KR20010024603A

KR20010024603A - 필수 세균 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20010024603A
Application number: KR1020007005037A
Authority: KR
Inventors: 크리스챤 프릿츠; 필립 영맨; 루즈-마리아 구즈맨
Original assignee: 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2001-03-26
Also published as: JP2002524069A; IL136005A0; CA2309212A1; WO2000014200A9; US6627747B1; WO2000014200A3; EP1030685A2; US6749858B2; WO2000014200A2; AU5822399A; US20030096267A1; EP1030685A4

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에서 발견되며, 광범위한 세균들의 생존에 필수적인, "yphC" 및 "yqjK"로 불리워지는 2개의 유전자에 관한 것이다. 상기 유전자들 및 이들이 코드화하는 필수 폴리펩타이드들 그리고 이들의 상동체(homolog) 및 오솔로그(ortholog)는 광범위한 스펙트럼의 세균성 감염 치료용 항균제를 동정하는데에 사용될 수 있다.

Description

필수 세균 유전자 및 그의 용도{ESSENTIAL BACTERIAL GENES AND THEIR USE}

[관련 출원에 대한 참조]

본원은 35 U.S.C. §119(e)에 의거 1998년 9월 9일에 출원된 미국특허출원 60/099,578호를 우선권 주장의 기초로 하는 출원으로서, 상기 미국툭허출원은 본원에 전문이 첨부되어 있다.

세균성 감염은 피부, 피하 또는 전신으로 감염될 수 있는 것이다. 기회감염성(opportunistic) 세균 감염은 특히 면역 체계를 타협시키는 AIDS 또는 기타 질병으로 고통받는 환자들에서 증식한다. 인간에 대해 병원성인 세균들의 대부분은 그램-양성 세균이다. 예를 들어, 세균 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)는 통상적으로 기관지를 침투하여 분획성 폐렴(lobar pneumoniae) 및 연막염, 정맥동염 및 기타 감염성 질환을 일으킨다.

[발명의 요약]

본 발명은 그램 양성 세균인 스트렙토코커스 뉴모니아에에 존재하며 상기 세균 및 기타의 세균의 생존에 필수적인 2개의 유전자를 발견한 것에 기초한다. 기능성인 yphC 및 yqjK 유전자가 결여된 스트렙토코커스 뉴모니아에는 생존할 능력이 없기 때문에 편의상, 이들 유전자 yphC 및 yqjK 모두를 본원에서는 "필수 유전자(essential gene)"라 부르기로 하고 상기 유전자들에 의해서 코드화되는 폴리펩타이드를 "필수 폴리펩타이드(essential polypeptide)"라고 한다.

상기 yphC 및 yqjK 유전자는 병원성 미생물내 유사한 유전자를 동정하는 분자성 도구(molecular tools)로 유용하다. 상기 유전자들이 코드화하는 필수 폴리펩타이드는 이것이 발현되는 병원체의 억제 물질인 화합물을 동정하는 타겟으로서 유용하다. 이러한 화합물은 필수 단백질의 활성을 감소시키거나 또는 필수 유전자의 전사 또는 상기 필수 유전자로부터 전사된 mRNA의 해독을 감소시킴으로써 세균의 성장을 억제시킬 수 있다.

따라서 본 발명은 도 1에 도시된 서열 2인 아미노산 서열을 갖는 분리된 yphC 폴리펩타이드 또는 이들의 보존적 변이체(conservative variation)를 특징으로 한다. yphC를 코드화하는 분리된 핵산은 본 발명의 범주내에 포함된다. 뿐만 아니라, 본 발명은

(a)도 1에 도시된 서열 1의 서열을 갖는 분리된 핵산 또는 이들의 퇴행성 변이체(degenerative variants);

(b)서열 1의 서열을 갖는 분리된 핵산 또는 이들의 퇴행성 변이체로서 T가 U로 치환된 퇴행성 변이체;

(c)(a) 및 (b)에 상보적인 핵산; 및

(d)길이가 15 염기쌍 이하이고 하기한 바와 같이, 엄격한 조건하에서 서열 2의 폴리펩타이드를 코드화하는 게놈성 DNA에 혼성화되는 (a), (b) 및 (c)의 단편들을 포함한다. 도 1에 도시된 상기 yphC 폴리펩타이드는 도 2a-2b에 도시된 전체 길이 폴리펩타이드의 일부 서열이다.

본 발명은 또한 상기 도 2a-2b에 도시된 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 분리된 yphC 폴리펩타이드 또는 이들의 보존적 변이체를 특징으로 한다. 전체 길이의 yphC를 코드화하는 분리된 핵산은 본 발명의 범주내에 포함된다. 뿐만 아니라, 본 발명은

(a)도 2a-2b에 도시된 서열 4의 분리된 핵산 또는 이들의 퇴행성 변이체;

(b)서열 4의 서열을 갖는 핵산 또는 이들의 퇴행성 변이체로서, T가 U로 치환된 퇴행성 변이체; 및

(c)(a) 및 (c)와 상보적인 핵산을 포함한다.

yphC에 대하여 상술한 바와 같이, 본 발명은 yqjK를 코드화하는 분리된 핵산을 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명은

(a)도 3에 도시된 서열 7의 서열을 갖는 분리된 핵산 또는 이들의 퇴행성 변이체;

(b)서열 7의 서열을 갖는 분리된 핵산 또는 이들의 퇴행성 변이체로서 T가 U로 치환된 퇴행성 변이체;

(c)(a) 및 (b)에 상보적인 핵산; 및

(d)길이가 15 염기쌍 이하이고 하기한 바와 같이, 엄격한 조건하에서 서열 8의 폴리펩타이드를 코드화하는 게놈성 DNA에 혼성화되는 (a), (b) 및 (c)의 단편들을 포함한다. 상기 서열들을 표 1에 요약하였다.

필수 핵산 또는폴리펩타이드	도면 번호	아미노산서열	코드화 유전자서열	비-코드화 유전자서열
yphC-부분 서열	1	2	1	3
yphC-전체 길이	2a-2b	5	4	6
yqjK	3	8	7	9

(▲필수 핵산 및 폴리펩타이드)

상기 유전자들을 동정함으로써 동일한 종에 속하는 다른 균주에서 필수 유전자들의 상동체들을 발견할 수 있고 다른 유기체(예를 들어, 바실러스 종, 에치. 인플루엔자, 에치. 피로리 및 이. 콜라이)에서 필수 유전자의 오솔로그(orthologs)를 발견할 수 있다.

"상동체(homologs)"란 스트렙토코커스 종에 포함된 구조적으로 유사한 유전자들을 말하는 반면에, "오솔로그(ortholog)"란 예를 들어 표준적 상보성 검정법(complementation assay)에서 결정된 바와 같은, 다른 종의 균주들로부터 얻어진 기능적으로 동등한 유전자를 말한다. 그러므로, 상기 필수 유전자는 다른 스트렙토코커스 균주의 유사한 유전자를 동정하는 모델이 될 뿐만 아니라, 다른 종(예를 들어, 기타 그램 양성 세균, 구체적으로 사람에 대해 병원성인 세균)에서의 필수 유전자의 상동체 및 오솔로그를 동정하는데에 사용될 수 있다. 이와 같은 오솔로그(ortholog)는 예를 들어, 종래의 상보성 검정법을 통하여 동정될 수 있다. 뿐만 아니라, 또는 이와는 달리, 이러한 오솔로그(ortholog)는 예를 들어 ftp://ftp.cme.msu.edu/pub/RDP/SSU_rRNA/SSU/Prok.phylo에 제시된 바와 같은 계통수의 동일한 가지에 있는 세균에 속할 것이라고 예상할 수 있다. 예를 들어, 비. 서브틸리스(B.subtilis)는 그램 양성 세균문의 바실러스-락토바실러스-스트렙토코커스 부문내 비.서브틸리스 그룹의 비.서브틸리스 하위 그룹에 속한다.

이와 유사하게, 에스.뉴모니아에(S.pneumoniae)는 스트랩토코싸이(Streptococci)의 스트렙토코커스 뉴모니아 하위 그룹에 속하는 것으로서 이는 또한 그램 양성 세균 문의 바실러스-락토바실러스-스트렙토코커스 부문에 속한다. 이. 콜라이는 퍼플 세균(Purple bacteria)의 감마 하위 부문에 속하는 엔테릭스(Enterics) 및 이와 관련된 세균인 에스케리치아 살모넬라 그룹에 속한다. 동일 문에 속하는 다른 세균(구체적으로, 동일한 하위 부분, 그룹 또는 하위 그룹에 속하는 세균)은 본원에 기술된 yphC 및/또는 yqjK 유전자를 포함할 것으로 예상된다.

스트렙토코커스 yphC 및 yqjK 유전자의 예를 표 2에 요약하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 스트렙토코커스 유전자 yphC는 비.서브틸리스에서 "B-yphC"라는 오솔로그를 가지며, 이.콜라이에서 "yfgK" 또는 "f503"으로도 알려져 있는 오솔로그를 갖는다. 스트렙토코커스 유전자 yqjK는 또한 비.서브틸리스에서 "B-yqjK"라는 오솔로그(ortholog)를 가지며 이.콜라이에서 "elaC" 또는 "O311"로도 알려져 있는 오솔로그를 갖는다. 하기된 바와 같이, 필수 유전자의 오솔로그는 그들 자체가 그들이 발견되는 유지체내에 필수적이거나 또는 비필수적일 수 있다.

후술하는 실험에 의하여 결정된 바와 같이, B-yphC, yfgK, 및 B-yqjK 오솔로그는 그들이 발견되는 세균의 생존에 필수적이다. 그러므로, 상기 필수 오솔로그 유전자들 및 상기 오솔로그에 의하여 코드화되는 폴리펩타이드는 숙주 유기체의 성장을 억제하는 화합물(예를 들어, 필수 단백질의 활성을 저해하거나 필수 유전자의 전사를 억제하는 화합물)을 동정하는데에 이용될 수 있다.

핵산 또는폴리펩티드	오솔로그	오솔로그의도면 번호	오솔로그의아미노산서열	오솔로그의핵산서열	오솔로그의비-코드화 서열서열
yphC	비.서브틸리스B-yphCGenBank접속 번호Z99115	4a-4b	11	10	12
yphC	이.콜라이yfgKGenBank접속 번호AE000337	5a-5b	14	13	15
yphC	비.서브틸리스B-yqjKGenBank접속 번호Z99116	6	17	16	18
yphC	이.콜라이elaCGenBank접속 번호AE000316	7	20	19	21

(▲yphC 및 yqjK의 오솔로그)

본 발명은 항균제를 동정하는데에 사용되는 필수 세균 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

도 1은 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 균주로부터의 yphC 폴리펩타이드 및 yphC 유전자의 코드화 및 비코드화 가닥들의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 2, 1 및 3).

도 2a-2b는 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 균주로부터의 yphC 폴리펩타이드 및 yphC 유전자의 코드화 및 비코드화 가닥들의 전체 길이 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 5, 4 및 6).

도 3은 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 균주로부터의 yqjK 폴리펩타이드 및 yqjK 유전자의 코드화 및 비코드화 가닥들의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 8, 7 및 9).

도 4a-4b는 비. 서브틸리스(B. subtilis) 균주로부터의 B-yphC 폴리펩타이드 및 B-yphC 유전자의 코드화 및 비코드화 가닥들의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 11, 10 및 12).

도 5a-5b는 이. 콜라이(E. coli) 균주로부터의 yfgK 폴리펩타이드 및 yfgK 유전자의 코드화 및 비코드화 가닥들의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 14, 13 및 15).

도 6은 비. 서브틸리스(B. subtilis) 균주로부터의 B-yqjK 폴리펩타이드 및 B-yqjK 유전자의 코드화 및 비코드화 가닥들의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 17, 16 및 18).

도 7은 이. 콜라이(E. coli) 균주로부터의 elaC 폴리펩타이드 및 유전자의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 도면이다(각각 서열 20, 19 및 21).

도 8은 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)내의 필수 유전자들의 표적화 결실들(targeted deletions)을 위해 이용된 DNA 분자들을 제조하는데 사용된 PCR 방법의 개략도이다.

도 9는 스트렙토코커스 뉴모니아에내의 필수 유전자들의 표적화 결실들(targeted deletions)을 만드는데 사용된 방법의 개략도이다.

도 10은 비. 서브틸리스내의 yphC 및 yqjK의 비극성 유전자 결실들(nonpolar gene deletions)을 수득하는데 이용된 방법의 개략도이다.

도 11a-11c는 yphC 및 yqjK 유전자들의 조건성 널 돌연변이체(conditional null mutant)의 제조에 이용된 방법의 개략도이다.

도 12는 이. 콜라이내의 필수 유전자의 결실을 만드는 방법의 개략도로, 에스. 뉴모니아에 yphC 유전자의 오솔로그(ortholog)인 이. 콜라이 yfgK 유전자의 필수 표현형(essential phenotype)을 보여준다.

세균 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)내의 적어도 두 개의 유전자들은 이러한 세균의 생존에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 이들 소위 필수 유전자들, yphC 및 yqjK 유전자들은 이하에서 필수 폴리펩타이드(essential polypeptide)로 명명한 것을 코드화한다. yphC 및 yqjK 유전자들은 바실러스의　병원성　균주와　같은　병원성　미생물들에　존재하는 유사한　유전자들을　동정하는　유용한　수단이다．필수　폴리펩타이드들은　필수　폴리펩타이드들이　발현되는　병원체들의　억제제로 기능하는 화합물들을　동정하는　유용한　표적이다．

본원에 기술된 yphC 폴리펩타이드 및 유전자는 본원의 도 1-도 2b에 도시한 폴리펩타이드 및 아이소자임, 변이체 및 도 1-도 2b에 도시한 서열들의 보존적 변이체를 포함한다. 본 발명은 yphC 및 yqjK의 다양한 아이소자임을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자를 포함하면서, 결과적으로 수득되는 필수 폴리펩타이드가 이의 생물학적 기능을 보유한다면, 하나 이상의 점 돌연 변이, 결실 또는 프로모터 변이체를 포함하는 유전자를 갖는다.

상기 yphC 폴리펩타이드는 공지의 GTPase의 구조적 특성을 갖는다. BLAST 분석법을 사용할 경우, 상기 yphC 폴리펩타이드는 GTPase 도메인으로 추측되는 2개의 도메인을 포함하는 것으로 나타나며, yphC는 시험관내(in vitro)에서 GTPase 활성을 나타낸다. 상기 GTPase 활성은 yphC 폴리펩타이드와 필수적으로 연관되어 있다. 돌연 변이체가 GTP와 결합하지 못하도록 yphC의 각각의 GTPase 도메인에 점 돌연변이가 발생하였을 경우, 이와 같은 돌연 변이체는 yphC가 결여된 세균 균주와 더이상 상보적이지 않다. 상기 yqjK 폴리펩타이드는 공지의 설파타제의 구조적 특성을 갖는다. 그러므로, 도 1- 도 2b에 도시한 yphC 및 yqjK 서열의 다양한 아이소자임, 변이체 및 보존적 변이체는 예를 들어, GTPase 또는 설파타제 활성에 대한 검정법 또는 종래의 상보성 검정법에서 결정된 yphC 또는 yqjK의 생물학적 기능을 보유한다. 적당한 GTPase 및 설파타제 활성 검정법은 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, 본원에 참조 문헌으로 포함되어 있는 Bollag 외 다수, Meth. Enzymol. 255:161 (1995) 및 Barbeyron 외 다수, Microbiol. 141:2897 (1995)를 참조하시오]. yphC의 GTPase 활성은 또한 종래의 Malachite Green phosphorelease 검정법을 사용하여 검정할 수도 있다[예를 들어, Lanzetta 외 다수, 1979, Analytical Biochemistry 100:95-97 참조]. 이와 같은 검정법에서 KCl을 첨가하는 경우 GTPase 활성을 약 70배 증가시킬 수 있으며, 따라서 GTP 활성 검출시 치밀한 검정법을 제공할 수 있다.

또한 yphC 유전자로서 포함된 유전자들은 도 1 - 도 2b (서열 1 및 4)에 제시된 핵산의 퇴행성 변이체이다. 핵산 서열의 퇴행성 변이체들은 아미노산 코드의 퇴행성(degeneracy)으로 인하여 존재하게 된다; 그러므로, 서열 1 및 4로 표시되는 서열과는 상이하지만, yphC 폴리펩타이드를 코드화하는 서열도 본 발명의 범주내에 포함된다.

이와 유사하게, 아미노산의 구조가 유사하기 때문에, 상기 폴리펩타이드의 기능을 보유하는 경우(예를 들어, 종래의 상보성 검정법에서 결정된 바와 같이), yphC 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 보존적 변이(conservative variation)(본원에 기술된 바와 같이)가 일어날 수 있다. 기타 세균에서 동정된 다른 yphC 폴리펩타이드들 및 유전자들은 도 1 - 도 2b(서열 1-6)에 도시된 특정 yphC 폴리펩타이드 및 핵산의 보존적 변이체이거나 또는 퇴행성 변이체일 수 있다. 상기 yphC 폴리펩타이드 및 유전자는 서열 2 및 1 또는 서열 5 및 4와 각각 80% 이상, 예를 들어 90%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 1, 2, 4 및 5로 표시되는 서열들과 yphC 서열 사이의 서열 동일성 퍼센트에 상관없이, 본 발명에 포함되는 상기 yphC 유전자 및 폴리펩타이드는 바람직하게는 표준적인 상보성 검정법에서 yphC 기능이 결핍된 경우(예를 들어, 온도-감수성 돌연 변이)와 상보적일 수 있다.

기타 세균 균주, 구체적으로 병원성, 그람-양성 균주로부터 동정되어 클로닝된 추가의 yphC 유전자들은 본원에 기술된 다양한 방법, 예를 들어 항균제 동정법(identifying antibacterial agents)에 사용되는 yphC 폴리펩타이드를 생산하는데에 사용될 수 있다. 이와 유사하게, yqjK는 아이소자임, 변이체, 및 도 3에 도시된 서열들의 보존적 변이체를 포함한다. 여러 가지 구체예에서, 본원에 기술된 검정법에 사용된 필수 폴리펩타이드는 비-병원성 또는 병원성 그람 양성 세균으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 엔도카르디티스(Streptococcus endocarditis), 스트렙토코커스 패시움(Streptococcus faecium), 스트렙토코커스 생구스(Streptococcus sangus), 스트렙토코커스 비리단스(Streptococcus viridans) 및 스트렙토코커스 헤모리티쿠스(Streptococcus hemolyticus)와 같은 스트렙토코커스 균주로부터 수득할 수 있다. yphC 및 yqjK 유전자들의 오솔로그들은 이.콜라이 및 바실러스 서브틸리스와 같은 광범위한 스펙트럼의 세균으로부터 유래될 수 있다.

본원에 기술된 yphC 및 yqjK 유전자가 생존에 필수적인 것으로 확인되었으므로, 상기 필수 유전자 및 이들의 필수 상동체 및 오솔로그에 의하여 코드화된 필수 유전자 및 폴리펩타이드는 항균제를 동정하는데에 사용될 수 있다. 이와 같은 항균제는 필수 폴리펩타이드가 관여하는 대사 경로를 억제하는 것을 검출하는 높은 처리량 분석법(high throughput assay)에 의해 용이하게 동정될 수 있다. 이와 같은 억제 현상은 필수 폴리펩타이드 또는 상기 경로의 기타 필수 폴리펩타이드와 상호 작용(예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로 결합)하는 작은 분자에 의하여 발생될 수 있다.

항균성 화합물을 동정하는 표준적인 방법에는 필수 폴리펩타이드와 특이적으로 상호 작용(즉, 직접적으로 또는 간접적으로 결합)하는 작은 분자들을 스크리닝하는 것을 포함한다. 다수의 적합한 상호 작용 및 결합 검정법(interaction and binding assay)은 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로 포함된 미국특허 제 5,585,277호 및 5,679,582호에 기술된 바와 같이, 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 다수의 종래 검정법에서 시험 화합물은 상기 작은 분자가 상기 필수 폴리펩타이드의 펴진 상태보다는 접힌 상태인 필수 폴리펩타이드를 안정화시키는 능력을 측정함으로써 필수 폴리펩타이드와 상호 작용하는 능력을 검정할 수 있다. 더욱 구체적으로, 시험 화합물에 의하여 제공되는 펼친 상태(unfolding)로부터 보호되는 정도를 측정할 수 있다. 친화도가 높은 필수 폴리펩타이드와 결합하는 시험 화합물은 예를 들어, 폴리펩타이드가 변성되는 온도 범위를 현격하게 전이시킬 수 있다. 필수 폴리펩타이드를 접힌 상태(folded state)로 안정화시키는 시험 화합물은 표준적인 감수성 검정법(susceptibility assay)에서 항균 활성에 대하여 추가로 테스트할 수 있다.

항균제를 검정하는 다른 표준적 방법에는 시험 화합물이 본원에 기술된 필수 폴리펩타이드중 하나와 결합하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. 결합 여부는 시험 화합물이 필수 폴리펩타이드에 결합될 경우 상기 필수 폴리펩타이드의 전기 이동성을 변화시키게 되는 종래의 모세관 전기영동 검정법(capillary electrophoresis assay)을 통하여 검정될 수 있다.

필수 폴리펩타이드의 억제제를 동정하는 기타의 적합한 방법에는 필수 폴리펩타이드의 생화학적 활성을 동정한후 예를 들어, 고 처리량(high throughput) 스크린 검정법을 사용하여 작은 분자 억제제들의 활성을 스크리닝하는 것을 포함한다. 상기 yphC 폴리펩타이드는 공지의 GTPase의 구조적 특성을 가지며 생체외에서 GTPase 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 폴리펩타이드의 억제제는 종래의 GTPase 활성 검정법에서 yphC의 GTPase 활성을 억제하는 능력으로써 동정될 수 있다. 적합한 검정법에 관하여는 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로서 포함되어 있는 Gollag et al., Meth. Enzymol. 255:161-170, 1995 에 기술되어 있다. 적합한 검정법의 자세한 예는 후술한다.

상기 yqjK 폴리펩타이드는 설파타제의 구조적 특성을 갖고 있으며 설파타제와 같은 기능을 가질 것을으로 예상된다. 따라서, 상기 yqjK 폴리펩타이드의 억제제는 시험 화합물의 yqjK의 설파타제 활성을 억제하는 능력을 검정함으로써 동정될 수 있다. 적합한 검정법의 일례는 본원에 참고 문헌으로서 포함되어 있는 Barbeyron et al., Microbiol. 141:2897-2904, 1995에 기술되어 있다.

본 발명은 또한

(a)필수 폴리펩타이드 또는 이들의 상동체 또는 오솔로그를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 시험 화합물이 상기 폴리펩타이드 또는 상동체 또는 오솔로그에 결합하는지 여부를 검출하는 단계; 및 선택적으로,

(c)상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 지표로서 상기 폴리펩타이드 또는 상동체 또는 오솔로그에 결합하는 시험 화합물이, 폴리펩타이드 또는 상동체 또는 오솔로그와 결합하는 시험 화합물의 부재하에서 배양된 세균의 성장에 비하여 세균의 성장을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계

를 포함하는 항균제 동정 방법을 포함한다.

다른 적합한 검정법에서, 상향 조절(upregulation) 또는 하향 조절(down regulation)로써 필수 폴리펩타이드의 고갈에 반응하는 프로모터는 리포터 유전자에 연결되어 있다. 필수 단백질 고갈에 의해 상향- 또는 하향- 조절되는 프로모터를 동정하기 위하여, 상기 필수 단백질을 코드화하는 유전자는 유전자로부터 결실되는 대신, 조절 가능한 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 필수 단백질을 코드화하는 서열 유전자로 치환된다. 상기 조절 가능한 유전자 구조체를 포함하는 세포는 상기 조절 가능한 프로모터를 포함하는 유전자 구조체로부터 생산된 필수 폴리펩타이드에 의하여 생존하게 된다. 그러나, 조절 가능한 프로모터는 상기 필수 폴리펩타이드의 발현을 감소시켜 성장이 억제되기까지 한다. 이와 같은 성장-제한 조건(growth-limiting condition)하의 세균으로부터 수득된 RNA는 야생형 세포로부터 수득되는 RNA와 비교된다. 제한된 조건하에서 발현될 경우 더욱 많이 발현되거나 또는 더욱 적게 발현되는(즉, 상향- 또는 하향-조절되는) mRNA를 동정하는데에 있어서, 전사 거동에 대한 표준적 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, GenBank로부터 얻어진 유전자 서열 정보는 동정된 RNA를 발현시키는 프로모터를 동정하는데에 사용될 수 있다. 이와 같은 프로모터는 필수 폴리펩타이드를 고갈시킴으로써 상향- 또는 하향-조절된다.

필수 폴리펩타이드의 고갈에 의해 상향- 또는 하향- 조절되는 프로모터를 동정한 후에는, 상기 프로모터는 리포터 유전자(예를 들어, β-갈락토시다제, gus, 또는 녹색 형광 단백질(GFP))와 작동 가능하도록 연결된다. 이후 상기 리포터 유전자 구조체를 포함하는 세균 균주는 시험 화합물에 노출된다. 필수 폴리펩타이드를 억제하는 화합물(또는 필수 폴리펩타이드가 관여하는 필수 경로에서의 기타 폴리펩타이드)은 필수 폴리펩타이드의 기능을 흠결시키게 되어 상기 리포터 유전자의 발현을 상향-조절 또는 하향-조절한다. 이와 같은 검정법에서 필수 폴리펩타이드를 억제하는 화합물은 항균성일 것으로 예상되고, 원할 경우 표준 감수성 검정법(standard susceptibility test)에 의해 추가로 시험할 수 있다.

항균성 화합물을 동정하는 관련 방법에서, 상기 필수 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 핵산 리간드를 분리하는데에 상기 필수 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 이후 상기 폴리펩타이드 또는 핵산 리간드는 필수 폴리펩타이드와 상호 작용하는 작은 분자를 동정하기 위한 치환 스크린(displacement screen)에 사용된다. 이러한 검정법은 상기한 바와 같이 필수적으로 수행될 수 있다.

기타 다른 방법에 있어서, 시험 화합물과 필수 폴리펩타이드의 상호 작용(즉, 직접적 또는 간접적 결합)은 종래의 단백질/단백질 상호 작용 검출용 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)(예를 들어, 효모 또는 포유 동물 세포)에서 검출될 수 있다. 상기 필수 폴리펩타이드와 상호 작용하는 것으로 관찰되는 시험 화합물은 종래의 감수성 검정법에서 항균 활성에 대하여 추가로 시험될 수 있다. 일반적으로, 이러한 투-하이브리드화 방법에 있어서,

(a)상기 필수 폴리펩타이드는 (i)전사 인자의 전사 활성화 도메인 또는 (ii)전사 인자의 DNA-결합 도메인에 융합된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서 제공되고;

(b)시험 폴리펩타이드는 (i)전사 인자의 전사 활성 도메인 또는 (ii)전사 인자의 DNA-결합 도메인에 융합된 시험 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서 제공되며;

(c)상기 폴리펩타이드에 시험 폴리펩타이드가 결합하였는지 여부는 전사 인자의 재구성(reconstitution)으로서 검출된다. 필수 폴리펩타이드의 상동체 및 오솔로그는 유사한 방법으로 사용될 수 있다. 상기 전사 인자의 재구성은 예를 들어, 재구성 전사 인자의 DNA-결합 도메인을 경계로 하고 있는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 유전자의 전사 여부를 검출함으로써 검출될 수 있다[예를 들어, White, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10001-10003 및 상기 문헌에 참고 문헌으로 언급된 Vidal et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10315-10320 참조].

다른 방법에서, 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 분리된 핵산 분자는 생체내에서 필수 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 화합물을 동정하는데에 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 항균제로서 사용될 수 있다. 이와 같은 화합물을 동정기 위해서, 필수 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 배양하고, 시험 화합물(또는 시험 화합물의 혼합물)에 노출시킨후 발현 또는 활성 수준을 시험 화합물에 노출시키지 않았다는 것을 제외하고는 동일한 조건의 세포에서의 필수 폴리펩타이드 발현 또는 활성 수준과 비교한다. 본 발명의 이러한 양상에서, 유전자 발현에 대한 다수의 표준적인 정량 검정법이 이용될 수 있다.

필수 폴리펩타이드(또는 상동 서열 또는 오솔로그(orthologous) 서열)의 발현을 조절하는 화합물을 동정하기 위하여, 본원에 기술된 바와 같이, 다양한 농도의 시험 화합물이 필수 폴리펩타이드(상동체 또는 오솔로그)를 발현시키는 세포의 배양 배지에 가하여질 수 있다. 이러한 시험 화합물에는 작은 분자(통상적으로, 비-단백질, 비-다당류인 화학 물질), 폴리펩타이드 및 핵산이 포함될 수 있다. 이후 필수 폴리펩타이드의 발현은 본 발명의 핵산 분자를 프로브로서 사용하는 예를 들어, 노던 블럿 PCR 분석법 또는 RNAse 보호 분석법으로 측정된다. 상기 시험 분자 존재하에서의 발현 수준은, 이의 부재하에서의 발현 수준과 비교하였을때, 상기 시험 분자가 필수 폴리펩타이드의 발현 정도를 변경시키는지의 여부를 나타낼 것이다. yphC 및 yqjK 폴리펩타이드가 생존에 필수적이기 때문에, 필수 폴리펩타이드 또는 이의 필수 상동체 또는 오솔로그의 발현 및/또는 기능을 억제하는 시험 화합물은이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 세포의 성장을 억제하거나 또는 사멸시킬 것이다.

필수 유전자에 의해서 코드화된 폴리펩타이드들은 상기 폴리펩타이드들과 상호 작용하는 시험 화합물을 동정하는 검정법에서도 독립적으로 또는 함께 사용될 수 있다. 이후 상기 폴리펩타이드들과 상호 작용하는 화합물은 이들이 세균 성장을 억제하는 능력에 대하여 종래의 검정법에 따라 용이하게 시험될 수 있다. 상기 필수 폴리펩타이드와 상호 작용하는 시험 화합물은 상기 필수 폴리펩타이드와 상호 작용하지 않는 화합물과 대조적인 것으로서 후보 항균제(candidate antibacterial agents)이다. 본원에 기술된 바와 같이, 시험 화합물과 필수 폴리펩타이드의 상호 작용을 검정하는데에는 당업계에 공지된 방법들중 임의의 방법이 사용될 수 있다.

통상적으로, 상기 시험 화합물은 작은 유기 분자(small organic molecule)일 것이다. 또는 상기 시험 화합물은 시험 폴리펩타이드(예를 들어, 랜덤한 또는 예정된 아미노산 서열; 또는 자연 발생 또는 합성 폴리펩타이드)이거나 또는 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산일 수 있다. 상기 시험 화합물은 자연 발생적 화합물이거나 또는 (원하는 경우) 합성된 화합물일 수 있다. 합성 라이브러리, 화학적 라이브러리 및 이의 유사 물질들은 필수 폴리펩타이드와 결합하는 화합물을 동정하기 위하여 스크리닝될 수 있다. 보다 일반적으로는, 상기 시험 화합물이 상기 폴리펩타이드, 상동체 또는 오솔로그와 결합하는지 여부는 생체내에서 또는 생체외에서 검출될 수 있다. 원한다면, 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는 상기의 방법들은 예를 들어, 필수 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석법(Western blot analysis)을 수행함으로써 세포내에서 발현된 필수 폴리펩타이드의 수준을 측정하는 방법과 결합하여 수행될 수 있다.

상기 시험 화합물의 출처와는 상관없이, 본원에 기술된 필수 폴리펩타이드는 필수 단백질의 활성 또는 필수 유전자의 전사 또는 상기 필수 유전자로부터 전사된 mRNA의 해독을 억제하는 화합물을 동정하는데에 사용될 수 있다. 상기 항균제는 광범위한 병원성 세균 균주 또는 비-병원성 세균 균주를 억제시키는데에 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 약제학상 허용 가능한 부형제(exipient) 및 본원에 기술된 방법을 사용하여 동정된 항균제를 포함하는 약제 제형(pharmaceutical formulation)을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 병원성 세균 균주(예를 들어, 병원성 스트렙토코커스 균주와 같은 병원성 그램 양성 세균 균주)의 성장을 억제하거나 사멸시키는 항균제를 함유하는 약제 제형을 포함한다. 이러한 약제 제형은 유기체내 세균성 감염(예를 들어, 스트렙토코커스 감염)을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 상기 유기체에 치료학적으로 유효량 즉, 세균성 감염의 징후 및/또는 증상을 개선시키는데에 충분한 양의 약제 제형을 투여하는 것을 포함한다. 구체적으로, 이러한 약제 제형은 사람 및 가축(예를 들어, 소, 돼지, 개 및 고양이)과 같은 포유 동물 및 식물내 세균성 감염을 치료하는데에 사용될 수 있다. 이러한 인간에 있어서의 항균제의 효능은 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 동물 모델 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스성 폐렴에 대한 생쥐 및 시궁쥐 모델 시스템)에서 측정될 수 있다.

미생물 막을 투과할 수 있는 다양한 친화성 시약(affinity reagents)(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)가 본 발명의 방법을 수행하는데에 유용하다. 예를 들어, 상기 yphC 폴리펩타이드 또는 yqjK 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체는 다수의 세균 균주(또는 이들의 추출물)에 존재하는 필수 폴리펩타이드의 검출을 촉진시킬 수 있다. 상기 항체들은 또한 필수 폴리펩타이드에 대한 시험 화합물의 결합을 검출하는데에(예를 들어, 본원에 기술된 검정법을 사용하여) 유용하다. 더욱이, 필수 폴리펩타이드에 결합하는 단클론성 항체 자체는 항균제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 조건성 치사 돌연 변이(conditional lethal mutations)가 발생한 다수 군의 돌연변이체를 동정하는 방법을 추가의 특징으로 한다. 일반적으로, 균주 자신들이 스크리닝 또는 진단 검정법(diagnostic assay)에서 사용될 수 있음에도 불구하고, 유전자 및 이에 대응하는 유전자 산물이 최종적으로 동정된다. 동정된 유전자 및 유전자 산물의 작용 기작은 항균성 치료제를 디자인하는데에 적합한 기반을 제공한다. 상기 항균제는 야생형 균주에서 유전자 산물의 작용을 감소시키기 때문에, 약제학상 유효한 양의 본 발명의 제제를 투여함으로써 본 발명의 감염 타입 또는 이와 유사한 감수성 감염 타입을 치료하는 데에 유용하다. 상기 유전자 산물의 작용의 감소에는 효소 또는 수용기의 활성 위치에 대한 유전자 산물의 경쟁적 억제; 비경쟁적 억제; 상기 유전자 산물을 필요로 하는 세포내 캐스케이드 경로(intracellular cascade path)를 파괴시키는 단계; 해독후 처리(post-translational processing) 이전 또는 이후에 상기 유전자 산물과 결합하는 단계; 및 유전자 산물 유사물질(gene product mimetics)로서 작용하여 활성을 하향-조절시키는 단계를 포함한다. 치료 제제에는 상기 유전자 산물로써 생산 증가된 모노클론성 항체를 포함한다.

더욱이, 원한다면 어떠한 세포(예를 들어, 동일 속 또는 유사 종인 병원성 세균)내 유전자 서열의 존재 또는 숙주 세포내 상기 서열의 부재 또는 분기(divergence)를 측정할 수도 있다. 숙주내 존재하지 않는 유전자 또는 유전자 산물에 대한 치료제는 몇가지 이점을 갖는데, 여기에는 더욱 낮은 부작용 발생률 및 전체 요구 용량이 포함된다.

핵산에는 RNA 및 게놈성 DNA 및 합성 DNA(화학적으로 합성된 DNA)를 포함하는 DNA를 포함한다. 상기 핵산은 이중-가닥이거나 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥일 경우, 상기 핵산은 센스 가닥이거나 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 이의 유도체(예를 들어, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 예를 들어, 염기쌍 형성능이 변경되었거나 또는 뉴클레아제에 대한 내성이 증가된 핵산 제조에 사용될 수 있다.

분리된 핵산은 그것이 수득된 유기체의 자연 발생적 게놈(naturally occuring genome)상에서 바로 가까이에 인접하고 있는(한쪽은 5' 말단에 그리고 다른 한쪽은 3' 말단에) 코드화 서열 모두와 인접해 있지 않는 DNA 또는 RNA이다. 그러므로 하나의 구체예에서, 분리된 핵산은 코드화 서열에 근접한 5' 비코드화(non-coding) 서열(예를 들어, 프로모터)의 일부 또는 모두를 포함한다. 따라서 상기 용어에는 예를 들어, 벡터, 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈성 DNA와 합체된 재조합 DNA 또는 다른 서열과는 독립적인 분리된 분자(예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생산된 게놈성 DNA 단편)로서 존재하는 DNA를 포함한다. 이는 또한 추가의 폴리펩타이드 서열을 코드화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA도 포함한다. "분리된(isolated)"이란 용어는 세포 물질, 바이러스성 물질, 또는 배지(재조합 DNA 기술에 의해 생산된 경우), 또는 화학적 전구체 또는 기타 화학 물질(화학적으로 합성된 경우)이 실질적으로 제거된 핵산 또는 폴리펩타이드를 말한다. 더욱이, 분리된 핵산 단편은 단편으로서 자연 발생되지 않은 핵산 단편이며 천연 상태에서는 발견되지 않는다.

실질적으로 필수 뉴클레오티드 서열과 동일한 핵산 서열은 도 1-3에 도시된 바와 같이 표 1에 서열로서 제시된 yphC 또는 yqjK의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상(예를 들어, 85% 이상) 동일하다. 핵산 비교용 참조 핵산 서열의 길이는 40 뉴클레오티드 이상, 예를 들어, 60 뉴클레오티드 이상이거나 그 이상의 길이일 것이다.

상기 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 동일성 퍼센트를 측정함에 있어서, 상기 서열들은 최적의 비교 목적을 위해서 정렬된다(예를 들어, 두번째 아미노산 또는 핵산 서열과 최적으로 정렬시키기 위해서 첫번째 아미노산 또는 핵산 서열에 갭(gap)이 도입될 수 있다). 이후 대응되는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 두번째 서열내 존재하는 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 첫번째 서열내에 존재하는 위치에 점유하고 있을때, 상기 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다. 상기 2개의 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 서열들에 의하여 나누어지는 동일한 위치의 수에 대한 함수이다(즉, 동일성 % = 동일 위치의 수/오버래핑된 위치의 총 수 ×100). 바람직하게는, 상기 2개의 서열들은 동일한 길이이다.

상기 2개의 서열들 사이의 동일성 또는 상동성에 대한 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 2개의 서열을 비교하는데에 이용된 적합한, 수학적 알고리즘은 Karlin 및 Altschul(1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5877의 것을 수정한 Karlin 및 Altschul(1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2264-2268의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul 외 다수(1990) J. Mol. Biol.215:403-410의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함되어 있다. 본 발명의 yphC 또는 yqjK 핵산 분자에 상동성인 핵산 서열을 수득하기 위한 BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램으로 수행될 수 있는데, 여기서 스코어는 100, 단어 길이는 12이다. 본 발명의 yphC 또는 yqjK 핵산 분자에 상동성인 핵산 서열을 수득하기 위한 BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램으로 수행될 수 있는데, 여기서 스코어는 50, 단어 길이는 3이다. 비교 목적용의 갭(gap)이 존재하는 DNA 정렬체를 수득하는데에 있어서, Altschul외 다수, (1997) Nucleic Acid Research 25:3389-3402에 기술된 바와 같이, 갭이 형성된 BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 갭이 형성된 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)에 대한 오류 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 서열 비교용으로 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 예로서는 Meyers 및 Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 한 부분인 ALIGN 프로그램(2.0 버젼)에 포함되어 있다. 상기 아미노산 서열 비교용 ALIGN 프로그램을 사용할 경우, 갭 길이 페널티(gap length penalty)가 12이고, 갭 페널티가 4인 PAM120 중량 잔기 표(weight residue table)가 사용될 수 있다.

2개의 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 후속되는 갭을 사용하거나 또는 사용하지 않고 상기 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 동일성 퍼센트 계산시, 정확히 매치되는 것만이 측정된다.

본 발명을 수행하는데에 있어서 유용한 필수 폴리펩타이드는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 재조합 폴리펩타이드 및 천연 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 본 발명에 유용한 핵산 서열은 자연 발생적 아미노산 서열이 변경되었거나 또는 결실된 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 형태의 핵산 서열이다. 바람직한 핵산은 보통의 생리적 조건하에서 용해성인 폴리펩타이드를 코드화한다. 또한 본 발명의 범주내에 속하는 핵산은 필수 폴리펩타이드의 일부가 이와 관련성이 없는 폴리펩타이드(예를 들어, 마커 폴리펩타이드 또는 융합 파트너)에 융합되어 융합 단백질을 생산하는 핵산이다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 헥사-히스티딘 택에 융합되어 세균에 의해서 발현된 폴리펩타이드의 정제 또는 헤마글루티닌 택에 융합되어 진핵 세포내에서 발현된 폴리펩타이드의 정제를 촉진시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 예를 들어 첫번째 부분 또는 두번째 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드(및 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산)를 포함하며; 상기 첫번째 부분은 필수 폴리펩타이드를 포함하며, 두번째 부분은 면역글로블린 불변 부위(Fc) 또는 검출 가능한 마커를 포함한다.

상기 융합 파트너는 예를 들어, 분비성 서열(secretory sequences)과 같은 분비를 촉진하는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 융합 폴리펩타이드를 통상적으로 전단백질(preprotein)이라 부른다. 상기 분비성 서열은 숙주 세포에 의하여 절단되어 성숙한 단백질을 생성할 수 있다. 또한 본 발명의 범주내에 속하는 핵산은 폴리펩타이드 서열에 융합된 필수 폴리펩타이드를 코드화하여 비활성 형태의 전단백질을 생산한다. 전단백질은 상기 비활성 서열을 제거함으로써 활성형의 단백질로 전환될 수 있다.

본 발명은 또한 예를 들어, 엄격한 혼성화 조건하(본원에 정의된 바와 같은)에서도 서열 1 또는 7로 표시되는 뉴클레오티드의 전부 또는 일부 또는 이들의 상보성 서열과 혼성화되는 핵산을 포함한다. 혼성화 핵산의 혼성화 부위의 길이는 통상적으로 15 뉴클레오티드 이상(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50 뉴클레오티드)이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부위는 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산의 전부 또는 일부 또는 이의 상보적 서열과 80% 이상, 예를 들어 95% 이상, 또는 98% 이상 동일하다. 예를 들어 클로닝 프로브 또는 프라이머(예를 들어, PCR 프라이머), 또는 진단 프로브와 같은, 본원에 기술된 타입의 혼성화 핵산이 사용될 수 있다. 서열 1 및 7로 표시되는 상기 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 핵산은 "안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)" 서열로 간주된다.

본 발명의 다른 구체예로서는 다수의 조작된 세포, 예를 들어 본원에 기술된 필수 핵산을 함유하는 형질 전환된 숙주 세포가 있다. 형질 전환된 세포는 재조합 DNA 기술에 의해서 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산이 도입된 세포이다. 여기에는 예를 들어, 스트렙토코커스, 바실러스등의 세균과 같은 원핵 세포 및 진핵 세포 모두를 포함한다.

또한 본 발명의 범주내에 속하는 유전자 구조체(예를 들어, 벡터 및 플라스미드)에는 전사 및/또는 해독 서열에 작동 가능하도록 연결되어 예를 들어, 발현 벡터를 발현시킬 수 있는 핵산을 포함한다. 선택된 핵산, 예를 들어 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 분자는 하나 이상의 서열 인자 예를 들어, 프로모터에 인접하여 위치할 경우, 전사 및 해독 서열에 "작동 가능하도록 연결되어" 있는 것인데, 이로써 선택된 핵산의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있도록 상기 서열 인자가 상기 서열의 전사 및/또는 해독을 지휘한다.

본 발명은 또한 필수 유전자인 yphC 및 yqjK에 의해 코드화되는 정제된 또는 분리된 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다. 상기 "단백질" 및 "폴리펩타이드"라는 용어는 모두 길이 또는 해독후 변형(예를 들어, 포도당화 또는 인산화) 여부를 불문하는, 아미노산 쇄를 말한다. 그러므로, yphC 폴리펩타이드 및 yqjK 폴리펩타이드라는 용어는 (yphC 폴리펩타이드의 일부분이 도 1에 도시된 서열의 일부분을 포함하는 경우) 전체 길이의, 자연 발생적, 분리된 yphC 및 yqjK 단백질 뿐만 아니라, 전체 길이의, 자연 발생적 단백질, 또는 자연 발생적 또는 합성 폴리펩타이드의 일부에 대응하는, 재조합 또는 합성에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 의미한다.

정제 또는 분리된 화합물은 목적으로 하는 화합물, 예를 들어, 필수 폴리펩타이드 또는 항체가 60 중량% 이상인 조성물이다. 바람직하게 조제는 목적으로 하는 화합물이 적어도 75중량%(예를 들어, 90%, 95% 또는 심지어 99% 이상인)이다. 순도는 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 HPLC분석법과 같은 적합한 표준적 방법으로 측정될 수 있다.

바람직한 필수 폴리펩타이드에는 (yphC 폴리펩타이드가 도 1에 도시된 서열의 일부를 포함하는 경우) 도 1-2b 및 3b에 나타낸 서열들의 전부 또는 일부를 포함하는 자연 발생적 필수 폴리펩타이드의 전부 또는 일부와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 본원에 기술된 필수 폴리펩타이드 서열과 "실질적으로 동일한(substatially identical)" 폴리펩타이드는 표 1에 기재된 서열들로 표시되는 필수 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한(본원에 기술된 바와 같이 측정된) 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 신규의 폴리펩타이드는 또한 예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 비교용인, 참조 필수 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 16 이상의 아미노산, 예를 들어, 20 또는 25 이상의 아미노산일 것이다.

폴리펩타이드 서열이 참조 서열에 대하여 동일성이 100% 미만인 경우, 동일하지 않은(non-identical) 위치는, 반드시 그런 것은 아니지만, 바람직하게는 참조 서열의 보존적 치환체이다. 보존적 치환은 일반적으로 다음의 그룹들 내에서의 치환을 포함한다. 즉: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.

특정 폴리펩타이드가 일정한 길이의 참조 폴리펩타이드에 대해 특정한 퍼센트 동일성(percent identity)을 갖는다고 할 때, 이러한 퍼센트 동일성은 참조 폴리펩타이드에 대해 상대적인 것이다. 따라서, 100 아미노산 길이의 참조 폴리펩타이드에 대해 50% 동일한 폴리펩타이드는 참조 폴리펩타이드의 50 아미노산 길이 부분과 완전히 동일한 50 아미노산 폴리펩타이드일 수 있다. 그렇지 않으면, 그것은 참조 폴리펩타이드의 전체 길이에 대해 50% 동일한 100 아미노산 길이 폴리펩타이드일 수 있다. 물론 다른 폴리펩타이드들도 이러한 기준을 만족시킬 수 있다.

본 발명은 필수 폴리펩타이드(essential polypeptide)에 특이적으로 결합하는 정제되거나 분리된 항체들도 특징으로 한다. 임의의 항체가 특정 항원, 예컨대, 필수 폴리펩타이드에 대해 "특이적으로 결합한다"는 것은 그러한 항원에만 결합하고 필수 폴리펩타이드를 포함하는 시료, 예컨대 생물학적 시료(biological sample)내의 다른 분자들은 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 것을 의미한다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 시료내의 필수 폴리펩타이드를 검출하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법은 : 필수 폴리펩타이드를 포함할 것으로 의심되는 시료를 수득하는 단계; 항체와 필수 폴리펩타이드의 복합체의 생성을 허용하는 조건하에서 필수 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및 존재하는 경우 시료내의 필수 폴리펩타이드의 존재의 표지로서 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명에 포함되는 다른 양상은 필수 유전자(essential gene)에 관련된 유전자를 수득하는 방법이다. 이러한 방법은 필수 핵산 또는 그의 상동체(homolog)의 전부 또는 일부를 코드화하는 분리된 핵산(isolated nucleic acid)을 포함하는 표지된 프로브를 수득하는 단계; 핵산 단편 라이브러리내의 핵산 단편들과 상기 표지된 프로브의 혼성화(hybridization)를 허용하여 핵산 듀플렉스(duplex)를 생성시키는 조건하에서 핵산 단편 라이브러리를 상기 표지된 프로브로 스크리닝하는 단계; 존재하는 경우 표지된 듀플렉스를 분리하는 단계; 및 임의의 표지된 듀플렉스내의 핵산 단편들로부터 전체 길이의 유전자 서열을 제조하여 필수 유전자 관련 유전자를 수득하는 단계를 수반한다. 그렇지 않으면, 이러한 관련 유전자들은 상술한 바와 같이 여러 가지 서열결정된 세균 게놈들의 BLAST 검색에 의해서 동정될 수 있다.

본 발명은 몇 가지 이점들을 제공한다. 예를 들어, 항균제(antibacterial agents)의 동정을 위한 방법들은 매우 많은 후보 항균제들을 높은 작업량으로 스크리닝(high throughput screening)하는데 적합하도록 이용될 수 있다. 본원에 개시된 필수 유전자들은 고도로 보존적인 것(highly conserved)으로 생각되기 때문에, 이러한 유전자 또는 유전자 산물을 표적으로 하는 항균성 약물들은 광범위한 세균에 대하여 항균 활성을 가질 것으로 예상된다.

다른 언급이 없는한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험을 위해 이용될 수 있다고 하더라도, 적합한 방법 및 재료들은 본원에 설명된 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허출원들, 특허들 및 기타의 참고문헌들은 전문 그대로 본원에 참고자료로 첨부된다. 저촉(conflict)의 경우에, 용어의 정의를 포함하는 본원 명세서가 기준이 될 것이다. 또한, 재료들, 방법들, 및 실시예들은 단지 설명을 위한 것으로, 청구범위에 의해서 정해지는 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하의 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

필수　스트렙토코커스　유전자들의　동정

이하의 실험에서 후술하는 바와　같이，yphC 및 yqjK 유전자들은　스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae）의　생존에　필수적이다．　스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)는　ＡＴＣＣ로부터　수득할　수　있다．　　일반적으로　그리고　후술하는　실시예의　경우에，　필수　유전자들은　세균，　예컨대，　에스．　뉴모니아에내에　존재하는　목적　유전자들의　표적화　결실들（ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）을　만들어　확인할　수있다．　　　이들　목적　유전자들은　다음과　같이　선정된다．　　　표준　분자생물학　기술을　이용함으로써，　스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae）게놈의　단편들을　포함하는　라이브러리를　Ｍ１３　파아지　또는　플라스미드　ＤＮＡ를　벡터로　이용하여　제조할　수　있다．　　　상기　벡터와　혼성화하는　프라이머를　이용하여，　이러한　라이브러리내에　포함된　오픈　리딩　프레임들（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ；ＯＲＦｓ）을　무작위로　서열결정하였다．　　표적화　결실을　위해　선택된　목적　유전자들은　해당　서열을뉴클레오티드　서열들의　ＧｅｎＢａｎｋ　데이터베이스와　비교하여　확인해 볼　때　다음의 ４　가지　조건들을　만족시킨다：　（１）　ＯＲＦ는　이미　알려진　기능을　갖지　않는다．　（２）　ＯＲＦ는　바실러스　서브틸리스내의　오솔로그（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）를　갖는다．　　（３）ＯＲＦ는　다른　세균에서도　ｐ＜１０^－１０로　보존되어　있다；　그리고　（４）　ＯＲＦ는　진핵　오솔로그（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｏｒｔｈｏｌｏｇ）를　갖지　않는다, ｐ＞１０^－３．　　스트렙토　코커스　유전자들　yphC 및 yqjK이　이러한　각각의　기준들을　만족시킨다는　것은，　yphC 및 yqjK 유전자들　또는　유전자　산물들을　억제하는　화합물들이　광범위한　스펙트럼의 항균　활성을　가질　것이라는　것을　시사한다．

yphC 및 yqjK 유전자들을　각각　항생제　에리스로마이신(erythromycin)에　대한　내성을　부여하는　핵산　서열（＂ｅｒｍ＂　유전자）로　대체하였다．　　　다른　유전자　마커들을　이러한　특수한　항생제　내성　마커　대신에　이용할　수　있다．　도　８에　도시된　바와　같이，　폴리메라제　연쇄　반응（ＰＣＲ）증폭을　이용하여　스트렙토코커스　게놈　ＤＮＡ내에　표적화　결실들을　만들었다．　　　몇몇　ＰＣＲ　반응을　이용하여　목적　유전자의　표적화　결실　수행에　요구되는　ＤＮＡ　분자들을　만들었다．　　우선，　프라이머　５　및　６을　이용하여　비．　서브틸리스（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，　ＯＨ로부터　수득가능）로부터의　ｐＩＬ２５２로부터　ｅｒｍ　유전자를　증폭시켰다．　　　프라이머　５는　ｅｒｍ　유전자의　프로모터　부분과　동일하고　서열　Ａ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａ）와　상보적인　２１　뉴클레오티드들로　구성된다．　　　프라이머　５는　서열이　５＇　ＧＴＧ　ＴＴＣ　GＴG　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＴＧＣ　ＡＣＣ３＇(서열 22)이다．　　프라이머　６은　ｅｒｍ　유전자의　３＇　말단에　대해　상보적인　２１　뉴클레오티드들로　구성된다．　　　프라이머　６은　５＇　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＣＣＣ　ＧＴＴ　ＡＡＡ３＂(서열 23)의　서열을　갖는다．　　　ｅｒｍ　유전자의　ＰＣＲ　증폭은　다음과　같은　조건하에서　수행하였다：　９４℃에서　１분，５５℃에서　１분　및　７２℃에서　１．５분으로　이루어지는　사이클을　３０회　수행하고나서　７２℃에서　１０분간　１　사이클　실시하였다．

두　번째　및　세　번째　ＰＣＲ 반응에서，　목적　유전자에　플랭킹하는　서열들을　증폭시켜　ｅｒｍ　유전자의　일부도　포함하는 하이브리드　ＤＮＡ　분자들로　제조하였다．　　　두　번째　반응은　목적　유전자의　５＇　말단의　상류에　있는　서열들　및　ｅｒｍ　유전자의　처음　２１　뉴클레오티드들을 포함하는　이중가닥　ＤＮＡ　분자（＂좌측　플랭킹　분자（Ｌｅｆｔ　Ｆｌａｎｋｉｎｇ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）이라　함）를　제조하였다．　　　도　８에　도시된　바와　같이，　이러한　반응은　길이가　２１　뉴클레오티드이고　목적　유전자의　해독개시부위의　상류　약　５００ｂｐ에　위치된　서열과　동일한　프라이머　１을　이용하였다．　　　프라이머　１　및　２는　유전자－특이성이고　각각　서열　５＇ＴＧＡ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＡＧＧ　ＡＣＧ　ＡＧＧ３＇（서열　２４）　및　서열　５＇ＣＣＴ　ＴＡＣ　ＧＴＧ　ＧＴＣ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＧＧ３＇（서열　２５）를　갖는다．　　　ｙｐｈＣ의　경우에，　서열　１　및　２는　각각　５＇ＴＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＡＡＧ３＇（서열　２６）　및　서열　５＇　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＡＧＧ３＇（서열　２７）을　갖는다．　　프라이머　２는　길이가　４２　뉴클레오티드이고　프라이머의　３＇　말단의　２１　뉴클레오티드는　목적　유전자의　센스　가닥(sense strand)의　５＇　말단에　대해　상보적이다．　　　상기　프라이머의　５＇　말단에　있는 2１　뉴클레오티드들은　서열　Ａ와　동일하므로　ｅｒｍ　유전자의　５＇　말단에　대해　상보적이다．　　　따라서，　프라이머　１　및　２를　이용한　ＰＣＲ　증폭은　도　８에　도시한　바와　같이，　목적　유전자의　상류에　위치한　서열　및　ｅｒｍ　유전자의　２１　염기쌍들을　포함하는　하이브리드　ＤＮＡ　분자인　좌측　플랭킹　ＤＮＡ　분자를　생성한다．

세　번째　ＰＣＲ　반응은　두　번째　반응과　비슷하지만，　도　８에　도시한　바와　같이　우측　플랭킹　ＤＮＡ　분자를　만든다．　　　우측　플랭킹　ＤＮＡ　분자는　ｅｒｍ　유전자의　３＇　말단의　２１　염기쌍，　목적　유전자의　３＇　말단　부분의　２１　염기쌍　부분　및　목적　유전자의　하류　서열들을　포함한다．　　　이러한　우측　플랭킹　ＤＮＡ　분자는　유전자－특이성　프라이머　３　및　４를　가지고　제조하였다．　　　ｙｇｊＫ의　경우에，　프라이머　３　및　４는　각각　서열　５＇ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＡＧ３＇（서열　２８）　및　서열　５＇ＡＴＣ　ＴＧＧ　ＴＴＣ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＧ３＇（서열　２９）를　갖는다．　　ｙｐｈＣ의　경우에，프라이머　３　및　４는　각각　서열 ５＇ＣＡＴ　ＴＧＣ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧＴ　ＴＧＣ　ＴＧＧ３＇（서열　３０）　및　５＇ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＴＣＧ３＇（서열　３１）을　갖는다．　　프라이머　３은　４２　뉴클레오티드이고；　프라이머　３의　５＇　말단에　있는　２１　뉴클레오티드는　서열　Ｂ와　동일하므로　ｅｒｍ　유전자의　３＇　말단과　동일하다．　　　상기　프라이머　３의　３＇　말단에　있는　２１　뉴클레오티드들은　목적　유전자의　３＇　말단과　동일하다．　　　프라이머　４는　２１　뉴클레오티드　길이이고　목적　유전자의　약　５００ｂｐ　하류에　있는　서열에　대해　상보적이다．

좌측　및　우측　플랭킹　ＤＮＡ　분자들의　ＰＣＲ　증폭을　개별적으로　다음　성분들을　포함하는　５０㎕　반응　혼합물에서　수행하였다：　１㎕　스트렙토코커스 뉴모니아에(ＲＸ１）　ＤＮＡ（０．２５㎍），　２．５㎕　프라이머　１　또는　４（１０ｐｍｏｌ／㎕），　２．５㎕　프라이머　２　또는　３（２０　ｐｍｏｌ／㎕），　１．２㎕　혼합 dNTPs(10 mM 각각), 37　㎕ H₂O, 0.7㎕ Taq 폴리메라제(5U/㎕), 및 5㎕ 10× Taq 폴리메라제 버퍼(10 mM Tris, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂). 좌측 및 우측 플랭킹 DNA 분자들을 다음의 ＰＣＲ　사이클링 프로그램에 의해 증폭시켰다: ９5℃에서　2분; 72℃에서　1분; 94℃에서 30초; 49℃에서 30초; 72℃에서 1분; 94℃, 49℃ 및 72℃ 인큐베이션을 30회 반복실시; 72℃에서 10분간 인큐베이션하고나서 반응 종료시킴. 이어서 각각의 반응혼합물의 15㎕ 분취량을 TAE 버퍼내의 1.2% 저융점 아가로스 겔을 통해 전기영동한 후,에시디움 브로마이드로 염색하였다. 증폭된 좌측 및 우측 플랭킹 DNA 분자들을 포함하는 단편들을 겔로부터 절제해내어 QIAQUICK™겔 추출 키트(Qiagen, Inc.)를 이용하여 정제하였다. 다른 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있는 DNA 증폭 및 분리방법을 사용할 수도 있다. 플랭킹하는 좌측 및 우측 DNA 단편들을 pH 8.0의 30㎕ TE 버퍼내에 용출하였다.

그다음으로 도 8에 도시된 바와 같이 증폭된 ｅｒｍ　유전자 및 좌측 및 우측 플랭킹 DNA 분자들을 융합시켜 융합 생성물을 제조하였다. 융합 PCR 반응(fusion PCR reaction)은 다음 성분들을 포함하는 50㎕ 반응혼합물로 수행하였다: 각각 2㎕의 좌측 및 우측 플랭킹 DNA 분자들 및 ｅｒｍ　유전자 PCR 생성물; 5㎕의 10× 버퍼; 2.5㎕의 프라이머 1(10 pmol/㎕); 2.5㎕의 프라이머 4(10 pmol/㎕); 1.2㎕의 dNTP 믹스(각각 10mM); 32㎕의 H₂O 및 0.7㎕의 Taq 폴리메라제. PCR 반응은 다음의 사이클링 프로그램에 따라 수행하였다: ９5℃에서　2분; 72℃에서　1분; 94℃에서 30초; 48℃에서 30초; 72℃에서 3분; 94℃, 48℃ 및 72℃ 인큐베이션을 25회 반복실시; 72℃에서 10분간. 반응이 종료된 후, 반응혼합물의 12㎕ 분취량을 아가로스 겔을 통해 전기영동하여 약 2 kb 정도의 최종생성물의 존재를 확인하였다.

융합 생성물의 5㎕ 분취량을 이용하여 표준 기술에 따라 에리스로마이신을 포함하는 배지에서 배양된 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae)를 형질전환시켰다. 도 9에 도시된 바와 같이, 융합 생성물과 에스. 뉴모니아에 게놈은 ｅｒｍ　유전자가 목적 유전자의 염색체 사본(chromosomal copy)을 대체할 수 있도록 상동 재조합을 일으켜 유전자 녹아웃(gene knockout)을 형성시킨다. 필수 유전자의 파열은 에리스로마이신을 포함하는 배지에서 성장하지 못하게 한다. 이러한 유전자 녹아웃 방법을 이용함으로써, yphC 및 yqjK 유전자들이 생존에 필수적임을 확인하였다. 표적화 결실을 수행하기 전에 서열결정된 yphC 오픈 리딩 프레임의 일부분을 도 1에 도시하였다. 전체 길이 yphC 서열(도 2a 및 도 2b에 도시한)을 도 1에 도시된 서열과 중첩되는 서열을 갖는 에스. 뉴모니아에로부터의 클론에 대한 TIGR 서열 데이터베이스를 검색하여 데이터베이스로부터의 유전자의 3' 말단과 도 1에 도시된 유전자의 5' 말단을 결합시킴으로써 컴파일하였다. 데이터베이스의 클론에 포함된 서열은 기능을 알지 못하는 것들이었다.

필수 유전자들의 오솔로그들(Orthologs)의 동정

yphC 및 yqjK 유전자들이 스트렙토코커스의 생존에 필수적임을 확인하였으므로, 예컨대, 비. 서브틸리스 또는 이. 콜라이내에서 확인된 이들 유전자들의 오솔로그들을 시험하여 이들이 그러한 유기체내에서도 생존에 필수적인지 확인할 수 있다. 이를 위해, yphC 및 yqjK의 코드화 서열(coding sequence)을 이용하여 뉴클레오티드 서열들의 GenBank 데이터베이스를 검색하여 각 서열의 오솔로그들을 비. 서브틸리스 및 이. 콜라이내에서 동정하였다. 서열 비교는 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)를 이용하여 행하였다. 필수 폴리펩타이드들과 그들의 오솔로그들 사이의 퍼센트 서열 동일성(percent sequence identity)은 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG) 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지(위스콘신 패키지 버젼 9.1; 매디슨, WI)의 GAP 프로그램을 이용하여 측정하였다. 갭 가중치(12) 및 길이 가중치(4)에 대한 디폴트 파라미터를 이용하였다.

전형적으로, 필수 폴리펩타이드들 및 그들의 오솔로그들은 적어도 25%(예컨대, 적어도 30% 또는 40%) 서열 동일성을 갖는다. 전형적으로, 필수 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 서열들과 그들의 상동체(homologs) 또는 오솔로그들은 적어도 20%(예컨대, 적어도 30%, 35%, 40%, 또는 45%)의 서열 동일성을 공유한다. yphC 및 yqjK 유전자들의 바이오인포매틱스 분석(bioinformatics analysis) 결과 이들 유전자들은 세균들 사이에서 폭넓게 보존되어 있는 것으로 확인되었다.

동정된 yphC 및 yqjK의 오솔로그들이 다른 세균의 생존에 필수적인지 확인하기 위해, 후술하는 바와 같이, 각각의 오솔로그 유전자들을 숙주 유기체의 게놈으로부터 개별적으로 결실시켰다. yphC의 비. 서브틸리스 및 이. 콜라이 오솔로그들(각각 B-yphC 및 yfgK)도 비. 서브틸리스 및 이. 콜라이의 생존에 필수적이라는 관찰 결과는 yphC 유전자가 그것이 존재하는 모든 세균내에서 필수적이라는 것을 가리킨다. 따라서, 이러한 유전자 또는 그의 유전자 산물을 표적으로 하는 항균제는 넓은 스펙트럼의 항균 활성을 가질 것으로 기대된다. yqjK의 비. 서브틸리스 오솔로그(B-yqjK)는 생존에 필수적이지만, 이. 콜라이 오솔로그(elaC)는 생존에 필수적이지 않다는 관찰 결과는 이러한 유전자가 그것이 존재하는 모든 그램-양성 세균에서는 필수적이지만, 그램-음성 세균내에서는 필수적이지 않다는 것을 가리킨다. 따라서, yqjK 유전자 또는 그의 유전자 산물을 표적으로 하는 항균제는 모든 그램-양성 세균들에 대해서 항균 활성을 가질 것으로 예상된다.

바실러스 서브틸리스내에서의 yphC 및 yqjK 유전자들의 결실 및 필수성(essentiality) 확인

이하의 실시예들은 yphC 및 yqjK 유전자들의 비. 서브틸리스 오솔로그(즉, B-yphC 및 B-yqjK)가 비. 서브틸리스의 생존에 필수적임을 설명한다. 후술하는 바와 같이 두 가지 방법을 이용하여 비. 서브틸리스 내의 B-yphC 및 B-yqjK 유전자들의 녹아웃 돌연변이(knockout mutations)를 만들고 B-yphC 및 B-yqjK 유전자들의 필수 표현형(essential phenotype)을 확인하였다. 첫번째 방법은 상술한 스트렙토코커스에서 유전자를 녹아웃시키는데 이용한 표적화 결실 방법과 유사한 것인데, 두드러진 차이는 아래와 같다.

(A). PCR에서, 플라스미드 pDG283으로부터의 비. 서브틸리스의 클로람페니콜 내성 유전자(CmR)가 에리스로마이신 내성 유전자 대신에 이용되었다. 그렇지 않으면, 임의의 다른 비. 서브틸리스 마커가 이용될 수 있다.

(B). CmR 유전자를 증폭하기 위해 이용된 프라이머들 및 yphC ORF에 바로 플랭킹하는 프라이머 B 및 C는 "만능 오버래핑 서열(universal flanking sequence)"로 불리우는 27 뉴클레오티드 스트레치를 포함한다. 이들 만능 오버래핑 서열들은 PCR 증폭에서 효과적으로 이용되어 융합 PCR 반응에서 다양한 삽입 서열들의 이용을 용이하게 할 수 있다. 내성 마커들, 프로모터들, 조절 요소들, 또는 임의의 핵산 서열은 이러한 오버래핑 서열들을 이용하여 증폭될 수 있고 동일한 세트의 유전자 결실 프라이머들(프라이머 A, B, C 및 D)과 함께 이용될 수 있다. 5' 오버래핑 영역의 서열은 5'CACAGGAAACAGC TATGACCATGATTA3'(서열 25)이고 3' 오버래핑 영역의 서열은 5' GAAATAAATGCATCTGTATTTGAATG3'(서열 26)이다.

(C). PCR에 의해 만들어진 좌측 및 우측 플랭킹 DNA 분자들은 비. 서브틸리스 염색체내로 재조합되는데 가장 적합하도록 900(예컨대 1000) 뉴클레오티드 길이이다.

(D). 융합 생성물을 제조하기 위해, 두 가지 동시 PCR 반응을 이용하였다. 하나의 반응은 50℃의 어닐링 온도를 이용하였고, 나머지 하나는 65℃를 이용하였다. 더 긴 연장 시간(extension time)(30-60초 더 긴)을 이용하였고, 제조자(베링거-만하임)의 지시에 따라 긴 고 신뢰도 폴리메라제(Long high fidelity polymerase)를 이용하였다.

(E). 야생형 균주, PY79의 컴피턴트 세포들(competent cells)을 표준 비. 서브틸리스 프로토콜에 따라 이용하였다(Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, Harwood and Cutting, Eds. Wiley ＆ Sons, Ltd. England).

(F). 도 10에 도시된 프라이머의 서열들은 다음과 같다: CmR 프로모터의 상류 서열과 혼성화하는 프라이머 Ra, (5'　CACAGGAAACAGCTATGACCA TGATTAAACTAAAGCACCCATTAGTTCA3'（서열　２７）; 전사 종결부위(transcription terminator)에 인접하여 위치된 서열과 혼성화하는 프라이머 Rb(5' CATTCAAATACAGATGCATTTTATTTCCTCATATTATAAAAGCCAGTCATT3')(서열 28); 프라이머 A-YPHC(5'GCCATTGCGTTTGAAAG3')(서열 29); 프라이머 A-YQJK(5'TGCTTCGCCGATTTCTT3')(서열 30); 프라이머 B-YPHC(5'TAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTATGAAAAGAAACCCTTCAGAG3')(서열 31); yqjK 개시코돈에 인접하여 위치된 프라이머 B-YQJK (5'TAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGCATACCG AACGCCTTTCTT3')(서열 32); yphC 종결 코돈에 인접하여 위치된 프라이머 C-YPHC(5'GAAATAAATGCA TCTGTATTTGAATGTTTTAGAAAACCGAATCAGAGA3')(서열 33); yqjK 종결 코돈에 인접하여 위치된 프라이머 C-YQJK (5' GAAATAAATGCATCTGTATTTGAATGAATAGCGTGGCGGCATA3')(서열 34); 프라이머 D-YPHC (5'ATTCAGATCGAATACTCCTG3') (서열 35); 및 프라이머 D-YQJK (5'AAAGCGGGCAAAGCAGA3')(서열 36).

융합된 좌측 및 우측 플랭킹 DNA 분자들에 의해 형질전환된 컴피턴트 세포들을 선택배지(LB, 5㎍/ml Cm)상에서 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하여 문제의 유전자가 필수인지(콜로니 성장이 없는 것으로 규명) 아니면 비필수(수십 내지 수백 콜로니들이 나타나는 것으로 규명)인지 확인하였다. yphC 및 yqjK 유전자들을 가지고 이러한 결실 실험을 행할 때, 선택 배지상에 콜로니가 나타나지 않았는데, 이는 이들 유전자 모두 비. 서브틸리스의 생존에 필수적임을 가리킨다.

세포 성장이 나타나지 않는 관찰 결과가 B-yphC 및 B-yqjK 유전자들의 필수 특성 때문이라는 것을 확인하기 위하여 몇 가지 대조 실험을 행하였다. 유사한 실험에서 필수가 아닌 것으로 알려진 유전자들을 이용한 동시 PCR 반응들 및 형질전환 실험 결과 수백개의 콜로니들이 형성되었는데, 이는 실험 조건들이 콜로니 성장의 부재가 필수 유전자의 지표라는 것을 확신시키기에 적당하다는 것을 가리킨다. CmR 유전자 삽입 결과 하류 유전자들에게는 극적인 영향을 미치지 않았고 하류 유전자들이 효율적으로 발현될 수 있게 하였다.

비. 서브틸리스의 yphC 및 yqjK 유전자들의 결실 돌연변이체를 수득하는데 이용된 두 번째 방법은 선택된 유전자의 발현을 정지시키고 돌연변이 표현형이 나타나게 하는 조건성 널 돌연변이체(conditional null mutant)를 구성하는 과정을 포함한다(도 11a-도 11c). 이러한 돌연변이체에서, yphC 및 yqjK 유전자의 야생형 사본은 유전자 발현을 효과적으로 끄는 확실하게 조절가능한 프로모터(tightly regulatable promotor)인, 비. 서브틸리스 파라(Para) 프로모터의 조절하에 놓이게 된다. 이어서 이들 조절가능한 유전자 구조체들을 비. 서브틸리스 염색체내에 삽입하였다. 도 11a에 도시된 바와 같이, 조절가능한 유전자 구조체들은 아밀라제 유전자(amy) 서열 및 amy 부위에서 염색체 내로 통합(integration)되기 위한 CmR 서열을 포함하였다. 이중 교차(double crossover)에 의한 amy 유전자의 파열은 세포에 해를 주지 않았고, amy⁺세포가 투명한 할로(halos)를 갖는 콜로니들을 생산하기 때문에 재조합체들은 전분 플레이트상에서 용이하게 검출할 수 있다.

조절가능한 yphC 및 yqjK 유전자들이 야생형 세포의 염색체내로 통합된 후, 그 결과로 수득한 세포들을 상술한 바와 같이 컴피턴트하게 만들어 대체 내성 마커(replacement resistant marker)를 포함하는 융합 PCR 단편으로 형질전환시켰다(도 11b). 이 경우에, 융합 PCR 단편들은 CmR 유전자 대신에 비. 서브틸리스로부터의 카나마이신 내성 유전자(Kan)를 포함하였다. 본래의 자리 이외의 자리에 삽입된(ectopically inserted) 조절된 yphC 및 yqjK 유전자들을 포함하는 세포들의 형질전환중에 이러한 Kan 마커의 선별은 yphC 및 yqjK 유전자의 발현을 허용하고 결실들의 트랜스 상보 작용(trans complementation)이 가능하도록 아라비노스의 존재하에서 수행하였다(도 11c).

이러한 방법으로 수득한 yphC 및 yqjK 돌연변이체들은 0.2% 아라비노스가 존재하는 선택 배지에서 성장할 수 있었던 반면에, 야생형 세포들은 돌연변이체를 만들지 못하였다. 상기 조절된 유전자들 및 그들의 결실들을 포함하는 콜로니들을 골라 유사한 배지(LB Kan, 0.2% 아라비노스)에 그리고 저농도의 아라비노스를 포함하거나, 아라비노스를 포함하지 않거나 0.2% 글루코스를 포함하는 선택 배지상에 플레이팅하였다. 성장하도록 18시간 동안 인큐베이션한 후에, 콜로니를 포함하는 유일한 플레이트는 0.2%, 0.02% 또는 0.002% 아라비노스를 포함하는 플레이트뿐이었다. 저농도의 유도물질(inducer) 또는 억제 조건(아라비노스가 존재하지 않음 또는 글루코오스의 존재)은 세포 성장 및 콜로니의 성장을 허용하지 않았다. 따라서, 이들 실험들은 (1) 문제의 유전자들의 발현만이 효과적인 상보성(efficient complementation)을 수득하는데 충분하였기 때문에, 융합 PCR에 의해 만들어진 결실이 yphC 및 yqjK 유전자의 하류에 있는 필수 유전자로 추정되는 유전자들에게 영향을 미치지 않았고 (2) yphC 및 yqjK 유전자의 발현이 비. 서브틸리스 세포들의 생존에 필요하다는 것을 가리킨다.

상술한 실험들은 B-yphC 및 B-yqjK가 비. 서브틸리스의 생존에 필수적이라는 것을 입증한다. 이들 실험들은 부족발현/과잉발현 분석, 전사 프로파일링(transcription profiling) 등을 포함하는 여러 가지 스크리닝 및 접근방법에 이용될 수 있는 조건성 치사 균주(conditional lethal strains)를 제공하였다. yphC 및 yqjK 유전자들의 녹아웃 돌연변이의 구성은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법을 이용하여 행할 수 있다.

이. 콜라이내에서의 yphC 및 yqjK 오솔로그들의 필수 특성 검정

yphC 및 yqjK 유전자들이 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoiae)에서 필수적이라는 발견은 이들 유전자들이 모든 그램-양성 세균들에서 필수라는 것을 시사한다. 이러한 관찰 결과를 그램-음성 세균들에게까지 그리하여 모든 세균으로 더욱 확장하기 위해, yphC 및 yqjK의 이. 콜라이 오솔로그들에 대해 결실 돌연변이들을 제작하였다.

조건성 널 돌연변이체는 물론 이. 콜라이 유전자 결실을 만드는데 채용된 일반적인 방법을 도 12에 도식적으로 나타내었다. 우선, 결실될 야생형 유전자의 사본을 이. 콜라이의 Pbad 프로모터를 포함하는 런어웨이, 반대-선택가능한 벡터(runaway, counter-selectable vectors)내에 클로닝하였다. 이러한 이. 콜라이 프로모터는 아라비노스 존재하에서 켜지고 상술한 비. 서브틸리스 카운터파트처럼 확실하게 조절된다. 이러한 벡터를 포함하는 세포들을 이용하여 선택된 유전자를 약 30 뉴클레오티드 길이의 마커없는 작은 TAG로 대체함으로써 선택된 유전자의 인-프레임 결실(in-framed deletions)을 일으켰다.

선택된 유전자에 플랭킹하는 상류 및 하류 영역들을 27-30 뉴클레오티드 오버래핑 TAG를 도입시킨 프라이머들을 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 융합 PCR 반응들을 중간에 위치한 TAG에 의해 연결되어 있는 단지 이들 두 단편들만을 이용하여 수행함으로써 선택된 유전자들을 대체시켰다.

이어서 이러한 단편을 종래 기술(예컨대, Church et al., 1997, J. Bacteriol. 참조)에 따라 온도-감수성, 반대선택가능한 플라스미드인 pKO-3내에 클로닝하하여 염색체내에 삽입하였다. 그 결과로 얻은 인-프레임 결실을 아라비노스의 존재하에서 Pbad 벡터로부터의 야생형 유전자의 발현에 의해 상보시켰다(도 11c, P turned on). 결실 돌연변이체는 아라비노스가 없고, 글루코오스가 존재하거나(P turned off) 또는 IPTG(상보성 Pbad 플라스미드의 복제 기원(replication origin)이 lac-IPTGd의 조절하에 있기 때문에, IPTG는 플라스미드의 손실을 초래한다)는 없고 스트렙토마이신이 존재하는 조건하에서는 유전자 발현을 억제할 수 있다.

도 12에 도시된 바와 같이, 이. 콜라이에서 yphC 서열을 결실시키고 그것을상보성 Pbad-yphC 오솔로그 플라스미드 존재하에서 TAG로 대체시키면 아라비노스 플레이트에서는 잘 성장하지만 글루코스 또는 스트렙토마이신 플레이트에서는 성장할 수 없는 돌연변이체가 수득된다. 이러한 결과는 yfgK 유전자(즉, 이.콜라이 yphC 오솔로그)가 이. 콜라이의 생존에 필수적이라는 것을 가리킨다. 이와 대조적으로, 유사한 실험을 이. 콜라이 yqjK 오솔로그, elaC를 가지고 해 보면, 모든 조건하에서 현저한 세포 성장이 관찰되는데, 이는 yqjK 유전자가 이. 콜라이 생존에 필수적이 아니라는 것을 나타낸다. 그렇지 않으면, 서열은 유사하지 않은 아릴설파타제/포스파타아제 활성을 갖는 다른 이. 콜라이 유전자들이 elaC 기능을 상보하는 것일 수도 있다.

yphC 유전자의 비. 서브틸리스 및 이. 콜라이 오솔로그들이 생존에 필수적이라는 사실은 이러한 유전자가 그것이 존재하는 모든 세균에서 필수적이라는 것을 가리킨다. 에스. 뉴모니아에 및 비. 서브틸리스에서 필수적인 yqjK 유전자는 모든 그램-양성 세균에서는 필수적이지만, 이. 콜라이에서는 필수적이 아닌 것으로 생각된다. 따라서, yphC 유전자 또는 그의 유전자 산물을 표적으로 하는 항균제는 넓은 스펙트럼의 항균활성(그램-양성 및 그램-음성 세균 포함)을 가질 것으로 예상되는 반면에, yqjK 유전자 또는 그의 유전자 산물을 표적으로 하는 항균제는 그램-양성 세균에 대해서만 항균 활성을 가질 것으로 예상된다.

추가의 세균 균주들에서의 필수 유전자 및 폴리펩타이드의 동정

yphC 및 yqjK 유전자들 및 다양한 오솔로그들, 또는 이들의 단편들은 또 다른 유기체내에 있는 상동 유전자 또는 오솔로그 유전자들을 검출하는데 이용될 수 있다. 특히, 이러한 유전자들은 다양한 병원성 및 비-병원성 세균 균주들을 분석하는데 이용될 수 있다. 필수 폴리펩타이드, 상동체 또는 오솔로그(또는 상보성인 서열들)를 코드화하는 핵산의 단편들(DNA 또는 RNA)은 병원성 세균들의 종래의 핵산 혼성화 분석에서 프로브로 이용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 프로브들(전형적으로 8-30, 흔히, 15-20 뉴클레오티드 길이)을 이용하여 서던 블로팅, 노던 블로팅, 도트 또는 슬롯 블로팅, PCR 증폭방법, 콜로니 혼성화 방법 등과 같은 당업계에 공지되어 있는 분자생물학 기술에 따라 필수 유전자들 또는 그들의 상동 또는 오솔로그 유전자들을 검출할 수 있다. 전형적으로, 본원에 설명되어 있는 핵산 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 그의 단편들을 표지하여 목적으로 하는 세균 균주로부터 수득한 게놈 라이브러리를 스크린하는데 이용한다. 적당한 표지 방법은 프로브로 이용될 올리고뉴클레오티드에³²P-표지된 ATP를 첨가하기 위해 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고, 이 방법 이외에 다른 몇 가지 적당한 방법을 이용할 수 있다(예컨대, 바이오틴화 및 효소 표지).

라이브러리 또는 다른 핵산 시료를 올리고뉴클레오티드 프로브로 혼성화하는 것은 전형적으로 적당한 조건 내지 엄격한 조건하에서 수행한다. 핵산 듀플렉스 또는 하이브리드 안정성은 프로브가 표적 DNA로부터 떨어져 나오는 온도인 융점, 즉 T_m으로 표현된다. 이러한 융점은 요구되는 엄격성 조건을 한정하는데 이용된다. 만약 동정하고자 하는 서열들이 프로브와 완전히 동일하기 보다는 관련되거나 실질적으로 동일한 정도라면, 먼저 특정 염농도(예컨대, SSC 또는 SSPE)에서 상동 혼성화만이 일어나는 가장 낮은 온도를 맞추는 것이 유용하다. 그리고나서, T_m이 1℃씩 감소할 때마다 1% 부정합(mismatch)이 초래된다고 가정할 때, 혼성화 반응의 최종 세정 온도는 따라서 감소된다(예를 들어, 만약 프로브와 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 찾는다면, 최종 세정 온도는 5℃ 감소된다). 실제로, T_m의 변화는 1% 부정합 마다 0.5℃와 1.5℃ 사이가 될 수 있다.

엄격한 조건(stringent conditions)은 예를 들어, 68℃에서 5×SSC/5×덴하르트 용액/1.0% SDS내에서 또는 0.5M NaHPO₄(pH 7.2)/1 mM EDTA/7% SDS내에서 또는 50% 포름아마이드/0.25M NaHPO₄(pH 7.2)/0.25 M NaCl/1 mM EDTA/7% SDS내에서 혼성화; 및 실온 또는 42℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS로 세정하거나, 68℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 세정하거나 또는 50℃에서 40 mM NaHPO₄(pH 7.2)/1 mM EDTA/5% SDS로 세정하거나 또는 50℃에서 40 mM NaHPO₄(pH 7.2)/1 mM EDTA/1% SDS로 세정한다. 적당한 엄격성 조건은 42℃에서 3×SSC로 세정하는 것을 포함한다. 염 농도 및 온도의 파라미터는 프로브와 표적 핵산 사이의 최적의 레벨의 동일성을 달성하기 위하여 변경될 수 있다. 이러한 조건에 관련된 추가의 가이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 손 쉽게 얻을 수 있는데, 예를 들어, 샘브룩 등의 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al., (eds), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley ＆ Sons, N.Y.) 유니트 2.10.을 참조할 수 있다.

하나의 접근방법에서, 병원성 또는 비병원성 세균 균주로부터 구성된 라이브러리를 스크린할 수 있다. 예를 들어, 이러한 균주들을 노던 블롯 분석에 의해 필수 유전자들을 발현하는지 스크린할 수 있다. 이러한 필수 유전자들 또는 그들의 상동체들의 전사체의 발견시, 당업계에 알려진 표준 기술을 이용하여 적당한 균주로부터 분리된 RNA로부터 라이브러리를 구성할 수 있다. 그렇지 않으면, 전체 게놈 DNA 라이브러리를 필수 유전자 프로브(또는 그들의 상동체에 대한 프로브)를 이용하여 스크린할 수 있다.

예를 들어, 본원에 설명된 필수 유전자들내의 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 상동체들 또는 오솔로그들에 기초하여 설계된 두 개의 퇴행성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀들(degenerate oligonucleotide primer pools)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 새로운 유전자 서열을 분리할 수 있다. 이러한 반응을 위한 주형(template)은 공지되어 있거나 필수 대립유전자 또는 그들의 상동체 또는 오솔로그의 대립유전자를 발현할 것으로 의심이 가는 균주들로부터 수득한 DNA일 수 있다. PCR 생성물은 증폭된 서열이 새로운 필수 핵산 서열 또는 그의 상동체의 서열이라는 것을 확인하기 위해 2차클로닝하여 서열결정할 수 있다.

항원으로 이용하기 위해 또는 기타의 목적을 위해 다양한 필수 폴리펩타이드들 또는 그들의 상동체들 또는 오솔로그들(또는 그들의 항원성 단편들)을 합성하는 것은 당업계에 공지된 여러 가지 기술 가운데 하나를 이용하여 용이하게 행할 수 있다. 예를 들어, 필수 폴리펩타이드 또는 그의 상동체 또는 오솔로그 또는 항원성 단편(들)은 시험관내에서 화학적으로 합성되거나 효소적으로 합성될 수 있다(예컨대, 시험관내 전사 및 해독). 그렇지 않으면, 유전자는 매우 많은 이용가능한 유전자 발현 시스템들 가운데 임의의 것을 이용하여 세포내에서 발현될 수 있고 폴리펩타이드는 그러한 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 항원은 원핵 숙주(예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스) 또는 효모 세포 또는 곤충세포와 같은 진핵세포내에서 생산될 수 있다(예컨대, 바큘로바이러스-기초 발현 벡터를 이용하여).

단백질 및 폴리펩타이드들은 바람직한 경우 식물세포내에서 생산될 수도 있다. 식물 세포의 경우, 바이러스 발현 벡터(예컨대, 카울리플라우워 모자이크 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스) 및 플라스미드 발현 벡터들(예컨대, Ti 플라스미드)이 적당하다. 이러한 세포들은 여러 공급처(예컨대, American Type Culture Collection, Rockland, MD; 또한 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, 1994 참조)으로부터 입수할 수 있다. 최상의 형질전환 또는 트랜스펙션 방법 및 발현 비히클의 선택은 선택된 숙주 시스템에 따라 달라진다. 형질전환 및 트랜스펙션 방법은 예컨대, 오스벨 등의 상기 문헌에 설명되어 있고, 발현 비히클들은 예컨대, Cloning Vectors; A Laboratory Manual (P.H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987)에 제공된 것들중에서 선택할 수 있다. 발현 비히클을 수용하는 숙주 세포들은 종래의 영양배지에서 배양될 수 있고, 선택된 유전자의 활성화, 선택된 유전자의 억제, 형질전환체의 선택 또는 선택된 유전자의 증폭을 위해 필요한 대로 개량될 수 있다.

바람직한 경우, yphC 및 yqjK 폴리펩타이드 또는 이들의 상동체 또는 오솔로그들은 융합 단백질로 생산될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791, 1983)은 lacZ 융합 단백질을 제조하는데 이용될 수 있다. 당업계에 공지된 pGEX 벡터들은 외래 폴리펩타이드들을 글루타치온 S-트랜스페라제(GST)와의 융합 단백질로 발현시키는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합단백질들은 가용성이고 글루타치온-아가로스 비드에의 흡착에 이어 유리된 글루타치온의 존재하에서 용출시킴으로써 용해된 세포들(lysed cells)로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터들은 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되어 클로닝된 유전자 산물은 GST 부분으로부터 유리될 수 있다.

일례의 발현 시스템에서, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포내에서 성장하는, 오토그라파 칼리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)와 같은 바큘로바이러스가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 이용될 수 있다. 필수 폴리펩타이드 또는 그의 상동체 또는 오솔로그들을 코드화하는 코드화 서열은 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예컨대, 폴리헤드린 유전자)내에 클로닝되고 폴리헤드린 프로모터 또는 외래 프로모터(exogenous promotor)와 같은 프로모터의 조절하에 놓이도록 위치될 수 있다. 필수 폴리펩타이드 또는 상동체를 코드화하는 유전자의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자의 불활성화 및 비-폐색 재조합 바이러스(즉, 폴리헤드린 유전자에 의해 코드화되는 단백질 코트가 없는 바이러스)의 생성을 초래한다. 이어서 이러한 재조합 바이러스들은 그 안에서 목적 유전자가 발현되는 곤충세포(예컨대, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)를 감염시키는데 이용될 수 있다(예컨대, Smith et al., J. Virol., 46:584, 1993; Smith, 미국특허 제 4,215,051 참조). 바람직한 경우, 목적 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자가 포유동물 세포에서 활성화되는 프로모터의 조절하에 놓이도록 바이러스가 유전자조작된다면 곤충 세포 대신에 포유동물 세포들을 이용할 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서 다수의 바이러스 기초 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스(adenovirous)가 발현 벡터로 사용될 때, 필수 폴리펩타이드 또는 상동체는 아데노바이러스의 전사, 해독 조절 복합체(transcriptional translation control complex) 예를 들어 후기 프로모터와 3부분으로 나누어진 리더 서열에 연결 될 수 있다. 다음, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노스바이러스 게놈 속으로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수적 영역(예를 들어 E1 또는 E2)으로의 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하고 필수 유전자 산물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 결과시킨다.(Logan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655, 1984)

삽입된 핵산 염기서열의 효과적인 해독을 위해 특정 개시신호가 요구되어질 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시코돈과 인접한 염기서열들을 포함한다. 일반적으로, 아마도 ATG 개시신호를 포함하는 외래 해독조절 신호들이 제공되어져야 한다. 나아가 전체 서열의 해독을 확실하게 하기 위해서, 개시코돈은 목적으로 하는 코드화 서열의 리딩 프레임와 동일한 페이스이어야 한다. 이러한 외인성 해독 제어신호와 개시코돈은 여러가지 기원을 가질 수 있는데 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인헨서 요소들 또는 전사 종결부위들에 의해 향상될 수 있다. (Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:516, 1987)

필수 폴리펩타이드들과 그의 상동체와 오솔로그는 개별적으로 발현되거나 또는 신호서열 또는 단백질 또는 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C- 말단에 특정 절단 부위를 가지는 다른 폴리페타이드와 같은 이종 폴리펩타이드와 융합되어 발현될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 융합 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는, 다시말해 신호펩티다아제에 의해 절단되는 것이어야 한다.

숙주세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 특정한, 요구되어지는 형태로 유전자 산물을 변형하여 처리할 수 있는 것으로 선택되어질 수 있다. 단백질 산물의 그러한 변형과 처리(예를 들어, 절단)는 단백질의 다양한 작용을 촉진할 수 있다. 다양한 숙주세포들은 특수하고 특징적인 단백질과 유전산물을 해독 후 처리 및 변형 메카니즘을 가진다. 분자생물학의 분야의 기술자에게 익숙한 적절한 세포주 또는 숙주 시스템들이, 발현되어지는 외부 단백질의 정확한 변형과 처리를 보장하기 위해서 선택될 수 있다. 이러한 목적으로 일차 전사체의 적절한 처리와 유전산물의 인산화를 위한 세포 기구를 가지는 진핵 숙주세포(eukaryotic host cell)가 사용될 수 있다. 그러한 포유동물 숙주세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 그리고 맥락막의 망상조직 세포주를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

필수 폴리펩타이드 또는 그의 상동체 또는 오솔로그는, 요구되는 경우, 안정하게 트랜스펙션된 포유동물 세포주에 의해 생산될 수 있다.

포유동물 세포의 안정한 트랜스펙션을 위한 다수의 적당한 효소가 공지된 기술, 예를 들어, Powel et al.(상기 참조)을 참조하여 사용가능하다. 그러한 세포주를 만드는 방법은 예를 들어 Ausubel et al.(상기 참조)에 알려져 있다. 하나의 예를 들어, 단백질을 코드화하는 DNA는 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원효소(DHFR) 유전자를 포함하는 발현벡터 내로 클로닝된다. 따라서 플라스미드 및 필수 폴리펩타이드-코드화 유전자의 숙주 세포 염색체내로의 통합은 세포 배양배지에서 0.01∼300μM 메토트렉사트(methotrexate)를 포함하는 것에 의해 선택되어진다.(상기 Ausubel et al.,에 설명된 바와 같이) 이러한 우성 선택은 대부분의 세포타입에서 실행될 수 있다.

재조합 단백질 발현은 트랜스펙션된 유전자의 DHFR-매개 증폭(amplication)에 의해 증가되어질 수 있다. 유전자 증폭이 일어난 세포주를 선택하는 방법은 Ausubel et al.의 상기 문헌에 설명되어 있다. 그러한 방법은 일반적으로 점차적으로 증가하는 농도의 메토트렉사트를 포함하는 배양 배지에서 배양시키는 과정을 포함한다. 이러한 목적을 위해 일반적으로 사용되는 DHFR포함 발현벡터는 Ausubel et al.에 설명된 pCVSEII-DHFR과 pAdD26SV(A)을 포함한다.

각각 tk, hgprt, 또는 aprt 세포들에서 이용될 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자들(herpes simplex virus thymidine kinase genes), 하이포카틴-구아닌 포스포리보실-트랜스페라제 유전자(hypoxanthine-guanine phoshporibosyl-transferase genes), 그리고 아데닌 포스포리보실 트랜스페라제 유전자들(adenine phosphoribosyl transferase genes) 등을 포함하는, 그러나 이에 한정되는 않는, 다수의 다른 선택시스템이 사용될 수 있다. 또한, 마이코페놀릭 애시드(mycophenolic acid)에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981); 그리고 하이그로마이신(hugromycin)에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene, 30:147, 1981)가 사용될 수 있다.

택일적으로, 발현되어지는 융합 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 분자를 사용하여 어떤 융합 단백질도 손쉽게 정제될 수 있다. 예를 들어, Janknecht et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8972 (1981)에 설명된 시스템은 인간 세포주에서 발현된 비변성 융합단백질의 손쉬운 정제를 가능하게 한다. 이 시스템에서 목적으로 하는 유전자는 그 유전자의 오픈 리딩 프레임이 여섯개의 히스티딘 잔기로 이루어지는 아미노 말단 택(tag)에 해독적으로 융합되도록 백시니아 재조합 플라스미드 내에 이차 클로닝된다. 재조합 백시니아 바이러스에 의해 감염된 세포들로부터의 추출물은 Ni²⁺니트릴로아세틱 애시드(nitriloacetic acid)-아가로스 칼럼에 로딩되고, 이미다졸 함유 버퍼를 사용하여 히스티딘이 말단에 부착된 단백질은 선별적으로 용출된다.

택일적으로, yphC 또는 yqjk, 또는 그것의 상동체 또는 오솔로그 또는 그의 일부분은 면역글로불린(immunobulin) Fc 영역에 융합될 수 있다. 그러한 융합 단백질은 예를 들어, 단백질 A 칼럼을 사용하여 용이하게 정제될 수 있다. 더구나, 그러한 융합 단백질은 생체 내에서 높은 안정성을 가지는 필수 폴리펩타이드 또는 상동체 또는 오솔로그의 키메라 형태의 생산을 허용한다.

일단 재조합 필수 폴리펩타이드(또는 상동체)가 발현되면, 그것은 분리 (즉 정제)될 수 있다. 분비되지 않는 형태는 숙주세포로부터 분리되어야 하는 반면, 폴리펩타이드의 분비된 형태는 세포 배양배지로부터 분리될 수 있다. 폴리펩타이드들은 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어 항 yphC 항체(예를 들어, 여기서 설명되는 대로 생산되는)는 칼럼에 부착되어 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 친화성 크로마토크래피 이전에 수행되는 단백질을 포함하는 세포의 용해와 분류는 표준 방법(예를 들어 상기의 Ausubel et al.)에 의해 행해질 수 있다. 택일적으로 융합 단백질을 제작하여 필수 폴리펩타이드(예를 들어, yphC-말토스 결합 융합 단백질, yphC-β-갈락토시다제(galatosidase) 융합 단백질 또는 yphC-trpE 융합 단백질; 예를 들어 상기 Ausubel et al. 참조; New England Biolabs Catalog, Beverly, MA)를 분리하는데 사용할 수 있다. 재결합 단백질은, 만약 요구된다면, 예를 들어 표준 기술(예를 들어 Fisher, Lavoatory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980)를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.

본원에 설명된 아미노산 서열이 주어지면, 본 발명의 실시에 이용가능한 폴리페타이드, 특히 필수 폴리펩타이드의 단편은 예를 들어 표준 화학 합성(예를 들어, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., The Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984에 설명된 방법에 의해)에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 항원으로 사용될 수 있다.

항체

yphC와 yqjk 폴리펩타이드(또는 이러한 폴리펩타이드들의 항원성 단편 또는 유사체(analogs))는 본 발명에 유용한 항체를 생성하는데 사용될 수 있으며, 그러한 폴리펩타이드는 재조합 또는 펩타이드 합성 기술(예를 들어, 상기 Solid Phase Peptide Synthesis, 상기 Ausubel et al. 참조)에 의해 제조될 수 있다. 동일하게, yphC와 yqjK의 상동체 또는 오솔로그(또는 이러한 상동체 또는 오솔로그의 항원성 단편 또는 유사체)에 대한 항체도 만들 수 있다. 일반적으로 폴리펩타이드들은 상기 Ausubel et al.에 설명된 바와 같이 KLH와 같은 캐리어 단백질과 커플링되고, 아쥬반트와 혼합되어 숙주 포유동물 내로 주사된다. "캐리어"는 결합된 분자에 안정성을 부여하고/하거나 그러한 분자의 수송 또는 면역성을 도와주거나 향상시키는 물질이다. 항체는 예를 들어 폴리펩타이드 항원이 수지에 고정되는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

특히, 다양한 숙주 동물들이 목적 폴리펩타이드의 주입에 의해 면역화될 수 있다. 적당한 숙주 동물들의 예로 토끼, 생쥐, 기니아 피그 그리고 쥐가 있다. 숙주 종에 따라서, 다양한 아쥬반트가 면역반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있으며, 프로인트(Freund's) 완전한 또는 불완전한 아쥬반트, 수산화 알루미늄 과 같은 아쥬반트 미네랄겔 또는 라이소레시틴(lysolecithin)과 같은 계면활성물질, 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리어니언(polyanions), 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 (dinitrophenol), BCG(bacille Calmette-Guerin) 그리고 코리네박테리움 파븀 (Corynebacterium parvum)을 포함하나 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 다클론 항체는 면역화된 동물의 혈청(sera)으로부터 유도된 항체분자의 이종 집단(heterogeneous populations)이다.

본 발명에 유용한 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 인체화 또는 키메라 항체, 단사슬 항체, Fab 단편, F(ab')₂단편, 그리고 Fab 발현 라이브러리(labrary)를 이용하여 만들어진 분자들을 포함한다.

특정한 항원에 대한 항체의 동종 집단(homogeneous population)인 단클론 항체(mAbs)는 yphC, yqjK, 또는 그들의 상동체 또는 오솔로그와 표준 하이브리도마 기술(예를 들어 Kohler et al., Nature, 256:495, 1975; Kehler et al., Eur. J. Immunol., 6:511, 1976; Kohler et al., Eur.J. Immunol., 6:292, 1976; Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981; 상기 Ausubel et al., 참조)을 사용하여 준비될 수 있다.

특히, 단클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495, 1975와 미국 특허 제4,376,10호; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., Imunology Today, 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026, 1983); 그리고 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 단클론 항체와 암치료, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983)에 설명된 바와 같은, 배양액 내에서의 지속적인 세포주에 의한 항체 분자의 제조를 위해 제공되는 어떠한 기술에 의해서도 획득되어질 수 있다. 그러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 그리고 그것의 서브클래스를 포함하는 면역글로불린 클래스로 이루어질 수 있다. 본 발명의 mAbs를 제조하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다.

제조된 후, 다클론 또는 단클론 항체는, 예를 들어 상기 Ausubel et al.에서 설명된 바와 같은, 표준기술을 사용한 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 면역침강 분석과 같은 면역분석에서, 필수 폴리펩타이드 또는 그들의 상동체 또는 오솔로그의 특이적 인식에 대해서 시험된다. 특히 필수 폴리펩타이드, 또는 보존 변이체(conervative variants) 그리고 그들의 상동체 또는 오솔로그에 특이적으로 결합하는 항체가 본 발명에서 유용하다. 예를 들어, 그러한 항체는, 병원성 또는 비병원성 세균균주에 있는 필수 폴리펩타이드를 검출하기 위한 면역분석에 이용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 항체는, 고빈도의 하전된 잔기와 같은 기준에 의해, 항원으로 나타나기 쉬운 필수 폴리펩타이드의 단편을 이용해서 제조된다. 특정한 실시예에서 그러한 단편은 PCR과 같은 표준기술에 의해 생성된 다음, pGEX 발현 벡터(상기 Ausubel et al.,)내에 삽입된다. 융합 단백질은 E. coli속에서 발현되어 상기 Ausubel, et at.에 설명된 글로타시온(glutathione) 아가로스 친화성 매트릭스를 사용하여 정제된다.

필요한 경우, 몇개의 (예를 들어 둘 또는 셋) 융합물이 각 단백질에 대해 생성될 수 있으며, 각 융합물은 적어도 두마리 이상의 토끼에 삽입될 수 있다. 항혈청은 통상적으로 적어도 3회의 초회항원자극 주사를 포함하는 일련의 주사에 의해 생성될 수 있다. 통상적으로 항혈청은 재조합 필수 폴리펩타이드 또는 상동체 또는 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(chloramphenicol acetyltransferase), 또는 루시페라제 (luciferase)와 같은 연관되지 않은 조절단백질을 면역침강시키는 능력에 대해서 조사된다.

"키메라 항체"의 제조를 위해 개발된 기술(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851, 1984; Neuberger et al., Nature, 312:604, 1984; Takeda et al., 314:452, 1984)들이, 적절한 생물학적 활성을 가지는 인간 항체분자로부터 유래되는 유전자와, 적절한 항원 특이성을 가지는 쥐 항체 분자로부터의 유전자를 접속하기 위해서 사용될 수 있다. 키메라 항체는 상이한 부분들의 쥐의 mAb의 가변영역과 인간 면역글로블린의 불변영역을 갖는 것과 같이 서로 다른 동물종으로부터 유래된 분자이다.

택일적으로, 단일쇄 항체(sigle chain antibodies)의 제조(미국 특허 제4,946,778호; 제4,946,778호; 그리고 제4,704,692호)에 대해서 설명된 기술이 필수 폴리펩타이드 또는 그것의 상동체 또는 오솔로그에 대한 단일쇄 항체를 제조하는데 채용될 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 다리를 매개로 하여 Fv 지역의 중쇄 단편과 경쇄 단편을 결합시키는 것에 의해 형성되어, 하나의 단일쇄 폴리펩타이드가 된다.

특정 에피톱들(epitopes)를 인지하여 결합하는 항체 단편은 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 단편은 항체분자의 펩신 소화에 의해 제조되는 F(ab′)₂단편과 F(ab′)₂단편의 디설파이드 브릿지를 감소시킴에 의해 형성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 택일적으로, 목적으로 하는 특이성을 지니는 단클론 Fab 단편의 신속하고 쉬운 동정이 가능하도록 Fab 발현 라이버러리를 만들 수 있다.(Huse et al., Science, 246:1275, 1989)

특히 필수 폴리펩타이드, 상동체, 또는 오솔로그에 결합하는 다클론 그리고 단클론 항체는, 예를 들어, 다른 박테리아에 있는 필수 유전자, 상동체, 또는 오솔로그의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 필수 폴리펩타이드는 공지된 세균 세포 또는 추출물의 면역분석에 의해서 용이하게 검출될 수 있다. 적절한 분석법의 예로는 웨스턴 블라팅, ELISAs, 방사선면역측정법과 같은 방법이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.

항균제에 대한 분석

본 발명은 항균제를 동정하는 방법을 제공한다. 관련된 생물학적 메카니즘에 대한 특정한 이론이 얽매이지 않은 채, 새로운 항균제는 (1) yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드 또는 그들의 상동체 또는 오솔로그의 작용, 또는 (2) yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드 또는 그들의 상동체 또는 오솔로그의 발현을 억제하는 것으로 생각되어 진다.

GenBank 데이타 베이스로부터 얻어진 유사한 서열과 yphC 단백질 서열을 나란히 정력시켜 대조한 결과는 yphC 단백질은 GTPase 활성을 갖는다는 것을 시사한다. 유사하게, Genbank로부터의 서열과 함께 yqjK 단백질의 배열은 yqjK 단백질이 아릴설파타제(arylsulfatase) 활성을 갖는다는 것을 시사한다. yphC 그리고 yqjK 단백질이 제안된 생화학적 활성을 가졌는지를 시험하도록 고안된 시험에서, yphC 단백질은 GTPase 활성을 가지는 것으로 확인되었고, yqjK 단백질은 아릴설파타제(arylsulfatase) 활성을 가지는 것으로 확인되었다.

각 단백질의 효소적 활성은 각 효소의 새로운 특성을 암시한다. 예를 들어, yphC 단백질은 두개의 GTP-결합 부위를 포함하나, 단지 하나의 부위만이 활성을 가지는 것으로 나타난다. yqjK 단백질은 아릴설파타제 활성에 부가하여 포스파타제 (phosphatase)활성을 가지며, 망간이온에 의해 촉매화되는 활성화 단계를 수행한다. 본원에 설명되어 있는 유전적 실험에서, yphC와 yqjK의 생물화학적 활성은 단백질들의 필수 특성에 접목되는 것으로 확인되었다. yphC 유전자의 GTP-결합 부위의 돌연변이체는 GTPase 활성이 없으며, 널 yqjK 돌연변이(null yqjk mutants)를 상보할 수 없는 단백질로 나타난다. 유사하게, 아릴설파타제 활성이 없는 yqjK 돌연변이체는 널 yqjK 돌연변이체를 상보할 수 없다. 더하여, 아릴설파타제 활성이 없는 돌연변이체는 또한 포스파타제 활성이 없으며, 그 역으로도 마찬가지였다. 이러한 실험은 세포 배양액 속의 yphC 또는 yqjK의 효소 활성의 억제는 세포의 생존능력을 저하시켜 세포가 사멸하게 한다. 그리하여, 이러한 생화학적 활성은 시험관내 또는 생체내에서 단독으로 또는 기존에 알려진 이러한 활성을 탐지하기 위한 방법과 결합하여 항균제를 동정하기 위해 사용된다.

다양한 적절한 방법으로, 항균제의 스크리닝은 필수 펩타이드의 활성 또는 필수 유전자의 발현을 방해하는 이러한 화합물(예를 들어, 작은 유기분자)를 동정함으로서 이루어진다. 항균제 스크리닝은 (ⅰ) 필수 폴리펩타이드에 영향을 주거나 이들에 결합하는 이러한 화합물을 동정하고, (ⅱ) 나아가 시험관내 또는 생체내에서 세균 성장을 방해하는 능력에 대해서 그러한 화합물을 시험함에 의해서 실행될 수 있다.

적절한 스크리닝 방법의 예가, 본원에 참고자료로 첨부된 미국 특허 제5,679,582호, 제5,585,277호에 나타나 있다. 간단히 설명하면, 이러한 방법에서 "시험 결합물(test combination)"을 제조하기 위해서, 표적 단백질이 시험 화합물(다시 말해, 시험 리간드)의 존재하에 인큐베이션 되며, "대조구 결합물 (control combination)"을 제조하기 위해서, 표적 단백질은 시험 화합물의 부존재하에 인큐베이션된다. 그후, 시험 결합물과 대조구 결합물은 부분적으로 또는 전체적으로 접혀지지 않은 상태로 존재하는 표적 단백질의 파편이 검출가능한 정도로 생성되도록 처리된다. 그리고, 시험 결합물과 대조구 결합물에서 접혀진 상태로, 접혀지지 않은 상태로, 또는 양쪽 상태로 목표단백질이 발생하는 정도가 측정된다. 표적 단백질이 접혀진 상태로 대조구 결합물에서 보다 더 많거나 더 적은 정도로 시험 결합물 속에서 존재할 때, 시험 화합물은 표적 단백질에 결합하는 화합물이다.

다른 방법에서, 목표 단백질로의 시험 화합물의 결합은 모세관 전기영동을 사용하여 검출된다. 요약하여, 목표 단백질에 결합하는 시험 화합물(예를 들어, 작은 분자)은 모세관 전기영동 동안 목표 단백질의 전기영동 이동성에 변화를 일으킨다. 적절한 모세관 전기영동 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되어 있다.(예를 들어 Freitag, J. Chromatography B, Biochemical Science ＆ Applications: 722(1-2):279-301, Feb. 5, 1999; Chu and Cheng, Cellular ＆ Molecular Life Science: 54(7):663-83, July 1998p; Thormann et al., Forensic Science International: 92(2-3): 157-83, April 5, 1998; Rippel et al., Electrophoresis: 18(12-13): 2175-83, Nov. 1997; Hage and Tweed, J. Chromatography. B, Biomedical Science ＆ Applications: 699(1-2): 499-525, October 10, 1997; Mitchelson et al., Trends In Biotechnology: 15(11):448-58, Nov. 1997; Jenkins and Guerin J. Chromatography B. Biomedical Applications: 682(1): 23-34, June 28, 1996; and Chen and Gallo, Electrophoresis: 19(16-17): 2861-9, Nov. 1998)

yphC의 억제인자 역시, 하기와 같은 GTPase 억제인자의 탐지를 위한 생물화학적 분석으로 동정될 수 있다. 이러한 분석법은 무기질 인산염의 나노몰 양의 동정을 위해 칼로리측정 검출 시스템을 사용한다. 분석은 바닥이 투명한 96-웰 마이크로플레이트(예를 들어, Corning-COSTAR Catalog #9710)에서 실행될 수 있다. 10% DMSO 내의 각 시험 화합물의 20㎕ 분취량을 대조구로 이용될 웰을 제외한 각 플레이트의 모든 웰에 넣는다. 다음 420μM GTP의 20㎕ 분취량을 대조반응을 위해서 사용될 웰을 제외한 각 플레이트의 웰에 첨가한다. 225μM GDP를 포함하는 IC₅₀의 20㎕를 두개의 대조구 웰로 투입한다; IC₁₀₀(420μM GTP의 12.75ml속에 포함되어 있는 0.5M EDTA 2.25ml)의 20㎕를 다른 두 개의 대조구 웰에 투입한다; 그리고 420μM GTP를 포함하고, 억제제를 포함하지 않는 20㎕를 네개의 다른 대조구 웰에 투입한다. 20㎕의 2X-버퍼(100mM Tris HCL, 500 mM KCL, 10 mM MGCl₂, 0.2 mg/ml 아세틸레이티드-BSA, H₂O)와 yphC 효소 용액(1μg/웰을 제공)을 각 웰내에 넣고, 상기 플레이트를 상온에서 3.5 시간동안 인큐베이션한다. 효소반응을 멈추기 위해서, 0.045% 멜러카이트(Malachite) 그린/35mM EDTA 용액 150㎕을 각 웰에 첨가한다. 25분 후, 15% 구연산염 50㎕를, 각 웰에 더하여 더이상 발생되지 않게 한다. 이어서, 상기 샘플을 균일한 용액이 수득될 때까지, 강하게 혼합한다.(예를 들어, TOMTEC-Quadra-96, Model 320를 사용) 다음으로 상기 플레이트를 플레이트 리더(예를 들어, a Wallac-Victor 2 플레이트 리더)를 사용하여 파장을 650nm로 세팅하여 채 판독한다. 일반적으로 플레이트는 멜러카이트 그린과 구연산염이 첨가된후 24시간 내에 판독되어야 한다.

시료웰의 퍼센트 억제율은 다음과 같이 계산될 수 있다. IC₁₀₀대조구를 포함하는 두웰의 평균값을 기초값(background)로 사용한다. 퍼센트 억제율은 다음의 식에 따라 계산될 수 있다 :

% 억제 = [1-(샘플카운트 - 기초카운트)/(평균카운트 - 기준카운트)] ×100.

40% 이상 억지시키는 시험 화합물은, 요구되는 경우, 더 높은 농도에서 도스반응으로 다시 시험될 수 있다.

항균제를 동정하기 위한 다른 방법에는 기존 단백질/단백질 상호작용의 투-하이브리드 분석법(예를 들어, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578, 1991; Fields et al., 미국특허 제 5,283,173호;Fields and Song, Nature, 340:245, 1989; Le Douarin et al., Nucleic Acids Research, 23:876, 1995; Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10315-10320, 1996; 그리고 White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10001-10003, 1996)과 같은, yphC, yqjK, 또는 이들의 상동체 또는 오솔로그에 결합하는 폴리펩타이드의 동정을 위한 다양한 세포-기초 방법을 포함한다. 일반적으로, 투-하이브리드 방법은 한 세포에서 하나의 전사 인자의의 두개의 분리가능한 도메인들을 재구성하는 것을 포함한다. 하나의 융합 단백질은, 트랜스액티베이터(transactivator) 도메인 또는 전사 인자(예를 들면, Gal4)의 DNA 결합 도메인 중 하나에 융합되는 필수 폴리펩타이드(또는 그들의 상동체 또는 오솔로그)를 포함한다. 다른 융합 단백질은, DNA 결합 도메인 또는 전사인자의 트랜스액티베이터 도메인 중 하나에 융합되는 시험 폴리펩타이드를 포함한다. 일단 단일한 세포(예를 들어, 효모 세포 또는 포유동물 세포)내에 집합되면, 하나의 융합 단백질은 트랙스액티베이터 도메인을 포함하고, 다른 융합 단백질은 DNA 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 필수폴리펩타이드의 시험 폴리펩타이드(다시 말해, 후보 항균제)에 대한 결합은 전사인자를 재구성한다. 전사인자의 재구성은, 전사인자의 DNA 결합 도메인에 의해 결합되는 DNA 서열에 작동가능하도록 연결된 유전자(다시말해, 리포터 유전자)의 발현을 검출함에 의해 검출될 수 있다. 다양한 투-하이브리드 방법의 실행을 위한 장치가 상업적으로 이용가능하다.(예를 들어, Clontech; Palo Alto, CA)

유일한 분석방법이 아닌 또 다른 분석방법의 일례에서, 상향조정(upregulation) 또는 하향조정(downregulation)에 의해 필수폴리펩타이드의 결실에 반응하는 프로모터가, 상기에서 설명된 바와 같이 리포터 유전자(예를 들어, β-갈락토시다아제(galactosidase), gus, 또는 GFP)에 결합된다. 다음으로, 이 리포터 유전자 구조체를 포함하고 있는 세균 숙주는 시험 조성물에 노출되어진다. 필수 폴리펩타이드 (또는 필수 폴리펩타이드가 참여하는 필수경로에 있는 다른 폴리펩타이드)를 저지하는 화합물들은 필수 폴리펩타이드의 기능 결실을 초래하여, 리포터 유전자 발현을 상향조정하거나 하향조정한다. 본원에 설명된 폴리펩타이드는 세균의 생존에 필수적이기 때문에, 이러한 분석에서 필수 폴리펩타이드를 억제하는 화합물은 항균제일 것으로 예상되며, 만약 요구된다면 종래의 다른 감염성 분석법으로 추가로 시험할 수 있다.

상기에서 설명된 이러한 방법은 후보 항균(또는 항세균) 물질을 동정하기 위한 매우 많은 시험 화합물들을 높은 처리량으로 스크리닝 하는데 사용될 수 있다. 시험 화합물이 후보 항균제로 확인되면, 필요한 경우 시험관내 또는 생체내 (예컨대 설치류 모델 시스템과 같은 동물을 이용하여)에서 세균성장을 억제하는지를 추가로 시험할 수 있다. 그러한 방법의 이미 알려진 다른 변형을 이용하여, 시험 화합물로서 사용되는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 yphC, yqjK, 또는 그것의 상동체 또는 오솔로그에 결합하는 능력을 시험할 수 있다.

시험관 내에서, 효소 억제 분석법 또는 전체-세포 세균 성장 억제 분석법(whole-cell bacterial growth inhibition assay)과 당업계에 공지된 방법에 의해 추가 시험을 행할 수 있다. 예를 들어 아가 희석(agar dilution) 분석법은 박테리아의 성장을 방해하는 물질을 탐지한다. 마이크로타이터(Microtiter) 플레이트에 시험 화합물의 일련의 희석액을 준비하여 넣고, 주어진 양의 성장기질(growth substrate) 조제를 첨가하고 나서, 박테리아의 표본을 공급한다.

박테리아 성장의 억제는, 예를 들어, 세균 배양액의 광학적 밀도상의 변화를 관찰하여 측정한다.

박테리아 성장의 억제는, 예를 들어, 박테리아 세포의 성장속도,(시험 화합물의 존재 또는 부존재 하에서) 또는 절대성장을 비교하여 증명된다. 억제는 상기 측정치 중 하나가 20% 이상 감소되는 것을 포함한다. 특히 유력한 시험 화합물은 성장 속도를 더욱 감소시킬 수 있다.(예를 들어, 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 80%, 또는 90%)

박테리아 감염의 쥐(예를 들어, 쥐과의 동물)와 토끼 동물 모델은 당업자들에게 공지되어 있으며, 그러한 동물 모델 시스템이 인체에서의 그들의 치료 효능의 지표로서 항균제를 스크리닝하는데 채택 사용될 수 있다. 통상의 시험관내 분석에서, 동물은 병원성 세균 균주, 예를 들면 스트렙토커스 뉴모니아에와 같은 박테리아의 흡입에 의해서 감염되며, 기존의 방법과 기준이 박테리아 감염으로 괴로움을 당하는 포유동물의 진단에 사용된다. 다음으로 후보 항균제를 체중의 1-100 mg/kg의 양으로 상기 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물의 질병이 완화되는 징후를 모니터한다. 그렇지 않으며, 세균으로 포유동물을 감염시키기 전에 포유동물에 테서트 화합물을 투여하고, 치료된 포유동물의 감염에 대한 저항력을 측정한다. 물론, 시험 화합물의 존재하에서 얻어진 결과는 시험화합물로 치료받지 못한 대조구 동물의 결과와 비교되어져야 한다. 포유동물로의 후보 항균제의 투입은 예를 들어 후술하는 바와 같이 실행될 수 있다.

약제 제형(Pharmaceutical Formulation)

치료는 항균제를 포함하는 조성물의 약학적으로 유용한 양을 그러한 치료를 필요로 하는 대상에 투입하여, 그것에 의해 그 대상에 있는 세균 성장을 저지하는 것을 포함한다. 그러한 조성물은 통상 약학적으로 허용가능한 담체내에 본 발명의 항균제 0.1 내지 90 중량%(1 내지 20% 또는 1 내지 10%)를 포함한다.

경구투입용 조성물의 고형 제형은 옥수수 전분, 젤라틴, 락토스, 아라비아고무, 수크로스, 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 카올린(kaolin), 마니톨 (mannitol), 디칼슘 포스페이트, 탄산칼슘, 염화나트륨, 또는 알긴산과 같은 적절한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 제한없이 사용될 수 있는 붕괴제(disintegrator)는 마이크로-크리스탈린 셀룰로스, 옥수수 전분, 나트륨 전분, 글리콜레이트(glycolate) 그리고 알긴산을 포함한다. 사용될 수 있는 정제 결합제(tabblet binders)로는 아라비아 고무, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스(sodium carboxymethylcellulose), 폴리비닐피롤리덴(polyvinylpyrrolidone, Povidone), 하이드록시프로필 메틸세룰로스 (hydroxypropyl methylcellulose), 수크로스, 전분, 그리고 에틸셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 윤활제로는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리콘 유체, 탈크, 왁스, 오일, 그리고 콜로이드 실리카를 포함한다.

물 또는 다른 수용성 제제속에서 준비되어지는 경구투여용 조성물의 액상 제형은 메틸셀룰로스, 알기네이트(alginates), 트래거캔스(tragacanth), 펙틴, 켈긴(kelgin), 카라게닌(carrageenan), 아라비아 고무, 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 그리고 폴리비닐 알콜을 포함할 수 있다. 이러한 액체 제형은 활성 화합물, 습윤제, 감미제, 그리고 착색, 착향제와 함께 용액, 에멀젼, 시럽, 그리고 엘릭시르(elixirs)를 포함할 수 있다. 다양한 액체 및 분말제형이, 치료되는 포유동물의 폐속으로의 흡입을 위한 기존의 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 조성물의 주사가능한 제형은, 야채오일, 디메틸아세트아마이드 (dimethylacetamide), 디메틸포름아마이드 (dimethylformamide), 에틸 락테이트 (ethyl lactate), 에틸 카보네이트(ethyl carbonate), 이소프로필 미리스테이트 (isopropyl myristate), 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 포함할 수 있다. 정맥주사의 경우 수용성 화합물이, 점적 방법(drip method)에 의해 투여되어, 항균제와 생리적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제 제형이 주입된다. 생리학적으로 수용가능한 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거 수용액, 또는 다른 적절한 부형제를 포함할 수 있다. 극육내 조제인, 적당한 가용성 염의 형태인 화합물들의 멸균 제형은 주사용수(Water-for-Injection) 0.9%염수 또는 5% 글루코스 용액과 같은 제약학적 부형제 내에 용해되어 투여될 수 있다.

적절한 불용성 염 형태의 화합물은 수용액 베이스 또는 긴 사슬의 지방산의 에스테르(예를 들어, 에틸 올리에이트(ethyl oleate))와 같은, 제약학상 허용 가능한 오일 베이스 내에 현탁액으로 제조되어 투여될 수 있다.

통상의 반고체 연고 제형은 통상적으로 제약학적 크림 기재와 같은 담체내에 약 1 내지 20%, 예를 들어 5 내지 10% 농도의 활성성분을 포함한다. 국소적인 사용을 위한 다양한 제형은 활성 성분과 다양한 보조제와 비히클을 포함하는 안약, 팅크제, 로숀, 크림, 용액, 그리고 연고를 포함한다.

각 약제 제형에서 항균제의 최적의 퍼센트는 제형 그 자체와 특정 병리학에서 요구되는 치료 효과 및 관련 치료 식이요법에 따라서 다르다. 항균제의 적절한 용량은, 그 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 포유동물의 질병이 완화되거나 개선되는 징후를 모니터하고, 용량 및/또는 요구되어지는 치료의 횟수를 증가시키거나 감소시켜 용이하게 결정될 수 있다. 박테리아 감염에 의해 기인하는 또는 세균 감염에 의해 유발된 상태의 치료에 사용되는 항균 화합물의 최적의 양은 투입방법, 대상의 연령과 체중, 그리고 치료되는 대상의 상태에 달려있다. 일반적으로 항균 화합물은 체중의 1 내지 10 mg/kg의 용량으로 투입되며, 더욱 바람직하게는 체중의 1 내지 10 mg/kg 용량으로 투입된다.

다른 실시예

본 발명은 또한, 예를들어 GTPase 또는 설파타제 활성과 같은 yphC와 yqjK 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 하나 이상 보유하는, 상기에서 설명된 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 아날로그, 그리고 유도체를 특징으로 한다. 상기 발명에 자연적으로 발생하거나 비자연적으로 발생하는 변이체가 포함된다. 도 1과 3에 도시된 자연적으로 발생하는 필수 서열에 비하여, 변이체를 코드화하고 있는 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있다. 바람직한 변이체는 예를 들어 상보성 분석법(complementation assay)에서 밝혀진 대로, 필수 폴리펩타이드의 기능을 유지한다.

본원 발명이 그것의 상세한 설명과 관련하여 설명되었으며, 앞선 설명은 발명을 예시하기 위한 것이므로 그 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며, 그 범위는 하기 청구항에 의해 결정된다. 다른 측면, 장점, 그리고 개량은 뒤따르는 청구범위의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 단백질과 시험 화합물의 상호작용을 동정하기 위한, 또는 박테리아 성장의 억제를 검출하기 위한 다른 공지기술 분석법에 본 발명의 필수 유전자, 유전자 산물, 그리고 그것의 상동체와 오솔로그가 이용될 수 있다.

Claims

서열 1; 서열 2; 또는 서열 7의 서열과 85% 이상이 동일한 분리된 핵산 분자.
제 1항에 있어서, 상기 핵산 분자가

도 1에 도시된 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 yphC 폴리펩타이드;

도 2a-2b에 도시된 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 yphC 폴리펩타이드; 또는

도 3에 도시된 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 yqjK 폴리펩타이드

를 코드화하는 핵산 분자.
(1)도 1에 도시된, 서열 1의 서열 또는 이들의 퇴행성 변이체(degenerative variants);

(2)도 1에 도시된, 서열 1의 서열 또는 T가 U로 치환된 이들의 퇴행성 변이체;

(3)상기 (1) 또는 (2)의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열;

(4)길이가 15 염기쌍 이상이고 엄격한 조건(stringent condition)하에서 서열 2의 폴리펩타이드를 코드화하는 게놈성 DNA에 혼성화되는, 상기 (1), (2) 및 (3)의 서열의 핵산 단편;

(5)도 2a-2b에 도시된, 서열4의 서열, 또는 이들의 변이체;

(6)도 2a-2b에 도시된, 서열4의 서열, 또는 T가 U로 치환된 이들의 퇴행성 변이체;

(7)상기 (5) 및 (6)에 상보적인 핵산;

(8)도 3에 도시된 서열 7의 서열, 또는 이들의 퇴행성 변이체;

(9)서열 7의 서열, 또는 T가 U로 치환된 이들의 퇴행성 변이체;

(10)상기 (8) 및 (9)의 서열에 상보적인 핵산 서열; 및

(11)길이가 15 염기쌍 이상이고 엄격한 조건하에서 서열 8의 폴리펩타이드를 코드화하는 게놈성 DNA에 결합되는 (8), (9) 및 (10)의 서열의 핵산 단편

으로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
길이가 15 염기쌍 이상이고 엄격한 조건하에서 서열 1 및 서열 4의 서열에 혼성화되는 분리된 핵산 분자.
제 1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제 1, 2 또는 3항중 어느 하나의 항의 외래적으로 도입된(exogenously introduced) 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제 1항의 핵산 분자에 의하여 코드화되는 분리된 폴리펩타이드.
(a)yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드와 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및

(b)상기 시험 화합물과 상기 yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드의 상호 작용을 검출하는 단계로서, 상기 상호 작용은 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계

를 포함하는 항균제 동정 방법.
제 8항에 있어서,

(c)상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 지표로서 상기 폴리펩타이드와 상호 작용하는 시험 화합물이 폴리펩타이드와 상호 작용하는 시험 화합물의 부재하에서 배양된 세균의 성장에 비하여 세균의 성장을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 비-병원성 세균 균주로부터 유래된 방법.
제 8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 병원성 세균 균주로부터 유래된 방법.
제 8항에 있어서, 상기 시험 화합물이 폴리펩타이드, 리보핵산, 작은 분자(small molecule), 및 데옥시리보핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법.
제 8항의 방법에 의해서 동정된 항균제 및 약제학상 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제 제형(pharmaceutical formulation).
유기체내의 세균성 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 유기체에 제 13항의 약제 제형을 치료학적으로 유효량만큼 투여하는 과정을 포함하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 유기체가 인간인 방법.
제 7항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
제 8항에 있어서, 상기 상호 작용을 상기 시험 화합물과 접촉된 폴리펩타이드의 기능의 감소 여부를 동정함으로써 검출하는 방법으로서; 상기 방법이

접촉한 폴리펩타이드의 기능을 감소시키는 시험 화합물이 상기 폴리펩타이드의 기능을 감소시키는 시험 화합물의 부재하에서 배양된 세균의 성장에 비해서, 세균의 성장을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로서, 성장 억제는 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
(a)시험 화합물과 yphC 또는 yqjK를 코드화하는 핵산을 접촉시키는 단계; 및

(b)상기 시험 화합물과 핵산의 상호 작용을 검출하는 단계로서, 상기 상호 작용은 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 포함하는 항균제 동정 방법.
제 18항에 있어서,

(c)핵산과 상호 작용하는 시험 화합물이 상기 핵산과 상호 작용하는 시험 화합물의 부재하에서 배양된 세균의 성장에 비하여 세균의 성장을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 성장 억제는 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
항균제를 동정하는 방법으로서, 상기 방법이

(a)yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드의 오솔로그(ortholog)를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 시험 화합물과 오솔로그의 상호 작용을 검출하는 단계로서, 상기 상호 작용은 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 방법이

(c)오솔로그(ortholog)와 상호 작용하는 시험 화합물이 상기 오솔로그와 상호 작용하는 시험 화합물의 부재하에서 배양된 세균의 성장에 비하여 세균의 성장을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 성장 억제는 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 21항에 있어서, 상기 오솔로그(ortholog)가 B-yphC, B-yqjK, yfgK 및 elaC로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법.
제 21항에 있어서, 상기 오솔로그(ortholog)가 병원성 세균으로부터 유래된 방법.
(a)yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드의 오솔로그와 시험 화합물을 접촉시키는 단계;

(b)상기 시험 화합물과 접촉한 오솔로그의 기능이 감소되는 것을 검출하는 단계; 및

(c)접촉한 오솔로그의 기능을 감소시키는 시험 화합물이 상기 접촉한 오솔로그의 기능을 감소시키는 시험 화합물의 부재하에 배양된 세균의 성장에 비하여 세균의 성장을 억제하는지 여부를 결정하는 단계로서, 상기 성장 억제는 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 포함하는 항균제를 동정하는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 오솔로그(ortholog)가 B-yphC, B-yqjK, yfgK 및 elaC로 구성된 그룹으로 부터 선택된 방법.
항균제를 동정하는 방법으로서, 상기 방법이

(a)yphC 또는 yqjK 오솔로그(ortholog)를 코드화하는 핵산을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 시험 화합물과 핵산의 상호 작용을 검출하는 단계로서, 상기 상호 작용은 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 포함하는 방법.
제 26항에 있어서, 상기 방법이

(c)핵산과 상호 작용하는 시험 화합물이 상기 핵산과 상호 작용하는 시험 화합물의 부재하에서 배양된 세균의 성장에 비하여 세균의 성장을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 성장 억제는 상기 시험 화합물이 항균제임을 나타내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 27항에 있어서, 상기 오솔로그(ortholog)가 B-yphC, B-yqjK, yfgK 및 elaC로 구성된 그룹으로 부터 선택된 방법.
스트렙토코커스 뉴모니아에 감염된 포유 동물을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 스트렙토코커스 뉴모니아에 감염된 포유 동물에서의 yphC 또는 yqjK 폴리펩타이드의 기능을 억제하는 과정을 포함하는 방법.