KR20010032401A

KR20010032401A - 지단백질 산화의 억제

Info

Publication number: KR20010032401A
Application number: KR1020007005641A
Authority: KR
Inventors: 마이클 아비람; 찰스 래리 비스가이어; 로저 스코필드 뉴톤; 미라 로젠블라트
Original assignee: 로즈 암스트롱, 크리스틴 에이. 트러트웨인; 워너-램버트 캄파니
Priority date: 1997-11-25
Filing date: 1998-11-04
Publication date: 2001-04-16
Also published as: PE134199A1; WO1999026583A3; ZA9810743B; US6362236B1; KR20050086975A; CO4970835A1; HUP0004396A3; NO20002639D0; IS5413A; TW552137B; UY25268A1; EP1047421A2; HK1033095A1; CN1279605A; WO1999026583A2; AU759376B2; IL135154A0; HUP0004396A2; KR100586754B1; JP2001523694A

Abstract

콜레스테롤 저하제의 히드록실화 유도체는 지단백질의 산화를 억제하고, 심장마비를 포함한 죽종형성의 진행 및 그 결과의 관상 질환을 방지하는데 유용하다.

Description

지단백질 산화의 억제 {Inhibition of Lipoprotein Oxidation}

과지질혈증과 연관된 아테롬성경화 심장 혈관 질병 및 관련 질환 및 질환 증상들은 장애 및 사망의 주요 원인이다. 건강한 포유류 뿐만 아니라 이미 과지질혈증을 경험한 개체들 모두에 있어서, 특정 형태의 콜레스테롤을 낮추는 것은 심장마비, 혈관 질환, 및 기타 아테롬성경화 질환들과 연관된 질환들을 상당히 감소시킬 수 있다고 인식되고 있다.

과지질혈증은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 및 인지질과 같은 혈청 지질의 비정상적 증가를 특징으로 하는 질환이다. 이들 지질들은 혈장내에서 용액으로 자유롭게 순환하지 않고, 단백질에 결합하며, 지단백질이라 불리는 거대분자 복합체로서 수송된다. 지단백질은 밀도에 기초하여 유미지립, 초저밀도지단백질(VLDL), 저밀도지단백질 (LDL), 중간밀도지단백질(IDL), 고밀도지단백질(HDL)의 다섯가지로 분류된다. 과지질혈증의 한 형태는 LDL 콜레스테롤 수준의 상승을 특징으로 하는콜레스테롤과잉혈증이다. 콜레스테롤과잉혈증에 대한 초기 치료는 적절한 물리적 운동과 더불어 저지방 및 저콜레스테롤의 식이요법과, 이어서 식이요법이나 운동만으로는 LDL-저하 목표를 달성할 수 없는 경우 약물 치료가 수반된다. LDL은 통상적으로 ″나쁜″ 콜레스테롤로 알려져 있고, 반면에 HDL은 ″양호한″ 콜레스테롤로 알려져 있다. 비록 LDL 콜레스테롤의 상승된 수준을 낮추는 것이 바람직하더라도, HDL 콜레스테롤의 수준을 증가시키는 것도 또한 바람직하다. 일반적으로, HDL의 증가된 수준은 관상 심장 질환 (CHD)에 대한 위험과 더 낮게 연관된 것으로 알려져 왔다.

LDL 콜레스테롤은 나쁜 것으로 인식되고, 대개의 콜레스테롤 저하제는 LDL 형태의 혈장내 농도를 저하시키는 작용을 하는 반면, 죽종형성의 초기 단계에는 LDL 산화라는 또다른 주요 과정이 있다. VLDL과 HDL의 산화 또한 일어나며, 이들 또한 죽종형성에 기여한다. 산화는 세포내 칼슘을 증가시키고, 에너지 생성을 감소시키며, 사이토킨의 활성, 세포막 손상을 일으켜, 이들 모두는 고사, 괴사 및 궁극적으로 세포 치사를 초래한다.

반응성 라디칼이 LDL 조각상의 다중불포화 지방산으로부터 수소 원자를 흡수할 때 전형적으로 산화가 시작된다. 지질 퍼옥실 및 알콕실 라디칼이 형성되고, 이는 이웃하는 지방산들의 산화를 개시하여 지질 과산화의 연쇄반응이 초래된다. 이러한 산화된 형태의 지단백질은 대식세포에 의해 본래의 지단백질보다 더 빠르게 흡수되며, 이는 대식세포내 콜레스테롤 축적과 이어서 거품 세포 형성 및 조직 대식세포와 내피세포의 운동성의 억제를 초래한다. 이러한 일련의 사건들은 혈관 기능장애와 아테롬성경화 병변의 형성 및 활성을 초래한다.

본 발명자들은 통상적으로 사용되는 콜레스테롤 저하제의 특정 히드록시-치환 유도체가 지단백질에 대한 효과적인 항산화제임을 발견하였다. 이외에, 이러한 화합물들은 또한 지단백질을 산화시키는 메카니즘인 유리 라디칼 스캐빈져 및 금속 이온의 킬레이팅제로 유용하다.

〈발명의 요약〉

본 발명은 히드록실화 콜레스테롤 저하제의 항산화제 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류의 지단백질 산화를 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 히드록실화 콜레스테롤 저하제의 유리 라디칼 스캐빈져 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류의 유리 라디칼 포획 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 히드록실화 콜레스테롤 저하제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 지단백질에 의한 금속 이온 킬레이팅의 억제 방법을 제공한다.

바람직한 실시양태에 있어서, 본 방법은 스타틴, 특히 본원 명세서에서 참고로 인용한 미국 특허 제 5,385,929호에 개시된 화합물인 아토르바스타틴의 히드록실화 형태를 사용하여 수행된다.

다른 바람직한 실시양태에 있어서, 본 방법은 예를 들어, 화학식의 화합물인 히드록실화 겜피브로질의 사용하여 수행된다.

또다른 실시양태에서, 예를 들어 화학식의 화합물인 히드록실화 플루바스타틴을 사용한다.

다른 실시 양태에 있어서, 특별하게는 화학식의 화합물인 히드록실화 세리바스타틴을 사용한다.

다른 바람직한 실시 양태에 있어서, 예를 들어 화학식 의 화합물인 로바스타틴의 히드록실화 유도체들을 사용한다.

본 발명은 지단백질의 산화를 억제함으로써 죽종형성을 늦추거나 정지시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 공지된 콜레스테롤 저하제의 히드록실화 유도체의 용도를 포함한다.

도 1은 아토르바스타틴 및 그의 히드록실화 대사물질들의 구조식을 나타내는 도.

도 2는 겜피브로질 및 그의 히드록실화 대사물질들의 구조식을 나타내는 도.

도 3은 구리 이온 산화계 (A), AAPH 산화계 (B) 및 J-774 A.1 대식세포 산화계 (C)에서 LDL 산화에 대한 아토르바스타틴 및 그의 히드록실화 대사물질들의 효과를 나타내는 도. A 및 B계에서는 37℃에서 4 시간 동안, C 세포에서는 20 시간 동안 약물 또는 그의 대사물질의 농도를 증가시키며 3 개의 산화계에서 LDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시켰다. 반응 종료시에 TBARS 분석에 의해 LDL 산화를 측정하였다. LDL의 대식세포-매개 산화는 세포 존재시 값과 부재시 값의 차로 계산하였다. 결과는 평균±표준편차 (SD)(n=3)로 나타내었다.

도 4는 구리 이온 산화계 (A)와 AAPH 산화계 (B)에서의 VLDL 산화에 대한 아토르바스타틴 및 그의 히드록실화 대사물질들의 효과를 나타내는 도. VLDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 37℃에서 4 시간 동안 아토르바스타틴 또는 그의 대사물질들 (10 μM)과 함께 반응시켰다. 반응 종료시에 TBARS 분석으로 VLDL 산화를 측정하였다. 결과는 평균±SD (n=3)으로 나타내었다.

도 5는 아토르바스타틴 및 그의 히드록실화 대사물질의 유리 라디칼 스캐빈져 활성 (A) 및 구리 이온 킬레이팅능 (B)를 나타내는 도. A. 아토르바스타틴 또는 그의 히드록실화 대사 물질 (20 μM)을 DPPH 1 mM에서 반응시키고, 517 nm에서 흡광도를 동력학적 측정하였다. 유사한 유형을 갖는 3 개의 상이한 연구의 대표적인 실험을 나타냈다. 비타민 E (20 μM)를 유리 라디칼 스캐빈져에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. B. 37℃에서 4 시간 동안 CuSO₄의 농도를 증가시키면서 아토르바스타틴 또는 그의 대사물질들 (10 μM)과 함께 LDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시키고 TBARS 분석에 의한 지단백질 산화를 분석하였다. 결과를 평균±SD (n=3)으로 나타내었다.

도 6은 구리 이온 산화계 (A), AAPH 산화계 (B), 및 J-774 A.1 대식세포 산화계 (C)에서 LDL 산화에 대한 겜피브로질 및 겜피브로질 대사물질 농도의 효과를 나타내는 도. A와 B계에서 37℃에서 4 시간 동안, C 세포에서는 20 시간 동안 약물 또는 그의 대사물질의 농도를 증가시키면서 3 개의 산화계에서 LDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시켰다. 반응의 종료시에 TBARS 분석에 의해 LDL 산화를 측정하였다. LDL의 대식세포-매개 산화는 세포 존재시의 값과 부재시의 값의 차로 계산하였다. 결과는 평균±표준편차 (SD) (n=3)로 나타내었다.

도 7은 구리 이온 산화계 (A) 및 AAPH 산화계 (B)에서 VLDL 산화에 대한 겜피브로질 및 그의 대사물질의 효과를 나타내는 도. 37℃에서 4 시간 동안 겜피브로질 또는 그의 대사물질 (4 μM)과 함께 VLDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시켰다. 반응 종료시에 TBARS 분석으로 VLDL 산화를 측정하였다. 결과는 평균±SD (n=3)으로 나타내었다.

도 8은 아토르바스타틴, 겜피브로질 또는 그의 대사물질들의 존재 또는 부재하의 구리 이온 (10 μM CuSO₄)-유도된 지단백질 산화에 따른 VLDL의 지단백질 전기 영동법을 나타내는 도.

도 9는 겜피브로질 및 그의 대사물질 (B)의 유리 라디칼 스캐빈져 활성 (A), 및 구리 이온 킬레이팅능. A. 겜피브로질 또는 그의 대사물질 (20 μM)을 DPPH 1 mM에서 반응시키고, 517 mm에서 흡광도의 동력학적 측정을 수행하였다. 유사한 유형을 갖는 3 개의 상이한 연구에서의 대표적인 실험을 나타냈다. 유사 농도의 비타민 E를 유리 라디칼 스캐빈져의 대조군으로 사용하였다. B. 37℃에서 4 시간 동안 CuSO₄의 농도를 증가시키면서 겜피브로질 또는 그의 대사물질 (3 μM)과 함께 LDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시키고, TBARS 분석에 의하여 지단백질 산화를 분석하였다. 결과는 평균±SD (n=3)으로 나타내었다.

도 10은 LDL 산화에 대한 겜피브로질의 대사물질 I 및 아토르바스타틴의 오르토-히드록시 대사물질의 배합 효과를 나타내는 도. 37℃에서 4 시간 동안 10 μM의 CuSO₄만 (대조군) 또는 겜피브로질의 대사물질 I (3 μM) 또는 아토르바스타틴 오르토-히드록시 대사물질 (4 μM)만의 존재하에서, 또는 그의 배합하에서 LDL (㎖ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시켰다. 이후, TBARS 분석에 의해 지단백질 산화를 측정하였다.^*P＜0.01 (대조구와 비교), P＜0.01 (대사물질 I과 비교) 및 #P＜0.01 (오르토-히드록시와 비교). 결과는 평균 ±SD(n=3)으로 나타내었다.

도 11은 다중불포화 지방산이 풍부한 세포막 제조물에서 아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질의 투여량 의존적인 항산화 효과를 나타내는 도.

도 12는 아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질, 비타민 E 및 프로부콜의 항산화 효능을 비교한 도.

도 13은 세포막 콜레스테롤이 증가된 아테롬성경화-유사 조건하에서 아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질 및 비타민 E의 항산화 효능을 나타내는 도.

용어 ″히드록실화 콜레스테롤 저하제″는 모구조에 치환된 1종 이상의 히드록시기를 가지고, 항산화 활성을 갖는, 포유류에서 LDL 콜레스테롤 저하에 효과적인 임의의 화합물을 말한다. 그 예는 히드록실화 스타틴류이다. 스타틴류는 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 및 세리바스타틴과 같은 공지된 HMG-CoA 환원효소 억제제들이다. 히드록실화 스타틴류는 1종 이상의 히드록시 치환기를 갖는 모 스타틴 화합물로, 그 예는 도 1에서 나타낸 오르토-히드록시 아토르바스타틴 및 파라-히드록시 아토르바스타틴이다. 기타 히드록실화 콜레스테롤 저하제는 도 2 (대사물질 I)에서 나타낸 히드록실화 겜피브로질과 같은 히드록시 치환 피브레이트이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 히드록실화 화합물은 바람직하게는 페닐 고리에 히드록시기가 부착된 화합물이다.

과지질혈증 환자에게 아테롬성경화증의 위험의 증가는 혈장 지단백질의 산화도가 증가로부터 초래된다. 아토르바스타틴과 같은 3-히드록시-3-메틸-글루타릴 조효소 A (HMG-CoA)환원효소 억제제 및 저트리글리세라이드성 약물 베자피브레이트를 포함하는 저콜레스테롤성 약물 치료는 과지질혈증 환자로부터 분리한 저밀도지단백질 (LDL)의 산화에 대한 감수성의 증가를 감소시키는 반면에, 이러한 항산화 효과는 생체외에서 이러한 약물들로 얻을 수 없다. 하기 실험은 산화(즉, 지질 과산화)에 대한 LDL, VLDL 및 HDL의 감수성에 대한 아토르바스타틴 및 겜피브로질 뿐만 아니라 특정 히드록실화 대사산물들의 효과를 보여준다.

구리 이온 (10 μM CuSO₄), 유리 라디칼 생성계 2'2'-아조비스 2-아미디노 프로판 히드로클로라이드 (5 mM AAPH), 또는 J-774A.1 대식세포-유사 세포주 중 어느 하나에 의해 유도된 지질 과산화는 아토르바스타틴 또는 겜피브로질의 모형태에 의해 억제되지 않았으나, 아토르바스타틴의 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질뿐만 아니라 겜피브로질의 파라-히드록시 대사물질 (대사물질 I)의 약리학적 농도에 의해 농도의존적으로 실질적으로 억제되었다 (57% 내지 97%). 아토르바스타틴 오르토-히드록시 대사물질 및 겜피브로질 대사물질 I을 배합하여 사용하는 경우 LDL 산화도에 대한 부가 억제 효과가 발견되었다. 상기 약술한 산화계에서 산화에 대한 VLDL 및 HDL의 감수성의 경우 상기 대사물질들의 유사한 억제 효과 (37% 내지 96%)를 얻었다. LDL, VLDL, 및 HDL 산화에 대한 이러한 대사물질들의 억제 효과는 그들의 유리 라디칼 스캐빈져 활성 뿐만 아니라, 그들 (주로 겜피브로질 대사물질 I)의 금속 이온 킬레이팅능에 관계될 수 있다. 이외에, HDL 산화의 억제는 HDL-연관된 파라옥소나제 활성의 보존과 관련되었다. 아토르바스타틴 히드록시 대사물질, 및 겜피브로질 대사물질 I은 잠재적 항산화 능력을 가지며, 그 결과 LDL, VLDL, 및 HDL을 산화로부터 보호한다는 것을 데이터는 보여준다. 이와 같이 히드록실화 콜레스테롤 저하제는 그들의 항산화능을 통해서 지단백질의 죽종형성 능력을 감소시키는데 유용하다.

LDL 산화는 초기 죽종형성의 주요 과정이며, 이에 LDL 산화의 억제는 죽종형성을 방지한다. VLDL 및 HDL 산화는 또한 산화 스트레스 동안에 발생하며, 또한 죽종 형성에 기여한다. 항산화제는 환경적으로 뿐만 아니라 유전적으로 유도된다. 예를 들어, 비타민 E, 카로테노이드, 또는 폴리페놀릭 플라보노이드와 같은 식이적 항산화제는 지단백질과 연관되고, 그들을 산화로부터 보호한다. 이외에, HDL-연관된 파라옥소나제와 같은 유전적 요소는 또한 이러한 지단백질을 산화 스트레스와 같은 손상으로부터 보호한다. 콜레스테롤과잉혈증 환자들로부터 유래한 산화에 대한 LDL의 증가된 감수성은 저콜레스테롤혈증 치료에 의해 상당히 감소된다. 따라서, 저지질혈증 치료는 혈장 VLDL, LDL, 및 HDL 수준에 대한 효과 때문만 아니라 죽종형성성 산화된 지단백질의 생성을 감소시킬 수 있기 때문에 유리하게 생각될 수 있다.

LDL 산화의 생체외 억제는 콜레스테롤과잉혈증 환자에 HMG-CoA 환원 효소 억제제인 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 또는 플루바스타틴의 투여 이후에나타났다. LDL 산화도에 대한 이러한 약물들의 억제 효과는 새롭게 합성된 LDL보다 산화하기 쉬운 경향이 있는 혈장의 ″숙성된 LDL″의 제거를 증가시키기 때문이라고 생각된다. 이러한 효과는 간 세포에 있어서 LDL 수용체 활성의 스타틴-유래된 자극 및 간의 VLDL 및 LDL 생성 억제에 대해 부수적일 수 있다. 약물 치료 중에 간에서 생성된 모 스타틴의 대사물질들이 또한 기계적으로 관여될 수 있다. 간의 P450 약물 대사계 활성은 대개는 히드록실화에 의해 모 스타틴 구조를 변경시킨다. 사실상, 치료된 콜레스테롤과잉혈증 피검자로부터 관찰된 혈액 약물 수준에 비교되는 농도에서 시험했을 때 플루바스타틴을 제외한 상기 모든 스타틴류이 생체외 LDL 산화에 대한 직접적인 항산화 효과를 나타내지 않았다. HMG-CoA-환원효소의 새로운 억제제인 아토르바스타틴은 혈장 전체 및 LDL 콜레스테롤 수준 모두를 감소시키는 데 가장 효과적인 스타틴이다. 이러한 화합물은 또한 모든 지단백질 분획에 대해서 상당한 저트리글리세라이드혈증 특성을 가진다. 아토르바스타틴 치료는 LDL 수용체 활성을 증가시키고 지단백질을 함유하는 아포리포단백질 B-100의 직접적인 생성을 억제시킨다. 모약물 및 그의 대사물질들 모두 14 내지 36 시간의 비교적 장주기 반감기를 갖는다. 피브레이트 약물은 또한 산화에 대한 지단백질의 감수성에 영향을 줄 수 있으며, 예를 들어 베자피브레이트는 그러한 능력을 갖는다. 피브르산 유도체들은 트리글리세라이드-풍부 지단백질의 대사를 증진시키며, 이차적으로 지단백질 리파제를 활성화시키고, 아포C-III 합성을 감소시키는 지질 조절 약물이다. 다른 피브레이트, 겜피브로질은 혈장 트리글리세라이드를 감소시킬뿐 아니라, 인간의 혈장 HDL 농도를 증가시키고 수컷 사이노몰거스 원숭이의 혈장 지단백질 (a) 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 인간에서 겜피브로질은 겜피브로질 아실 글루쿠로니드로 대사되고, 이러한 대사물질들은 하기 치료법의 자원자들의 혈장 및 뇨내에서 발견되었다. 겜피브로질-치료된 설치류의 혈장에서 발견된 겜피브로질의 파라-히드록시 대사물질 (대사물질 I)의 수준은 치료된 인간의 수준보다 훨씬 높았으며, 이는 투여량과 대사계 사이의 차이점을 반영한다. 이제 산화에 대한 LDL, VLDL, 및 HDL 감수성에 대한 아토르바스타틴 및 겜피브로질 뿐만 아니라 특정 히드록실화 대사물질 (단독 및 배합)의 효과를 보았다. 그 결과는 혈장 지단백질 산화에 대한 약물 대사물질 (모 약물이 아님) 각각의 억제 효과 및 배합했을 때의 부가적인 효과를 명백하게 입증한다. 데이타는 히드록실화 유도체가 지단백질 산화를 막는데 유용하고, 그로인해 그들의 죽종형성성 능력을 감소시킨다는 것을 보여준다.

하기 상세한 실시예들은 다양한 히드록실화 콜레스테롤 저하제의 항산화 활성을 입증한다.

〈실시예 1〉

재료-아토르바스타틴 및 그의 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질들 (도 1) 뿐만 아니라 겜피브로질 및 그의 대사물질 I (도 2)을 선행기술의 방법으로 합성하였다. 2,2-아조비스2-아미디노프로판 히드로클로라이드 (AAPH)을 Wako Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 1,1-디페닐-2피크릴-히드라질 (DPPH)를 Sigma (St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

지단백질-혈청 VLDL, LDL, 및 HDL을 금식한 정상지질혈증 지원자들로부터 단리하였다. 불연속적인 밀도 구배 초원심분리기로 지단백질을 제조하였다. 지단백질들을 그들의 적합한 밀도 (각각 1.006 g/mL, 1.063 g/mL, 및 1.210 g/mL)에서 세척하고, 4℃에서 염화나트륨 150 mM (pH 7.4)에 투석시켰다. 이후, 지단백질을 여과 (0.45 μM)하여 멸균하고, 4℃에서 암실내 질소하에서 보관하고, 2주 이내에 사용하였다. 산화 연구에 앞서, 지단백질을 4℃의 질소하에서 PBS, pH 7.4인 EDTA 없는 용액에 투석시켰다. 상기 지단백질을 리물루스 아메보시트 라이세트 (Limulus Amebocyte Lysate) 분석 (Cape Cod, Inc; Woods Hole, MA, USA과 연관됨)으로 분석했을 때 지다당류 (LPS) 오염이 없었다. 지단백질 단백질 함량은 표준 방법으로 측정하였다.

지단백질 산화-37℃에서 4 시간 동안 CuSO₄10 μM 또는 AAPH 5 mM과 지단백질 (㎕ 당 단백질 100 ㎍)을 반응시켰다. AAPH는 열적으로 분해되어, 일정한 속도로 수용성 퍼옥실 라디칼을 생성하는 수용성 아조 화합물이다. 산화는 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT) 10 μM를 첨가하고 4℃로 냉각시켜 종결하였다. 표준선으로 말로디알데히드 (MDA)를 사용하는 티오바르비투르산 반응 물질 (TBARS) 분석으로 지단백질 산화량을 측정하였다. 이외에, 지단백질 산화는 또한 365 nm에서 광학적으로 측정할 수 있는 요오다이드를 요오드로 전환시키는 능력으로 지질 과산화물을 분석하는 지질 과산화 시험으로 측정하였다. LDL의 동력학적 산화는 234 nm에서 흡광도의 증가로서 공액된 디엔들의 생성을 측정함으로써 연속적으로 모니터하였다.

대식세포에 의한 LDL 산화- J-774 A.1 쥐 대식세포-유사 세포주를 American Type Culture Collection (Rockville, MD)로부터 구입하였다. 대식세포를 5% 열불활성 송아지 태아 혈청 (FCS)이 보충된 둘베코의 변형 이글스 배지 (DMEM)에서 증식시켰다. 지단백질 산화 연구에서, 세포 (1×10⁶/35 mm 접시)를 반응기내에서 37℃에서 20 시간 동안 CuSO₄2 μM 존재하의 RPMI 배지 (페놀 레드 없이)에서 LDL (mL 당 단백질 100 μg)과 함께 배양하였다. 대조군 LDL은 또한 동일한 조건하에서 무세포계에서 배양하였다. 배양기의 종료시 TBARS 분석으로 배지 (10 분 동안 1000×g에서 원심분리 후)에서 LDL 산화량을 측정하였다. 세포에서 얻은 값과 무세포계에서 얻은 값의 차로 LDL의 세포-매개된 산화를 계산하였다.

지단백질 전기영동법-약물과 함께 또는 약물 없이 지단백질 (mL 당 단백질 100 μg)을 배양한 후 CuSO₄10 μM 존재하에 산화시켰다. 이후, 지단백질의 전기영동법을 히드라겔-리포 키트 (Hydragel-Lipo kit) (Sebia, France)를 사용하여 1% 아가로스에서 수행하였다.

유리 라디칼 스캐빈져능-약물의 유리 라디칼 스캐빈져능을 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질 (DPPH) 분석으로 분석하였다. 각각의 약물 (20 μM)를 DPPH/l (에탄올 중) 0.1 nmol 3 mL과 혼합하였다. 이후, 517 nm에서 광학 밀도 변화에 대한 시간 경과가 동력학적으로 모니터하였다.

파라옥소나제 활성 측정-파라옥손의 가수분해 속도를 25℃, 412 nm에서 p-니트로페놀의 생성을 측정하여 판단하였다. 기초 분석 혼합물은 pH 10.5인 글리신/NaOH 50 mM중의 파라옥손 1.0 mM 및 CaCl₂1.0 mM이었다. 파라옥소나제 활성 1 단위는 분당 p-니트로페놀 1 nmol을 생성한다.

통계 분석-둘 이상의 그룹을 비교할 때 사용된 분산 분석 (ANOVA)과 같이 두 평균을 비교하는데 스튜던트 t-검사를 사용하였다. 데이터를 평균±표준 편차(SD)로 나타냈다.

〈결과〉

산화에 대한 지단백질의 감수성에 대한 아토르바스타틴 및 그의 히드록시 대사물질 뿐만 아니라 겜피브로질 및 그의 대사물질의 효과를 금속 이온 (CuSO₄10 μM)를 함유하는 것, 유리 라디칼 (AAPH 5 mM)을 생성하는 능력을 갖는 것, 및 유사 생물학적 산화 (J-774A.1 대식세포-유사 세포 선)를 포함하는 몇몇의 산화계에서 조사하였다.

아토르바스타틴 및 지단백질 산화-조사된 모든 산화계에서 아토르바스타틴을 제외하고 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 아토르바스타틴 대사물질에 의해 LDL 산화가 억제되었다. 이러한 억제 효과는 농도 의존적이었다 (도 3). 10 μM에서, 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질 모두가 TBARS 분석으로 측정하였을 때 CuSO₄계에서 각각 73% 및 60% (도 3A), AAPH 계에서 각각 44% 및 34% (도 3B), 대식세포계에서 각각 50% 및 46% (도 3C) LDL 산화를 억제시켰다. 연구된 모든 농도 및 모든 산화계에서 오르토-히드록시 대사물질은 파라-히드록시 대사물질보다 더 우수한 LDL 산화 억제제였다 (도 3). 유리 라디칼 생성계 (도 3B)에서 유도된 것에 비교하여 금속 이온 산화계 (도 3A)에서 아토르바스타틴 대사물질 모두의 보다 효과적인 억제 효과를 얻었다. 지단백질-연관된 과산화물을 분석하여 LDL 산화를 측정했을 때, 다른 산화계에서 유사한 결과를 얻었다. 아토르바스타틴의 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질은 CuSO₄계에서 대조군 LDL 710±51로부터 각각 LDL 단백질 192±15 및 284±13 nmol/mg 및 AAPH계에서 대조군 LDL 990±89로부터 각각 LDL 단백질 554±32 및 624±38 nmol/mg으로 LDL-연관된 과산화물 함량을 감소시켰다.

더욱이, 구리 이온 (10 μM CuSO₄)-유도된 LDL 산화 동안의 234 nm에서 공액된 디엔 형성의 동력학적 분석으로 LDL 산화 개시에 요구되는 지연 시간이 대조군 또는 아토르바스타틴-처리된 LDL의 경우 50±7 분 (n=3)이었던 데 비하여 아토르바스타틴 대사물질들 모두의 경우에 LDL 공액된 디엔 형성이 180±25 분 (n=3) 후에야 개시됨을 나타냈다.

VLDL 산화에 대한 아토르바스타틴 및 그의 대사물질들의 효과를 도 4에 나타냈다. 구리 이온 산화계에서, 아토르바스타틴 그 자체만으로는 효과가 전혀 없었던 데 비해, 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질 (10 μM)은 지단백질 산화를 각각 79% 및 37% 정도로 억제하였다 (도 4A). AAPH 산화계에서, 이들 대사물질의 억제 효과는 각각 43% 및 16%였으며, 역시 아토르바스타틴 그자체만으로는 효과가 전혀 없었다 (도 4B). VLDL 산화를 과산화물 생성으로 분석할 때 유사한 결과를 발견했다. 아토르바스타틴의 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질은 대조군 VLDL의 1818±333로부터, CuSO₄계에서 각각 VLDL 단백질 242±22 및 1088±310 nmol/mg, AAPH 계에서 대조군 VLDL의 2169±329로부터 각각 VLDL 단백질 1228±210 및 1819±228 nmol로 VLDL-연관된 과산화물 함량을 감소시켰다. 유사하게, 유사한 반응 조건 하에서 CuSO₄존재시 HDL 산화는 파라-히드록시 대사물질이 약 50% 정도로 지단백질 산화를 억제시키는 데 비해 오르토-히드록시 대사물질은 완전히 HDL 산화를 억제한다는 것을 나타냈다 (표 1). HDL 산화에 대한 이들 대사물질들의 억제 효과는 각각 54% 및 27% 정도의 파라옥소나제의 차단과 연관되어 있다. 첨가된 모 약물의 부재시 산화된 HDL의 파라옥소나제 활성에 비하여 증가된 HDL-연관된 파라옥소나제의 활성이 주목되었다 (표 1).

HDL 산화 및 HDL-연관된 파라옥소나제 활성에 대한 아토르바스타틴 및 그의 대사물질들의 효과.

	CuSO₄-유도된 HDL 산화(nmol/mg HDL 단백질)MDA 과산화물	파라옥소나제 비 활성 (nmol/mg HDL 단백질/분)
대조군아토르바스타틴오르토-히드록시대사물질파라-히드록시대사물질	9.1±0.1 122±149.6±0.5 122±150.2±0.1^9±1^4.5±0.3^65±9^	26±229±440±4^33±3^
^*p＜0.01 (대조군 비교)

지단백질 산화에 대한 아토르바스타틴 대사물질의 억제 효과는 또한 유리 라디칼 스캐빈져 활성 및 금속 이온 킬레이팅능과 관계가 있다. DPPH 분석에서, 아토르바스타틴 (도 5A)을 제외하고 아토르바스타틴의 대사물질들 (20 μM) 모두에 의해 517 nm에서 시간에 따른 흡광도의 감소가 관찰되었다. 300 초의 반응 후, 오르토-히드록시 및 파라-히드록시 대사물질이 517 nm의 흡광도를 각각 37% 및 28%로 감소시켰다. 그에 비해, 유리 라디칼 스캐빈져 항산화제 (비타민 E) 20 μM로 흡광도의 95% 감소가 얻어졌다 (도 5A). 이들 결과는 아토르바스타틴 대사물질이 실질적인 유리 라디칼 스캐빈져능을 가진다는 결과를 보여준다.

과량의 구리 이온이 LDL 산화에 대한 대사물질들의 억제 효과를 극복할 수 있는지를 결정하기 위하여 37℃에서 2 시간 동안 CuSO₄의 농도를 증가시키면서 LDL 반응으로 구리 이온의 킬레이팅에 의해 LDL 산화 억제제로 작용하는 아토르바스타틴 대사물질의 능력을 시험했다 (도 5B). 반응계에 구리 이온의 농도를 증가시키며 첨가하면 대조군 LDL에 비하여 대사물질이 존재할 때 LDL 산화는 단지 작은 증가를 나타냈으며 이는 금속 이온 킬레이팅에 의하여 LDL 산화를 억제시키는 대사물질들의 최소능을 나타낸다 (도 5B).

〈실시예 2〉

겜피브로질 및 지단백질 산화

LDL 산화에 대한 겜피브로질 및 그의 대사물질들 중 하나 (대사물질 I)의 효과를 측정하기 위하여 상기 실험을 실시하였으며, 이는 아토르바스타틴의 경우와 유사했다 (도 3 내지 5). 모든 연구된 산화계에서, LDL 산화는 겜피브로질 그 자체만의 경우는 제외하고 대사물질 I에 의해 억제되었다. 대사물질 I의 이러한 억제 효과는 농도의존적이었다 (도 6). 4 μM의 낮은 농도에서 TBARS 분석에 의해 측정하였을 때 겜피브로질 대사물질 I은 CuSO₄산화계에서 96% (도 6A), AAPH 산화계에서 26% (도 6B), 및 J-774A.1 대식세포-매개된 산화계에서 99% (도 6C)로 LDL 산화를 억제시켰다. 생성된 과산화물의 양으로 LDL 산화를 분석하였을 때 유사한 결과를 얻었다. 겜피브로질 대사물질 I은 LDL-연관된 과산화물을 CuSO₄산화계에서 LDL 단백질을 710±57에서 28±7 nmol/mg으로, AAPH 계에서 917±78에서 708±38 nmol/mg로 감소시켰다. 더욱이, LDL 산화의 개시에 요구되는 시간 (공액된 디엔 생성의 동력학적 분석으로 측정함)은 LDL 단독 또는 겜피브로질 존재시 LDL에 대하여 60±9분의 지연시간을 나타냈다. 대조적으로, 겜피브로질 대사물질 I과 반응시킨 후 240분 후에, LDL에서 공액된 디엔을 관찰할 수 없었다.

또한, VLDL 산화에 대한 겜피브로질 및 그의 대사물질의 효과에 대한 분석은 CuSO₄산화계에서 VLDL 산화 96% 억제 (도 7A), AAPH 산화계에서 91% 억제 (도 7B)로 겜피브로질을 제외하고 대사물질 I (4 μM)의 매우 효과적인 억제 효과를 나타냈다.

VLDL을 아토르바스타틴 및 그의 대사물질들과 산화시킨 후 또는 겜피브로질 및 그의 대사물질의 존재하에서 VLDL의 지단백질 전기영동법은 지단백질 전기영동 이동을 감소시키는 아토르바스타틴 오르토-히드록시 대사물질 및 겜피브로질 대사물질 I의 효능을 분명하게 나타냈다 (도 8). 유사한 결과를 LDL 및 HDL의 경우에서 수득했다.

CuSO₄10 μM 존재하에서 HDL 산화시, HDL-연관된 파라옥소나제 활성의 초기 수준을 유지하면서, 동시에 파라옥소나제 활성을 보호하면서 겜피브로질의 대사물질 I은 실질적으로 지단백질 산화를 억제시켰다 (표 2). 겜피브로질 자체만으로는 효과가 없었다.

약물 10 μM 존재 또는 부재 (대조군)하에서 CuSO₄10 μM로 37℃에서 4 시간 동안 지단백질 산화를 수행했다. 구리 이온과 반응하기 전에 HDL 파라옥소나제 활성은 분당 50±3 nmol/mg HDL 단백질이었다. 결과를 평균±SD (n=3)으로 나타냈다.

HDL 산화 및 HDL-연관된 파라옥소나제 활성에 대한 겜피브로질 및 그의 대사물질들의 효과.

CuSO₄-유도된 HDL 산화 파라옥소나제 비활성(nmol/mg HDL 단백질) (분당 HDL 단백질 nmol/mg)MDA 과산화물

대조군 9.1±0.1 122±14 26±3겜피브로질 8.2±0.4 134±13 27±5대사물질 I 0.8±0.1^*18±4^*50±7^*

^*p＜0.01 (대조군 비교)

겜피브로질 대사물질 I에 의한 지단백질 산화 억제를 담당하는 메카니즘을 분석하여, 이러한 대사물질의 유리 라디칼 스캐빈져능 (도 9A) 및 구리 이온 킬레이팅능 둘 모두를 나타냈다 (도 9B). DPPH 분석을 사용하여, 겜피브로질 자체 (20 μM)를 제외하고 대사물질 I만이 반응 300초 후에 광학 밀도에서 최대 86% 감소로 517 nm에서의 흡광도가 시간에 따른 감소를 나타냈다 (도 9A). 겜피브로질 대사물질 I 존재하에 37℃에서 2 시간 동안 CuSO₄의 농도를 증가시키면서 LDL을 반응시키면 CuSO₄20 μM를 사용하여 대사물질 I의 억제 효과가 완전히 차단되며 이는 LDL 산화계에서 대사물질 I에 의한 구리 이온의 킬레이팅이 지단백질 산화를 억제하는 역할을 함을 나타낸다 (도 9B).

〈실시예 3〉

아토르바스타틴 및 겜피브로질의 상호작용

배합된 효과적인 대사물질 (겜피브로질 대사물질 I 및 아토르바스타틴 오르토-히드록시 대사물질)을 생체외 첨가하는 것이 단독으로 사용했을 때보다 LDL 산화에 대한 억제 효과가 더 큰 것인지를 측정하기 위하여 상기 기술된 일반적인 방법을 반복하였다. 저농도의 겜피브로질의 대사물질 I (3 μM) 또는 아토르바스타틴 오르토-히드록시 대사물질 (4 μM)를 사용하였을 때, 이들 약물들은 대조군 LDL에 비하여 구리 이온-유도된 LDL 산화에 대하여 각각 단지 40% 또는 43%의 억제 효과를 나타내었다 (도 10). 그러나 상기 농도로 이들을 배합하여 사용하였을 때, LDL 산화의 경우 88%의 현저한 부가적인 억제 효과가 관찰되었다 (도 10).

〈실시예 4〉

아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질, 및 공지된 항산화제 비타민 E 및 프로부콜을 다중불포화 지방산이 풍부한 세포막 소포에서 평가하였다. 지질 과산화 실험에서, 세포막 소포 500 ㎕를 1.0 mg DLPC/mL의 농도로 디리놀레오일 포스파티딜콜린 (DLPC)으로 농축시켰다. HEPES 완충액 (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES 0.5 mM, 염화나트륨 154.0 mM, pH 7.3)중에서 농축된 소포를 신속하게 제조하였다. 항산화제를 첨가하지 않고 (대조군), 다양한 농도의 아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질 (1), 비타민 E (2), 4,4'-[(1-메틸에틸이덴)비드(티오)]비스[2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-페닐)-페놀인 프로부콜 (3) 으로 완충액을 제조하였다. 즉시 세포막 소포 용액을 37℃에서 진탕 수조에 방치했다. 반응 (0 내지 72 시간)동안, 분액 샘플 100 ㎕를 제거하고 5.0 mM의 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA) 25 ㎕ 및 35.0 mM의 부틸화 히드록시톨루엔 20 ㎕를 첨가하여 과산화 반응을 종결시켰다. CHOD-요오다이드 (Merck, Darmstadt, FRG, Merck Cat. No. 14106)로 공지된 착색제를 사용하여 혈청 지단백질 내의 지질 과산화물에 대한 분광학적 분석으로 각 샘플의 지질 과산화도를 측정하였다. 착색제는 하기 조성을 갖는다.

칼륨 포스페이트, pH 6.2 0.2 M

칼륨 요오다이드 0.12 M

나트륨 아지드 0.15 μM

폴리에틸렌글리올 모노[p-(1,1',3,3'-테트라메틸-부틸-페닐]에테르 2 g/L

알킬벤질디메틸암모늄 클로리드 0.1 g/L

암모늄 몰리브데이트 10 μM

생성된 트리요오다이드의 농도를 하기 반응식 (L=지단백질)에 따라 분광학적으로 측정하였다.

LOOH + 2H⁺+ 2I^-→ LOH + H₂O + I₂

I₂+ I- → I₃ ^-

회수한 각 세포막 소포의 분액에 CHOD 착색제 1.0 mL를 첨가하고, 샘플을 4 시간 동안 광원 없이 반응시켰다. 용액의 흡광도를 365 nm (ε= 2.4 ×10⁴M^-1cm^-1)에서 측정하였다. 지질 과산화물 형성을 세 번 측정하고, 값을 평균±SD로 나타냈다. 상이한 실험 조건으로부터 유래한 유의 수준을 2-테일드 스튜던트 t-검사를 사용하여 테스트하였다.

아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질의 항산화 활성을 다양한 투여 농도에 대하여 도 11에 나타냈다. 그 결과는 파라-히드록시 화합물은 투여량에 따른 항산화 활성을 가지며 10.0 μM에서 지질 과산화를 80% 억제한다는 것을 보여준다. 10.0 μM와 같이 낮은 농도에서도 파라-히드록시 화합물은 지질 과산화를 높은 수준으로 억제하였다 (＞10²μM).

도 12에 나타낸 결과는 아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질이 기타 공지된 항산화제, 특히 비타민 E와 프로부콜보다 상당히 더 활성이라는 것을 나타낸다.

아토르바스타틴 파라-히드록시 대사물질의 항산화 활성은 세포막 콜레스테롤이 상승된 아테롬성경화-유사 조건하에서 증가했으며, 이는 도 13에 나타난다.

상기 실험은 HMG-CoA 환원효소 억제제, 예를 들어 아토르바스타틴의 대사물질 및 피브르산 유도체, 예를 들어 겜피브로질의 대사물질이 몇몇 산화계에서 지단백질 산화를 상당히 억제한다는 것을 보여준다. LDL 산화는 죽종형성의 주요 사건이며, 이로 인해 대식세포의 콜레스테롤 축적 및 거품 세포 형성 뿐만 아니라 세포독성, 혈전증 및 염증을 발생시키는데 기여한다. 이와 같이 LDL 산화 억제는 아테롬성경화 과정의 완하에 기여한다. 비록 광범위하게 연구되지 않았지만, VLDL 및 HDL 산화 또한 산화 스트레스하에서 발생하며, 또한 아테롬성경화증 발생을 촉진한다. VLDL에 있어서, 지질 과산화는 주로 코어 트리글리세라이드 다중불포화 지방산의 산화에 관련되며, HDL에 있어서, 표면 인지질 지방산은 산화에 민감한 주요 기질이다.

콜레스테롤과잉혈증 및 과트리글리세라이드혈증 환자에 있어서, 높은 혈액 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 농도는 아테롬성경화증의 위험 요소이다. 위험의 증가는 산화에 대한 지단백질의 상승된 감수성에 기인한다. 여러 저지방혈증 약물은 콜레스테롤과잉혈증 환자에 있어서 산화에 대한 LDL의 상승된 경향을 감소시킴을 나타냈다. 이러한 LDL 산화에 대한 억제 효과는 더 산화적 변형되기 쉬운 ″숙성된 LDL″의 제거를 증가 (약물-유도된 증가된 LDL 수용체 활성을 매개로 하여 주로 간에서)시킴으로써 초래할 수 있다. 더욱이 산화에 대한 이러한 보호 효과는 항산화 특성을 가지는 생체내 생성된 약물 대사물질로부터 초래될 수 있다. 그러나, 플루바스타틴을 제외하고, 연구된 저지방혈증 약물의 모 구조 중 어느 것도 생체외에서 약리학적 농도로 시험할 때 LDL 산화에 대한 직접적 억제 효과를 나타내지 않았다. 상기 데이타는 아토르바스타틴 및 겜피브로질과 같은 모 약물이 고농도로 사용될 때 조차 생체외에서 LDL, VLDL, 또는 HDL 산화성에 효과가 없다는 것을 입증한다. 그러나 낮은 약리학적 농도의 특정 히드록실화 대사물질은 금속 이온 -의존계 및 -비의존계 모두에서 LDL, VLDL, 및 HDL 산화에 대한 매우 효과적인 억제 효과를 유도한다. 지단백질 산화성에 대한 약물 대사물질 억제 효과는 AAPH 계에 비하여 CuSO₄계에서 보다 명백하다는 것을 발견했으며, 이러한 현상은 유리 라디칼의 스캐빈져능 및 구리 이온의 결합 모두에 대한 상기 대사물질의 효과에 관계될 수 있다. 겜피브로질 대사물질 I 및 아토르바스타틴의 히드록시 대사물질 모두가 효과적인 유리 라디칼 스캐빈져임을 나타냈다.

아토르바스타틴 오르토-히드록시 대사물질에 비하여, 겜피브로질 대사물질 I은 CuSO₄산화계에서 양호한 금속 이온 킬레이터로 작용한다. 증가된 구리 이온 농도는 LDL 산화에서 아토르바스타틴 대사물질의 경우는 그렇지 않지만 겜피브로질 대사물질 I의 억제 효과를 완전히 제거했다. 히드록시기가 분자의 카르복스아미드 위치에 부착된 아토르바스타틴 히드록시 대사물질의 분자 구조는 이러한 대사물질에 전자 공여자 및 이에 따라 효과적인 항산화제로 작용할 수 있다 (도 1). 오르토-히드록시 대사물질은 아토르바스타틴의 파라-히드록시 대사물질보다 더 효과적인 항산화제이며, 아민기의 오르토 위치의 히드록시기 (파라 위치의 히드록시기는 아님)는 퍼옥실 라디칼의 비교적 안정한 전이 질환을 형성할 수 있어, 효과적인 항산화제로 작용할 수 있다. 유사하게, 겜피브질 대사물질 I (겜피브로질은 아님)에 있어서, 방향족 고리의 히드록시기는 주로 이들 화합물의 항산화능에 실질적으로 기여할 수 있다 (도 2).

산화 스트레스하에서 지단백질 산화는 반응성 산소 종의 작용을 포함하며, 이로 인하여 전이 금속 이온들이 아테롬성경화성 병변의 부위에 존재하는 것으로 공지되어 있으며, 상기 실험에서 사용된 산화 모델은 생체내 상황을 나타낸다.

LDL 산화에 대한 아토르바스타틴 및 겜피브로질 대사물질 모두의 억제 효과는 또한 VLDL 및 HDL에서도 나타난다. 억제의 유형은 모든 연구된 산화계에서 유사했다. 이들 결과는 대사물질은 통상적인 메카니즘, 즉, 유리 라디칼 포획 및 금속 이온 킬레이팅에 의하여 지단백질 산화에 대한 그들의 억제 효과에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 한 연구에서, 유전적으로 조합된 고지질혈증 환자에 있어서 겜피브로질 치료는 LDL 산화성에 상당히 효과적이지 않았다. 그러나 이러한 결과는 LDL 산화에 대한 항산화 효과를 발휘하기엔 약물 대사물질의 농도가 너무 낮았거나 또는 샘플 수집 시간 때문일 것이다. 더욱이 약물 대사물질은 혈장의 비지단백질 성분 (예를 들면 알부민)과 결합되거나 세포 또는 세포 간질의 구획 내에서 격리되었을 수 있다. 따라서, 치료된 인간 또는 실험 동물로부터 분리한 지단백질의 산화 능력의 생체외 검사가 반드시 생체내 지단백질의 환경을 반영하는 것은 아니다.

상기 나타낸 데이타는 히드록실화 콜레스테롤 저하제가 유리 라디칼 포획 및 지단백질의 금속 이온 킬레이팅을 감소시켜 지단백질의 산화를 억제한다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명은 지단백질 산화를 억제시키는 방법 뿐만 아니라 지단백질의 금속 이온 킬레이팅을 억제하는 방법, 및 유리 라디칼을 포획하는 방법을 제공한다. 지단백질의 금속 이온 킬레이팅을 억제하고 유리 라디칼을 포획하는 데 요구되는 히드록실화 콜레스테롤 저하제의 양은 모두 본원 명세서에 ″항산화량″으로 언급되어 있다.

히드록실화 콜레스테롤 저하제는 항산화량, 즉 지단백질 산화의 억제를 일으키는데 유효한 양으로 투여될 것이다. 그러한 항산화 유효량은 약 1 내지 100 mg/kg일 수 있다. 그러한 양의 활성제는 지단백질 산화를 억제하기 위하여 하루에 1 내지 4 차례 투여될 수 있다.

히드록실화 화합물은 편리한 경구 또는 비경구적 투여용으로 제형될 수 있으며, 칼슘 카르보네이트, 칸델릴라 왁스 (candelilla wax), 히드록시프로필 셀룰로오스, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 활석, 및 티타늄 디옥시드와 같은 통상적인 부형제 및 담체와 배합될 수 있다. 경구 투여용으로, 제형은 정제형으로 압출되거나 젤라틴 캡슐로 캡슐화될 수 있다. 전형적인 정제는 활성 성분을 약 10 mg 내지 약 80 mg 함유할 수 있다. 화합물은 이외에 예를 들어, 삼투성 펌프 기술 (osmotic pump technology) 및 경피 피부 패취를 사용하는 서방성 투여 형태로 제형될 수 있다. 비경구 투여용으로, 화합물은 전형적으로 편리한 혈관내 투여 또는 주사용으로 등장성 식염수에 용해된다.

Claims

항산화 유효량의 히드록실화 콜레스테롤 저하제를 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 지단백질 산화의 억제 방법.
제1항에 있어서, 히드록실화 겜피브로질, 히드록실화 아토르바스타틴, 또는 히드록실화 플루바스타틴을 사용하는 방법.
제2항에 있어서, 오르토- 또는 파라-히드록실화 아토르바스타틴을 사용하는 방법.
히드록실화 콜레스테롤 저하제의 유리 라디칼 포획량을 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 유리 라디칼의 포획 방법.
제4항에 있어서, 히드록실화 콜레스테롤 저하제가 오르토- 또는 파라-히드록실화 아토르바스타틴, 히드록실화 겜피브로질, 또는 히드록실화 플루바스타틴인 방법.
히드록실화 콜레스테롤 저하제의 금속 이온 킬레이팅 억제량을 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 지단백질의 금속 이온 킬레이팅의 억제 방법.
제6항에 있어서, 히드록실화 콜레스테롤 저하제가 오르토- 또는 파라-히드록실화 아토르바스타틴, 히드록실화 겜피브로질, 또는 히드록실화 플루바스타틴인 방법.