KR20010046731A - 삼일열말라리아원충 분열소체막단백질의 ｄｎａ서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말라리아의 혈청학적 진단법에 이용될 수 있는 삼일열말라리아원충의 분열소체막단백질(merozoite surface protein of Plasmodium vivax)을 코딩하는 DNA서열에 관한 것이다. 본 발명에 의한 DNA서열을 혈청학적 진단법에 적용하면, 말라리아를 누구나 간단하고 정확하게 진단하거나, 치료효과를 측정할 수 있는 이점이 있다.

Description

삼일열말라리아원충 분열소체막단백질의 ＤＮＡ서열{DNA sequence of merozoite surface protein of Plasmodium vivax}

본 발명은 삼일열말라리아원충 분열소체막단백질의 DNA서열에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 말라리아의 혈청학적 진단법에 이용될 수 있는 삼일열말라리아원충의 분열소체막단백질을 코딩하는 DNA서열에 관한 것이다.

말라리아는 학질(栖疾) 또는 학(栖)이라 하여 우리 나라에서도 오래 전부터 알려진 열병으로서, 현재 우리나라는 물론 세계적으로 널리 유행하고 있다. 세계적으로 10억 이상의 인구가 말라리아 위험 지역에 살고 있고, 매년 1억 이상의 말라리아 환자가 발생하며, 연간 1백만명 이상이 사망하고 있다고 한다. 따라서, 세계보건기구(WHO)가 선정한 6대 열대병 중에서도 가장 중요한 질환으로 인정되고 있다.

특히, 최근에는 해외여행이 증가하면서 여행 도중 감염되어 있다가 귀국 후에 발병하는 수입성 말라리아(imported malaria) 환자가 우리나라는 물론 말라리아의 유행이 전혀 없는 선진국에서도 커다란 문제가 되고 있다.

말라리아 감염의 원인인 열원충은 인체의 적혈구 내에 기생하며, 적혈구를 파괴함에 따라 주기적인 열 발작, 빈혈, 비종대 등의 증상을 나타내는 특성을 가지고 있다. 말라리아의 감염은 모기 주둥이에서 말라리아포자(sporozoite)들이 인체 내로 유입되어 일어난다. 이렇게 유입된 말라리아포자는 간실질세포 내에서 번식한 후(8∼9일), 적혈구로 들어가 무성생식을 하여 약 48시간 동안 분열된 분열소체(merozoite)들이 적혈구를 파괴하고 혈액 속에 나와 다시 새 적혈구 속으로 들어간다. 이같은 무성번식을 되풀이하는 중 일부는 자웅생식모세포(macrogametocyte 및 microgametocyte)로 변형된다. 이들이 모기 체내로 들어가면 유성생식을 하게 된다. Zygote∼ookimete∼oocyst의 단계를 거쳐 포자로 되어 (포자번식:sporgony) 침샘에 있다가 또 다른 사람에게 감염될 수 있는 기회를 갖는다.

말라리아의 임상적 특성에 대해서 살펴본다. 열원충의 포자소체가 간세포 내에서 분열, 증식하고 많은 수의 크립토메로조이트(cryptomerozoite)를 형성한 후 적혈구에 기생한다는 것은 생활사에서 이미 언급하였다. 모기에 물린 후 이 때까지가 잠복기인데, 이 기간은 매우 다양하여 수주에서 수개월까지 가능하다. 따라서 모기가 없는 겨울에도 말라리아 환자가 발생할 수 있으며 이것은 잠복기가 수 개월 경과되었기 때문이다.

말라리아 환자에서 볼 수 있는 전형적인 임상적 경과는, 수분 내지 한두 시간동안 오한, 두통, 구역 등을 보이는 오한 전율기(cold stage)를 거쳐, 따뜻하고 건조한 피부, 빈맥, 빈호흡 등을 보이는 발열기(hot stage)가 3∼6시간 이상 지속된 후, 땀을 흘리는 발한기(wet stage)로 이어지게 된다. 발열의 주기는 충체의 종에 따라 다른데 삼일열말라리아는 48시간이다.

발열 이외에도 환자는 빈혈, 두통, 비종대, 혈소판감소증 등의 소견을 보인다. 빈혈은 적혈구의 파괴 때문이고, 비종대는 파괴된 적혈구 및 헤모글로빈의 침착에 의해 발생되고, 혈소판감소증은 원충 항원으로 코팅(coating)된 혈소판의 안티바디-메디에티드 스프레닉 시퀘스트레이션(antibody-mediated splenic sequestration)에 의해 유발된다.

이러한 특징의 말라리아를 진단하는 방법에는, 임상적 경과를 관찰하는 방법과 후층도말법이 있다.

먼저, 임상적 경과를 관찰하는 방법에 대해 살펴본다. 상술한 바와 같이, 말라리아 임상적 경과의 특성은, 발열주기가 매우 규칙적이며, 충체의 종에 따라 다르다는 것이다. 따라서 이를 이용하여 말라리아의 감염 여부 및 충체의 종까지 진단할 수 있다. 그러나, 임상적 경과를 관찰하여 진단하는 방법은 정확성이 떨어지기 때문에, 약제의 오용 및 그로 인한 부작용(side-effects)과 약제 내성을 초래하는 문제점이 있다.

후층도말법은, 많은 양의 혈액을 도말하여 말린 후, 적혈구는 모두 용혈시키고 원충과 백혈구만 남겨서 검경하여 말라리아 양성, 음성을 판단하는 방법으로, 말라리아의 감염여부를 정확하게 진단할 수 있다. 그러나, 상기와 같이 검경하기 위해서는 혈액표본을 염색하여야 하므로, 블러드 필름(blood film)을 관찰하기 까지 수시간이 필요하다. 또한, 말라리아 양성, 음성을 정확히 판단하기 위해서는, 숙련된 사람이 상기 혈액표본에 침지용유(immersion oil)를 떨어뜨린 후 현미경 아래에서 적어도 100 필드(field) 이상을 이동하면서 관찰하여야 하기 때문에, 적어도 1시간 이상의 관찰시간이 필요하다. 결국, 상기 후층 도말법은, 숙련된 현미경 사용자(microscopist)가 필요하며, 진단결과를 얻기까지 상당한 시간이 걸리는 문제점이 있다. 따라서, 상기 방법은 이러한 시간과 숙련된 현미경 사용자가 부족한 말라리아 유행지역에서는 적용되기 어렵다.

상기와 같은 배경하에서, 신속하고 정확하게 말라리아 감염여부를 진단할 수 있는 진단법의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 말라리아 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 혈청학적 방법에 이용될 수 있는 유전자서열을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명의 목적은, 말라리아원충에 의해 발병하는 질환에 대해 항원성을 나타내는 삼일열말라리아의 분열소체막단백질을 코딩하는 유전자서열을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은, 말라리아의 혈청학적 진단법에 이용될 수 있는 삼일열말라리아의 분열소체막단백질을 코딩하는 DNA서열을 제공함으로써 달성된다.

본 발명자들은 말라리아증을 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 열대열말라리아의 분열소체막단백질(merozoite surface protein)이 말라리아원충에 의해 발병되는 질환에서 항원성을 나타내고 있다(Derek Wakelin, Immunity to parasite, 44-54, 1996)는 사실로부터 삼일열말라리아원충의 진단에 이용하고자 하였으며, 이를 위하여 말라리아원충으로부터 분열소체단백질을 코딩하는 DNA서열 및 상기 DNA서열에 의해 코딩되는 아미노산서열을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명에 의한 유전자 서열 및 아미노산 서열은, DNA probe, 단일클론항체, 재조합단백질 등의 제조에 이용될 수 있으므로, 이에 따라서 말라리아증을 누구나 간단하고 정확하게 진단하거나, 치료효과를 측정하는 방법으로 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

일반적으로, 사람의 말라리아는 열원충속(genus Plasmodium)에 속하는 다음 4종의 기생원충의 감염에 의해 일어난다. 삼일열원충(Plasmodium vivax), 열대열원충(P. falciparum), 사일열원충(P. malariae), 난형열원충(P. ovale)인데, 이중 삼일열말라리아와 사일열말라리아가 주종을 이루고 있다. 이중 삼일열말라리아는 가장 넓은 분포를 이루고 있으며, 한국에 있어서 말라리아의 주요 원인원충이다(인체기생충학, 소진탁저). 말라리아의 분열소체막단백질(이하, MSP라고 함)중 MSP-1, MSP-2, MSP-4은 말라리아 분열소체의 바깥쪽막에 GPI-lipid에 의해 결합되어 있어 숙주에 항원성을 나타낸다(Camila I et al, Vaccine. 17, 2959-2968, 1999). 그런데 이러한 MSP중 삼일열말라리아의 MSP-1에 대한 단세포군항체는 열대열말라리아의 MSP-1과는 교차반응이 없다는 보고가 있다(John WB et al, Experimental parasitology, 91, 238-249, 1999)

상기한 사실들로부터, 본 발명자들은 삼일열말라리아 MSP-1 재조합 단백질 중에서 말라리아원충증 환자의 혈청과 반응하는 재조합 단백질을 찾게 되면, 삼일열말라리아의 진단에 이용할 수 있다는 것을 착안하게 되었고, 따라서 본 발명자들은 삼일열말라리아로부터 MSP-1를 코딩하는 유전자를 클로닝한 것이다.

삼일열원충으로부터 MSP-1를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 과정은 먼저, MSP에 관련된 유전자를 분리하기 위하여 β-시아노에틸포스포미디트(cyanoethyl phosphormidite)방법으로 프라이머를 설계하는 것이다.

MSP의 보존부위와 제한효소 EcoRⅠ으로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 1(5'- gctctagacaaaatgagctccgagcacaca-3')과 제한효소 Hind Ⅲ로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 2(5'-cgggatccctattaaagctccatgag-3')를 설계한다.

두 번째 과정은, 말라리아원충으로부터 genomic DNA와 상기 프라이머를 반응시켜 MSP에 관련된 DNA 조각을 분리하는 것이다.

세 번째 과정은, DNA 염기서열을 결정하는 것이다.

이하, 본 발명의 MSP-1 유전자의 염기서열의 결정과정을 다음 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명을 어떠한 방식으로도 한정하는 것이 아니다.

[실시예 1]

말라리아원충에서 DNA분리

삼일열말라리아원충 0.5g(wet weight)을 액체질소로 동결하고, 이들을 막자사발로 분쇄한 후 충체 100mg당 다이제스쳔버퍼(digestion buffer, 100mM NaCl, 10mM tris-HCl, pH 8.0, 25mM EDTA, 0.5% SDS, 0.12mg proteinase K) 1.2ml를 첨가하여 50℃에서 18시간 진탕하면서 세포막을 용해시켰다. 이들 시료에 동량의 페놀/클로로폼/이소아밀알콜(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)을 25:24:1로 첨가하고 잘 혼합한 후 실온에서 20,000g(swinging bucket rotor;Sorvall RC-5, USA)으로 10분간 원심분리하였다. 그리고 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 7.5M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)(상층액의 1/2양)와 100% 에탄올(ethanol)(상층액의 2배)을 첨가하여 10,000g에서 2분간 원심분리하였다. 그리고 70%의 에탄올로 펠릿(pellet)을 씻은 후 건조시켰다. TE 버퍼(buffer)(10mM tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)에 DNA를 65℃에서 3시간 동안 방치하여 완전히 용해시켰으며, 잔존하는 RNA를 제거하기 위해 0.1% SDS와 1ug/ul DNase-free RNase를 첨가하여 37℃에서 1시간 처리한 후 유기추출(organic extraction)과 에탄올침전(ethanol precipitation)을 실시하였다.

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 얻은 genomic DNA 10㎕와 프라이머 1 및 2 각각을 10㎕씩 GeneAmp PCR reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase(Perkin-Elmer Cetus사 )시스템에 첨가하고, 여기서 얻은 PCR 반응액 99.5㎕를 DNA 써멀 싸이클러(DNA Thermal Cycler, Perkin-Elmer Cetus사, model=9600)에 첨가하여 PCR 증폭(polymerase chain reaction method)을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃에서 1.5분간 DNA를 변성시키는 단계; 25℃에서 1.5분간 어닐링(annealing)시키는 단계; 72℃에서 3분간 DNA를 합성하는 단계를 총 45회 반복하여 실시하였다. 증폭된 DNA 단편들을 확인하기 위하여 PCR 증폭을 실시한 반응액 10㎕에 시료 완충용액(6X, 0.25% 브로모페놀블루, 0.25% 자일렌 시아노 FF, 40% 슈크로스) 2㎕를 혼합하여 1% 아가로스젤로 전기영동하는데, 이때 트리스-초산/에틸렌디아민테트라아세트산(TAE) 전기영동 완충액으로 100V에서 30분 동안 전기영동하여, 489 kbp 정도의 DNA분획을 분리하였다.

[실시예 3]

상기 실시예 2에서 전기영동하여 얻은 증폭된 DNA 분획을 1% 아가로스젤에서 전기영동하고 난 후 잘라내어, Geneclean II kit (Bio 101 Inc.)를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 정제하였고( Wilson VG et al., 1988 ), 정제한 DNA를 pT7Blue T-벡터(Novagen)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드 DNA를 알칼리시스 방법으로(Birnboim HC et al., 1979; Ish-Horowicz O and Barke JF, 1981) 정제한 후 다시 Geneclean II kit를 이용하여 정제하였다.

[실시예 4]

상기 실시예 3에서 정제한 DNA를 T7 프로모터 프라이머(promotor primer)와 T3 리버스(reverse) 프라이머(ABI cloning system)를 첨가하여 PCR 반응을 한 뒤, 8M의 우레아가 함유된 4.75% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 2,500V, 30mA로 12시간 전기영동하였다. 전기영동 결과는 Microgene software program (ABI사 제품)을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 서열 1과 같다.

서열 1은 GenBank에 AF200953으로 99년 11월 3일 기탁한 삼일열말라리아의 MSP를 코딩하는 DAN서열이다(2002년 11월 2일 까지 미공개).

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 삼일열말라리아원충 MSP를 코딩하는 DNA서열을 제공하는데, 상기 서열은 DNA probe, 단일클론항체, 재조합단백질 등의 제조에 이용될 수 있다. 따라서, 본원발명을 혈청학적 진단법에 적용하면, 말라리아증을 누구나 간단하고 정확하게 진단하거나, 치료효과를 측정하는 방법으로 활용할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

<110> LeeYoungJu;S.P.M.CO.Ltd.

<120> DNA sequence of merozoite surface protein of Plasmodium vivax

<130> 1

<160> 2

<170> KOPATIN 1.5

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> Plasmodium vivax

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(489)

<223> merozoite surface protein

<400> 1

aaa atc gag agc atg atc gcc act gag aag aac aag ccg acc gtg gca 48

Lys Ile Glu Ser Met Ile Ala Thr Glu Lys Asn Lys Pro Thr Val Ala

1 5 10 15

gcg gca gat ata gtg gca aag gga caa tcg ctt aga gga gca agt gaa 96

Ala Ala Asp Ile Val Ala Lys Gly Gln Ser Leu Arg Gly Ala Ser Glu

20 25 30

aca ggg aca act ggc aat aca gtc aat gcg caa aca gct gta gta caa 144

Thr Gly Thr Thr Gly Asn Thr Val Asn Ala Gln Thr Ala Val Val Gln

35 40 45

caa caa caa caa cag caa caa caa caa tca caa gta gta cca gca cct 192

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Gln Val Val Pro Ala Pro

50 55 60

gca gga gat gcc caa caa gta atc tca aca caa ccg act agt caa tcc 240

Ala Gly Asp Ala Gln Gln Val Ile Ser Thr Gln Pro Thr Ser Gln Ser

65 70 75 80

gca gca cca ggc gta tca gcc aca cca gca cca aca cct gct gcc gca 288

Ala Ala Pro Gly Val Ser Ala Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ala

85 90 95

gcc gcc cca gca cca gcc atg tcc aaa ctg gaa tac ctc gaa aag ctc 336

Ala Ala Pro Ala Pro Ala Met Ser Lys Leu Glu Tyr Leu Glu Lys Leu

100 105 110

ctt gat ttt tta aaa tcc gct tac gca tgt cac aag cac att ttt gta 384

Leu Asp Phe Leu Lys Ser Ala Tyr Ala Cys His Lys His Ile Phe Val

115 120 125

acc aac tcc acc atg aaa aag gag cta ctc gat cag tac aaa ctt aac 432

Thr Asn Ser Thr Met Lys Lys Glu Leu Leu Asp Gln Tyr Lys Leu Asn

130 135 140

gct gat gag caa aac aaa att aag gaa aat aaa tgc gat gaa ttg gac 480

Ala Asp Glu Gln Asn Lys Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asp Glu Leu Asp

145 150 155 160

ctc ctt tca 489

Leu Leu Ser

<210> 2

<211> 163

<212> PRT

<213> Plasmodium vivax

<400> 2

Lys Ile Glu Ser Met Ile Ala Thr Glu Lys Asn Lys Pro Thr Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Asp Ile Val Ala Lys Gly Gln Ser Leu Arg Gly Ala Ser Glu

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Gly Asn Thr Val Asn Ala Gln Thr Ala Val Val Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Gln Val Val Pro Ala Pro

50 55 60

Ala Gly Asp Ala Gln Gln Val Ile Ser Thr Gln Pro Thr Ser Gln Ser

65 70 75 80

Ala Ala Pro Gly Val Ser Ala Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Pro Ala Pro Ala Met Ser Lys Leu Glu Tyr Leu Glu Lys Leu

100 105 110

Leu Asp Phe Leu Lys Ser Ala Tyr Ala Cys His Lys His Ile Phe Val

115 120 125

Thr Asn Ser Thr Met Lys Lys Glu Leu Leu Asp Gln Tyr Lys Leu Asn

130 135 140

Ala Asp Glu Gln Asn Lys Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asp Glu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Leu Ser

Claims (3)

1. 서열 1로 표시되는 삼일열말라리아원충의 분열소체막단백질(merozoite surface protein)을 코딩하는 DNA서열.
2. 제1항에 있어서, 상기 분열소체막단백질은 삼일열말라리아원충에 의해 발병되는 질환에 대해 항원성을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA서열.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA서열에 의해 코딩되고 서열 2에 의해 표시되는 삼일열말라리아원충의 분열소체막단백질의 아미노산서열.