KR20010040398A - 화학적으로 개질된 돌연변이 효소 및 이를 제조하는 방법및 스크리닝하는 방법 - Google Patents

화학적으로 개질된 돌연변이 효소 및 이를 제조하는 방법및 스크리닝하는 방법 Download PDF

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마가렛 에이.혼
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Abstract

본발명은 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제 및/또는 에스테라제 활성에 대해 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는 것을 포함하는데, 여기서 최소한 시스테인 잔기의 일부는 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시키고, 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제에 대한 기질 및/또는 에스테라제에 대한 기질과 접촉시키고 화학적으로 개질된 돌연변이 효소가 아미다제 및/또는 에스테라제 활성을 나타내는지를 결정함으로써 개질된다. 본발명의 또한 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소 및 이를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 하나 이상의 아미노산이 시스테인 잔기로 대체되고, 시스테인 잔기는 시스테인 잔기 내의 최소한 일부의 티올 수소를 티올 측쇄로 대체하여 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 형성하는 단계를 포함한다. 티올 측쇄는 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 또는 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

Description

화학적으로 개질된 돌연변이 효소 및 이를 제조하는 방법 및 스크리닝하는 방법{CHEMICALLY MODIFIED MUTANT ENZYMES AND METHODS FOR PRODUCING THEM AND SCREENING THEM}
관련된 출원에 대한 상호-참조문헌
본출원은 1998년 1월 23일에 출원된 미국 예비 특허 출원 일련 번호 60/072,266 호에 대한 우선권을 주장하는데, 이 출원은 참고문헌으로서 포함되어 있다.
부위-지향성(site-directed) 돌연변이화에 의해 효소 특성 개질은 천연 아미노산 변형에만 제한되어 왔는데, 최근에는 이러한 제한을 극복하기 위한 분자 생물학적 전략이 개발되었다(Cornish 등, Angew. Chem, Int. Ed. Engl., 34:621-633(1995)). 그렇지만, 이러한 전략은 대부분의 실험실에서 적용하기 어렵다. 대조적으로, 효소의 제어된 화학적 개질은 효소 구조의 용이하고도 융통성있는 개질에 대한 폭넓은 가능성을 부여하고, 이에 의해 효소 특이성의 제어된 개조의 가능성을 확장시킨다.
화학적 개질에 의해 효소 특성을 변경시키는 것은 예전부터 연구되어 왔는데, 그 첫번째 보고는 1966년 Bender 그룹(Polgar 등, J. Am. Chem. Soc., 88:3153-3514(1966)) 및 Koshland 그룹(Neet 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 56:1606-1611(1966))에 의해 행해졌는데, 이들은 서브틸리신 BPN'의 활성부위 세린 잔기를 시스테인으로 화학적 변환(Ch2OH →CH2SH)시킴에 의해 티올서브틸리신을 생성하였다. 합성 가능성을 포함하는 화학적으로 생성된 인공 효소에 대한 관심은 Wu(Wu 등, J. Am. Chem. Soc., 111:4514-4515(1989);Bell 등, Biochemistry, 32:3754-3762(1993)) 및 Peterson(Peterson 등, Biochemistry, 34:6616-6620(1995)), 및, 더욱 최근에는 Suckling(Suckling 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:531-534(1993))에 의해 부활되었다.
효소는 유기 합성에서 유용한 촉매로서 현재 널리 사용된다. 그렇지만, 천연, 야생-형 효소는 대상 합성 화학물의 모든 구조를 받아들이는 것을 기대할 수 없고, 합성에 필요한 소기의 에난티오머적으로 순수한 물질로 입체특이적으로 항상 변환되는 것도 아니다. 효소의 합성 응용성에 대한 이러한 가능성 제한이 인식되어 왔고, 단백질 엔지니어링에 의한 부위 지향성 및 랜덤 돌연변이화 기술을 사용하여 제어적인 방법으로 효소의 특이성을 변경시키는 조작들이 행해져왔다. 그렇지만, 단백질 엔지니어링에 의한 효소 특성 개질은 천연 아미노산 변형물을 생산하는데만 제한되었고, 이러한 제한을 극복하기 위한 분자 생물학적 방법은 통상적인 적용이나 대량 합성에는 용이하게 적용할 수 없다. 효소의 화학적 개질에 의해 얻어지는 새로운 특이성 및 활성의 생성을 위해 수 년동안 화학자들이 연구해왔고 지금도 계속되고 있다.
Bech 등("Bech")에 의한 미국 특허 제 5,208,158 호는 화학적으로 개질된 세제 효소를 기술하는데, 여기서 하나 이상의 메티오닌이 시스테인으로 돌연변이되었다. 시스테인은 산화제에 대한 효소의 향상된 안정성을 부여하기 위해 연이어서 개질된다. 청구된 화학적 개질은 티올 수소를 C1-6알킬로 변형시키는 것이다.
비록 Bech가 돌연변이화 및 화학적 개질을 통하여 효소의 산화 안정성을 변경시키는 것을 기술하였지만, 활성, 친핵 특이성, 기질 특이성, 입체 특이성, 열 안정성, pH 활성 프로필, 및 예를 들면 세제 또는 화학적 합성에 사용하기 위한 표면 결합 특성과 같은 특성이 변형된 하나 이상의 효소를 식별하는 것 또한 요망된다. 특히, 서브틸리신과 같이 펩티드 합성용으로 개조된 효소가 바람직하다. 펩티드 합성용으로 유용한 효소는 높은 에스테라제 활성 및 낮은 아미다제 활성을 갖는다. 일반적으로, 서브틸리신은 이들 조건을 만족시키지 않으며, 서브틸리신의 아미다제 대 에스테라제 선택성의 향상은 서브틸리신의 에스테라제 대 아미다제 선택성의 향상과 마찬가지로 요망된다. 그렇지만, 아미다제 활성을 낮춤으로써 펩티드 합성에 대해 효소를 개조시키는 예전의 시도들은 에스테라제 및 아미다제 활성 모두를 극적으로 감소시키는 결과를 낳았다. 아미다제 활성을 감소시키는 예전의 전략은 수-혼용성 유기 용매의 사용(Barhas 등, J. Am. Chem. Soc., 110:5162-5166(1988); Wong 등, J. Am. Chem. Soc., 112:945-953(1990); 및 Sears 등, Biotechnol. Prog., 12:423-433(1996)) 및 부위-지향성 돌연변이화(Abrahamsen 등, Biochemistry, 30:4151-4159(1991); Bonneau 등, J. Am. Chem. Soc., 113:1026-1030(1991); 및 Graycar 등, Ann. N. Y. Acad. Sci., 67:71-79(1992))를 포함한다. 그렇지만, 에스테라제-대-아미다제 활성의 비는 이러한 방법에 의해 향상된 반면, 절대적인 에스테라제 활성은 동시에 저하되었다. Abrahamsen 등, Biochemistry, 30:4151-4159(1991). 화학적 변조 기술(Neet 등, Proc. Nat. Acad. Sci., 56:1606(1966); Polgar등, J. Am. Chem. Soc., 88:3153-3154(1966); Wu 등, J. Am. Chem. Soc., 111:4514-4515(1989); 및 West 등, J. Am. Chem. Soc., 112:5315-5320(1990))은 비천연 아미노산 부분의 포함도 허용하는데 또한 서브틸리신의 에스테라제에 대한 아미다제 활성을 향상시키는데도 적용되어 왔다. 예들들면, 서브틸리신의 촉매 3조 세린(Ser221)을 시스테인으로(Neet 등, Proc. Nat. Acad. Sci., 56:1696(1966);Polgar 등, J.Am. Chem. Soc., 88:3153-3154(1966); 및 Nakatsuka 등, J. Am. Chem. Soc., 109:3808-3810(1987)), 또는 셀레노시스테인으로(Wu 등, J. Am. Chem. Soc., 111:4514-4515(1989)) 화학적 변환, 및 크로모트립신의 촉매 3조 히스티딘(His57)의 메틸화(West 등, J. Am. Chem. Soc., 112:5313-5320(1990))는 에스테라제-대 -아미다제 선택성에 있어서 상당한 향상을 이룩했다. 그러나 불행히도, 이들 개질법은 절대적인 에스테라제 활성이 50 내지 1000 배 감소하는 것을 수반하였다.
더나아가, 향상된 에스테라제 대 아미다제 선택성을 가진 효소를 식별하기 위한 예전의 시도는 대량의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 요구하는 느린 공정을 유발하였다. 특히, 완전히 특성화된 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 동력학적 상수는 비색 정량 측정법으로 초기 속도를 측정하는 방법에 의해 평가되었다. 아미다제 활성은 테트라펩티드 기질 숙시닐알라닐알라닐프로필페닐알라닐 p-니트로아닐리드(sucAAPF-pNa)의 방출을 뒤따른다. 유사한 티오벤질 에스테르 기질 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라민-티오벤질 에스테르(sucAAPF-SBn)는 크로모겐성(chromogenic) 이탈기를 가지고 있지 않아서, 가수분해의 검출은 티오벤질 이탈기가 5,5'-디티오비스-2,2'-니트로벤조에이트(DTNB, Ellman 시약)와 반응하는 것을 요구한다. 그렇지만, 새로운 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 이러한 방법으로 완전히 특성화 및 동력학적 평가하는 것은 매우 물질 및 시간-소모적이다.
본발명은 이러한 단점을 극복하기 위한 것이다.
발명의 요약
본발명은 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제 및/또는 에스테라제 활성에 대해 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다. 본방법은 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는 것을 포함하는데, 여기서 최소한 시스테인 잔기의 일부는 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시키고, 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제에 대한 기질 및/또는 에스테라제에 대한 기질과 접촉시키고 화학적으로 개질된 돌연변이 효소가 아미다제 및/또는 에스테라제 활성을 나타내는지를 결정함으로써 개질된다.
본발명의 또다른 양상은 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소에 관한 것인데, 여기서 최소한 시스테인 잔기의 일부는 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시킨다. 티올 측쇄는 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 또는 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)일 수 있다.
본발명은 또한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본방법은 하나 이상의 아미노산이 시스테인 잔기로 대체된 효소를 제공하는 단계, 최소한 일부의 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로 대체하여 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 형성하는 단계를 포함한다. 티올 측쇄는 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 또는 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)일 수 있다.
화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제 및/또는 에스테라제 활성에 대해 스크리닝하기 위한 본 방법은 신속한 효소 개질 스크린을 제공하여 새로운 화학적으로 개질된 돌연변이 효소("CMM")를, 새로운 CMM을 다량 제조할 필요없이, 또한 새로운 CMM의 완전 특성화 및 동력학적 평가같은 물질 및 시간-소모없이 찾아낸다.
본발명의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소는 야생-형 효소와 비교하여 증가된 에스테라제 대 아미다제 비를 나타내고, 따라서 더욱 효과적으로 펩티드 합성에 촉매작용한다. 또한, 본발명의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소는 다양한 세제 조성물을 제조하고 동물 사료를 제조하는데 유용하다.
본출원은 화학적으로 개질된 돌연변이 효소 및 이를 제조하는 방법 및 아미다제 및/또는 에스테라제 활성에 대해 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 서브틸리신 Bacilus lentus("SBL")의 시스테인 돌연변이를 화학적으로 개질하여 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 생성하는 것을 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 96-웰 비색 정량 분석기를 도시한다.
도 3은 [kcat/KM에스테라제]/[kcat/KM아미다제] 대 a-g 티올 측쇄 대 화학적으로 개질된 돌연변이의 3차원 플롯으로서, 에스테라제/아미다제 활성에 대한 kcat/KM의 비에 대해 얻어진 결과를 나타낸다. 시약은 도 1에 규정되어 있다.
도 4는 본발명 및 상응하는 완전 특성화 효소의 신속한 조합 분석으로부터의 에스테라제/아미다제 특이성 비의 대조를 도시한다.
본발명은 아미다제 및/또는 에스테라제 활성에 대해 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는 것을 포함하는데, 여기서 최소한 시스테인 잔기의 일부는 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시키고, 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제에 대한 기질 및/또는 에스테라제에 대한 기질과 접촉시키고 화학적으로 개질된 돌연변이 효소가 아미다제 및/또는 에스테라제 활성을 나타내는지를 결정함으로써 개질된다.
바람직하게는, 효소는 프로티아제이다. 더욱 바람직하게는, 효소는 Bacillus 서브틸리신이다. 서브틸리신은 생촉매분해, 특히 키랄 분해, 다관능기 화합물의 레지오선택적 아실화, 펩티드 커플링, 및 글리코펩티드 합성에서 그 수요가 증가되고 있는 알칼린 세린 프로티아제이다. 펩티드 커플링, 및 글리코펩티드 합성에의 적용은 특히 관심사인데, 왜냐하면 서브틸리신이 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입시키기 위한 화학적 개질 및 부위-지향적 돌연변이화에 대한 대안을 제공하기 때문이다. 서브틸리신은 에스테르 기질로부터 시작하여 펩티드 결합 형성에 촉매작용을 할 수 있는데, 먼저 아실 효소 중간체를 형성하고 이것이 1차 아민과 반응하여 펩티드 생성물을 형성하는 것에 의한다. 그러므로 이 적용은 아실 효소 형성을 촉진시키기 위해 높은 에스테라제 활성을 요구하고 소기의 생성물의 펩티드 결합의 가수분해를 최소화하기 위해 낮은 아미다제 활성을 요구한다. 일반적으로, 서브틸리신은 이들 조건을 만족시키고 않으며 향상된 에스테라제 대 아미다제 선택성을 가진 서브틸리신을 식별하는 것이 필요하다.
또한, 바람직하게는, 효소 내에서 시스테인에 의해 대체되는 아미노산은 아스파라긴, 루신, 또는 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 대체되는 아미노산이 효소의 서브사이트 내, 바람직하게는 S1, S1', 또는 S2서브사이트 내에 위치한다. 더욱 바람직하게는, 대체되는 아미노산이 N62, L217, 및 S166인데, 여기서 위치 번호는 Bacillus amyloliquefaciens로부터의 자연-발생적 서브틸리신 또는 Bacillus lentus 서브틸리신과 같은 기타 서브틸리신 내의 동등한 아미노산 잔기에 상응한다.
특히 바람직한 구체예에서, 효소는 Bacillus lentus 서브틸리신이다. 또다른 특히 바람직한 실시예에서, 시스테인에 의해 대체되는 아미노산은 N62, L217, 또는 S166이고 티올 측쇄 그룹은
-SCH2C6H5;
-SCH2(p-CH3C6H4);
-SCH2(p-OCH3-C6H4);
-SCH2(p-COOH-C6H4);
-SCH2C6F5;
-SCH2(p-CF3-C6H4); 및
-SCH2(2,4-디NO2-C6H3)
으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 에스테라제 활성에 대해, 기질에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 비는 약 1M:10M 로부터 1M:108M이다. 가장 바람직하게는 기질에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 비는 약 1M:103M이다.
바람직하게는, 아미다제 활성에 대해, 기질에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 비는 약 1M:10M 로부터 1M:1010M이다. 가장 바람직하게는 기질에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 비는 약 1M:6×103M이다.
"화학적으로 개질된 돌연변이 효소"는 아스파라긴, 루신, 또는 세린과 같은 아미노산 잔기를 시스테인 잔기를 대체시키고 이후 시스테인의 티올 수소를 티올 측쇄 (예를 들면,-SCH2C6H5; -SCH2(p-CH3C6H4);-SCH2(p-OCH3-C6H4);-SCH2(p-COOH-C6H4);-SCH2C6F5;-SCH2(p-CF3-C6H4); 및-SCH2(2,4-디NO2-C6H3))로 대체시킴으로써 변경된 효소이다. 개질 이후, 효소의 특성, 측 활성 또는 기질 특이성은 변경될 수 있다. 바람직하게는, 효소의 활성이 증가된다.
"효소"라는 용어는 자신은 변화하지 않으면서 다른 물질 내에서의 화학적 변화에 촉매작용할 수 있는 단백질을 포함한다. 효소는 야생-형 효소이거나 변형 효소일 수 있다. 본발명의 범위 내의 효소는 풀루라나제(pullulanase), 프로티아제, 셀룰라제, 아밀라제, 아이소머라제, 리파제, 옥시다제, 및 리덕타제를 포함한다. 효소는 야생-형 또는 돌연변이 프로티아제가 될 수 있다. 야생-형 프로티아제는, 예를 들면 Bacillus amyloliquefaciens 또는 Bacillus lentus(또한 BPN'으로 언급됨)으로부터 분리될 수 있다. 돌연변이 프로티아제는 예를 들면, PCT 공개 번호 제 W0 95/10615호 및 W0 91/06637호의 기재에 따라 제조될 수 있는데, 이들 문헌은 참고 문헌으로서 포함되어 있다.
여러 타입의 부분(moiety)이 시스테인 잔기의 티올 수소를 대체하는데 사용될 수 있다. 이들은 -SCH2C6H5; -SCH2(p-CH3C6H4); -SCH2(p-OCH3-C6H4); -SCH2(p-COOH-C6H4); -SCH2C6F5;-SCH2(p-CF3-C6H4); 및-SCH2(2,4-디NO2-C6H3)를 포함한다.
"티올 측쇄 그룹", "티올 함유 그룹" 및 "티올 측쇄"라는 용어는 서로 혼용하여 사용되는 용어이고, 효소 내의 아미노산 중의 하나를 대체하여 사용된 시스테인의 티올 수소를 대체시키는데 사용되는 그룹을 포함한다. 통상, 티올 측쇄 그룹은 상기에서 정의된 티올 측쇄가 시스테인의 티올 황에 부착될 수 있는 황을 포함한다.
효소의 결합 부위는 효소의 표면을 가로지르는 일련의 서브사이트로 구성된다. 서브사이트에 상응하는 기질 잔기는 P로 라벨되고, 서브사이트는 S로 라벨된다. 규칙에 의해, 서브사이트는 S1, S2, S3, S4, S1' 및 S2'로 라벨된다. 서브사이트에 대한 논의는 Siezen 등, Protein Engineering 4:719-737(1991) 및 Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2ed., Freeman:New York, 29-30(1985)에서 찾아볼수 있는데, 이들 문헌은 참고문헌으로서 포함되어 있다. 바람직한 서브사이트는 S1, S1' 및 S2이다.
본발명의 또다른 양상은 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소에 관한 것인데, 여기서 최소한 시스테인 잔기의 일부는 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시킨다. 티올 측쇄는 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 또는 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)일 수 있다.
본발명은 또한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본방법은 하나 이상의 아미노산이 시스테인 잔기로 대체된 효소를 제공하는 단계, 최소한 일부의 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로 대체하여 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 형성하는 단계를 포함한다. 티올 측쇄는 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 또는 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)일 수 있다.
본발명의 아미노산 잔기는 부위-지향적 돌연변이 방법 또는 기타 공지된 방법을 사용하여 시스테인 잔기로 대체될 수 있다. PCT 공개 번호 W0 95/10615호를 참조하는데, 이는 참고문헌으로서 포함되어 있다. 시스테인 잔기의 티올 수소를 개질시키는 방법 중 하나가 실시예에 규정되어 있다.
본발명의 개질된 효소는 약 0.01 내지 약 5 중량%(바람직하게는 0.1% 내지 0.5%)의 수준에서 6.5 내지 12.0 pH를 갖는 공지된 분말 및 액체 세제로 제조될 수 있다. 이들 세제 세척 조성물 또는 첨가물은 또한 공지된 프로티아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제 또는 엔도글리코시다제와 같은 기타 효소뿐만 아니라, 빌더 및 안정화제를 포함할 수 있다.
본발명의 개질된 효소는, 특히 서브틸리신은 다양한 세제 조성물을 제조하는데 유용하다. 다수의 공지된 화합물은 본발명의 개질된 효소를 포함하는 조성물에 유용한 적합한 계면활성제이다. 이들은 Anderson에 의한 미국 특허 제 4,404, 128호 및 Flora 등에 의한 미국특허 제 4,261,868호에 기재된 바와 같은 비이온, 음이온, 양이온, 또는 양성 이온 세제를 포함하는데, 이들 문헌은 참고문헌으로서 포함되어 있다. 적절한 세제 조성은 Caldwell 등에 의한 미국특허 제 5,204,015호의 실시예 7에 기술되어 있는데, 이 문헌은 참고문헌으로서 포함되었다. 본 기술분야에서 세정 조성물로서 사용될 수 있는 여러 조성은 널리 공지되어 있다. 전형적인 세정 조성물에 부가하여, 본발명의 개질된 효소는 천연 또는 야생-형 효소가 사용되는 어떠한 용도에도 사용될 수 있다. 그러므로, 이들 개질된 효소는 예를 들면, 고체 및 액체 비누, 접시보호 조성물, 콘택트 렌즈 세정 용액 또는 제품, 펩티드 생성, 사료 첨가제 또는 사료첨가제의 제조와 같은 용도, 쓰레기 처리, 직물 처리와 같은 직물 용도, 단백질 생성에서의 융합-분해 효소에서 사용될 수 있다. 본발명의 개질된 효소는 세제 조성물 내에서 전구체와 비교하여 향상된 세척 성능을 포함할 수 있다. 본명세서에서 사용된, 세제에서의 향상된 세척 성능은 풀 또는 혈액과 같은 특정의 효소-민감성 얼룩의 세척을 향상시키는 것으로서 정의되는데, 표준 세척 사이클 후의 빛 반사 평가에 의해 결정된다.
본발명의 개질된 효소를 통상의 세정 조성물에 부가하는 것은 특별한 용도 제한을 발생시키지 않는다. 다시 말하면, 세제에 적합한 어떠한 온도 및 pH도 pH가 상기한 범위 이내이고, 온도가 기술된 개질 효소의 변성 온도 이하인 한, 본명의 조성물에도 적합하다. 부가적으로, 본발명에 따른 개질된 조성물은 세제 없이, 빌더 및 안정화제와 조합하여 또는 단독으로 세정 조성물 내에서 사용될 수 있다.
본발명의 또다른 양상은 개질된 효소가 동물 사료, 예를 들면 곡물-원료 사료의 제조에 사용된다. 곡물은 밀, 보리, 옥수수, 수수, 호밀, 귀리, 트리티칼(triticale), 및 쌀 중의 최소한 하나일 수 있다. 비록 곡물-원료 사료의 곡물 성분은 단백질의 공급원을 구성하지만, 사료 내에는 생선-가루, 육류-고기, 또는 야채와 같은 것을 보충적인 단백질 공급원으로서 포함하는 것이 일반적으로 필요하다. 야채 단백질의 공급원은 완전 지방 콩, 평지 씨, 카놀라, 콩-가루, 평지 씨-가루, 및 카놀라-가루 중의 최소한 하나를 포함한다.
본발명의 개질된 효소를 동물 사료 내에 포함시키는 것은 단백 원 재료 수치 및/또는 소화가능성 및/또는 아미노산 함량 및/또는 사료의 소화가능 지수가 증가하는 것을 가능하게 한다. 이는 이전에 동물 사료에서 필요한 성분이었던 대안적 단백질 공급원 및/또는 아미노산 보충물의 양을 감소시키는 것을 가능하게 한다.
본발명에서 제공된 사료는 β-글루카나제, 글루코아밀라제, 만나제, α-갈락토시다제, 피타제(phytase), 리파제, α-아라비노푸라노시다제, 크실라나제, α-아밀라제, 에스테라제, 옥시다제, 옥시도-리덕타제, 및 펙티나제 중의 하나 이상인 기타 효소 보충물을 또한 포함할 수 있다. Bacillus 속으로부터 유도된 서브틸리신과 같은 추가적인 효소 보충물로서 크실라나제를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 크실라나제는 예를들면, PCT 특허출원 제 WO 97/20920 호에 상세히 기술되어 있는데, 이 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로서 포함되어 있다.
본발명의 또다른 양상은 직물을 처리하는 방법이다. 본 방법은 효소 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는데, 여기서 최소한 일부의 시스테인 잔기는 시스테인 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시킴으로써 개질된다. 화학적으로 개질된 돌연변이 효소는 특정 효소-민감성 얼룩에 저항하는 직물을 생성하는데 효과적인 조건하에서 직물과 접촉된다. 이러한 효소 민감성 얼룩은 풀 또는 혈액을 포함한다. 바람직하게는, 직물은 개질된 효소를 포함한다. 본 방법은 예를 들면, 실크 또는 울을 처리하는데 사용될 수 있는데, Research Disclosure 216,044, 유럽 특허 출원 제 134, 267호, 미국특허 제 4,533,359호, 및 유럽특허 출원 제 344,259호와 같은 간행물에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로서 포함되어 있다.
실시예1-아미다제 및 에스테라제활성에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 분석 및 스크리닝에 대한 신속 조합 분석의 검증
96-웰 효소 활성 분석에서, kcat/KM은 저 기질 농도에서 Michaelis-Menten 식의 제한된 경우를 사용하여, 생성물 형성(v) 속도로부터 대략적으로 얻어진다(식1, 식 중 [S] 및 [E]는 각각 기질 농도 및 효소 농도이다):
V≒[S]에 대한 (kcat/KM)[S][E]≪KM
(식1)
효소 스톡 용액은 아미다제 분석에 대해서는 약 5×10-7M에서, 에스테라제 분석에 대해서는 5×10-8M에서 pH 6.5, 2mM CaCl2를 가진 5mM 4-몰폴린에탄설폰산("MES") 내에서 제조되었다. 기질 용액은 디메틸 설폭사이드("DMSO") 내에서 제조되었다. 아미다제 기질 sucAAPF-pNa 스톡은 1.6 mM이었고, 웰 내에서는 0.08 mM이었다. 에스테라제 기질 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-티오벤질 에스테르("sucAAPF-SBn") 스톡 용액은 1.0mM 이었고, 웰 내에서 0.05mM이었다. 분석은 0.005% Tween을 함유한 pH 8.6 트리스 히드록시메틸아미노메탄("Tris") 1.0M 내에서 수행되었다. 에스테라제 분석을 위한 Tris 버퍼는 0.375 nM DTNB를 함유하였다. 이 버퍼는 즉각 사용되어야만 했는데, DTNB가 버퍼의 높은 pH로 인해 몇시간 내에 분해되기 때문이다. Berglund 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6:2507-2512(1996) 및 Berglund 등, J. Am. Chem. Soc., 119:5265-5266(1997)을 참조하는데, 이들 문헌은 참고문헌으로서 포함되어 있다.
각 효소 용액의 샘플(~150μL)을 효소 로딩 판의 1, 5, 또는 9번째 칼럼 내의 웰 내에 두었다. A 내지 G 행은 효소를 함유하였고, H 행은 MES 버퍼를 함유하였다. 별도의 분석 판(Corning, 편평 바닥, 96-웰) 상에, 10μL의 기질 용액 및 180 μL의 버퍼를 작동에 사용되는 칼럼을 따라서 웰 내로 혼합시켰다. 분석 판 상의 칼럼 1-4는 로딩 판의 칼럼 1 내의 효소의 4개의 복제물을 함유하였다; 분석 판 상의 칼럼 5-8는 로딩 판의 칼럼 5 내의 효소의 4개의 복제물을 함유하였다; 분석 판 상의 칼럼 9-12는 로딩 판의 칼럼 9 내의 효소의 4개의 복제물을 함유하였다. 효소 용액 10μL를 로딩 판으로부터 8-채널 피페트를 가진 분석판으로 이동시킴으로써 반응을 개시하였다. 아미다제 분석에 대해서는, 한 번 작동에 대해 네 개의 칼럼을 개시시켰다. 에스테라제 분석에 대해서는, 한 번 작동에 대해 두 개의 칼럼을 개시시켰다. 제 1 칼럼에 대한 효소의 부가 및 판독 개시 사이의 시간 지연은 22-30초(아미다제) 및 10-15초(에스테라제) 이었다. 개시후 곧바로, 판을 Titertech Multiscan MCC340 판독기(동역학적 모드로 프로그램됨, 필터 414 nm, 래그 시간 0.0 분, 간격 5초, 블랭크 행 H의 자동 배경 삭제)(Labsystems, Finland) 상에 놓고, 1.0분(아미다제) 또는 30초(에스테라제) 동안 판독하였다. 판독이 연장됨에 따라, 진행 커브의 대략적인 직선 부분을 지나서(~50% 변환까지)는 속도의 과소평가가 나타났다. 판독기로부터의 출력은 414 nm 분-1에서 5초 간격에서 측정된 프로그램된 총 시간의 흡수율의 평균 속도 변화를 나타낸다. 이들 데이터는 p-니트로아닐리드에 대해서는 e414=8581 M-1cm-1, 3-카복실레이트-4-니트로티오페놀레이트에 대해서는 e141-8708-Mcm-1을 사용하여 Ms-1단위의 속도로 변환시켰다. 두 흡광 계수 모두 분석에서와 동일한 조건 및 동일한 배경 삭제를 사용하여 판독기 상에서 결정되었다. 경로 길이는 5mm 이었다. 속도는 활성 효소 농도에 대해 보정되었고, 각 효소에 대한 네 개의 복제물은 평균값을 구하였다.
표 1. pH 8.6a에서 아미다제 활성에 대해 얻어진 kcat/KM
효소 분석 타입 kcat/KM(s-1mM-1)
WT 큐베트b(스탠다드c) 76±7f
WT 큐베트(저 기질d) 75
WT 96-웰e(저 기질) 75±5f
WT 96-웰(스탠다드) 80±17c
L217C-SCH2C6H5 96-웰(저 기질) 52±6f
L217C-SCH2C6H5 96-웰(스탠다드) 48±3c
L217C-S(CH2)5CH3 96-웰(저 기질) 113±18f
L217C-S(CH2)5CH3 96-웰(스탠다드) 97±12c
a모든 분석은 실온(약 20℃)에서 수행되었다. 1 mL 큐베트 내에서의 분석에 대해,셀 홀더는 20℃로 자동온도 조절되었다.
b1mL 큐베트 내에서의 동역학적 분석
c초기 속도 방법에 의한 완전 효소 동역학, 여기서 kcat/KM은 kcat및 KM값으로부터 얻어졌고, 에러는 kcat및 KM내의 커브-피팅으로부터 얻어졌다.
d저 기질 근사화를 사용한 kcat및 KM측정(텍스트 참조).
e큐베트 대신 마이트로티터 판 상에서 수행된 분석
f4 개의 복제물의 평균±스탠다드 에러
96-웰 분석을 사용하여 얻어진 kcat/KM(아미다제)(표1)의 값은 1mL 큐베트 내에서 실온에서 초기 속도의 방법으로 얻어진 값과 동일하다. 25℃에서 WT 및 CMM 에 대해 얻어진 kcat/KM(아미다제) 값은 실온에서 얻어진 값보다 두 배 높았다. 통상, 큐베트 분석은 25℃에서 수행된다. 20℃에서 완전 동역학적 평가 및 최저 기질 농도(식1)에서의 속도로부터 계산된 값을 사용한 큐베트 내에서 얻어진 kcat/KM값은 동일한데, 저 기질 농도 근사화가 WT에 대해 유지되었음을 나타낸다.
본 방법을 더욱 검증하기 위해, 완전 동역학적 실험이 행을 따라 서로 다른 8 개의 기질 농도 및 하나의 효소/칼럼을 수행함으로써 96-웰 판상에서 수행되었다. 이들 시험으로부터 얻어진 kcat/KM값은 WT 및 두 개의 L217C CMM에 대해 저 기질 근사화로 얻어진 값과 동일한데, CMM에 대해서도 저 기질 근사화가 유지됨을 의미한다. 유사하게 판상에서 얻어진 에스테라제에 대한 kcat/KM값은 스탠다드 분석으로 얻어진 값과 실질적으로 다르지 않았다(표2).
표 2. pH8.6a에서 에스테라제에 대해 얻어진 kcat/KM
효소 분석 타입 kcat/KM(s-1mM-1)
WT 96-웰(저 기질) 3321±256
L217C 큐베트(스탠다드) 5540±798
L217C 96-웰(저 기질) 5563±419
N62C 큐베트(스탠다드) 4380±655
N62C 96-웰(저 기질) 4151±198
N62C-SCH3 큐베트(스탠다드) 1011±1287
N62C-SCH3 96-웰(저 기질) 8739±765
a표1에서와 같은 의미
에스테라제 분석에서, 온도는 상당한 영향을 미치지 않았다.
실시예2-아미다제 및 에스테라제활성에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 스크리닝 및 제조에 대한 신속 조합 분석을 사용한 아미다제 및 에스테라제 활성에 대한 새로운 CMM의 스크리닝 및 96-웰 판 상에서의 새로운 CMM 배열의 생성
새로운 CMM의 소-단위 제조를 위해, 7개의 서로 다른 방향족 메탄티오설포네이트("MTS")시약(1 a-g)(도1) 및 3 시스테인 돌연변이(N62C, L217C 및 S166C)의 조합을 WT 대조구와 더불어 도 2의 상단에 도시된 바와 같은 96-웰 판 상에 세팅하였다. 각 돌연변이에 대한 두 개의 복제물을 각 시약으로 제조하였다. 하나의 시약인 벤질 MTS(1a)는 대 단위 개질에서 이미 평가되었고, 대조 목적으로 포함되었다. 각 웰 내의 반응 혼합물은 20μL의 효소 용액 (5mM MES 내에, 2mMCaCl2, pH6.5, 약 8×105M), 40 μL의 [N-시클로헥실아미노]에탄설폰산("CHES") 버퍼(70mM CHES, 5mM MES, 2mM CaCl2, pH 9.5) 및 10 μL의 MTS 아세트니트릴 내 시약(약 1×102M)으로 구성되었다. 반응 판 상의 블랭크는 20 μL의 MES, 40μL의 CHES 및 10μL의 아세트 니크릴이었다.
반응물은 실온에서 방치되었고, 연이어 두 시간 후 자유 티올 그룹에 대해 테스트되었다. 별도의 판상에, 10μL의 반응 혼합물을 60μL의 DTNB-함유 Tris 버퍼(pH8.6)에 부가시키고, 모니터링 판을 15분 후 414 nm에서 검사하였다. WT 및 개질된 시스테인 돌연변이 사이에서 어떠한 변화도 검출되지 않았는데, 반응이 완결되었음을 나타낸다. 반응을 종결시키고 위해, pH 6.5에서 10μL의 MES를 각 웰에 부가시키고, 각 웰로부터의 20μL의 혼합물을 980μL의 MES 버퍼와 (Eppendorf 튜브 내에서) 희석시켰다. 아미다제 로딩 판은 상기 희석된 혼합물과 함께 제조되었다; 에스테라제 로딩 판은 10μL의 희석된 혼합물 및 90μL의 MES 버퍼와 함께 적절한 웰 내에서 제조되었다. 이후부터, 분석은 실시예 1에서 기술된 것과 동일하다. 각 반응 복제물은 2 중으로 분석되었다. kcat/KM값은 [E]를 부모 돌연변이 내의 활성 효소의 농도에 기초하고 상당한 변성이 없다고 가정하여, 식 1에 따라서 계산되었다. 두 개의 반응 복제물 사이에서 차이가 거의 발견되지 않아서, 각 조합에 대한 4 개의 값은 최종 결과 내에서 평균값을 구하였다.
스크린 내에서 얻어진 N62C-a 및 S166C-a에 대한 아미다제 kcat/KM은 완전 특성화된 효소에 대해 얻어진 것보다 약 2배 낮았고(표3), 실시예 1에서의 이전 분석 검증 결과와 일치하였다.
표 3. 스크린으로부터의 데이터 및 상응하는 완전 특성화된 효소의 대조
효소 시약 아미다제kcat/KM(s-1mM-1)a 아미다제kcat/KM(s-1mM-1)b 에스테라제kcat/KM(s-1mM-1)1 아미다제kcat/KM(s-1mM-1)2
스크린 완전 특성화됨 스크린 완전 특성화됨
WT 121±3 178±15 3890±170 3560±540
N62C 1a 207±13 379±35 6510±560 6330±1360
1c 86±6 93±4 5680±1000 7870±160
1d 74±11 442±36 5780±1410 50700±2160
1e 111±3 198±44 7520±710 14260±590
S166C 1a 10±1 20±1 1160±140 4920±1320
1c 17±1 68±2 1746±120 5798±106
1d 16±1 72±3 2370±91 11460±400
13 14±0 67±3 784±75 5198±145
a네 개의 복제물로부터의 평균±스탠다드 에러, 실온에서 얻어짐(텍스트 참조).
b25℃에서 얻어진 각 kcat및 KM로부터 개산된 값 및 에러
N62C-a 및 S166C-a에 대한 아미다제 kcat/KM값과 WT로부터의 값과 차이 인자는 스크린 및 특성화된 CMM 에 대한 것과 동일한데, 스크린이 아미다제 활성에 대해 보정된 상대 패턴을 보여줌을 나타낸다. 에스테라제에 대해, WT 및 N62C-a에 대한 kcat/KM값은 스크린 및 특성화된 효소 내에서 동일하고(표3), 검증 결과와 일치한다. 그렇지만,S166C-a에 대해서는 스크린이 에스테라제 kcat/KM값보다 ~5-배 더 작았다. S166C-a에 대한 아미다제 값이 과소평가되었다고 주어지면, 불일치의 이유는 상당한 변성이 될 수 없다. 7 개의 WT 대조 처리는 동일한 에스테라제 및 아미다제 활성을 갖는데(따라서 에스테라제/아미다제 비, 도 3), 시약 자체가 서로 다른 변성을 유발하지 않음을 나타낸다.
스크린 결과(도 4)는 N62c-, d 및 e가 WT에 비해서 크게 향상된 에스테라제 활성을 가짐을 암시한다. 166 군에서, 어떤 CMM은 매우 유리한 에스테라제/아미다제 비를 가지는 것으로 나타났다. 217 군의 구성원은 에스테라제 및 에스테라제/아미다제 비에 대해 중간적이다. 이들 결과의 신뢰성을 결정하기 위해, N62C- 및 S166C-c, d, 및 e가 제조되어 특성화되었다. 스크린 및 특성화된 효소로부터의 kcat/KM값은 상당한 변경이 양 CMM에 대해 발생함으로 인해, 4-카복시벤질(d)CMM에 대한 아미다제 및 에스테라제가 모두 스크린 내에서보다 ~5배 작게 나온 4-카복시벤질(d)CMM을 제외하고는 상기에서 논의한 에러 제한 범위 내에서 일치하였다. 활성 효소의 농도는 부모 돌연변이로부터의 예상치보다 4배 더 낮았다. 이러한 문제에도 불구하고, 스크린은 양 4-카복실벤질(d)CMM 모두 S-벤질(a)변이체에 비해 향상된 에스테라제 활성을 가짐을 분명히 보여준다(표3). 더나아가, 스크린은 N62C- 및 S166C-c, d, 및 e에 대한 에스테라제/아미다제 특이성 비가 상당히 향상되었음을 정확히 예측하였다(도 4).
비록 본발명이 예시적 목적으로 상세히 기술되었지만, 이러한 상세함은 예시를 위한 것이고, 다음의 특허청구범위에서 정의된 본발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 변형이 당업자에 의해 행해질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (36)

  1. 시스테인 잔기로 대체된 효소로부터의 하나 이상의 아미노산을 갖고, 최소한 일부의 시스테인이 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로 대체시킴으로써 개질되는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는 단계; 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제에 대한 기질 및/또는 에스테라제에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 및 화학적으로 개질된 돌연변이 효소가 아미다제 및/또는 에스테라제 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는, 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제 및/또는 에스테라제 활성에 대해 스크리닝하기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 화학적으로 개질된 돌연변이 효소는 아미다제활성에 대해 스크리닝되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 화학적으로 개질된 돌연변이 효소는 에스테라제 활성에 대해 스크리닝되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는 단계는
    효소 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체되는, 효소의 시스테인 돌연변이를 제공하는 단계;
    메탄티오설포네이트 시약을 제공하는 단계; 및
    효소의 시스테인 돌연변이, 메탄티오설포네이트 시약, 및 버퍼 용액을 조합시키는 단계를 포함하고, 여기서 시스테인 잔기는 시스테인 자기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로 대체시킴으로써 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 형성하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 시스테인 잔기로 대체된 효소로부터의 하나 이상의 아미노산을 갖고, 최소한 일부의 시스테인이 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로 대체시킴으로써 개질되는 화학적으로 개질된 다수개의 돌연변이 효소를 제공하는 단계;
    다수개의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 아미다제에 대한 기질 및/또는 에스테라제에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 및
    화학적으로 개질된 다수개의 돌연변이 효소가 아미다제 및/또는 에스테라제 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 기질에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 비는 약 1M:10M 내지 1M:108M인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 기질에 대한 화학적으로 개질된 돌연변이 효소의 비는 약 1M:1010M인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 효소가 프로티아제인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 효소가 프로티아제가 Bacillus lentus 서브틸리신인 방법.
  10. 제 1항 있어서, 시스테인으로 대체된 아미노산이 아스파라긴, 루신, 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산인 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 시스테인으로 대체되는 아미노산이 효소의 서브사이트 내에 있는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 서브사이트가 S1, S1',S2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 티올 측쇄 그룹은 -SCH2C6H5,-SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4),-SCH2(p-COOH-C6H4), -SCH2C6F5,-SCH2(p-CF3-C6H4) 및-SCH2(2,4-디NO2-C6H3)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 시스테인 잔기에 의해 대체된 효소로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소로서, 최소한 시스테인 잔기의 일부는 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 티올 측쇄로써 대체시킴으로써 개질되고, 여기서 티올 측쇄는 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 및 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  15. 제 14항에 있어서, 효소가 프로티아제인 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  16. 제 15항에 있어서, 효소가 프로티아제가 Bacillus lentus 서브틸리신 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  17. 제 14항 있어서, 시스테인으로 대체된 아미노산이 아스파라긴, 루신, 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산인 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  18. 제 14항에 있어서, 시스테인으로 대체되는 아미노산이 효소의 서브사이트 내에 있는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  19. 제 18항에 있어서, 서브사이트가 S1, S1',S2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  20. 제 14항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(p-CH3C6H4)인 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  21. 제 14항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(p-OCH3-C6H4)인 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  22. 제 14항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(p-CF3-C6H4)인 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  23. 제 14항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)인 화학적으로 개질된 돌연변이 효소.
  24. 하나 이상의 아미노산이 시스테인 잔기로 대체된 효소를 제공하는 단계 및
    최소한 일부의 시스테인 잔기 내의 티올 수소를 -SCH2(p-CH3C6H4), -SCH2(p-OCH3-C6H4), -SCH2(p-CF3-C6H4), 및 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)로 구성된 그룹으로 선택된 티올 측쇄로 대체하여 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 형성하는 단계를 포함하는 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 생산하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 효소가 프로티아제인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 효소가 프로티아제가 Bacillus lentus 서브틸리신인 방법.
  27. 제 24항 있어서, 시스테인으로 대체된 아미노산이 아스파라긴, 루신, 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산인 방법.
  28. 제 24항에 있어서, 시스테인으로 대체되는 아미노산이 효소의 서브사이트 내에 있는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 서브사이트가 S1, S1',S2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  30. 제 24항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(p-CH3C6H4)인 방법.
  31. 제 24항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(p-OCH3-C6H4)인 방법.
  32. 제 24항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(p-CF3-C6H4)인 방법.
  33. 제 24항에 있어서, 티올 측쇄가 -SCH2(2,4-디NO2-C6H3)인 방법.
  34. 제 14항의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 포함하는 세제 첨가제.
  35. 제 14항의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 포함하는 사료 첨가제.
  36. 제 14항의 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 제공하는 단계 및 효소-민감성 얼룩에 저항하는 직물을 생성하는데 효과적인 조건하에서 상기 화학적으로 개질된 돌연변이 효소를 직물과 접촉시키는 단계를 포함하는 직물 처리 방법.
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