 비장세포를 EB바이러스로 형질전환하여 얻은 형질전환체를 배양하므로써 생산할 수가 있다.(져널 어브 크리니칼 인베스티게이션, 98권 5호, 1142~ 1149항, 1996년; 미국특허제5792851등).
또한 PGT항체로서는 키메라(chimaera)항체, 혹은 히트(hit)화항체 등도 예시된다. 키메라항체는 상기 비히트형인 모노클로날항체의 가변영역과 히트항체의 정상영역을 조합하여 조제할 수가 있다. 히트화항체는 상기 키메라항체 중 가변영역의 아미노산을 히트가 허용될 수 있도록(새로운 항원성을 일으키지 않도록) 치환한 것이다. 이것은 유전자공학적수법에 의하여 조제할 수가 있다.
PGT항체를 포함하는 제제는 관용제제방법에 준하여 조제할 수가 있다.
본 발명의 PGT저해작용이 있는 물질은 아폽토시스 유도작용이 있으며 종양 또는 병원세포에 의거 발생하는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 예를 들면 제암제, 항암제, 항종양제로서 혹은 종양이외의 증식성질환 나아가서는 각종 바이러스 감염이 원인인 질환, HI바이러스에 의한 감염증, 특히 후천적 면역부전증후군(AIDS)의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
본 발명을 보다 상세히 설명하기 위하여 실시예 및 실험예를 열거하지만 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시크로덱스티린 포접화
PGE117mg을 에탄올 0.2ml에 녹인 용액에 시크로덱스트린 257mg을 물 6ml에 가온 용해시켜 조제한 용액을 첨가하여 45℃에서 혼화한 후에 실온으로 되돌리고 침전을 석출시켰다. 상기 용액을 0℃에서 방치한 후에 여과하고 50% 에탄올 수용액으로 세정한 후 멸균 건조함으로써 시크로덱스트린 포접화물을 얻었다.
실시예 2: 리포솜화
난황호스화티질코린 60mg 및 올레아민 11mg을 클로로포름 5ml에 용해시킨 후에 PGE130㎍을 에탄올 100㎕에 용해한 것을 가하여 나스형 플라스크에 넣고 로터리 이베포레이터(evaporator)로 용매를 흘러보냈다. 이에 0.1M 등장인산완충액(pH 5) 1ml를 첨가, 진탕, 초음파처리(쇄케-트) 및 원심분리한 후 상등액 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과하고 리포솜 제제를 얻었다.
실시예 3: 에탄올 용액
PGE1500㎍을 에탄올 1mL에 용해함으로써 에탄올 용액을 얻었다. 상기 에탄올 용액은 이용할 때 생리식염수 또는 포도당액등으로 희석하여 사용한다.
실시예 4: 지방유제화
정제대두유 30g에 고도정제난황 인지질 5.4g, PGE11.5mg 및 오레인산 0.72g을 첨가 40~75℃에서 가온 용해하였다. 상기 용액에 증류수 200ml를 첨가하고 일본약국방 글리세린 7.5g을 첨가한 후 20~40℃의 증류수로 전체양을 300ml로 하고 호모지나이저에서 조유화하였다. 더 나아가 만튼가브린형 호모지나이저로 고온유제하고 균질화된 미세한 지방유제를 얻었다. 상기 유제의 평균입자직경은 0.15~0.4㎛이며 1㎛이상의 입자는 함유하지 않았다.
실시예 5: 지방유제화
PGE1대신에 PGE2를 이용하는 이외는 실시예 4에 준하여 마찬가지로 지방유제를 조제하였다.
실시예 6
PGT에 특이적인 안티센스·올리고뉴클레오티드로서, 5'-GGCTTGAGCAGGAGCCCCAT-3'인 DNA배열을 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다. 이어서 티오에트로 수식하였다. 더욱이 리포훼크틴(기부고사 제품)와 동량 혼합하였다.
실시예 7
PGT 또는 그 단편을 동량의 아쥬반트(adjuvant)와 함께 2~3일간 마다 토끼에게 여러번 투여하였다. 그 후에 항혈청을 회수하였다. 상법에 의거 항혈청을 정제하여 항체를 조제하였다.
실시예 8
PGE1대신에 PGK1, PGK2또는 비시크로PGE2를 이용하는 이외는 실시예 3에 준하여 에탄올 용액을 조제하였다.
실시예 9
면역원으로서 래트 PGT의 말단단편(N끝 1번~23번에 해당된다. MGLLLKPGAR QGSGTSSVPD RRC의 아미노산 배열로 완성된다)과 LH(Keyhole Limpet-Hemocyanine)의 복합체를 이용하여 항PGT항체를 조제하였다.
면역원을 동량의 후로인드완전아쥬반트(또는 불완전 아쥬반트)와 함께 1회 1mg씩 일본산 토끼에게 주사하므로써 면역하였다. 이 후 2시간 간격으로 총 3회 추가 면역하였다. 2개월 후에 전채혈하여 항혈청을 얻었다.
항혈청을 0.02M 등장인산완충액(pH 7, 이하 PBS)으로 2배 희석하고 포화유산암모늄용액을 40%포화농도가 되도록 첨가하였다. 정치후에 원심분리하여 침전화분을 회수하고 PBS에 녹였다. 포화유산암모늄용액을 40%포화농도가 되도록 첨가하였다. 정치후에 원심분리하여 침전화분을 회수하고 PBS에 용해하였다. 투석 튜브에 넣은 물로 투석하고 유산암모늄을 제거하였다. 상기 PGT단편을 아가로스에 고정화한 담체를 이용하여 이-휘니티크로미-트그래피를 행하고 정제하였다. 항체화분을 PBS 용액과 컬럼에 첨부하였다. PBS 및 염화나트륨을 포함하는 PBS로 세정하고 4M염화마그네슘액으로 항체화분을 용출·회수하였다. PBS로 투석하고 정제항체하였다. 바이오래트사의 프로테인에세이킷트를 이용하여 항체 농도측정을 행하여 얻어진 정제항체의 농도는 약 8㎍/ml이었다.
실험예 1
1) 신경세포의 아폽토시스 억제
① 래트 부신수질유래의 갈색세포종 PC12세포(입수처ATCC, 수입처는 대일본제약사)를 10ml/l 열비동화말 혈청 및 5ml/l 열비동화 소 태아혈청을 포함하는 RPMI1640으로 증식시킨 후 마우스βNGF(100ng/ml), 사프리멘트 및 TIP(트랜스훼린 5㎍/ml, 인슐린 5㎍/ml, 프로게스테론 10ng/ml)을 포함하는 RPMI1640으로 배양하고 신경양세포로 분화시켰다.
② 분화시킨 PC12세포를 Neurobasal배지에서 세정하고 마우스βNGF, N2사프린멘트 및 TIP을 포함하지 않는 동배지에 교환한 후 마우스βNGF항체(종농도 50ng/ml)를 첨가하고 24시간 배양하여 아폽토시스를 유도시켰다.
③ PGE1의 에탄올 용액을 이 배지교환시에 신선배지에 첨가하여 (종농도 0.01~1μM) 24시간 배양하였다. 아폽토시스의 검출은 세포를 1% 글루탈알데히드 용액으로 고정한후 (실온 30분), 헤키스트33342 염색에 의해 수행하였다(1mM에서 실온 2분간 반응). 형광현미경하에서 임의의 5시야를 관찰하고 전세포수 및 아폽토시스 양성세포수를 세어 아폽토시스 발현률을 산출하였다.
④ 얻어진 값은 평균치±표준오차로 표시하였다. 통계학적 검정으로서 2군간에서는 student's t-test(이하 검정이라 함)를 다군간에서는 일원비치분산분석(one-Way ANOVA)후에 Dunnet법(이하 던넷트법이라 함)을 이용하고 어느것이나 위험률이 5%이하에서 유의차가 있게 하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타나듯이 PGE1은 1μM으로 세포 아폽토시스를 억제할 수 있음이 판명되었다.
PGE1 농도 아폽토시스 발현률(%) 검정 (위험률)
실험전 4.6±1.0
없음(음성대조) 26.3±1.8
0.01μM 21.3±1.5
0.1μM 19.1±8.1
1μM 17.1±0.6 *
*는 음성대조와 비교하여 유의차가 있음을 나타냄.
2) 아폽토시스와 PGT발현
총 RNA는 분석한 PC12세포에서 트리졸 시약(기부고사 제품)을 이용하여 추출분리하였다. RT-PCR(역전사-폴리머라제연쇄반응)로 사용하는 PGT에 대한 프라이머는 래트 PGT의 cDNA배열(Kanai N., Science, Vo. 268, 866~869, 1995)을 참고하여 설계하였다. 이용한 PGT의 프라이머를 아래와 같이 나타낸다.
센스 (개시염기번호:264)
５′－ＧＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧ－３′
안티센스 (개시염기번호: 670)
５′－ＧＧＣＴＣＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣ－３′
프라이머-대를 이용하여 증폭된 PCR산물의 분자량은 444bp라고 계산되었다. RT-PCT은 RNA PCR킷트(다카라사 제품)를 이용하여 행하였다. DNA의 복제반응은 95℃에서 1분간, 60℃에서 2분간, 72℃에서 3분간의 프로그램으로 25사이클을 DNA써머루사이클라(PJ2000, 파킨·에루마사 제품)를 이용하여 행하였다. 반응종료후의 각 RT-PCR 산물은 시료의 1/5의 양을 이용하여 2% 아가로스 전기영동을 행하고 에티디움브로마이드(ethidium bromide)로 염색후에 자외선 조사해서 해석하였다.
PC12세포에는 mRNA 유래의 1개의 유전자 단편이 증폭되었다. 이 점에서 PGT특이적인 전사가 확인되었다.
실험예 2
PGE1의 신경세포 아폽토시스 억제 작용에 대하여 아폽토시스의 검출을 TUNEL염색에 의해 실시하는 이외는 실험예 1의 방법에 준하여 실험을 행하였다. 그 결과를 표 2에 나타냈다. 표 2에 나타나듯이 PGE10.1μM 및 1μM에 있어서 세포 아폽토시스를 억제할 수 있음을 확인하였다.
PGE1농도 TUNEL 양성세포율(%) 검정 (위험율)
실험전 7.00±1.27
없음(음성대조) 30.93±2.31
0.1μM 13.80±0.75 **P=0.0006
1μM 8.10±1.57 **P=0.0001
**는 음성대조와 비교하여 유의차가 있음을 나타냄.
실험예 3
1) 분화시킨 PC12세포를 토리티움 표식 PGE1(첨가농도 0.1μM)과 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 그 후에 세포를 냉각시키고 5g/l 소혈청 알부민 첨가한 뒤 이어서 냉각한 등장인산완충액으로 세정하고 방사활성을 측정하였다. PC12 세포에 투입된 PGE1양을 산출하였다.
2) PGT 저해제인 브롬크레졸·그린(Bromcresol green, 이하 BrCG이라 함)을 PGE1의 첨가시점에서 배지에 공존시켰다. 그 후에는 상기 1)과 마찬가지로 처리하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
BrCG 첨가량 PGE1투입량(fmol/mg단백/10분간)
첨가하지 않음 78±11
3μM 60±15
10μM 20±8*
더 나아가 수치는 평균치±표준오차를 나타냄. *는 검정했을 때, PGE1첨가군과의 사이에 위험률 5%미만으로 유의차가 있음을 나타냄.
3) PGT cDNA에 특이적인 안티센스·올리고뉴클레오티드를 아래와 같이 설계하였다: ５′－ＧＧＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＴ－３′
더 나아가 해당 안티센스를 티오에트 수식하고 리포펙틴(기부코사 제품)을 이용하여 PGE1과의 배양전에 2일간 PC12를 트랜스펙트하였다. 그 후는 상기 1)과 마찬가지로 처리하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.
안티센스 첨가량 PGE1투입량(fmol/mg단백/10분간)
첨가하지 않음 78±11
0.5μM 56±17
1.5μM 14±14*
더욱, 수지는 평균치±표준오차를 나타냄. *는 검정했을 때, PGE1 첨가군과의 사이에 위험률 5%미만으로 유의차가 있음을 나타냄.
4) SAPK/JNK를 매개로 한 세포내 시그널
SAPK/JNK(Stress Activated Protein Kinase/ Jun N-terminal Kinase의 약자)는 아폽토시스 유도에 관여한다. 그래서 SAPK/JNK 활성변동에 대한 결과로부터 SAPK/JNK를 매개로 한 세포내 시그널에 대하여 검토하였다.
본 실험은 웨스턴블럿 분석에 의하였다. 각종첨가물은 상기의 실험예에 준하여 PC12 세포의 배양배지에 첨가하였다. NGF를 제거한후 1~4시간 배양하였다. PC12 세포를 완충액중에서 용해시켜 원심분리하고 세포추출 상등액을 조제하였다. 해당상등액을 JNK1폴리클로난 항체(산타클루스사 제품)와 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후 프로틴 A-세파로스를 첨가하여 1시간 인큐베이션한 것을 이하의 면역침전에 제공하였다. 세포융해를 100mg을 SDS-PAGE 전기영동법으로 분리하고 나일론 막(아마샴사 제품)으로 전사하였다. 이 막을 인산화(활성형) JNK 항체(산타클루스사 제품)와 함께 블롯드하고 취급 설명서에 준하여 밴드를 검출하였다. 세포내 시그널은 화학발광·자기방사활성법(ECL사 제품, 아마샴사 제품)에 의거 증강시켰다. 결과를 표 5에 나타내었다.
첨가물 발광도
첨가하지 않음 +++
PGE1(1μM) ±
PGE1(0.1μM) +
PGE1(0.1μM) + BrCG(10μM) +++
PGE1(0.1μM) + PGT안티센스 +++
발광도: +++는 매우 강함. +는 발광이 인정됨. ±는 약간 발광있음.
SAPK/JNK는 NGF제거한 뒤 1시간후부터 활성화하였다. PGE1를 첨가하고 PC12세포에서는 해당활성의 상승은 보이지 않고 활성화를 억제하였다. PGT의 저해제인 BrCG 혹은 안티센스는 SAPK/JNK의 활성화에 대한 PGE1의 억제작용을 저해하였다.
상기의 결과에서 PGT를 매개로 하여 세포내에 투입되면 세포 아폽토시스는 억제된다. 그 때에 PGT저해제를 공존시켜서 해당물질이 세포내에 투입되는 것을 저해하면 아폽토시스는 억제되지 않는다.
이 상의 결과에서 PGT를 매개로 하여 세포내에 투입되는 성질이 있는 물질은 PGT를 매개로 하여 세포내에 투입될 때에 어떤 종류의 세포내 시그널을 유도하고 그 유도된 시그널이 직접적/간접적으로 세포 특히 신경세포인 아폽토시스를 억제하는 것이라고 생각된다.
실험예4
1) 래트 부신수질유래 갈색 세포증 PC12세포 (입수처 ATCC, 수입처는 대일본제약)를 마우스βNGF(100ng/ml), N2사폴리멘트(1%) 및 TIP(트렌스훼린) 5㎍/ml, 인슐린 5㎍/ml, 프로게스테론 10ng/ml)을 포함하는 Neurobasal 배지에서 배양하고 신경양세포로 분화시켰다.
2) 더 나아가 실시예 6에서 조제한 안티센스 용액을 첨가하여(종농도: 600nM), 2일간 배양하였다. 음성대조로서 리포펙틴만을 마찬가지로 첨가하고 동시간 배양하였다. 아폽토시스의 검출은 세포를 10% 중성완형 포르말린 용액에서 고정후(실온 30분), TUNEL 염색에 의거하여 행하였다. 광학현미경 하에서 임의의 시야를 관찰하고 전세포수 및 TUNEL(아폽토시스) 양성세포수를 세어 양성세포의 비율을 산출하였다. 그 결과를 표 6(평균치±표준오차)에 나타내었다.
표6에 나타나듯이, 안티센스를 첨가한 구에서는 아폽토시스가 촉진됨이 판명되었다.
안티센스 TUNEL양성세포율(%)
미첨가 7.4±0.9
첨가 12.9±1.1
실험예 5
아밀로이드베타펩티드에 의한 아폽토시스 유도
1) 래트 대뇌피질 뉴론의 배양
태어난지 17 또는 16일 되는 래트 태아의 대뇌로부터 피질부위를 냉각시켜 적출하고, 세절한 후 신경세포분산액(SUMILON)을 이용하여, 세포를 분산시켰다. 그 후 미리 폴리에틸렌이민코트 한 배양액 플라스크에 세포를 1.5 ×105주/cm2의 밀도에서 4일간 배양후, 다음의 실험에 사용하였다. 더 나아가 배양액을 B27서플리멘트(1/50용량), 2 메루카푸트에탄올(27.5μM), 글루타민산(25μM) 및 글루타민(0.5mM)을 첨가한 Neurobasal배지(기부코사 제품)를 이용하였다.
2) 아밀로이드베타펩티드에 의한 아폽토시스의 유도
아밀로이드베타펩티드 25-35(Aβ25-35)을 1mM의 농도가 되도록 증류수에 녹여 37℃에서 약 1주간 배양하고 Aged-Aβ25-35를 조제하였다. 신경세포로의 아폽토시스 유도는 10μM의 Aged-Aβ25-35을 포함하는 상기 배양액(L-글루타민산은 제외)에 교환함으로써 행하였다.
3) 아폽토시스 유도의 24시간 후에 해당하는 세포에 있어서의 PGT 발현의 유무를 확인하였다. 웨스턴블럿법에 따라, PGT의 N말단에 대한 항체를 이용하여 전세포단액 추출액 중의 PGT를 검출하였다. 그 결과 분자량 약 40kd의 부분에 단일한 밴드가 검출되었다. 즉, 뇌에 존재하는 PGT를 종래부터 알려져 있는 폐에 존재하는 PGT(분자량 70kd)와는 다른 분자량을 가지고 있음을 판명하였다.
4) 아밀로이드베타펩티드에 의한 아폽토시스의 유도에 대한, PGE1의 억제효과를 확인하였다. PGE1을 에탄올에 용해후 상기 2)의 Aged-Aβ25-35를 첨가함과 동시에 배양액에 첨가하였다. 그 종농도는 1μM으로 하였다.
5) 아폽토시스의 검출
아폽토시스 유도의 24시간 후, 세포를 PBS(-)를 세정하고, 1% 글루탈알데히드 용액(PBS 용액)을 이용하여 실온에서 30분간 고정하였다. 다음에 PBS(-)로 2회 세정후 1mM 헤키스트 33342용액(PBS용액)으로 약 2분간 반응시켰다. 그 후 형광 현미경 하에서 임의의 시야에 대하여 핵크로마틴의 형태를 관찰하고 정상세포수 및 아폽토시스 양성세포수(크로마틴의 단편화 또는 응집을 인정하는 세포)를 세고 그 비를 아폽토시스 발현률로서 산출하였다. 결과를 표7에 나타내었다.
6) 아밀로이드베타펩티드에 의거 유도된 아폽토시스와 PGT저해제와의 관계를 확인하였다. PGT 저해제인 BrCG을 60μM의 종농도에서 PGE1와 동시에 첨가하는 이외는 상기 1)~5)의 방법에 준하여 실험을 행하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.
약제 아폽토시스 발현률(%)
베히클 30±2
PGE1 23±2**
PGE1+ BrCG 28±1#
더 나아가 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.**는 던넷트법에 따라 검정했을 때 베히클(아밀로이드베타펩티드 처리만)와의 사이에 위험율 1%미만이고#는 검정했을 때 PGE1첨가군과의 사이에 위험율 5%미만으로 유의차 있음을 나타냄.
PGE1은 아밀로이드베타펩티드에 의한 아폽토시스 유도를 억제하였다. 또한 PGT저해제인 BrCG는 PGE1의 해당작용(아밀로이드베타펩티드에 의한 아폽토시스 유도를 억제하는 작용)을 저해하였다. 그 결과, PGE1의 해당작용은 PGT를 매개하고 있음이 시사되었다.
실험예 6
PGT안티센스를 이용하여 아밀로이드펩티드에 의한 아폽토시스 유도에 대한 PGE1의 억제작용으로의 영향을 확인하였다. PGT안티센스는 실험예 3의 올리고뉴클레오티드를 그대로 이용하였다. 그 첨가 농도는 1.5μM으로 하였다. 아폽토시스 발현은 실험예 5에 준하여 실험을 행하였다. 결과를 표 8에 나타냈다.
약제 아폽토시스 발현율(%)
베히클 33±2
PGE1 23±2**
PGE1+ PGT안티센스 32±2**
더욱, 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.**는 던넷트법에 따라 검정했을 때 배히클(아밀로이드베타펩티드 처리만)와의 사이에 위험율 1%미만이고#는 검정했을 때 PGE1첨가군과의 사이에 위험율 5%미만으로 유의차 있음을 나타냄.
실험예 7
1) 아밀로이드베타펩티드에 의한 아폽토시스 유도에 대한 억제효과가 있는 약물을 검토하였다. 피험약물(PGE1, PGK1, PGK2, 비시크로PGE2)을 에탄올에 용해한 후 Aged-Aβ25-35를 첨가함과 동시에 배양액에 첨가하는 이외는 실험예 5에 준하여 실험을 행하였다. 정상세포수와 아폽토시스 양성세포수와의 비율에서 아폽토시스 유도 억제율을 산출하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.
2) 피험약물의 혈압강하작용을 조사하였다. 정상 래트(수컷, 체중약 300g)를 넨부털의 복강내 투여로 마취한 후 배위로 고정하였다. 이어서 경동맥에 카뉠레를 삽입하고 혈압을 압트랜스듀서(일본광전)를 매개로 하여 측정하고 폴리그래프(일본광전)에 연결하여 동시 기록하였다. 피험물질을 에탄올에 용해후 생식으로 희석하고(×200), 미정맥에서 100㎍/㎏체중의 투여량으로 투여하고 평균체혈압(MBP)을 측정하였다. 투여전후의 측정치로부터 혈압강하도를 산출하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.
약제 아폽토시스 유도 억제율(%) 혈압강하도(%)
PGK1 45.4 -5
PGK2 36.2 +2
비시크로PGE2 40.6 0
PGE1 38.2 -55
PGK1, PGK2, 비시크로PGE2는 실질적으로 혈압강하를 일으키지 않는 투여량으로 아폽토시스를 충분히 억제할 수 있음을 가능하다는 점이 판명되었다.
실험예 8
1) 신장세포에 있어서 NO(일산화질소)에 의하여 아폽토시스를 유도시켰다. 래트의 뇨세관상피세포주(주로 원위 유래)인 NRK52E세포를 형콜라겐으로 코트한 챤 바슬라이드에서 24시간배양하였다. 그 후 배지를 무혈청배지로 바꾸고 NO더나- 인NOC12(0.4mM) 또는 S-니트로소-L-글루타티온(S-nitroso-L-glutathione, GSNO;1mM)을 첨가하여 아폽토시스를 유도하였다.
2) 아폽토시스를 유도한 신세포에 있어서의 PGT 발현의 유무를 확인하였다. 웨스턴블럿법에 의하여 전체 신장단백추출액중의 PGT를 PGT의 N말단에 대한 항체를 이용하여 검출하였다. 그 결과 신장에 있어서도 뇌형 PGT와 마찬가지로 분자량 40kd의 부분에 단일한 밴드가 검출되었다.
3) 아폽토시스를 유도한 신세포에 있어서의 PGT의 국재유무를 확인하였다.조직면역염색에 의거 신장조직절편의 PGT를 PGT의 N말단 항체를 이용하여 염색하였다. 원위뇨세관 및 집합관에 강한염색이 인정되었다.
4) 신세포에 있어서의 PGE1의 아폽토시스 억제효과를 확인하였다. PGE1은 NO도너의 첨가와 동시에 종농도 1 또는 10μM이 되도록 첨가하였다. 24시간 후에 1% 글루타루알데히드로 세포를 고정하고 헤키스트33342로 세포를 염색하였다. 1 슬라이드당 3시야를 임의로 선택하고 시야중(비율 400배)의 전세포수에 대한 핵의 단편화 및 응집이 발생하고 있는 세포수의 비율을 산출하였다. 결과를 표 10 및 표 11에 나타내었다.
NOC12를 첨가한 경우
PGE1의 첨가량 아폽토시스 발현율(%)
첨가하지 않음(베히클) 16±1
1μM 11±2**
10μM 6±1**
더 나아가 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.*는 던넷트법에 따라 검정했을 때 배히클(아밀로이드베타펩티드 처리만)와의 사이에 위험율 5%미만이고 유의차가 있음을 나타낸다.**는 마찬가지로 위험율 1% 미만에서 유의차가 있음을 나타냄.
GSNO를 첨가한 경우
PGE1의 첨가량 아폽토시스 발현율(%)
첨가하지 않음(베히클) 25±4
1μM 10±2**
10μM 11±3**
더 나아가 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.*는 던넷트법에 따라 검정했을 때 배히클(아밀로이드베타펩티드 처리만)와의 사이에 위험율 5%미만이고 유의차가 있음을 나타낸다.**는 마찬가지로 위험율 1% 미만에서 유의차가 있음을 나타냄.
PGE1은 신세포에 있어서의 아폽토시스를 억제하였다. 구체적으로는 래트의 뇨세관상피세포주(NRK52E세포)에 있어서 GSNO에 의한 아폽토시스 유도를 억제하는 것으로 판명되었다.
5) GSNO에 의하여 유도된 신세포의 아폽토시스와 PGT 저해제와의 관계를 확인하였다. PGT 저해제인 BrCG를 60μM의 종농도에서 GSNO 및 PGE1과 동시에 첨가하는 이외는 상기 4)의 방법에 준하여 실험을 행하였다. PGE1의 농도는 1μM으로 하였다. 결과를 표 12에 나타내었다.
약제 아폽토시스 발현율(%)
첨가하지 않음(베히클. GSNO 처리만) 19±1
PGE1 8±2
PGE1+ BrCG 13±1*
더 나아가 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.*는 검정했을 때 PGE1첨가군과의 사이에 위험율 5%미만으로 유의차가 있음을 나타냄.
BrCG는 PGE1에 의한 아폽토시스 억제 작용을 저해하였다. 이 결과 PGE1가 래트 뇨세관상피세포주(NRK52E세포)에 있어서 GSNO에 의한 아폽토시스 유도를 억제하는 작용은 PGT를 매개로 한 것임이 증명되었다.
실험예 9
1) NO 도너에 의한 신세포의 아폽토시스 유에 대한 억제효과가 있는 약물을 검토하였다. 피험약물로서 PGK1, 비시크로PGE2를 이용한 이외는 실험예 8에 준하여 실험을 행하였다. 피험약물의 농도는 1μM로 하였다. 결과를 표 13에 나타냈다.
약물 아폽토시스 발현율(%)
베히클(GSNO처리만) 13±1
PGK1 8±1**
비시크로PGE2 6±1**
더욱이, 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.**는 던넷트법에 따라 검정했을 때 배히클과의 사이에 위험율 1%미만이고 유의차가 있음을 나타낸다.
PGK1, 비시크로PGE2는 GSNO에 의한 신세포의 아폽토시스 유도를 억제하였다.
2) PGK1, 비시크로PGE2의 신세포에 있어서 아폽토시스 억제 작용에 대한 PGT 저해제의 영향을 확인하였다. PGT 저해제인 BrCG를 종존도 60μM으로 GSNO 및 피험약물과 동시에 첨가하는 이외는 상기 1)의 방법에 준하여 실험을 행하였다. 예의 수는 4이다. 결과를 표 14 및 표 15에 나타냈다.
약제 아폽토시스 발현율(%)
첨가하지 않음 (베히클.GSNO처리만) 22±2
PGK1 8±1
PGK1+ BrCG 12±1**
더욱이, 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.**는 검정했을 때 PGK1첨가군과의 사이에 위험율 1%미만이고 유의차가 있음을 나타낸다.
약제 아폽토시스 발현율(%)
첨가하지 않음(베히클. GSNO 처리만) 22±2
비시크로PGE2 9±2
비시크로PGE2+ BrCG 16±3*
더욱, 수치는 평균치±표준오차를 나타냄.*는 검정했을 때 비시크로PGE2첨가군과의 사이에 위험율 5%미만으로 유의차가 있음을 나타냄.
BrCG는 PGK1, 비시크로PGE2에 의한 아폽토시스 억제 작용을 부분적으로 저해하였다.
본 발명에 의하면, PGT를 매개로 하여 세포내에 투입되는 성질이 있는 물질을 이용함으로써 세포 아폽토시스가 억제됨으로써 해당물질을 세포보호제로서 유용하다. 특히 신경세포 아폽토시스의 억제제, 신경세포보호제, 신세포 아폽토시스의 억제제 및 신세포보호제로서 유용하며 신경질환, 신경변성을 수반하는 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 한친튼무답병, 근위축성측색경화증, 배주관협착증등의 질환 예방 및 치료에 대한 적용이 기대된다.
또한 본 발명에 의하면 PGT의 저해작용이 있는 물질을 이용하므로써 아폽토시스를 유도하고 종양등의 세포증식성질환등의 예방 및 치료에 적용할 수 있다.
더욱이 본 발명에 의하면 PGT를 매개로 하여 발생하는 시그널과 세포 아폽토시스 사이에는 관련성이 있다. 이 것에는 SAPK/JNK가 관여하고 있음을 판명하였다. 즉 본 발명의 물질은 PGT를 매개로 하여 세포내에 투입된 결과 이 것이 SAPK/JNK의 활성화에 대한 억제효과를 나타내듯이 혹은 억제성의 세포내 시그널을 유도하므로써 세포 아폽토시스를 억제하고 세포를 보호하는 작용을 발현하는 것으로 기대할 수 있다.
또한 본 발명의 선별방법에 의하면 PGT를 매개로 하여 세포내에 투입되어 세포보호작용을 나타내는 물질 및 세포 아폽토시스 유도작용을 나타내는 물질을 간편히 선별할 수 있다.

Claims (19)

  1. 프로스타그란딘·트랜스포터(PGT)에 작용을 매개로 하여 후보물질을 선별하는 것을 특징으로 하는 아폽토시스 제어물질의 선별방법.
  2. 제 1항에 있어서, 프로스타그란딘·트랜스포터(PGT)에 작용이 PGT를 매개로 하는 세포내의 투입량에 의하여 측정됨을 특징으로 하는 아폽토시스 제어물질의 선별방법.
  3. 제 1항에 있어서, 프로스타그란딘·트랜스포터(PGT)의 작용이 PGT를 매개로 하는 세포내의 투입속도에 의하여 측정됨을 특징으로 하는 아폽토시스 제어물질의 선별방법.
  4. 제 1항에 있어서, 프로스타그란딘·트랜스포터(PGT)의 작용이 PGT기능 또는 PGT 발현의 저해능에 의하여 측정됨을 특징으로 하는 아폽토시스 제어물질의 선별방법.
  5. 제 1 내지 4항의 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 혈압강하작용이 없는 물질을 선별함을 특징으로 하는 아폽토시스 제어물질의 선별방법.
  6. 제 1항 내지 5항의 어는 한 항에 있어서, 상기 방법으로 선별된 신규한 아폽토시스 제어물질.
  7. PGT를 매개로 하여 세포내로 투입되는 기능이 있는 한편 아폽토시스를 억제하는 작용이 있는 아폽토시스 제어물질을 유효성분으로 하는 세포보호제.
  8. 제 7항에 있어서, PGT를 매개로 하여 세포내로 투입되는 기능이 적어도 70fmol/mg단백/10분간의 투입량으로 나타냄을 특징으로 하는 세포보호제.
  9. 제 7항에 있어서, PGT를 매개로 하여 세포내로 투입되는 기능이 약 100nM(Km) 이하의 투과속도에 나타나는 PGT의 친화성을 가짐을 특징으로 하는 세포보호제.
  10. 제 7항 내지 9항의 어느 한 항에 있어서, 세포가 뇌세포, 신경세포 또는 신세포임을 특징으로 하는 세포보호제.
  11. 제 7항 내지 9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포보호제가 실질적으로 혈압강하작용이 없음을 특징으로 하는 세포보호제.
  12. PGT기능 또는 PGT 발현의 저해능이 있는 한편 아폽토시스를 유도하는 기능이있는 아폽토시스 제어물질을 유효성분으로 하는 아폽토시스 유도제.
  13. 제 12항에 있어서, 아폽토시스 제어물질이 항PGT항체 또는 PGT안티센스임을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제.
  14. 제 7항 내지 12항의 어는 한 항에 있어서, 아폽토시스 제어물질이 PGK1, PGK2 또는 비시크로PGE2로부터 선택됨을 특징으로 하는 세포보호제.
  15. 아폽토시스를 억제하는 작용이 있는 아폽토시스 제어물질을 유효성분으로 하는 세포보호제를 첨가한 배지를 이용한 PGT 발현세포의 배양방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 세포보호제가 PGT를 매개로 하여 세포에 투입되는 작용이 있음을 특징으로 하는 PGT 발현세포의 배양방법.
  17. 제 15항 또는 16항에 있어서, 상기 세포보호제가 PGE1임을 특징으로 하는 PGT 발현세포의 배양방법.
  18. 제 7 내지 12항 , 13항 또는 14항의 어는 한 항에 있어서, 상기 세포보호제 또는 아폽토시스 유도제의 유효량을 투여함을 특징으로 하는 아폽토시스의 제어방법.
  19. 제 7항 내지 12항, 13항 또는 14항의 어느 한 항에 있어서, 아폽토시스 제어를 위한 약제의 제조를 목적으로 하는 세포보호제 또는 아폽토시스 유도제의 사용.
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