KR20010048697A - 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC-10656을 모균주로 자외선조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하여 모균주의 형질을 변형시켜, 머캅토퓨린(Mercaptopurine)내성을 가지게 함으로써 균주의 대사경로에 변화가 생겨서, 모균주에 비해 글루탐산 생산능이 향상된 변이주에 관한 것이다. 또한 이 변이주를 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루탐산을 채취하는, 미생물을 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법{A microorganism producing glutamic acid and a method for producing glutamic acid using said microorganism}

본 발명은 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC-10656의 변이주로서 머캅토퓨린(Mercaptopurine) 내성을 보유하며 이에 따른 대사경로상의 변화에 의해 기존 균주에 비해 글루탐산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

미생물들은 에너지 대사 과정에 있어서 에너지 저장물질로서 ATP, GTP등 고에너지 인산화합물들을 이용한다. 이러한 물질들은 에너지 대사과정에서 합성되고, 필요시 소모되어 에너지를 발생시키며 미생물의 대사에 중요한 역할을 한다. 따라서 ATP, GTP 등의 에너지 저장 물질들의 생성을 강화시키면, 미생물의 에너지 대사가 강화되어서 균체의 활성 또한 강화될 것으로 기대된다. 에너지 대사 활성의 증가는 물질 대사 과정의 전체적 흐름을 개선시켜 대사 산물들의 생성에도 영향을 미칠 것으로 생각되었다. ATP, GTP 등 고에너지 인산 화합물의 기본 물질인 아데닌 및 구아닌은 퓨린 화합물이며, 따라서 퓨린 유사체인 머캅토퓨린(Mercaptopurine)을 이용하면 퓨린계 에너지 저장물질인 ATP, GTP 등의 생성을 강화할 수 있을 것으로 생각되었다. 퓨린 유사체인 머캅토퓨린에 내성을 가지는 균주는 강화된 ATP, GTP 생성 플럭스를 보일 것으로 생각되었으며, 이러한 에너지 대사의 강화는 전체적인 대사 흐름을 원활하게 해서 목적 산물인 글루탐산의 생산 또한 증가시킬 수 있을 것으로 기대되었다.

본 발명자들은 종래 미생물의 형질을 변형시켜서 머캅토퓨린에 내성을 갖게 하여 기존 균주에 비해 글루탐산 생산성이 향상된 변이주를 획득하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 미생물 SM5는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC-10656을 모균주로하여 자외선조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후, 머캅토퓨린이 농도별로 첨가된 배지[포도당 10 g/l, 인산제1칼륨 1 g/l, 인산제2칼륨 0.5 g/l, 황산암모늄 0.5 g/l, 요소 1 g/l, 황산철 20 mg/l, 황산마그네슘 0.5 g/l, 황산망간 20 mg/l, 티아민염산염 200 ㎍/l, 비오틴 200 ㎍/l, 당밀 5 g/l, pH 7.0로 이루어진 최소배지에 머캅토퓨린 50-1000 mg/l을 첨가한 배지]에서 생육할 수 있는 변이주들 중에서 선별해낸 균주이다. 이때 사용된 배지중의 머캅토퓨린 농도는 1000 mg/l 까지였으며, 분리에 성공한 내성주는 400 mg/l 머캅토퓨린 농도에서 생육가능한 것으로 확인되었다.

여기서 얻어진 변이주에 대해 플라스크 실험 및 발효조 배양 실험을 실시한 결과 기존 균주에 비해 글루탐산 생산성이 약 9정도 향상된 사실이 입증되었으며, 이 균주를 SM5라 명명하여 1999년 11월 15일에 KFCC-11112로 한국종균협회에 기탁하였다.

본 발명의 균주를 위해 사용된 영양배지는 펩톤 1, 육즙 1, 염화나트륨 0.25, 효모엑기스 1, 한천 2, pH 7.2로 구성된다.

본 발명에서 분리한 신규의 변이주 SM5의 생화학적 특성은 표1 및 표2의 기재와 같으며, 이들 내용에 의하면 본 발명의 미생물은 400 mg/l 농도의 머캅토퓨린 첨가배지에서도 생육 가능하다. 또한 이 균주는 α-나프토퀴놀린에도 높은 내성을 가지는 것으로 나타났는데, 이러한 특성은 균주의 산소 요구성이 낮아지는 것을 의미하며, 산소 공급이 부족한 조건하에서도 기존 균주에 비해 우수한 발효 능력을 보일 것으로 생각된다.

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

머캅토퓨린에 대한 내성 비교

균 주	머캅토퓨린(mg/l)
	0	50	100	200	400	700	1000
KFCC-10656	+++	++	+	-	-	-	-
SM5	+++	+++	++	+	+	-	-

(주) +; 생육, -; 생육하지 못함, 30℃에서 72시간 배양.

α-나프토퀴놀린에 대한 내성

균 주	α-나프토퀴놀린(㎍/ml)
	0	10	30	50	100	150	200
KFCC-10656	+++	+++	++	+	-	-	-
SM5	+++	+++	+++	++	+	+	-

(주) +; 생육, -; 생육하지 못함, 30℃에서 72시간 배양.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

실시예 1

사용균주: 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10656 및 본 발명의 미생물 SM5(KFCC-11112).

종배지: 펩톤 1, 효모엑기스 0.5, 육즙 0.5, 포도당 1, 염화나트륨 0.25, 요소 0.13, pH 7.2.

발효배지: 포도당 3, 미액 0.2, 비오틴 1 ㎍/l, 폐당밀 0.05, 황산암모늄 0.1, 황산철 0.002, 황산 망간 0.002, 황산 마그네슘 0.05, 티아민 염산염 200 ㎍/l, 인산 제1칼륨 0.2, 요소 0.95, pH 7.2.

발효방법: 상기 종배지 3 ml을 지름 18 mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40 ml을 500 ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균하여 종배양액 1 ml을 식균한 다음 48시간 배양하였다. 회전수는 분당 180회, 30℃, pH 7.2로 조절하였다. 배양완료 후 배지내 글루탐산 축적량은 KFCC10656이 16.5 g/l, SM5가 17.8 g/l이었다.

본 실시예의 결과, 본 발명의 미생물은 기존 균주에 비해 당농도 3배지에서 글루탐산 생산성이 약 8정도 향상된 것으로 확인되었다.

실시예 2

사용균주: 실시예 1과 동일

1차 종배지: 펩톤 1, 효모 엑기스 0.7, 육즙 0.7, 포도당 1, 자당 1, 염화나트륨 0.25, 요소 0.3, 페놀레드 0.001, pH 7.2.

2차 종배지: 원당 3, 포도당 1, 과당 1, 황산 마그네슘 0.04, 인산 제1칼륨 0.1, 인산 제2칼륨 0.05, 황산 암모늄 0.8, 황산철 0.002, 황산망간 0.002, 황산아연 0.0002, 황산구리 0.0002, 비오틴 500 ㎍/l, 티아민 염산염 2 mg/l, 대두단백 가수분해물 0.2, 페놀레드 0.001, pH 6.8.

발효배지: 자당 6, 포도당 2, 과당 2, 황산 마그네슘 0.05, 인산 제1칼륨 0.05, 인산 제2칼륨 0.15, 황산 암모늄 0.1, 황산철 0.002, 황산망간 0.002, 황산아연 0.0002, 황산구리 0.0002, 비오틴 30 ㎍/l, 티아민 염산염 1 mg/l, 대두단백 가수분해물 0.2, 페놀레드 0.001, 탄산칼슘 3, pH 6.75.

1차 종배양: 상기 1차 종배양 배지 2.5 ml을 18 mm 시험관에 분주하고 121℃에서 5분간 가압 살균하여 냉각한후 사용균주를 접종하고 30℃에서 분당 160회의 회전수로 12시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지 30 ml을 250 ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 5분간 가압 살균 후 냉각하여 1차 종배양액의 배양완료액을 1 ml 접종한 후 31℃에서 150 rpm으로 14시간 진탕 배양하였다.

발효방법: 상기 발효배지를 250 ml 삼각 플라스크에 30 ml씩 분주하고, 10요소 용액 1 ml을 첨가한 후 2차 종배양액 5 ml을 접종한 후, 31℃에서 150 rpm으로 36시간 배양하였다. 배양 중간에 pH에 따라 10요소수용액을 8 ml 수시로 첨가하여, pH 조절 및 질소원 공급을 하였다. 발효시작 2시간 후 계면 활성제 0.04와 페니실린 0.3 U/ml을 첨가한 후 당이 모두 소모될 때까지 배양하였다.

배양완료후 글루탐산의 농도는 KFCC-10656이 45.2 g/l, SM5가 50.6 g/l였다.

실시예3

1차 종배지: 펩톤 0.7, 효모엑기스 0.7, 육즙 0.7, 포도당 1, 염화나트륨 0.25, 요소 0.13, 황산 암모늄 0.1, pH 7.5.

2차 종배지: 원당 3, 당밀 1, 황산마그네슘 0.04, 인산제2칼륨 0.1, 황산 암모늄 0.3, 황산철 0.001, 황산망간 0.001, 비오틴 500 ㎍/l, 티아민 염산염 2 mg/l, 요소 0.1, pH 7.1.

발효배지: 원당 1.7, 당밀 6.8, 인산 0.13, 황산마그네슘 0.04, 황산철 0.001, 황산망간 0.001, 미액 0.1, 티아민 염산염 200 ㎍/l, 수산화칼륨 0.18, 소포제 0.005, pH 7.5.

1차 종배양: 1차 종배지 40 ml을 500 ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균하여 냉각후 균주를 접종하여 회전수 분당 180회, 30℃에서 20시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지를 5리터 용량의 실험용 발효조에 2.5리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압살균한후 냉각시켜 1차 종배양액의 배양완료액을 30 ml 접종한 후 공기를 배분당 0.5리터 공급하면서 900 rpm, 30℃에서 18시간 진탕 배양하였다.

발효방법: 상기 발효배지를 30리터 용량의 시험발효조에 9리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 약 1.5리터씩 접종한 후, 공기를 매분당 2.5리터씩 공급하면서 450 rpm, 31℃에서 배양하였다.

상기 조건으로 배양하여 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 페니실린 혹은 계면활성제를 첨가하고 배양하며, 배양중 발효액의 pH는 28암모니아수로 pH 7.7이 되도록 계속 조절하였다. 배양중 잔당의 농도가 1.5가 되면, 살균된 폐당밀 또는 폐당밀과 원당을 일정한 비율로 혼합한 당을 수시로 공급하였다. 추가된 당밀 또는 혼합당과 초기의 발효배지에 첨가된 당의 합계가 발효액량 대비 22가 될 때까지 배양을 계속하였다. 배양완료 후 글루탐산의 농도는 KFCC-10656이 108.6 g/l, SM5가 118.4 g/l이었다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 SM5는 글루탐산 생산능이 향상된 균주로서 이를 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지에서 배양하여 글루탐산을 고수율로 제조할 수 있다.

Claims (4)

1. 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum)의 변이주로 글루탐산을 생산하는 미생물 SM5 (KFCC-11112).
2. 제1항에 있어서, 머캅토퓨린 농도 400 mg/l 이상에서 생육할 수 있는 미생물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, α-나프토퀴놀린 농도 150 ㎍/l 이상에서 생육가능한 미생물.
4. 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) SM5를 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루탐산을 채취하는 것을 특징으로 하는 글루탐산의 제조방법.