KR101665180B1

KR101665180B1 - 아포지단백질 a-i 돌연변이체 g59v를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물

Info

Publication number: KR101665180B1
Application number: KR1020140081869A
Authority: KR
Inventors: 박성우; 김동학; 한송희
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-01
Filing date: 2014-07-01
Publication date: 2016-10-14
Also published as: KR20160003961A

Abstract

본 발명은 아포지단백질 A-I의 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 단백질 치료제로써 산화 스트레스를 예방하는데 유용한 작용을 할 수 있는 아포지단백질 A-I의 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 59번째 서열이 글리신(G)으로 치환되고, 173번째 서열이 아르기닌(R)으로 치환된 서열번호 1을 갖는 아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항산화성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.

Description

아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물{Antioxidant Peptide Including ApoA-I mutant protein G59V and Antioxidant Composition Comprising the Same}

본 발명은 아포지단백질 A-I의 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 단백질 치료제로써 산화 스트레스를 예방하는데 유용한 작용을 할 수 있는 아포지단백질 A-I의 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

지질단백질(Lipoprotein)은 단백질의 합성, 지질 구성, 아포단백질(apoprotein) 성분에 따라 아래의 9가지의 아포단백질로 구분되며, 이들 중 소위 좋은 지질단백질이라 불리는 HDL(High Density Lipoprotein)을 이루는 주요 단백질은 아포지단백질(Apolipoprotein) A-I으로 알려져 왔다.

최근 연구들에 의하면 아포지단백질 A-I이 다양한 치료제 요법으로 이용될 수 있는 가능성이 제시되었으며, 특히, 아포지단백질 A-I을 정맥에 주사함으로써 관상동맥 질환에 있어 치료적인 효과를 보고가 다수 있었다. 또한, Nissen 등 (2003)의 보고에 의하면 아포지단백질 A-I의 2가지 돌연변이 단백질인 V156K와 R173C가 항염증/항산화 기능을 촉진한다는 것이 실험을 통해 입증되기도 하였다.

본 발명은 이러한 인간의 아포지단백질 A-I의 전체 유전체 서열 정보를 이용하여 모든 아포지단백질 A-I 유전자의 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 이들의 효소 활성 분석, 단백질 분자 구조 규명 및 유용한 돌연변이 생성을 통하여 새로운 돌연변이체 아포지단백질 A-I을 이용한 항염증 치료약물의 개발 토대를 마련하고자 한다.

등록특허 제10-1131223호 등록특허 제10-0586754호

본 발명은 아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 59번째 서열이 글리신(G)에서 발린(V)으로 치환된 서열번호 1을 갖는 아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항산화성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아포지단백질 A-I의 야생형이나 R173C 돌연변이체보다 항산화 기능이 뛰어난 돌연변이체를 발굴하기 위해 고속-대량 스크리닝 방법을 이용하였다.

또한, 본 발명은 재조합 아포지단백질을 이용하여 LDL 산화 억제 능력을 평가하는 것을 특징으로 하는 아포지단백질 A-I의 항산화 억제 실험방법을 제공한다.

상기 항산화 억제 기능을 갖는 아포지단백질 A-I 돌연변이체는 산화 스트레스로 인한 노화 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.

이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드를 단백질 치료제로 이용하면 산화 스트레스에 대항하는 항산화 조성물을 제공함으로써, 노화 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 발굴된 아포지단백질 A-I의 G59V 돌연변이체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 발굴된 아포지단백질 A-I 야생형 및 돌연변이체의 LDL 산화 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따라 발굴된 아포지단백질 A-I 야생형 및 돌연변이체에 대해 TBARS assay를 수행함으로써 측정한 항산화 능력을 검토한 것이다.

본 발명은 단백질 치료제로써 산화 스트레스를 예방하는데 유용한 작용을 할 수 있는 아포지단백질 A-I의 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 돌연변이체 단백질의 제작

1. 무작위 돌연변이유발 ( Random Mutagenesis )을 이용한 돌연변이 제작

1) 인간의 아포지단백질 A-I의 무작위 돌연변이 라이브러리(random mutant library)는 아래와 같은 프라이머를 이용하여 PCR에 기초한 무작위 돌연변이 라이브러리 클론을 제작하였다. 각 클론은 대략 1~2개의 아미노산 잔기가 변화를 갖는 돌연변이 형성비율을 가지고 있다.

Foward : 5'- cgaatCATATGCACCATCATCATCATCATaaagctgcgg-3'

Reverse : 5‘- cgacctAAGCTTtcactggg -3'

Mutation Frequency ( mutations / kb ) : 0 - 4.5

2) DNA 제한효소를 이용하여 단백질 발현 벡터에 클로닝한 후, 완성된 클론을 DNA 염기서열분석을 통해 변화된 돌연변이의 위치를 확인하였다.

2. 지정 돌연변이유발 ( Site - Directed Mutagenesis )을 이용한 돌연변이 제작

1) 기존에 알려진 항산화기능이 향상된 아포지단백질 A-I milano 돌연변이의 경우 173번째 아르기닌(Arg) 잔기가 시스테인(Cys)으로 변화된 클론으로, 본 연구에서는 지정 돌연변이유발 방법을 이용하여 야생형의 아포지단백질 A-I과 더불어 대조군으로써 R173C 돌연변이 클론을 제작하였다.

2) 인간의 아포지단백질 A-I의 R173C 돌연변이 DNA는 아래의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 제작하였다.

R173C ( ApoA - I _milano ) 프라이머

Foward : 5‘-CTGCGCCAGTGCTTGGCC-3'

Reverse : 5‘-GGCCAAGCACTGGCGCAG-3'

3) PCR 결과 완성된 R173C 돌연변이 클론은 DNA 염기서열분석을 통해 DNA 서열을 확인 후, 단백질 발현 벡터에 클로닝하였다.

< 실시예 2> 고속-대량 스크리닝( High - throughput screening )을 이용한 항산화 기능이 향상된 아포지단백질 A-I의 돌연변이체 발굴

1. 고속-대량 스크리닝 (High-throughput screening)

1) 무작위 돌연변이 유발을 통해 제작된 돌연변이 라이브러리의 활성을 측정하기 위해 TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substance) assay에 기초한 고속-대량 스크리닝 시스템을 이용하였다.

2) 제작된 무작위 돌변변이 라이브러리의 항산화 능력을 측정하는 방법은 다음과 같다.

3) 먼저, BL21 ( DE3 ) pLysS 대장균에 제작된 무작위 돌연변이 라이브러리를 형질전환(transformation) 시킨 뒤 각각의 형성된 콜로니를 96-well plate에서 약 하루 동안 37°C에서 220rpm으로 키운다. 그 뒤 2mM IPTG를 첨가한 후 37°C에서 220rpm으로 약 5시간 동안 균을 키운다.

4) 과발현된 단백질을 이용하여 TBARS assay를 수행하기 위해 먼저 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거한다. 원심분리 후 세포 하층액에 50mM Kpi와 200mM CuSO₄를 첨가 후 균일하게 잘 섞어준 뒤 4시간 동안 37℃에서 반응시킨다. 그 뒤 TBA 용액을 넣고 1시간 동안 37°C에서 반응시킨 뒤 517nm 또는 532nm에서 흡광도를 측정한다.

5) 이 방법으로 약 2000개 이상의 무작위 돌연변이 라이브러리 중에서 1차적으로 선별된 돌연변이는 약 100개이며, 이들은 항산화 능력이 야생형의 아포지단백질 A-I에 비해 30-40% 뛰어난 결과를 보였다. 반복된 실험을 통해 100개의 돌연변이 중에서 또다시 30개의 돌연변이를 선별하였고, 최종적으로 가장 높은 항산화 능력을 보인 G59V 돌연변이체를 이용하여 추가 실험을 시행하였다.

6) 아포지단백질 A-I의 G59V 돌연변이체의 아미노산 서열번호는 다음과 같다.

< 서열번호 1 >

< 실시예 3> 아포지단백질 A-I 단백질의 발현 및 정제

1. 아포지단백질 A-I 야생형 및 돌연변이체 단백질의 발현

대장균 BL21 ( DE3 ) pLysS 를 이용하여 아포지단백질의 과발현을 수행하였다. DNA 서열이 확인된 아포지단백질 A-I 야생형 및 돌연변이체 DNA를 각각 대장균 BL21(DE3) pLysS에 형질전환 (transformation) 시킨 뒤, 각각의 형성된 콜로니를 하루 동안 소량의 LB 배지에서 미리 배양을 한 후에 대량의 LB 배지에서 IPTG를 첨가하고 5시간 추가 배양하였다. 배양종료 후 대장균에서 과발현된 아포지단백질 A-I은 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

2. 아포지단백질 A-I 야생형 및 돌연변이체 단백질의 정제

과발현된 아포지단백질 A-I의 분리 및 정제는 니켈 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 His-tag을 갖는 단백질을 일차 분리하였고, 추가적인 정제 과정을 수행하기 위해 단백질의 크기별로 순수분리가 가능한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하였다. 정제된 단백질의 농도를 높여주기 위해 추가적으로 농축과정을 거쳐 SDS-PAGE를 통해 정제된 아포지단백질 A-I의 순수분리를 검증하였다.

< 실시예 4> 아포지단백질 A-I 변이체 단백질의 항산화 능력 측정

1. LDL 산화 억제 활성 측정

구리-매개 LDL 산화에 대한 항산화 활성을 검토하기 위해서 각각의 정제된 아포지단백질 A-I 150nM을 50μg의 LDL과 40μM의 CuSO₄ 존재 하에 120분간 반응시켰다. 반응물을 잘 혼합한 후 자외선 가시광선 분광광도계(UV-Visible spectrophotometer)를 사용하여 24.5℃에서 234nm의 흡광도로 매 15초 간격으로 값을 읽어 시간이 경과함에 따라 아포지단백질 A-I에 의해 감소되는 공액 이중결합(conjugated dienes)의 양의 경향을 비교하였다.

그 결과, 도 2와 같이 G59V 돌연변이체는 야생형의 아포지단백질 A-I보다 더 억제되고 R173C 돌연변이체와는 유사한 양의 공액 이중결합을 함유하였다. 이로써 G59V 돌연변이체가 야생형의 아포지단백질 A-I보다 더 뛰어난 LDL 산화 억제 활성을 보였음을 확인하였다.

2. TBARS assay

구리-매개 LDL 산화에 대한 또 다른 항산화 활성의 검토 방법으로 TBARS assay (Thiobarbituric Acid Reactive Substances)를 수행하였다. 정제된 아포지단백질 A-I 50nM을 40μM의 CuSO₄존재 하에 50μg의 LDL과 혼합하여 준비하였다. 혼합물은 4시간 동안 37℃에서 반응시킨 뒤 TBA(Thiobarbituric acid)를 넣고 산화 억제능력을 측정하였다. 일반적으로 TBA는 산화 스트레스를 받으면 이중결합 구조를 형성하는데 이 구조는 517nm에서 특이적인 흡광을 나타낸다. 따라서, 아포지단백질 A-I의 항산화 활성은 억제된 흡광도의 값을 측정함으로써 결정할 수 있다.

도 3과 같이, G59V 돌연변이체는 야생형 및 R173C 돌연변이체보다 각각 1.9배 및 1.5배 감소된 TBA 이중결합체를 함유하였다. 이는 G59V 돌연변이체가 야생형 및 R173C 돌연변이체보다 산화 억제 능력이 높다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 단백질 치료제로 이용하면 산화 스트레스로 인한 노화 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.

상기에 제시된 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 고안을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 고안에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Antioxidant Peptide Including ApoA-I mutant protein G59V and Antioxidant Composition Comprising the Same <130> WP-2014-0208 <140> 10-2014-0081869 <141> 2014-07-01 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Val Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *** 260 265

Claims

59번째 서열이 글리신(G)에서 발린(V)으로 치환된 서열번호 1로 이루어진 아포지단백질 A-I 돌연변이체 G59V를 포함하는 항산화성 펩타이드.
제1항의 항산화성 펩타이드를 포함하는 항산화 조성물.